WO2023027169A1 - 生細胞の選別システム - Google Patents

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WO2023027169A1
WO2023027169A1 PCT/JP2022/032191 JP2022032191W WO2023027169A1 WO 2023027169 A1 WO2023027169 A1 WO 2023027169A1 JP 2022032191 W JP2022032191 W JP 2022032191W WO 2023027169 A1 WO2023027169 A1 WO 2023027169A1
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cells
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protein
cell
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秀之 中西
啓史 位▲高▼
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method and system for selecting living cells in which target molecules are present.
  • the tissues and organs of multicellular organisms are composed of many types of cells. There are about 400 types of cells that make up humans, including only mature cells. Techniques for selecting desired cells from a population of cell types with different properties are very important for regenerative medicine.
  • a method using a flow cytometer is known as a cell sorting technology.
  • surface antigens are labeled with fluorescence and sorted one by one using a cell sorter. Therefore, among the various proteins expressed by each cell, only those appearing on the cell surface can be used as selection criteria. Moreover, it was not suitable for sorting a large amount of cells.
  • flow cytometers are also disadvantageous in that they are expensive.
  • Patent Document 1 discloses controlling the expression of cell-killing proteins in a miRNA-specific manner using mRNAs having miRNA target sequences.
  • miRNA switches which are mRNAs that express puromycin in response to miRNA endogenous to cells, are commercially available. When a miRNA switch is introduced into a mixed cell population of different cell types, the mRNA encoding the puromycin resistance gene is degraded in cell types with high specific miRNA activity. Therefore, the cell type is eliminated by treating the cell population with puromycin.
  • miRNA switch technology is suitable for selective elimination of specific cell types. However, it is unsuitable for selectively allowing a specific cell type to survive. This is because it is difficult to imagine miRNAs that are highly active in all cell types other than target cells. In miRNA-switch technology, it is also necessary to look for miRNAs that are highly active enough to prevent leaky expression of the puromycin resistance gene in order to selectively leave specific cell types. However, many miRNAs have low activity even if they have high transcript amounts, and information on miRNA activity is still scarce.
  • the present invention includes the following. [1] (I) and (II) below: (I) Expressing a first fusion protein comprising a first target binding molecule that specifically recognizes a first portion of the target molecule, the N-terminal domain of the caged intein, and the N-terminal domain of the drug resistance protein mRNA, (II) expressing a second fusion protein comprising a second target binding molecule that specifically recognizes a second portion of the target molecule, the C-terminal domain of the caged intein, and the C-terminal domain of the drug resistance protein; mRNA, or live cell sorting systems containing DNA encoding them.
  • the mRNA of (I) is a first mRNA containing a nucleic acid sequence encoding the first fusion protein
  • the mRNA of (II) is a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein.
  • the mRNA of (I) and the mRNA of (II) are, in the 5′ to 3′ direction, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, a self-cleavage sequence encoding a self-cleavage peptide, and the The system of [1], which is a single mRNA comprising a nucleic acid sequence encoding the first fusion protein.
  • the N-terminal domain of the caged intein is caged eNpu N-intein or a variant thereof, and the C-terminal domain of the caged intein is caged Npu C-intein or a variant thereof, [1]-[ 4], the system according to any one of the items.
  • a method for sorting living cells using a target molecule as an indicator comprising the following (a) and (b): (a) introducing the system according to any one of [1] to [5] into a cell; (b) A method comprising the step of culturing the cells obtained in step (a) in the presence of a drug corresponding to the drug resistance protein.
  • a method for producing a viable cell population selected using a target molecule as an indicator comprising the following (a) and (b): (a) introducing the system according to any one of [1] to [5] into a cell population; (b) A method comprising the step of culturing the cell population obtained in step (a) in the presence of a drug corresponding to the drug resistance protein.
  • the cell sorting system enables sorting based on various intracellular target molecules, unlike existing live cell sorting methods using sorting equipment such as cell sorters, which can only use surface antigens as sorting criteria. be.
  • the selection criteria are proteins, more information can be used than the technique based on miRNA activity, and as a result, accurate cell selection becomes possible.
