JP2003527561A - 蛋白の部位特異的標識化方法およびそのための使用 - Google Patents

蛋白の部位特異的標識化方法およびそのための使用

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Abstract

(57)【要約】 蛋白の部位特異的修飾方法を提供するものである。これらの方法はトランスグルタミナーゼを蛋白に導入したグルタミンペプチド配列と反応させることによって部位特異的に標識された蛋白を修飾するものである。本発明の部位特異的修飾方法はハイスループットスクリーニング法および細胞および無細胞を標的として目標とするための蛋白送達担体を製造するのに有用な試薬を製造するのに有用である。また新規のビオチン化剤も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は生物学的アッセイ、特に蛋白およびペプチドの部位特異的標識を使用
する、ハイスループットスクリーニング方法に関する。
【０００２】 （背景技術） 蛋白標識化方法はよく知られている。しかしながら、これらの方法は特定の蛋
白の標識化に限定されることも多く、使用するのに煩わしかったりする。蛋白の
結合または他の活性に不利な影響を及ぼすことなく、予測しうる標識化を得るか
、あるいは蛋白を標識することは困難である。さらに、この方法は精製蛋白に限
定されることも多い。 遺伝子工学によって蛋白の部位特異的修飾が可能になった。Satoらは、Bioche
mistry、３５、１３０７２−１３０８０（１９９６）において、ｈＩＬ−２蛋白
の末端にトランスグルタミナーゼに対する基質配列を有するｈＩＬ−２のキメラ
蛋白の設計について記載している。SatoのキメラｈＩＬ−２蛋白はトランスグル
タミナーゼで触媒される反応で二つのアルキルアミン、ＭＤＣおよびＰＯＥで修
飾される。 他に、通常、ビオチン化されていない分子を標識化するために、このような分
子の検出、精製および／または固定を可能とする、ビオチンの使用が記載されて
いる。しかしながら、蛋白をビオチン化する既知の方法のいくつかは蛋白の化学
的精製を必要とする。さらには、そのように標識すべき蛋白へのビオチンの組み
込み量を増加させる方法が望ましい。 必要とされるのは粗形態であってもよい蛋白を容易に標識する方法である。
【０００３】 （発明の開示） 本発明は、蛋白の精製を必要としない、生物学的アッセイ、特にハイスループ
ットスクリーニングを行うための方法および試薬を提供する。 一の態様において、本発明は第１蛋白と相互に作用する候補化合物のスクリー
ニング技法を提供する。この方法は、第１蛋白を配列：Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）（配列番号：１）を含有するように修飾し、
トランスグルタミナーゼを修飾された第１蛋白および検出可能な標識化化合物と
反応させてこの修飾された第１蛋白を標識化することからなる。標識した修飾蛋
白を少なくとも一つの候補化合物と接触させ、その標識を検出し、それによって
第１蛋白および候補化合物の相互作用を同定する。
【０００４】 一の具体例において、候補化合物は第１蛋白と第２蛋白の間の相互作用に影響
する。この具体例では、該方法はさらに、標識された第１蛋白を第２蛋白と接触
させ、標識された第１蛋白と第２蛋白の結合を候補化合物がある場合とない場合
とで比較して第１および第２蛋白の間の相互作用に影響する化合物を同定する工
程を含む。 もう一つ別の態様において、本発明は選択された蛋白の部位特異的標識化法を
提供する。この方法は選択された蛋白を配列：Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）（配列番号：１）を含むように修飾し、トランスグル
タミナーゼを選択された蛋白および標識化化合物と反応させ、それによって修飾
蛋白をグルタミン残基の部位にて標識化化合物で標識化することからなる。
【０００５】 もう一つ別の態様において、本発明は該発明の方法に従って標識した修飾蛋白
を提供する。 さらにもう一つ別の態様において、本発明は、式：ビオチン−Ｒ１−Ｒ２を有
し、Ｒ１がスペーサー化合物で、Ｒ２が少なくとも４個のメチレン基および１個
のＮＨ２基を有する化合物であるビオチン化試薬を提供する。好ましい具体例に
おいては、Ｒ１はＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐアミノ酸から選択され、Ｒ２はＬ
ｙｓである。
【０００６】 その上さらに別の態様において、本発明は、人工アミノ酸配列：（Ａａ）ｎ−
ＧｌｎＰ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−（Ａａ）ｎ’（配列番号
：２）を含み、ｎおよびｎ’が０から１００までで独立して選択され、Ｐが部位
特異的標識化化合物である、生物学的アッセイにて有用な標識された修飾蛋白を
提供する。 本発明は、第１標識を蛋白に組み込み、つづいてその第１標識を第２標識と置
換することのできる、蛋白およびペプチドの部位特異的標識化方法を提供すると
いう点で有利である。本発明のさらなる利点は可溶性および不溶性の両方の蛋白
または「オーファン」蛋白の発現をモニターするのに用いることのできる蛋白ま
たはペプチドの標識化方法を提供することである。加えて、本発明の標識化方法
および標識された修飾蛋白は、粗製蛋白混合物において用いることも容易であり
、ハイスループットスクリーニング法を含む自動スクリーニング法との関連で用
いるのに特に適している。
【０００７】 その上さらなる態様において、本発明は一の部分が選択した標的を目標とする
のに有用な修飾蛋白であって、人工アミノ酸配列：（Ａａ）ｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−（Ａａ）ｎ’を含み、ｎおよびｎ’が前記
と同じである、修飾蛋白を提供する。修飾蛋白の人工配列は、一の選択された部
分が修飾蛋白の結合部位から離れた位置で結合することを可能とし、その部分が
その修飾蛋白の選択された細胞または無細胞の受容体を標的とすることができる
。本発明はさらにはこのような修飾蛋白を含有する組成物、および本発明のこれ
らの組成物を用いて選択された部分を標的に送達する具体的方法を提供する。 本発明のもう一つ別の有利な点は本発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０００８】 （発明を実施するための最良の形態） 一般に、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて選択された蛋白を部位特
異的に標識化する方法、および生物学的アッセイ、特にハイスループットスクリ
ーニングアッセイにおけるこれらの標識蛋白の使用を提供する。本発明の標識蛋
白は蛋白の精製および固定に用いることもできる。また本発明ではこれらおよび
他の方法において使用される改良されたビオチン標識も提供される。さらに本発
明では細胞および無細胞の標的を目標とする際に使用される結合部位から離れた
位置にある蛋白を特異的に修飾する方法も提供される。
【０００９】 より具体的には、本発明の方法は、一の蛋白が所定のグルタミン（Ｇｌｎ）−
含有配列、最も好ましくは、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＬｅｕまたはＩ
ｌｅ）（以下、Ｇｌｎペプチド配列（配列番号：１）という）を含有するように
蛋白を修飾することを含む。その修飾蛋白は、その蛋白をトランスグルタミナー
ゼおよび修飾蛋白および／またはその標的を検出する手段（例えば、検出可能な
標識化化合物）または選択される部分をその標的に送達する別の手段（例えば、
トキシン）を付与することのできる、選択される部分と接触させることで標識さ
れる。 従来技術は、トランスグルタミナーゼの、Ｃａ２＋存在下、Ｒ−ＣＯＮＨ２＋
Ｒ’−ＮＨ２＿Ｒ−ＣＯＮＨＲ’＋ＮＨ３反応を触媒する能力について記載して
おり、ここでＲ−ＣＯＮＨ２はアクセプター、すなわち蛋白のＧｌｎ残基を示し
、Ｒ’−ＮＨ２はドナー、すなわちアルキルアミンを示している。しかしながら
、トランスグルタミナーゼはＧｌｎ残基すべてと反応するわけではなく、蛋白ま
たはペプチド配列内にあるＧｌｎ残基を認識するための要件は当該分野において
不明である。
【００１０】 本発明者は、上記した４個のアミノ酸配列の蛋白中の位置に拘わらず、Ｇｌｎ
残基（Ｇｌｎ残基が該アミノ酸配列に隣接または最も隣接する）に対する反応を
触媒しうることを見出した。かくして、本発明の方法は、標識を、要すれば、蛋
白のいかなる位置にも、例えば、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、または内部にも効果
