CN116284410A - 一种纯化her2单链抗体的方法 - Google Patents

一种纯化her2单链抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纯化HER2单链抗体(scFv)的方法，所述方法通过SPY Cather蛋白与SPY Tag多肽间的特异性结合，经过PT Linker‑SPY Cather重组蛋白修饰的环氧载体，用以捕获scFv‑Mxe GyrA‑EGFP‑SPY Tag重组蛋白，并通过单因素试验与响应面法优化出最优的反应条件提高了该载体的吸附效率，最后利用二硫苏糖醇(DTT)使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂，一步法释放出单链抗体(scFv)，所述HER2单链抗体保持活性不变。本发明简化单链抗体纯化的操作流程、一步洗脱与标签切除、提供了一种无蛋白液相纯化仪与纯化柱也可纯化蛋白的方法，不仅适用于单链抗体的纯化、也适用于其他多种蛋白质的纯化，具有广阔的应用前景。

Description

一种纯化HER2单链抗体的方法
技术领域
本发明属于蛋白表达技术领域，具体涉及一种快速的纯化HER2单链抗体(HER2-scfv)的方法。
背景技术
乳腺癌目前已成为女性诊断和死亡率高的恶性肿瘤。其中大约25-30％的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体(HER2)过度表达，近年来随着靶向治疗的发展，针对HER2为治疗靶点的抗体偶联药物已成为当下的研究热点。
单链抗体(scFv)相对分子质量小，更容易穿透组织到达靶部位，使肿瘤周围达到有效的血药浓度；由于缺少Fc段，scFv并不具备完整抗体的效应功能从而导致免疫原性降低，不易引起人体排斥和超敏反应；scFv在体内清除速度快，减少了全抗分子带来的心脏、肝、肾等重要器官的损伤。因此，scFv逐渐成为了基因工程抗体的研究热点之一。
蛋白质内含肽(intein)是前体未成熟蛋白质中的一段多肽链，可通过蛋白质自我剪接作用实现蛋白质结构的重新排列。Mxe GryA是蟾分枝杆菌Mycobacterium xenopiGryA中198Aa组成的微小型内含肽，将其C端剪接结构模块中的天冬氨酸突变为丙氨酸后可阻断内含肽C端的剪接反应，但在其N末端半胱氨酸处仍然可发生N-S酰基重排形成硫酯键，可通过添加硫醇试剂如二硫苏糖醇(DTT)来控制硫酯键的断裂。
SPY Cather与SPY Tag是来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的纤连结合蛋白(FbaB)第二个免疫球样胶原黏附蛋白结构域(CnaB2)的两个可通过异肽键结合的蛋白。SPY Cather与SPY Tag可以在各种不同的条件下(pH、温度、缓冲液组分)可迅速形成稳固的异肽键且不容易发生断裂。
单链抗体因与质粒、标签构建简便且在重组质粒可在大肠杆菌中成功表达，有利于发挥其免疫诊断、治疗作用。大肠杆菌作为传统生物学表达系统之一，易于培养、遗传背景清晰是表达外原蛋白的首选表达系统。但目前单链抗体在表达纯化方面仍然存在上清表达量较低、沉淀表达操作复杂、纯化步骤繁琐等问题。实现单链抗体的可溶性表达、简化蛋白纯化过程，对后续单链抗体的研究及治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种一步法纯化单链抗体的方式，所述方法通过SPYCather与SPY Tag之间的特异性捕获scFv，再利用二硫苏糖醇(DTT)使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂纯化scFv，从而实现无需仪器与纯化柱的一步分离纯化单链抗体的新方法。
本发明的目的可通过以下技术实现。
本发明的的第一个方面，提供了一种用于修饰环氧载体的PT Linker-SPY Cather重组蛋白，所述重组蛋白由多肽片段PT Linker和SPY Cather蛋白组成，所述PT Linker-SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的的第二个方面，提供了一种scFv-Mxe GyrA-SPY Tag重组蛋白，所述重组蛋白由单链抗体(scFv)、内含肽(Mxe GyrA)及多肽片段SPY Tag组成，所述scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的的第三个方面，供了一种纯化HER2单链抗体(scFv)的方法，包括如下
步骤：
1)将PT Linker-SPY Cather基因序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达PT Linker-SPY Cather重组蛋白，纯化得到该重组蛋白，将PT Linker-SPY Cather重组蛋白与环氧载体LX-1000EP在室温下孵育，得到PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体；
2)将scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的融合基因核苷酸编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达，获得scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白，
3)将步骤(1)中得到的PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附细胞裂解上清中的scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白；
4)除去未吸附的杂蛋白，加入DTT的磷酸盐缓冲液将被吸附的scFv洗脱下来。
在其中的一些实施例中，步骤3)中的吸附反应条件为：反应体积为0.2mL-0.4mL，反应pH为8.0-9.0，反应温度为25℃-30℃。优选为：在26℃条件下25rpm搅拌反应2h，反应pH为8.4。
