JP2001033448A - 組み換え型ウイルス抗原の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い抗原活性を有するウイルス抗原を得るこ
とができる組み換え型ウイルス抗原の調製方法を提供す
る。 【解決手段】 ウイルス抗原遺伝子を、シャペロン遺伝
子とともに宿主中で共発現させる組み換え型ウイルス抗
原の調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高い抗原活性を有する
ウイルス抗原を得ることができる組み換え型ウイルス抗
原の調製方法ならびに組み換え型ウイルス抗原に関す
る。

【０００２】

【従来技術】現在、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイル
ス等のウイルスの免疫学的に高活性な抗原タンパク質や
ペプチドを安価に供給できる方法が望まれている。

【０００３】例えば、Ｂ型肝炎ウイルスにおいては、ウ
イルス表面抗原を、酵母、動物細胞等を用いた組み換え
抗原粒子として製造する方法が開発されている（特開平
６−９０７８１号公報、特開平２−１５０２９２号公報
及び特開平２−１６３０８９号公報）。しかしながら、
これらの組み換え体の生産性はそれほど優れておらず、
しかもその抗原性は感染患者血液から得られる天然型の
抗原のそれに比べて低かった。また、動物細胞を用いる
系は、培養、株の維持等の面で細菌を用いる場合に比べ
て高価であり、操作も繁雑であり、培養し始めてから精
製するまでに長い時間を要するものであった。更に、ウ
イルス抗原は、元来、抗原タンパク質が特有の集合状
態、即ち、球状粒子にならなければ抗原活性を示さない
場合も多いので、酵母、動物細胞等の宿主内において発
現させたものには、粒子形成されていない不完全な構造
の抗原タンパク質も存在するという問題点があった。

【０００４】Ｂ型肝炎ウイルス抗原では、また、大腸菌
を用いた組み換え系を利用して製造する方法も報告され
ている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１９８３，１１，３５８１−３５９１）が、抗原の
粒子形成が認められた例はこれまでにないのが現状であ
る。

【０００５】一方、Ｃ型肝炎ウイルス抗原においても、
大腸菌で生産させる例がある（特表平８−５０６８３３
号公報、特開平４−１２１１９３号公報及び特表平４−
３２０６９３号公報）が、抗原性及び特異性の両面で満
足のいくものは調製されていないのが現状である。ま
た、過剰に生産させると、沈殿画分に不活性なタンパク
質として生産されることもあった。さらにエイズウイル
ス抗原においても、大腸菌で生産させる例がある（特表
平３−５０１６８４公報）が、抗原性や生産性で満足の
いくものは調製されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、高い抗原活性を有するウイルス抗原を得ることが
できる組み換え型ウイルス抗原の調製方法を提供するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ウイルス抗原
遺伝子を、シャペロン遺伝子とともに宿主中で共発現さ
せる組み換え型ウイルス抗原の調製方法である。

【０００８】上記ウイルス抗原としては特に限定され
ず、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）等のＢ
型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ＨＩＶ抗
原等が挙げられる。上記ＨＢｓ抗原のａｄｒ型のＤＮＡ
配列を配列表の配列番号１（Ｌｏｎｃａｒｅｖｉｃ，
Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，４９４０）に、ａｄｗ型のＤ
ＮＡ配列を配列番号３（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，１
９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，
１７４７）に、上記ＨＢｃ抗原のＤＮＡ配列を配列番号
５に、上記Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原のＤＮＡ配列を配
列番号７に、上記Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３領域抗原のＤ
ＮＡ配列を配列番号９に、上記Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ４
領域抗原のＤＮＡ配列を配列番号１１に、それぞれ示
す。

【０００９】上記ウイルス抗原の遺伝子としては、感染
患者の血液、患部組織等から、ウイルスゲノムＤＮＡや
ＲＮＡを抽出することによって、ＤＮＡライブラリー作
製し、ＰＣＲ等の通常の遺伝子工学的手法を用いてクロ
ーン化することが可能である。

【００１０】上記ウイルス抗原の分子量が小さい場合
は、これをコードする遺伝子を化学的なＤＮＡ合成、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成のいずれかとＰＣ
Ｒを併用することによって、人工的にウイルス抗原遺伝
子を作製することも可能である。例えば、Ｂ型肝炎ウイ
ルス表面抗原や、Ｃ型抗原コアタンパク質は、それぞれ
約２５０及び約１６０アミノ酸からなる分子量が比較的
小さいタンパク質であるので、これをコードする遺伝子
は上記ＤＮＡ合成等によって人工的に作製することも可
能である。

【００１１】上記シャペロンは、熱ショックタンパク質
の一種であり、細胞が温度変化等の様々な環境ストレス
にさらされた際に生産されるものであり、ＡＴＰ存在
下、タンパク質の折り畳みや安定化に関与することが知
られている。上記シャペロンとしては、バクテリア型の
ＧｒｏｕｐＩ型、並びに、真核生物及び古細菌型のＧｒ
ｏｕｐＩＩ型シャペロンが知れられているが、Ｇｒｏｕ
ｐＩ型シャペロンであるＧｒｏＥＬは別の因子であるＧ
ｒｏＥＳの助けを必要とする。一方、ＧｒｏｕｐＩＩ型
のなかでも古細菌由来のシャペロンは、ＧｒｏＥＳ分子
がなくとも充分にその機能を発現することができる（Ｆ
ｕｒｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２８３９９−２８４０７）た
め、古細菌由来のものを用いることが好ましい。

【００１２】上記古細菌としては、例えば、スルホロバ
ス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルホロコッカス
（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロディクテ
ィム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サーモフィラス
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュラム（Ｐｙ
ｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙ
ｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎ
ｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａ
ｒｃｉｎａ）属由来のものが使用できる。

【００１３】上記シャペロン遺伝子を調製する方法とし
ては、上記ウイルス抗原遺伝子の調製方法として例示し
た方法等が挙げられる。例えば、上記古細菌由来のシャ
ペロン遺伝子としてメタノコッカス・サーモリソトロフ
ィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌ
ｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：ＡＴＣＣ３５０９７）由
来のものを使用する場合、配列表の配列番号１３として
記載したＤＮＡ塩基配列を利用することができる（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，１９９８，２７３，２８３９９）。

【００１４】上記古細菌メタノコッカス・サーモリソト
ロフィカスについては、また、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ―１６４３８として
寄託されているプラスミドｐＥＴＴＳＩを鋳型として、
適当な制限酵素サイトを含むように一部の塩基配列を合
成してＰＣＲ用プライマーを作製し、それを用いたＰＣ
Ｒ法によって、メタノコッカス・サーモリソトロフィカ
ス由来シャペロン遺伝子を得ることもできる。

