JP6967002B2 - トランスグルタミナーゼ認識部位を有するfkbpドメイン - Google Patents
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Description
(F*−L)y−X (I)
による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を提供することによって解決される。
配列X1−YRYRQ−X2(配列番号1)、X1−RYRQR−X2(配列番号2)、X1−RYSQR−X2(配列番号3)、X1−FRQRQ−X2(配列番号4)、X1−RQRQR−X2(配列番号5)、X1−FRQRG−X2(配列番号6)、X1−QRQRQ−X2(配列番号7)、X1−YKYRQ−X2(配列番号8)、X1−QYRQR−X2(配列番号9)、X1−YRQTR−X2(配列番号10)、X1−LRYRQ−X2(配列番号11)、X1−YRQSR−X2(配列番号12)、X1−YQRQR−X2(配列番号13)、X1−RYTQR−X2(配列番号14)、X1−RFSQR−X2(配列番号15)、X1−QRQTR−X2(配列番号16)、X1−WQRQR−X2(配列番号17)、X1−PRYRQ−X2(配列番号18)、X1−AYRQR−X2(配列番号19)、X1−VRYRQ−X2(配列番号20)、X1−VRQRQ−X2(配列番号21)、およびX1−YRQRA−X2(配列番号22)から選択され、X1およびX2が上記の通りである、本発明によるQ−タグが好ましい。
式(I)において、yは1〜100の整数であり、したがって、いくつかのマーカー基F*−Lが目的タンパク質に結合されうる。
前記FKBPドメインがSLYDポリペプチドのN末端アミノ酸1〜64および123〜149を含み、アミノ酸65〜122が前記Q−タグで置換されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質が好ましい。
これより、本発明について、添付の図を参照して以下の非限定的な例でさらに説明を行う。本発明において、本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献が、その全内容にわたって参照により組み込まれる。
配列番号23は、Kutzneria albida由来のトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列(データベース番号WP_030111976)を示す。
配列番号25は、Cyclobacteriaceae bacterium AK24のslyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、E.coliのslyDのFKBPドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号29は、Thermus thermophilusのslyDのFKBPドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号52は、SlyDのFKBPドメインに組換えにより移植された、KalbTGグルタミン供与体配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号54はSlyDアミノ酸配列を示す。
配列番号56は、KalbTG Q−タグを有するSlyDのアミノ酸配列を示す。
配列番号57はSlpAアミノ酸配列を示す。
配列番号59は、イムノアッセイにおけるより良好な溶解性、安定性および反応性のために操作された、改変「gp21」エクトドメインポリペプチド配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号61は、組換え融合タンパク質「TtSlyD−Xa−gp21−8H」のアミノ酸配列を示す。
基本的には、例えばプログラムClustal Omegaを使用して、置換される(または付加される)IFドメインの位置を特定するため、FKBPドメインのアミノ酸配列の一次構造のアラインメントを使用することができる。ドメインが構造的に保存されたエレメントを構成することから、特に非細菌FKBPに関しては、代替法は3D構造のアラインメントである(例えばプログラムPyMolを使用して)。
Escherichia coli(株K12)FKBPドメインのSLYD_ECOLI FKBP型ペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼSlyD、IFドメインに二重下線を引いてある。
NおよびC末端グリシン残基3つ(G1およびG2)が結合した5−merアミノ酸配列を含む一連のペプチドを用いた標識化アッセイを使用して特定されたKalbTGペプチド基質の分析により、これらの基質が共有する一連の特徴が明らかとなった。具体的な例は以下の通りであった:
G1−YRYRQ−G2(配列番号30)、G1−RYRQR−G2(配列番号31)、G1−RYSQR−G2(配列番号32)、G1−FRQRQ−G2(配列番号33)、G1−RQRQR−G2(配列番号34)、G1−FRQRG−G2(配列番号35)、G1−QRQRQ−G2(配列番号36)、G1−YKYRQ−G2(配列番号37)、G1−QYRQR−G2(配列番号38)、G1−YRQTR−G2(配列番号39)、G1−LRYRQ−G2(配列番号40)、G1−YRQSR−G2(配列番号41)、G1−YQRQR−G2(配列番号42)、G1−RYTQR−G2(配列番号43)、G1−RFSQR−G2(配列番号44)、G1−QRQTR−G2(配列番号45)、G1−WQRQR−G2(配列番号46)、G1−PRYRQ−G2(配列番号47)、G1−AYRQR−G2(配列番号48)、G1−VRYRQ−G2(配列番号49)、G1−VRQRQ−G2(配列番号50)、およびG1−YRQRA−G2(配列番号51)。
1.蛍光色素