在其中的一些实施例中，每50mg所述PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体，加入0.3mL-0.4mL pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag大肠杆菌裂解上清液中。
在其中的一些实施例中，所述scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，包括步骤如下：
1)scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组质粒的构建：
利用RF克隆方法将scFv和EGFP基因核苷酸编码序列与pET28a-EGFP-SPY Tag表达载体连接，
2)将培养过夜的菌液接种于LB液体培养基中扩大培养，当OD600为1.0时加至终浓度为0.3mM-0.8mM的异丙醇-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，16±1℃诱导12±1h收集菌体。
在其中的一些实施例中，步骤4)中加入15-25mM DTT的磷酸盐缓冲液。在其中的一些实施例中，步骤1)中的表达载体为pET30a，步骤2)中的表达载体为pET28b(+)。
在其中的一些实施例中，构建pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白表达时的引物如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。
本发明的优点及有益效果如下：
1)利用SPY Cather蛋白与SPY Tag蛋白之间的特异性能够实现环氧载体高效专一地捕获目的蛋白；
2)利用Mxe GyrA内含肽将单链抗体蛋白从环氧载体中释放出来，可避免蛋白纯化过程中繁琐的洗脱步骤以及去除标签操作，可实现一步纯化得到单链抗体蛋白；
3)发明了一种用于纯化蛋白的新型填料——PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体，并通过响应面优化法确定了该环氧载体最优的吸附条件；
4)本发明提供的纯化方法应用广泛、不限用于单链抗体蛋白的纯化，且可在无仪器、无纯化柱的情况下纯化蛋白，减少蛋白生产成本，提高纯化效率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为SPY Cather蛋白和内含肽纯化HER2单链抗体的方法示意图。
图2为PT Linker-SPY Cather重组蛋白的SDS-PAGE与Western blot结果图，其中M为蛋白Marker；泳道1为未诱导组；泳道2为诱导组。
图3为PT Linker-SPY Cather重组蛋白纯化的SDS-PAGE的结果图，其中M为蛋白Marker。泳道1为裂解上清液；泳道2为流穿液；泳道3为含有100mM咪唑的洗脱液；泳道4为含有500mM咪唑的洗脱液。
图4为PT Linker-SPY Cather重组蛋白与LX1000EP环氧载体孵育的结果图，其中M为蛋白Marker；泳道1为孵育前蛋白条带；泳道2为孵育后蛋白条带。
图5为在不同浓度IPTG中诱导scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的表达，其中：M为蛋白Marker，W为裂解全液(whole bacteria)；S为裂解上清部分(supernatant)；P为裂解沉淀部分(precipitation)。
图6为单因素试验结果，其中：M为蛋白Marker，A为反应体积对环氧载体吸附效率的影响；B为反应温度对环氧载体吸附效率的影响；C为反应pH对环氧载体吸附效率的影响。
图7为反应体积、反应温度、反应pH对环氧载体吸附效率的影响的响应面三维图。
图8为PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体捕获重组蛋白scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag前后颜色变化。
图9为使用20mM DTT剪切液从载体上洗脱scFv结果，其中M为蛋白Marker；泳道1为细胞裂解上清液；泳道2为孵育环氧载体后细胞裂解上清液；泳道3为反应后的20mM DTT剪切液上清；泳道4为62.5μg/mL的牛血清白蛋白；泳道5为125μg/mL的牛血清白蛋白；泳道6为250μg/mL的牛血清白蛋白；泳道7为500μg/mL的牛血清白蛋白；泳道8为1000μg/mL的牛血清白蛋白。
图10为scFv处理HER2阳性细胞SKBR-3与HER2阴性细胞MDA-MB-231的细胞毒性检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一些实施例中，涉及了一种用于修饰环氧载体LX-1000EP的PT Linker-SPY Cather重组蛋白的表达，包含多肽片段(PT Linker)与SPY Cather蛋白连接而成，编码所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的PT Linker-SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
本发明的一些实施例中，涉及了一种scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白，包含单链抗体(scFv)、Mxe GyrA内含肽、绿色荧光蛋白(EGFP)标签以及多肽片段SPY Tag通过GS Linker连接而成。编码所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的一些实施例中，一种用于无柱纯化单链抗体的纯化方法，步骤如下：