  • any intracellular protein can be treated by exchanging the target-binding molecule that binds to the target molecule.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically showing the intracellular behavior of a target protein, which is an example of a target molecule, and a fusion protein expressed intracellularly by the live cell sorting method according to the present invention.
  • Schematically represents the first fusion protein (left), the second fusion protein (middle), and the target protein (right) in the cell after the introduction step, (b) the first fusion protein, and the second fusion protein are both bound to the target protein, and (c) shows the reconstituted drug resistance protein (right), the caged intein released by the action of the caged intein, the target binding molecule, and Complexes derived from target proteins (left) are shown.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically showing the intracellular behavior of a target protein, which is an example of a target molecule, and a fusion protein expressed intracellularly by the live cell sorting method according to the present invention.
  • Schematically represents the first fusion protein (left), the second fusion protein (middle), and the
  • FIG. 2 is a conceptual diagram schematically showing the live cell sorting method according to the present invention, showing introduced mRNA and target protein, non-target cells and target cells, and live sorted target cells.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an application of the method for sorting living cells according to the present invention, and is a conceptual diagram schematically showing cells into which three different genes have been integrated and a method for confirming the integrated genes. be.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Example 1 of the method for sorting living cells according to the present invention, showing the results of the method for sorting cells expressing eDHFR as a target protein.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Example 2 of the method for sorting living cells according to the present invention, showing the results of the method for sorting cells expressing EGFP as a target protein.
  • the present invention relates to a system and method for sorting living cells using target molecules as indicators.
  • the live cell sorting system includes the following (I) and (II): (I) Expressing a first fusion protein comprising a first target binding molecule that specifically recognizes a first portion of the target molecule, the N-terminal domain of the caged intein, and the N-terminal domain of the drug resistance protein mRNA, (II) expressing a second fusion protein comprising a second target binding molecule that specifically recognizes a second portion of the target molecule, the C-terminal domain of the caged intein, and the C-terminal domain of the drug resistance protein; mRNA, or DNA encoding these including.
  • the method for sorting living cells comprises the following steps (a) and (b): (a) introducing into cells the mRNA of (I) and the mRNA of (II), or DNAs encoding them; (b) culturing the cells obtained in step (a) in the presence of a drug corresponding to the drug resistance protein;
  • the mRNA expressing the first fusion protein (mRNA of (I) above) and the mRNA expressing the second fusion protein (mRNA of (II) above) are separate mRNA molecules including. It also includes the case where one molecule of mRNA expresses the first fusion protein and the second fusion protein as separate molecules.
  • the case where the mRNA of (I) and the mRNA of (II) are separate RNA molecules as a first embodiment, and the case where the mRNA of (I) and the mRNA of (II) are the same RNA molecule as a second embodiment are described below.
  • the system and method according to the present invention are characterized in that the mRNA of (I) is a first target-binding molecule that specifically recognizes the first site of the target molecule and N of caged intein.
  • a first mRNA comprising a nucleic acid sequence encoding a first fusion protein comprising a terminal domain and an N-terminal domain of a drug resistance protein, wherein the mRNA of (II) specifically binds to the second site of the target molecule;
  • a second mRNA comprising a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein comprising a recognizing second target binding molecule, the C-terminal domain of the caged intein, and the C-terminal domain of the drug resistance protein. That is, in the first embodiment, mRNA containing a nucleic acid sequence encoding a first fusion protein and mRNA containing a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein are included as separate molecules.
  • the selection of viable cells means killing cells other than the target cell or cells and keeping the target cell or cells in a viable state.
  • sorting viable cells refers to separating one or more cells of interest alive from a live heterogeneous cell population, which may contain more than one type of cell.
  • sorting viable cells refers to keeping a cell viable if the cell is the cell of interest. The method is performed without sophisticated sorting equipment, in particular a flow cytometer.
  • a cell type of interest is also referred to herein as a target cell.
  • other cell types are also collectively referred to as non-target cells.
  • the target molecule refers to a molecule that exists in the target cell at the time of performing the method of the present invention, and in certain embodiments, it can refer to a molecule that exists in the cytoplasm or nucleus of the target cell. .
  • the target molecule is not particularly limited as long as it has a first binding site and a second binding site that can be specifically recognized by other molecules. However, it is preferred that the first binding site and the second binding site on the target molecule are separate sites.