【００１５】上記宿主としては、大腸菌等の細菌及び酵
母；ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞等
が挙げられる。培養日数が短い点及び培養操作が簡便な
点並びに大量に調製可能である点から、細菌及び酵母が
好ましい。

【００１６】本発明は、上記ウイルス抗原遺伝子を、上
記シャペロン遺伝子とともに宿主中で共発現させる。本
明細書中において、共発現とは２種以上の遺伝子を宿主
中で発現させることを意味する。

【００１７】本発明において、上記ウイルス抗原遺伝子
及び上記シャペロン遺伝子は、それぞれ共存可能な別々
のベクターに挿入して、２種のプラスミドを作製する。
次いで、２種のプラスミドで上記宿主を形質転換する。
２種のプラスミドが組み込まれた形質転換体は、上記ベ
クターに予め互いに異なる任意の薬剤耐性遺伝子が導入
されたものを使用し、その薬剤存在下で培養することに
よって、２種の薬剤耐性遺伝子がともに発現したものを
選択することができる。

【００１８】上記宿主として大腸菌を使用する場合、例
えば、クローン化したウイルス抗原遺伝子をｐＢＲ系の
Ｔ７プロモーター等を有する発現ベクターに挿入してウ
イルス抗原用発現プラスミドを作製し、一方、ｐＢＲ系
ベクターと共存可能であるｐＡＣＹＣベクター等に、Ｔ
７プロモーター、ターミネーター等とともにシャペロン
遺伝子を導入する。ウイルス抗原遺伝子発現プラスミド
とシャペロン遺伝子発現プラスミドに、互いに異なる任
意の薬剤耐性遺伝子を導入することによって、２つの発
現プラスミドを大腸菌内で維持させることが可能とな
る。

【００１９】上記ウイルス抗原遺伝子及び上記シャペロ
ン遺伝子は、１種類のベクター中に挿入してプラスミド
を作製し、上記宿主を形質転換することによって、共発
現させることも可能である。本発明においては、通常１
プロモーター１遺伝子が原則である点、及び、ウイルス
抗原を挿入したプラスミドを種々変えるだけで種々のウ
イルス抗原の発現に使用することができ汎用性が高い点
から、上記ウイルス抗原遺伝子及び上記シャペロン遺伝
子は別々のベクター中に挿入する方法が好ましい。

【００２０】上記シャペロン遺伝子以外にも、ジスルフ
ィド結合の形成・交換、プロリン残基の異性化等はタン
パク質折り畳みにおける重要なステップであるため、こ
れらを触媒する生体内因子であるプロティンジスルフィ
ドイソメラーゼ遺伝子、チオレドキシン遺伝子；ペプチ
ジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子等を更に
共発現させることも有効である。

【００２１】上記ウイルス抗原遺伝子及び上記シャペロ
ン遺伝子が上記宿主中で共発現していることは、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いそれらの遺伝
子産物の分子量を測定することにより確認することがで
きる。また、ウイルス抗原及びシャペロンの各活性測定
によっても確認することができる。

【００２２】上記シャペロンの活性測定法としては、シ
ャペロンはＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌａｎｚｅ
ｔｔａ Ｐ．Ａ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１００
号、９５〜９７頁記載のＡＴＰアーゼ活性測定法を用い
ることにより行うことができる。

【００２３】上記ウイルス抗原の活性測定法としては特
に限定されず、例えば、天然型ウイルス抗原に対するポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、そ
れらを使った酵素免疫測定法（ＥＩＡ）やＲＩＡ等によ
り行うことができる。上記ウイルス抗原の活性測定法に
は、市販の分析キット等を利用することも可能である。

【００２４】上記ウイルス抗原の精製法としては特に限
定されず、例えば、硫安分画、ゲル濾過カラムクロマト
グラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等の
常法により行うことができる。

【００２５】上記ウイルス抗原遺伝子の発現において
は、発現されたウイルス抗原タンパク質の精製法を簡略
化するために、ヒスチジンタッグをＮ末端若しくはＣ末
端に付加させて発現させ、ニッケルキレートクロマトグ
ラフィーによって精製することもできる。また、上記ウ
イルス抗原をグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）等との融合タンパク質として発現させ、抗ＧＳＴ抗
体が担持された担体を用いるアフィニィティクロマトグ
ラフィーによって容易に精製することも可能である。更
に、大腸菌を宿主とする場合、ウイルス抗原タンパク質
のＮ末端から１０アミノ酸程度のコドンを大腸菌型にす
ることによって、ウイルス抗原遺伝子の発現量を増大さ
せることも可能である。

【００２６】本発明の組み換え型ウイルス抗原の調製法
は、高い抗原活性を有するウイルス抗原を大量かつ簡便
に得ることができるものである。一般的に、大腸菌内で
比較的疎水性アミノ酸に富む領域を含むタンパク質を生
産させるとしばしば不溶性となり、封入体を形成する。
これは、発現したタンパク質の折り畳みがうまくいって
いないことが原因であると考えられる。そのため、本発
明では、ポリペプチドの折り畳み中間体と一旦結合し、
ＡＴＰの加水分解とともにこれを遊離させることによっ
て不可逆的凝集を防ぐ作用を有するシャペロンとの共発
現系を利用するものであると考えられる。即ち、本発明
は、ウイルス抗原遺伝子とシャペロン遺伝子を共発現さ
せることによって、特に細菌、酵母内で可溶性画分に免
疫学的に高活性なウイルス抗原タンパク質を多量に生産
させることができる。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。実施例１は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｈ
Ｂｓ）をコードする遺伝子と古細菌メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来シャ
ペロン遺伝子とを共発現させることによって、Ｂ型肝炎
ウイルス粒子を得る方法である。

【００２８】参考例１ メタノコッカス・サーモリソト
ロフィカス由来シャペロン遺伝子を有する発現ベクター
の構築 メタノコッカス・サーモリソトロフィカス (Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｓ）のシャペロンをコードする遺伝子を、工業技
術院生命工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６４３８と
して寄託されている大腸菌からプラスミドを回収しこれ
を鋳型として配列番号１５のフォワードプライマー及び
配列番号１６のリバースプライマーを用いるＰＣＲによ
って増幅させた。増幅断片をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで
消化した後、これを同じ制限酵素処理が施されたｐＥＴ
−１１ｄ（ストラタジェン社）にライゲーションした。
このように構築された発現ベクターｐＥＴＴＳを大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした
後、コロニーを得た。コロニーをＬＢ培地（トリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、アンピシリン
１００ｍｇ／ＬｐＨ７．８にて培養しｐＥＴＴＳを回収
した。回収されたｐＥＴＴＳをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲ
Ｖで切断し、ｐＥＴＴＳのプローモーターからターミネ
ーター領域を含む断片を電気泳動によって回収した。回
収された断片をＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＶ処理されたｐＡ
ＣＹＣベクター（ニッポンジーン社製）にＳｐｈＩ／Ｂ
ｇｌＩＩリンカーである配列番号１７及び１８を介して
ライゲーションし、古細菌由来シャペロン遺伝子を含む
共発現ベクターｐＡＴＣＰＮを構築した。