標識化アッセイでは、Thermus thermophilus由来のシャペロンSlyD(Universal Protein Resource(UniProt)番号Q5SLE7)を、KalbTGに対する標識化スキャホールドとして使用した。SlyD配列は:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号29)
である。
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGRYRQRGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHHHHHHHH(配列番号52)。
Z−RYESKG−O2Oc−EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU−C(sCy3−MH)−OH(配列番号53)
であった。
標識がルテニウム(rhutenium)標識である、slyD Q−タグgp21融合物(図3Bを参照のこと)からなる同様のQ−タグ構築物について試験した。図3AのSDS−PAGE結果は、標識対構築物が良好な1:1比であることを示している。
さらなる標識化アッセイでは、Thermus thermophilus由来のシャペロンSlyD(Universal Protein Resource(UniProt)番号Q5SLE7)、HTLVウイルスエンベロープ糖タンパク質「gp21」(Genbank受託番号DQ224032.1)および、一例では、Escherichia coli由来のシャペロンSlpA(UniProt番号P0AEM0)の間の組換え融合物を、MTGまたはKalbTGに対する標識化スキャホールドとして使用した。SlyD配列は:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号54)
である。
MTG Q−タグを有するSlyD:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号55)
KalbTG Q−タグを有するSlyD:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(配列番号56)
SlpA配列は:
MSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEA(配列番号57)
である。
IVSSACNNSLILPPFSLSPVPTVGSRSRRAVPVAVWFVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGITLVALLLLVILAGPCIRCPCRTMHP(配列番号58)
である。
MSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTG(配列番号59)
である。
「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号60)
「TtSlyD−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号61)
「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGMSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号62)
であった。
KalbTG K−タグ−Bi(「Bi」はビオチン標識を表す):
Z−RYESKG−PEG27−K(Bi)−OH(2532.0g/mol)
KalbTG K−タグ−Ru(「Ru」は、電気化学発光用のルテニウムベースの標識を表す):
Z−RYESKG−PEG27−K(BPRu)−OH(2958.4g/mol)
であった。
標識化反応の質および量をSDS−PAGEで分析した。ビオチン標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化により推定した。ルテニウム標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化、およびインゲル蛍光(BioRad ChemiDocゲルドキュメンテーションシステム、Cy3LEDおよびフィルターセット)により推定した。Elecsys e411装置で、製造業者の説明書に従い、試験の試薬R1におけるビオチン標識化された抗原部分を、MTGでビオチン標識化された「TtSlyD−Xa−gp21−8H」またはKalbTGでビオチン標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」でそれぞれ置き換え、かつ、試験の試薬R2におけるルテニウム標識化された抗原部分を、MTGでルテニウム標識化された「TtSlyD−Xa−gp21−8H」またはKalbTGでルテニウム標識化された「TtSlyKQD−SlpA−Xa−gp21−8H」でそれぞれ置き換えて、診断用イムノアッセイ(Roche HTLV I/II)を実施した。HTLV陽性血清および市販のHTLV I/IIキットを用いて陽性対照を実施した。HTLV陰性血清、ならびに様々なキャリブレータおよび対照溶液と組み合わせたHTLV陽性血清を用いて陰性対照を実施した。
TtSlyQD−Xa−gp21−8Hルテニウム標識化の質量分析
図5Aは、配列番号60の融合タンパク質「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」を図式的に示す。図5Bは、Streptomyces mobaraensisの細菌トランスグルタミナーゼによる、組換えgp21(HTLV)抗原の特異的および非特異的ルテニウム標識化について示す、SDS−PAGE分析後の結果を示す。Ru標識化後の、非標識化、一重標識化、二重標識化、および三重標識化された「TtSlyQD−Xa−gp21−8H」融合タンパク質が示される。Ru−標識については図5Cを参照のこと。
