KR20180087431A - 트랜스글루타미나제 인식 부위를 갖는 fkbp 도메인 - Google Patents

트랜스글루타미나제 인식 부위를 갖는 fkbp 도메인 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FKBP 폴리펩티드의 FKBP 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질에 관한 것으로서, 여기서 이의 "인서트-인-플랩" (IF) 도메인은 적어도 부분적으로, 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1)의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5 내지 20개 아미노산의 아미노산 서열 ("Q-태그")에 의해 치환되고, 상기 TG 기질은 쿠트츠네리아 알비다(Kutzneria albida) TG의 TG 기능을 위한 기질이다. 본 발명은 뿐만 아니라 상기 기질의 용도에 관한 것이다.

Description

트랜스글루타미나제 인식 부위를 갖는 FKBP 도메인
본 발명은 FKBP 폴리펩티드의 FKBP 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질에 관한 것으로서, 이의 "인서트-인-플랩 (insert-in-flap)" (IF) 도메인이 적어도 부분적으로, 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1), 특히 이 펩티드 서열의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5 내지 20개 아미노산의 아미노산 서열 ("Q-태그")에 의해 치환되며, 상기 TG 기질은 쿠트츠네리아 알비다 (Kutzneria albida) TG (KalbTG)의 TG 기능에 대한 기질이다. 본 발명은 뿐만 아니라 상기 기질의 용도에 관한 것이다.
가용성 및/또는 면역반응성 항원 및 이의 변이체는 시험관 내 진단 검사에 필수적이다. 예로서, 바이러스 외피 단백질 gp41의 재조합 및 가용성 변이체는 HIV-1 감염을 검출하기 위해 사용된다.
면역반응성 항원 및 이의 변이체의 필요한 가용성은 효과적인 어세이의 디자인에서 도전일 수 있지만, 펩티딜 프롤릴 이소머라제 (peptidyl prolyl isomerase) (PPIase) 활성을 갖는 하나 이상의 샤페론 유닛에 융합시켜서 개선시킬 수 있다. 스캐폴드에 의해 디스플레이되는 폴리펩티드 도메인을 조작하기 위해 단백질 스캐폴드를 사용하는 기술이 항체 및 항체 단편 분야에서 공지되어 있다. 따라서, 도메인 예컨대 항체의 항원 결합 영역의 가변 루프는 기지의 표적에 대해 개선된 결합성 (예를 들어, 친화성 및/또는 특이성)을 갖는 아미노산 서열 절편을 생성시키도록 광범위하게 조작되어 왔다 (WO 2014/071978 참조).
FK506 결합 단백질 (FKBP)은 효모에서 인간까지 많은 진핵생물에서 동정되었고 프롤린 잔기를 함유하는 단백질을 위한 단백질 폴딩 샤페론으로서 기능한다. 사이클로필린과 함께, FKBP는 이뮤노필린 패밀리에 속한다. 인간 게놈에는, 그 절편이 강력한 면역억제성 마크롤리드 FK506 또는 라파마이신의 표적인 12 kDa 단백질의 서열과 상당한 상동성을 갖는 코딩되는 15개 단백질이 존재한다. FKBP-12로 알려진, FK506-결합 단백질 (FKBP)의 12 kDa 원형은 풍부한 세포내 단백질이다. FKBP12는 프롤릴 시스/트랜스 입체형태 간 상호전환을 촉매하는 PPIase로서 기능한다. FKBP는 단백질 폴딩, 세포 신호전달, 아폽토시스 및 전사를 포함한, 다양한 세포 기능에 관여한다. 그들은 그들의 표적 단백질과의 직접 결합 및 입체 형태 변경을 통해 그들의 기능을 유발시켜, 분자 스위치로서 작용한다.
박테리아 slyD 유전자는 FKBP-유형 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 (PPIase)를 코딩한다. SlyD는 분자 샤페론, 프롤릴 시스/트랜스 이소머라제, 및 니켈-결합 단백질로서 기능하는 박테리아의 2-도메인 단백질이다. SlyD의 한 도메인에 위치하는 샤페론 기능은 쌍-아르기닌 전좌에 관여하고 2자릿수 만큼 단백질 폴딩에서 프롤릴 시스/트랜스 이소머라제 도메인의 촉매 효율을 증가시킨다.
Schlapschy 및 Skerra (문헌 [Periplasmic chaperones used to enhance functional secretion of proteins in E. coli. Methods Mol Biol. 2011;705:211-24]에서)는 재조합 유전자 생성물의 폴딩을 비롯하여 단백질 응집, 즉 봉입체의 형성에 관한 문제가 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)에서 빈번하게 마주된다고 개시하고 있다. 이것은 항체 단편, 사이토카인, 성장 인자, 및 진핵생물 세포 표면 수용체의 세포외 단편을 포함한, 구조적 디술피드 결합을 보유하는 단백질의 경우에서 특히 사실이다. 그러므로, 그들은 다음의 4개의 확립된 주변세포질 샤페론 및/또는 폴딩 촉매의 과발현을 실행하는 헬퍼 플라스미드 pTUM4를 개발하였다: 디술피드 가교의 형성 및 이성질체화를 촉매하는 티올-디술피드 옥시도리덕타제 DsbA 및 DsbC, 샤페론 활성을 갖는 2종의 펩티딜-프롤릴 시스/트랜스 이소머라제, FkpA 및 SurA.
이. 콜라이 SlyD 및 FKBP12 (야생형 및 돌연변이체 C23A 및 C23S)는 가용성 형태로 고수율로 이. 콜라이에서 재조합적으로 생성될 수 있다 (Standaert, R.F., et al, Nature 346 (1990) 671-674). 호열성 유기체로부터 유래되는 FKBP 및 이. 콜라이 SlyD는 이. 콜라이에서 키메라 폴리펩티드의 재조합 발현 시 샤페론으로서 사용될 수 있다 (Ideno, A., et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99-105). 이. 콜라이 SlyD 및 FKBP12 폴리펩티드는 가역적으로 폴딩되는 폴리펩티드이다 (Scholz, C, et al, J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707). 문헌 [Low C, et al. J. Mol. Biol. 398 (2010) 375-390]은 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus) 유래의 금속성 샤페론 SlyD의 결정 구조 및 기능적 특징을 보고하고 있다. 써머스 써모필러스는 2개의 기능적 유닛을 대표하는 2개 도메인으로 이루어진다. PPIase 활성은 전형적인 FKBP 도메인에 위치하는 한편, 샤페론 기능은 자체적으로 폴딩되는 인서트-인-플랩 (IF) 도메인과 회합된다. 2개의 단리된 도메인은 용액에서 안정하고 기능성이다.
Kovermann 등 (문헌 [Kovermann M, Schmid FX, Balbach J Molecular function of the prolyl cis/trans isomerase and metallochaperone SlyD. Biol Chem. 2013 Aug;394(8):965-75]에서)은 SlyD가 분자 샤페론, 프롤릴 시스/트랜스 이소머라제, 및 니켈-결합 단백질로서 기능하는 박테리아 2-도메인 단백질이라는 것을 개시한다. 그들은 SlyD의 분자 효소 기전에 관한 최근의 발견을 요약하고 있다. SlyD의 한 도메인에 위치하는 샤페론 기능은 쌍-아르기닌 전좌에 관여하고 단백질 폴딩에서 프롤릴 시스/트랜스 이소머라제 도메인의 촉매 효율을 2자릿수만큼 증가시킨다.
FKBP 12 폴리펩티드의 아미노산 서열은 위치 60에 단일 트립토판 잔기를 포함한다. 따라서, FKBP12 돌연변이체는 간단히 트립토판 형광발광을 분석하여 구조적 무결성에 대해 분석될 수 있다 (DeCenzo, M.T., et al, Protein Eng. 9 (1996) 173-180). FKBP 12 돌연변이체의 잔여 촉매 활성에 대한 검사는 잔존하는 로타마제 활성을 결정하여 수행될 수 있다 (Brecht, S., et al., Neuroscience 120 (2003) 1037-1048; Schories, B., et al, J. Pept. Sci. 13 (2007) 475-480; Timerman, A.P., et al, J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451-2459). FK506-결합 또는 라파마이신 결합을 측정하여 FKBP 12 돌연변이체의 구조적 무결성을 결정하는 것이 또한 가능하다 (DeCenzo, M.T., et al, Protein Eng. 9 (1996) 173-180).