  • Target molecules are also preferably non-toxic to cells. Specific examples of target molecules include proteins, peptides, non-peptide compounds, synthetic low-molecular-weight compounds, natural compounds, or fragments thereof.
  • a suitable target molecule can be selected according to the cells to be sorted.
  • metabolites produced as a result of natural or artificial reactions in cells can also be target molecules, and in this case metabolites may be low-molecular-weight compounds and the like.
  • target molecule consisting of a protein or a fragment thereof is hereinafter also referred to as a target protein.
  • a target protein is selected and determined for the purpose of specifically reconstituting a drug-resistant protein in cells in which the target protein is present, and based on the target protein, (a) and (b) ) can be designed.
  • the target protein it is preferable to select, for example, a protein that has a large difference in expression level or abundance between target cells and non-target cells.
  • target molecules other than target proteins it is also preferable to select molecules that have a large difference in the amount present between target cells and non-target cells.
  • target proteins include proteins that are endogenous to specific cells. Proteins that are endogenous to a particular cell include, but are not limited to, proteins that are expressed according to the differentiation stage of the cell and proteins that are expressed according to the disease state of the cell. Reconstitution of drug-resistant proteins in the presence of these target proteins selectively confers drug resistance to cells undergoing differentiation or disease states characterized by each target protein. be able to.
  • Another example of a target protein is a protein produced due to a substance introduced exogenously into a cell. Proteins produced due to substances introduced from the outside include proteins that can be produced in the cells due to genes restored by genome editing, proteins that can be produced in the cells by mRNA vaccination or mRNA medicine.
  • proteins that can be produced in the cell by plasmid DNA, viral vectors, and the like are not limited to these.
  • target molecules other than target proteins include molecules produced intracellularly in specific disease states and molecules artificially produced in cells, and the types thereof are not limited.
  • the step (a) of the method for selecting viable cells is the step of introducing the first mRNA and the second mRNA into the cell.
  • cell is not particularly limited and may be any cell.
  • a cell may be a single cell or a "cell population” that is a collection of two or more cells. Although there is no theoretical upper limit to the number of "cell populations", for example, a population consisting of about 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cells is referred to.
  • Cells may be cells collected from unicellular or multicellular organisms, or may be cells (including cell lines) that have been artificially manipulated. For example, yeast, insect cells, animal cells, etc. are used, and among them, animal cells are preferred.
  • Animal cells include, for example, cells derived from mammals (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, humans, etc.).
  • Cells derived from mammals include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, dhfr gene-deficient CHO cells, mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, and rats.
  • Cell lines such as GH3 cells, human embryonic kidney-derived cells (e.g. HEK293 cells), human liver cancer-derived cells (e.g. HepG2), human FL cells, etc., and primary cells prepared from human and other mammalian tissues Cultured cells are used. Furthermore, zebrafish embryos, Xenopus laevis oocytes and the like can also be used.
  • the cells may be (A) stem cells, (B) progenitor cells, (C) terminally differentiated somatic cells, or (D) other cells.
  • stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, spermatogonial stem cells ("GS cells”). , embryonic germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells, and the like.
  • Progenitor cells include, for example, tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • Somatic cells include, for example, keratinizing epithelial cells (e.g., keratinizing epidermal cells), mucosal epithelial cells (e.g., tongue epithelial cells), exocrine gland epithelial cells (e.g., mammary gland cells), hormone secretion cells (e.g., adrenal medulla cells), cells for metabolism and storage (e.g., hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (e.g., type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain duct ( vascular endothelial cells), ciliated cells with carrying capacity (e.g.
  • airway epithelial cells extracellular matrix-secreting cells (e.g. fibroblasts), contractile cells (e.g. smooth muscle cells), blood and Immune system cells (e.g. T lymphocytes), sensory cells (e.g. rod cells), central and peripheral nervous system neurons and glial cells (e.g. astrocytes), pigment cells (e.g. retinal pigment epithelium) cells), and their progenitor cells (tissue progenitor cells).
  • Other cells include, for example, cells that have undergone differentiation induction, including progenitor cells and somatic cells that have undergone differentiation induction from pluripotent stem cells.
