JP6591511B2 - スプリットインテイン、複合体およびそれらの使用 - Google Patents

Description

米国政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた助成番号ＧＭ０８６８６８の下、米国政府の支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

本出願は、開示の独立した部分として、コンピューター読み取り可能な形式の配列表を含み（ファイル名：４７０４６Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；５４７，８３８バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル−２０１３年６月２０日作成）、これは引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

背景
タンパク質スプライシングは、インテインとして知られるタンパク質ファミリーにより触媒される翻訳後プロセスである（１）。このプロセスでは、インテインドメインがより大きな前駆体タンパク質からのその自己切断を触媒し、同時に２つの隣接するポリペプチド 配列（エクステイン）を相互に連結する。ほとんどのインテインはスプライシングをシスに触媒するが、これらのタンパク質の少数のサブセットは自然に断片化されたドメインとして存在し、これらは別々に発現されるが、速やかに会合してスプライシングをトランスに触媒する。ポリペプチド結合を形成および破壊するそれらの能力を考えて（インテインはタンパク質リガーゼと考えることができる）、シススプライシングインテインおよびトランススプライシングインテインは両方ともケミカルバイオロジーツールとして幅広い用途を見出した（２）。

ケミカルバイオロジーにおいてインテインの使用はますます増えているにもかかわらず、それらの実際の有用性は、このファミリーの２つの共通の特徴、すなわち（ｉ）速度が遅いこと、（ｉｉ）直接隣接するエクステイン配列に関してコンテキスト依存性の効率、によって制約を受けてきた（３、４）。最近、シアノ細菌ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)（Ｎｐｕ）由来のスプリットインテインは、ほとんどのシスまたはトランススプライシングインテインのような何時間というものではなく、１分程度でタンパク質のトランススプライシングを触媒することが示された（５）。さらに、このインテインは、他のインテインよりも、重要な＋２Ｃ−エクステイン残基における配列バリエーションの許容性が若干大きかった（６）。

よって、様々なタンパク質精製およびタンパク質修飾適用における使用のための、より頑強(robust)でより効率的なスプリットインテインの必要性が存在する。

概要
スプリットインテインＮ末端断片およびＣ末端断片、それらの変異体、ならびにポリペプチド精製および修飾においてこれらのスプリットインテインを使用する方法が開示される。

よって、本明細書では、以下により詳細に記載されるようなポリペプチドとスプリットインテインＮ末端断片またはその変異体の融合タンパク質が提供される。また、以下に詳細に記載されるような融合タンパク質とスプリットインテインＣ末端断片またはその変異体との複合体も提供される。融合タンパク質とＣ末端断片またはその変異体との複合体は、融合タンパク質とＣ末端断片もしくはその変異体との間の共有結合的相互作用を介するか、または非共有結合的相互作用（例えば、イオン、水素結合、および／またはファンデルワールス相互作用）を介したものであり得る。

さらに本明細書では、スプリットインテインＣ末端断片またはその変異体も提供される。場合によっては、スプリットインテインＣ末端断片は、ペプチドリンカー、または以下に詳細に記載されるような他のリンカーなどのリンカーをさらに含んでなる。企図される特異的ペプチドリンカーは、下記のスプリットインテインＣ末端断片のいずれかと結合した−ＳＧＧＣ（配列番号７０５）である。リンカーは、支持体、例えば、ビーズ、樹脂、スライドグラス、粒子への目的のスプリットインテインＣ末端断片の付着を可能とするように調整することができる。

また、以下に詳細に記載されるようなスプリットインテインＮ末端断片およびＣ末端断片、またはそれらの変異体を使用する方法も提供される。より詳しくは、本明細書では、（ａ）（１）以下に詳細に記載されるような、ポリペプチドおよびスプリットインテインＮ末端断片またはその変異体を含んでなる融合タンパク質と、（２）以下に詳細に記載されるようなスプリットインテインＣ末端断片またはその変異体とを接触させること；ここで、接触は、前記スプリットインテインＮ末端断片と前記スプリットインテインＣ末端断片が結合してインテイン中間体を形成することを可能とする条件下で行われる；および（ｂ）前記インテイン中間体を求核試薬と接触させて、タンパク質と求核試薬の複合体を形成することを含んでなる方法が提供される。種々の実施態様において、スプリットインテインＣ末端断片またはその変異体は、支持体に結合される。いくつかの実施態様では、支持体は、ビーズ、樹脂、粒子またはスライドグラスである。Ｎ末端断片およびＣ末端断片の選択は同じ野生型スプリットインテインから（例えば、両方ともＮｐｕ、または下記に詳細に述べるようなＮ末端断片もしくはＣ末端断片のいずれかの変異体から）であり得、あるいはまた異なる野生型スプリットインテインまたは以下に述べるコンセンサススプリットインテイン配列から選択され得ると考えられるが、これは、異なるＣ末端断片に対するＮ末端断片の（例えば、Ｎｐｕ Ｎ末端断片またはその変異体とＳｓｐ Ｃ末端断片またはその変異体との）親和性は、開示される方法において使用するのに十分な結合親和性をなお維持することが見出されたためである。さらに、このような知見は、支持体に結合された単一のＣ末端断片またはその変異体が、Ｎ末端断片が本明細書で開示されるもののうちいずれかまたはその変異体である融合タンパク質を用いた本明細書で開示される精製および／または修飾方法において有用であることを考慮する。よって、任意の個々の目的ポリペプチド、例えば、本明細書で開示される他のものよりも良好に発現するものにとって有利なＮ末端断片を選択することができる。

融合タンパク質は全細胞溶解液中にあっても、または細胞（例えば、哺乳類細胞）から分泌され、細胞上清中にあってもよい。いくつかの場合では、融合タンパク質のポリペプチドは、抗体、例えばＩｇＧ抗体である。いくつかの実施態様では、Ｎ末端断片は、抗体の一方または両方の重鎖に融合される。いくつかの実施態様では、Ｎ末端断片は、抗体の一方または両方の軽鎖に融合される。本明細書で開示される方法は、（求核試薬と接触させる前に）インテイン中間体を洗浄して、例えば、細胞溶解液または細胞上清を除去することをさらに含んでなり得る。

本明細書で開示される方法は、生じたポリペプチドと求核試薬の複合体を単離することをさらに含んでなり得る。よって、本明細書で開示される方法は、組換えタンパク質法により生成されたポリペプチドのための効率的な精製として有用であり得る。

求核試薬は、本ポリペプチドのα−チオエステルである複合体を形成するためにはチオールであり得る。いくつかの場合では、生じたα−チオエステルは、タンパク質修飾のための周知のα−チオエステル化学を用いて第２の求核試薬と接触させることによってさらに修飾することができる。いくつかの場合では、本明細書で開示される方法は、本ポリペプチドの複合体を提供することができ、前記ポリペプチドはいくつかの場合では、抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）、および求核試薬（例えば、薬物、ポリマー、オリゴヌクレオチド）である。

図１は、スプリットＤｎａＥインテインのトランススプライシングを示す。（ａ）可変ローカルＣ−エクステイン配列によるＫａｎＲタンパク質のタンパク質トランススプライシングを表すスキーム。（ｂ）内因性「ＣＦＮ」Ｃ−エクステイン配列ならびに外因性「ＣＧＮ」、「ＣＥＮ」、および「ＣＲＮ」配列による３０℃でのｉｎ ｖｉｖｏ相対的トランススプライシング効率。ＩＣ_５０値（±ＳＥ、ｎ＝３〜４）は、適当なＣ−エクステイントリペプチドを有する完全ＫａｎＲタンパク質の値に対して正規化したものである。 図２は、トランススプライシング反応のｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を示す。示されている、モデルエクステインＵｂまたはＳＵＭＯに融合されたスプリットインテイン対（Ｕｂ−Ｉｎｔ^ＮおよびＩｎｔ^Ｃ−ＳＵＭＯ）を３０℃または３７℃のいずれかで混合し、生成物の形成をゲル電気泳動により経時的にモニタリングした。（ａ）半減期は反応進行曲線から導き出し、標準的な一次速度方程式に当てはめた（±ＳＥ、ｎ＝３）。（ｂ）３７℃での高速Ａｖａスプライシング、および（ｃ）３７℃での非効率的Ｓｓｐスプライシングを示す代表的なクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。 図３は、スプリットＤｎａＥインテインにおける配列−活性の関係を示す。（ａ）対応する多重配列アラインメントから選択された切断を伴うｉｎ ｖｉｖｏスプライシング活性の順序で示したインテイン。（ｂ）末端触媒残基Ｃ１およびＮ１３７への１２０番の位置の近接を強調したＮｐｕ構造のレンダリング。（ｃ）ＡｈａインテインにおけるＣ１２０Ｇ突然変異のｉｎ ｖｉｖｏ分析（±ＳＤ、ｎ＝３）。（ｄ）鍵となる触媒残基（棒）とＳｓｐ活性を調節する重要な非触媒位置（球）を強調したＮｐｕ構造のレンダリング。（ｅ）Ｓｓｐ活性を向上させるＳｓｐからＮｐｕへの点突然変異のｉｎ ｖｉｖｏ分析（±ＳＤ、ｎ＝４）。総ての残基のナンバリングはＮＭＲ構造（ＰＤＢ：２ＫＥＱ）によって定義されるＮｐｕ上の関連位置に相当することに留意されたい（２１）。 図４は、操作型の超高速ＤｎａＥインテインが効率的な発現タンパク質ライゲーションを補助することを示す。（ａ）直鎖チオエステル中間体の形成およびＥＰＬを目的とするタンパク質α−チオエステルの生成のためのその使用を示すスキーム。（ｂ）融合ＡｖａＤｎａＥインテインからのユビキチンの効率的ＭＥＳＮａチオ開裂によるＵｂ−ＭＥＳチオエステル４の生成を示す、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（ｃ）ワンポットチオ開裂および示されたインテインを用いたネイティブケミカルライゲーション反応からのＵｂ−ＣＧＫ（フルオレセイン）連結産物（６）の形成を示す、蛍光ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（ｄ）前駆体アミド（１）および直鎖チオエステル（２）の比較集団のｐＨ依存性を示す、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ。 図５は、スプリットＤｎａＥインテインの配列アラインメントを示す。ナンバリングは、ＮＭＲ構造（ＰＤＢ ２ＫＥＱ）に関して割り付けられたＮｐｕのナンバリングに従う。重要な触媒残基をアスタリスクで示す。 図６は、高活性および低活性インテインの配列ロゴを示す。インテインは、「ＣＦＮ」Ｃ−エクステイン配列によるｉｎ ｖｉｖｏ活性に基づいてランク付けされる。高活性および低活性インテインは、カナマイシン３５０μｇ／ｍＬのカットオフＩＣ_５０値に基づいて識別され、Ａｈａインテインは、Ｃ^１２０Ｇ突然変異が劇的に高活性を回復させることを考えて、高活性セットに含める。 図７は、スプリットインテインを用いたＣ末端α−チオエステルの精製を示す。Ａ）スプリットインテインに基づくタンパク質Ｃ末端α−チオエステルの精製のスキーム。Ｂ）ＷＴ Ｎｐｕ^Ｃおよび固相支持体に固定するためのリンカー（下線）を有するその変異型Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡの配列。溶液中でのチオ開裂実験のために、Ｃ末端Ｃｙｓ残基は事前にヨードアセトアミドでアルキル化された。 図８は、Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡアフィニティーカラムを用いた可溶性タンパク質α−チオエステルの精製を示す。Ａ）スプリットＮｐｕ ＤｎａＥインテインを用いる精製法のスキーム。Ｂ）細胞溶解液からのＵｂ−チオエステル（Ｕｂ−ＣＯＳＲ）の精製。Ｃ）細胞溶解液からのＭＢＰ−チオエステル（ＭＢＰ−ＣＯＳＲ）の精製。両精製とも、クーマシーで染色したＳＤＳＰＡＧＥ分析（上）またはα−Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットによりモニタリングした。 図９は、ＵｂおよびＭＢＰ α−チオエステルのＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳ分析を示す。Ａ）Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡカラムから溶出したＵｂ−ＣＯＳＲのＲＰ−ＨＰＬＣ（上）およびＭＳ（下）分析。Ｂ）Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡカラムから溶出されたＭＢＰ−ＣＯＳＲのＲＰ−ＨＰＬＣ（上）およびＭＳ（下）分析。 図１０は、樹脂上でのチオ開裂の効率に及ぼす−１残基の影響を示す。ＵｂのＣ末端に２０のタンパク質構成アミノ酸のそれぞれ（−１残基）を含有する２０種類の異なるＵｂ−Ｎｐｕ^Ｎタンパク質を発現させ、Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡカラムで精製した。Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡカラムからの切断収率をゲル電気泳動により評価し、副反応（主に加水分解）に対するチオエステルの量をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳ分析により決定した。 図１１は、変性条件下でのＨ２Ｂ（１−１１６）−α−チオエステルの精製を示す。Ａ）３Ｍ尿素の存在下、Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡカラムでのＨ２Ｂ（１−１１６）α−チオエステルの精製のＳＤＳＰＡＧＥ分析。パネルＡからのＥ１のＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ）およびＭＳ（Ｃ）分析により、所望のＨ２Ｂチオエステルの存在が確認された。 図１２は、２９３Ｔ細胞で発現したαＤＥＣチオエステルの、スプリットインテインカラムを用いた精製を示す。Ａ）２９３Ｔ細胞における、種々のインテインと融合したαＤＥＣの発現レベル。Ｂ）Ｎｐｕ^Ｃ−ＡＡアフィニティーカラムによるαＤＥＣ α−チオエステルの精製。Ｃ）αＤＥＣ−チオエステルと蛍光ペプチドを含有するＮ末端Ｃｙｓとの発現タンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）。 図１３は、Ｉｎｔ^Ｃ−カラムにより溶出されたチオエステルをそのまま用いた場合のＥＰＬを示す。Ｈ−ＣＧＫ（Ｆｌ）−ＮＨ_２ペプチドと、Ｉｎｔ^Ｃ−カラムを用いて大腸菌から精製したＭＢＰ ＭＥＳチオエステル（Ａ）との間、およびＰＨＰＴ１ ＭＥＳチオエステル（Ｂ）との間の反応のＲＰ−ＨＰＬＣ（３０から７３％Ｂへの勾配、２１４ｎｍおよび４４０ｎｍで検出）およびＭＳ分析。 図１４は、Ｈ−ＣＧＫ（フルオレセイン）−ＮＨ_２ペプチド（ＣＧＫ（Ｆｌ））に対する、ユビキチンのワンポット精製／連結実験。大腸菌細胞溶解液からのＵｂ−Ｎｐｕ^ＮをＩｎｔ^Ｃ−カラムに結合させ、十分洗浄して夾雑物を除去した後、インテイン切断および連結を、２００ｍＭ ＭＥＳおよび１ｍＭ ＣＧＫ（Ｆｌ）ペプチドの添加により誘導した。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および精製／連結のゲル内蛍光（左）。溶出画分のＲＰ−ＨＰＬＣ（２１４ｎｍおよび４４０ｎｍで検出）およびＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ（右）により、所望の連結タンパク質が細胞溶解液から直接、ワンステップで、９５％に近い連結収率（ＲＰ−ＨＰＬＣにより定量）で得られたことが確認される。 図１５は、変性条件下でのＨ２Ｂ−Ｋ１２０Ａｃの半合成を示す。Ａ）２Ｍ尿素の存在下でのＨ２Ｂ（１−１１６）α−チオエステル生成のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ｓｕｐ：細胞溶解液上清、ｔｒｉｔ：封入体の１％トリトン洗液、ｉｎｐ：Ｉｎｔ^Ｃ−カラムのインプットとして使用した可溶化封入体）。Ｅ１〜Ｅ６をプールし、１５０μＭまで濃縮し、１ｍＭのペプチドＨ−ＣＶＴＫ（Ａｃ）ＹＴＳＡＫ−ＯＨと室温で３時間連結させた。Ｂ）ライゲーション反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣ（左）および連結されたＨ２Ｂ−Ｋ１２０Ａｃ産物のＭＳ（右）。 図１６は、Ｈ−ＣＧＫ（フルオレセイン）−ＮＨ２ペプチド（ＣＧＫ（Ｆｌ））に連結されたαＤＥＣ２０５の特性決定を示す。αＤＥＣ２０５−ＭＥＳチオエステルを含有するＮｐｕ^Ｃ−カラムからの溶出画分を２０μＭに濃縮し、１ｍＭのＣＧＫ（Ｆｌ）蛍光ペプチドと室温で４８時間連結させた。Ａ）連結後に脱グルコシル化(degycosylated)され、完全に還元されたＨＣのＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によれば、ＨＣの７５％が標識されることが示される。連結産物の予想量＝５０２２１．２Ｄａ。遊離ＨＣ＝４９５７５．０Ｄａ。Ｂ）連結された抗体のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析によれば、チオ開裂および連結後にその四量体構造を保持することを示される（ＭＷ＝１５１ｋＤａ、ＭＷ計算値＝１４８ｋＤａ）。Ｃ）αＤＥＣ２０５−ＣＧＫ（Ｆｌ）とＤＥＣ２０５受容体の結合。ＰＥ標識α−マウスＩｇＧを用いるフローサイトメトリーによってモニタリングされた、マウスＤＥＣ２０５受容体を発現するＣＨＯ細胞に対するαＤＥＣ２０５−ＣＧＫ（Ｆｌ）（左）または対照α−ＤＥＣ２０５抗体（右）の用量依存的結合。受容体を発現しない対照ＣＨＯ／ＮＥＯ細胞に対する結合を灰色で示す。 図１７は、ＣＨＯ細胞で発現されたαＤＥＣチオエステルの、スプリットインテインカラムを用いた精製を示す。上）Ｎｐｕ^Ｃ−カラムを用いたＣＨＯ細胞からのαＤＥＣ−ＭＥＳチオエステルの精製のクーマシー染色ＳＤＳＰＡＧＥゲル。下）同じ精製のウエスタンブロット解析。 図１８は、Ａｖａ^Ｃスプリットインテインカラムを用いたαＤＥＣチオエステルの精製、およびＡｖａ^Ｃ−カラムを用いた哺乳類細胞上清からのαＤＥＣチオエステルの精製のウエスタンブロット解析を示す。 図１９は、抗体軽鎖のＣ末端を介してＡｖａ^Ｎスプリットインテインと融合したαＤＥＣ２０５抗体の発現試験、およびαＤＥＣ２０５−ＡｖａＮ融合物を発現するＣＨＯ細胞上清の種々の時点でのウエスタンブロット解析。