Geitner 등 (문헌 [Geitner AJ1, Varga E, Wehmer M, Schmid FX. Generation of a highly active folding enzyme by combining a parvulin-type prolyl isomerase from SurA with an unrelated chaperone domain. J Mol Biol. 2013 Nov 15;425(22):4089-98]에서)은 폴딩 효소의 촉매 도메인으로서 제공되는 소형 프롤릴 이소머라제로서 파르불린을 개시한다. 에스케리치아 콜라이의 주변세포질 유래의 SurA (survival protein A)는 불활성 (Par1) 및 활성 (Par2) 파르불린 도메인을 비롯하여 샤페론 도메인으로 이루어진다. 샤페론 도메인의 부재 하에서, Par2의 폴딩 활성은 사실상 폐기된다. 그들은 FKBP 패밀리 유래의 미관련 폴딩 효소인, SlyD의 샤페론 도메인을 SurA의 단리된 Par2 도메인의 루프에 삽입시켜 키메라 단백질을 생성시켰다. 이것은 Par2가 이의 천연 샤페론 도메인과 연결된, SurA의 활성보다 더 높은 값까지 이의 폴딩 활성을 450배 증가시켰다. 천연 및 외래 샤페론 도메인 둘 모두의 존재 하에서, Par2의 폴딩 활성은 1500배 증가되었다. 따라서 관련 및 미관련 샤페론 도메인은 프롤릴 이소머라제 Par2의 폴딩 활성을 증강시키는데 있어 유사하게 효율적이다. 다양한 샤페론 도메인의 서열 분석은 이동성 사슬 영역 내 노출된 메티오닌 잔기의 클러스터가 폴딩되지 않은 단백질 사슬과의 포괄적 상호작용에 중요할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 결합은 샤페론과 촉매 도메인 사이에서 폴딩 단백질 사슬의 빈번한 전달을 허용하도록 고도로 역동적이다.
면역학적 진단 시스템의 경우, 항원 및/또는 항체 또는 다른 면역학적 결합 파트너 (관심 단백질)는, 그들의 검출을 위해, 또한 종종 예를 들어 바이오틴 (스트렙타비딘과의 고정화 경우) 또는 루테늄과 같은 다른 라벨과 접합된다. 일반적으로, 이러한 마커를 반응성 아미노 모이어티 또는 술프히드릴 모이어티에 접합시키기 위해 화학적 방법이 사용된다.
불행하게도, 단백질 변형을 위한 통상의 화학적 전략은 제어가 어렵고, 각각이 그 자신의 생체내 특징을 갖는, 가변적인 화학양론으로 면역접합체의 불균질 개체군을 야기시킨다. 뿐만 아니라, 접합된 분자 또는 라벨의 수를 제어할 수 없어서, 한정되지 않고, 일반적으로 정상 분포가 후속되어, 반응을 정량하고자 할 때 문제를 초래한다.
부위-특이적 및 화학양론적 단백질 변형을 위한 인공, 생물-직교군의 도입은 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결안을 제공한다. 이러한 전략이 유행되고 있지만 보통은 고되고 여전히 생성물 불균질성의 위험성이 있다. 게다가, 시스템의 모든 성분은 장기간 동안, 그리고 접합 조건 하에서 안정해야만 하고 안정한 채로 남아있어야 한다. 또한, 접합(들)의 위치/자리를 제어할 수 없다. 예를 들어 단백질의 활성 중심 내 또는 그 근처에서, 또는 면역학적 활성을 매개하는 위치(들) 또는 그 근처에서, 마커의 비특이적 포함은 면역 반응성을 방해할 수 있거나 또는 심지어 그것을 완전하게 억제할 수 있다.
마커의 부위-특이적 효소적 접합을 위한 방법이 공지되어 있지만 (예를 들어, 솔타제 (sortase), MTG), 이들은 라벨링하려는 관심 단백질에 추가의 특이적 인식 서열 (태그 서열)의 존재를 요구한다.
미생물 트랜스글루타미나제 (MTG)는 많은 식품 및 생물공학적 응용분야에서 단백질 및 펩티드의 가교를 위해 가장 중요한 효소 중 하나이다. MTG는 유기체 스트렙토마이세스 모바라엔시스 (Streptomyces mobaraensis)에서 처음 발견되어 이후 그로부터 추출되었다. 재조합적으로 생성된 스트렙토마이세스 모바라엔시스 MTG는 오늘날 대부분의 산업적으로 사용되는 MTG를 대표한다. 이 효소는 아실 기, 예를 들어 글루타민 (Q) 측쇄 및 알킬-아민, 예를 들어 리신 (K) 측쇄 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 촉매한다. 반응성 아민 기의 부재 하에서, 물과 효소적 반응은 글루타민 측쇄의 탈아민화를 초래한다. 박테리아 효소는 보조인자 예컨대 Ca2+ 또는 GTP의 첨가없이 광범위한 pH-, 완충제- 및 온도 조건 하에서 작용한다. MTG는 이미 치료적 항체-약물 접합체의 개발에 사용되고 있지만, 효소의 낮은 특이성으로 인해, 이러한 MTG-매개 접합체의 대규모 생산은 아직 확립되지 못하였다. 모든 기지의 활성 미생물 트랜스글루타미나제 종은 > 38 kDa의 분자량을 나타낸다. 자연계에서 가교 효소로, 미생물 트랜스글루타미나제는 아민-도너 분자에 대해서는 광범위한 기질 특이성 및 아실-도너에 대해서는 비교적 낮은 특이성을 나타낸다. 단지 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 효소 및 상동성 효소의 기질 특이성만이 알려져 있기 때문에, 생물-직교 접합 접근법, 예를 들어 둘 이상의 상이한 라벨-기질 및 둘 이상의 트랜스글루타미나제 종을 사용하는 생물분자의 동시 라벨링은 현재 불가능하다.
상기의 관점에서, 면역학적 진단 및/또는 치료적 시스템 및 방법의 상황에서 항원 및/또는 항체 또는 다른 면역학적 결합 파트너 (관심 단백질)의 효율적이고 제어적인 라벨링을 제공하기 위한 신규한 도구 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 다른 양상 및 목적은 본 발명의 하기의 보다 상세한 설명을 검토시 당업자에게 자명해질 것이다.
이의 제1 양상에 따라서, 상기 목적은 하기 일반식 I에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질의 제공에 의해 해결된다:
(F*-L)y-X (I).
상기 식 (I)에서, F*는 바람직하게, 비변형된 폴리펩티드에서, FK506 결합 단백질 (FKBP) 유형의 프롤릴 이소머라제인, 숙주 도메인의 표면 루프로 게스트로서 내부적으로 삽입되는 "인서트-인-플랩" (IF) 도메인을 포함하는, FKBP 폴리펩티드의 FKBP 도메인의 아미노산 서열로부터 선택된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 또한 "인서트-인-플랩" (IF) 도메인을 천연적으로 (비변형) 포함하지 않는 FKBP 도메인을 포함하고, 여기서 Q-태그는 효소 내 상동성 위치에서 삽입된다 (예를 들어, 하기 Knappe 등의 문헌을 참조).
상기 "인서트-인-플랩" (IF) 도메인은 적어도 부분적으로, 5개의 인접한 아미노산의 하위 서열을 포함하는 5 내지 20개 아미노산 길이를 갖는 아미노산 서열 ("Q-태그")에 의해 치환되고, 하위 서열은 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1), 특히 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1)의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 여기서 X1 및 X2 는 부재하거나 또는 링커 아미노산을 구성한다. 특정 실시형태에서, IF 도메인은 적어도 부분적으로, 5 내지 15개 또는 5 내지 20개 아미노산 길이를 갖는 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1) ("Q-태그")에 의해 치환되고, Q-태그는 5개의 아미노산의 인접하는 하위 서열 (즉, 5개의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 하위 서열)을 포함하고, 하위 서열은 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1) (내)의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 여기서 X1 및 X2 는 부재하거나 또는 링커 아미노산을 구성한다.
보다 특정한 실시형태에서, 오직 X1 만이 부재하고 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 의 길이는 6 내지 15개 또는 6 내지 20개 아미노산이다. 보다 더 특정한 실시형태에서, X2 는 YRYRQ 하위 서열 또는 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하위 서열 직후에 아르기닌 잔기를 포함한다 (또는 그로 이루어질 수 있다).
보다 더 매우 특정한 실시형태에 있어서, 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1)의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 5개의 인접하는 아미노산 잔기로 이루어진 하위 서열에서, 글루타민 잔기가 하위 서열의 선택된 위치 상에 있고, 하위 서열에서 위치는 제3의 위치, 제4의 위치, 제5의 위치, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더 매우 특정한 실시형태에 있어서, 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1)의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 5개의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 하위 서열에서, 아르기닌 잔기가 하위 서열의 선택된 위치 상에 있고, 하위 서열에서 위치는 제4의 위치, 제5의 위치, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따라서, 존재한다면, 링커 아미노산 X1 및 X2 는 서로 독립적으로 선택된다는 것을 더욱 이해한다.