  • cells induced by so-called "direct reprogramming (also referred to as trans-differentiation)" in which somatic cells or progenitor cells are directly differentiated into desired cells without passing through an undifferentiated state, may be used.
  • Live cells are cells in a living state, and can be distinguished from dead cells by the presence or absence of metabolism and differences in cell membrane permeability.
  • the first and second mRNAs to be introduced into the cells are mRNAs that express the first and second fusion proteins, respectively.
  • the first and second fusion proteins contain the N-terminal domain and C-terminal domain of the drug-resistant protein, and associate when the target molecule is present in the introduced cell, and the drug-resistant protein to generate
  • FIG. 1(a) schematically shows the first fusion protein (left), the second fusion protein (middle), and the target protein (right), which is an example of the target molecule, in the cell after the introduction step (a).
  • the first fusion protein is a substance produced by intracellular translation of the first mRNA, and from the N-terminus, the N-terminal domain of the drug resistance protein, the N-terminal domain of the caged intein, and the first target-binding molecule are combined in this order.
  • the second fusion protein is a substance produced by intracellular translation of the second mRNA. linked in this order.
  • FIG. 1(b) shows a state in which both the first fusion protein and the second fusion protein are bound to the target protein. This binds the N-terminal domain of the caged intein and the C-terminal domain of the caged intein. Then, by the action of the caged intein, the N-terminal domain and C-terminal domain of the drug resistance protein bind to reconstitute the drug resistance protein.
  • FIG. 1(c) shows the reconstituted drug-resistant protein (right), the caged intein detached by the action of the caged intein, the target-binding molecule, and the complex derived from the target protein (left).
  • the drug resistance protein can be any drug resistance protein, for example puromycin resistance protein (puromycin-N-acetyltransferase), blasticidin resistance protein (blasticidin S deaminase), neomycin (geneticin/G418) Resistance protein (aminoglycoside phosphotransferase), hygromycin resistance protein (hygromycin phosphotransferase), zeocin (phleomycin D1) resistance protein (Shble), but not limited to these.
  • puromycin resistance protein puromycin-N-acetyltransferase
  • blasticidin resistance protein blasticidin S deaminase
  • neomycin geneeticin/G4108
  • Resistance protein as aminoglycoside phosphotransferase
  • hygromycin resistance protein hygromycin phosphotransferase
  • zeocin phleomycin D1 resistance protein
  • mutants include, for example, mutants obtained by making conservative substitutions in the amino acid sequence of known or commercially available drug-resistant protein amino acid sequences, and one or several (e.g., two, three, 4, 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, or 85% or more (e.g., 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more above), including, but not limited to, variants containing amino acid sequences having the same identity.
  • the point at which the drug resistance protein is divided into the N-terminal domain and the C-terminal domain is not particularly limited as long as the drug resistance protein is reconstituted and the original function of the drug resistance protein is maintained after reconstitution.
  • the three-dimensional structure of a drug-resistant protein when the three-dimensional structure of a drug-resistant protein is analyzed, it can be divided into an N-terminal domain and a C-terminal domain at a loop portion that does not constitute an ⁇ -helix or a ⁇ -sheet.
  • the split point is between the 32nd alanine and the 33rd residue threonine, between the 84th alanine and the 85th glycine, 119 It may be between the lysine residue and the 120th glutamic acid residue.
  • the splitting sites may be changed within 5 amino acid residues from the splitting site to the N-terminal side or C-terminal side, but in that case, a site that does not constitute an ⁇ -helix or a ⁇ -sheet may be selected. desirable. It is particularly preferred to be between the 84th alanine and the 85th threonine. Appropriate division points can be confirmed by prior experiments and simulations by those skilled in the art.
  • caged inteins are proteins that cause rearrangement only when there is an interaction through other domains. Defined as an intein with fused structures.
  • a protein or peptide having a C-intein-like sequence can be used as a cage structure for N intein
  • a protein or peptide having an N-intein-like sequence can be used as a cage structure for C intein.
  • the other domains are the first and second target binding molecules.
  • Any caged intein can be used.
  • caged eNpu N-intein SEQ ID NO: 1
  • the N-terminal domain of caged intein disclosed in Gramespacher J. A. et al., J. Am.
  • the terminal domain caged Npu C-intein (SEQ ID NO: 2) can be used, but is not limited to these.