的に組み込むことが可能である。従って、蛋白の機能的要件に適合するように特
定の位置を選択することができる。例えば、ケモキネシスのＮ末端修飾はその活
性に影響を及ぼすことがわかっているため、内部またはＣ末端修飾のいずれかが
好ましい。本発明の方法は部位特異的で予測可能な標識化操作を提供するため、
単一の分子種しか形成されない。さらに、標識化は所定の位置にあるため、修飾
蛋白の活性に対する外因的な標識化および作用は少なくあるいは防止される。
【００１１】 蛋白の部位特異的標識化方法 かくして、一の態様において、本発明は選択された蛋白を部位特異的に標識化
する方法を提供する。選択された蛋白は既知の配列を有することが最も望ましい
。別法として、例えば、所定のＧｌｎペプチド配列を選択された蛋白と融合させ
ることによって、配列の不明な選択された蛋白を利用することもできる。本明細
書で使用される「蛋白」なる語は、限定されるものではないが、融合蛋白、キメ
ラ蛋白などを含め、人工蛋白を包含する。便宜上、明細書全体を通して「蛋白」
で使用する。しかしながら、ペプチド配列を修飾（または本明細書に記載するよ
うに合成または処理）し、本明細書に定義されるＧｌｎ−ペプチド配列を含有さ
せ、本発明の部位特異的修飾蛋白について記載されるように使用されることが容
易にわかるであろう。
【００１２】 適当な蛋白を選択すれば、本明細書の記載に従ってＧｌｎペプチド配列を含む
ように蛋白を修飾する。一の好ましい具体例において、得られた修飾蛋白は、配
列：（Ａａ）ｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）−
（Ａａ）ｎ’（配列番号：３）を含有し、ここでｎは０ないし１００である（配
列番号：３）。ある具体例において、ｎは１ないし５０の範囲にあるのが望まし
く、別の具体例では、ｎは１ないし１０または１ないし４の範囲にあるのが望ま
しい。この配列はＮ−またはＣ−末端に位置していてもよく、選択蛋白内に埋め
込まれていてもよい。そして、ｎ’は０ないし１００の範囲から独立して選択さ
れてもよい。
【００１３】 選択蛋白の修飾は、例えば、化学合成、修飾されるアミノ酸配列をコードして
いるコドンの部位特異的修飾または他の遺伝子操作技法を含む、いずれか適当な
方法を用いて達成することができる。一般に、G.BaronyおよびR.B.Merrifield、
The Peptides：Analysis,Synthesis and Biology, Academic Press（１９８０）
；Chemical Modification of Enzymes, Eyzaguirre編（Ellis Horwood Limited
、Chichester）（１９８７）；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor NY、１９８９）を参
照のこと。別法として、Ｇｌｎペプチド配列（または選択された蛋白が人工Ｇｌ
ｎペプチド配列を提供するのに必要なそのフラグメント）を常套手段により選択
された蛋白に融合させることでその蛋白を修飾してもよい。かかる状況において
、融合のために使用されるペプチド配列は化学合成によって造られるかまたは適
当な方法を用いて処理することができる。Ｇｌｎペプチド配列（またはそのフラ
グメント）を選択された蛋白に融合させることでその蛋白を修飾する場合、その
Ｇｌｎペプチド配列はＮ−末端、ｃ−末端、または内部に位置してもよい。一つ
の望ましい具体例において、選択された蛋白に必要な修飾は（例えば、そのコー
ド化配列を改変することによる）蛋白の適当な位置にＧｌｎを導入することだけ
である。
【００１４】 修飾蛋白が得られれば、蛋白をトランスグルタミナーゼおよび適当な標識化化
合物と接触させる。本発明の方法で使用するために選択されたトランスグルタミ
ナーゼは、本発明に限定されるものではなく、当業者であれば容易に選択するで
あろう。４種の既知の哺乳動物トランスグルタミナーゼ：血漿トランスグルタミ
ナーゼまたは第ＸＩＩＩ因子、組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧＣ）、ケラチ
ノサイトトランスグルタミナーゼ（ＴＧＫ）および表皮トランスグルタミナーゼ
（ＴＧＥ）がある。さらに、ストレプトベルチシリウム・モバレンス（Streptov
erticillium mobarense）由来のトランスグルタミナーゼを含め、トランスグル
タミナーゼを細菌から得た。これらの酵素は市販品［例えば、Sigma Chemical社
］であるか、または当業者に公知の技術を使用して単離される。未変性トランス
グルタミナーゼ活性を有するこれらの蛋白またはそのフラグメント、または他の
選択されたトランスグルタミナーゼのいずれも、本明細書に記載の標識化反応を
行うのに十分な酵素的活性を有するであろう。
【００１５】 本発明に有用な標識化化合物は、トランスグルタミナーゼ触媒反応のための１
級アミンを形成するその能力にて、およびその１級アミンと検出可能な標識との
結合の間の距離にて、リジン側鎖を模倣する化合物に連結する慣用的に検出可能
な標識を含有する。このようなアミン供与体化合物は本明細書に示されるガイド
ラインを使用して容易に選択することができる。以下に一般的なトランスグルタ
ミナーゼ触媒のアミド基転移を示す：
【００１６】
【化１】
【００１７】 このように、一般的なトランスグルタミナーゼ反応において、一の（ポリ）ペ
プチドまたは蛋白のリジン側鎖は第２（ポリ）ペプチドまたは蛋白のグルタミン
に連結する。選択されたアミン供与体化合物は同様の方法にて一級アミンを提供
するという点からリジン側鎖を模倣する。典型的なアミン供与体化合物、ダンシ
ルカダベリンの反応を以下に示す：
【００１８】
【化２】
【００１９】 このようなアミン供与体化合物の適当な例は、カダベリン（ＮＨ２(ＣＨ２)５ ＮＨ２）および少なくとも４個のメチレン基および１個のＮＨ２を含む同様の部
分を含む。これらのアミン供与体化合物は、その検出を可能とし、本発明の標識
化化合物を形成する、慣用的な標識を備えている。アミン供与体化合物に関連し
て使用される適当な検出可能な標識は、潜在的化学反応基（ケタール、アセター
ル、チオエステルなどのマスクした求電子試薬または求核試薬）を有する、蛍光
および非蛍光性、放射性、着色性の置換基およびビオチンから選択される化合物
を包含してもよい。本発明の方法で用いることのできる標識化化合物のいくつか
の例は、テキサスレッドカダベリン、テトラメチルローダミンカダベリン、エオ
シンカダベリン、オレゴングリーンカダベリン、カスケードブルーカダベリン、
ボジピー(bodipy)ＴＲカダベリン、フルオレセインカダベリン、ルシファーイエ
ローカダベリン、ローダミングリーンカダベリン、およびセンシタイザーＤＴＰ
Ａランタニドキレートのリジン誘導体、およびルテニウムトリスビピリジルカダ
ベリンを包含する。ビオチンカダベリンがビオチンを導入するための許容される
標識化化合物であることが見出された。しかしながら、本発明者らは従来のビオ
チン化合物よりもビオチンの取り込みが有意に速く、より効率的である新規のビ
オチン標識化化合物を設計した。
【００２０】 それゆえ、もう一つ別の具体例において、本発明は、式：ビオチン−Ｒ１−Ｒ ２ で示され、ここでＲ１がスペーサー化合物であり、Ｒ２が少なくとも４個のメ
チレン基および１個のＮＨ２を含む化合物である改良した標識化化合物を提供す
る。本明細書で定義されるように、スペーサー化合物はビオチンとＲ２との間に
十分な距離を付与し、その結果、そのスペーサー化合物によって得られるビオチ
ン化試薬（標識化化合物）はビオチンカダベリンおよび他のビオチン分子が標識
される蛋白に組み込まれる能力に比べてそれよりも大きな能力を付与する。スペ
ーサー化合物は大きな疎水性化合物であるのが望ましい。適当には、かかるスペ
ーサー化合物は、修飾アミノ酸を含むアミノ酸、および化合物の中から容易に選
択することができる。一般に好ましい具体例としては、Ｒ１はＰｈｅ、Ｔｙｒお
よびＴｒｐアミノ酸の中から選択される。別の具体例としては、Ｒ１はナフトー
ル基またはその誘導体である。望ましくは、Ｒ２は少なくとも４個のメチレン基
およびＮＨ２を含む化合物から選択される。一の一般的に好ましい具体例におい
て、Ｒ２はリジンである。しかしながら、カダベリンまたは他の類似する基も容
易に利用することができる。本発明者は、配列：ビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｏ
Ｈを有するビオチンジペプチドが従来のビオチン標識よりも有意に改良されてい
ることを見出した。これらの利点を実施例２に示す。本発明のもう一つ別の望ま
しいビオチンジペプチドはビオチン−ニトロＴｙｒ−ｌｙｓ−ＯＨである。かく
して、本発明のこれらビオチン標識化化合物は、本発明の方法またはビオチン標
識化が望ましい他の用途に容易に利用することができる。