서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1), X1-RYRQR-X2 (서열번호 2), X1-RYSQR-X2 (서열번호 3), X1-FRQRQ-X2 (서열번호 4), X1-RQRQR-X2 (서열번호 5), X1-FRQRG-X2 (서열번호 6), X1-QRQRQ-X2 (서열번호 7), X1-YKYRQ-X2 (서열번호 8), X1-QYRQR-X2 (서열번호 9), X1-YRQTR-X2 (서열번호 10), X1-LRYRQ-X2 (서열번호 11), X1-YRQSR-X2 (서열번호 12), X1-YQRQR-X2 (서열번호 13), X1-RYTQR-X2 (서열번호 14), X1-RFSQR-X2 (서열번호 15), X1-QRQTR-X2 (서열번호 16), X1-WQRQR-X2 (서열번호 17), X1-PRYRQ-X2 (서열번호 18), X1-AYRQR-X2 (서열번호 19), X1-VRYRQ-X2 (서열번호 20), X1-VRQRQ-X2 (서열번호 21), 및 X1-YRQRA-X2 (서열번호 22)로부터 재 선택되는 본 발명에 따른 Q-태그가 바람직하며, 여기서 X1 및 X2 는 상기와 같다.
놀랍게도 IF 도메인의 삽입 상류 및 하류 FKBP 도메인의 2개 부분이 IF 도메인 부분을 치환하고/하거나 그로 삽입되는 서열 ("헤드", "Q-태그")에 대해 구조적으로 상당히 견고하고 정밀한 스캐폴드 또는 "이음부 (collar)"로서 기능한다는 것을 발견하였다. 이 때문에, 삽입/치환의 배향 및 표상 (presentation)이 기질의 다른 성분의 임의의 다른 기능, 특히 관심 단백질 (X)의 기능 (들)을 실질적으로 방해하지 않는다. 더욱이, - 이 경우에 - TG 기질 결합 부위 (Q-태그)의 표상은 라벨의 고도로 제어된 화학양론적 결합, 및 그에 따라 관심 단백질의 라벨링을 야기시킨다.
식 (I)에서, L은 부재하거나 또는 링커 아미노산 서열로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 링커 서열 L은 1 내지 20개 아미노산을 포함하고 보다 바람직한 상기 아미노산은 FKBP 도메인의 기능 (들) (특히 치환/삽입) 및/또는 단백질의 기능 (들) (관심 s9) (면역학적 기능)을 본질적으로 방해하지 않는다.
X는 바람직하게 효소, 항원, 예컨대 바이러스 단백질, 항체 또는 이의 단편, 및 다른 면역학적 결합 파트너로부터 선택되는 관심 단백질을 표시한다.
식 (I)에서, y는 1 내지 100의 정수이고, 따라서 몇몇 마커 군 F*-L이 관심 단백질에 부착될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질은 바이오틴, 말토스 또는 his-태그(들)와 같은, 정제 및/또는 고정화를 위한 단백질 태그를, 예를 들어 N-말단 및/또는 C-말단에 더욱 포함할 수 있다.
바람직하게, 기질 F*, L 및/또는 X의 상이한 성분은 TG 활성을 사용하는 기질의 제어된 라벨링을 가능하게 하기 위해 서로에 공유적으로 부착된다. 기질은 융합 단백질로서 재조합적으로 생성될 수 있고, 숙주 세포, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 또는 효모 숙주 세포로부터 발현되어 정제될 수 있다. 개별 방법들은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 성분들은 또한 개별적으로 또는 부분적으로 생성 (예를 들어, 합성)될 수 있고, 그러고 나서 이후에, 이의 원하는 목적 (들) 및 상황에 따라서, 접합되거나 또는 공유적으로 연결된다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 TG 기질은 서열번호 23에 따른 쿠트츠네리아 알비다 TG, 또는 이의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95, 98 또는 99%가 동일하고 본 명세서에 기술된 바와 같은 실질적인 TG 활성을 나타내는 상동성 단백질의 트랜스글루타미나제 (TG) 기능을 위한 기질이다. 바람직하게, 실질적인 트랜스글루타미나제 기능 또는 활성을 갖는 TG 폴리펩티드 또는 이의 일부분은 클로닝되어 숙주 세포에서 재조합적으로 생성되고, 이의 원하는 목적 (들) 및 상황에 따라서, 이후에 (적어도 부분적으로) 정제된다. 개별 방법들은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. TG 활성은 역시 당업자에게 충분히 공지된 어세이를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 "재조합 TG 기질"은 전체로서 기질이 자연계에서 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것이다.
본 발명에 따라 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질을 위해 사용시 FKBP 도메인은 바람직하게 FKBP12, AIP, AIPL1, FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP7, FKBP8, FKBP9, FKBP9L, FKBP10, FKBP11, FKBP14, FKBP15, FKBP52, LOC541473, 및 SLYD로부터 선택되는 진핵생물 또는 박테리아 FKBP 폴리펩티드, 및 이의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95, 98 또는 99%가 동일하고 Q-태그의 삽입에 적합한 이의 FKBP 도메인의 상동체로부터 선택된다. 개별 도메인은 본 명세서, 및 문헌에 기술된 바와 같이, 예를 들어 특히 구조적 정렬을 확인하기 위한, 정렬 프로그램을 사용하여, 그들의 적합성에 대해 분석될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따라 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질을 위해 사용시 FKBP 도메인은 PPIase 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. PPIase 활성을 갖는 폴리펩티드는 원핵생물 또는 진핵생물 기원이거나, 또는 이의 인공 변이체 (돌연변이체)로서 PPIase 활성을 갖는 폴리펩티드이다. PPIase 활성을 갖는 폴리펩티드의 인공 변이체는 단백질 조작 분야에 따른 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따라서, PPIase 활성을 갖는 폴리펩티드의 인공 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따라 재조합 트랜스글루타미나제 기질을 위해 사용시 FKBP 도메인의 샤페론 기능 및/또는 PPIase 활성은 인공 변이체에서 보존된다.
Knappe 등 (문헌 [Knappe TA, Eckert B, Schaarschmidt P, Scholz C, Schmid FX. Insertion of a chaperone domain converts FKBP12 into a powerful catalyst of protein folding. J Mol Biol. 2007 May 18;368(5):1458-68. Epub 2007 Mar 14]에서)은 프롤릴 이소머라제로서 인간 FKBP12의 촉매 활성이 짧은 펩티드에 대해서는 높지만, 프롤린-제한된 단백질 폴딩 반응에서는 매우 낮다고 개시하고 있다. 대조적으로, FKBP 패밀리의 구성원인 SlyD 단백질은 폴딩 효소로서 고도로 활성적이다. 그들은 프롤릴 이소머라제 활성 부위 근처에 여분의 "인서트-인-플랩" 또는 IF 도메인을 함유한다. 이러한 도메인의 제거는 짧은 펩티드 기질에 대한 에스케리치아 콜라이 유래 SlyD의 프롤릴 이소머라제 활성에 영향을 미치지 않았지만 프롤린-제한된 단백질 폴딩 반응에서 이의 촉매 활성은 제거하였다. 인간 FKBP12로 SlyD의 IF 도메인의 상호간 삽입은 이의 폴딩 활성을 200배 증가시켰고 SlyD 그 자체보다 훨씬 더 활성적인 폴딩 촉매를 생성시켰다. IF 도메인은 리폴딩 단백질 사슬에 결합하고 따라서 샤페론 모듈로서 기능한다.
이. 콜라이에서, SLYD의 아미노산 1 내지 69는 PPIase 도메인의 제1 부분을 형성하고, 아미노산 76 내지 120은 IF-샤페론 (도메인)을 형성하며, 아미노산 129 내지 151은 PPIase 도메인의 제2 부분을 형성한다고 여겨진다. 따라서, 아미노산 1 내지 151은 FKBP-도메인을 형성한다. 아미노산 152 내지 196은 금속 결합에 관여한다.
본 발명에 따라 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질이 바람직하고, 여기서 상기 FKBP 도메인은 상기 FKBP 폴리펩티드의 N 말단 아미노산의 약 120 내지 170, 바람직하게 약 130 내지 160, 및 가장 바람직하게 약 145 내지 155의 길이를 갖는다. 이것은 IF-도메인 서열을 포함한다.
본 발명의 문맥에서 "약"은 소정 값의 +/- 10%를 의미한다.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질이 바람직하고, 여기서 상기 FKBP 도메인은 SLYD 폴리펩티드의 N 말단 아미노산 1 내지 64 및 123 내지 149를 포함하고, 아미노산 65 내지 122는 상기 Q-태그에 의해 치환된다.
상기에 언급한 바와 같이, 링커 서열 L은 1 내지 20개 아미노산, 바람직하게 1 내지 10개 아미노산, 보다 바람직하게 1 내지 5개 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 바람직하게 상기 아미노산은 FKBP 도메인 및/또는 관심 단백질을 본질적으로 방해하지 않는다. 바람직한 링커 아미노산은 글리신 또는 알라닌과 같은 소형 아미노산이다. 아미노산 링커 및 그들의 조성은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Chichili et al. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions Protein Sci. 2013 Feb; 22(2): 153-167]을 참조함).