1)将PT Linker-SPY Cather基因序列与pET30a质粒连接得到pET30a-PT Linker-SPY Cather重组表达质粒，转化至大肠杆菌中诱导表达纯化PT Linker-SPY Cather重组蛋白；
2)将步骤1)中纯化的PT Linker-SPY Cather蛋白与环氧载体LX-1000EP在室温下孵育12小时后，可得到PT Linker-SPY Cather-LX1000EP载体；
3)将scFv和EGFP基因核苷酸序列构建到pET28b-Mxe GyrA-SPY Tag载体上，转化至大肠杆菌中诱导表达scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白并优化该重组蛋白的诱导表达条件，收集菌体后超声破碎，离心后取上清液与步骤2)被修饰的载体进行孵育；
4)选取三个主要影响环氧载体吸附效率的单因素，即反应体积、温度及pH进行单因素实验，分别考察各因素对环氧载体吸附效率的影响，并在单因素实验的基础上进行响应面优化试验，运用Design-Expert 12.0软件确定最优反应条件；
步骤4)确定的最优反应条件：反应体积0.327mL、反应温度26℃、反应pH8.4，并在该条件下进行PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体对scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的吸附实验。使用PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附裂解液中的scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白，之后利用20mM DTT(二硫苏糖醇)-磷酸盐缓冲液将scFv从环氧载体上剪切下来。
SPY Cather蛋白和内含肽纯化HER2单链抗体的技术路线，请参见图1。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1PT Linker-SPY Cather重组蛋白的表达与纯化
将pET30a-PT Linker-SPY Cather重组菌株37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入0.1mM IPTG，30℃诱导6h。收集菌体，使用HiTrap FF 5mL预装柱纯化重组蛋白，并进行SDS-PAGE和Western blotting实验。经纯化的PT Linker-SPYCather重组蛋白在磷酸缓冲液中透析12h后浓缩至5mg/mL用于后续实验。
结果如图2和图3所示，PT Linker-SPY Cather重组蛋白成功表达，并在100mM咪唑条件下从纯化柱上成功被洗脱下来。
PT Linker-SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：PTPPTTPTPPTTPTPTPVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAH。
编码PT Linker-SPY Cather的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
Figure BDA0004144233710000071
实施例2PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体的制备
用磷酸缓冲液清洗LX1000EP环氧载体，加入20mg PT Linker-SPY Cather重组蛋白，室温下，25rpm搅拌12h，使重组蛋白与环氧载体充分结合。取环氧载体孵育前后的上清液进行SDS PAGE电泳检测。再用磷酸缓冲液清洗PTLinker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体，除去未结合的蛋白，保存于4℃留用。
结果如图4所示，PT Linker-SPY Cather重组蛋白与LX1000EP环氧载体经过搅拌后充分结合，85％的PT Linker-SPY Cather重组蛋白被结合到载体上。
实施例3pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的表达及其表达条件优化
使用RF克隆法将EGFP与scFv核苷酸序列插入到pET28b-Mxe GyrA-SPY Tag表达载体中，引物序列如下：
Figure BDA0004144233710000081
将pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落37℃培养至OD600为1.0，分别加至终浓度0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0mM IPTG，16℃诱导12h。收集菌体后超声破碎，制样进行SDS-PAGE和Western-blotting实验。鉴定重组蛋白是否表达并分析IPTG浓度对于重组蛋白在上清表达的影响。
结果如图5所示，pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白成功表达。当IPTG终浓度0.5mM时，重组蛋白在裂解上清液中的含量最高，可达表达总蛋白的2.76％。
scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
AHIVMVDAYKPTKGGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKCITGD ALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHGNPVLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDYAVIQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADELTDGRFYYAKVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHATQVQLLQSGAELKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCSSSNCAKWPEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYGRTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCAAWDHSLSGWVFGGGTKLTVLGGDL。
编码scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例4PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附效率的响应面优化
1)影响PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附效率的单因素试验
50mg PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体分别加入0.1mL、0.2mL、
0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag菌株的裂解上清液，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃条件下25rpm孵育2h，反应pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，测定环氧载体的吸附效率。
由图6中A可知，环氧载体的吸附效率在上清液体积为300uL时可达到最大，约为83.24％左右；
由图6中B可知，环氧载体的吸附效率在反应温度为25℃时可达到最大，约为63.69％左右；
由图6中C可知，环氧载体的吸附效率在反应pH为8.0时可达到最大53.24％左右。
2)PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附效率的响应面优化试验根据Box-Benhnken中心组合设计原则，在单因素试验的基础上，以反应体积(A)、反应温度(B)、反应pH为自变量(C)、以环氧载体的吸附效率(Y)为响应值，进行三因素三水平的响应面试验分析，响应面试验因素与水平见表1，试验设计及结果见表2。
表1环氧载体吸附效率的响应面优化试验因素与水平
Figure BDA0004144233710000101
表2响应面试验设计与试验结果
Figure BDA0004144233710000102
Figure BDA0004144233710000111
响应面优化试验结果如表3所示：模型F值＝385.14，p<0.0001表示该模型极显著，而缺失项＝0.2223(>0.05)，差异不显著，表明该模型能够准确的模拟反应体积、反应温度及反应pH这三个变量对环氧载体吸附效率的影响；模型R2＝0.9980，预测R2＝0.9954，差值<0.2表明该模型拟合度良好，可用于环氧载体的吸附效率的分析和预测。
表3响应面设计试验方差分析及回归系数显著性检验
Figure BDA0004144233710000112
注：“**”表示对结果影响极显著(p<0.01)；“*”表示对结果影响显著(p<0.05)
用Design-Expert 13.0软件对表2中17个响应值进行多元回归拟合，得到回归模型方程为：
Y＝81.96+1.84A+1.02B+1.15C+0.2135AB+0.3033AC-0.0089BC-18.70A2-11.65B2-7.92C2
根据表3中结果可知，一次项A、C，二次项A2、B2、C2都对结果有极显著影响(p<0.01)，一次项B对结果有显著影响(p<0.05)，由图7可知，反应体积的曲线最陡峭，其次是反应pH，反应温度最平缓，说明对结果影响大小的顺序为反应体积>反应pH>反应温度。
Design-Expert 12.0软件优化的反应条件为：反应体积0.327mL、反应温度26℃、反应pH 8.4，在此条件下进行三组平行实验，得到平均吸附效率为77.263％，与预测值75.926％的误差不超过1％，证明此模型能很好的预测最优反应条件。实施例5PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体纯化单链抗体(scFv)
1)挑取pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组菌株，37℃培养至OD600为1.0时加入0.1mM IPTG，16℃诱导12h后离心收集菌体。加入pH为8.4的Tris缓冲液重悬菌体，超声裂解。4℃12000rpm离心15min后取裂解上清，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度；
2)称取50mg PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体，加入0.327mL步骤1)中的裂解上清，在26℃条件下孵育2h；
3)孵育结束后，用Tris缓冲液清洗除去未吸附的杂蛋白。加入1mL含有20mM DTT的磷酸缓冲液反应12h使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂，从而将单链抗体(scFv)从载体上洗脱下来。利用ImageJ凝胶分析软件对目的条带进行灰度分析。
Figure BDA0004144233710000121
如图8和图9以及表4所示，每50mg PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体可捕获0.327mL裂解上清中共约28.16μg pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白。经过灰度分析可知，20mM DTT剪切液中scFv浓度为24.15μg/mL，经过计算可得到该方法纯化scFv的回收率高达85.76％。
