JP2019508366A - トランスグルタミナーゼ認識部位を有するfkbpドメイン - Google Patents

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Abstract

本発明は、FKBPポリペプチドのFKBPドメインのアミノ酸配列を含む組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質であって、その「インサートインフラップ」(IF)ドメインが、ペプチド配列X−YRYRQ−X2(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸5〜20個のアミノ酸配列(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、前記TG基質がKutzneria albida TGのTG機能に対する基質である、組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質に関する。本発明はさらに、前記基質の使用に関する。【選択図】図4

Description

本発明は、FKBPポリペプチドのFKBPドメインのアミノ酸配列を含む組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質であって、その「インサートインフラップ(insert−in−flap)」(IF)ドメインが、ペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)、特にこのペプチド配列のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸5〜20個のアミノ酸配列(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、前記TG基質がKutzneria albida TG(KalbTG)のTG機能に対する基質である、組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質に関する。本発明はさらに、前記基質の使用に関する。
インビトロでの診断検査には、可溶性および/または免疫反応性の抗原およびそのバリアントが必須である。例として、HIV−1感染症を検出するために、ウイルス外被タンパク質gp41の組換えおよび可溶性バリアントが使用される。
免疫反応性抗原およびそのバリアントに必要な溶解性は、有効なアッセイの設計における難題となる場合があるが、ペプチジルプロリルイソメラーゼ(PPIアーゼ)活性を有する1つまたは複数のシャペロンユニットと融合させることにより改善することができる。スキャホールドにより提示されるポリペプチドドメインを操作するための、タンパク質スキャホールドを使用する技術が、抗体および抗体断片の分野で既知である。このように、抗体の抗原結合領域の可変ループなどのドメインを大きく操作して、既知の標的への結合性(例えば親和性および/または特異性)が改善されたアミノ酸配列セグメントが産生されてきた(WO 2014/071978を参照のこと)。
FK506結合タンパク質(FKBP)は、酵母からヒトまで多くの真核生物で確認されており、プロリン残基を含むタンパク質のタンパク質フォールディングシャペロンとして機能する。シクロフィリンとともに、FKBPはイムノフィリンファミリーに属する。ヒトゲノムでは、そのセグメントが、強力な免疫抑制性マクロライドであるFK506またはラパマイシンの標的である12kDaのタンパク質の配列と有意な相同性を有するタンパク質15種がコードされている。FKBP−12として知られる、FK506結合タンパク質(FKBP)の12kDaの原型は豊富に存在する細胞内タンパク質である。FKBP12は、プロリルcis/transコンフォメーション相互転換を触媒するPPIアーゼとして機能する。FKBPは、タンパク質フォールディング、細胞シグナル伝達、アポトーシスおよび転写を含む様々な細胞の機能に関与する。FKBPは、標的タンパク質に直接結合してコンフォメーションを変化させることによりその機能を引き出し、したがって分子スイッチとして作用する。
細菌slyD遺伝子は、FKBP型ペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼ(PPIアーゼ)をコードする。SlyDは、分子シャペロン、プロリルcis/transイソメラーゼ、およびニッケル結合タンパク質として機能する2ドメインの細菌タンパク質である。SlyDの一方のドメインに存在するシャペロン機能はツインアルギニン移行に関与し、タンパク質フォールディングにおけるプロリルcis/transイソメラーゼドメインの触媒効率を2桁増加させる。
SchlapschyおよびSkerra(Periplasmic chaperones used to enhance functional secretion of proteins in E. coli. Methods Mol Biol. 2011;705:211〜24にて)は、Escherichia coliにおいて、組換え遺伝子産物のフォールディング、およびタンパク質凝集すなわち封入体形成に関する問題に頻繁に直面することについて開示している。このことは特に、抗体断片、サイトカイン、増殖因子、および真核生物細胞表面受容体の細胞外断片を含む、構造上ジスルフィド結合を有するタンパク質に当てはまる。したがって彼らは、確立された4種のペリプラズムシャペロンおよび/またはフォールディング触媒:ジスルフィド架橋の形成および異性体化を触媒するチオール−ジスルフィドオキシドレダクターゼDsbAおよびDsbC、ならびにシャペロン活性を有する2種のペプチジル−プロリルcis/transイソメラーゼ、FkpAおよびSurAの過剰発現をもたらすヘルパープラスミドpTUM4を開発した。
E.coli SlyDおよびFKBP12(野生型および突然変異体C23AおよびC23S)は、E.coliにおいて可溶性形態として高収量で組換え産生可能である(Standaert、R.F.、ら、Nature 346 (1990) 671〜674)。好熱性生物由来FKBPおよびE.coli SlyDは、E.coliでのキメラポリペプチドの組換え発現においてシャペロンとして使用可能である(Ideno、A.、ら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99〜105)。E.coli SlyDおよびFKBP12ポリペプチドは、ポリペプチドを可逆的にフォールディングさせる(Scholz、C、ら、J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703〜12707)。Low C、らJ. Mol. Biol. 398 (2010) 375〜390は、Thermus thermophilus由来の金属シャペロンSlyDの結晶構造および機能的特徴について報告している。Thermus thermophilusは、2つの機能性ユニットに相当する2つのドメインからなる。PPIアーゼ活性は典型的なFKBPドメインに存在し、シャペロン機能は自律的にフォールディングされたインサートインフラップ(IF)ドメインに関連する。これら2つの分離したドメインは溶液中で安定かつ機能性である。
Kovermannら(Kovermann M、Schmid FX、Balbach J Molecular function of the prolyl cis/trans isomerase and metallochaperone SlyD. Biol Chem. 2013 Aug;394(8):965〜75にて)は、SlyDが分子シャペロン、プロリルcis/transイソメラーゼ、およびニッケル結合タンパク質として機能する2ドメインの細菌タンパク質であることを開示している。彼らは、SlyDの分子酵素機構についての最近の発見をまとめている。SlyDの一方のドメインに存在するシャペロン機能はツインアルギニン移行に関与し、タンパク質フォールディングにおけるプロリルcis/transイソメラーゼドメインの触媒効率を2桁増加させる。