본 발명의 문맥에서 관심 단백질은 일반적으로 본 발명의 기술을 사용하여 라벨링할 수 있는 모든 단백질이다. 바람직한 것은 본 발명에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질이고, 여기서 상기 관심 단백질은 효소, 항원, 예컨대 바이러스 단백질, 항체 또는 이의 단편, 및 다른 면역학적 결합 파트너로부터 선택된다. 본 발명은 특히 정량이 바람직한, 면역학적 반응 및 어세이에서 유용하다.
다음으로 본 발명의 다른 양상은 a) 관심 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질을 제공하는 단계; b) 쿠트츠네리아 알비다의 트랜그글루타미나제 (예를 들어, 서열번호 23에 따름) 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 상동체의 유효량을 제공하는 단계; c) 알킬-아민 기 ("아민 도너"), 예컨대, 예를 들어, 리신을 포함하는 적합한 라벨을 제공하는 단계, 및 d) 단계 a) 내지 c)에 따른 상기 성분들을 접촉시켜서, 상기 트랜스글루타미나제 (활성)가 상기 표지를 상기 기질에 부착시키는 단계를 포함하는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법이 바람직하고, 여기서 쿠트츠네리아 알비다의 상기 트랜스글루타미나제 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 상동체는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 재조합적으로 생성된다.
본 발명에 따른 이러한 방법에서, Q-태그 (임의로 IF-도메인 영역을 치환)를 포함하는 F* 기를 포함하는 기질은 쿠트츠네리아 알비다의 트랜스글루타미나제의 활성을 사용하여 라벨링된다. 바람직하게, 부착하려는 라벨은 효소, 바이오틴, 방사성 기, 염료, 예컨대 형광발광성 염료, 동위원소, 및 금속으로부터 선택된다. 상기 라벨은 알킬-아민 기, 예컨대, 예를 들어, 리신을 포함하는 라벨 성분/화합물의 일부분이다. 가장 바람직한, 상기 라벨 성분/화합물은 펩티드 서열 RYESK과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아민-도너 태그 ("K-태그")를 포함한다. 바람직한 K-태그 및 그들 조성에 관한 예는 하기에 기술되며 또한 문헌에서도 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 방법이 바람직하고, 상기 라벨링은 제어되고, 예를 들어 라벨 및 관심 단백질의 화학양론적 비율, 예를 들어 약 1:1에서 획득된다. 다수의 라벨링은 또한, 단백질/관심 단백질에 2개 또는 심지어 다수의 라벨을 부착시키기 위해, 추가의 효소 (예를 들어, Kalb-TG 이외의 다른 TG) 및 개별적인 다른 TG-기질을 사용해 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 방법이 바람직하고, 여기서 상기 관심 단백질은 효소, 항원, 예컨대 바이러스 단백질, 항체 또는 이의 단편, 및 다른 면역학적 결합 파트너로부터 선택된다. 본 발명은 정량이 바람직한, 면역학적 반응 및 어세이에서 특히 유용하다.
관심 단백질의 선택은 또한 요법, 연구 및/또는 진단에서, 사용시 piRNA 분자의 의도하는 용도에 따라 좌우될 수 있다. 본 발명에 따른 방법이 바람직하고, 여기서 상기 관심 단백질은 암, 신경학적 질환, 면역학적 질환, 알레르기, 대사 질환, 출산력 (예를 들어, 증식률 또는 증식수), 동물 생산 (예를 들어, 고기 또는 우유의 양)의 야기/관여 단백질, 세포 성장 및/또는 발생, mRNA 분해, 번역 억제, 및/또는 전사 유전자 침묵화에 필수적인 단백질로부터 선택된다.
다음으로 본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질과 함께, 약학적으로 허용되는 담체 및 성분, 예컨대 완충제를 함께 포함하는 약학 또는 진단 조성물에 관한 것이다. 다수의 라벨링을 위한 약학 또는 진단 조성물은 또한 2개 또는 심지어 다수의 라벨을 관심 단백질/단백질들에 부착시킬 수 있기 위해서, 추가의 효소 (Kalb-TG 이외의 다른 TG) 및 개별적인 다른 TG-기질을 포함하는 것을 또한 수득할 수 있다.
다음으로 본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 방법에 따라 생성된 적어도 하나의 라벨링된 관심 단백질을, 약학적으로 허용되는 담체 및 성분, 예컨대 완충제와 함께 포함하는 약학 또는 진단 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학 또는 진단 조성물이 바람직하고, 여기서 상기 관심 단백질은 라벨 및 관심 단백질의 화학양론적 비율, 예를 들어 약 1:1에서 라벨링된다. 2개 또는 심지어 몇개의 라벨이 또한 단백질/관심 단백질에 부착될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 진단 조성물을, 임의로 면역어세이를 수행하기 위한 다른 성분과 함께 포함하는, 진단 키트에 관한 것이다. 키트는 미생물 재조합 트랜스글루타미나제, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이 쿠트츠네리아 알비다 미생물 트랜스글루타미나제와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 정제된 미생물 트랜스글루타미나제를 포함할 수 있다. 키트는 펩티드 서열 RYESK와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아민-도너 태그를 포함하는 기질을 더 포함할 수 있다. 키트는 또한 라벨링 또는 비라벨링된, 본 발명에 따른 기질의 사용을 요구하는 반응 (예를 들어, 면역어세이)을 수행하기 위한 지시서를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 라벨링 또는 관심 단백질의 라벨링, 특히 정량이 바람직한 면역학적 반응 및 어세이에서 본 발명에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질, 약학 또는 진단 조성물 또는 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 생체내 또는 시험관내, 특히 실험 동물, 또는 배양물에서 수행될 수 있다.
본 발명을 첨부된 도면을 참조하여, 하기의 비제한적인 예에서 더욱 예시할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 및 다른 본 명세서에 언급된 문헌들은 그들 전체로 참조로 편입된다.
도 1은 쿠트츠네리아 알비다 유래의 트랜스글루타미나제의 아미노산 서열 (데이타베이스 번호WP_030111976), 이. 콜라이의 slyD의 아미노산 서열, 시클로박테리아과(Cyclobacteriaceae) 박테리아 AK24의 slyD의 아미노산 서열, 및 박테로이드목(Bacteroidales) 박테리아의 slyD의 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 하기 실시예에 따라 Cy3 또는 Cy5를 사용한 라벨링의 결과를 도시한다. 도 2B는 6.2 내지 9.0 범위에서 상대적 pH 독립성을 도시한다.
도 3A는 루테늄 라벨링된 융합 구성체의 일반적 구조를 도시하고, 도 3A는 하기 실시예에 따라 SDS-PAGE를 사용한 라벨링의 결과를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 기질-라벨링된 관심 단백질 (여기서, 항체의 2개 사슬)의 바람직한 실시형태를 도시한다.
도 5 A는 서열번호 60의 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H'의 개략도를 나타낸다. 실시예에 표시한 바와 같이 SlyD 부분은 추가로 융합 단백질 내 Q-태그를 비롯하여, 인자 Xa 프로테아제에 대한 인식 부위, 및 'gp21' 부분이 표시되어 있다. 별표는 루테늄 라벨을 상징한다.
도 5 B는 스트렙토마이세스 모바라엔시스의 박테리아 트랜스글루타미나제에 의한 재조합 gp21 (HTLV) 항원의 특이적 및 비특이적 루테늄 라벨링을 보여주는 SDS-PAGE 분석 이후의 결과를 도시한다. Ru 라벨링 후 비라벨링, 단일-라벨링, 이중-라벨링, 및 삼중 라벨링된 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H' 융합 단백질을 도시한다.
도 5 C는 루테늄 라벨을 도시한다.
도 6 A-E는 엘렉시스 (Elecsys) 어세이에서 서열번호 62에 따른 라벨링된 'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H'를 사용한 결과를 나타낸다.
서열번호 1 내지 22는 본 발명에서 동정된 Q-태그 모티프의 서열을 도시하고, 여기서 N 말단 X는 상기 X1 과 같고, C 말단 X는 상기 X2 와 같다.
서열번호 23은 쿠트츠네리아 알비다 유래의 트랜스글루타미나제의 아미노산 서열 (데이타베이스 번호 WP_030111976)을 도시한다.
서열번호 24는 이. 콜라이의 slyD의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 25는 시클로박테리아과 박테리아 AK24의 slyD의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 26은 박테로이데스목 박테리아 CF의 slyD의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 27은 이. 콜라이의 slyD의 FKBP 도메인의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 28은 이. 콜라이의 FKBP16의 FKBP 도메인의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 29는 써머스 써모필러스의 slyD의 FKBP 도메인의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 30 내지 51은 본 발명에서 동정된 Q-태그 모티프의 서열을 도시하고, 여기서 N 말단 및 C 말단 아미노산은 하나의 예시적인 글리신 링커이다.