  • Each sequence is shown in Table 1.
  • the bold letters are the N intein-derived sequence (in SEQ ID NO: 1), the C intein-derived sequence (in SEQ ID NO: 2), the underlined portion is the linker sequence, and the boxed portion is the C intein-like sequence (in SEQ ID NO: 1). ), representing the N intein-like sequence (in SEQ ID NO:2).
  • the original N-intein-derived sequence is from the 1st residue to the 102nd residue.
  • the 30-residue sequence from the 125th to the 154th residue and the 30-residue sequence from the 160th to the 189th residue are the same and are C-intein-like sequences.
  • a sequence consisting of 22 residues from the 103rd residue to the 124th residue is a linker sequence of the N intein-derived sequence and the C intein-like sequence.
  • a sequence consisting of five residues from the 155th to the 159th residue is a linker sequence between the C-intein-like sequences.
  • the caged eNpu N-intein shown in SEQ ID NO: 1 is a sequence containing two repeats of a C-intein-like sequence, and the types of amino acids in the sequence with one repeat of the C-intein-like sequence, the sequence with three or more repeats, and the linker sequence. can also be used as well as caged eNpu N-inteins.
  • the sequence consisting of 52 residues from the 1st residue to the 52nd residue is an N intein-like sequence, consisting of 22 residues from the 53rd residue to the 74th residue.
  • the sequence is a linker sequence between the N-intein-like sequence and the C-intein-derived sequence, and the sequence consisting of 35 residues from the 75th to the 109th residue is the C-intein-derived sequence.
  • a sequence in which the N-intein-like sequence in caged Npu C-intein has two or three or more repeats, and a sequence in which the type of amino acid in the linker sequence is changed can also be used in the same manner as in caged Npu C-intein.
  • Mutants of caged eNpu N-intein and mutants of caged Npu C-intein can also be used as long as they do not impair the activity of caged intein.
  • variants include, for example, variants in which conservative substitutions are made to the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2; ) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, or amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 and 85% or more (e.g., 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater) amino acid sequence identity.
  • the first and second target-binding molecules are molecules that specifically recognize the first and second sites of the target molecule, eg, the target protein, respectively.
  • the first and second target binding molecules can be selected or designed to match the target protein.
  • the target-binding molecule may be any molecule that has the ability to bind to the target molecule, and when the target molecule is an antigen, antibodies, peptide aptamers, artificial peptides derived from fibronectin, DARPin, and the like can be mentioned. Even when the target molecule is a molecule other than protein, a molecule that specifically binds to the target molecule can be appropriately determined.
  • low-molecular-weight compounds include target-binding molecules that utilize interactions such as rapamycin-mediated binding between FKBP (FK506-binding protein) and FRB (FKBP-rapamycin binding protein).
  • the origin of the antibody used in the present invention is not particularly limited, and whether it is a full-body antibody or a fragment antibody (e.g., nanobody antibody, Fab, F(ab') 2 , etc., Variants (e.g., scFv, etc.) may also be used, and the term "antibody” is used herein to include these.
  • the peptide aptamer used in the present invention is an amino acid residue or both terminal portions. Peptide aptamers can be selected using methods well known to those skilled in the art.For example, but not limited to, selection can be performed by yeast two-hybrid method.
  • the target-binding molecule is an artificial molecule obtained by modifying a different protein from the antibody to have the same antigen-binding ability as the antibody. and include, but are not limited to, monobodies, affibodies, anticalins, and the like.
  • the first and second target-binding molecules are selected from the known target-binding molecules. be able to.
  • the first site and the second site are different parts, and the first site and the second site are proximal to each other as long as they do not inhibit the binding of the target binding molecule to each other. preferable. This is because the interaction between the first site of the target protein and the first target-binding molecule and the interaction between the second site of the target protein and the second target-binding molecule cause rearrangement of the caged intein.
  • the target binding molecule that specifically recognizes the target protein is unknown, or when only one target binding molecule is known, the target protein or its fragment is used as an antigen to immunize camelids such as alpaca. to generate antibodies and obtain the sequences of their antigen-recognition sites.
  • target binding molecules such as two or more Nanobodies, that specifically recognize different sites of the target protein.