FKBP12ポリペプチドのアミノ酸配列は、60位に単一のトリプトファン残基を含む。したがって、トリプトファン蛍光を分析するだけで、FKBP12突然変異体を構造上の完全性について分析することができる(DeCenzo、M.T.、ら、Protein Eng. 9 (1996) 173〜180)。残ったロタマーゼ(rotamase)活性を決定することで、FKBP12突然変異体の残った酵素活性についての試験を実施することができる(Brecht、S.、ら、Neuroscience 120 (2003) 1037〜1048; Schories、B.、ら、J. Pept. Sci. 13 (2007) 475〜480; Timerman、A.P.、ら、J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451〜2459)。FK506またはラパマイシンとの結合について決定することでも、FKBP12突然変異体の構造上の完全性を決定することができる(DeCenzo、M.T.、ら、Protein Eng. 9 (1996) 173〜180)。
Geitnerら(Geitner AJ1、Varga E、Wehmer M、Schmid FX. Generation of a highly active folding enzyme by combining a parvulin−type prolyl isomerase from SurA with an unrelated chaperone domain. J Mol Biol. 2013 Nov 15;425(22):4089〜98にて)は、フォールディング酵素の触媒ドメインとして機能する低分子プロリルイソメラーゼとしてのパルブリン(parvulin)について開示している。Escherichia coliのペリプラズム由来のSurA(survival protein A)は、不活性(Par1)および活性(Par2)パルブリンドメイン、ならびにシャペロンドメインからなる。シャペロンドメインが存在しない状態では、Par2のフォールディング活性は実質的に失われる。彼らは、FKBPファミリーにおける無関係のフォールディング酵素であるSlyDのシャペロンドメインを、SurAの分離したPar2ドメインのループに挿入することによりキメラタンパク質を作り出した。これにより、Par2がその天然のシャペロンドメインと結合しているSurAの活性より大きい値まで、Par2のフォールディング活性が450倍増加した。天然および外来性のシャペロンドメイン両方が存在する状態では、Par2のフォールディング活性が1500倍増加した。このように、関連するシャペロンドメインも無関係のシャペロンドメインも、プロリルイソメラーゼPar2のフォールディング活性を増強するのに同様に効率的である。各種シャペロンドメインの配列分析により、可動鎖領域(mobile chain region)において曝露されるメチオニン残基のクラスターが、フォールディングされていないタンパク質鎖との全体的な相互作用において重要である可能性があることが示唆される。この結合は非常にダイナミックであり、フォールディングしつつあるタンパク質鎖がシャペロンおよび触媒ドメイン間を頻繁に移行することができる。
免疫学的診断システムでは、抗原および/もしくは抗体またはその他の免疫学的結合相手(目的タンパク質)が大抵、これらの検出のため、例えばビオチン(ストレプトアビジンと固定化させるため)、またはルテニウムなどのその他の標識とさらにコンジュゲートされる。通常、このようなマーカーを反応性のアミノまたはスルフヒドリル部分とコンジュゲートさせるのには化学的方法が使用される。
不運なことに、タンパク質改変における従来の化学的戦略は制御が困難であり、それぞれが各自のインビボでの特徴を有する、可変の化学量論組成での不均一なイムノコンジュゲート集団を生じさせる。さらに、コンジュゲートされる分子または標識の数が制御不可能であり、そのため規定されず、通常は正規分布に従うことにより、反応を定量化しようとすると問題が起こる。
部位特異的かつ化学量論的なタンパク質改変のための、人工の生体直交性基(bio−orthogonal group)の導入は、この問題に対し見込みのある解決策をもたらす。このような戦略は流行しているものの、大抵は労力を要し、産物が不均一となるおそれが依然としてある。さらに、系の成分全てが、長期間およびコンジュゲーション条件下で安定でなければならず、また安定なままでなければならない。また、コンジュゲーションの位置/場所を制御することができない。例えばタンパク質の活性中心、もしくはその近くに、または免疫学的活性を媒介する位置、もしくはその位置近くにマーカーを非特異的に含めると、免疫反応性が妨害されるか、これが完全に阻害されることさえありうる。
マーカーを、酵素により部位特異的にコンジュゲートさせる方法は既知である(例えばソルターゼ、MTG)が、これらには、標識化される目的タンパク質にさらなる特異的な認識配列(タグ配列)の存在が必要である。
微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)は、多くの食品およびバイオテクノロジー用途でのタンパク質およびペプチドの架橋において最も重要な酵素の1つである。MTGは最初に生物Streptomyces mobaraensisで発見され、後にこれより抽出された。組換え産生されたStreptomyces mobaraensis MTGは、今日工業的に使用されるMTGのバルクの代表例である。この酵素は、アシル基、例えばグルタミン(Q)側鎖と、アルキル−アミン、例えばリジン(K)側鎖との間でのイソペプチド結合の形成を触媒する。反応性アミン基が存在しない状態では、水との酵素反応でグルタミン側鎖の脱アミノが起こる。この細菌酵素は、Ca2+またはGTPなどの補因子の添加なしに、広範なpH、緩衝液および温度条件で作用する。MTGは治療用抗体−薬物コンジュゲートの開発に既に使用されているが、酵素の特異性が低いため、このようなMTG媒介性コンジュゲートの大規模産生は未だ確立されていない。既知の活性な微生物トランスグルタミナーゼの全ての種類が、38kDa超の分子量を示す。天然に存在する架橋酵素であるため、微生物トランスグルタミナーゼは、アミン供与体分子に対しては広範な基質特異性を示し、アシル供与体に対しては比較的低い特異性を示す。Streptomyces mobaraenis由来の酵素およびホモログ酵素の基質特異性が知られているのみであるため、生体直交性コンジュゲーション手法、例えば、2つ以上の異なる標識−基質および2種類以上のトランスグルタミナーゼを使用する、生体分子の同時標識化は現時点では不可能である。
上記のことを考慮して、本発明の目的は、免疫学的診断システムおよび/または治療システムならびに免疫学的診断法および/または治療法の状況における、抗原および/または抗体またはその他の免疫学的結合相手(目的タンパク質)の効率的かつ制御された標識化を提供するための新規の手段および方法を提供することである。その他の態様および目的は、本発明についての以下のより詳細な記載を読めば当業者には明らかとなるはずである。
その第1の態様によれば、上記の目的は、以下の一般式I
(F−L)−X (I)
による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を提供することによって解決される。