発明の具体的説明

現在カタログに掲載されているおよそ６００（７）のインテインのうち、５％未満がスプリットインテインであり、ほとんどがシアノバクテリアスプリットＤｎａＥインテインとして知られるファミリーに由来する（８）。驚くことに、これらのうち、程度にかかわらず実験的に分析されているのはＮｐｕを含む６つだけであり（６、９、１０）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで厳密に特性決定されているのは、シアノバクテリア(Synechocystis)種ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）由来のＮｐｕとその広く研究されている低効率の相同分子種だけである（５、１１）。

スプリットインテインの効率を正確に比較するために、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法を用いて１８のスプリットＤｎａＥインテインの迅速調査が行われた（１２、１３）。
このアッセイでは、スプリットインテインの２つの断片を、断片化されたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＫａｎＲ）酵素との融合物として大腸菌で共発現させる。
トランススプライシング時、活性酵素が組み立てられ、細菌が抗生物質カナマイシン耐性となる（図１ａ）。活性の高いインテインほどより大きなカナマイシン耐性を付与することから、カナマイシン濃度の関数として、細菌増殖により高いＩＣ_５０値を有する。このアッセイは、ダイナミックレンジを有意に混乱することなく変化するローカルＣ−エクステイン配列のバックグラウンドで行うことができる。総てのＤｎａＥインテインはそれらの内在コンテキスト中の同じローカルエクステイン配列をスプライシングするので、このスクリーニングは最初、野生型Ｃ−エクステインバックグラウンド（ＣＦＮ）にてＫａｎＲ酵素内で行った。予想されたように、Ｎｐｕインテインを発現する細菌は高い相対的ＩＣ_５０を持っていたが、Ｓｓｐを発現するクローンはカナマイシンに不十分な耐性を示した。注目すべきは、これらのＤｎａＥインテインのうち半数を超えるものが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて３０℃で、Ｎｐｕに匹敵するスプライシング効率を示した（図１ｂ）。

ｉｎ ｖｉｖｏで見られた高いＩＣ_５０値が迅速トランススプライシングを反映したものであることを確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて標準化された条件下で一連の動態研究を行った。このため、個々に発現させ精製したスプリットＤｎａＥインテイン断片にモデルＮ−およびＣ−エクステインドメイン、ユビキチンならびにＳＵＭＯを融合したものを作製した。野生型スプライシングコンテキストを再現するために、内在ローカルエクステイン残基は、エクステインドメインとインテイン断片の間のリンカーとして保存した。同族インテイン断片を１μＭで混合し、Ｕｂ−ＳＵＭＯスプライシング産物の形成を３０℃および３７℃でゲル電気泳動によりモニタリングした。これらのアッセイにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて高い活性を有するこれらの新規インテインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて数十秒で実質的にＳｓｐより速く、トランススプライシングを触媒できたことが確認された（図２ａ）。興味深いことに、Ｓｓｐを除く、分析した総てのインテインが３７℃でスプライシング速度の上昇を示した。さらに、これらの高速スプライシングインテインの総てが低い、ないしは検出できないレベルの副反応を示し（図２ｂ）、これについてもＳｓｐと対照的であった（図２ｃ）。

Ｃ−エクステイン配列バリエーションに対するスプリットインテインの許容性を検討した。これまでに、ＤｎａＥインテインの感受性は、Ｃ−エクステインの＋２位における変化に対して記載されている（６、１２）。従って、総てのスプリットＤｎａＥインテインを、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングアッセイにおいて＋２グリシン（ＣＧＮ）、グルタミン酸（ＣＥＮ）、またはアルギニン（ＣＲＮ）の存在下で分析した（図１ｂ）。ＮｐｕおよびＳｓｐと同様に、ほとんどのインテインは、３種類の＋２突然変異の総ての存在下で劇的な活性低下を示した。試験したアミノ酸のうち、グルタミン酸は総てのインテインに対して最も許容性があり、この位置における負電荷を考慮するための保存された機構が示唆された。トランススプライシングに及ぼすＣ−エクステイン突然変異の影響の大きさをより正確に評価するために、Ｎｐｕ、Ｃｒａ（ＣＳ５０５）、およびＣｗａインテインをｉｎ ｖｉｔｒｏにて＋２グリシンの存在下で分析した。３種類のこれらの反応は総て、チオエステル中間体の急速な蓄積を特徴とし、これらは数十分かけてゆっくりスプライシング産物とＮ−エクステイン切断産物へと分解した。これまでに報告された所見に一致して、これらのデータは、スプリットＤｎａＥインテインが分岐型中間体の分割および効率的スプライシングのために＋２位に立体的な嵩高さを必要とすることを示す（１２）。Ｃｒａ（ＣＳ５０５）およびＣｗａインテインはｉｎ ｖｉｖｏにおいてより高いＣ−エクステインの無差別性を示したが、Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）は試験した突然変異をいずれも許容しなかったことは注目に値する。これは、スプリットインテイン間の微妙な配列バリエーションが様々な無差別性を与え得ることを示す。よって、この特性は、定方向進化（１２）または合理的設計によってさらに最適化され得る。

これらのデータは、スプリットＤｎａＥインテインは、総てが事実上同一の基質に対してトランススプライシングを触媒するように進化してきたにもかかわらず、活性の多岐性が高い(highly divergent)ことを示す。興味深いことに、スプライシングに関与する重要な触媒残基は、ファミリー全体で保存されている（図５）。従って、スプライシング活性に影響を及ぼす残基は非触媒性であり、おそらくそこそこ保存されているに過ぎない。相対活性の測定は、高活性インテインを非効率なものから識別する特異的な配列特徴の発見を助ける可能性がある。実際に、配列ホモロジー分析は、高活性を有するインテインは、低活性インテインの場合よりも互いに相同性が高いことを示す。この所見に対する１つの顕著な例外が耐塩性シアノバクテリア(Aphanothece halophytica)（Ａｈａ）由来のインテインであり、高活性インテインと６５％を超える配列同一性を有するにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて野生型「ＣＦＮ」Ｃ−エクステインモチーフとの活性がなかった。複数の配列アラインメントを詳しく調べたところ、このインテインは、それ以外の場合では絶対的に保存されているグリシンの代わりに非触媒システイン（１２０番の位置）を有することが示された（図３ａ）。さらに、この位置はインテイン活性部位に近接しており、外来の求核試薬が望ましくない副反応を促進する可能性もある（図３ｂ）。満足なことに、このシステインからグリシンへの突然変異はＡｈａインテインに高い活性を回復させ、しかもその逆突然変異はＮｐｕのスプライシング活性を損ない（図３ｃ）、これらのデータの予測能がバリデートされた。

スプリットインテイン配列アラインメントをさらに分析したところ、高活性インテイン間でいくつかの位置が強いアミノ酸保存を有するが、低活性インテインでは逸脱している(diverge)ことを示した（図３ａ、６）。これらは、高速インテインが、低速インテインでは欠損されてしまった有益な相互作用を保持していた部位であり得る。この観点を検討するために、この配列−活性相関が明確であったいくつかの位置を選択し、Ｓｓｐの残基をその高速インテインに見られる対応するアミノ酸で置換した。この仮説と一致して、いくつかの点突然変異がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＳｓｐの活性を上昇させた（図３ｅ）。これらの残基の具体的役割は明確でないものの、特に、それらが活性部位の外側にあること（図３ｄ）を考えれば、インテインフォールド上のそれらの位置（１４）は、それらの機能に何らかの洞察を与えるかもしれない。例えば、高活性インテインでは、５６番の位置において、芳香族残基が好ましい。この位置は保存されている触媒ＴＸＸＨモチーフ（６９〜７２番の位置）に隣接し、芳香族残基はそれらの残基を安定化させるためのパッキング相互作用を助長し得る。同様に、グルタミン酸は、触媒ヒスチジン１２５に近接した１２２番の位置に好ましい。８９番の位置のグルタミン酸は、スプリットインテイン複合体を安定化させるために重要であることが従前に示された緊密なイオンクラスターに関与している（１３）。興味深いことに、Ｅ２３は触媒部位から離れ、明確な構造的役割を持たない。この位置は、他のインテインにおいて点突然変異の活性化に関して従前に見られたように、安定性または動力学を保持するために重要であると考えることができる（１５、１６）。

新規な高速トランススプライシングインテインの発見は、タンパク質化学に幅広い意味を持つ。実際に、Ｎｐｕの発見は、スプリットインテインに基づく技術の使用の再燃の後押しをした（１３、１７、１８）。総てのタンパク質化学の試みに理想的であるようなインテインは１つとして無いが、数種の新規な高速スプライシングスプリットインテインが利用できることは、ほとんどのトランススプライシング適用の効率を増強するための選択肢を提供し得る。例えば、スプリットインテインを用いた研究における１つの共通の問題が、問題のタンパク質とのインテイン断片融合物の低い発現収率または溶解度の低さである。実際に、ここで、過剰発現および精製の試みは、Ｕｂ−ＩｎｔＮ融合物およびＩｎｔＣ−ＳＵＭＯ融合物は、インテインに依存して可溶性発現の著しく異なる収率を有することを示す。従って、挙動の異なる高活性のスプリットインテインのショートリストは、所与のトランススプライシング適用の経験的な最適化の出発点として役立つであろう。

さらに、異なる高速スプライシングスプリットインテインの断片は非同族体として混合してもなお極めて効率的なスプライシング活性を保持することができ、さらには、いずれのトランススプライシング適用にも利用可能な選択肢を拡大することができる。例えば、ＮｐｕのＮ末端断片スプリットインテインまたはその変異体は、ＮｐｕのＣ末端断片もしくその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくは変異体と結合し得る。同様に、ＳｓｐのＮ末端断片もしくはその変異体は、ＳｓｐのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＡｈａのＮ末端断片またはその変異体は、ＡｈａのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＡｏｖのＮ末端断片またはその変異体は、ＡｏｖのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＡｓｐのＮ末端断片またはその変異体は、ＡｓｐのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＡｖａのＮ末端断片もしくはその変異体は、ＡｖａのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｃｒａ（ＣＳ５５０５）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｃｒａ（ＣＳ５５０５）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｃｓｐ（ＣＣＹ０１１０）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｃｓｐ（ＣＣＹ０１１０）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＣｗａのＮ末端断片またはその変異体は、ＣｗａのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｍａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｍａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＯｌｉのＮ末端断片またはその変異体は、ＯｌｉのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｓｅｌ（ＰＣ７９４２）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｓｅｌ（ＰＣ７９４２）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）のＮ末端断片またはその変異体は、Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）のＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＴｅｌのＮ末端断片またはその変異体は、ＴｅｌのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；ＴｅｒのＮ末端断片またはその変異体は、ＴｅｒのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る；また、ＴｖｕのＮ末端断片またはその変異体は、ＴｖｕのＣ末端断片もしくはその変異体、または下記に述べる他のいずれかのスプリットインテインＣ末端断片もしくはその変異体と結合し得る。