  • each domain may be directly linked or linked by a linker of about 2 to 30 amino acids.
  • the first mRNA comprises, in the 5′ to 3′ direction, [5′ UTR containing a Cap structure or Cap analog at the 5′ end], [an open reading frame containing a nucleic acid sequence encoding a first fusion protein ], [3′UTR containing PolyA] may be linked in this order.
  • the 5'UTR of the first mRNA contains a Cap structure or Cap analog at the 5' end.
  • the Cap structure may be a 7-methylguanosine 5' phosphate.
  • the Cap analog is a modified structure recognized by eIF4E, which is a translation initiation factor similar to the Cap structure, and is manufactured by Ambion's Anti-Reverse Cap Analog (ARCA ), m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog from New England Biolabs, CleanCap from TriLink, and the like. Cap analogs may be other modified structures recognized by translation initiation factors.
  • the open reading frame which is the coding region of the first mRNA, includes an initiation codon, a nucleic acid sequence encoding the first fusion protein, and a termination codon.
  • the nucleic acid sequence encoding the first fusion protein comprises, from the 3' side of the start codon AUG to the 5' side of the stop codon, the nucleic acid sequence encoding the N-terminal domain of the drug resistance protein, the N-terminal domain of the caged intein. and a nucleic acid sequence encoding the first target binding molecule, in that order.
  • the nucleic acid sequence encoding each domain can be determined from the structure of the previously designed first fusion protein.
  • the 3'UTR of the first mRNA contains PolyA tail.
  • a PolyA tail may be a sequence of about 50-250 adenine bases attached. However, it is not necessary that about 50 to 250 adenine bases are continuously linked, and other nucleobases may be included between the adenine bases as long as the stability of the mRNA can be maintained.
  • the second mRNA comprises, in the 5′ to 3′ direction, [5′ UTR containing a Cap structure or Cap analog at the 5′ end], [an open reading frame containing a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein ], [3′UTR containing PolyA] may be linked in this order. [5′UTR containing a Cap structure or Cap analog at the 5′ end] and [3′UTR containing PolyA] may be the same as the first mRNA.
  • the 5'UTR and 3'UTR nucleic acid base sequences and number of nucleic acid bases may be the same or different between the first mRNA and the second mRNA, but are preferably the same.
  • the open reading frame which is the coding region of the second mRNA, includes an initiation codon, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, and a termination codon.
  • the nucleic acid sequence encoding the second fusion protein has a nucleic acid sequence encoding the second target binding molecule, the C-terminal domain of the caged intein, in the direction from 3' to the start codon AUG to 5' to the stop codon.
  • a nucleic acid sequence encoding and a nucleic acid sequence encoding the C-terminal domain of the drug resistance protein are included in this order.
  • the nucleic acid sequence encoding each domain can be determined from the structure of the previously designed second fusion protein.
  • Both the first and second mRNAs described above may be those in which the sugar residue (ribose) of each nucleotide is modified for the purpose of reducing cytotoxicity.
  • Modified sites in the sugar residue include, for example, those in which the 2'-, 3'- and/or 4'-position hydroxy groups or hydrogen atoms of the sugar residue are replaced with other atoms.
  • Types of modifications include, for example, fluorination, alkoxylation (e.g., methoxylation, ethoxylation), O-allylation, S-alkylation (e.g., S-methylation, S-ethylation), S-allylation. , amination (eg —NH 2 ).
  • Such modification of sugar residues can be performed by a method known per se (for example, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
  • the sugar residues of the first and second mRNAs can be BNA: Bridged nucleic acid (LNA: Linked nucleic acid) that forms a crosslinked structure at the 2' and 4' positions. Modification of such sugar residues can also be performed by a method known per se (e.g., Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003), Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)).
  • LNA Bridged nucleic acid
  • Modification of such sugar residues can also be performed by a method known per se (e.g., Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003), Rahman S.M.A., Seki S
  • first and second mRNAs may be modified (eg, chemically substituted) nucleic acid bases (eg, purines, pyrimidines).
  • modifications include, for example, pyrimidine modifications at position 5, purine modifications at positions 6 and/or 8, modifications with exocyclic amines, substitutions with 4-thiouridine, substitutions with 5-bromo or 5-iodo-uracil. mentioned.