【００２１】 混合物および固相における蛋白の標識化 意外にも、本発明の方法が溶液中の純蛋白または粗蛋白混合物のどちらの標識
化にも用いることができることが見出された。トランスグルタミナーゼの機能は
蛋白を架橋すること、例えば、血餅形成におけるフィブリン架橋することにある
ので、この方法を粗蛋白混合物において用いることは期待されるものではない。
これらの標識化反応中、粗混合物中または精製蛋白を用いるものであっても、非
特異的架橋はまったく見られない。粗蛋白混合物の標識化はアッセイを行うのに
必要な費用と時間を減らすので、その標識化はハイスループットスクリーニング
法における使用では特に有用である。特に、粗製または不純な混合物中にある本
発明の標識された修飾蛋白を特異的に標識しうることは、アッセイを行う前にさ
らに精製する必要性を減少または不要とする。しかしながら、さらに蛋白の精製
が必要ならば、粗混合物中の修飾蛋白に標識を組み込み、さらなる蛋白精製を容
易にすることができる。最終的には、粗混合物中の修飾蛋白を標識することによ
って、蛋白の発現レベルをモニターすることができる。
【００２２】 本発明の方法の適応性は溶液中の蛋白に限定されない。蛋白は、固相において
、特にニトロセルロース、ＰＶＤＦなどの膜上で固定されていても、特異的かつ
効果的に標識することができる。それゆえ、不溶性蛋白を検出し、モニター観察
することもできる。さらには、いわゆる「オーファン」蛋白、抗体が見つからな
い蛋白を（すなわち、ウェスタンブロットに類似する方法にて）検出し、モニタ
ー観察することもできる。加えて、本発明の方法はＧｌｎペプチド配列を含むよ
うに適当に操作された蛋白の翻訳後修飾における発現レベルまたは変化を検出す
ることもできる。それゆえ、蛋白の検出に抗体を必要とするゲルおよび膜をベー
スとする方法はすべて抗体を使用しないこの方法と置き換えることができる。そ
れゆえ、この方法は蛋白分析（proteomic analyse）には非常に有用である。
【００２３】 アミド結合はトランスグルタミナーゼにより触媒され、化学的に極めて安定で
あるが容易に除去することのできる標識を有する本発明の選択された修飾蛋白が
得られると考えられる。この特性は共に本発明の有意な利点である。本発明が機
能する作用機序に拘束されることなく、本発明者らはこれらの利点は、使用され
る標識化化合物が修飾蛋白と比較的反応しにくい第一級アミンであって、一般に
加水分解されないという事実によるものと考える。そうして、標識化化合物は非
改変形態にて回復され、再利用することができる。さらに、本発明の修飾蛋白を
トランスグルタミナーゼおよび第１標識化化合物と接触させる前に形成されるア
ミド結合は、接触工程および第２標識化化合物を用いて形成される第２標識のア
ミド結合により置換されうる。それゆえ、修飾蛋白上の第１標識化化合物は標識
した修飾蛋白をトランスグルタミナーゼおよび所望の第２標識化化合物と接触さ
せることによって除去することができる。これは本発明の修飾蛋白が特定の用途
に合うように標識するこのができるという点から特に有用である。例えば、修飾
蛋白を、ビオチンなどの、精製を行うための第１標識化化合物で標識し、蛋白を
固定されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合させて、ついでカラムクロ
マトグラフィーを介する精製に付し、精製可能な第１標識化化合物を立体配置ま
たは視覚化アッセイにより適した蛍光標識化化合物と置換することもできる。さ
らに、蛍光標識化化合物と容易に置換することによって、本発明は修飾蛋白の蛍
光における修飾蛋白−標識化化合物相互作用の環境効果によって蛍光標識化化合
物の選択を最適化する非常に有用な手段を提供する。
【００２４】 部位特異的標識蛋白の使用 かくして、本発明は、本明細書で定義されるＧｌｎ−ペプチド配列を有する、
部位特異的標識蛋白の製法を提供する。修飾された標識蛋白は、生物学的アッセ
イ、蛋白精製および固定を含む種々の用途に、および蛋白の相互作用部位をマッ
ピングするために容易に用いることができる。
【００２５】 １．生物学的アッセイ 本発明の標識された修飾蛋白はいかなる生物学的アッセイにおいても容易に使
用される。しかしながら、これらの方法は特にハイスループットスクリーニング
法に有用であることが判明した。ハイスループットスクリーニング法は当該分野
にてよく知られており、標識蛋白に結合またはそれと相互作用する化合物を同定
するのに用いることができる。いずれの周知アッセイ、例えば、ラジオイムノア
ッセイ、競合性結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッ
セイ、抗体検出、ＥＬＩＳＡアッセイ、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆ
ＲＥＴ）および均質分解時間蛍光（ＨＴＲＦ）を含む蛍光エネルギー移動、蛍光
度、蛍光相関分光学、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、閃光プレート
アッセイおよび一つまたはそれ以上の要素の結合または固定に関する認識事象を
提供するためのビオチンの組み込みを必要とするアッセイなどを用いることがで
きる。例示であって限定することを目的とするものではない、トランスグルタミ
ナーゼ標識蛋白またはペプチドを用いることができる可能性のあるアッセイのい
くつかを以下で示す。
【００２６】 １）候補化合物との相互作用をモニターできるような修飾蛋白／ペプチドリガン
ドの標識化（例えば、蛍光色素を使用）。本明細書で使用されるように、候補化
合物は第２蛋白／ペプチドであってもよく、化合物であってもよい。標識された
修飾蛋白と候補化合物との相互作用は、直接的な、例えば、共有結合または非共
有結合に関するものであってもよく、また間接的な、例えば、中間化合物を介す
る、または標識された修飾蛋白にてコンフォメーション変化を惹起する蛋白また
はペプチドの位置に結合するものであってもよい。標識された修飾蛋白は溶液と
することができ、小胞または細胞膜にて結合または固定させることもできる。蛋
白間の相互作用を分子量の増加によって検出し、それで標識の蛍光偏光を用いて
相互作用をモニターすることもできる。
【００２７】 ２）固体担体に固定される候補化合物との相互作用をモニターできるような修飾
蛋白／ペプチドリガンドの標識化（例えば、蛍光色素、ランタニドキレート、放
射性標識などの使用）。相互作用は、非結合リガンドを分離した後、または非結
合リガンドが均質に存在する下で、組み込まれた標識に適する、蛍光度、放射分
析などによって検出される。
【００２８】 ３）修飾蛋白／ペプチドリガンドの標識化（例えば、蛍光標識の使用）および第
２蛋白／ペプチドの、２種の蛋白／ペプチドが相互作用すると、一方の標識の蛍
光度または寿命が第２標識によって調節されるような、第２標識を用いる標識化
。 ４）この標識された蛋白／ペプチドにおける酵素の作用が、例えば、プロテアー
ゼ作用のように標識をモニターするのに使用される読み出しに変化をもたらし、
蛋白／ペプチドの部分と標識を開裂させるような修飾蛋白／ペプチドの標識化（
例えば、蛍光色素、ランタニドキレート、放射性標識などの使用）。これによっ
て、遊離した標識を、標識に適した分離または読み出しの変化によって、標識の
特性、例えば蛋白をクエンチすることによって惹起される蛍光度が有用な方法に
て改変されるようなコンフォメーションの変化により定量することができる。
【００２９】 ２．ハイスループットスクリーニングアッセイ 本発明のトランスグルタミナーゼ触媒標識化方法および得られた標識された修
飾蛋白は、ハイスループットスクリーニング、特に自動ハイスループットスクリ
ーニング法では以下の理由のため特に有用である。第一に、標識された蛋白を粗
蛋白混合物中で使用できる：蛋白を精製する必要がない。第二に、標識と蛋白と
の結合は化学的に極めて安定している。第三に、不変状態の標識を回復し、再利
用できる。第四に、標識化は可逆的であり、第１標識は第２標識と容易に置換さ
れ、その結果、アッセイの要件に応じて標識を適合させることができる。第五に
、高レベルの蛋白の標識化が得られる。
【００３０】 自動ハイスループットスクリーニングの好ましい具体例において、各サンプル
のインキュベートする容量は約５００μｌ未満、好ましくは２５０μｌ未満、最
も好ましくは約１００μｌ未満である。このような少量のサンプル量は希少な候
補試薬の使用を最小限にする。さらに、標識化方法はコンピューター自動ハイス
ループットスクリーニング法においては特に有用である。各工程が独立して自動
操作されるかもしれず、または一本の腕を搭載している一体のコンピューター制
御ロボットにて多様な機能を行えるかもしれない。一般に、標準ハイスループッ