最も広く使用されているインテインに基づく技術としての発現タンパク質ライゲーションは、シス作用インテインを利用して組換えタンパク質α−チオエステル誘導体を生成する（２）。原理的には、いずれのスプリットインテインも人工的に融合させて、この適用においてシススプライシングインテインとして使用することができる（図４ａの１）。超高速スプリットインテインは、それらの速度と効率のために、この点で特に魅力的である。この観点を試験するために、Ｎｐｕ、Ａｖａ、およびＭｃｈｔとＮ末端ユビキチンドメインとの人工融合変異体を作製した。スプライシング、早期Ｃ末端切断または望ましくない高レベルの競合加水分解を防ぐために、残基Ａｓｎ１３７およびＣｙｓ＋１をＡｌａに変異させた。外因性２−メルカプトエタンスルホン酸チオールナトリウム（ＭＥＳＮＡ）と反応させると、融合ＤｎａＥインテインは、速やかに切断されて、数時間内にユビキチンα−チオエステル４を生成した（図４ｂ）。対照的に、慣用ＭｘｅＧｙｒＡインテインのＭＥＳＮａチオ開裂は、同じ条件下で１日後であっても完了しなかった。融合ＤｎａＥインテインは、半合成タンパク質６を得るためのワンポットチオ開裂およびＮ末端システイン含有蛍光ペプチド５とのネイティブケミカルライゲーション反応を可能とするのに十分速かった（図４ｃ）。さらに、これらのインテインを用いて、異なるＣ末端アミノ酸残基を有する、他の４つの構造がユニークなタンパク質ドメインのα−チオエステルを効率的に生成することができた。これらの結果は、融合型のスプリットＤｎａＥインテインがタンパク質の半合成に全般的な有用性があることを実証する。

融合ＤｎａＥインテインに関して見られた高速のチオ開裂は、機械的意義ならびに実用的意義を持つ。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＭｘｅＧｙｒＡインテインを超えるそれらの増強された反応性の１つの可能性のある説明は、これらのインテインがＮからＳへのアシルシフト反応をより効率的に駆動して、反応性直鎖チオエステル種２のより大きな集団を生成するということであると考えられる（図４ａ）。このチオエステル中間体は一般に、タンパク質スプライシングにおいて一時的に分布すると思われ、発明者の知る限りでは、それは直接観察されたことがない（１）。驚くことに、逆相ＨＰＬＣによりユビキチン−ＤｎａＥインテイン融合物を分析すると、２つの主要ピークと３つの副ピークが観察される場合が多く、総て同じ質量を持っている。これらの種の相対的存在量は、タンパク質を変性されること(unfolding)またはｐＨ変化によって変調することができ、２つの主要な種はｐＨ４から６まではほぼ等しく分布していた（図４ｄ）。これらの主要ピークは前駆体アミド１と直鎖チオエステル２に、そして、副ピークは四面体オキシチアゾリジン中間体に相相当する可能性が最も高い。重要なことに、ユビキチン−ＭｘｅＧｙｒＡ融合物では同じ条件下で１つのＨＰＬＣピークだけが見られた。これらの所見は、チオ開裂速度の上昇とともに、これらのＤｎａＥインテインが超活性化Ｎ末端スプライスジャンクションを有するという見解を強く裏付ける。

スプリットインテインの一ファミリー全体でスプライシング活性が特性評価されている。このファミリーでは、超高速タンパク質トランススプライシングは、例外ではなく標準である。さらに、異なるスプリットインテインは、Ｃ−エクステイン突然変異に対して様々な許容度を持ち、このことは、いずれかの高活性インテインをある程度操作すれば痕跡のないタンパク質スプライシングが達成可能であることを示唆している。相同タンパク質の小ファミリーの活性の詳細比較を用いれば、活性を調節する重要な非触媒位を特定することができる。最終的に、スプリットＤｎａＥインテイン断片を人工的に融合することにより、発現タンパク質ライゲーションにおいて使用されるタンパク質α−チオエステルの効率的合成のための新規構築物が得られた。これらの結果は、改良型タンパク質化学技術の開発を導き、効率的タンパク質スプライシングのより根本的な理解に向けた基礎を築くはずである。

スプリットインテインＮ末端断片の融合タンパク質
本明細書では、ポリペプチドとスプリットインテインＮ末端断片の融合タンパク質が開示される。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、あまねく「タンパク質」と互換的に呼ばれるアミノ酸に基づくポリマーを意味し、糖タンパク質およびリポタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、本ポリペプチドは、細胞（例えば、哺乳類細胞）から放出されるポリペプチドである。様々な場合において、本ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。本ポリペプチドは目的の天然または合成のどのようなポリペプチドであってもよく、２０種の天然アミノ酸以外の１以上のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。

いくつかの場合では、本ポリペプチドは、４５ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７５ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、または１５０ｋＤａ以上の分子量を有する。本ポリペプチドは、例えば、抗体またはそのフラグメントであり得る。抗体の場合、スプリットインテインＮ末端断片は、一方もしくは両方の重鎖、および／または一方もしくは両方の軽鎖に融合させることができる。いくつかの場合では、本ポリペプチドは、細胞、例えば、哺乳類細胞から分泌されるタンパク質である。

スプリットインテインＮ末端断片は、図５に示されるような配列、例えば、Ｎｐｕ（配列番号１）、Ｓｓｐ（配列番号２）、Ａｈａ（配列番号３）、Ａｏｖ（配列番号４）、Ａｓｐ（配列番号５）、Ａｖａ（配列番号６）、Ｃｒａ（ＣＳ５０５）（配列番号７）、Ｃｓｐ（ＣＣＹ０１１０）（配列番号８）、Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）（配列番号９）、Ｃｗａ（配列番号１０）、Ｍａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）（配列番号１１）、Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）（配列番号１２）、Ｏｌｉ（配列番号１３）、Ｓｅｌ（ＰＣ７９４２）（配列番号１４）、Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）（配列番号１５）、Ｔｅｌ（配列番号１６）、Ｔｅｒ（配列番号１７）、Ｔｖｕ（配列番号１８）、またはその変異体を含んでなる。いくつかの場合では、スプリット(spilt)インテインＮ末端断片配列は、Ｎｐｕ（配列番号１）またはＳｓｐ（配列番号２）以外の配列を含んでなり、他の場合では、Ｎｐｕ（配列番号１）、Ｓｓｐ（配列番号２）、またはＡｈａ（配列番号３）以外の配列を含んでなる。いくつかの特定の場合では、スプリットインテインＮ末端断片配列は、Ａｖａ（配列番号６）、Ｃｒａ（配列番号７）、Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）（配列番号９）、Ｃｗａ（配列番号１０）、Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）（配列番号１２）、Ｏｌｉ（配列番号１３）、Ｔｅｒ（配列番号１７）およびＴｖｕ（配列番号１８）の配列を含んでなる。いくつかの場合では、スプリットインテインＮ末端断片は、配列番号１９：
のコンセンサス配列を含んでなる配列を有する。

本明細書で使用する場合、スプリットインテインＮ末端断片の変異体は、スプリットインテインＮ末端断片の活性（例えば、スプリットインテインＣ末端断片と結合し、かつ／またはそれに融合されたポリペプチドの求核作用を触媒するその能力）を保持する、本明細書で開示されるような変異型スプリットインテインＮ末端断片である。本明細書で開示されるスプリットインテインＮ末端断片の企図される変異体は、Ｃｙｓ１以外は、１以上のＣ残基の、Ａ、Ｉ、ＬもしくはＦなどの脂肪族残基への、またはＳ残基への突然変異を含む。企図されるこのような変異体の１つは、Ｃｙｓ２８およびＣｙｓ５９がＳｅｒに変異した変異型Ｎｐｕ、配列番号２０
である。

変異型スプリットインテインＣ末端断片および支持体への結合
本明細書で開示されるスプリットインテインＣ末端断片は、Ｎ１３７残基およびＣ＋１残基が、Ｎ１３７ではＡｓｎまたはＧｌｎ以外の残基に、Ｃ＋１ではＣｙｓ以外の残基に変異するように天然配列から変異させる（配列番号１２９〜１４６）。いくつかの場合では、これらの２か所での突然変異は、疎水性残基、例えば、側鎖に遊離ＳＨチオール（Ｃｙｓ）、カルボン酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、または塩基（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）または他の望ましくない基（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）を含まない残基へのものである。様々な場合において、これら２つの変異した脂肪族残基は同じであっても異なっていてもよく、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｇ、もしくはＷであり得るか、またはノルロイシン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、２−アミノペンタン酸(aminopentoic acid)、または２−アミノヘキサン酸(aminohexaanoic acid)などの非天然型の（例えば、遺伝コードによりコードされていない）脂肪族アミノ酸残基であり得る（配列番号２１９〜２３６）。
具体的には、両残基がＡ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、ＧおよびＦから選択される突然変異が企図される（配列番号３０９〜３２６）。様々な場合では、これら２つの変異残基のうち少なくとも１つはＡである。

よって、本明細書では、Ｎｐｕ（配列番号１２９、１４７、１６５、１８３、２０１、２１９、２３７、２５５、２７３、２９１、３０９、３２７、３４５、３６３、３８１および３９９）、Ｓｓｐ（配列番号１３０、１４８、１６６、１８４、２０２、２２０、２３８、２５６、２７４、２９２、３１０、３２８、３４６、３６４、３８２および４００）、Ａｈａ（配列番号１３１、１４９、１６７、１８５、２０３、２２１、２３９、２５７、２７５、２９３、３１１、３２９、３４７、３６５、３８３および４０１）、Ａｏｖ（配列番号１３２、１５０、１６８、１８６、２０４、２２２、２４０、２５８、２７６、２９４、３１２、３３０、３４８、３６６、３８４および４０２）、Ａｓｐ（配列番号１３３、１５１、１６９、１８７、２０５、２２３、２４１、２５９、２７７、２９５、３１３、３３１、３４９、３６７、３８５および４０３）、Ａｖａ（配列番号１３４、１５２、１７０、１８８、２０６、２２４、２４２、２６０、２７８、２９６、３１４、３３２、３５０、３６８、３８６および４０４）、Ｃｒａ（ＣＳ５０５）（配列番号１３５、１５３、１７１、１８９、２０７、２２５、２４３、２６１、２７９、２９７、３１５、３３３、３５１、３６９、３８７および４０５）、Ｃｓｐ（ＣＣＹ０１１０）（配列番号１３６、１５４、１７２、１９０、２０８、２２６、２４４、２６２、２８０、２９８、３１６、３３４、３５２、３７０、３８８および４０６）、Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）（配列番号１３７、１５５、１７３、１９１、２０９、２２７、２４５、２６３、２８１、２９９、３１７、３３５、３５３、３７１、３８９および４０７）、Ｃｗａ（配列番号１３８、１５６、１７４、１９２、２１０、２２８、２４６、２６４、２８２、３００、３１８、３３６、３５４、３７２、３９０および４０８）、Ｍａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）（配列番号１３９、１５７、１７５、１９３、２１１、２２９、２４７、２６５、２８３、３０１、３１９、３３７、３５５、３７３、３９１および４０９）、Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）（配列番号１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６、３７４、３９２および４１０）、Ｏｌｉ（配列番号１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７、３７５、３９３および４１１）、Ｓｅｌ（ＰＣ７９４２）（配列番号１４２、１６０、１７８、１９６、２１４、２３２、２５０、２６８、２８６、３０４、３２２、３４０、３５８、３７６、３９４および４１２）、Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）（配列番号１４３、１６１、１７９、１９７、２１５、２３３、２５１、２６９、２８７、３０５、３２３、３４１、３５９、３７７、３９５および４１３）、Ｔｅｌ（配列番号１４４、１６２、１８０、１９８、２１６、２３４、２５２、２７０、２８８、３０６、３２４、３４２、３６０、３７８、３９６および４１４）、Ｔｅｒ（配列番号１４５、１６３、１８１、１９９、２１７、２３５、２５３、２７１、２８９、３０７、３２５、３４３、３６１、３７９、３９７および４１５）、またはＴｖｕ（配列番号１４６、１６４、１８２、２００、２１８、２３６、２５４、２７２、２９０、３０８、３２６、３４４、３６２、３８０、３９８および４１６）のＮ１３７およびＣｙｓ＋１に突然変異を含んでなる変異型スプリットインテインＣ末端断片が提供され、ここで、Ｎ１３７およびＣｙｓ＋１における突然変異は、天然または非天然疎水性残基である。いくつかの特定の場合では、これらの突然変異のうち少なくとも１つはＡであり（配列番号１８３〜２００、２５５〜２７２、３２７〜３４４、および３４５〜４１６）、より具体的な場合では、両突然変異がＡである（配列番号３９９〜４１６）。

様々な支持体が使用可能である。一般に、固相支持体はポリマー、または場合によりリンカーを介して、スプリットインテインＣ末端断片の連結を可能とする物質である。このリンカーは、スプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に操作により付加されたさらなるアミノ酸残基であり得、または支持体にペプチドを結合させるための他の既知のリンカーであり得る。１つの企図されるリンカーは、小ペプチド−ＳＧＧＣ（配列番号７０５）であり、この場合、Ｃ末端Ｃｙｓのチオールを用いてスプリットインテインＣ末端断片を支持体に結合させることができる。よって、具体的には、−ＳＧＧＣペプチドリンカー（配列番号７０５）を有する（例えば、Ｎ１３７の位置で始まる残基を指定する：ＡＡＦＮ−ＳＧＧＣ）（配列番号７０６）、上記のＮｐｕ、Ｓｓｐなどの配列の変異型スプリットインテインＣ末端断片が企図される。ペプチド(pepide)リンカーの長さは、任意の個々の状況において長さおよびフレキシビリティーの変更を提供するために可変である（例えば、３以上のＧｌｙ残基）。また、ペプチドリンカーのＣ末端残基は、選択された表面にスプリットインテインＣ末端断片を結合させるために適当な反応性の官能基を導入するように改変できることも明らかである（例えば、アミンを介して反応させるにはＬｙｓ、チオールを介して反応させるにはＣｙｓ、またはカルボン酸を介して反応させるにはＡｓｐもしくはＧｌｕ）。その他、目的の支持体へのＣ末端断片の種々の結合化学を可能とする目的で他の官能基部分（例えば、アジド、アルキン、カルボニル、アミノ−オキシ、シアノ−ベンゾチアゾール、テトラゾール、アルケン、アルキル−ハリド）を提供するためのペプチドリンカーにおいて使用される非天然アミノ酸残基も企図される。リンカーはあるいはポリマーリンカーであり得る。