서열번호 52는 SlyD의 FKBP 도메인 상에 재조합적으로 그라프트된 KalbTG 글루타민 도너 서열의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 53은 트랜스글루타미나제 리신 도너 서열 (K-태그)의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 54는 SlyD 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 55는 MTG Q-태그를 갖는 SlyD의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 56은 KalbTG Q-태그를 갖는 SlyD의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 57은 SlpA 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 58은 주요 HTLV 항원 및 바이러스 엔벨로프 당단백질 아미노산 서열 'gp21'을 도시한다.
서열번호 59은 면역어세이에서 보다 양호한 가용성, 안정성 및 반응성을 위해 조작된, 변형된 'gp21' 엑토도메인 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 60은 재조합 융합 단백질 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H'의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 61는 재조합 융합 단백질 'TtSlyD-Xa-gp21-8H'의 아미노산 서열을 도시한다.
서열번호 62는 재조합 융합 단백질 'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H'의 아미노산 서열을 도시한다.
실시예
IF 도메인의 위치의 동정
이론상으로, FKBP 도메인의 아미노산 서열의 1차 구조의 정렬은 예를 들어 프로그램 클러스탈 오메가 (Clustal Omega)를 사용하여 치환 (또는 첨가)하려는 IF 도메인의 위치를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 도메인이 구조적으로 보존된 구성요소로 구성되므로, 특히 비박테리아 FKBP에 대한 대안은 3D 구조의 정렬 (예를 들어, 프로그램 PyMol을 사용)이다.
특정 예는 다음과 같다:
에스케리치아 콜라이 (균주 K12)의 SLYD_ECOLI FKBP-유형 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 SlyD. FKBP 도메인, IF 도메인은 이중 밑줄표시하였다.
Figure pct00001
에스케리치아 콜라이 (균주 K12)의 ECOLI FKBP-유형 16 kDa 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제. FKBP 도메인, IF 도메인은 이중 밑줄표시하였다.
Figure pct00002
써머스 써모필러스 (균주 HB8/ATCC 27634)의 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제. FKBP 도메인, IF 도메인은 이중 밑줄표시하였다.
Figure pct00003
KalbTG에 대한 Q-태그의 분석
세(3)개의 N 말단 및 C 말단 글리신 잔기 (G1 및 G2)가 부착된 5량체 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 세트를 이용한 라벨링 어세이를 사용하여 동정된 KalbTG 펩티드 기질의 분석은 이들 기질이 공유하는 특징 세트를 밝혀주었다. 특정예는 하기와 같다:
G1-YRYRQ-G2 (서열번호 30), G1-RYRQR-G2 (서열번호 31), G1-RYSQR-G2 (서열번호 32), G1-FRQRQ-G2 (서열번호 33), G1-RQRQR-G2 (서열번호 34), G1-FRQRG-G2 (서열번호 35), G1-QRQRQ-G2 (서열번호 36), G1-YKYRQ-G2 (서열번호 37), G1-QYRQR-G2 (서열번호 38), G1-YRQTR-G2 (서열번호 39), G1-LRYRQ-G2 (서열번호 40), G1-YRQSR-G2 (서열번호 41), G1-YQRQR-G2 (서열번호 42), G1-RYTQR-G2 (서열번호 43), G1-RFSQR-G2 (서열번호 44), G1-QRQTR-G2 (서열번호 45), G1-WQRQR-G2 (서열번호 46), G1-PRYRQ-G2 (서열번호 47), G1-AYRQR-G2 (서열번호 48), G1-VRYRQ-G2 (서열번호 49), G1-VRQRQ-G2 (서열번호 50), 및 G1-YRQRA-G2 (서열번호 51).
KalbTG의 경우, 데이타는 식 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (여기서, Xaa는 임의의 아미노산임)을 갖는 5량체 아미노산 서열을 포함하는 아실-도너 기질이 일반적으로 몇가지 디자인 규칙으로 편집된다는 것을 밝혀주었다. 먼저, 각각의 5량체 서열은 적어도 하나의 글루타민 (Q)을 포함하였다. 보다 특히, 5량체 서열의 제3, 제4, 및 제5의 위치 (즉, Xaa3, Xaa4, 및 Xaa5) 중 적어도 하나가 글루타민이었다. 몇몇 서열은 제3 및 제5의 위치 각각에 글루타민을 포함하는 것으로 관찰되었다. 뿐만 아니라, 각각의 5량체 서열이 적어도 하나의 아르기닌 (R)을 포함하는 것이 관찰되었다. 보다 특히, 5량체 서열의 제4 및 제5의 위치 (즉, Xaa4 및 Xaa5) 중 적어도 하나는 아르기닌이었다.
라벨링 어세이
1. 형광발광 염료
라벨링 어세이를 위해서, 써머스 써모필러스 (UniProt (Universal Protein Resource) 번호 Q5SLE7) 유래의 샤페론 SlyD를 KalbTG에 대한 라벨링 스캐폴드로서 사용하였다. SlyD 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
KalbTG 글루타민 도너 서열 (Q-태그, 밑줄표시)은 SlyD의 FKBP 도메인 상에 재조합적으로 그라프트시켜서, 다음의 폴리펩티드 서열을 산출하였다:
Figure pct00005
8X-히스티딘-태그화된 단백질을 이.콜라이 BL21 터너 (Tuner)에서 생성시켰고 표준 Ni 세파로스-기반 고정화 금속 이온 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피 (HisTrap, Superdex 200; GE Healthcare)를 통해 정제하였다. 모든 펩티드는 표준 플루오레닐메틸옥시카보닐 (FMOC)-기반 고체상 펩티드 합성을 통해 합성하였다.
라벨링된 펩티드는 (N 말단에서 C 말단의 순서로) Z-보호기 (즉, 카복시벤질 기), 트랜스글루타미나제 리신 도너 서열 (K-태그), 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (O2Oc), 펩티드, 및 Cy3 또는 Cy5 형광발광 염료를 갖도록 화학적으로 합성하였다. 라벨링된 펩티드의 1차 화학적 구조는 다음과 같다:
Figure pct00006
라벨링 반응은 15분 동안 37℃에서 200 mM MOPS pH 7.2 및 1 mM EDTA 중 72 μM 기질 단백질, 720 μM 라벨 펩티드 및 1 μM 트랜스글루타미나제의 존재 하에서 수행하였다. 30분간 37℃에서 항온반응 후, 1 mM K-태그-Cy5 또는 K-태그-Cy3을 첨가하였고 추가 15분간 37℃에서 항온반응하였다. 반응은 50 mM TCA의 첨가에 의해 중지시켰다. 샘플은 항온반응 단계 사이에 채취하였고, SDS-PAGE, 겔 내 형광발광(BioRad ChemiDoc 겔 도큐멘테이션 시스템, Cy3 및 Cy5 LED 및 필터 세트)에 의해 분석하였다. 결과는 도 2에 도시하였다.
2. 루테늄 라벨
slyD Q-태그 gp21 융합물로 이루어진 유사한 Q-태그 구성체를 시험하였고 (도 3B 참조), 여기서 라벨은 루테늄-라벨이었다. 도 3A의 SDS-PAGE의 결과는 라벨 대 구성체의 양호한 1:1 비율을 보여준다.
바이오틴- 및 루테늄 라벨링된 TtSlyD-gp21 (HTLV) 항원의 생성
추가의 라벨링 어세이를 위해서, 써머스 써모필러스 유래의 샤페론 SlyD (UniProt (Universal Protein Resource) 번호 Q5SLE7), HTLV 바이러스 엔벨로프 당단백질 'gp21' (유전자은행 수탁 번호 DQ224032.1) 및, 일례에서, 에스케리치아 콜라이 유래의 샤페론 SlpA (UniProt 번호 P0AEM0) 간 재조합 융합을 MTG 또는 KalbTG에 대한 라벨링 스캐폴드로서 사용하였다. SlyD 서열은 다음과 같다:
Figure pct00007
MTG 또는 KalbTG 글루타민 도너 서열 (Q-태그)는 SlyD의 FKBP 도메인 상에 재조합적으로 그라프트시켜서 다음의 폴리펩티드 서열을 산출하였다:
MTG Q-태그를 갖는 SlyD:
Figure pct00008
KalbTG Q-태그를 갖는 SlyD:
Figure pct00009
SlpA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00010
주요 HTLV 항원 및 바이러스 엔벨로프 당단백질 서열 'gp21'은 다음과 같다:
Figure pct00011
면역어세이에서 보다 양호한 가용성, 안정성 및 반응성을 위해 조작된, gp21 엑토도메인 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:
Figure pct00012
라벨링 어세이를 위해 사용되는 재조합 융합 서열은 다음과 같다:
'TtSlyQD-Xa-gp21-8H':
Figure pct00013
'TtSlyD-Xa-gp21-8H':
Figure pct00014
'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H':
Figure pct00015
8X-히스티딘-태그화된 단백질은 이. 콜라이 BL21 터너에서 생성시켰고 표준 Ni 세파로스-기반 고정화 금속 이온 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피 (HisTrap, Superdex 200; GE Healthcare)에 의해 정제하였다.