トアッセイ法に従って、例えば、９６、３８４、または１５３６個のウェルのプ
レートを用いてアッセイを形成し、各種アッセイで測定された相互作用を調節す
る化合物をスクリーニングする。
【００３１】 ３．蛋白固定 加えて、本発明の方法および標識された修飾蛋白は蛋白固定に用いることがで
き、それは共有結合カラムクロマトグラフィーを介する蛋白精製に有用であった
。例えば、市販の、化学的に活性化可能な不溶性樹脂、アミノヘキシル−セファ
ロース（Pharmacia）を、粗混合物または精製形態のいずれかの、本発明の修飾
蛋白と一緒に用いて、標識された修飾蛋白を樹脂に共有結合的に固定することが
できる。標識された固定蛋白はクロマトグラフィー法でそのように固定されてい
ない他のすべての蛋白より容易に分離されるであろう。共有結合的に固定した蛋
白は固定形態で使用されるか、またはその後のトランスグルタミナーゼおよび標
識化化合物との反応によって樹脂から可溶化される。この標識化化合物は、前記
のように、蛍光−カダベリン基質を包含し、それはトランスグルタミナーゼ−触
媒の樹脂からの解離の間に蛋白の検出を容易にする。別法として、固定した修飾
蛋白をハイスループットスクリーニング法におけるように使用できる。
【００３２】 ４．相互作用部位のマッピング 本発明の方法を用いて蛋白間の相互作用部位を地図作成することができる。特
に、同一または別の、少なくとも二つの蛋白は、本発明の方法を使用して修飾か
つ標識される。その後、これらの標識された修飾蛋白を特異的な非共有結合（例
えば、特異的な蛋白の同種および異種２量体および他の多量体の形成）に付し、
その蛋白のパートナーをω−ジアミノアルカンとの酵素（トランスグルタミナー
ゼ）反応によって近接のトランスグルタミナーゼエピトープを介して共有結合的
に架橋させてもよい。共有結合的に架橋した蛋白のパートナーは、蛋白変性、逆
相高性能液体クロマトグラフィーおよびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動のような分析法によって検出可能である。本発明の修飾蛋白
は本発明による部位特異的方法で標識され、それゆえ、架橋部位はペプチドマッ
ピングまたは蛋白を配列決定することなく決定できる。さらに、選択した蛋白を
本発明に従って複数のＧｌｎペプチド配列を含むように修飾し、その配列を蛋白
内の様々な位置に設け、それでその第２蛋白について構造を決定することができ
る。これによって、二つの蛋白間の相互作用部位を地図作成することができる。
【００３３】 細胞または無細胞標的の特異的標的化法 別の態様において、本発明の修飾蛋白は選択した部分を所望の標的に送達する
担体として使用される。本発明によれば、蛋白の結合部位から離れた部位に挿入
されている人工Ｇｌｎペプチド配列の部位にて選択された部分を修飾蛋白に結合
させることができ有利である。その修飾蛋白は選択した宿主細胞または結合相手
を具体的に標的としうることが望ましい。それゆえ、本発明の方法は選択した標
的に特異的に結合する能力を有し、有意に干渉することなく、送達担体としての
使用するために蛋白を修飾する方法を提供する。
【００３４】 一つの特に望ましい具体例において、本発明の送達担体として修飾した部位特
異的蛋白は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、
またはその機能的フラグメントであり、それは選択した標的に対して特異性を有
する。このような機能的フラグメントは抗体から誘導したＦａｂおよびＦ（ａｂ
’）２フラグメント、および抗体、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２フラグ
メントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列に基づいて産生された、これらの抗体
またはフラグメントと同じまたは実質的に等価な結合能力を有する合成分子を含
む。適当な抗体およびそのフラグメントはいずれか適当な方法、例えば、組換え
、合成、またはこれらの技術の組み合わせによって産生することができる。本発
明はこのような抗体の製法を選択することを限定するものではない。
【００３５】 もう一つ別の具体例において、例えば、所望の細胞レセプターを特異的に標的
とする、本発明の部位特異的修飾蛋白はウィルスに由来する。別法として、特定
のウィルスの細胞レセプター由来蛋白（例えば、ＣＤ４蛋白）は本発明に従って
ウィルスを標的とするように修飾される（例えば、抗ウィルス組成物での使用）
。送達担体として用いるための本発明の修飾される蛋白の選択は当業者の能力の
範囲内にあるものとする。
【００３６】 同様に、本発明は、本発明の修飾蛋白によって送達される部分を選択すること
に限定されない。このような部分は前記の通り、診断のための生物学的アッセイ
で有用な化合物（例えば、蛍光色素、放射性標識など）および治療に有用な化合
物から容易に選択される。適当な治療化合物は化学療法剤、例えば、リシンなど
トキシン、およびサイトカイン、インターロイキン、インターフェロンなどの免
疫療法剤を包含する。かかる部分を本発明の修飾蛋白に結合させるための敵と名
方法は、蛋白化学技術を含むが、これに限定されることなく、当業者に公知であ
る。蛋白化学技術の一般的記載に関しては、Chemical Modification of Enzymes
、ed．Eyzaguirre（Ellis Horwood Limited、Chichester）（１９８７）を参照
。
【００３７】 それゆえ、本発明の方法は選択された部分を標的に特異的に送達する方法を提
供する。この方法はインビボにおける使用に特に有利であり、本発明の修飾蛋白
が生理学的に適合する担体中の活性成分として有効量の修飾蛋白を送達する担体
を含む医薬組成物として調製される。
【００３８】 注射用の形態の、好ましくは生理学的ｐＨに緩衝化されている、修飾蛋白送達
担体（例えば、抗体）を含む水性懸濁液または溶液が好ましい。非経口投与用の
組成物は本発明の修飾蛋白溶液または医薬上許容される担体、好ましくは水性担
体に溶かしたそのカクテルを一般に含むであろう。様々な水性担体が、例えば、
０．４％セイライン、０．３％グリシンなどが使用される。これらの溶液は滅菌
状態で一般に微粒子ではない。これらの溶液は従来の、よく知られた滅菌法（例
えば、濾過）によって滅菌できる。組成物はｐＨ調整および緩衝剤などの生理学
的状態に近づけるのに必要な医薬上許容される副次的物質を含む。
【００３９】 このような医薬処方における本発明の修飾蛋白の濃度は広範囲に変化する、例
えば、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から、１５または２０
重量％までもあり、選択した投与の方法に従って、基本的に液量、粘度などに基
づいて選択されるであろう。 それゆえ、筋内注射用の本発明の医薬組成物を１ｍＬの滅菌緩衝液、および約
１ｎｇないし約１００ｍｇの本発明の修飾蛋白を含むように調製した。望ましく
は、組成物は約５０ｎｇないし約８０ｍｇの本発明の修飾蛋白を、より好ましく
は、約５ｍｇないし約７５ｍｇの修飾蛋白を含むことができる。同様に、静脈内
注入用の本発明の医薬組成物は約２５０ｍｌの滅菌リンガー液、約１ないし７５
、好ましくは５ないし約５０ｍｇ／ｍｌの本発明の修飾蛋白を含むように調製す
ることができる。非経口投与用の組成物の実際の製法はよく知られており、当業
者に自明である。このような方法は、例えば、Remington Pharmaceutical Scien
ce、１５th ed.、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaの中でより
詳細に記載されている。
【００４０】 本発明の修飾蛋白は、医薬製剤の場合、単一投与形であるのが好ましい。適当
な治療有効量は当業者によって容易に決定される。ヒトまたは他の動物における
炎症性障害を効果的に治療するには、一回服用で体重７０ｋｇにつき約０．１ｍ
ｇないし約２０ｍｇの本発明の修飾蛋白（例えば、修飾抗体）が非経口、好まし
くは静脈内または筋内に投与されるだろう。このような服用を、要すれば、医師
によって適切に選択された適切な時間間隔で繰り返してもよい。本明細書の修飾
蛋白は貯蔵のために凍結乾燥でき、従来技術を使用して使用前に適当な担体で復
元することもできる。 本発明は以下の具体的な、限定するものではない実施例を用いて説明する。
【００４１】 実施例１ グルタミン残基を含む数種のペプチド配列をトランスグルタミナーゼの基質と
して試験した。そのペプチド配列は第ＸＩＩＩ因子、市販のトランスグルタミナ
ーゼ［Enzyme Research Laboratories］の基質であることがわかっている配列に
基づいた。以下は効果的に標識されたペプチド配列の例である；これらの配列の
誘導体は蛋白に組み入れた。