検討した高活性スプリットインテインＣ末端断片の配列の分析に基づけば、スプリットインテインＣ末端断片のコンセンサス配列が導かれる：配列番号７０７(VKIISRQSLGKQNVYDIGVEKDHNFLLANGLIASN)、ならびにＮ１３７がＡｓｎまたはＧｌｎ以外に変異している（配列番号７０８）、またはより具体的には、Ｎ１３７がＡ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｈ、もしくはＷなどの天然もしくは非天然疎水性残基に変異している、またはノルロイシン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、２−アミノペンタン酸、または２−アミノヘキサン酸などの非天然（例えば、遺伝コードによりコードされていない）脂肪族アミノ酸残基であり得る（配列番号７０９）変異型。具体的には、コンセンサス配列のＮ１３７において企図される突然変異としては、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、Ｇ、およびＦ（配列番号７１０）が含まれる。また、Ｎ１３７がＡに変異している場合も企図される（配列番号７１１）。

さらに、＋１位にＣｙｓ以外の残基を有するコンセンサス配列の変異体（配列番号７１２、７１６、７２０、および７２４）も企図される。より具体的には、＋１位は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｈ、もしくはＷなどの天然または非天然疎水性残基であり得、またはノルロイシン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、２−アミノペンタン酸、または２−アミノヘキサン酸などの非天然（例えば、遺伝コードによりコードされない）脂肪族アミノ酸残基であり得る（配列番号７１３、７１７、７２１、および７２５）。具体的には、＋１位がＡ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、Ｇ、およびＦから選択される突然変異（配列番号７１４、７１８、７２２、および７２６）が企図される。様々な場合において、コンセンサス配列の変異残基のうち少なくとも１つはＡである（配列番号７１５、７１９、および７２３）。いくつかの場合では、コンセンサスＣ末端断片配列は、両方の突然変異をＡｌａとして持つ（配列番号７２７）。さらに、＋２および＋３位にＦＮを含んでなるコンセンサス配列も企図される（配列番号７２８〜７４３）。また、固相支持体への結合のためのペプチドリンカーを含んでなるコンセンサス配列も企図され、１つの具体例は、＋４〜＋７位の−ＳＧＧＣである（配列番号７４４〜７５９）。

本明細書で開示されるスプリットインテインＣ末端断片またはその変異体は、リンカーを介して固相支持体に結合させることができる。様々な場合において、リンカーは、限定されるものではないが、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、またはそれらの組合せを含むポリマーである。それは主としてリンカーとして働くので、リンカーの化学構造が何であるかは重要でない。リンカーは、Ｃ末端断片の活性に干渉しないように選択されるべきである。リンカーは、ペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸で構成することができる。よって、いくつかの実施態様では、リンカーは、Ｙ_ｎを含んでなり、ここで、Ｙは天然アミノ酸またはその立体異性体であり、「ｎ」は１〜２０のうちのいずれか１つである。従って、リンカーは、ペプチド結合により連結された１〜２０のアミノ酸から構成することができ、ここで、アミノ酸は２０の天然アミノ酸から選択される。いくつかの場合では、１〜２０のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓから選択される。いくつかの場合では、リンカーは、Ｇｌｙなどの立体障害のない大多数のアミノ酸から構成される。

非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−−ＨＮ−（ＣＨ_２）_ｓ−−ＣＯ−−（ここで、ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーが使用可能である。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ_１−Ｃ_６）、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどの立体障害のない任意の基でさらに置換されてよい。

別のタイプの非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール基、例えば、−−ＨＮ−（ＣＨ_２）_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯであり、ここで、ｎは、リンカーの総分子量がおよそ１０１〜５０００、好ましくは、１０１〜５００の範囲となるようなものである。

いくつかの場合では、リンカーは、約０〜１４サブユニット（例えば、アミノ酸）の長さを有する。

リンカーがポリヌクレオチドである場合、リンカーの長さは、種々の実施態様において、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、またはさらには３０を超えるヌクレオチドである。種々の面において、ポリヌクレオチドリンカーの塩基は、総てアデニン、総てチミン、総てシチジン、総てグアニン、総てウラシル、または総ていくつかの他の修飾塩基である。

別の実施態様では、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、塩基性ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物を含んでなる。具体例としては、Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353およびNucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585およびBiochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301; Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al., 国際公開第ＷＯ８９／０２４３９号; Usman et al., 国際公開第ＷＯ９５／０６７３１号; Dudycz et al., 国際公開第WO95/11910号およびFerentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000に記載されているものが挙げられ、これらの開示は総て引用することにより本明細書の一部とされる。「非ヌクレオチド」は、糖置換および／またはリン酸基置換のいずれかを含め、１以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込むことができ、かつ、残りの塩基に酵素活性を呈させる任意の基または化合物をさらに意味する。このような基または化合物は、例えば、糖鎖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの共通に認識されるヌクレオチド塩基を含まないという点で脱塩基性であり得る。

種々の面において、企図されるリンカーは、直鎖ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリジン、デキストランなど）、分岐鎖ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍの同第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ９３／２１２５９参照）；脂質；コレステロール群（例えば、ステロイド）；または炭水化物またはオリゴ糖を含む。他のリンカーとしては、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号に記載されるようなポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどの１以上の水溶性ポリマーの付加を含む。当技術分野で公知のリンカーとしての他の有用なポリマーとしては、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が含まれる。

さらに他の面において、ポリＡなどのオリゴヌクレオチド、または親水性もしくは両親媒性ポリマーなどのリンカーも企図され、例えば、両親媒性化合物（オリゴヌクレオチドを含む）を含む。

企図される固相支持体としては、樹脂、粒子、およびビーズが含まれる。より具体的な固相支持体としては、ポリヒドロキシポリマー、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどの多糖に基づくもの、および合成ポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）およびポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、およびスチレンとジビニルベンゼンに基づくポリマー、および上述のポリマーに相当する２種類以上のモノマーが含まれるコポリマーが含まれる。企図される具体的固相支持体としては、アガロース、セファロース、セルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、誘導体化アガロース、アクリルアミド、セファデックス、セファロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−アクリルアミド、およびポリスチレン−ＰＥＧに基づく支持体が含まれる。いくつかの場合では、固相支持体は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ルーイヴィル、Ｋｙ．）、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから入手されるＰＡＭ−樹脂）（クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンを含む）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）グラフトスチレンコ−ジビニル−ベンゼン（例えば、ＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂、Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、カナダから入手）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）、ポリエチレングリコール（例えば、ＴＥＮＴＡＧＥＬまたはＡＲＧＯＧＥＬ、Ｂａｙｅｒ、チュービンゲン、ドイツ）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、カリフォルニアから入手）、またはセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）をグラフトしたポリスチレン樹脂といった樹脂であり得る。種々の実施態様において、固相支持体は、磁性ビーズ、スライドグラス、ガラスビーズ、または金属もしくは無機粒子（例えば、金、シリカ、鉄、またはそれらの混合物）であり得る。

ポリペプチドの精製および修飾方法
タンパク質の部位特異的修飾は、タンパク質機能の分子詳細を研究するための極めて貴重なツールである（１９）。さらに、タンパク質治療薬の創薬および開発に対するその可能性も最近承認された（２０）。部位特異的修飾タンパク質を作製するためのいくつかの方法が長年かけて開発され、最も広く使用されているものの１つが発現タンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）であり、様々な研究でタンパク質機能の基本的疑問に取り組むために多くの異なるタンパク質に適用されている。ＥＰＬは、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）（１９、２２）の組換えタンパク質への拡張として１９９８に初めて記載され（２１）、Ｃ末端組換えタンパク質α−チオエステルと、Ｎ末端にＣｙｓを含む合成ペプチドとの間の、これら２つの断片の間での新たなネイティブペプチド結合の形成を介した反応からなる。Ｃｙｓ含有ペプチドの合成特性は、目的タンパク質へのほとんどどんな化学修飾の組み込みも可能とする。

ＥＰＬをどんな所与のタンパク質にも適用するためには、良好な収率かつ高純度でのタンパク質Ｃ末端チオエステルの生成が絶対的要件となる。このようなチオエステルの生成のためのＥＰＬの出現以来、インテインと呼称されるシングルターンオーバー酵素のファミリーが使用されてきた。インテインは、天然の翻訳後修飾であるタンパク質スプライシングを触媒することができ、このタンパク質スプライシングにより、インテインは、自身が埋め込まれているポリペプチドから自身を切り取り、並行して、インテインの隣接タンパク質領域間に新たなペプチド結合を形成する（２３）。重要なことに、この反応は、いくつかのタンパク質α−チオエステルを介して生じ、これらは外因性チオールとのトランスチオエステル化反応を介して捕捉され得る。

ＧｙｒＡまたはＶＭＡなどのインテインは、多様なタンパク質チオエステルを生成するために首尾良く利用されてきた。所望のタンパク質チオエステルを単離するためには、インテインは通常、キチン結合ドメインまたはヘキサ−Ｈｉｓタグなどのアフィニティータグと融合される。しかしながら、この方法の著しい成功にもかかわらず、効率的チオ開裂に必要とされる反応条件（還元剤、高濃度のチオールおよび長いインキュベーション時間）がこのようなタグの性能に影響を及ぼし、かつ、ライゲーションに望まれる純粋な生成物を得るためにその後の付加的精製工程が必要とされる場合が多い（２４〜２６）。さらに、目的タンパク質のＣ末端残基の属性によっては、相当なレベルのｉｎ ｖｉｖｏ早期切断が起こる場合があり、最終的な生成物収率が著しく減る。

理想的なシステムは、インテインのチオエステル形成能とビルトインアフィニティー精製方法（チオ開裂反応条件と完全に適合したもの）および早期切断のリスクの軽減を併せ持つべきである。自然にスプリットするインテインを調べたところ、このインテインはタンパク質スプライシングに類似した反応を実行できるが、インテイン自体が２つの異なるポリペプチドに分割される。これら２つのインテイン断片のそれぞれはそれら自体によっては完全に不活性であるが、互いに強い親和性を有し、結合時にそれらはスプライシング競合活性コンフォメーション(splicing competent active conformation)を採り、タンパク質トランススプライシングを実行することができる。最近、非修飾タンパク質の精製に関して人工スプリット型のＤｎａＢインテインが報告された（２７）。従って、代わりに天然スプリットインテインを用い、細胞溶解液から直接に組換えタンパク質α−チオエステル（図７）のワンポット精製および生成にそれらを利用するための精製方法が提供される。

天然スプリットインテインのこの極めて速い反応速度のおかげで、効率的チオエステル形成を可能とし、かつ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて望まない切断反応を最小化するためにいくつかの突然変異が導入された。具体的には、早期Ｃ末端切断およびＮ末端切断を防ぐためにそれぞれ、Ｃ−インテインＣ末端触媒Ａｓｎ１３７およびＣｙｓ＋１残基の両方をＡｌａに変異させなければならなかった。天然または非天然の２個の連続する脂肪族残基への突然変異も、ＡＡ突然変異に匹敵する結果をもたらすと予想される。上記のような他の変異型スプリットインテインＣ末端断片も、記載の精製および／または修飾方法において使用可能であり、具体的に企図される。

スプリットインテインに基づく精製およびチオエステル形成方法を開発するために、これまでに知られている最速のＤｎａＥスプリットインテイン［１０］の１つであるＮｐｕスプリットインテインが選択された。まず、溶液中でのスプリットＮｐｕのタンパク質チオエステル生成能を、ＮｐｕＮと融合したモデルタンパク質ユビキチンと変異型ＮｐｕＣ（Ａｓｎ１３７およびＣｙｓ＋１→Ａｌａ）をチオールＭＥＳＮａの存在下（および不在下）で混合することによって調べた。これらの反応のＳＤＳＰＡＧＥ、ＨＰＬＣおよびＭＳ分析によれば、数時間で所望のユビキチン(ubiquitin)Ｃ末端α−チオエステルの形成が示された。これらの結果に後押しされて、固相支持体へのＮｐｕＣインテイン変異体の共有結合的固定に基づくアフィニティー精製方法が設計された。次に、固定化された変異型ＮｐｕＣは、複合体混合物からＮｐｕＮタグを持つタンパク質を精製するために使用可能であり、外因性チオールの添加により所望のタンパク質α−チオエステルを切り取り、これはカラムから高精製形態で溶出する。上記のような他のスプリットインテインＮ末端断片も本明細書で開示される方法において使用可能であり、具体的に企図される。

そのＣ−エクステインのＣ末端にＣｙｓ残基を有するＮｐｕＣ変異体（Ａｓｎ^１３７およびＣｙｓ^＋１がＡｌａに変異、ＮｐｕＣ−ＡＡ（配列番号７７７）を作製し、ヨードアセチル樹脂にペプチドを固定するために用いた。得られたＮｐｕＣ−ＡＡ親和性樹脂を用いたところ、数種のタンパク質Ｃ末端α−チオエステル（ユビキチン、ＭＢＰ、ＰＨＰＴ１）が容易に生産でき、細胞溶解液から精製できることが示された（図８）。ＨＰＬＣおよびＭＳ分析によれば、望まない加水分解が極めて低いレベルで、所望のタンパク質チオエステルの形成が確認された（図９）。回収率は７５〜９５％の間で変動し、ＮｐｕＣ−ＡＡ樹脂は、１ｍＬ当たりタンパク質３〜６ｍｇの一貫した負荷容量を持っていた。カラムから得られたＵｂ、ＭＢＰ、およびＰＨＰＴ１のα−チオエステル誘導体の有用性を、Ｎ末端Ｃｙｓ含有蛍光ペプチド（ＣＧＫ（Ｆｌ））に対してそれら各々のライゲーションを行うことによって実証し、対応する半合成生成物を優れた収率で得た（図１３）。重要なこととしては、ワンポットチオ開裂／ライゲーション反応が実施可能であり、これにより、中間体チオエステルを単離することなく、細胞溶解液から直接部位特異的修飾タンパク質が得られる（図１４）。

スプリットインテイン（およびインテインでも）を用いて実施する場合の懸念点は、スプライシングおよび／またはチオ開裂活性に対する隣接するアミノ酸配列の影響である。
Ｎ末端ジャンクションは天然Ｎ−エクステイン残基からの逸脱に対する許容性がより高いとみなされるが、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸（インテインナンバリング慣例に従って−１残基）がチオエステル形成の収率に及ぼす影響を評価することが重要であった。Ｃ末端Ｕｂ残基（Ｘ）がその天然Ｇｌｙから他の１９のタンパク質構成アミノ酸の総てに変更された、Ｕｂ−Ｘ−ＮｐｕＮ融合タンパク質の完全ライブラリーを構築した。タンパク質を大腸菌および細胞溶解液で発現させ、ＮｐｕＣ−ＡＡアフィニティー樹脂に適用し、精製した。タンパク質収量は、各精製に関するＳＤＳＰＡＧＥ分析から、また、加水分解
レベルは溶出画分のＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳ分析から評価した（図１０）。結果はＧｙｒＡなどの非スプリットインテインに関して知られているもの（２９）と同様の傾向を示し、ほとんどのアミノ酸は、ＭＥＳＮａとともに一晩インキュベートした後に高い切断収率を示す（例外はＰｒｏおよびＧｌｕであり、これらに関する回収率はそれぞれ４９および５０％であった）。予測されたように、Ａｓｎ α−チオエステルは、その側鎖の隣接するα−チオエステルとの周知の反応によるスクシンイミドの形成のために単離できなかった。