  • modified bases such as pseudouridine ( ⁇ ), N1-methylpseudouridine (N1m ⁇ ), and 5-methylcytidine (5mC) are included in place of normal uridine and cytidine. You can stay.
  • the positions of the modified bases can be all or part of them independently, and when they are part, they can be random positions at any ratio.
  • Phosphate groups (eg, terminal phosphate residues) contained in the first and second mRNAs of the present invention may be modified in order to enhance resistance to nucleases and hydrolysis.
  • the P(O)O group serving as a phosphate group is P(O)S (thioate), P(S)S (dithioate), P(O)NR 2 (amidate), P(O)R, R( O) optionally substituted with OR', CO or CH2 (formacetal) or 3'-amine (-NH- CH2 - CH2- ), wherein each R or R' is independently H or substituted or unsubstituted alkyl (eg, methyl, ethyl)].
  • the linking group is exemplified by -O-, -N- or -S-, and can be linked to adjacent nucleotides through these linking groups.
  • the first mRNA and the second mRNA can be synthesized by a person skilled in the art by any method known in genetic engineering, once the molecular structure and nucleic acid sequence are determined according to the above. For example, it can be obtained as a synthetic mRNA molecule by an in vitro transcription method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
  • RNA molecules can be introduced directly into cells.
  • the advantage of introducing synthetic RNA molecules is that the introduced mRNA is degraded with a half-life of about several days, so there is no integration into the genome, and the cells after introduction can be easily used for medical applications. be done.
  • synthetic mRNA has a high transfection efficiency, so it is advantageous in that a predetermined amount of the first and second fusion proteins can be expressed in cells.
  • the first mRNA and the second mRNA are preferably co-introduced into cells. This is because the activity ratio of the proteins expressed from the two or more co-introduced mRNAs is constant in the cell, so that the first fusion protein and the second fusion protein can be introduced at a constant ratio. .
  • DNA constructs such as RNA expression vectors can also be used to introduce the first mRNA and the second mRNA into cells.
  • expression vectors encoding the first mRNA and the second mRNA can be designed separately, and the two expression vectors can be directly introduced into cells by the same introduction method as described above.
  • Expression vectors encoding the sequences of the first mRNA and the second mRNA can be well-known and commonly used in the art. For example, a virus vector, an artificial chromosome vector, a plasmid vector, an expression system using a transposon (sometimes called a transposon vector) and the like.
  • viral vectors examples include retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, Sendai viral vectors and the like.
  • artificial chromosome vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC) and the like.
  • a plasmid vector mammalian plasmids in general can be used, and for example, an episomal vector can be used.
  • transposon vectors include expression vectors using piggyBac transposons. It is also possible to design DNA constructs that allow both the first mRNA and the second mRNA to be expressed as separate mRNAs from a single RNA expression vector.
  • the first mRNA and the second mRNA produced by being transcribed from the expression vector and transcribed in the cell are directly transferred to the cell. It can function like the introduced synthetic mRNA molecule to express the first fusion protein and the second fusion protein.
  • a method of introducing a DNA construct into a cell is advantageous, for example, when preparing cells stably expressing the first fusion protein and the second fusion protein by integrating into the genome of the cell, and pluripotent stem cells. or transgenic animals in advance, and after inducing differentiation or collecting somatic cells, the cells of interest are isolated from them and used for basic research.
  • the amount of the first mRNA and the second mRNA introduced into the cell varies depending on the type of target cell and the structure of the mRNA, and is not limited to a specific amount. For example, a preliminary experiment or the like can be used to determine the introduction amount at which the survival of target cells and the death of non-target cells are below a predetermined threshold value by culturing in the presence of the drug described below.
  • the first mRNA introduced into each cell constituting the cell and the second mRNA generate the first fusion protein and the second fusion protein in the cell (Fig. 1 (a) ).
  • a target molecule such as a target protein
  • the first target-binding molecule and the second target-binding molecule respectively bind to the first site and the second site of the target protein.
  • a complex is formed in which the caged intein N-terminal domain of the first fusion protein and the caged intein C-terminal domain of the second fusion protein are bound (FIG. 1(b)).