【００４２】 ペプチド１：ＮＨ２−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２［配列番号：４］ ペプチド２：ＮＨ２−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２［配列番号：５］ ペプチド３：ＮＨ２−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２［配列番号：６］ 上記のペプチド１配列の変異体をイー・コリアシル担体蛋白（ＡＣＰ）のＮ−
およびＣ−末端上に遺伝子操作した。両方の改変されたＡＣＰはイー・コリ中の
可溶性蛋白として過剰に発現した。過剰発現した改変ＡＣＰの分析によって、そ
れらがアポおよびホロ蛋白の混合物であることがわかった。
【００４３】 ホロＡＣＰの存在はこれらの改変ＡＣＰが内因性のイー・コリホスホパンテテ
イン転移酵素活性に関して生物学的に活性であるというを示した。 テキサスレッドカダベリン、テトラメチルローダミンカダベリン、エオシンカ
ダベリン、オレゴングリーンカダベリン、カスケードブルーカダベリン、ボジピ
ーＴＲカダベリン、フルオロセインカダベリン、ルシファーイエローカダベリン
、ローダミングリーンカダベリン、およびセンシタイザー−ＤＴＰＡランタニド
キレートのリジン誘導体を含む、種々の蛍光および非蛍光カダベリンを、ＡＣＰ
および上記のペプチド１［配列番号：４］の誘導体のＮ−およびＣ−末端融合体
に組み入れた。
【００４４】 ローダミングリーンカダベリンを含む、特定のカダベリン誘導体の場合、ＡＣ
Ｐ−ペプチド１Ｃ−末端融合体の標識化効率は９０％より大きかった。Ｎ−末端
ペプチド１−ＡＣＰ融合体がダンシルカダベリンで標識され、Ｎ−末端配列決定
および質量マッピングを合わせて分析した場合も＞９０％の標識化効率であるこ
とが明らかにされた。Ｃ−末端改変ＡＣＰ（Ｃ−タグ化ＡＣＰ）を第ＸＩＩＩ因
子下でビオチンカダベリンおよびローダミングリーンカダベリンの両方と反応さ
せた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光イメージング（ローダミングリーンカダベリ
ン）またはストレプトアビジンＨＲＰ（ビオチンカダベリン）を使用するウェス
タンブロットアミノ基転移反応の進行を分析することによって改変ＡＣＰを予測
通りに標識できることがわかった。改変ペプチド配列を欠く天然のイー・コリＡ
ＣＰを使用する対照実験ではこれらのサンプルは標識されなかった。それゆえ、
改変第ＸＩＩＩ因子配列があることで、蛋白の部位特異的標識は可能になる。ロ
ーダミングリーンとの最適ではない反応における標識の程度は高分解イオン交換
によって８５％より大きいと推定された。 第ＸＩＩＩ因子の特異性が、Ｎ−タグ化およびＣ−タグ化ＡＣＰを含む、粗イ
ー・コリ抽出物をローダミングリーンカダベリンで標識して明らかにされた。Ｓ
ＤＳ ＰＡＧＥ分析およびＵＶ透視法によってタグ化ＡＣＰだけが各場合で標識
されるということがわかった。記載される通り、粗混合物中のトランスグルタミ
ナーゼ標識蛋白を検出し、モニターすることは可能である。それゆえ、原核生物
系および真核生物系における発現レベルをモニターすることができ、組換え蛋白
を精製しやすい基、例えばビオチンで標識することによって容易に精製できる。
【００４５】 実験の詳細を以下に記載する。 Ａ．ペプチド標識化： 典型的なペプチド標識化反応混合物は、４０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、６ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ８．３）の緩衝液中に、 ２８６単位／ｍｌのトロンビン活性化ＸＩＩＩａ因子； １ｍＭペプチド（すなわち、ペプチド１ 配列番号：４、ペプチド２ 配列番
号：５またはペプチド３ 配列番号：６）； ０．５ｍＭカダベリン誘導体、例えば、ダンシルカダベリンを含有した。 反応アリコートを０から２４時間までの様々な時間で取り出し、標識化反応を
５０ｍＭまでのＥＤＴＡを加えて停止した。サンプルをＨＰＬＣ分析の前に約２
０℃で保存した。ＴＦＡ／水／アセトニトリル溶媒系をＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカ
ラムとともに使用して反応成分を分離した。
【００４６】 ペプチド１［配列番号：４］基質を蛍光および非蛍光標識：ダンシルカダベリ
ン、ローダミングリーンカダベリン、フルオロセインカダベリン、およびセンシ
タイザー−ＤＴＰＡランタニドキレートのリジン誘導体の両方で標識した。 カダベリン誘導体標識ペプチドは未標識ペプチドの場合よりも種々のアセトニ
トリルの割合で溶離することがわかった。ペプチドの標識化は蛍光標識の吸収か
ら、可能なら、例えば、ローダミングリーンカダベリンの場合５０２ｎｍでモニ
ターした。このようなＨＰＬＣ分析から、ダンシルおよびローダミングリーンカ
ダベリンによるペプチドの標識の予測される範囲は２４時間後で９０％より大き
かった。質量分光法によってダンシルおよびローダミングリーン反応混合物中の
未標識ペプチド、遊離標識および標識ペプチドの有無が確認された。
【００４７】 Ｂ．遺伝子操作： ４種のＰＣＲオリゴヌクレオチドを、イー・コリアシル担体蛋白（ＡＣＰ）の
Ｎ−およびＣ−末端の両方にトランスグルタミナーゼペプチドタグを導入するよ
うに設計し、それを以前にｐＥＴ２２（ｂ）＋［Ｎｏｖａｇｅｎ］にクローン化
した。 Ｎ−末端タグを導入するように設計されたオリゴヌクレオチドは以下の通りで
あった： ＡＣＰ３（５’から３’へ）配列番号：７： ＴＧＴ−ＡＣＣ−ＴＣＡ−ＧＡＣ−ＣＡＴ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＣＴＧ−ＴＣＣ−
ＣＴＧ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＡＡＡ−ＧＴＴ−ＣＴＧ−ＣＣＧ−ＧＧＴ−
ＣＣＧ−ＡＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＧＡＡ−ＧＡＡ−ＣＧＣ−ＧＴＴ−ＡＡＧ ＡＣＰ２（５’から３’へ）配列番号：８： ＴＧＡ−ＴＧＴ−ＣＡＧ−ＴＣＡ−ＡＧＣ−ＴＴＡ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＧＴＧ−
ＧＣＣ−ＧＴＴ−ＧＡＴ−Ｇ
【００４８】 このヌクレオチドの対を使用すれば、ＰＣＲによってＡＣＰのＮ−末端にタグ
配列（Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−、配列番号：９、上記のペプ
チド１の配列に類似）を導入し、ＡＣＰの最初のＡＴＧ開始コドンを省き、蛋白
配列の残基をコードするだろう。Ｃ−末端タグを導入するように設計されたオリ
ゴヌクレオチドは以下の通りであった： ＡＣＰ１（５’から３’へ）配列番号：１０： ＴＧＴ−ＡＣＣ−ＴＣＡ−ＧＡＣ−ＣＡＴ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−
ＧＡＡ−ＧＡＡ−ＣＧＣ−Ｇ ＡＣＰ４（５’から３’へ）配列番号：１１： ＴＧＡ−ＴＧＴ−ＣＡＧ−ＴＣＡ−ＡＧＣ−ＴＴＡ−ＣＧＧ−ＡＣＣ−ＣＧＧ−
ＣＡＧ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＧＧＡ−ＣＴＧ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−
ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＧＴＧ−ＧＣＣ−ＧＴＴ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＡＴＣ
【００４９】 このオリゴヌクレオチドの対を使用すれば、ＰＣＲによってＡＣＰのＣ−末端
にタグ配列（−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、配列番号：１２、上記のペプチド１の
配列に類似）を導入し、タグの尾部に新規の終止コドンを導入するだろう。標準
ＰＣＲ条件下で、ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Clontech Laboratories
、Palo Alto、CA）を使用して、各タグ化ＡＣＰを産生した。サイクルパラメー
タは以下の通りである：１サイクルでは９５℃−５分、３０サイクルでは９５℃
−１．５分、５５℃−１分、６８℃−１分、および１サイクルでは６８℃−５分
。
【００５０】 各場合で得られた約２５０塩基対のＰＣＲ産物をプライマー対（プライマー配
列は上記の下線部）に取り込んだＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩという部位で切