前記式(I)において、Fは、好ましくは、未改変のポリペプチドでは、FK506結合タンパク質(FKBP)型のプロリルイソメラーゼである宿主ドメインの表面ループにゲストとして内部に挿入されている「インサートインフラップ」(IF)ドメインを含む、FKBPポリペプチドのFKBPドメインのアミノ酸配列から選択される。それにも関わらず、本発明は、Q−タグが酵素の相同な位置に挿入された、「インサートインフラップ」(IF)ドメインを天然に(未改変では)含まないFKBPドメインも含む(例えば、以下のKnappeらを参照のこと)。
前記「インサートインフラップ」(IF)ドメインは、連続する5個のアミノ酸のサブ配列(sub−sequence)を含む5〜20個の長さのアミノ酸を有するアミノ酸配列(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、サブ配列はペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)と、特にペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有し、XおよびXは不存在かリンカーアミノ酸を構成する。具体的な実施形態において、IFドメインは、5〜15個または5〜20個の長さのアミノ酸を有するX−YRYRQ−X(配列番号1)(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、Q−タグはアミノ酸5個の連続するサブ配列(すなわち連続する5個のアミノ酸残基からなるサブ配列)を含み、サブ配列はペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有し、XおよびXは不存在かリンカーアミノ酸を構成する。
より具体的な実施形態においては、Xのみが不存在であり、ペプチド配列X−YRYRQ−Xの長さがアミノ酸6〜15個または6〜20個である。さらにより具体的な実施形態において、Xは、YRYRQサブ配列またはYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有するサブ配列の後に直接、アルギニン残基を含む(か、これらからなっていてよい)。
さらに非常に具体的な実施形態において、ペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する連続する5個のアミノ酸残基からなるサブ配列において、グルタミン残基がサブ配列の選択された位置にあり、サブ配列におけるその位置は、第3位、第4位、第5位、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
さらに非常に具体的な実施形態において、ペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する連続する5個のアミノ酸残基からなるサブ配列において、アルギニン残基がサブ配列の選択された位置にあり、サブ配列におけるその位置は、第4位、第5位、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
本発明によれば、リンカーアミノ酸XおよびXがもしあれば、互いに独立に選択されることがさらに理解される。
配列X−YRYRQ−X(配列番号1)、X−RYRQR−X(配列番号2)、X−RYSQR−X(配列番号3)、X−FRQRQ−X(配列番号4)、X−RQRQR−X(配列番号5)、X−FRQRG−X(配列番号6)、X−QRQRQ−X(配列番号7)、X−YKYRQ−X(配列番号8)、X−QYRQR−X(配列番号9)、X−YRQTR−X(配列番号10)、X−LRYRQ−X(配列番号11)、X−YRQSR−X(配列番号12)、X−YQRQR−X(配列番号13)、X−RYTQR−X(配列番号14)、X−RFSQR−X(配列番号15)、X−QRQTR−X(配列番号16)、X−WQRQR−X(配列番号17)、X−PRYRQ−X(配列番号18)、X−AYRQR−X(配列番号19)、X−VRYRQ−X(配列番号20)、X−VRQRQ−X(配列番号21)、およびX−YRQRA−X(配列番号22)から選択され、XおよびXが上記の通りである、本発明によるQ−タグが好ましい。
驚くべきことに、IFドメインのFKBPドメイン上流および下流挿入の2つの部分(the two parts of the FKBP domain upstream and downstream insertion of the IF domain)が、構造的に相当に強固かつ正確なスキャホールド、またはIFドメイン部分に挿入されるかつ/もしくはこれを置換する配列のための「カラー(collar)」(「ヘッド」、「Q−タグ」)として機能することが発見された。このため、挿入/置換の提示および方向づけにより基質のその他の成分の任意のその他の機能、具体的には目的タンパク質(X)の機能が実質的に妨害されることは、確実になくなる。さらに、−この場合−TG基質結合部位(Q−タグ)の提示により、標識の高度に制御された化学量論的結合、したがって目的タンパク質の標識化につながる。
式(I)において、Lは不存在かリンカーアミノ酸配列から選択される。好ましくは、前記リンカー配列Lは1〜20個のアミノ酸を含み、より好ましい前記アミノ酸は、FKBPドメインの機能(具体的には置換/挿入)および/またはタンパク質(目的s9)の機能(例えば免疫学的機能)を本質的に阻害しない。
Xは目的タンパク質を示し;好ましくは酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される。
式(I)において、yは1〜100の整数であり、したがって、いくつかのマーカー基F−Lが目的タンパク質に結合されうる。
好ましくは、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質は、例えばNおよび/またはC末端に、ビオチン、マルトースまたはhisタグなどの、精製および/または固定化用タンパク質タグをさらに含んでいてよい。
好ましくは、TG活性を使用する制御された基質標識化を可能にするため、基質F、Lおよび/またはXの様々な成分が互いに共有結合される。基質は融合タンパク質として組換え産生可能であり、例えば、細菌または酵母宿主細胞などの宿主細胞から発現および精製されうる。各方法は当業者にとって周知である。成分は、別々にまたは一部産生(例えば合成)することもでき、次いで、状況および望ましい目的に応じて、共有結合またはコンジュゲートされる。
本発明によれば、発明によるTG基質は、配列番号23によるKutzneria albida TG、またはそのアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95、98もしくは99%同一であり、本明細書に記載される実質的なTG活性を示す相同なタンパク質のトランスグルタミナーゼ(TG)機能に対する基質である。好ましくは、TGポリペプチド、またはその、実質的なトランスグルタミナーゼ機能もしくは活性を有する一部が宿主細胞でクローニングおよび組換え産生され、次いで、状況および望ましい目的に応じて(少なくとも一部)精製される。各方法は当業者に周知である。TG活性は、これも当業者に周知のアッセイを使用して測定することができる。本発明の文脈での「組換えTG基質」は、基質が概して天然には存在しないことを意味するものとする。
本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質に使用されるFKBPドメインは、好ましくはFKBP12、AIP、AIPL1、FKBP1A、FKBP1B、FKBP2、FKBP3、FKBP5、FKBP6、FKBP7、FKBP8、FKBP9、FKBP9L、FKBP10、FKBP11、FKBP14、FKBP15、FKBP52、LOC541473、およびSLYD、および、これらのアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95、98または99%同一であり、Q−タグの挿入に適した、これらのFKBPドメインのホモログから選択される真核生物または細菌FKBPポリペプチドから選択される。各ドメインを、本明細書および文献に記載されるように、例えば、具体的には構造上のアラインメントを特定するためアラインメントプログラムを使用して、その適合性について分析することができる。