라벨링된 펩티드는 (N 말단에서 C 말단 순서로), "Z-" 기 (즉, 카복시벤질 기), 트랜스글루타미나제 리신 도너 서열 (K-태그), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 펩티드, 및 바이오틴 라벨 또는 비피리미딘 루테늄 (BPRu) 복합체를 갖도록 화학적으로 합성되었다. 라벨링된 펩티드의 1차 화학적 구조는 다음과 같다:
KalbTG K-태그-Bi ("Bi"는 바이오틴 라벨을 의미함):
Z-RYESKG-PEG27-K(Bi)-OH (2532.0 g/mol)
KalbTG K-태그-Ru ("Ru"는 전기화학발광을 위한 루테늄-기반 라벨을 의미함):
Z-RYESKG-PEG27-K(BPRu)-OH (2958,4 g/mol)
달리 언급하지 않으면, 전형적인 라벨링 반응은 KalbTG 효소로 라벨링 경우 200 mM MOPS pH 7.4 중 65 μM 기질 단백질, 1000 μM 라벨 펩티드 및 0.1 μM 트랜스글루타미나제의 존재하에 15분 동안 37℃에서, 그리고 MTG 효소의 라벨링의 경우 200 mM MOPS pH 7.4 중 72 μM 기질 단백질, 720 μM 라벨 펩티드 및 1 μM 트랜스글루타미나제의 존재 하에 37℃에서 수행하였다. 트랜스글루타미나제 라벨링은 미국 특허 출원 US　2016/0178627 (발명의 명칭: 'System and Method for Identification and Characterization of Transglutaminase Species') 및 WO　2016/096785 (발명의 명칭: 'IDENTIFICATION OF TRANSGLUTAMINASE SUBSTRATES AND USES THEREFOR')에 보다 상세하게 기술되어 있다.
라벨링 반응 믹스는 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200; GE Healthcare)를 통해 분리하였고 라벨링된 융합 단백질을 함유하는 분획은 후속 분석을 위해 단리하였다.
바이오틴- 및 루테늄 라벨링의 분석 및 면역어세이
라벨링 반응의 품질 및 양은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 바이오틴 라벨링의 효율은 쿠마시-염색된 겔에서 밴드의 분자량의 이동을 통해 추산하였다. 루테늄 라벨링의 효율은 쿠마시-염색된 겔에서 밴드의 분자량 이동 및 겔내 형광발광을 통해 추산하였다 (BioRad ChemiDoc 겔 도큐멘테이션 시스템, Cy3 LED 및 필터 세트). 진단 면역어세이 (Roche HTLV I/II)는 시험 시약 R1 중 바이오틴 라벨링된 항원 모이어티를 MTG로 라벨링된 'TtSlyD-Xa-gp21-8H' 바이오틴 또는 KalbTG로 라벨링된 'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H' 바이오틴으로 각각 치환시키고, 시험 시약 R2 중 루테늄 라벨링된 항원 모이어티를 MTG로 라벨링된 'TtSlyD-Xa-gp21-8H' 루테늄 또는 KalbTG로 라벨링된 'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H' 루테늄으로 각각 치환시켜서, Elecsys e411 장비 상에서 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 양성 대조군은 HTLV 양성 혈청 및 상업적으로 입수할 수 있는 HTLV I/II 키트를 사용해 수행하였다. 음성 대조군은 상이한 교정기 및 대조군 용액과 조합하여 HTLV 음성 혈청 및 HTLV 양성 혈청에서 수행하였다.
결과는 도 5 및 6을 참조한다.
TtSlyQD-Xa-gp21-8H 루테늄 라벨링의 질량 분광분석
도 5A는 서열번호 60의 융합 단백질 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H'를 개략적으로 도시한다. 도 5B는 스트렙토마이세스 모바라엔시스의 박테리아 트랜스글루타미나제를 사용한 재조합 gp21 (HTLV) 항원의 특이적 및 비특이적 루테늄 라벨링을 보여주는 SDS-PAGE 분석 후 결과를 도시한다. Ru 라벨링 후, 비라벨링, 단일-라벨링, 이중-라벨링, 및 삼중-라벨링된 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H' 융합 단백질을 도시한다. Ru-라벨은 도 5C를 참조한다.
루테늄 라벨링된 융합 단백질의 2개의 풀링된 분획, [1] TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 17-19 및 [2] TtSlyQDXa-gp21-8H_분획 20-23을 분석하였고, 비라벨링된 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H' 단백질은 대조군으로 제공하였다 (TtSlyQD-Xa-gp21-8H_대조군).
펩티드 지도화를 수행하였다. 트립신에 의한 소화, 크로마토그래피 분리, 후속 MS/MS 분석, 및 수동 해석 도구와 조합한 데이타베이스 검색을 통한 펩티드 지도화 후, 다음을 발견하였다:
(a) 하나의 라벨을 갖는 트립신소화 펩티드, 62-85' " AYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGK " 서열번호 63 (번호는 하기에 제공되는 서열을 의미함)은 양쪽 분획 TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 17-19' 및 TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 20-23'에 존재하였다.
(b) 하나의 라벨을 갖는 트립신소화 펩티드, 195-222' " ALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENR " 서열번호 64는 미량으로 오직 TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 17-19'에 존재하였다.
(c) 하나의 라벨을 갖는 트립신소화 펩티드, 241-255' " EALQTGGHHHHHHHH " 서열번호 65 (His-태그)는 양쪽 분획, TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 17-19' 및 TtSlyQD-Xa-gp21-8H_분획 20-23'에 존재하였다.
(d) 상기 이외에도, 또한 다른 루테늄 라벨링된 펩티드/부산물이 양쪽 분획에 존재하는 것으로 확인되었지만, 유의하지 않은 분량이었다.
(a-c)에서 상기에 제공된 바와 같은 TtSlyQD-Xa-gp21-8H, 트립신소화 펩티드의 아미노산 서열은 굵은체 및 밑줄로 표시하였다:
Figure pct00016
쿠트츠네리아 알비다의 박테리아 트랜스글루타미나제를 사용하여 바이오틴 및 루테늄으로 부위-특이적으로 라벨링된 재조합 gp21 (HTLV) 항원은 Elecsys HTLV-I/II 시험관내 진단 어세이에서 본 발명의 장점을 입증한다.
결과를 도 6에 표시하였고 다음과 같다.
도 6 A는 루테늄 및 바이오틴 라벨링된 gp21 항원 (Q = KalbTG Q-태그, L = 링커, Xa = 인자 Xa 절단 부위, 8H = His-태그)의 1차 구조 및 진단 검사 원리를 보여주는 개략적인 대표도를 도시하고, 환자 샘플 유래의 혈청 항원 (적색)은 바이오틴 및 루테늄 라벨링된 항원 (녹색)을 가교한다.
도 6 B-D: KalbTG를 사용한 gp21의 단일 바이오틴 또는 루테늄 라벨링을 보여주는 SDS-PAGE 분석. B: 바이오틴 라벨링을 보여주는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔, 레인 1: 사전염색된 단백질 분자량 마커, 레인 2: KalbTG 및 바이오틴 라벨과 항온반응시킨 TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H. C: 루테늄 라벨링을 보여주는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔, 레인 3a: KalbTG 및 루테늄 라벨과 항온반응시킨 TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H, 레인 4a: 미변형된 TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H (대조군). D: C에 도시된 SDS-PAGE 분석의 형광발광 이미지. 레인 3b-4b는 레인 3a-4a에 상응한다.
도 6 E: MTG 라벨링된 시약 또는 시판 키트 (대조군) 시약을 사용한 HTLV 항체에 대한 음성 (좌) 및 양성 (우) 혈청 상에서의 Elecsys 어세이 (HTLV-I/II). 양성 대조군 신호가 KalbTG 라벨링된 gp21 신호보다 더 높은 것을 주목하며, 대조군에서 라벨링 화학양론이 1:1보다 높기 때문이다. 이것은 즉, KalbTG 라벨링된 분자가 라벨을 덜 보유한다는 것이다. 측정은 이중으로 수행하였고, 평균 신호로 도시하였다.
TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00017
<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics Operations, Inc. <120> FKBP domain with transglutaminase recognition site <130> R30521WO <150> EP15200111.1 <151> 2015-12-15 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Xaa Tyr Arg Tyr Arg Gln Xaa 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Xaa Arg Tyr Arg Gln Arg Xaa 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa 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Thr Trp Arg Val Glu Asp Tyr Val Glu Ala Trp Glu Arg 50 55 60 Tyr His Gly Arg Glu Met Thr Glu Asp Glu Arg Glu Asn Leu Ala Arg 65 70 75 80 Gly Cys Ile Gly Val Thr Val Val Asn Leu Asn Arg Glu Asp Leu Ser 85 90 95 Asn Pro Pro Leu Asn Leu Ser Phe Gly Ser Leu Arg Thr Ala Glu Ala 100 105 110 Val Gln Ala Ala Leu Asn Lys Ile Val Asp Thr His Pro Ser Pro Ala 115 120 125 Gln Tyr Glu Ala Ala Val Ala Lys Asp Pro Ile Leu Lys Arg Leu Lys 130 135 140 Asn Val Val Lys Ala Leu Pro Ser Trp Ile Asp Ser Ala Lys Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ile Phe Ser Lys Arg Phe Tyr Ser Trp Gln Asn Pro Asp Trp 165 170 175 Ser Glu Glu Arg Ala His Thr Thr Tyr Arg Pro Asp Arg Glu Thr Asp 180 185 190 Gln Val Asp Met Ser Thr Tyr Arg Tyr Arg Ala Arg Pro Gly Tyr Val 195 200 205 Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Asp Gln Asp Thr Asn Thr Trp Trp His 210 215 220 Ala Asn His Glu Glu Pro Arg Met Val Val Tyr Gln Ser Thr Leu Arg 225 230 235 240 His Tyr Ser Arg Pro Leu Gln Asp Phe Asp Glu Gln Val Phe Thr Val 245 250 255 Ala Phe Ala Lys Lys Asp 260 <210> 24 <211> 196 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 24 Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg 1 5 10 15 Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30 Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45 Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60 Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro 65 70 75 80 Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe 85 90 95 Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile Thr Ala Val 100 105 110 Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln 115 120 125 Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160 Asp His Asp His Asp Gly Cys Cys Gly Gly His Gly His Asp His Gly 165 170 175 His Glu His Gly Gly Glu Gly Cys Cys Gly Gly Lys Gly Asn Gly Gly 180 185 190 Cys Gly Cys His 195 <210> 25 <211> 176 <212> PRT <213> Cyclobacteriaceae bacterium <400> 25 Met Arg Phe Gln Ser Gln Leu Val Phe Met Glu Ile Ser Glu Asn Thr 1 5 10 15 Val Val Gly Leu Thr Tyr Glu Leu Lys Val Thr Asn Asn Glu Glu Asp 20 25 30 Ser Ile Pro Phe Ser Val Glu Val Arg Asp Glu Glu Asp Pro Phe Tyr 35 40 45 Phe Val Phe Gly Asn Ser Gly Leu Pro Glu Lys Phe Glu Arg Leu Leu 50 55 60 Glu Asn Lys Val Ala Gly Asn Thr Phe Asn Phe Thr Leu Ser Ile Glu 65 70 75 80 Glu Ala Tyr Gly His Ala Asp Glu Glu Leu Ile Leu Thr Val Pro Lys 85 90 95 Lys Gln Phe Thr Gly Glu Lys Gly Phe Glu Pro Glu Met Leu Glu Glu 100 105 110 Gly Asn Phe Leu Pro Leu Ile Asp Glu Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ala 115 120 125 Lys Val Ile Lys Asp Leu Gly Glu Glu Leu Leu Leu Asp Phe Asn His 130 135 140 Pro Leu Val Gly Met Asn Leu His Phe Asp Gly Glu Val Tyr Lys Val 145 150 155 160 Arg Lys Ala Thr Lys Glu Glu Thr Glu Lys Gly Tyr Ile Glu Val Asn 165 170 175 <210> 26 <211> 176 <212> PRT <213> Bacteroidales bacterium <400> 26 Met Lys Ile Gly Thr Asn Lys Val Val Ser Leu Ala Tyr Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Gly Asp Val Met Glu Thr Val Thr Ser Glu Lys Pro Leu Glu 20 25 30 Phe Ile Phe Gly Thr Gly Tyr Leu Leu Pro Lys Phe Glu Glu Asn Val 35 40 45 Ser Asn Lys Val Val Gly Asp Ala Phe Asp Phe Thr Leu Thr Ala Ser 50 55 60 Glu Gly Tyr Gly Glu Glu Asn Pro Asp Ala Ile Ile Glu Leu Pro Lys 65 70 75 80 Asp Ile Phe Lys Val Asp Gly Lys Ile Glu Glu Gly Leu Leu Thr Val 85 90 95 Gly Asn Ile Leu Pro Met Gln Asp Ser Asp Gly Asn Arg Leu Gln Gly 100 105 110 Ser Ile Asp Glu Ile Lys Asp Asp Val Val Val Met Asn Phe Asn His 115 120 125 Pro Leu Ala Gly Ala Asp Leu His Phe Lys Gly Ile Val Val Ala Val 130 135 140 Arg Glu Ala Ser Glu Thr Glu Leu Val Asn Gly Leu Arg Gly Glu Leu 145 150 155 160 Gly Thr Ser Cys Gly Asp Gly Gly Cys Ser Gly Cys Ser Gly Cys His 165 170 175 <210> 27 <211> 165 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 27 Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg 1 5 10 15 Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30 Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45 Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60 Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro 65 70 75 80 Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe 85 90 95 Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile Thr Ala Val 100 105 110 Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln 115 120 125 Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160 Asp His Asp His Asp 165 <210> 28 <211> 149 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 28 Met Ser Glu Ser Val Gln Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 30 Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu 35 40 45 Glu Gln His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60 Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu Ile Gln 65 70 75 80 Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu Ile Gly 85 90 95 Ala Ile Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110 Ile Arg Glu Ile Asn Gly Asp Ser Ile Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125 Leu Ala Gly Gln Thr Val His Phe Asp Ile Glu Val Leu Glu Ile Asp 130 135 140 Pro Ala Leu Glu Ala 145 <210> 29 <211> 149 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 29 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Pro His Asp Pro Glu Gly Val Gln Val Val Pro Leu Ser Ala Phe Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Glu Val Val Pro Gly Ala Gln Phe Tyr Ala Gln Asp Met 85 90 95 Glu Gly Asn Pro Met Pro Leu Thr Val Val Ala Val Glu Gly Glu Glu 100 105 110 Val Thr Val Asp Phe Asn His Pro Leu Ala Gly Lys Asp Leu Asp Phe 115 120 125 Gln Val Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu 130 135 140 His Gly His Ala His 145 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 30 Gly Tyr Arg Tyr Arg Gln Gly 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 31 Gly Arg Tyr Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 32 Gly Arg Tyr Ser Gln Arg Gly 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 33 Gly Phe Arg Gln Arg Gln Gly 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 34 Gly Arg Gln Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 35 Gly Phe Arg Gln Arg Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 36 Gly Gln Arg Gln Arg Gln Gly 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 37 Gly Tyr Lys Tyr Arg Gln Gly 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 38 Gly Gln Tyr Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 39 Gly Tyr Arg Gln Thr Arg Gly 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 40 Gly Leu Arg Tyr Arg Gln Gly 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 41 Gly Tyr Arg Gln Ser Arg Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 42 Gly Tyr Gln Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 43 Gly Arg Tyr Thr Gln Arg Gly 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 44 Gly Arg Phe Ser Gln Arg Gly 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 45 Gly Gln Arg Gln Thr Arg Gly 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 46 Gly Trp Gln Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 47 Gly Pro Arg Tyr Arg Gln Gly 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 48 Gly Ala Tyr Arg Gln Arg Gly 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 49 Gly Val Arg Tyr Arg Gln Gly 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 50 Gly Val Arg Gln Arg Gln Gly 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Q-tag <400> 51 Gly Tyr Arg Gln Arg Ala Gly 1 5 <210> 52 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q-tag example <400> 52 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Arg Gln Arg Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val Glu Val Val Lys Val 85 90 95 Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly His Ala His His His 100 105 110 His His His His His 115 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-tag example sequence <400> 53 Arg Tyr Glu Ser Lys Gly 1 5 <210> 54 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SlyD amino acid sequence <400> 54 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Pro His Asp Pro Glu Gly Val Gln Val Val Pro Leu Ser Ala Phe Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Glu Val Val Pro Gly Ala Gln Phe Tyr Ala Gln Asp Met 85 90 95 Glu Gly Asn Pro Met Pro Leu Thr Val Val Ala Val Glu Gly Glu Glu 100 105 110 Val Thr Val Asp Phe Asn His Pro Leu Ala Gly Lys Asp Leu Asp Phe 115 120 125 Gln Val Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu 130 135 140 His Gly His Ala His 145 <210> 55 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SlyD with a MTG Q-tag <400> 55 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Gln Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val Glu Val Val Lys Val 85 90 95 Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly His Ala His 100 105 110 <210> 56 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SlyD with a KalbTG Q-tag <400> 56 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Tyr Arg Gln Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val Glu Val Val Lys Val 85 90 95 Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly His Ala His 100 105 110 <210> 57 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SlpA amino acid sequence <400> 57 Met Ser Glu Ser Val Gln Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 30 Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu 35 40 45 Glu Gln