断した。そのフラグメントを標準クローニング法［Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press NY、１９８９参照］を
使用してＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＥＴ−２２ｂ（＋）に結合させた。挿
入をジデオキシ配列から確認した。Ｎ−標識ＡＣＰおよびＣ−標識ＡＣＰの各場
合における単一の陽性クローンを発現において化学的に競合するイー・コリ鎖Ｌ
Ｗ２９（ＤＥ３）［ＡＴＣＣ］に形質転換させた。
【００５１】 Ｃ．イー・コリ ＬＷ２９（ＤＥ３）におけるＮ−およびＣ−タグ化ＡＣＰの発
現： １００μｇ／ｍｌカルベニシリンを補足した、１Ｌのテリフィックブロス（te
rrific broth）（Difco）をＮ−タグ化またはＣ−タグ化ＡＣＰ ｐＥＴ２２ｂ
（＋）構築物を含むＬＷ２９（ＤＥ３）細胞の１０ｍｌの一夜培養基に接種した
。培養基を３７℃でＡ６００が１．０になるまで振盪して培養させ、その際にＩ
ＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加えて発現を誘発した。培養物をさらに３時間；
０、１、２および３時間でＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を行ったサンプルとともに培養
させた。細胞を遠心分離によって収穫した。各タグ化ＡＣＰについての推定発現
レベルは約２０ｍｇ／Ｌであった。
【００５２】 Ｄ．Ｎ−およびＣ−タグ化ＡＣＰの精製： 汚染イー・コリ蛋白を除去するために５０％イソプロパノール沈降操作により
細胞溶解を行った。タグ化ＡＣＰをｐＨ３．９の酢酸沈降操作により濃縮した。
再溶解したＡＣＰをＱセファロース高速液体カラムに付し、５０ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ６．１、０から０．６５Ｍまでの塩化リチウムで勾配溶出させた。約０
．３Ｍ塩化リチウムで各タグ化ＡＣＰを溶出させた。蛋白を４０ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで透析した。精製完了時の最終収率
は約５０％であった。
【００５３】 Ｅ．Ｎ−およびＣ−タグ化ＡＣＰの特徴化： モノＱイオン交換クロマトグラフィーを使用して、精製したタグ化ＡＣＰのホ
ロ（ホスホパンテテイン化）およびアポ形態を区別して分離した。２０ｍＭトリ
ス−塩酸、ｐＨ７．５中０ないし１Ｍ塩化ナトリウムの勾配が２種のＡＣＰの分
離基準を与えることがわかった。タグ化アポＡＣＰは０．３５６Ｍ塩化ナトリウ
ムで溶出し、タグ化ホロＡＣＰは０．４２４Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。タグ
化ＡＣＰのアポおよびホロ形態は天然ＡＣＰの二つの形態に比べて低い塩濃度で
溶出した。ＦａｂＤアッセイおよびＦａｂＨ結合アッセイ（Ｒ．Ｊ．Ｈｅａｔｈ
＆Ｃ．Ｏ．Ｒｏｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０９９６−１１００
０（１９９６））によってＣ−タグ化ホロＡＣＰ種の生物学的活性が確認された
。
【００５４】 Ｆ．Ｎ−およびＣ−タグ化ＡＣＰの標識化： ２７０ユニット／ｍｌの第ＸＩＩＩ因子の反応を緩衝液１：４０ｍＭトリス−
塩酸、ｐＨ８．３、０．１５Ｍ塩化ナトリウム中の固定した４２ユニット／ｍｌ
のトロンビンで活性化した。カダベリン誘導体（ローダミングリーンおよびビオ
チン）を各標識反応において０．５ｍＭで使用した。６ｍＭのＤＴＴおよび５ｍ
Ｍ塩化カルシウム．０．５ｍｇ／ｍｌのタグ化ＡＣＰを含んだ標識化反応物を０
．５ｍｇ／ｍｌ天然ＡＣＰ対照サンプルに比較して、標識化反応で使用した。イ
ンキュベーションを室温で行った。アリコートを様々な時間で混合物から取り出
し、５０ｍＭ ＥＤＴＡを使用し、標識反応（Ｃａ２＋依存性第ＸＩＩＩ因子）
を停止した。ＮｕＰＡＧＥトリス−グリシンゲル（４−１２％）［Novex］を使
用し、標識化生成物を分析した。ローダミングリーンカダベリン標識化ゲルをＵ
Ｖ透視法で分析し、一方ビオチンカダベリン標識蛋白をウェスタンブロット／ス
トレプトアビジン−ＨＲＰ検出で分析した。種々のカダベリン誘導体は上記の条
件下でＣ−タグ化ＡＣＰを十分に標識するということがわかった。上記の条件下
で天然ＡＣＰ対照には標識はまったく組み込まれなかった。
【００５５】 Ｇ．Ｎ−タグ化およびＣ−タグ化ＡＣＰ含有のイー・コリ細胞溶解産物の標識化 Ｎ−タグ化およびＣ−タグ化ＡＣＰ構築物を含む５−ｍｌＬＢ培養物を１ｍＭ
イソプロピル−１−チオ−β−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトピラノシド［ＩＰＴ
Ｇ］で２時間誘発した。細胞を遠心分離で収穫し、音波処理で溶解させた。細胞
溶解産物をさらに遠心分離し、細胞残骸を除去した。クーマシープラス蛋白アッ
セイ試薬（Pierce）を使用して、溶解産物上澄み液中の総蛋白濃度（どちらとも
２ｍｇ／ｍｌ）を推定した。Ｎ−タグ化およびＣ−タグ化溶解産物を標識化実験
まで−２０℃で保存した。
【００５６】 ２５２ユニット／ｍｌの第ＸＩＩＩａ因子を１ｍＭローダミングリーンカダベ
リン、０．５ｍｇ／ｍｌ粗蛋白溶解産物、６ｍＭＤＴＴ、５ｍＭ塩化カルシウム
、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、４０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．３を含む各反応
混合物に加え、標識化反応を開始した。アリコートを１、４．５、２０および２
４時間で反応混合物から採取した。５０ｍＭＥＤＴＡを各アリコートに加え、反
応を停止した。マイクロバイオ−スピンＰ６カラム［Bio−Rad］を使用して脱塩
を行い、遊離標識を除去した。脱塩したサンプルをＮｕＰＡＧＥトリス−グリシ
ン４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Novex］で分析した。
【００５７】 Ｈ．エレクトロブロット（「Ｑブロッティング」）後のタグ化蛋白の検出 ヒトケモキネシス（ＣＫβ９）とペプチド１、２および３の誘導体を融合させ
てＡＣＰ−タグ構築物を上記の通り調製した。これらの融合物を含むイー・コリ
粗溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。蛋白をエレクトロブロットでニトロ
セルロース膜に移した。ブロットを１６５ユニット／ｍｌ第ＸＩＩＩａ因子、１
ｍＭビオチン−カダベリン、４０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．３、０．１５ｍＭ塩
化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、６ｍＭＤＴＴを含む反応混合物とインキ
ュベートする前にＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０で軽く濯いだ。標識化反応
物を１８時間室温で振盪した。ブロットを過剰のＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ
−２０で５回洗浄した。ブロットを１：２０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲ
Ｐ（Pierce）で４５分間室温においてインキュベートした。ブロットをＰＢＳお
よびＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで振盪しながら広く洗浄した。５分間につき
７回の洗浄を行った。標識蛋白をＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Amersham）検出システムで
検出した。三つすべての蛋白−ＣＫβ９縮合をこの手順で標識できることがわか
った。ＣＫβ９のみの対照は標識化されなかった。この技術によって抗体を必要
としないニトロセルロースのような固定担体上でタグ化蛋白を検出する技術の使
用を明らかにした。この手順はタグ化した組換え蛋白の発現レベルをモニターす
るのにも使用できる。
【００５８】 実施例２−改良ビオチン化剤 ＡＣＰ−ペプチド１Ｃ−末端融合を０．５ｍｇ／ｍｌＡＣＰ−ペプチド１融合
、１．５ｍＭビオチン−カダベリンおよび５０４ユニット／ｍｌ第ＸＩＩＩａ因
子の反応混合物においてビオチンカダベリン（Molecular Probes）で標識した
。組み込み効率は競合ＥＬＩＳＡで５６％であると測定された。
【００５９】 新規のビオチン化剤（例えば、標識化化合物）を収率上昇のために試験した。