この精製方法は、自然条件下での数種の可溶性タンパク質の精製に極めて好結果を示した。しかしながら、ＥＰＬに必要とされるタンパク質断片は溶解度の低さおよび高い毒性という欠点があり、発現中に細胞封入体に蓄積する傾向がある。Ｎｐｕスプリットインテインは、変性剤の存在下で有意な活性レベルを保持することを示されており（２８）、これはこの方法がこのような条件下で適合することを示唆した。モデルＵｂ−ＮｐｕＮタンパク質融合物を用い、ＮｐｕＣ−ＡＡ−樹脂との結合およびチオエステル形成の両方が２Ｍおよび４Ｍ尿素の存在下で十分機能したことが確認された。結合およびチオ開裂の両方で、変性剤の不在下の同じ反応条件に比べて、類似したレベルが得られた。

この系を、次に、ヒストンＨ２Ｂの断片の封入体からの精製に関して調べた。ＥＰＬを用いた部位特異的修飾ヒストンの調製は、エピジェネティック調節の理解におけるそれらの重要な役割のために注目度の大きいトピックである。しかしながら、ヒストン断片は著しく挙動が不十分で、それらの組換えＣ末端α−チオエステルの調製は特に難しい。ＮｐｕＮと融合したＨ２Ｂ（１〜１１６）断片を大腸菌で発現させ、封入体を６Ｍ尿素で抽出した。次に、Ｈ２Ｂ−ＮｐｕＮ融合物を３Ｍ尿素バッファー中に希釈し、対応するＣ末端α−チオエステルを、ＮｐｕＣ−ＡＡアフィニティー樹脂上での精製と並行して生成した（図１１）。その凝集傾向のために、極めて薄いタンパク質溶液の方がより効率的に樹脂と結合し、また、効率的なチオエステル生成により長い反応時間を要し、明らかにこれらはタンパク質とタンパク質の間で最適化する必要のあるパラメーターである。これらの条件を用い、Ｈ２Ｂ（１〜１１６）Ｃ末端チオエステルが優れた純度（ＲＰ−ＨＰＬＣにより＞９０％）および単離収量（培養物１Ｌ当たり約２０ｍｇ）で得られた。これは、得られるタンパク質が少なく（培養物１Ｌ当たり４ｍｇ）、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む複数のクロマトグラフィー精製工程の使用を必要とする従来のプロトコールに優る有意な改善に相当する。重要なこととしては、ＩｎｔＣ−カラムから得られたＨ２Ｂ（１〜１１６）−ＭＥＳチオエステルは、それ以上精製せずにそのままＥＰＬ反応に使用することができる。よって、このタンパク質は１２０位にアセチル化Ｌｙｓを含有する合成Ｈ２Ｂ（１１７〜１２５）ペプチドに上手く連結され、半合成Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０Ａｃが得られた（図１５）。

このチオエステル形成精製方法の可能性を、モノクローナル抗体の部位特異的修飾にそれを適用することにより実証した。従って、具体的には、本明細書で開示される抗体とスプリットインテインＮ末端断片の融合タンパク質および本明細書で開示される変異型スプリットインテインＣ末端断片を用いることにより抗体を精製する方法が企図される。

抗体の修飾は研究の激しい分野であり、特に治療用抗体−薬物複合体の開発に焦点が当てられている（３０）。Ｎ−インテインの属性は、所与の目的タンパク質とのその融合物の発現レベルに有意な影響を持ち得る。最速スプリットＤｎａＥインテインのうちいくつかのＮ末端断片はＮｐｕＣと交差反応し、それらはいずれも同じＮｐｕＣに基づくアフィニティーカラムとともに使用可能であった。従って、モデル抗体（αＤＥＣ、ＤＥＣ２０５受容体に対する抗体）の発現レベルを調べたところ、αＤＥＣがＡｖａＮインテインと融合された場合に最高の発現レベルが得られることが判明した（図１２Ａ）。αＤＥＣ−ＡｖａＮ融合物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、培養４日後に上清を回収し、ＮｐｕＣ−ＡＡカラムで精製した。精製したαＤＥＣ中のＣ末端チオエステルの存在を、それを、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を有する短い蛍光ペプチドと反応させることによって確認した（図１２ＢおよびＣ）。脱グリコシル化され還元されたａＤＥＣ−蛍光団複合体のＭＳを用いてその同一性を確認し、ＳＥＣ−ＭＡＬＳは、生成物が単分散性であり、ＩｇＧ抗体の予想サイズであったことを示す。

スプリットインテインはタンパク質α−チオエステルの調製のために操作することができ、２つのスプリットインテイン断片間の強い親和性がそれらの精製のための強力な手段を提供する。このアプローチの普遍性は、可溶性（ユビキチン(ubiquitin)、ＭＢＰ、ＰＨＰＴ）および不溶性タンパク質（Ｈ２Ｂ断片）の両方の高純度のチオエステルならびにモノクローナル抗体（ａＤＥＣ）を生成するためにこれを使用することによって実証される。さらに、数種のＮ−インテインを、目的タンパク質の最適発現レベルに関して調べることができ、ある単一のＮｐｕＣ−カラムで使用することができる。

よって、本明細書で開示されるスプリットインテインは、目的ポリペプチドを精製および修飾するために使用することができる。目的ポリペプチドは、例えば、周知の組換えタンパク質法により、スプリットインテインＮ末端断片との融合タンパク質として提供される。次に、融合タンパク質と、対応するスプリットインテインＣ末端断片とを、そのＮ末端断片とＣ末端断片を結合してインテイン中間体の形成を可能とする条件下で接触させる。スプリットインテインＣ末端断片は支持体（例えば、樹脂などの固相支持体）に結合させることができ、またはその後に（例えば、スプリットインテインＮ末端断片と結合してインテイン中間体を形成した後に）支持体と結合させることもできる。これは組換えタンパク質合成のために混合物中に存在した成分の洗浄による除去を可能とし、融合タンパク質を他の成分から単離することを可能とする。洗浄液は洗剤、変性剤および塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）を含み得る。

次に、インテイン中間体を求核試薬と反応させて、結合したＮ末端断片インテインおよびＣ末端断片インテインから目的のポリペプチドを遊離させる、なお、このポリペプチドＣ末端は加えた求核試薬により修飾されている。求核試薬は、ポリペプチドをα−チオエステルとして定方向生産するためのチオールであり得、これはさらに、Ｃ末端のタンパク質修飾のための周知のα−チオエステル化学を用いて、例えば、異なる求核試薬（例えば、薬物、ポリマー、別のポリペプチド、オリゴヌクレオチド）、または他のいずれかの部分で修飾することはできる。この化学の１つの利点は、Ｃ末端がさらなる修飾のためのチオエステルで修飾され、従って、そのポリペプチドの他のいずれの酸性残基も修飾されることなく、Ｃ末端のみの選択的修飾を可能とする。

本明細書で開示される方法において、インテイン中間体とともに、または例えばα−チオエステルと反応する、その後の求核試薬として使用される求核試薬は、適切な求核部分を有するいずれの化合物または物質であってもよい。例えば、α−チオエステルを形成するために、チオール部分が求核試薬として企図される（contemplaed)。いくつかの場合では、チオールは、１，２−アミノチオール、または１，２−アミノセレノールである。α−セレノチオエステルは、セレノチオール（Ｒ−ＳｅＨ）を用いることにより形成され得る。企図される別の求核試薬としては、アミン（すなわち、直接アミドを得るためのアミノ分解）、ヒドラジン（ヒドラジドを得るため）、アミノ−オキシ基（ヒドロキサム酸を得るため）が含まれる。さらに、求核試薬は、目的ポリペプチド（例えば、タンパク質−薬物複合体を形成するための薬物）とのコンジュゲーションのための目的化合物内の官能基であってもよく、あるいはアジドもしくはアルキン（トリアゾールを形成するための２つの官能基間のクリックケミストリー反応のため）、テトラゾール、α−ケト酸、アルデヒドもしくはケトン、またはシアノベンゾチアゾールといった、続いての既知の生体直交型(biorthogonal)反応のための付加的官能基を代わりに有してもよい。

本発明のさらなる面および詳細は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例から明らかとなる。

材料
総てのバッファー塩、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）から購入した。硫酸カナマイシン（Ｋａｎ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、クーマシーブリリアントブルー、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）、フェニルシラン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物、および５（６）−カルボキシフルオレセインは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ）から購入した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（レウフェルフィンゲン、スイス）から購入した(purchasd)。ピペリジンは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（ワールド・ヒル、ＭＡ）から購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびリンクアミド樹脂は、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ビレリカ、ＭＡ）から購入した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）は、ＡｎａＳｐｅｃ（フリーモント、Ｃａ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、ハロ炭素（ノース・オーガスタ、ＳＣ）から購入した。完全プロテアーゼインヒビタータブレットは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（マンハイム、ドイツ）から購入した。ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（ギブズタウン、ＮＪ）からのものであった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キットは、Ａｇｉｌｅｎｔ（ラホヤ、ＣＡ）からのものであった。ＤｐｎＩおよびＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキットは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、ＭＡ）からのものであった。ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニキット、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット）は、Ｑｉａｇｅｎ（バレンシア、ＣＡ）からのものであった。サブクローニング・エフィシェンシーＤＨ５コンピテントセルおよびＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）化学コンピテント大腸菌(E. coli)は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、ＣＡ）から購入し、「インハウス」高コンピテンシー細胞株を作製するために使用した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、ＩＡ）から購入した。新規インテイン遺伝子は、合成により作製され、ＧＥＮＥＷＩＺ（サウス・プレインフィールド、ＮＪ）から購入した。本研究で使用したプラスミドは総て、ＧＥＮＥＷＩＺにより配列決定が行われた。

Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１２％）、免疫ブロットＰＶＤＦメンブレン（０．２μｍ）、およびブラッドフォード試薬色素濃縮液は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、ＣＡ）から購入した。２０×ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファーは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（アッシュランド、ＭＡ）から購入した。マウス抗ｍｙｃモノクローナル抗体（α−ｍｙｃ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、ＣＡ）から購入した。抗Ｈｉｓ Ｔａｇ、クローンＨＩＳ．Ｈ８マウスモノクローナル抗体（α−Ｈｉｓ６）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ビルリカ、ＭＡ）から購入した。マウスＨＡ．１１モノクローナル抗体（α−ＨＡ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ（プリンストン、ＮＪ）から購入した。ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｃｏｒマウス８００）およびＬｉｃｏｒブロッキングバッファーは、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（リンカーン、ＮＥ）から購入した。

器具
サイズ排除クロマトグラフィーは、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステムで実施した。分取および分析の両ＦＰＬＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００またはＳ２００ １０／３００カラムで行った。総ての実施で、タンパク質を１．３５カラム容量のバッファーで溶出させた（流速：０．５ｍＬ／分）。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｃ１８ Ｖｙｄａｃカラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を装備したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００および１２００シリーズ装置で、流速１ｍＬ／分にて実施した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ２５４５バイナリー・グラジェント・モジュールおよびＷａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器から構成されるＷａｔｅｒｓ
ｐｒｅｐ ＬＣシステムで実施した。精製は、Ｃ１８ Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０２２カラム（１０μＭ；２２×２５０ｍｍ）にて実施した。総ての実施で、水中０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡを含有する水中９０％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用した。総ての実施で、初期条件で２分の無勾配期間の後、バッファーＢ濃度を漸増して３０分の直線的勾配とした。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＭｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ ＩＩ質量分析計で実施した。ｉｎ ｖｉｖｏインテイン活性アッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＶｅｒｓａＭａｘ ｔｕｎａｂｌｅマイクロプレートリーダーで実施した。細胞は、Ｓ−４５０Ｄ Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを用いて溶解させた。ウエスタンブロットおよびクーマシー染色ｉｎ ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイゲルは、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージャーで画像化した。蛍光フルオレセイン含有ゲルは、ＧＥ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００イメージャーを用いて画像化した。

ＤｎａＥ配列ライブラリーと配列分析のコンパイル
スプリットＤｎａＥインテインのタンパク質配列は、ＮＥＢ ＩｎＢａｓｅ１から取得した。このリストは、２０１１年５月時点での２３エントリーからなった。これらのエントリーのうち、Ｃｓｐ（ＰＣＣ７８２２）およびＮｏｓｐ（ＣＣＹ９４１４）の２つは、Ｃ−インテイン配列を持たなかったので本研究から除いた。２対のインテインは同一の配列を持っていた：Ｎｓｐ（ＰＣＣ７１２０）とＡｓｐ（これらは、２つの異なる名称を有する同じ生物である可能性が最も高い）およびＳｅｌ（ＰＣＣ６３０１）とＳｅｌ（ＰＣ７９４２）。従って、Ｎｓｐ（ＰＣＣ７１２０）およびＳｅｌ（ＰＣＣ６３０１）は、ライブラリーから除いた。Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）およびＯｌｉ Ｃ−インテイン配列も同一であったが、それらのＮ−インテイン配列が異なっていたので、両インテインともライブラリーで維持した。ＩｎＢａｓｅでは、Ａｏｖインテインは、８７位に絶対的に保存されているイソロイシン（Ｉ）の代わりに「Ｘ」を持っており，従って、この位置においてＩ８７が用いられた。Ｃｓｐ（ＰＣＣ７４２４）インテインを有するカナマイシン耐性アッセイ用プラスミドは不安定であることが分かり、変動の大きい結果をもたらしたことから、このインテインは分析から除いた。最終的なライブラリーは１８のインテインを含んだ（表１）。