【００２９】実施例１ ＨＢｓ遺伝子及びシャペロン遺伝子の大腸菌での共発現
による組み換え型ＨＢｓ抗原の調製 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、Ｂ型肝炎陽性患者由来
のａｄｒ型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子
をＴ７プローモーター下に保持した発現ベクターｐＴＨ
Ｂｓ（アンピシリン耐性を有する）と、ｐＡＣＹＣベク
ター内にＴ７プロモーター、メタノコッカス・サーモリ
ソトロフィカス由来シャペロン遺伝子及びターミネータ
ーを有する参考例１で得られた発現ベクターｐＡＴＣＰ
Ｎ（クロラムフェニコール耐性を有する）で形質転換し
た後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラム
フェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ（酵母
エキス５ｇ、バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／
Ｌ、ｐＨ７．８）にまき、３７℃で一昼夜培養した。

【００３０】生育してきたコロニー１０個を２ＸＬＢ
（酵母エキス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣ
ｌ５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ及びクロラムフェニコ
ール２５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）で、３５℃で培養し
た。培養液のＯＤが０．８５に到達した時点でＩＰＴＧ
を１ｍＭ添加し、更に１０時間培養した後、遠心分離に
よって菌体を回収した。菌体を超音波破砕後、遠心分離
によって上清を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動によってタンパク質の発現を確認した結果、ＨＢ
ｓ抗原タンパク質に相当する２５ｋＤａのバンドとメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来シャペロンに
相当する５９ｋＤａのバンドが発現タンパク質として検
出された。

【００３１】得られた発現タンパク質を含む上清を５０
℃で３０分間加熱処理し、大腸菌由来夾雑タンパク質を
沈殿させた。遠心分離によって上清を回収後、これに４
０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分
離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝
液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分
子量１０００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍＬに
まで濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ
化ナトリウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷ
ＸＬ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。分離開始
後、保持時間が６．９分であるフラクションを回収し、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析した結果、
２５ｋＤａのＨＢｓタンパク質であることが判明した。
これは、ＨＢｓ蛋白質が粒子構造を形成していることを
示す。

【００３２】得られた組み換え型ＨＢｓ抗原０．１５μ
ｇに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で
希釈した後、更にヒト管理血清Ｌ−コンセーラＮ「ニッ
スイ」（日水製薬）で０．０１５μｇ／ｍＬにまで希釈
した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキ
ット、エンザイグノスト−ＨＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノスティック社
製）によって評価した。結果を表１に示す。

【００３３】比較例１ ヒト陽性血漿より、塩化セシウム溶液及ショ糖溶液によ
る密度勾配法により小球状粒子抗原を回収し、更にゲル
濾過法により精製した。ゲル濾過のクロマトグラムを図
１に示す。得られたＨＢｓ抗原を、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）／０．２ＭＮａＣｌを用い
て２ｍｇ／ｍＬになるように調製した。また、この抗原
液を実施例１と同様の方法で、組み換え体と同一濃度で
ＥＩＡによって抗原性を評価した。結果を表１に示す。

【００３４】比較例２ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、Ｂ型肝炎陽性患者由来
のａｄｒ型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子
をＴ７プローモーター下に保持した発現ベクターｐＴＨ
Ｂｓ（アンピシリン耐性を有する）のみで形質転換した
後、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ
培地にまき、３７℃で一昼夜培養した。

【００３５】生育してきたコロニー１０個を２ＸＬＢ培
地で、３５℃で培養した。培養液のＯＤが０．８５に到
達した時点でＩＰＴＧを１ｍＭ添加し、更に１０時間培
養した後、遠心分離によって菌体を回収した。菌体を超
音波破砕後、遠心分離によって上清を回収し、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動によってタンパク質の発現
を確認した結果、ＨＢｓ抗原蛋白に相当する２５ｋＤａ
のバンドが発現タンパク質タンパク質として検出され
た。

【００３６】得られた発現タンパク質を含む上清を５０
℃で３０分間加熱処理し、大腸菌由来夾雑タンパク質を
沈殿させた。遠心分離によって上清を回収後、これに４
０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分
離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝
液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分
子量１００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍＬにま
で濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ化
ナトリウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ
６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。分離開始後、
各フラクションをＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析した結果、ＨＢｓ抗原は１０．８分にピーク
を持つフラクションにわずかに存在した。このことは、
可溶性画分に生産されたＨｂｓ抗原の量は少なく、また
それは粒子形成しておらず、単量体であることを示す。
回収されたＨＢｓ抗原の抗原性を実施例１の方法と同様
の方法で同一濃度でＥＩＡによって評価した。

【００３７】

【表１】

【００３８】実施例２ 配列表の配列番号１９に示された、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原
をコードする２本鎖合成遺伝子（６９７ｂｐ、アミノ酸
配列を配列番号２０に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ
で消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモー
ターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢｓ遺伝
子発現ベクターｐＴＳＨＢｓを構築した。大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）をｐＴＳＨＢｓ及び参考例１で調製したｐ
ＡＴＣＰＮで形質転換した後、アンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃で一昼夜培養し
た。

【００３９】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、
３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８５に到
達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに１０時
間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白
質の発現を確認した結果、約２５ｋＤａのＨＢｓ蛋白質
に相当するバンドとメサノコッカス・サーモリソトロフ
ィカス由来シャペロンに相当する約６０ｋＤａのバンド
が発現蛋白として検出された。

【００４０】得られた発現蛋白を含む上清を５０℃で３
０分間加熱処理し、大腸菌由来共雑タンパク質を沈殿さ
せた。遠心分離によって上清を回収後、これに４０％飽
和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分離後、
沈殿を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分子
量１０００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍｌにま
で濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ化
ナトリウム／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷ
ＸＬ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。分離開始
後、リテンションタイムが６．８分のフラクションを回
収しＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析した結
果、２５ｋＤａのＨＢｓタンパク質であることが判明し
た。これは、ＨＢｓ蛋白質が粒子構造を形成しているこ
とを示す。