この目的では、二つのビオチン化したジペプチド、ビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−
ＯＨおよびビオチン−ニトロＴｙｒ−Ｌｙｓ−ＯＨを０．５ｍｇ／ｍｌＡＣＰ−
ペプチド１融合、１．５ｍＭビオチン−カダベリンおよび５０４ユニット／ｍｌ
第ＸＩＩＩａ因子の反応混合物中で評価した。ビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ
ジペプチドの組み込みは、ビオチン−ニトロＴｙｒ−Ｌｙｓジペプチドの５５％
組み込み（図１）に比べて、モノＱイオン交換によって＞８５％であることがわ
かった（図２）。図２はＣ−タグ化ＡＣＰ標準を提供する。修飾ピークの同定は
反応の終わりに未修飾ＡＣＰを加えることから確認した（図４）。
【００６０】 実施例３− Ｑ−タグ化ＦａｂＨの構成、精製および標識化 Ｎ−末端Ｑ−タグ化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓＦ
ａｂＨ遺伝子構築物を予めクローン化したＦａｂＨｃＤＮＡからＰＣＲ増幅によ
って創製した。５’プライマー、配列番号：１３
【化３】 はＮｄｅＩ制限部位（下線）を、つづいてＱ−タグ−ＬＳＬＳＱＳＫＶＬＰＧＰ
−（配列番号：１２、ＤＮＡ配列、二重下線部）をコードする配列を含有した。
このオリゴヌクレオチドをＦａｂＨｃＤＮＡの５’末端にアニールし、開始のＭ
ｅｔ残基（太文字、囲んだＤＮＡ配列）を省く。３’プライマー、配列番号：１
４：
【化４】 をＦａｂＨ遺伝子（囲んだ太文字配列）の３’末端にアニールし、終止コドンを
含む（二重下線部）。このプライマーはクローニング用のＢｇｌＩＩ部位を含有
した（下線部）。
【００６１】 Ｑ−タグ化ＦａｂＨＰＣＲ産物をＫｌｅｎＴａｑＨＦポリメラーゼ（Clontech
）で増幅させ、標準方法を使用してＴ−ベクター（ｐＣＲ２．１、Invitrogen）
にクローンした。ジデオキシ配列決定によって配列を決定した後、Ｑ−タグ化Ｆ
ａｂＨＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を使用して、デカ−Ｈｉｓ
タグの下流にあるｐＥＴ−１６ｂ［Novagen］にクローンした（ｐＥＴベクター
をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩは適合性粘
着尾部を有する）。組換えＨｉｓ−タグ化、Ｑ−タグ化ＦａｂＨの蛋白配列は、
配列番号：１５：
【化５】 （改変Ｑ−タグに下線を付す）
【００６２】 挿入の確認後、Ｑ−タグ化ＦａｂＨｐＥＴ−１６ｂ構築物をイー・コリＬＷ２
９（ＤＥ３）に形質転換させた。２リットルの細胞培養物を１ｍＭＩＰＴＧで誘
発し、３時間増殖させた。誘発後、総細胞抽出物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析から約
４０ｋＤａの蛋白の堆積物が見つかった。Ｑ−タグ化ＦａｂＨの推定サイズは３
９．２ｋＤａであった。組換え蛋白をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー［Oiagen
］によってある段階においてはっきりと均質になるまで精製した。要するに、細
胞を５ｍＭイミダゾールを含むヘペス緩衝液に溶解させた。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を
加え、２時間穏やかに攪拌した。樹脂を洗浄し、結合した蛋白をイミダゾールの
量を増加させていく（５００ｍＭまで）段階的バッチ法で溶出させた。
【００６３】 第ＸＩＩＩａ因子を使用するフルオロセイン−カダベリンで精製蛋白を標識し
た。反応混合物（１ｍｌ）は４ｍｇＱ−タグ化ＦａｂＨ、５５４ユニット第ＸＩ
ＩＩａ因子および１．５ｍＭフルオロセイン−カダベリンを含んでいた。標識後
、反応物をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびＵＶ光に曝したゲルで分画した。Ｑ−タグ化
ＦａｂＨはフルオロセインで標識し、蛍光バンドは約４０ｋＤａで観察されるこ
とがわかった。その後、このフルオロセイン標識ＦａｂＨ蛋白は酵素活性である
ことがわかった。
【００６４】 実施例４−Ｑ−タグ化Ｅｐｏレセプターの構成および標識化 Ｑ−標識およびＩＥ８エピトープ［１３−２７のヒトベータアミロイドペプチ
ド残基］含有合成ＤＮＡフラグメントを配列決定オリゴヌクレオチドアニールお
よびＰＣＲ増幅で産生した。このフラグメントをＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞中の発現において合成ＥＰＯ(ｓＥＰＯ)レセプター−Ｑ
−ＩＥ８−ＦＸａ−Ｆｃ融合蛋白を産生するクローン化したＥｐｏレセプター（
ｐｍｔａｌｌｓＥＰＯｒ）内の同一部位間にサブクローニングしてＢｓｓＨＩＩ
およびＫｐｎＩ制限酵素切断部位に添付した。得られた構築物、ｐＭｔＳＥＰＯ
ｔｇをＳｐｅ１およびＸｂａ１で消化し、全ＥＰＯレセプター／トランスグルタ
ミナーゼ／ＩＥ８／Ｆ融合物を切り出した。このフラグメントをバキュロウィル
ス発現、ｐＦＢＥＰＯｔｇに関連する部位にあるｐＦａｓｔｂａｃ［Life Tech
nologies］に挿入した。
【００６５】 ＳＥＰＯレセプターＱ−ＦＣ融合物：配列番号：１６： 下線部＝シグナルペプチド 標準文字＝Ｅｐｏレセプター 太字＝Ｑ標識 イタリック＝ＩＥ８エピトープ 太下線部＝切断部位 太二重下線部＝ＩｇＧＦＣ領域
【化６】
【００６６】 バキュロウィルス発現の後に、Ｑ−タグ化ＥｐｏレセプターをＧ蛋白アフィニテ
ィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー［Pharmacia］で均質になるまで精製
した。Ｑ−タグ化Ｅｐｏレセプターを２７７．２ユニット／ｍｌの第ＸＩＩＩ因
子、０．５ｍｇ／ｍｌＥｐｏＲおよび１ｍＭローダミングリ−ン−カダベリン反
応内でローダミングリーンを使用して標識した。Ｑ−タグの代わりにＨｉｓ標識
を有するＥｐｏＲ種含有の対照反応も行った。室温で２２時間標識した後、反応
物をＳＤＡ ＰＡＧＥ／ＵＶ透視法で分析した。Ｑ−標識ＥｐｏＲ種のみが標識
され、陰性対照では蛍光は観察されなかった。
【００６７】 本明細書で引用した特許および特許出願を含め、これらに限定するものではな
いが、すべての刊行物は、仮に十分に記載されていても、その出典を明示するこ
とにより本明細書の一部とするものである。
【００６８】 本発明はその精神または本質的な属性から離れずに他の特定の形態として具体
化されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２２時間の時点でのビオチン−ニトロＴｙｒ−Ｌｙｓ−ＯＨを用
いてＣ−タグ化したＡＣＰの第ＸＩＩＩａ因子媒介標識化を示すクロマトグラム
である。
【図２】 ２２時間の時点でのビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨを用いてＣ
−タグ化したＡＣＰの第ＸＩＩＩａ因子媒介標識化を示すクロマトグラムである
。
【図３】 Ｃ−タグ化した標準を示すクロマトグラム３である。
【図４】 ２２時間の時点でのビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨを用いてＣ
−タグ化したＡＣＰの、未標識のＣ−標識したＡＣＰでスパイクした、第ＸＩＩ
Ｉａ因子媒介標識化を示すクロマトグラムである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/15 Ｚ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 33/58 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 デイビッド・ジェイ・パウエル イギリス、エイエル１・５エイエイ、セン ト・オールバンズ、ドレイクス・ドライブ (72)発明者 トーマス・ディ・ミーク アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、スコット・コート26番 (72)発明者 チェン・ウェンファン アメリカ合衆国19702デラウェア州ニュー アーク、コブル・クリーク・カーブ902番 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 BB29 BB51 FB02 FB06 FB07 FB12 GC15 2G054 CA23 EA03 GA04 GB01 4B024 AA11 BA80 CA04 CA06 DA06 EA04 HA01 4B063 QA18 QQ08 QR48 QR56 QS02 QS31 4B064 AG01 CA21 CB30 CD20 DA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA40 EA50 EA54 FA30 FA74