ＤｎａＥインテイン配列の高い相同性が考えられたので、そのＮ−インテインとＣ−インテインを、多重アラインメントソフトウエアＪａｌｖｉｅｗ２を用いて手作業でアラインした。Ｎ−インテイン配列は、最初のシステイン残基を整列させるために「左揃え」とし、可変Ｎ−インテインテール領域はアラインしなかった。Ｃ−インテイン配列は総て、Ｃ末端アスパラギンを整列させるために「右揃え」とした。本研究で用いた残基のナンバリングは、融合したＮｐｕインテインのＮＭＲ構造（ＰＤＢコード２ＫＥＱ）のナンバリングに基づく。従って、残基１０２（ＮｐｕＮの最後の残基）の後の可変Ｎ−インテインテール領域は、Ｃ−インテインのＮ末端メチオニンと同様に、ナンバリングから除いた。
Ｃ−インテインのナンバリングは、ＴｅｌおよびＴｖｕインテイン（この位置にギャップを有し、１０４番から始まる）を除き、１０３から始まる。配列ロゴ（図６）については、Ｎ−インテインアラインメントおよびＣ−インテインアラインメントはそれぞれ、高活性と低活性に基づいて２つのアラインメントに分けた。高活性の配列ロゴは、Ｃｗａ、Ｃｒａ（ＣＳ５０５）、Ｃｓｐ（ＰＣＣ８８０１）、Ａｖａ、Ｎｐｕ、Ｃｓｐ（ＣＣＹ０１１０）、Ｍｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）、Ｍａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）、Ａｓｐ、Ｏｌｉ、およびＡｈａ（高活性のＣ１２０Ｇ突然変異に基づいて含めた）から構成された。低活性の配列ロゴは、Ａｏｖ、Ｔｅｒ、Ｓｓｐ（ＰＣＣ７００２）、Ｔｖｕ、Ｔｅｌ、Ｓｓｐ、およびＳｅｌ（ＰＣ７９４２）から構成された。配列ロゴは、ＷｅｂＬｏｇｏを用いて作成した（４）。ヒートマップは、統計コンピューター・グラフィックスプログラム「Ｒ」を用いて作成した。

ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングのためのプラスミドのクローニング
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＫａｎＲ）およびＮｐｕ遺伝子断片を、従前に記載されたように（３６、３７）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ベクターのＫｐｎＩ制限部位とＳａｃＩ制限部位の間にクローニングした。この構築物は下記の構造を含んだ。
［ＫａｎＲプロモーター］−［ＲＢＳ］−［ｍｙｃ−ＫａｎＲＮ］−［ＩｎｔＮ］−［ｉＲＢＳ］−［ＩｎｔＣ］−［ＣＦＮ−ＫａｎＲＣ］
ここで、ＫａｎＲプロモーターは、ほとんどのカナマイシン耐性プラスミドに見られる構成プロモーターであり、ＲＢＳは、共通の大腸菌(E. coli)リボゾーム結合部位であり、ｉＲＢＳは、前にリンカーを持つ介在リボゾーム結合部位であり、ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃエピトープタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号７６０）をコードし、ＫａｎＲＮおよびＫａｎＲＣは、ＫａｎＲタンパク質の断片であり、ＩｎｔＮおよびＩｎｔＣは、スプリットインテイン断片である。類似のＳｓｐプラスミドも、従前に記載されたように（３６、３７）構築した。これらのプラスミドを、ｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＮｐｕＤｎａＥスプリットおよびｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＳｓｐＤｎａＥスプリットと呼称する。残りのスプリットインテインのスクリーニングベクターを作製するために、以下の構造を含む合成遺伝子を設計し、ＧＥＮＥＷＩＺから購入した。
［５’オーバーハング］−［ＩｎｔＮ］−［ｉＲＢＳ］−［ＩｎｔＣ］−［３’オーバーハング］
ここで、５’および３’オーバーハングはそれぞれ、ｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＮｐｕＤｎａＥスプリットプラスミドにおいてＮｐｕＮの上流に見られる正確に３９ｂｐおよびＮｐｕＣの下流に見られる２５ｂｐであった。総てのインテインについて、購入した遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ８の総ての大腸菌コード配列に基づいて作成されたデフォルト大腸菌コドン使用頻度表を用いてコドンの最適化を行った。これらの合成遺伝子は、ｐＵＣ５７ベクターに受容された。

これらのスクリーニングプラスミドをクローニングするために、総ての合成遺伝子を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用い、５’および３’オーバーハングに対するプライマーアニーリングによって増幅した。得られたメガプライマーを、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いたオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（３９）により、ｍｙｃ−ＫａｎＲプラスミドに、Ｎｐｕの代わりに挿入した。この結果、同一の骨格、プロモーター、およびＫａｎＲ遺伝子を含むが、異なるコドン最適化インテイン遺伝子を有する１８の相同プラスミドが得られた。これらのプラスミドをｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＸｙｚＤｎａＥスプリット（ここで、Ｘｙｚは、表１に示されるインテインを示す）と呼称する。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを標準的な推奨プロトコールを用い、種々のインテインに特定の点突然変異を導入した。

相対的インテイン活性のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング
９６ウェルプレートアッセイ： インテイン活性共役カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）アッセイを、従前に記載されたように（３６、３７）に、９６ウェルプレート形式で行った。
一般に、プラスミドを熱ショックにより１５μＬのサブクローニング・エフィシェンシーＤＨ５α細胞に形質転換し、形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＬＢ／ａｍｐ）を含む３ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で１８時間増殖させた。一晩培養物を８種類の異なるカナマイシン濃度を含有するＬＢ／ａｍｐ溶液（培養物当たり１５０μＬ）で２５０倍希釈した。細胞を９６ウェルプレートにて３０℃で、５分ごとに６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）をモニタリングしながら２４時間培養した（なお、各測定の前には１分間振盪した）。この増殖曲線（一般に、固定相）のエンドポイントをカナマイシン濃度の関数としてプロットして用量反応相を可視化し、変数勾配用量応答方程式に当てはめてＩＣ_５０値を計算した。

各回帰分析では、一般に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、３つまたは４つの独立した用量反応曲線をまとめて上記の方程式に当てはめた。各当てはめでは、ＯＤ_Ｍｉｎを６５０ｎｍでのバックグラウンド吸光度に固定し、他の総てのパラメーターを変動させた。ＩＣ_５０棒グラフに関して報告したエラーバー（図１ｂ）は、３つまたは４つをひとまとめにして当てはめた用量反応曲線からのベストフィットのＩＣ_５０値における標準誤差を表す。

ｉｎ ｖｉｖｏスプライシングのウエスタンブロット分析： ウエスタンブロット分析では、ＤＨ５α細胞を９６ウェルプレートセットアップの場合と同様にアッセイプラスミドで形質転換し、振盪しながら３７℃で１８時間増殖させた。一晩培養物を３ｍＬの新鮮ＬＢ／ａｍｐに１：３００希釈で播種し、これらの細胞を３０℃で２４時間インキュベートした。３０℃の培養物のＯＤを６５０ｎｍで測定して相対的細菌レベルを評価した後、１５０μＬの各培養物をエッペンドルフ管に移し、１７，０００ｒｃｆで２分間遠心分離した。上清を吸引除去し、細胞ペレットを、４％ＢＭＥを含有する約２００μＬの２×ＳＤＳゲルローディング色素に再懸濁／溶解した（再懸濁液容量は、ＯＤの違いに関して正規化するために若干異なっていた）。これらのサンプルを１０分間煮沸した後、１７，０００ｒｃｆで１分間遠心分離した。各サンプル（５μＬ）を１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードし、ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファーで泳動させた。これらのタンパク質をＴｏｗｂｉｎトランスファーバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、１５％メタノール）中、１００Ｖで９０分間、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをＴＢＳＴ中４％のミルクでブロッキングした後、ＴＢＳＴ中の４％ミルク中、一次抗体（α−ｍｙｃ、１：５０００）および二次抗体（Ｌｉｃｏｒマウス８００、１：１５，０００）を順次適用した。これらのブロットを、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを用いて画像化した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイのためのプラスミドのクローニング
Ｕｂ−ＩｎｔＮプラスミド： Ｎ−インテイン発現プラスミドは、従前に記載のＮｐｕＮプラスミドｐＭＲ−Ｕｂ−ＮｐｕＮ（ＷＴ）（３６、３７）に由来した。このプラスミドは、以下のタンパク質配列をコードした。
ここで、ＮｐｕＮ配列を太字で、即時型天然ローカルエクステイン残基を下線で示し、これらの残基の前に、Ｇｌｙ_４リンカーを持つＨｉｓ_６−Ｕｂがある。この構築物の発現の際に著しいｉｎ ｖｉｖｏタンパク質分解が従前に見られたので、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅを用い、このプラスミドにＧｌｙ_４配列を除去する改変を行った。得られたプラスミドｐＭＲ−Ｕｂ−ＮｐｕＮ−ΔＧｌｙ_４を他の総てのＵｂ−ＩｎｔＮプラスミドのための鋳型として用い、以下のタンパク質配列をコードした。

他の総てのＩｎｔＮプラスミドを、相同プラスミド内に痕跡のない方式でＵｂ−ＩｎｔＮ融合遺伝子を作出するためにオーバーラップ・エクステンションＰＣＲを用いてクローニングした（３９）。具体的には、ｐＭＲ−Ｕｂ−ＮｐｕＮ−ΔＧｌｙ_４内のＮｐｕＮの前後のプラスミド配列にアニールするオーバーハングを有するプライマーを用い、合成遺伝子プラスミドから、ＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼによりＮ−インテイン遺伝子を増幅した。次に、得られたメガプライマーを用いて、ＮｐｕＮの代わりに新規Ｎ−インテイン遺伝子を挿入し、Ｎ−インテイン遺伝子以外はＮｐｕＮプラスミドと同一の、ｐＭＲ−Ｕｂ−ＩｎｔＮと呼ばれる新規プラスミドを作出した。

ＩｎｔＣ−ＳＵＭＯプラスミド： Ｃ−インテインプラスミドは総て、従前に記載されたＮｐｕＣプラスミドｐＥＴ−ＮｐｕＣ（ＷＴ）−ＳＵＭＯ（３７）に由来した。このプラスミドは、以下のタンパク質配列をコードした。
ここで、ＮｐｕＣ配列を太字で、即時型天然ローカルエクステイン残基を下線で示し、後にリンカー配列およびＳＵＭＯ−ＨＡが続く。この構築物の前にＨｉｓ_６タグおよびタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列がある。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位は「｜」で示し、Ｎ末端ＩｎｔＣメチオニンの代わりにグリシン残基が後に残る。

他の総てのＩｎｔＣプラスミドを、相同プラスミド内に痕跡のない方式でＩｎｔＣ−ＳＵＭＯ融合遺伝子を作出するためにオーバーラップ・エクステンションＰＣＲを用いてクローニングした（３９）。具体的には、ｐＥＴ−ＮｐｕＣ（ＷＴ）−ＳＵＭＯ内のＮｐｕＣ前後のプラスミド配列にアニールするオーバーハングを有するプライマーを用い、合成遺伝子プラスミドから、ＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼによりＣ−インテイン遺伝子を増幅した。次に、得られたメガプライマーを用いて、ＮｐｕＣの代わりに新規Ｃ−インテイン遺伝子を挿入し、Ｃ−インテイン遺伝子以外はＮｐｕＣプラスミドと同一の、ｐＥＴ−ＩｎｔＣ−ＳＵＭＯと呼ばれる新規プラスミドを作出した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイのためのタンパク質の精製
Ｕｂ−ＩｎｔＮ構築物（Ｕｂ−ＣｗａＮを除く）の過剰発現および精製： 各Ｎ−インテインプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ＬのＬＢ中、３７℃で、ＯＤ_６００＝０．６まで増殖させた。次に、これらの細胞を１８℃に冷却し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加により１８℃で１６時間、発現を誘導した。遠心分離（１０，５００ｒｃｆ、３０分）により細胞を採取した後、細胞ペレットを、５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＢＭＥ、ｐＨ８．０）の入った５０ｍＬコニカル管に移し、−８０℃で保存した。細胞ペレットを、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した１５ｍＬの溶解バッファーを追加することにより再懸濁させた。細胞を音波処理（３５％振幅、氷上、３０秒間隔で８×２０秒のパルス）により溶解した。可溶性画分を遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）により回収した。可溶性画分を２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、スラリーをフリット付きカラムにロードした。通過画分を廃棄した後、カラムを５カラム容量（ＣＶ）の溶解バッファー、５ＣＶの洗浄バッファー１（２０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）、および３ＣＶの洗浄バッファー２（５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）で洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）で４つの１．５ＣＶ溶出画分に溶出した。洗浄液および溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

Ｎｉ−ＮＴＡカラムで濃縮した後、タンパク質をゲル濾過により精製した。洗浄液および溶出画分を総て５０ｍＭ ＤＴＴで氷上にて３０分間処理した。発現の十分なタンパク質については、次に、最初の溶出画分をそのままＳ７５ １０／３００ゲル濾過カラムに注入し（３×１ｍＬ注入）、新しく調製して脱気したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）にて１．３５ＣＶにわたって溶出させた。より薄い低収量のタンパク質の場合、一般に、５０ｍＭイミダゾール洗浄画分と最初の２つの溶出画分をプールし、４倍濃縮して３ｍＬとした。次に、この濃縮タンパク質を高収量構築物と同様にゲル濾過により精製した。
ＦＰＬＣ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、最も純度の高い画分をプールし、分析的ゲル濾過、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ、および質量分析により分析した。純粋なタンパク質の濃度は、ＵＶ Ａ２８０ｎｍおよびブラッドフォードアッセイにより決定した。

Ｕｂ−ＣｗａＮの過剰発現および精製： Ｕｂ−ＣｗａＮタンパク質は可溶性画分中に十分発現せず、ゲル濾過分析により観察したところ、濃縮されたタンパク質は総て凝集していた。従って、上記のように、発現、細胞溶解、および分画の後の、タンパク質を次のように溶解液の不溶性画分から抽出した。まず、溶解液ペレットを２０ｍＬのトリトン洗浄バッファー（０．１％トリトンＸ−１００を含む溶解バッファー）中に再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートした。このトリトン洗浄液を３５，０００ｒｃｆで３０分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、このペレットを、６Ｍ尿素を含有する２０ｍＬの溶解バッファーに再懸濁させ、混合物を４℃で一晩インキュベートした。混合物を３５，０００ｒｃｆで３０分間遠心分離した後、上清を２ｍＬのＮｉＮＴＡ樹脂と混合した。このＮｉカラムを総てのバッファーが６Ｍ尿素のバックグラウンドを持っていたこと以外は上記の本来の精製と同様に流出させた。Ｎｉ−ＮＴＡカラムでの濃縮後、５０ｍＭイミダゾール洗浄液と最初の２つの溶出画分をプールし、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈したタンパク質を、４℃での尿素の段階的透析除去によって溶解バッファー（尿素不含）でリフォールディングした。タンパク質を４倍濃縮して３ｍＬとし、すぐに、上記の本来の精製に関して示した通りにゲル濾過により精製した。純粋なタンパク質を分析的ゲル濾過、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ、および質量分析により分析した。この構築物は極めて凝集を受けやすいことに留意されたい。０．２ｍｇ／ｍＬではなく２ｍｇ／ｍＬでリフォールディングを行った場合、得られたタンパク質の１０％未満がモノマーであったが、より薄いリフォールディングでは、ほぼ５０％のモノマータンパク質を生じた。得られたタンパク質は８０％がモノマーであり、凝集物に対するモノマーの比は、４℃で２４時間の保存の後にも変わらなかった。純粋なタンパク質の濃度は、ブラッドフォードアッセイで決定した。