表4
Figure BDA0004144233710000131
实施例6单链抗体(scFv)的细胞毒性检测
分别接种5×103个SKBR-3和MDA-MB-231细胞于96孔板中，每孔200μL培养基，37℃，5％ CO2培养48h。将scFv作梯度稀释(25、50、100、200、400、800、1600nM)，每孔分别加入100μL蛋白稀释液，处理细胞72h。每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃静置1h。酶联免疫检测仪检测450nm处各孔的吸光值。重复实验三次，取平均值。计算细胞存活率：
Figure BDA0004144233710000132
如图10所示，scFv只对HER2阳性细胞SKBR-3表现高毒性，对HER2阴性细胞MDA-MB-231毒性几乎无毒性，说明其只特异性杀伤HER2阳性细胞。scFv可抑制SKBR-3细胞生长并存在浓度依赖性，其IC50约为1370nM。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于修饰环氧载体的PT Linker-SPY Cather重组蛋白，其特在在于，所述PTLinker-SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种scFv-Mxe GyrA-SPY Tag重组蛋白，其特在在于，所述scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPYTag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种纯化HER2单链抗体的方法，其特在在于，包括如下步骤：
1)将PT Linker-SPY Cather基因序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达PT Linker-SPY Cather重组蛋白，纯化得到PT Linker-SPYCather重组蛋白，将PT Linker-SPY Cather重组蛋白与环氧载体LX-1000EP在室温下孵育，得到PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体；
2)将scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的融合基因核苷酸编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达，获得细胞裂解上清中的scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白；
3)将步骤(1)中得到的PT Linker-SPY Cather-LX1000EP环氧载体吸附步骤2)获得细胞裂解上清中的scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白；
4)除去未吸附的杂蛋白，加入DTT的磷酸盐缓冲液将被吸附的scFv洗脱下来。
4.根据权利要求3所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，步骤3)中的吸附反应条件为：反应体积为0.2mL-0.4mL，反应pH为8.0-9.0，反应温度为25℃-30℃。
5.根据权利要求3所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，每50mg所述PT Linker-SPYCather-LX1000EP环氧载体，加入0.3mL-0.4mL pET28b-scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag大肠杆菌裂解上清液中。
6.根据权利要求4所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，步骤3)中的吸附反应条件为：在26℃条件下25rpm搅拌反应2h，反应pH为8.4。
7.根据权利要求3-6任一项所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，所述scFv-MxeGyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，包括步骤如下：
2.1)scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组质粒的构建：
利用RF克隆方法将scFv和EGFP基因核苷酸编码序列与pET28a-EGFP-SPY Tag表达载体连接，
2.2)将培养过夜的菌液接种于LB液体培养基中扩大培养，当OD600为1.0时加至终浓度为0.3mM-0.8mM的异丙醇-β-硫代半乳糖苷，16±1℃诱导12±1h后收集菌体。
8.根据权利要求7所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，构建pET28b-scFv-MxeGyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白表达时的引物如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。
9.根据权利要求3-6任一项所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，步骤4)中加入15-25mM DTT的磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求3-6任一项所述纯化单链抗体的方法，其特在在于，步骤1)中的表达载体为pET30a，步骤2)中的表达载体为pET28b(+)。
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