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第１蛋白と相互に作用する候補化合物をスクリーニングする
    方法であって、以下の工程： 配列：Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）（配列番号
    ：１）を含有するように第１蛋白を修飾し； トランスグルタミナーゼを該修飾第１蛋白および検出可能な標識化化合物と反
    応させることによって該修飾第１蛋白を標識化し； 標識した修飾第１蛋白を少なくとも一つの候補化合物と接触させ；および 標識を検出し、それによって該第１蛋白および該候補化合物の相互作用を同定
    することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 第１蛋白を（アミノ酸）ｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ
    ｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）−（アミノ酸）ｎ’（配列番号：３）からなる配列
    を含むように修飾し、ｎおよびｎ’が０から１００までで独立して選択される請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ｎが１ないし５０である請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 ｎが１ないし１０である請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 ｎが１ないし４である請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 第１蛋白を遺伝子工学で上記配列を含むように修飾する請求
    項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 第１蛋白を化学合成で上記配列を含むように修飾する請求項
    １記載の方法。
  8. 【請求項８】 上記の配列を第１蛋白の末端に融合させる請求項１記載の方
    法。
  9. 【請求項９】第１蛋白が粗製蛋白混合物内にある請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 第１蛋白の少なくとも８５％を標識する請求項１記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 上記の方法がさらに以下の工程： 第１蛋白上にある標識化化合物を第２標識化化合物に置換することを含む請求
    項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 上記の接触工程が少なくとも９６個のウェルを含むプレー
    トで行われる請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 上記のプレートが３８４個のウェルを含む請求項１２記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 上記のプレートが１５３６個のウェルを含む請求項１２記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 候補化合物が第１蛋白および第２蛋白の間の相互作用に影
    響する方法であって、以下の工程： 該標識第１蛋白を該第２蛋白に接触させ；および 該標識第１蛋白および該第２蛋白の間の結合を候補化合物がある場合とない場
    合にて比較して第１および第２蛋白の間の相互作用に影響する化合物を同定する
    、 ことを含む請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 第２蛋白が溶液中にある請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 第２蛋白が小胞にて結合する請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 第２蛋白が細胞膜にて結合している請求項１５記載の方法
    。
  19. 【請求項１９】 第２蛋白を固定する請求項１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 相互作用を分子量の増加で検出する請求項１５記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】 以下の工程： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）（配列番号：１）
    からなる配列を含むように選択された蛋白を修飾し；および トランスグルタミナーゼを上記の選択された蛋白および標識化化合物と反応さ
    せ、それによって該蛋白と該グルタミン残基の部位で該標識化化合物で標識する
    ことを特徴とする選択された蛋白の部位を特異的に標識化する方法。
  22. 【請求項２２】 修飾蛋白が、 （Ａａ）ｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）−（
    Ａａ）ｎ’（配列番号：３）からなる配列を含み、ｎおよびｎ’が０から１００
    までで独立して選択される請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ｎが１ないし５０である請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ｎが１ないし１０である請求項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ｎが１ないし４である請求項２１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 蛋白が粗蛋白である請求項２１記載の方法。
  27. 【請求項２７】 標識化化合物が標識を含むカダベリンおよびビオチンから
    成る群から選択される請求項２１記載の方法。
  28. 【請求項２８】 標識化化合物が蛍光カダベリンである請求項２７記載の方
    法。
  29. 【請求項２９】 請求項２１記載の方法で標識された蛋白。
  30. 【請求項３０】 式：ビオチン−Ｒ１−Ｒ２を有し、Ｘがスペーサー化合物
    で、Ｒ２が少なくとも４個のメチレン基および１個のＮＨ２基を含む化合物であ
    るビオチン化試薬。
  31. 【請求項３１】 Ｒ１がＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐアミノ酸からなる群か
    ら選択される請求項３０記載のビオチン化試薬。
  32. 【請求項３２】 Ｒ２がリジン（Ｌｙｓ）およびカダベリンからなる群から
    選択される請求項３０記載のビオチン化試薬。
  33. 【請求項３３】 ビオチン−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨからなる請求項３０記載
    のビオチン化試薬。
  34. 【請求項３４】 ビオチン−ニトロＴｙｒ−Ｌｙｓ−ＯＨからなる請求項３
    ０記載のビオチン化試薬。
  35. 【請求項３５】 人工アミノ酸配列： （Ａａ）ｎ−ＧｌｎＰ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）−
    （Ａａ）ｎ’（配列番号：３）を含み、ｎおよびｎ’が０から１００までで独立
    して選択され、Ｐが部位特異的標識化化合物である部位特異的標識蛋白。
  36. 【請求項３６】 人工アミノ酸配列： （Ａａ）ｎ−ＧｌｎＰ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−（ＬｅｕまたはＩｌｅ）−
    （Ａａ）ｎ’（配列番号：３）で示され、ｎおよびｎ’が０から１００までで独
    立して選択される部位特異的修飾修飾蛋白送達ビヒクル、およびこの修飾蛋白送
    達ビヒクルによって標的に送達される部分を含む分子。
  37. 【請求項３７】 送達蛋白が抗体およびその機能性フラグメントの中から選
    択される請求項３６記載の分子。
  38. 【請求項３８】 請求項３６記載の分子および生理学的に適合する担体を含
    む組成物。
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