【００４１】回収された組み換え型ＨＢｓ抗原を０．１
５μｇに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラＮ「ニ
ッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／ｍｌに
まで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原測定用
ＥＩＡキット、エンザイグノスト−ＨＢｓＡｇｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノスティ
ック社製）によって評価した。結果を表２に示す。

【００４２】実施例３ 配列表の配列番号２２に示された、ＨＢｃ（Ｂ型肝炎ウ
ィルスコア蛋白）抗原をコードする２本鎖合成ＤＮＡ
（５６８ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号２３に示す）を
ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理
が施されたＴ７プロモーターを保持する発現ベクターに
導入し、ＨＢｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＢｃを構築し
た。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＴＨＢｃ及び参考例
１で調製したｐＡＴＣＰＮで形質転換した後、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃
で一昼夜培養した。

【００４３】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、
３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８５に到
達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに１０時
間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白
質の発現を確認した結果、約２１ｋＤａのＨＢｃ蛋白質
に相当するバンドとメサノコッカス・サーモリソトロフ
ィカス由来シャペロンに相当する約６０ｋＤａのバンド
が発現蛋白として検出された。

【００４４】菌体を超音波処理で破砕後、上清を回収
し、４０％飽和の硫酸アンモニウムを添加し、塩析し
た。遠心分離後、沈殿を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析
内液を分画分子量１０００００の限外濾過によって１０
ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／
０．０１％アジ化ナトリウム／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−
ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅ
ｌＧ４０００ＳＷＸＬ（トーソー社）によるゲル濾過に
よって流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行
った。分離開始後、リテンションタイム（保持時間）が
６．９分に均一なピークを示すフラクションを回収し、
ＳＤＳーポリアクリルアミド電気泳動で分析した結果、
約２１ｋＤａのＨＢｃ蛋白質であることが判明した。こ
れはＨＢｃ蛋白質が粒子構造を形成していることを示
す。

【００４５】精製されたＨＢｃ粒子は、ＥＬＩＳＡによ
って評価した。９６穴マイクロタイタープレートに抗Ｈ
Ｂｃポリクローナル抗体（カルテット社製）をコート
し、次ぎに牛血清アルブミンでコートした後、５０ｍＭ
Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した
後、さらに標準血清で０．０２５μｇ／ｍｌにまで希釈
した精製ＨＢｃ粒子を反応させた。洗浄操作後、これに
常法によってパーオキシダーゼ標識した抗ＨＢｃモノク
ローナル抗体（ケミコン社製）を作用させた。洗浄後、
これに発色基質としてＡＢＴＳ（アジノジエチルベンゾ
チアゾリンスルホン酸）を加え、発色させた後、４０５
ｎｍの吸収を測定した。結果を表３に示す。

【００４６】実施例４ 配列表の配列番号２３に示された、ＨＣＶｃ（Ｃ型肝炎
ウィルスコア蛋白）抗原をコードする２本鎖合成ＤＮＡ
（５９０ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号２４に示す）を
ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理
が施されたＴ７プロモーターを保持する発現ベクターに
導入し、ＨＣＶｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶｃを構
築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＴＨＣＶｃ及び
参考例１で調製したｐＡＴＣＰＮで形質転換した後、ア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコ
ール（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、３
７℃で一昼夜培養した。

【００４７】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、
３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８５に到
達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに１０時
間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白
質の発現を確認した結果、約２１ｋＤａのＨＣＶｃ蛋白
質に相当するバンドとメサノコッカス・サーモリソトロ
フィカス由来シャペロンに相当する約６０ｋＤａのバン
ドが発現蛋白として検出された。

【００４８】菌体を超音波処理で破砕後、上清を回収
し、４０％飽和の硫酸アンモニウムを添加し、塩析し
た。。遠心分離によって上清を回収後、これに４０％飽
和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分離後、
沈殿を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分子
量１０００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍｌにま
で濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ化
ナトリウム／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ ６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００Ｓ
ＷＸＬ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。分離開始
後、リテンションタイム（保持時間）が６．９分に均一
なピークを示すフラクションを回収し、ＳＤＳーポリア
クリルアミド電気泳動で分析した結果、約２１ｋＤａの
ＨＣＶコア蛋白質であることが判明した。これはＨＣＶ
コア蛋白質が粒子構造を形成していることを示す。

【００４９】精製されたＨＣＶコア粒子を９６穴マイク
ロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミン
でブロッキングを施し、ＰＢＳーＴ緩衝液（１０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウム／０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次にＰＢＳー
Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性あるいは陰性血清を加え反
応させた。ＰＢＳーＴ緩衝液で洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（バイオジェネシス社製）を作用
させた。反応終了後、ＰＢＳーＴ緩衝液で４回洗浄し、
基質発色液（フェニレンジアミン及び過酸化水素を含
む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止
めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。結果を表
４に示す。

【００５０】比較例３ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ａｄｒ型合成ＨＢｓ遺
伝子をＴ７プローモーター下に保持した発現ベクターｐ
ＴＳＨＢｓ（アンピシリン耐性を有する）のみで形質転
換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有す
るＬＢ（酵母エキス５ｇ、バクトトリプトン１０ｇ、Ｎ
ａＣｌ５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）にまき、３７℃で一昼夜
培養した。生育してきたコロニー１０個を２ＸＬＢ（酵
母エキス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ５
ｇ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）で、３
５℃で培養した。培養液のＯＤが０．８５に到達した時
点でＩＰＴＧを１ｍＭ添加し、さらに１０時間培養した
後、遠心分離によって菌体を回収した。菌体を超音波破
砕後、遠心分離によって上清を回収し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動によってタンパク質の発現を確認
した結果ＨＢｓ抗原蛋白に相当する２５ｋＤａのバンド
が発現蛋白として検出された。

【００５１】得られた発現蛋白を含む上清を５０℃で３
０分間加熱処理し、大腸菌由来共雑タンパク質を沈殿さ
せた。遠心分離によって上清を回収後、これに４０％飽
和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分離後、
沈殿を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分子
量１００００の限外濾過によって濃縮した後、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％アジ化ナトリウム／５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）を展開液と
してＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬ（トーソー社）に
よるゲル濾過によって流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでタンパ
ク質の分離を行った。各フラクションのＳＤＳーＰＡＧ
Ｅ分析の結果ＨＢｓ抗原はリテンションタイムが１０．
８分のピークにわずかに存在した。このことは、可溶性
画分に生産されたＨＢｓ抗原の量は少なく、それは粒子
形成しておらず、単量体であることを示す。また、この
抗原液を実施例１と同様の方法で、組み換え体と同一濃
度でＥＩＡによって抗原性を評価した。結果を表２に示
す。