ＩｎｔＣ−ＳＵＭＯの構築物過剰発現および精製： 各Ｃ−インテインプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する１ＬのＬＢ培地中、３７℃でＯＤ_６００＝０．６まで増殖させた。次に、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加により、３７℃で３時間、発現を誘導した。細胞を溶解し、所望のタンパク質を、本来の方法で精製されたＵｂ−ＩｎｔＮタンパク質の場合と同様にＮｉ−ＮＴＡ樹脂で濃縮した。ＡｖａＣ−ＳＵＭＯおよびＣｓｐ（ＰＣＣ８８０１）Ｃ−ＳＵＭＯタンパク質は３７℃で十分な発現をしなかったので、これらのタンパク質は１８℃で１６時間の誘導により再発現させた。各タンパク質について、５０ｍＭイミダゾール洗浄液と最初の２つの溶出画分をプールし、ＴＥＶ切断バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で透析した後、一晩室温にて４０μｇのＨｉｓタグＴＥＶプロテアーゼで処理した。切断はＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳにより確認し、その後、反応溶液を室温で３０分間、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂とともにインキュベートした。通過画分と、洗浄バッファー１を含む２回の１．５ＣＶ洗浄液を回収し、プールした。次に、タンパク質を３〜４ｍＬに濃縮し、Ｓ７５ １０／３００ゲル濾過カラム（３×１ｍＬ注入）に注入し、新しく調製して脱気したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で１．３５ＣＶにわたって溶出した。ＦＰＬＣ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、最も純度の高い画分をプールし、分析的ゲル濾過、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ、および質量分析により分析した。純粋なタンパク質の濃度は、ＵＶ Ａ_{２８０ｎｍ}およびブラッドフォードアッセイにより決定した。

Ｕｂ−ＩｎｔＮおよびＩｎｔＣ−ＳＵＭＯ構築物の使用および保存： 精製されたタンパク質は総て４℃で保存し、それらの同族ＩｎｔＣ−ＳＵＭＯとのスプライシングアッセイのために２日以内に使用した。残りのタンパク質（２用量相当）を、６０％グリセロールを含有するスプライシングバッファー（１用量相当）と混合して２０％グリセロール原液を得、これをアリコートに分け、液体Ｎ_２中で急速冷凍した。これらのタンパク質アリコートは−８０℃で保存した。これらのタンパク質は氷上で解凍した後に十分機能があり、検出可能な機能損失なく急速冷凍と再解凍を少なくとも１回行うことができた。

ｉｎ ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイ
動態アッセイ手順： 典型的なアッセイでは、Ｕｂ−ＩｎｔＮ構築物およびＩｎｔＣ−ＳＵＭＯ構築物の個々のタンパク質原液を、濾過したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に終濃度の２倍で（例えば、１．０μＭの反応のためには２．０μＭ原液）調製した。
各タンパク質溶液に１ｍＭ ＴＣＥＰを加え（ｐＨを中性にした１００ｍＭ原液から）、これらのタンパク質を３０℃または３７℃で、反応温度にもよるが５分間インキュベートした。反応を開始させるために、Ｎ−インテインとＣ−インテインを等容量（すなわち、等モル比）で混合した。典型的な反応容量は３００μＬであり、ヒートブロック上のエッペンドルフ管で実施した。反応中、２０μＬアリコートの反応溶液を所望の時点で取り出し、氷上、２０μＬの２倍濃縮ＳＤＳゲルローディング色素中で急冷し、４０ｍＭトリス（ｐＨ約７．０）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、および２％（ｖ／ｖ）ＢＭＥを含む最終クエンチング溶液を得た。各反応について、等量の出発材料をクエンチャー溶液に直接混合することにより、人為的ゼロ時点を取った。サンプルを１０分間煮沸した後、１７，０００ｒｃｆで１分間遠心分離した。出発材料および時点のアリコート（１５μＬ）をＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードし、ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファーで泳動させた。ゲルをクーマシー染色した後、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを用いて画像化した。

ＣＧＮ Ｃ−エクステイン配列との反応については、クエンチャー溶液中にＢＭＥは用いなかったことに留意されたい。さらに、サンプルを煮沸する前に、各サンプルを１μＬの２Ｎ ＨＣｌで処理した。サンプルを煮沸および冷却した後、それらを１μＬの２Ｎ ＮａＯＨで処理した。この手順は、分岐型中間体の望まない加水分解またはチオ開裂を防いだ。

速度パラメーターの決定： 反応速度を決定するために、ゲルの各レーンを、Ｌｉｃｏｒ
Ｏｄｙｓｓｅｙ定量機能またはＩｍａｇｅＪを用いて分析した。出発材料バンドの密な近接が見られたので、これらのバンドを一般に積分した。ローディング誤差に関して正規化するために、あるレーンの各バンドの積分強度を、そのレーンの総バンド強度（レーン間で比較的一定を維持していた）の分数強度として表した。これらの正規化強度を時間の関数としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、３回の独立した反応からのデータをまとめて一次速度方程式に当てはめた。
反応物の消耗については：
生成物の形成については：
Ｙは、ある種の分数強度であり、ｔは、時間（分）であり、Ｓは、反応物の消耗の倍率であり（変動性）、Ｚは、反応エンドポイントに残留する反応物の分画を示し（変動性）、Ｙ_ｍａｘは、生成物形成の倍率であり、ｋ_ｏｂｓは、スプライシング反応に関して観測された一次速度定数である（変動性）。半減期は、一次速度定数に関するベストフィット値から計算した。
検出可能な副生成物の形成がない反応では、生成物（Ｕｂ−ＳＵＭＯ）およびＩｎｔＮ形成の速度は、出発材料消耗の速度と一致していた。

反応のウエスタンブロット分析： 見られたバンドの同一性を確認するために、ゼロ時点と反応エンドポイントのウエスタンブロットを行った。上記の反応の急冷時点のものを１２％ビス−トリスゲル（５μＬ／サンプル、２つの同一ゲル）にロードし、ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファーで泳動させた。分離したタンパク質をゲルから、ＣＡＰＳトランスファーバッファー（１０ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１０％（ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ１０．５）中、１００Ｖで６０分間、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをＬｉｃｏｒブロッキングバッファーでブロッキングした後、Ｌｉｃｏｒブロッキングバッファー中、一次抗体（α−Ｈｉｓ_６、１：３０００、またはα−ＨＡ、１：２５，０００）を適用した。ＴＢＳＴ中の４％ミルク中で、二次抗体（Ｌｉｃｏｒマウス８００、１：１５，０００）を適用した。これらのブロットを、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを用いて画像化した。３０℃および３７℃の反応からのブロットは実際に同一であった。

Ｎｐｕ−ＣＧＮ反応およびＣｒａ（ＣＳ５０５）−ＣＧＮ反応のＨＰＬＣ／ＭＳ分析
Ｎｐｕ−ＣＧＮおよびＣｒａ（ＣＳ５０５）−ＣＧＮのＨＰＬＣ／ＭＳ分析のため、Ｕｂ−ＩｎｔＮおよびＩｎｔＣ−ＣＧＮ−ＳＵＭＯの個々のタンパク質原液を、濾過したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に８．０μＭで調製した。各タンパク質溶液に１ｍＭ ＴＣＥＰを加え（ｐＨを中性とした１００ｍＭ原液から）、これらのタンパク質を３０℃で５分間インキュベートした。反応を開始させるために、Ｎ−インテインおよびＣ−インテインを等容量（すなわち、等モル比）で混合し、３０℃でインキュベートした。反応中、反応溶液の９０μＬアリコートを所望の時点で取り出し、３０μＬのクエンチング溶液（４％トリフルオロ酢酸を含む６Ｍ塩酸グアニジン）中で急冷した。各急冷時点のもの１００μＬを分析的Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入し、２５％バッファーＢで２分間の無勾配期の後、２５％から７３％のバッファーＢ勾配で３０分間溶出させた（カラムおよびランニングバッファーの詳細に関しては器具の節を参照）。種々の時点で、様々なＨＰＬＣピークを収集し、それらの同一性を質量分析により確認した。ＩｎｔＣ−（Ｕｂ）ＳＵＭＯ種をＭＳにより同定し、分岐型中間体形成および消耗を確認した。

動態モデリング
ＣＧＮの存在下でＮｐｕ、Ｃｒａ（ＣＳ５０５）、およびＣｗａの反応を比較したところ、スプライス産物よりも切断ユビキチンの速度が遅いにもかかわらず、スプライス産物よりも高い量の切断ユビキチン（すなわち、Ｎ−エクステイン切断）が見られた。この筋書きでは、スプライシングおよび切断は同じ反応物（分岐型中間体）から起こる競合一次反応であって、切断よりも多くのスプライス産物をもたらす（観察とは逆）ので、この所見は分岐型中間体からのみ起こるＮ−エクステイン切断およびスプライス産物形成と一致しない。これらの所見を一致させる試みとして、一連の動態モデリングシミュレーションを行った。総てのモデリングは、ＢＰＲｅｉｄからの動態モデリングアプレットを用いて行った（４０）。これらのモデルはスプライシング経路に関して３つの基本的仮定を持つ。
１．第１の平衡では正および逆反応が速い。さらに、この平衡の位置はややアミド側にある。
２．第２の平衡も速く、両中間体はシステイニルチオエステルであるので、Ｋ_ｅｑは１に近いはずである。
３．高速インテインでは、分岐型中間体の分割（ｋ_５）は最初の２つの可逆的段階の速度と同桁であるが、Ｌ（ｋ_６）およびＢ（ｋ_７）からの切断速度は比較的遅い。遅いインテインでは、分岐型中間体の分割（ｋ_５）も遅く、切断と同桁であった。

これらの仮定を用いると、切断および分岐型中間体の分割の相対的速度および直鎖型中間体と分岐型中間体の間の平衡が、切断およびスプライシング産物の形成の速度および程度にどのような影響を及ぼし得るかを評価する６通りの筋書きが案出された。外因性のＣ−エクステイン残基を持つものなどの遅いインテインでは、分岐型中間体の分割速度は、Ｎ−エクステイン切断の速度と同等である。これらの状況下では、３つの因子が重要である。
１．ＬとＢからの切断の相対的速度（ｋ_６とｋ_７）。
２．分岐型中間体の分割と切断の相対的速度（ｋ_５とｋ_６＋ｋ_７）。
３．最も重要には、直鎖型中間体と分岐型中間体の間の交換速度（ｋ_３／ｋ_４）。
これらの分析は、切断が直鎖型中間体および分岐型中間体の両方から起こるはずであることだけでなく、直鎖中間体における切断が有利であり得ることを示唆する。

融合ＤｎａＥインテインおよびＭｘｅＧｙｒＡからのタンパク質チオ開裂およびライゲーション
Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−ＮＨ _２ （ＣＧＫ−フルオレセイン）の固相合成および精製： Ｆｍｏｃに基づく固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、配列Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−ＮＨ_２を有するペプチドを生産した。
このペプチドを下記のように０．２ｍｍｏｌスケールにてＲｉｎｋアミド樹脂上で合成した：ＤＭＦ中２０％のピペリジンを用い、１分間の樹脂の平衡化の後に２０分のインキュベーションを用いてＦｍｏｃの脱保護を行った。Ｆｍｏｃ脱保護の後、活性化剤としてＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いてアミノ酸をカップリングした。まず、アミノ酸（１．１ｍｍｏｌ）を５０：５０ ＤＣＭ：ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶かし、０℃にて１５分間、ＤＩＣ（１．０ ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１．２ｍｍｏｌ）で活性化した。この混合物を、Ｎ末端を脱保護した樹脂に加え、室温で１０分間カップリングした。

システインがカップリングされた後、乾燥ＤＣＭ中で３０分間、Ｐｄ（Ｐｈ_３）_４（０．１当量）およびフェニルシラン（２５当量）で処理することにより、リジン側鎖を脱保護した。ペプチジル樹脂をＤＣＭ（２×５ｍＬ）およびＤＭＦ（２×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ中０．５％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）で２回洗浄し、およびＤＭＦ中０．５％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ｗ／ｖ）で２回洗浄してＰｄ触媒の残留痕跡を除去した。次に、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化法を用い、一晩室温で、５（６）−カルボキシフルオレセインをリジン側鎖にカップリングした。最後に、このペプチドを、９４％ＴＦＡ、１％ＴＩＳ、２．５％ＥＤＴ、および２．５％Ｈ_２Ｏ（６．５ｍＬ）を用いて１時間、樹脂から切断した。切断後、ＴＦＡのほぼ半分を窒素流下で蒸発させた。粗ペプチドを冷エーテルで沈殿させ、冷エーテルで２回洗浄した。最後に、Ｃ１８分取カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣにより、４０分かけて１５％から８０％のバッファーＢ勾配でペプチドを精製した。精製したペプチドをその同一性を確認するために、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳで分析した。５−カルボキシフルオレセイン複合体および６−カルボキシフルオレセイン複合体を別々に単離する試みは行わなかったので、このペプチドはこれら２種の異性体の混合物であることに留意されたい。

Ｕｂ−インテイン融合物のクローニング： 総てのＵｂ−インテイン融合物を、ユビキチンを含有する、ＮＥＢからの改変ｐＴＸＢ１ベクター（Ｈｉｓ_６−タグおよび終止コドンをＭｘｅＧｙｒＡインテインとキチン結合ドメインの間に挿入）にクローニングした。この結果、Ｕｂ−ＭｘｅＧｙｒＡ−ＡＴＥＡ−Ｈ_６と呼ばれる下記のタンパク質をコードするプラスミドｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＭｘｅＧｙｒＡ−ＡＴＥＡ−Ｈ_６が得られた。
ここで、ＭｘｅＧｙｒＡ（Ｎ１９８Ａ）のインテイン配列を太字で示し、その前にユビキチンがあり、後に内因性ローカルＣ−エクステイン配列（下線）およびＨｉｓ_６−タグが続く。

このプラスミドにＭｘｅＧｙｒＡインテインを融合Ｎｐｕインテインに置換する改変を行った。まず、ｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＮｐｕＤｎａＥ−スプリットプラスミドに、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅにより、ＮｐｕＮ遺伝子およびＮｐｕＣ遺伝子を隔てているｉＲＢＳ配列を除去する改変を行った。次に、得られたプラスミドｍｙｃ−ＫａｎＲ−ＮｐｕＤｎａＥ融合物を鋳型として用い、改変ｐＴＸＢ１ベクター内のＭｘｅＧｙｒＡ前後の配列に相同なオーバーハングを有する融合Ｎｐｕインテインを有するメガプライマーを増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いたオーバーラップ・エクステンションＰＣＲを用い、ＭｘｅＧｙｒＡの代わりに、Ｎ１３７Ａ突然変異を有するＮｐｕ遺伝子を挿入した（３９）。
重要なこととしては、この構築物をＮｐｕの天然Ｃ−エクステイン残基（ＣＦＮ）をＭｘｅＧｙｒＡのそれ（ＴＥＡ）の代わりに含むように改変した。得られたプラスミドｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＮｐｕＤｎａＥ−ＡＣＦＮ−Ｈ_６は、下記のタンパク質をコードした。
この融合物は、大腸菌で発現させた際に、ユビキチンの実質的なｉｎ ｖｉｖｏ加水分解を示した。よって、これを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発を用い、＋１システインからアラニンへ変異させることによってさらに改変し、プラスミドｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＮｐｕＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６を作出した。このプラスミドは、下記のタンパク質（Ｕｂ−ＮｐｕＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６）をコードし、これをｉｎ ｖｉｔｒｏチオ開裂実験に使用した。