一実施形態において、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質に使用されるFKBPドメインは、PPIアーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含む。PPIアーゼ活性を有するポリペプチドは、原核生物または真核生物起源であるか、それらの人工のバリアント(突然変異体)としての、PPIアーゼ活性を有するポリペプチドである。PPIアーゼ活性を有するポリペプチドの人工のバリアントは、タンパク質工学の最新技術による技術で生成可能である。本発明によれば、PPIアーゼ活性を有するポリペプチドの人工のバリアントは、例えば1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を特徴とする。具体的な実施形態では、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ基質に使用されるFKBPドメインのPPIアーゼ活性および/またはシャペロン機能が、人工のバリアントで保存される。
Knappeら(Knappe TA、Eckert B、Schaarschmidt P、Scholz C、Schmid FX. Insertion of a chaperone domain converts FKBP12 into a powerful catalyst of protein folding. J Mol Biol. 2007 May 18;368(5):1458〜68. Epub 2007 Mar 14にて)は、プロリルイソメラーゼとしてのヒトFKBP12の触媒活性が、短いペプチドに対しては高いがプロリン制限性のタンパク質フォールディング反応では非常に低いことを開示している。対照的に、FKBPファミリーのメンバーであるSlyDタンパク質は、フォールディング酵素として非常に活性である。これらは、プロリルイソメラーゼ活性部位近くにさらなる「インサートインフラップ」つまりIFドメインを含む。このドメインを除去しても、短いペプチド基質に対するEscherichia coli由来のSlyDのプロリルイソメラーゼ活性に影響はなかったが、プロリン制限性タンパク質フォールディング反応では触媒活性が失われた。ヒトFKBP12にSlyDのIFドメインを相互挿入(reciprocal insertion)するとフォールディング活性が200倍増加し、SlyD自体よりも活性なフォールディング触媒が生じた。IFドメインはリフォールディングしつつあるタンパク質鎖に結合し、そのためシャペロンモジュールとして機能する。
E.coliでは、SLYDのアミノ酸1〜69がPPIアーゼドメインの第1の部分を形成し、アミノ酸76〜120がIF−シャペロン(ドメイン)を形成し、アミノ酸129〜151がPPIアーゼドメインの第2の部分を形成すると考えられている。したがって、アミノ酸1〜151がFKBPドメインを形成する。アミノ酸152〜196は金属結合に関与する。
前記FKBPドメインが、約120〜170個、好ましくは約130〜160個、および最も好ましくは約145〜155個の長さの、前記FKBPポリペプチドのN末端アミノ酸を有する、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質が好ましい。これは、IFドメイン配列を含む。
本発明の文脈では、「約」は所与の値の+/−10%を意味するものとする。
前記FKBPドメインがSLYDポリペプチドのN末端アミノ酸1〜64および123〜149を含み、アミノ酸65〜122が前記Q−タグで置換されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質が好ましい。
上記の通り、リンカー配列Lは1〜20個のアミノ酸、好ましくは1〜10個のアミノ酸、より好ましくは1〜5個のアミノ酸を含んでいてよく、好ましくは、前記アミノ酸はFKBPドメインおよび/または目的タンパク質を本質的に妨害しない。好ましいリンカーアミノ酸はグリシンまたはアラニンなどの低分子アミノ酸である。アミノ酸リンカーおよびそれらの組成物は当技術分野で既知である(例えばChichiliらLinkers in the structural biology of protein−protein interactions Protein Sci. 2013 Feb; 22(2): 153〜167を参照のこと)。
本発明の文脈において目的タンパク質とは、概して、本技術を使用して標識化されうるタンパク質全てである。前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質が好ましい。本発明は、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイに特に使用される。
次いで、本発明の別の態様は、目的タンパク質を標識化するインビトロ方法であって、a)目的タンパク質を含む、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を用意するステップ;b)本明細書に記載される、有効量の、Kutzneria albidaのトランスグルタミナーゼ(例えば配列番号23による)またはそのホモログを用意するステップ、c)例えばリジンなどの、アルキル−アミン基(「アミン供与体」)を含む適切な標識を用意するステップ、および、d)a)〜c)による前記成分を接触させ、それにより前記トランスグルタミナーゼ(活性)が前記標識を前記基質に結合させるステップを含む、インビトロ方法に関する。
本明細書に記載されるKutzneria albidaの前記トランスグルタミナーゼまたはそのホモログが、本明細書に記載されるように組換え産生される、本発明による方法が好ましい。
本発明によるこの方法において、Q−タグ(任意選択でIF−ドメイン領域を置換)を含むF基を含む基質は、Kutzneria albidaのトランスグルタミナーゼ活性を使用して標識化される。好ましくは、結合される標識は、酵素、ビオチン、放射性基(radioactive group)、蛍光色素などの色素、同位体、および金属から選択される。前記標識は、例えばリジンなどの、アルキル−アミン基を含む標識成分/化合物の一部である。最も好ましくは、前記標識成分/化合物は、ペプチド配列RYESKと少なくとも80%の配列同一性を有するアミン供与体タグ(「K−タグ」)を含む。好ましいK−タグおよびそれらの組成物の例は以下に記載され、文献でも見つけることができる。
前記標識化が、制御され、かつ例えば、標識および目的タンパク質の化学量論比例えば約1:1で実現される、本発明による方法が好ましい。2つまたは偶数倍の標識を単一/複数の目的タンパク質に結合させるため、さらなる酵素(例えばKalb−TG以外のTG)およびその他の各TG基質を使用して、複数標識化を実現することもできる。
前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、本発明による方法が好ましい。本発明は、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイに特に使用される。
目的タンパク質の選択は、療法、研究および/または診断のいずれかにおける、使用されるpiRNA分子の意図される用途によっても決まる。前記目的タンパク質が、がん、神経疾患、免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、妊孕性(例えば繁殖率または数)、動物産生(例えば肉または乳の量)に関係する/を引き起こすタンパク質、細胞増殖および/もしくは発達、mRNA分解、翻訳抑制、ならびに/または転写遺伝子のサイレンシングに必須のタンパク質から選択される、本発明による方法が好ましい。