【００５２】

【表２】

【００５３】比較例４ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＢｃのみで形質転
換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のみを含
有するＬＢプレートにまき３７℃で一昼夜培養した。生
育してきたコロニー１０個をアンピシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、３５℃で培
養した。培養液のＯＤ６５０が０．８５に到達した時点
で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに１０時間培養し
た。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白質の発現
を確認した結果、約２１ｋＤａのＨＢｃ蛋白質に相当す
るバンドのみが発現蛋白として大量に検出された。

【００５４】菌体を超音波処理で破砕後、遠心分離によ
って上清を回収し、上清に４０％飽和硫安を添加し、塩
析した。遠心分離後、沈殿を回収し、５０ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。
透析内液を分画分子量１００００の限外濾過によって濃
縮した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％アジ化ナ
トリウム／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ
６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。各フラクショ
ンのＳＤＳーＰＡＧＥ分析の結果ＨＢｃ抗原はリテンシ
ョンタイムが１１．０分のピークにわずかに存在した。
このことは、可溶性画分に生産されたＨＢｃ抗原の量は
少なく、それは粒子形成しておらず、単量体であること
を示す。また、この単量体様ＨＢｃの抗原性をを実施例
３と同様の方法で同一濃度で表した結果を表３に示す。

【００５５】

【表３】

【００５６】比較例５ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶｃのみで形質
転換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のみを
含有するＬＢプレートにまき３７℃で一昼夜培養した。
生育してきたコロニー１０個をアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、３５℃で
培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８５に到達した時
点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに１０時間培養し
た。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白質の発現
を確認した結果、約２１ｋＤａのＨＣＶｃ蛋白質に相当
するバンドのみが発現蛋白として大量に検出された。

【００５７】菌体を超音波処理で破砕後、遠心分離後に
よって沈殿画分と可溶性画分にわけた。これらの画分を
ＳＤＳーＰＡＧＥによって分析した結果、ＨＣＶコア蛋
白質の大部分は沈殿画分に多量に存在していた。このこ
とと実施例４の結果から、ＨＣＶコア蛋白質はシャペロ
ンの存在下では可溶性画分に粒子構造を形成し、生産さ
れるが、シャペロン非存在下では、不可逆的な凝集体と
して沈殿画分に生産されることがわかった。

【００５８】沈殿画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄した後、
６Ｍグアニィディウム塩酸で変性処理した後、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内
液の抗原性の評価を実施例４と同様の方法、濃度で行っ
た。結果を表４に示す。

【００５９】

【表４】

【００６０】実施例５ 配列２５に示されたＨＣＶ−Ｅ１（Ｃ型肝炎ウィルス表
面抗原Ｅ１蛋白質）をコードする２本鎖合成遺伝子（５
９１ｂｐ、アミノ酸配列番号を配列番号２６に示す）を
ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化後、同様の制限酵素処
理が施されたＴ７プロモーターを保持する発現ベクター
に導入し、ＨＣＶ−Ｅ１遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶ
Ｅ１を構築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨ
ＣＶＥ１及び参考例１で調製したｐＡＴＣＰＮで形質転
換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びク
ロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレ
ートにまき、３７℃で一昼夜培養した。

【００６１】生育してきたコロニー１０個をカルベニシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、
３５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４から
１．０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さ
らに１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって
菌体を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって蛋白質の発現を確認した結果２１ｋＤａのＨ
ＣＶ−Ｅ１蛋白質に相当するバンドとメタノコッカス・
サーモリソトロフィカスシャペロンに相当する約６０ｋ
Ｄａのバンドが発現蛋白質として検出された。

【００６２】菌体を超音波処理で破砕後、上清を回収
し、４０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。
遠心分離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。遠心分離後、沈殿
を除去し、０．１５ＭＮａＣｌ０．０１％アジ化ナトリ
ウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．
８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカ
ラム（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１ｍｌ
／ｍｉｎで蛋白質を分離した。分離開始後、保持時間が
７．２分に均一なピークを示すフラクションを回収し、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結
果、約２１ｋＤａのＨＣＶ−Ｅ１蛋白質であることが判
明した。これはＨＣＶコア蛋白質が均一な粒子構造を形
成していことを示す。精製されたＨＣＶ−Ｅ１粒子と実
施例４で調製されたＨＣＶコア粒子を蛋白質量で等量ず
つ９６穴マイクロタイタープレートにコートした後、牛
血清アルブミンでブロッキングを施し、実施例４と同一
の方法でヒト陽性血清で抗原性の評価を行った。結果を
表５に示す。

【００６３】比較例６ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶＥ１のみで形
質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）の
みを有するＬＢプレートにまき３７℃で一昼夜培養し
た。生育してきたコロニー１０個をカルベニシリン（１
００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植菌し、３
５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４から１．
０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって蛋白質の発現を確認した結果２１ｋＤａのＨＣＶ
−Ｅ１蛋白質に相当するバンドが発現蛋白質として検出
された。

【００６４】菌体を超音波処理で破砕後、上清を回収
し、４０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。
遠心分離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。遠心分離後、沈殿
を除去し、０．１５ＭＮａＣｌ０．０１％アジ化ナトリ
ウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．
８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカ
ラム（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１ｍｌ
／ｍｉｎで蛋白質を分離した。各フラクションのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した結
果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質は保持時間が１１．８分のピー
クにわずかに存在した。このことは可溶性画分に生産さ
れたＨＣＶ−Ｅ１蛋白質の量は少なく、粒子形成はして
おらず、単量体であることを示す。また、この単量体と
実施例４で調製されたＨＣＶコア粒子ととの等量混合物
の抗原性評価結果を表５に示す。

【００６５】

【表５】

【００６６】実施例６ 配列表の配列番号２７に示したＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ
２４をコードする２本鎖合成遺伝子（７１５ｂｐ、アミ
ノ酸配列を配列番号２８に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロ
モーターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＩＶ
遺伝子発現ベクターｐＴＨＩＶを構築した。大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）株を、発現ベクターｐＴＨＩＶ（アンピ
シリン耐性を有する）と、ｐＡＣＹＣベクター内にＴ７
プロモーター、メタノコッカス・サーモリソトロフィカ
ス由来シャペロン及びターミネーターを有する参考例１
で調製した発現ベクターｐＡＴＣＰＮ（クロラムフェニ
コール耐性を有する）で形質転換した後、アンピシリン
（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２５
μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ（酵母エキス５ｇ、バクト
トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）に
まき、３７℃で一昼夜培養した。