図6Aは、ルテニウムおよびビオチン標識化されたgp21抗原(Q=KalbTG Q−タグ、L=リンカー、Xa=第Xa因子切断部位、8H=His−タグ)の一次構造、および診断検査の原理を示す概略図を示す;患者試料由来の血清抗体(赤)が、ビオチンおよびルテニウム標識化された抗原(緑)を架橋している。
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGMSESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH(配列番号62)。
Claims (19)
- 以下の一般式I
(F*−L)y−X (I)
による組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質であって、
F*が、FKBPポリペプチドのFKBPドメインのアミノ酸配列から選択され、その「インサートインフラップ」(IF)ドメインが、アミノ酸5〜20個のアミノ酸配列(「Q−タグ」)で少なくとも一部置換されており、Q−タグがペプチド配列X1−YRYRQ−X2(配列番号1)のYRYRQ部分と少なくとも80%の配列同一性を有する連続する5個のアミノ酸のサブ配列を含み、かつ前記Q−タグが少なくとも1つのグルタミン(Q)を含み、X1およびX2が不存在またはリンカーアミノ酸を構成し;
Lが不存在またはリンカーアミノ酸配列から選択され;
Xが目的タンパク質であり;
yが1〜100の整数であり、
前記TG基質が、配列番号23によるKutzneria albida TGのTG機能に対する基質である、
前記組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。 - 前記FKBPドメインが、FKBP12、AIP、AIPL1、FKBP1A、FKBP1B、FKBP2、FKBP3、FKBP5、FKBP6、FKBP7、FKBP8、FKBP9、FKBP9L、FKBP10、FKBP11、FKBP14、FKBP15、FKBP52、LOC541473、およびSLYD、およびこれらのFKBPドメインのホモログから選択される真核生物または細菌FKBPポリペプチドから選択される、請求項1に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記FKBPドメインが、120〜170個の前記FKBPポリペプチドのN末端アミノ酸を含む、請求項1または2に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記FKBPドメインが、130〜160個の前記FKBPポリペプチドのN末端アミノ酸を含む、請求項3に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記FKBPドメインが、145〜155個の前記FKBPポリペプチドのN末端アミノ酸を含む、請求項3に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記FKBPドメインがSLYDポリペプチドのN末端アミノ酸1〜64および123〜149を含み、アミノ酸65〜122が前記Q−タグで置換されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記リンカー配列Lが1〜20個のアミノ酸を含み、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記アミノ酸が、FKBPドメインおよび/または目的タンパク質を本質的に妨害しない、請求項7に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 前記目的タンパク質が、酵素、抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質。
- 目的タンパク質を標識化するインビトロ方法であって、
a)目的タンパク質と結合させた、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ(TG)基質を用意するステップ、
b)有効量のKutzneria albidaのトランスグルタミナーゼを用意するステップ、
c)アルキル−アミン基を含む、結合させる適切な標識を用意するステップ、および、
d)a)〜c)による前記成分を接触させ、それにより前記トランスグルタミナーゼが前記標識を前記基質に結合させるステップ、
を含む、前記インビトロ方法。 - 前記Kutzneria albidaのトランスグルタミナーゼが、配列番号23で表されるアミノ酸配列からなるものである、請求項10に記載の方法。
- Kutzneria albidaの前記トランスグルタミナーゼが組換え産生される、請求項10または11に記載の方法。
- 前記標識が、酵素、ビオチン、放射性基、色素、同位体、化学発光標識、および金属から選択される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識化が、標識および目的タンパク質の化学量論比を約1:1として実現される、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的タンパク質が、酵素、抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法に従って産生される、少なくとも1つの標識された目的タンパク質を、薬学的に許容される担体化合物とともに含む医薬組成物または診断用組成物。
- 前記目的タンパク質が、標識および目的タンパク質の化学量論比を約1:1として標識される、請求項16に記載の医薬組成物または診断用組成物。
- 請求項16または17に記載の診断用組成物を含む診断用キット。
- さらに、イムノアッセイを実施するためのその他の成分を含む、請求項18に記載の診断用キット。
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