His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60 Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu Ile Gln 65 70 75 80 Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu Ile Gly 85 90 95 Ala Ile Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110 Ile Arg Glu Ile Asn Gly Asp Ser Ile Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125 Leu Ala Gly Gln Thr Val His Phe Asp Ile Glu Val Leu Glu Ile Asp 130 135 140 Pro Ala Leu Glu Ala 145 <210> 58 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> main HTLV antigen and viral envelope glycoprotein amino acid sequence 'gp21' <400> 58 Ile Val Ser Ser Ala Cys Asn Asn Ser Leu Ile Leu Pro Pro Phe Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Pro Thr Val Gly Ser Arg Ser Arg Arg Ala Val Pro 20 25 30 Val Ala Val Trp Phe Val Ser Ala Leu Ala Met Gly Ala Gly Val Ala 35 40 45 Gly Gly Ile Thr Gly Ser Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu 50 55 60 His Glu Val Asp Lys Asp Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys 65 70 75 80 Asn His Lys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg 85 90 95 Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Cys Lys Ala 100 105 110 Leu Gln Glu Gln Cys Cys Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val Ser 115 120 125 Ile Leu Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp 130 135 140 Gly Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu 145 150 155 160 Gln Thr Gly Ile Thr Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Val Ile Leu Ala 165 170 175 Gly Pro Cys Ile Arg Cys Pro Cys Arg Thr Met His Pro 180 185 <210> 59 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of modified the 'gp21' ectodomain polypeptide sequence, engineered for better solubility, stability and reactivity in the immunoassay <400> 59 Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys Asp 1 5 10 15 Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu Leu 20 25 30 Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu 35 40 45 Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Ala Lys Ala Leu Gln Glu Gln Ala Ala 50 55 60 Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val Ser Ile Leu Gln Glu Arg Pro 65 70 75 80 Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu 85 90 95 Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gln Thr Gly 100 105 <210> 60 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant fusion protein 'TtSlyQD-Xa-gp21-8H' <400> 60 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Gln Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val Glu Val Val Lys Val 85 90 95 Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly His Ala His Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys 130 135 140 Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys Asp Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala 145 150 155 160 Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala 165 170 175 Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu 180 185 190 Ala Lys Ala Leu Gln Glu Gln Ala Ala Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser 195 200 205 His Val Ser Ile Leu Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu 210 215 220 Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ala Leu Gln Thr Gly Gly His His His His His His His His 245 250 255 <210> 61 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant fusion protein 'TtSlyD-Xa-gp21-8H' <400> 61 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Pro His Asp Pro Glu Gly Val Gln Val Val Pro Leu Ser Ala Phe Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Glu Val Val Pro Gly Ala Gln Phe Tyr Ala Gln Asp Met 85 90 95 Glu Gly Asn Pro Met Pro Leu Thr Val Val Ala Val Glu Gly Glu Glu 100 105 110 Val Thr Val Asp Phe Asn His Pro Leu Ala Gly Lys Asp Leu Asp Phe 115 120 125 Gln Val Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu 130 135 140 His Gly His Ala His Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg 165 170 175 Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys Asp 180 185 190 Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu Leu 195 200 205 Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu 210 215 220 Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Ala Lys Ala Leu Gln Glu Gln Ala Ala 225 230 235 240 Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val Ser Ile Leu Gln Glu Arg Pro 245 250 255 Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu 260 265 270 Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gln Thr Gly Gly His His 275 280 285 His His His His His His 290 <210> 62 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant fusion protein 'TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H' <400> 62 Met Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr Leu Gln 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu His Gly 20 25 30 His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Tyr Arg Gln Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val Glu Val Val Lys Val 85 90 95 Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly His Ala His Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Met Ser Glu Ser Val Gln Ser Asn Ser Ala Val 130 135 140 Leu Val His Phe Thr Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser 145 150 155 160 Thr Arg Asn Asn Gly Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser 165 170 175 Leu Ser Glu Gly Leu Glu Gln His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp 180 185 190 Lys Thr Thr Phe Ser Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser 195 200 205 Pro Asp Leu Ile Gln Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly 210 215 220 Glu Pro Glu Ile Gly Ala Ile Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser 225 230 235 240 Glu Met Pro Gly Val Ile Arg Glu Ile Asn Gly Asp Ser Ile Thr Val 245 250 255 Asp Phe Asn His Pro Leu Ala Gly Gln Thr Val His Phe Asp Ile Glu 260 265 270 Val Leu Glu Ile Asp Pro Ala Leu Glu Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Ile Glu Gly Arg Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His 305 310 315 320 Glu Val Asp Lys Asp Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn 325 330 335 His Lys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg 340 345 350 Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Ala Lys Ala Leu 355 360 365 Gln Glu Gln Ala Ala Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val Ser Ile 370 375 380 Leu Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly 385 390 395 400 Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gln 405 410 415 Thr Gly Gly His His His His His His His His 420 425 <210> 63 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide ,62-85' <400> 63 Ala Tyr Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Lys 20 <210> 64 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide ,241-255' <400> 64 Ala Leu Gln Glu Gln Ala Ala Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val 1 5 10 15 Ser Ile Leu Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg 20 25 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide ,241-255' <400> 65 Glu Ala Leu Gln Thr Gly Gly His His His His His His His His 1 5 10 15

Claims (14)

  1. 하기 일반식 I에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질로서, 상기 TG 기질은 서열번호 23에 따른 쿠트츠네리아 알비다 (Kutzneria albida) TG의 TG 기능을 위한 기질인, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질:
    (F*-L)y-X (I)
    [상기 식에서,
    F*은 FKBP 폴리펩티드의 FKBP 도메인의 아미노산 서열로부터 선택되고, 여기서 이의 "인서트-인-플랩 (insert-in-flap)" (IF) 도메인은 적어도 부분적으로, 5 내지 20개 아미노산의 아미노산 서열 ("Q-태그")에 의해 치환되며, Q-태그는 펩티드 서열 X1-YRYRQ-X2 (서열번호 1) (여기서, X1 및 X2 는 부재하거나 또는 링커 아미노산을 구성함) 의 YRYRQ 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 5개의 인접한 아미노산의 하위 서열을 포함하고;
    L은 부재하거나 또는 링커 아미노산 서열로부터 선택되고;
    X는 관심 단백질이고;
    y는 1 내지 100의 정수임].
  2. 제1항에 있어서, 상기 FKBP 도메인은 FKBP12, AIP, AIPL1, FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP7, FKBP8, FKBP9, FKBP9L, FKBP10, FKBP11, FKBP14, FKBP15, FKBP52, LOC541473, 및 SLYD로부터 선택되는 진핵생물 또는 박테리아 FKBP 폴리펩티드, 및 이의 FKBP 도메인의 상동체로부터 선택되는, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 FKBP 도메인은 약 120 내지 170개, 바람직하게 약 130 내지 160개, 및 가장 바람직하게 약 145 내지 155개의 상기 FKBP 폴리펩티드의 N-말단 아미노산을 포함하는, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FKBP 도메인은 SLYD 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 1 내지 64 및 123 내지 149를 포함하고, 아미노산 65 내지 122는 상기 Q-태그에 의해 치환되는, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 서열 L은 1 내지 20개의 아미노산을 포함하고, 바람직하게 상기 아미노산은 FKBP 도메인 및/또는 관심 단백질을 본질적으로 방해하지 않는, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 효소, 항원, 예컨대 바이러스 단백질, 항체 또는 이의 단편, 및 다른 면역학적 결합 파트너로부터 선택되는, 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질.
  7. 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법으로서,
    a) 관심 단백질에 부착시키려는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 재조합 트랜스글루타미나제 (TG) 기질을 제공하는 단계,
    b) 바람직하게 서열번호 23에 따른, 쿠트츠네리아 알비다의 트랜스글루타미나제의 유효량을 제공하는 단계,
    c) 알킬-아민 기, 예컨대, 예를 들어, 리신을 포함하는 연결되는 적합한 라벨을 제공하는 단계, 및
    d) 단계 a) 내지 c)에 따른 상기 성분들을 접촉시켜서, 상기 트랜스글루타미나제가 상기 라벨을 상기 기질에 부착시키는 단계
    를 포함하는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 쿠트츠네리아 알비다의 트랜스글루타미나제는 재조합적으로 생성되는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 라벨은 효소, 바이오틴, 방사성 기, 염료, 예컨대 형광발광성 염료, 동위원소, 화학발광성 라벨, 및 금속으로부터 선택되는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라벨링은 라벨 및 관심 단백질의 화학양론적 비율, 예를 들어 약 1:1에서 획득되는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 효소, 항원, 예컨대 바이러스 단백질, 항체 또는 이의 단편, 및 다른 면역학적 결합 파트너로부터 선택되는, 관심 단백질을 라벨링하기 위한 시험관내 방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생성되는 적어도 하나의 라벨링된 관심 단백질을 약학적으로 허용되는 담체 화합물과 함께 포함하는 약학 또는 진단 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 관심 단백질은 라벨 및 관심 단백질의 화학양론적 비율, 예를 들어 약 1:1에서 라벨링되는, 약학 또는 진단 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 따른 진단 조성물을, 임의로 면역어세이를 수행하기 위한 다른 성분과 함께 포함하는 진단 키트.
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