【００６７】生育してきたコロニー１０個を２ＸＬＢ
（酵母エキス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣ
ｌ５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ及びクロラムフェニコ
ール２５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）で、３５℃で培養し
た。培養液のＯＤが０．８５に到達した時点でＩＰＴＧ
を１ｍＭ添加し、更に１０時間培養した後、遠心分離に
よって菌体を回収した。菌体を超音波破砕後、遠心分離
によって上清を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動によってタンパク質の発現を確認した結果ＨＩＶ
コア抗原蛋白質ｐ２４に相当する２６ｋＤａのバンドと
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来シャペロ
ンに相当する６０ｋＤａのバンドが発現タンパク質とし
て検出された。

【００６８】得られた発現タンパク質を含む上清を５０
℃で３０分間加熱処理し、大腸菌由来夾雑タンパク質を
沈殿させた。遠心分離によって上清を回収後、これに４
０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分
離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝
液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分
子量１０００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍＬに
まで濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ
化ナトリウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷ
ＸＬ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。分離開始
後、リテンションタイム（保持時間）が１２．５分のフ
ラクションを回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で分析した結果、２６ｋＤａのＨＩＶコア抗原蛋白
質ｐ２４であることが判明した。 回収された組み換え
型ＨＩＶ抗原０．１５μｇ／ｍｌを５０ｍＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した後、さらにヒト管理
血清Ｌ−コンセーラＮ「ニッスイ」（日水製薬）でさら
に０．０１５μｇ／ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の
抗原性をＨＩＶ抗原・ＥＩＡキット、ＨＩＶ抗原・ＥＩ
ＡII「アボット」（ダイナボット（株）社製）によって
評価した。また、本実施例のコントロールとして標準血
清についても同様の抗原性評価を行った。

【００６９】比較例７ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＩＶのみで形質転
換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬ
Ｂプレートにまき、３７℃で一昼夜培養した。生育して
きたコロニー１０個を２ＸＬＢ培地で、３５℃で培養し
た。培養液のＯＤが０．８５に到達した時点でＩＰＴＧ
を１ｍＭ添加し、更に１０時間培養した後、遠心分離に
よって菌体を回収した。菌体を超音波破砕後、遠心分離
によって上清を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動によってタンパク質の発現を確認した結果、ＨＩ
Ｖ抗原タンパク質に相当する２６ｋＤａのバンドが発現
タンパク質として検出された。

【００７０】得られた発現タンパク質を含む上清を５０
℃で３０分間加熱処理し、大腸菌由来夾雑タンパク質を
沈殿させた。遠心分離によって上清を回収後、これに４
０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、塩析した。遠心分
離後、沈殿を回収し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝
液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析内液を分画分
子量１００００の限外濾過によって１０ｍｇ／ｍＬにま
で濃縮した後、０．１５ＭＮａＣｌ／０．０１％アジ化
ナトリウム／５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ
６．８）を展開液としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌ（トーソー社）によるゲル濾過によって流速１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎでタンパク質の分離を行った。各フラクショ
ンのＳＤＳーＰＡＧＥ分析の結果ＨＢｓ抗原は保持時間
が１２．５分のピークにわずかに存在した。このこと
は、可溶性画分に生産されたＨＩＶ抗原の量は少ないこ
とを示す。また、この抗原液を実施例６と同様の方法
で、組み換え体と同一濃度でＥＩＡによって抗原性を評
価した。結果を表６に示す。

【００７１】

【表６】

【００７２】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、粒
子形成された高い抗原活性を有する組み換え型ウイルス
抗原を、簡便に調製することができる。