次いで、本発明の別の態様は、本発明による少なくとも1つの組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を、緩衝液などの、薬学的に許容される担体および成分とともに含む医薬組成物または診断用組成物に関する。2つまたは偶数倍の標識を単一/複数の目的タンパク質に結合させることができるように、さらなる酵素(例えばKalb−TG以外のTG)およびその他の各TG基質を含む、複数標識化のための医薬組成物または診断用組成物を得ることもできる。
次いで、本発明の別の態様は、本発明による方法に従って産生される少なくとも1つの標識化された目的タンパク質を、緩衝液などの薬学的に許容される担体および成分とともに含む医薬組成物または診断用組成物に関する。
前記目的タンパク質が、標識および目的タンパク質の化学量論比例えば約1:1で標識化される、本発明による医薬組成物または診断用組成物が好ましい。2つまたは偶数のいくつかの標識を単一/複数の目的タンパク質に結合させることもできる。
次いで、本発明の別の態様は、本発明による診断用組成物を、任意選択で、イムノアッセイを実施するためのその他の成分とともに含む診断用キットに関する。キットは、共同のまたは別々の容器に、微生物組換えトランスグルタミナーゼ、例えば本明細書に記載されるKutzneria albida微生物トランスグルタミナーゼと少なくとも80%の配列同一性を有する精製済み微生物トランスグルタミナーゼを含んでいてよい。キットは、ペプチド配列RYESKと少なくとも80%の配列同一性を有するアミン供与体タグを含む基質などの基質をさらに含んでいてよい。キットは、本発明による標識化されたまたは標識化されていない基質の使用が必要な反応(例えばイムノアッセイ)を実施するための説明書も含んでいてよい。
本発明の別の態様は、具体的には、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイにおける、目的タンパク質を標識化するためのまたは目的タンパク質の標識化での、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質、医薬組成物または診断用組成物、またはキットの使用に関する。
本発明の方法は、インビボでもインビトロでも、具体的には実験動物でも培養物でも実施可能である。
これより、本発明について、添付の図を参照して以下の非限定的な例でさらに説明を行う。本発明において、本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献が、その全内容にわたって参照により組み込まれる。
Kutzneria albida由来のトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列(データベース番号WP_030111976)、E.coliのslyDのアミノ酸配列、Cyclobacteriaceae bacterium AK24のslyDのアミノ酸配列、およびBacteroidales bacteriumのslyDのアミノ酸配列を示す図である。 以下の実施例による、Cy3またはCy5を使用した標識化の結果を示す図である。図2Bは、6.2〜9.0の範囲では比較的pH非依存であることを示す。 図3Aは、ルテニウム(rhutenium)で標識化された融合構築物の一般的な構造を示す図である。図3Aは、以下の実施例による、SDS−PAGEを使用した標識化の結果を示す図である。 本発明による、基質を標識化された目的タンパク質(ここでは、抗体の鎖2本)の好ましい実施形態を示す図である。 図5A:配列番号60の「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」を示す概略図である。SlyD部分、さらに実施例で示す、融合タンパク質中のQ−タグ、および第Xa因子プロテアーゼの認識部位、および「gp21」部分が示される。星はルテニウム標識を象徴する。図5B:Streptomyces mobaraensisの細菌トランスグルタミナーゼによる、組換えgp21(HTLV)抗原の特異的および非特異的ルテニウム標識化について示す、SDS−PAGE分析後の結果を示す図である。Ru標識化後の、非標識化、一重標識化、二重標識化、および三重標識化された「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」融合タンパク質が示される。 図5C:ルテニウム標識について示す図である。 図6A:Elecsysアッセイにおいて、配列番号62による標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」を使用した結果を示す図である。 図6B−D:Elecsysアッセイにおいて、配列番号62による標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」を使用した結果を示す図である。 図6E:Elecsysアッセイにおいて、配列番号62による標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」を使用した結果を示す図である。
配列番号1〜22は、本発明の文脈で特定されるQ−タグモチーフの配列を示し、N末端のXは上記の通りX、C末端のXは上記の通りXである。
配列番号23は、Kutzneria albida由来のトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列(データベース番号WP_030111976)を示す。
配列番号24は、E.coliのslyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号25は、Cyclobacteriaceae bacterium AK24のslyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、Bacteroidales bacterium CFのslyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、E.coliのslyDのFKBPドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号28は、E.coliのFKBP16のFKBPドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号29は、Thermus thermophilusのslyDのFKBPドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号30〜51は、N末端およびC末端アミノ酸が1つの例示的なグリシンリンカーである、本発明の文脈で特定されるQ−タグモチーフの配列を示す。
配列番号52は、SlyDのFKBPドメインに組換えにより移植された、KalbTGグルタミン供与体配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号53は、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列(K−タグ)のアミノ酸配列を示す。
配列番号54はSlyDアミノ酸配列を示す。
配列番号55は、MTG Q−タグを有するSlyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号56は、KalbTG Q−タグを有するSlyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号57はSlpAアミノ酸配列を示す。