下記のタンパク質配列（それぞれＵｂ−ＡｖａＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６およびＵｂ−ＭｃｈｔＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６）をコードするｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＡｖａＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６プラスミドおよびｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＭｃｈｔＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６プラスミドを、ｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＮｐｕＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６プラスミドを改変することによって同様にクローニングした。

ＤｎａＥインテイン構築物における＋１Ｃｙｓ残基の除去の対照として、＋１Ｔｈｒ残基をｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＭｘｅＧｙｒＡ−ＡＴＥＡ−Ｈ_６プラスミドからＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発によって変異させ、タンパク質Ｕｂ−ＭｘｅＧｙｒＡ−ＡＡＥＡ−Ｈ_６をコードするプラスミドｐＴＸＢ１−Ｕｂ−ＭｘｅＧｙｒＡ−ＡＡＥＡ−Ｈ_６を作出した。

融合ＤｎａＥインテインへのさらなる融合物のクローニング： いくつかの他のタンパク質をＡｖａＤｎａＥまたはＭｃｈｔＤｎａＥに融合し、これらのインテインからのチオ開裂の配列依存性を調べた。用いたタンパク質は、ヒトＧｒｂ２のＮ末端ＳＨ３ドメイン（ＡＡ１〜５５＋／−外因性Ｃ末端Ｇｌｙ）、ヒトＡｂｌキナーゼのＳＨ２ドメイン（ＡＡ１２２〜２１７）、ｅＧＦＰ、およびヒトＰＡＲＰ１の触媒ドメイン（ＡＡ６５７〜１０１５）であった。プラスミドは総て、上述の方法を用いてクローニングし、下記のタンパク質をコードするプラスミドを作出した。

種々のタンパク質−インテイン融合物の精製： 各タンパク質−インテイン融合物プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する１ＬのＬＢ培地中、３７℃でＯＤ_６００＝０．６まで増殖させた。次に、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加と３７℃で３時間のインキュベーションまたは１８で℃１６時間のインキュベーションによって発現を誘導した。Ｕｂ融合物は総て３７℃で発現し、ｅＧＦＰ融合物は１８℃で発現し、ＳＨ３、ＳＨ２、およびＰＡＲＰ_Ｃ融合物は両方の温度で発現した。これらの細胞を遠心分離（１０，５００ｒｃｆ、３０分）により採取した後、細胞ペレットを５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ＢＭＥ無し、ｐＨ８．０）の入った５０ｍＬのコニカル管に移し、−８０℃で保存した。細胞ペレットを、完全タンパク質阻害剤カクテルを添加した溶解バッファー１５ｍＬを追加することにより再懸濁させた。細胞を音波処理（３５％振幅、氷上、３０秒間隔で８×２０秒のパルス）により溶解した。可溶性画分を遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）により回収した。可溶性画分を２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、スラリーをフリット付きカラムにロードした。通過画分を廃棄した後、カラムを５カラム容量（ＣＶ）の溶解バッファー、５ＣＶの洗浄バッファー１（２０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）、および３ＣＶの洗浄バッファー２（５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）で洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）で４つの１．５ＣＶ溶出画分に溶出した。洗浄液および溶出画分を、チオール不含のローディング色素を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。最も純粋な画分をプールし、１０ｍＭ ＴＣＥＰで氷上にて２０分間処理した。次に、溶液をＳ７５またはＳ２００ １０／３００ゲル濾過カラムに注入し（２×１ｍＬ注入）、チオ溶解バッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２）中、１．３５ＣＶで溶出させた。ＦＰＬＣ画分を、チオール不含のローディング色素を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、最も純粋な画分をプールし、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析により分析した。純粋なタンパク質の濃度をＵＶ Ａ_{２８０ｎｍ}により決定した。

Ｕｂ−インテイン融合物のチオ開裂および小蛍光ペプチドとのユビキチンライゲーション： 各Ｕｂ−インテイン融合タンパク質について、３０℃にて１００μＬのスケールで４種類の反応を行った。バックグラウンド加水分解をモニタリングするための第１の反応では、融合タンパク質（５０μＭ）を、新たにＴＣＥＰ（さらに５ｍＭ）を加えたチオ溶解バッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２）中でインキュベートした。第２および第３の反応では、タンパク質を、各反応が１００ｍＭ ＭＥＳＮａまたは１ｍＭ ＣＧＫ−フルオレセインのいずれかを含んだ以外は、第１の反応と同様にインキュベートした。第４の反応では、ＭＥＳＮａおよびペプチドを加えた。種々の時点で、５μＬの反応溶液を取り出し、チオールを含有しない３０μＬの２倍ＳＤＳローディング色素中で急冷した。各時点の溶液を採取した際は、それらを反応が終了するまで−２０℃で保存した。反応後、各時点の３５μＬの急冷溶液を解凍し、１μＬの１Ｍ ＴＣＥＰ原液で処理し、１０分間煮沸し、１７，０００ｒｃｆで１分間遠心分離した。各時点の溶液（５μＬ）を１２％ビス−トリスゲルにロードし、ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファーで泳動させた。これらのゲルを蛍光イメージャーで画像化してＵｂ−ＣＧＫ−フルオレセインライゲーション産物を可視化した。その後、これらのゲルをクーマシー染色し、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを用いて画像化した。さらに、反応エンドポイント溶液を、０．１％ＴＦＡを含有するＨ_２Ｏで２０倍希釈することにより急冷し、分析的Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入した。混合物を２分の０％Ｂ無勾配期の後、３０分間かけて０から７３％Ｂへの直線勾配で分離した。
主要ピークを回収し、ＭＳにより分析した。

ＳＨ３−、ＳＨ２−、ｅＧＦＰ−、およびＰＡＲＰ _Ｃ −インテイン融合物のチオ開裂： ＡｖａＤｎａＥ融合インテインおよびＭｃｈｔＤｎａＥ融合インテインに融合した他の数種のタンパク質を用いてチオ開裂反応を、上記のユビキチン反応と同様に行った。３０℃にて３００μＬスケールで行った典型的な反応において、１０μＭの融合タンパク質をチオ溶解バッファー中、５ｍＭのＴＣＥＰで処理した後、ｐＨ調整した１Ｍの原液から加えたＭＥＳＮａ（１００ｍＭまたは２００ｍＭのいずれか）の存在下または不在下でインキュベートした。種々の時点で、アリコート（１５μＬ）の反応溶液をチオール不含の３０μＬの２倍ＳＤＳゲルローディング色素中で急冷し、反応が終了するまで−２０℃で保存した。反応後、各時点の４５μＬの急冷溶液を解凍し、１μＬの１Ｍ ＴＣＥＰ原液で処理し、１０分間煮沸し、１７，０００ｒｃｆで１分間遠心分離した。各時点の溶液（１５μＬ）を１２％ビス−トリスゲルにロードし、ＭＥＳ−ＳＤＳランニングバッファー中で泳動した。次に、これらのゲルをクーマシー染色し、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを用いて画像化した。さらに、反応エンドポイント溶液を、０．１％ＴＦＡを含有するＨ_２Ｏで４倍希釈することにより急冷し、分析的Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入した。この混合物を２分の０％Ｂ無勾配期の後、３０分間かけて０から７３％Ｂへの直線勾配で分離した。生成物ピークを回収し、ＭＳにより分析した。

融合ＤｎａＥインテインにおける直鎖チオエステル中間体の観察
ユビキチンとのＮｐｕ、Ａｖａ、およびＭｃｈｔ融合物について、中性バッファーからＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに直接注入した場合、精製されたタンパク質に３つのピークが見られた。これらのピークは総て、同じ質量の目的タンパク質を持っていた。０．１％ＴＦＡを含有するＨ_２Ｏ（ｐＨ２）で２０倍希釈し、室温で少なくとも２時間インキュベートした場合、最初の２つのピークは第３のピークに重なった（図４ｄ）。ＭｘｅＧｙｒＡでは同じ条件で同じ観察はできなかった。前駆体アミドと直鎖チオエステルの間の平衡が生じていたことをさらに確認するために、Ｕｂ−ＮｐｕＤｎａＥ−ＡＡＦＮ−Ｈ_６タンパク質を、１％ＳＤＳを含有するチオ溶解バッファーで２０倍希釈した。煮沸前には、これら２つの主要ピークが見られた。１０分間煮沸した後、このタンパク質がアンフォールド(unfolded)されると、第１の主要ピークは一部が第２の主要ピークに変換したが、このことは前記ピークが、アンフォールドした(unfolded)インテインにおいてより安定であるはずのアミドであったことを示唆する。３つのピークが平衡状態であったというさらなる証拠は、ｐＨ滴定から得られた。このタンパク質をｐＨ２〜ｐＨ８の範囲のクエン酸／リン酸塩バッファーで２０倍希釈し、室温で３〜４時間インキュベートした後、３０分かけて３０％から７３％Ｂの勾配のＨＰＬＣにより分析した（図４ｄ）。これら３つの種の相対的存在量を調整したところ、それらの活性部位に複数のイオン性官能基を含む酵素の活性と類似のベル型のｐＨ依存性を示した。

観察された３つ総てのＨＰＬＣピークから目的タンパク質の質量が観察された他、最初の２つのピークでは、−１８Ｄａ種の存在が見られた。この質量変化は脱水反応の特徴であり、このような反応は、最初のＮからＳへのアシルシフトを効率的に触媒することのできないＳｓｐＤｎａＢインテインの変異型に関してＭｏｏｔｚらによりこれまでに報告されている（４１）。具体的には、正および逆アシル化反応の四面体中間体は、酸により触媒される脱水を受けてチアゾリン副生成物を生成し得る。Ｍｏｏｔｚおよび共同研究者らによれば、この種は、通常の反応条件下での、それらの変異型インテインの不可逆的副生成物であり、低収量を招いた。ＤｎａＥインテインが完全に反応可能な本明細書の系では、この種はＲＰ−ＨＰＬＣの際の酸性化の人為的産物であるか、または通常の反応条件下で十分可逆的である。ＭＳによるチアゾリンのさらなる観察により、本反応混合物中に検出可能なレベルの四面体中間体の存在が確認されることは注目に値する。

ユビキチン以外のタンパク質とのＤｎａＥインテインの融合についても、中性ｐＨにおいて多重ピークを伴って同様のＨＰＬＣ特性が見られたが、３つのピークの比率は配列によって異なっていた。さらに、内因性「Ａ−Ｅ−Ｙ」ＤｎａＥ Ｎ−エクステインに類似性の高い配列（「Ｉ−Ｅ−Ｍ」配列とのＳＨ３融合物など）では、ＭｏｏｔｚらによってスプリットＳｓｐＤｎａＢインテインに関して見られたものと同様に（４１）、脱水生成物の実質的蓄積（ＨＰＬＣ／ＭＳによれば５０％も）が見られた。これらの構築物に関して、この種はタンパク質発現中に蓄積して、「捕捉された」（脱水した）ものと「遊離型」（天然、水和）融合タンパク質の混合物を生じると思われる。中性のｐＨでＭＥＳＮａを添加すると、「遊離型」のタンパク質は速やかにチオ開裂を受けて目的生成物を生じ、「捕捉された」タンパク質はゆっくり再水和し、チオ開裂も受け、同じ目的生成物を生じる。従って、反応進行曲線では、「バースト」相の後により緩慢な相が見られた。重要なこととしては脱水された融合タンパク質の蓄積は、より低い温度（３７℃ではなく１８℃）での発現によって減少させることができ、これらの反応は、ＭＥＳＮａ濃度を１００ｍＭから２００ｍＭ ＭＥＳＮａに引き上げることによってより速く、かつ、より完全に近くさせることができた。さらに、注目すべきは、ＳＨ３チオ開裂反応に関して、ＭｃｈｔＤｎａＥインテインはＡｖａＤｎａＥインテインよりも(that the AvaDnaE intein)実質的に効率的であるこということであり、このことは、目的のタンパク質によって異なる融合ＤｎａＥインテインが好ましい場合があることを示唆している。

上記の例示的実施例において示されるように当業者には本発明において多数の改変および変形が想到すると思われる。従って、添付の特許請求の範囲に見られる限定だけが本明細書に課せられるべきである。

参考文献

Claims (16)

1. （ａ）（１）ポリペプチドと、配列番号１〜１９からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片またはその変異体とを含んでなる融合タンパク質と、（２）配列番号５７〜７４からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片またはその変異体とを接触させること、
   ここで、前記スプリットインテインＮ末端断片の変異体は配列番号２０〜３８および７６１からなる群から選択される配列であり、
   前記スプリットインテインＣ末端断片の変異体は配列番号５７〜３９８、７０８〜７１１、７２８〜７４２、４１７〜６８６および７４４〜７５９からなる群から選択される配列であり、
   前記接触は、前記スプリットインテインＮ末端断片と前記スプリットインテインＣ末端断片が結合してインテイン中間体を形成することを可能とする条件下で行われる；および
   （ｂ）前記インテイン中間体を求核試薬と接触させて、タンパク質と求核試薬の複合体を形成すること
   を含んでなる、方法。
2. 前記スプリットインテインＣ末端断片が支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記支持体がビーズ、樹脂、粒子またはスライドグラスを含んでなる、請求項２に記載の方法。
4. 前記融合タンパク質が全細胞溶解液中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記インテイン中間体を洗浄して全細胞溶解液の成分からインテイン中間体を分離することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
6. 前記融合タンパク質が細胞上清に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記インテイン中間体を洗浄して細胞上清の成分からインテイン中間体を分離することをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
8. 前記ポリペプチドが４０ｋＤａ以上の分子量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項８に記載の方法。
10. 前記ポリペプチドが細胞から分泌される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記複合体を単離することをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記求核試薬が第２のポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、薬物、またはポリマーを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記求核試薬がチオールを含んでなり、前記複合体がチオエステルを含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記チオールが２−メルカプトエタンスルホネート、アルキルチオール、またはアリールチオールである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記チオエステルを第２の求核試薬と反応させて第２の複合体を形成することをさらに含んでなる、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記第２の求核試薬がアミン、ヒドラジン、またはアミノ−オキシ部分を含んでなる、請求項１５に記載の方法。