【００７３】

【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. <120> 組み換え型ウイルス抗原の調製法 <130> 99P02401 <150> JP P1998-377105 <151> 1998-12-28 <150> JP P1999-136335 <151> 1999-05-17 <160> 28 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 1 atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc cta aca ata cca cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cag tca cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc cta tgg gag ggg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tca cta 528 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att taa 681 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 2 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 3 atg gag aac atc aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc 192 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct 384 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 caa ggc aac tct aag ttt ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat 432 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca tcg tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta 528 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc 624 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta 672 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 4 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 4 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 5 <211> 558 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..555 <400> 5 atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc 48 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gta cga gat ctc cta gac 96 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc 144 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa 192 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg caa gat cca gca 240 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 tcc aga gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag 288 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga 336 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act 384 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg 432 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga 480 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga 528 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt tag 558 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 6 <211> 185 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 6 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 7 <211> 575 <212> DNA <213> Type C hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..573 <400> 7 atg agc acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac 48 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 cgc cgc cca cag gac gtc aag ttc ccg ggc ggt ggt cag atc gtt ggt 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 gga gtt tac ctg ttg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 act agg aag act tcc gag cgg tcg caa cct cgt gga agg cga caa cct 192 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 atc ccc aag gct cgc cgg ccc gag ggc agg gcc tgg gct cag ccc ggg 240 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 tac cct tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggc tta ggg tgg gca gga tgg 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 ctc ctg tca ccc cgc ggc tcc cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 cgg cgt agg tcg cgt aac ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca tgc 384 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 ggc ttc gcc gac ctc atg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc ttg 432 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 gga ggc gct gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac 480 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 ggc gtg aac tat gca aca ggg aat ctg ccc ggt tgc tct ttc tct atc 528 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 ttc ctc ttg gct ctg ctg tcc tgt ctg acc atc cca gcc tcc gct ta 575 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 8 <211> 191 <212> PRT <213> Type C hepatitis virus <400> 8 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 9 <211> 1893 <212> DNA <213> Type C hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..1893 <400> 9 gcg ccc atc acg gcc tac tcc cag cag aca cgg ggc cta ctt ggc tgc 48 Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 atc atc act agc ctc aca ggc cgg gac aag aac cag gtc gag ggg gag 96 Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu 20 25 30 gtc caa gtg gtt tcc acc gca aca cag tcc ttc ctg gcg acc tgc acc 144 Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Thr 35 40 45 aac ggt gtg tgt tgg act gtc tac cat ggt gcc ggc tcg aag acc cta 192 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 50 55 60 gcc ggt cct aag ggc cca atc acc caa atg tac acc aat gtg gac cag 240 Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 65 70 75 80 gac ctc gtc ggc tgg cag gca ccc tcc ggg gcg cgt tcc ttg aca ccg 288 Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Ser Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro 85 90 95 tgc acc tgc ggc agc tcg gac ctt tac ttg gtc acg agg cat gct gat 336 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp 100 105 110 gtc att ccg gtg cgc cgg cgg ggc gac ggc agg ggg agc ttg ctc tcc 384 Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu Ser 115 120 125 ccc agg ccc gtc tcc tac ttg aag ggc tct tcg ggc ggc cca ctg ctc 432 Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu 130 135 140 tgc ccc tcg ggg cac gcc gtg ggc atc ttc cgg gct gcc gtg tgc acc 480 Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr 145 150 155 160 cgg ggg gtt gcg aag gcg gtg gac ttc ata ccc gtt gag tct atg gaa 528 Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu 165 170 175 acc act atg cgg tct ccg gtc ttc acg gac aac tcg tcc ccc ccg gcc 576 Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala 180 185 190 gta ccg caa aca ttc caa gtg gcc cat cta cac gct ccc act gga agc 624 Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser 195 200 205 ggc aag agt aac aag gtg ccg gtt gaa tat gca gcc caa ggg tac aag 672 Gly Lys Ser Asn Lys Val Pro Val Glu Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys 210 215 220 gta ctt gtc ctg aac cca tcc gtc gcc gcc act tta ggc ttt ggg gcg 720 Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala 225 230 235 240 tat atg tct aaa gca cat ggt gtt gac ccc aac atc aga act ggg gta 768 Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val 245 250 255 agg act atc acc acg ggc gcc cct atc aca tac tcc acc tat ggc aag 816 Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys 260 265 270 ttc ctc gcc gat ggt ggt tgc tct gga ggc gcc tac gac atc ata ata 864 Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile 275 280 285 tgt gat gag tgc cac tcg act gac tcg acc agc atc ttg ggc ata ggc 912 Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly 290 295 300 aca gtc ctg gac caa gcg gag acg gct gga gcg cgg ctt gtc gtg ctc 960 Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu 305 310 315 320 gcc acc gct acg cct ccg gga tcg gtc acc gtg cca cat ccc aat atc 1008 Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile 325 330 335 gag gag gtg gct ctg tcc aac act gga gag atc ccc ttc tac ggc aaa 1056 Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys 340 345 350 gcc atc ccc atc gag acc atc aag ggg ggg agg cat ctc att ttc tgc 1104 Ala Ile Pro Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys 355 360 365 cat tcc aag aag aaa tgt gac gaa ctc gcc gca aag ctg tcg ggt ctc 1152 His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu 370 375 380 gga atc aat gct gta gca tat tac cgg ggt ctt gat gtg tcc gtc ata 1200 Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 385 390 395 400 ccg gcc agc gga gac gtc gtt gtt gtg gca aca gac gct cta atg acg 1248 Pro Ala Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr 405 410 415 ggc ttt acc ggc gac ttt gac tca gtg atc gac tgt aat aca tgt gtc 1296 Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val 420 425 430 acc cag aca gtc gat ttc agc ttg gac cct acc ttc acc att gag aca 1344 Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr 435 440 445 acg acc gtg ccc caa gac gcg gtg tcg cgc tca caa cgg cgg ggc agg 1392 Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg 450 455 460 act ggt agg ggc agg gca ggc atc tac agg ttc gtg act cca gga gaa 1440 Thr Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu 465 470 475 480 cgg ccc tcg ggc atg ttc gat tcc tcg gtc ctg tgc gag tgc tat gac 1488 Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp 485 490 495 gcg ggc tgt gct tgg tat gag ctc acg ccc gcc gag acc tcg gtt agg 1536 Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg 500 505 510 ttg cgg gct tac cta aat aca cca ggg ttg ccc gtt tgg cag gac cat 1584 Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Trp Gln Asp His 515 520 525 ctg gag ttc tgg gag agc gtc ttt aca ggc ctc act cac ata gat gcc 1632 Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala 530 535 540 cat ttc ctg tcc caa act aag cag gca gga gac aac ttc cca tac ctg 1680 His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu 545 550 555 560 gta gca tac cag gct acg gtg tgc gcc agg gct cag gct cca cct cca 1728 Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro 565 570 575 tcg tgg gat caa atg tgg aag tgt ctc ata cgg cta aag cct acg ctg 1776 Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu 580 585 590 cat ggg cca aca ccc ctg ctg tat agg cta gga gcc gtc caa aac gag 1824 His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu 595 600 605 gtc atc ctc aca cac ccc ata acc aaa tac atc atg gca tgc atg tcg 1872 Val Ile Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met Ser 610 615 620 gct gac ctg gag gtc gtt acg 1893 Ala Asp Leu Glu Val Val Thr 625 630 ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ ６３１ ＜２１２＞ ＰＲＴ <400> 10 Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu 20 25 30 Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Thr 35 40 45 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 50 55 60 Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 65 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Ser Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro 85 90 95 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp 100 105 110 Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu Ser 115 120 125 Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu 130 135 140 Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr 145 150 155 160 Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu 165 170 175 Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala 180 185 190 Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser 195 200 205 Gly Lys Ser Asn Lys Val Pro Val Glu Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys 210 215 220 Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala 225 230 235 240 Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val 245 250 255 Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys 260 265 270 Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile 275 280 285 Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly 290 295 300 Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu 305 310 315 320 Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile 325 330 335 Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys 340 345 350 Ala Ile Pro Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys 355 360 365 His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu 370 375 380 Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 385 390 395 400 Pro Ala Ser Gly Asp Val Val Val Val 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220 gta tac att taa tag ggatccgg 697 Val Tyr Ile 225 <210> 20 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 21 <211> 568 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(560) <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＢｃ抗原をコードする２本鎖合成ＤＮＡ <400> 21 ggcat atg gac atc gac ccg tac aaa gaa ttc ggt gct tct gtt gaa ctg 50 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu 1 5 10 15 ctg tct ttt ctg cct tct gac ttc ttt cct tct att cgt gat ctc ctc 98 Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu 20 25 30 gac acc gcc tct gct ctg tat cgt gag gcc ctc gag tct ccg gaa cat 146 Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His 35 40 45 tgc tct cct cac cat aca gca ctc cgt caa gct atc ctg tgc tgg ggt 194 Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly 50 55 60 gag ctg atg aat ctg gcc acc tgg gtg ggt agc aat ctg gaa gac cca 242 Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro 65 70 75 gca tcc agc gaa ctt gta gtc agc tat gtc aat gtt aat atg ggc ctg 290 Ala Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu 80 85 90 95 aaa atc cgt caa ctg ctg tgg ttt cac att tcc tgc ctt act ttt ggc 338 Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly 100 105 110 cgt gaa act gtt ctt gag tat ctg gtg tct ttt ggt gtg tgg att cgc 386 Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg 115 120 125 act cct ccg gct tac cgt cca cca aat gcc cct atc ctg tct aca ctt 434 Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu 130 135 140 ccg gaa act act gtt gtt cgt cgt cgt ggc cgt tcc cct cgt cgc cgt 482 Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg 145 150 155 act ccg tct cct cgc cgt cgt cgt tct caa tct ccg cgt cgc cgt cgc 530 Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg 160 165 170 175 tct caa tct cgt gaa tct caa tgc taa tag ggatccgg 568 Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 22 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 22 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 23 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶｃ抗原をコードする２本鎖合成ＤＮＡ <220> <221> CDS <222> (6)..(590) <400> 23 ggcat atg tct act aac ccg aaa ccg cag cgt aaa act aaa cgt aac act 50 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 1 5 10 15 aac cgt cgc cca cag gac gtc aag ttc cct ggt ggt ggt cag atc gtt 98 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 ggt ggc gtt tac ctg ctt cca cgc cgt ggc cca cgt ctg ggt gtg cgt 146 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 gcg act cgt aag act tcc gag cgc tct caa cct cgt ggt cgt cgt caa 194 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 cct atc ccg aag gct cgt cgt cca gag ggt cgt gcc tgg gct cag cca 242 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 ggt tac cct tgg cca ctc tat ggc aat gag ggc atg ggt tgg gca ggt 290 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 80 85 90 95 tgg ctc ctg tct cca cgc ggt tcc cgt cct agc tgg ggt ccg act gac 338 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 cca cgt cgt cgc tct cgt aac ctg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca 386 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 tgc ggc ttc gcc gac ctc atg ggt tac att ccg ctc gtc ggt gcc cca 434 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro 130 135 140 ctg ggt ggt gct gcc cgt gcc ctg gcg cat ggc gtc cgt gtt ctg gaa 482 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 145 150 155 gac ggc gtg aac tat gca aca ggt aat ctg cca ggt tgc tct ttc tct 530 Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser 160 165 170 175 atc ttc ctc ctg gct ctg ctg tcc tgc ctg acc atc cca gcc tcc gct 578 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 taa tag gga tcc gg 592 <210> 24 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 24 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 25 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(582) <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶ−Ｅ１をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 25 cat atg tat gag gtg cgc aac gcg tcc ggg gtg tac cat gtc acg aac 48 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn 1 5 10 15 gac tgc tct aac gca agc att gtg tat gag gca gcg gac atg atc atg 96 Asp Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met 20 25 30 cat acc ccc ggg tgt gtg ccc tgc gtt cgg gag gcc aat tcc tcc cgc 144 His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg 35 40 45 tgc tgg gta gcg ctc act ccc acg ctc gcg gcc agg aac tcc agc gtc 192 Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val 50 55 60 cca act acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct 240 Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala 65 70 75 gct ttc tgc tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc tgc gga tct gtt ttc 288 Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe 80 85 90 95 ctc gtc tcc cag ctg ttc acc ttc tcg cct cgc cgg cat gag acg gta 336 Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 100 105 110 cag gac tgc aat tgt tca atc tat ccc ggc cac gta tca ggt cac cgc 384 Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg 115 120 125 atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tca cct aca aca gcc cta gtg 432 Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 130 135 140 gta tcg cag cta ctc cgg atc cca caa gct gtc atg gac atg gtg gcg 480 Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala 145 150 155 ggg gcc cac tgg gga gtc ctg gcg ggc ctt gcc tac tat tcc atg gtg 528 Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val 160 165 170 175 ggg aac tgg gct aag gtc ttg att gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtt 576 Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val 180 185 190 gac ggg taataggaat tc 594 Asp Gly <210> 26 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 26 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 1 5 10 15 Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His 20 25 30 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg Cys 35 40 45 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val Pro 50 55 60 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 85 90 95 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln 100 105 110 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 115 120 125 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 130 135 140 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly 145 150 155 160 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 165 170 175 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 180 185 190 Gly <210> 27 <211> 715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(701) <223> 配列表フリーテキスト ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 27 ggcat atg ccg ata gtg cag aac tta cag ggg caa atg gta cat cag gcc 50 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala 1 5 10 15 atc tca cct aga act tta aat gca tgg gtt aaa gta ata gag gag aag 98 Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys 20 25 30 gct ttc agc cca gaa gta ata ccc atg ttt tca gca tta tca gaa gga 146 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 35 40 45 gcc acc cca caa gat tta aac acc atg cta aac aca gtg ggg gga cat 194 Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His 50 55 60 cag gca gct atg cag atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa gct gca 242 Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala 65 70 75 gaa tgg gat aga tta cat cca gcg cat gca ggg ccc aat gca cca ggc 290 Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly 80 85 90 95 cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga act act agt acc 338 Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr 100 105 110 ctt cag gaa cag ata gga tgg atg aca agt aat cca cct gta cca gta 386 Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val 115 120 125 gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg ggg tta aat aaa ata gta 434 Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val 130 135 140 aga atg tat agt cct gtc agc att ctg gac ata aga caa gga cca aag 482 Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys 145 150 155 gaa ccc ttt aga gat tat gta gac cgg ttc tat aaa act cta aga gcc 530 Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala 160 165 170 175 gag caa gct tca cag gat gta aaa aat tgg atg aca gaa acc ttg ttg 578 Glu Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu 180 185 190 gtc caa aat gca aac cca gat tgt aag act att tta aaa gca ttg gga 626 Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly 195 200 205 cca gca gct aca tta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag gga gtg gga 674 Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly 210 215 220 gga ccc agc cat aag gca aga att ttg taatagggat ccgg 715 Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230 <210> 28 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 28 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala 20 25 30 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 50 55 60 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu 65 70 75 80 Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val Gly 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230

【図面の簡単な説明】

【図１】比較例１における、天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 東儀 彰子 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 井手野 晃 岩手県釜石市平田第３地割75番１ 株式会 社海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究 所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルス抗原遺伝子を、シャペロン遺伝
   子とともに宿主中で共発現させることを特徴とする組み
   換え型ウイルス抗原の調製方法。
2. 【請求項２】 宿主は、細菌又は酵母である請求項１記
   載の組み換え型ウイルス抗原の調製方法。
3. 【請求項３】 シャペロン遺伝子は、古細菌ゲノムから
   クローン化されたものである請求項１又は２記載の組み
   換え型ウイルス抗原の調製方法。
4. 【請求項４】 ウイルス抗原遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイル
   ス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原又はエイズウイルス抗原
   をコードする遺伝子である請求項１、２又は３記載の組
   み換え型ウイルス抗原の調製方法。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３又は４記載の組み換え
   型ウイルス抗原の調製法により得られたウイルス抗原。