配列番号58は、主要なHTLV抗原およびウイルスエンベロープ糖タンパク質アミノ酸配列「gp21」を示す。
配列番号59は、イムノアッセイにおけるより良好な溶解性、安定性および反応性のために操作された、改変「gp21」エクトドメインポリペプチド配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号60は、組換え融合タンパク質「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」のアミノ酸配列を示す。
配列番号61は、組換え融合タンパク質「TtSlyD−Xa−gp21−8H」のアミノ酸配列を示す。
配列番号62は、組換え融合タンパク質「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」のアミノ酸配列を示す。
IFドメインの位置の特定
基本的には、例えばプログラムClustal Omegaを使用して、置換される(または付加される)IFドメインの位置を特定するため、FKBPドメインのアミノ酸配列の一次構造のアラインメントを使用することができる。ドメインが構造的に保存されたエレメントを構成することから、特に非細菌FKBPに関しては、代替法は3D構造のアラインメントである(例えばプログラムPyMolを使用して)。
具体的な例は以下の通りである:
Escherichia coli(株K12)FKBPドメインのSLYD_ECOLI FKBP型ペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼSlyD、IFドメインに二重下線を引いてある。
Escherichia coli(株K12)FKBPドメインのECOLI FKBP型16kDaペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼ、IFドメインに二重下線を引いてある。
Thermus thermophilus(株HB8/ATCC27634)FKBPドメインのペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼ、IFドメインに二重下線を引いてある。
KalbTGに対するQ−タグ配列の分析
NおよびC末端グリシン残基3つ(GおよびG)が結合した5−merアミノ酸配列を含む一連のペプチドを用いた標識化アッセイを使用して特定されたKalbTGペプチド基質の分析により、これらの基質が共有する一連の特徴が明らかとなった。具体的な例は以下の通りであった:
−YRYRQ−G(配列番号30)、G−RYRQR−G(配列番号31)、G−RYSQR−G(配列番号32)、G−FRQRQ−G(配列番号33)、G−RQRQR−G(配列番号34)、G−FRQRG−G(配列番号35)、G−QRQRQ−G(配列番号36)、G−YKYRQ−G(配列番号37)、G−QYRQR−G(配列番号38)、G−YRQTR−G(配列番号39)、G−LRYRQ−G(配列番号40)、G−YRQSR−G(配列番号41)、G−YQRQR−G(配列番号42)、G−RYTQR−G(配列番号43)、G−RFSQR−G(配列番号44)、G−QRQTR−G(配列番号45)、G−WQRQR−G(配列番号46)、G−PRYRQ−G(配列番号47)、G−AYRQR−G(配列番号48)、G−VRYRQ−G(配列番号49)、G−VRQRQ−G(配列番号50)、およびG−YRQRA−G(配列番号51)。
KalbTGについて、式Xaa−Xaa−Xaa−Xaa−Xaaを有する5−merアミノ酸配列を含むアシル供与体基質が、Xaaが任意のアミノ酸である場合に、概していくつかの設計ルールに従うことがデータより明らかとなった。まず、各5−mer配列は少なくとも1つのグルタミン(Q)を含んでいた。より具体的には、5−mer配列の第3、第4、および第5位(すなわち、Xaa、Xaa、およびXaa)のうち少なくとも1つがグルタミンであった。第3および第5位のそれぞれにグルタミンを含む配列がいくつか観察された。さらに、各5−mer配列が少なくとも1つのアルギニン(R)を含むことが観察された。より具体的には、5−mer配列の第4および第5位(すなわち、XaaおよびXaa)のうち少なくとも1つがアルギニンであった。
標識化アッセイ
1.蛍光色素
標識化アッセイでは、Thermus thermophilus由来のシャペロンSlyD(Universal Protein Resource(UniProt)番号Q5SLE7)を、KalbTGに対する標識化スキャホールドとして使用した。SlyD配列は:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号29)
である。
KalbTGグルタミン供与体配列(Q−タグ、下線)を、SlyDのFKBPドメインに組換えにより移植し、以下のポリペプチド配列を得た:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGRYRQRGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHHHHHHHH(配列番号52)。
8X−ヒスチジン−タグ付きタンパク質をE.coli Bl21 Tunerで産生させ、標準的なNiセファロースベースの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー(HisTrap、Superdex200;GE Healthcare)で精製した。ペプチドは全て、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)ベースの固相ペプチド合成により合成した。
(N末端〜C末端の順序で)Z−保護基(すなわちカルボキシベンジル基)、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列(K−タグ)、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(dioxaoctanoic acid)(O2Oc)、ペプチド、およびCy3またはCy5蛍光色素を有するように、標識化されたペプチドを化学的に合成した。標識化されたペプチドの一次化学構造は:
Z−RYESKG−O2Oc−EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU−C(sCy3−MH)−OH(配列番号53)
であった。
200mM MOPS pH7.2および1mM EDTA中に72μM基質タンパク質、720μM標識ペプチドおよび1μMトランスグルタミナーゼが存在する状態で、37℃で15分間標識化反応を実施した。37℃で30分間インキュベートした後、1mM K−タグ−Cy5または−Cy3を添加し、37℃でさらに15分間インキュベートした。50mM TCAを添加して反応を停止させた。インキュベーションステップの間に試料を採取し、SDS−PAGE、インゲル蛍光(in−gel fluorescence)(BioRad ChemiDocゲルドキュメンテーションシステム、Cy3およびCy5LEDならびにフィルターセット)で分析した。結果を図2に示す。
2.ルテニウム(rhutenium)標識
標識がルテニウム(rhutenium)標識である、slyD Q−タグgp21融合物(図3Bを参照のこと)からなる同様のQ−タグ構築物について試験した。図3AのSDS−PAGE結果は、標識対構築物が良好な1:1比であることを示している。
ビオチンおよびルテニウムで標識化されたTtSlyD−gp21(HTLV)抗原の産生
さらなる標識化アッセイでは、Thermus thermophilus由来のシャペロンSlyD(Universal Protein Resource(UniProt)番号Q5SLE7)、HTLVウイルスエンベロープ糖タンパク質「gp21」(Genbank受託番号DQ224032.1)および、一例では、Escherichia coli由来のシャペロンSlpA(UniProt番号P0AEM0)の間の組換え融合物を、MTGまたはKalbTGに対する標識化スキャホールドとして使用した。SlyD配列は:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号54)
である。
MTGまたはKalbTGグルタミン供与体配列(Q−タグ)を、SlyDのFKBPドメインに組換えにより移植し、以下のポリペプチド配列を得た:
MTG Q−タグを有するSlyD:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号55)
KalbTG Q−タグを有するSlyD:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号56)
SlpA配列は:
MSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEA(配列番号57)
である。
主要なHTLV抗原およびウイルスエンベロープ糖タンパク質配列「gp21」は:
IVSSACNNSLILPPFSLSPVPTVGSRSRRAVPVAVWFVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGITLVALLLLVILAGPCIRCPCRTMHP(配列番号58)
である。
イムノアッセイにおけるより良好な溶解性、安定性および反応性のために操作された、gp21エクトドメインポリペプチド配列は:
MSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTG(配列番号59)
である。
標識化アッセイに使用した組換え融合物配列は:
「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号60)
「TtSlyD−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号61)
「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGMSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号62)
であった。
8X−ヒスチジン−タグ付きタンパク質をE.coli Bl21 Tunerで産生させ、標準的なNiセファロースベースの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー(HisTrap、Superdex200;GE Healthcare)で精製した。
(N末端〜C末端の順序で)「Z−」基(すなわちカルボキシベンジル基)、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列(K−タグ)、ポリエチレングリコール(PEG)、ペプチド、およびビオチン標識またはビピリミジンルテニウム(BPRu)複合体を有するように、標識化されたペプチドを化学的に合成した。標識化されたペプチドの一次化学構造は:
KalbTG K−タグ−Bi(「Bi」はビオチン標識を表す):
Z−RYESKG−PEG27−K(Bi)−OH(2532.0g/mol)
KalbTG K−タグ−Ru(「Ru」は、電気化学発光用のルテニウムベースの標識を表す):
Z−RYESKG−PEG27−K(BPRu)−OH(2958.4g/mol)
であった。
別途注記されない限り、典型的な標識化反応は、KalbTG酵素による標識化では、200mM MOPS pH7.4に65μM基質タンパク質、1000μM標識ペプチドおよび0.1μMトランスグルタミナーゼが存在する状態で37℃で、またMTG酵素では200mM MOPS pH7.4中に72μM基質タンパク質、720μM標識ペプチドおよび1μMトランスグルタミナーゼが存在する状態で37℃で、15分間実施した。トランスグルタミナーゼによる標識化については、出願US2016/0178627「System and Method for Identification and Characterization of Transglutaminase Species」およびWO2016/096785「IDENTIFICATION OF TRANSGLUTAMINASE SUBSTRATES AND USES THEREFOR」により詳細に記載されている。
標識化反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200;GE Healthcare)で分離し、標識化された融合タンパク質を含む画分をその後の分析用に単離した。
ビオチンおよびルテニウム標識化の分析ならびにイムノアッセイ
標識化反応の質および量をSDS−PAGEで分析した。ビオチン標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化により推定した。ルテニウム標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化、およびインゲル蛍光(BioRad ChemiDocゲルドキュメンテーションシステム、Cy3LEDおよびフィルターセット)により推定した。Elecsys e411装置で、製造業者の説明書に従い、試験の試薬R1におけるビオチン標識化された抗原部分を、MTGでビオチン標識化された「TtSlyD−Xa−gp21−8H」またはKalbTGでビオチン標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」でそれぞれ置き換え、かつ、試験の試薬R2におけるルテニウム標識化された抗原部分を、MTGでルテニウム標識化された「TtSlyD−Xa−gp21−8H」またはKalbTGでルテニウム標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」でそれぞれ置き換えて、診断用イムノアッセイ(Roche HTLV I/II)を実施した。HTLV陽性血清および市販のHTLV I/IIキットを用いて陽性対照を実施した。HTLV陰性血清、ならびに様々なキャリブレータおよび対照溶液と組み合わせたHTLV陽性血清を用いて陰性対照を実施した。
結果については、図5および6を参照のこと。
TtSlyQD−Xa−gp21−8Hルテニウム標識化の質量分析
図5Aは、配列番号60の融合タンパク質「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」を図式的に示す。図5Bは、Streptomyces mobaraensisの細菌トランスグルタミナーゼによる、組換えgp21(HTLV)抗原の特異的および非特異的ルテニウム標識化について示す、SDS−PAGE分析後の結果を示す。Ru標識化後の、非標識化、一重標識化、二重標識化、および三重標識化された「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」融合タンパク質が示される。Ru−標識については図5Cを参照のこと。
ルテニウム標識化された融合タンパク質のプールされた2つの画分、[1]TtSlyQD−Xa−gp21−8H_Fraction17〜19および[2]TtSlyQDXa−gp21−8H_Fraction20〜23について分析した;非標識化「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」タンパク質は、対照(TtSlyQD−Xa−gp21−8H_Control)として機能した。
ペプチドマッピングを実施した。トリプシンによる消化、クロマトグラフィー分離、その後のMS/MS分析、および手動の解釈ツールと組み合わせたデータベース検索によるペプチドマッピング後、以下のことが発見された:
上記(a〜c)で与えられるTtSlyQD−Xa−gp21−8Hトリプシンペプチドのアミノ酸配列には太字でかつ下線を引いて印を付けている:
Kutzneria albidaの細菌トランスグルタミナーゼを使用してビオチンおよびルテニウムにより部位特異的に標識化された組換えgp21(HTLV)抗原により、Elecsys HTLV−I/IIインビトロ診断用アッセイにおける本発明の利点が実証される。
結果を図6および以下に提示する。
図6Aは、ルテニウムおよびビオチン標識化されたgp21抗原(Q=KalbTG Q−タグ、L=リンカー、Xa=第Xa因子切断部位、8H=His−タグ)の一次構造、および診断検査の原理を示す概略図を示す;患者試料由来の血清抗体(赤)が、ビオチンおよびルテニウム標識化された抗原(緑)を架橋している。
図6B〜D:KalbTGによるgp21の一重ビオチンまたはルテニウム標識化について示すSDS−PAGE分析。B:ビオチン標識化を示す、クーマシー染色したSDS−PAGEゲル、レーン1:染色済みタンパク質分子量マーカー、レーン2:KalbTGおよびビオチン標識とともにインキュベートしたTtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H。C:ルテニウム標識化を示す、クーマシー染色したSDS−PAGEゲル、レーン3a:KalbTGおよびルテニウム標識とともにインキュベートしたTtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H、レーン4a:未改変TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H(対照)。D:Cに示すSDS−PAGE分析の蛍光画像。レーン3b〜4bはレーン3a〜4aに対応する。
図6E:MTGで標識化された試薬または市販のキット(対照)試薬を使用した、HTLV抗体についての血清陰性(左)および陽性(右)での、Elecsysアッセイ(HTLV−I/II)。対照における標識化のための化学量論組成が1:1より大きいため、陽性対照シグナルがKalbTGで標識化されたgp21シグナルより高いことに留意されたい。つまり、KalbTGで標識化された分子はより少ない標識を保持する。測定は二連で実施し、平均シグナルを示した。
TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8Hのアミノ酸配列は以下の通りである:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGMSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号62)。

Claims (14)

  1. 以下の一般式I
    (F−L)−X (I)
    による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質であって、
    が、FKBPポリペプチドのFKBPドメインのアミノ酸配列から選択され、その「インサートインフラップ」(IF)ドメインが、アミノ酸5〜20個のアミノ酸配列(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、Q−タグがペプチド配列X−YRYRQ−X(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する連続する5個のアミノ酸のサブ配列を含み、XおよびXが不存在またはリンカーアミノ酸を構成し;
    Lが不存在またはリンカーアミノ酸配列から選択され;
    Xが目的タンパク質であり;
    yが1〜100の整数であり、
    前記TG基質が、配列番号23によるKutzneria albida TGのTG機能に対する基質である、
    前記組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  2. 前記FKBPドメインが、FKBP12、AIP、AIPL1、FKBP1A、FKBP1B、FKBP2、FKBP3、FKBP5、FKBP6、FKBP7、FKBP8、FKBP9、FKBP9L、FKBP10、FKBP11、FKBP14、FKBP15、FKBP52、LOC541473、およびSLYD、およびこれらのFKBPドメインのホモログから選択される真核生物または細菌FKBPポリペプチドから選択される、請求項1に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  3. 前記FKBPドメインが、約120〜170個、好ましくは約130〜160個、および最も好ましくは約145〜155個の、前記FKBPポリペプチドのN末端アミノ酸を含む、請求項1または2に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  4. 前記FKBPドメインがSLYDポリペプチドのN末端アミノ酸1〜64および123〜149を含み、アミノ酸65〜122が前記Q−タグで置換されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  5. 前記リンカー配列Lが1〜20個のアミノ酸を含み、好ましくは前記アミノ酸が、FKBPドメインおよび/または目的タンパク質を本質的に妨害しない、請求項1から4のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  6. 前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項1から5のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
  7. 目的タンパク質を標識化するインビトロ方法であって、
    a)目的タンパク質と結合させた、請求項1から6のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を用意するステップ、
    b)有効量の、好ましくは配列番号23による、Kutzneria albidaのトランスグルタミナーゼを用意するステップ、
    c)例えばリジンなどの、アルキル−アミン基を含む、結合させる適切な標識を用意するステップ、および、
    d)a)〜c)による前記成分を接触させ、それにより前記トランスグルタミナーゼが前記標識を前記基質に結合させるステップ、
    を含む、前記インビトロ方法。
  8. Kutzneria albidaの前記トランスグルタミナーゼが組換え産生される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記標識が、酵素、ビオチン、放射性基、蛍光色素などの色素、同位体、化学発光標識、および金属から選択される、請求項7または8に記載の方法。
  10. 前記標識化が、標識および目的タンパク質の化学量論比、例えば約1:1で実現される、請求項7から9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項7から10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 請求項7から10のいずれか1項に記載の方法に従って産生される、少なくとも1つの標識された目的タンパク質を、薬学的に許容される担体化合物とともに含む医薬組成物または診断用組成物。
  13. 前記目的タンパク質が、標識および目的タンパク質の化学量論比、例えば約1:1で標識される、請求項12に記載の医薬組成物または診断用組成物。
  14. 請求項12または13に記載の診断用組成物を、任意選択で、イムノアッセイを実施するためのその他の成分とともに含む診断用キット。
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