  • a complex composed of the target protein, the first target-binding molecule, the second target-binding molecule, and the bound caged intein is detached from the complex in FIG. 1(b) to reconstitute the drug-resistant protein.
  • the reconstituted drug resistance protein can selectively confer drug resistance to the cell.
  • the first mRNA, the first fusion protein expressed from the second mRNA, and the second fusion protein exist as separate proteins in the cell without binding, i.e., the drug resistance protein is reconstituted. Therefore, drug resistance is not conferred in the cells.
  • cultivation process is a process of culture
  • a drug corresponding to the drug resistance gene encoded by the first mRNA and the second mRNA is used.
  • Culture conditions vary depending on cells or cell populations that may contain target cells, and can be cultured using an appropriate medium at an appropriate temperature and atmosphere for about 1 to 14 days, preferably about 1 to 5 days.
  • media for culturing animal cells include minimum essential medium (MEM) containing about 5 to about 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) [ Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. can be used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6 to about 8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30°C to about 40°C. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • cells reconstituted with drug-resistant proteins are maintained alive even after being cultured in the presence of drugs.
  • cells in which the drug-resistant protein is not reconstituted die by culturing in the presence of the drug. Since dead cells cannot adhere to a culture dish or the like, they can be removed by medium exchange, cell passage, or the like. Alternatively, in the case of floating cells, live cells and dead cells can be separated by centrifugation or the like. By these means, viable cells can be sorted.
  • FIG. 2 is a diagram conceptually showing an introduction step, a culture step, and a population of viable cells sorted through these steps.
  • the method for selecting living cells according to the present invention can also be regarded as a method for producing a selected living cell population, especially when the first mRNA and the second mRNA are introduced into the cell population.
  • a method of producing a sorted living cell population can comprise steps similar to a sorting method.
  • a specific living cell population in which a specific target molecule is present can be produced.
  • the live cell selection system can also be provided as a selection kit containing the first mRNA and the second mRNA, or DNAs encoding them.
  • the selection kit contains the agent used in step (b), a medium suitable for culturing cells or cell populations containing the target cells, and/or the first mRNA and the second mRNA, or DNAs encoding them. Instructions for handling may be included.
  • the instructions may include information such as experimental methods for determining the appropriate amount of mRNA to be introduced in a particular cell, and the appropriate amount to be introduced depending on the cell type. According to the kit provided with the viable cell sorting system according to this embodiment, it becomes possible to selectively sort viable cells.
  • the selection method according to the present invention is used to confirm that the desired cell line has been established. It can be carried out repeatedly.
  • Fig. 3 is a conceptual diagram schematically showing cells into which the three types of genes have been integrated and the confirmation method thereof.
  • the purpose is to integrate a gene that expresses enzyme A, a gene that expresses enzyme B, and a gene that expresses enzyme C into cells.
  • a selection system A with enzyme A as the target molecule In order to select cell lines into which these three types of genes have been integrated, a selection system A with enzyme A as the target molecule, a selection system B with enzyme B as the target molecule, and a selection system C with enzyme C as the target molecule. to build.
  • selection system A a first target binding molecule and a second target binding molecule that bind to the first portion and the second portion of enzyme A are designed for the design of the first mRNA and the second mRNA.
  • a first target-binding molecule and a second target-binding molecule that bind to the first portion and the second portion of enzyme C for the design of the first mRNA and the second mRNA to construct a set C of first and second mRNAs that, in the presence of enzyme C, produce drug resistance proteins.
  • the caged intein and the drug resistance protein can have the same structure.
  • the first and second mRNA sets A are introduced into a cell population that has undergone an operation to integrate the three types of genes, and cells into which the enzyme A gene has been integrated are selected (step 1).
  • the first and second set B of mRNAs are introduced into the cell population surviving in step 1 to create a cell population into which the enzymes A and B genes have been integrated.
  • Sort step 2
  • the first and second set C of mRNAs are introduced into the cell population surviving in step 2
  • the cells in which the enzymes A, B, and C genes are integrated Screen the population (step 3).
  • the order in which the sets A, B, and C are introduced is not limited, and theoretically the same result can be obtained by introducing any set.
  • the (I) mRNA and the (II) mRNA may be a single mRNA.
  • This single mRNA may be such that one mRNA molecule is capable of expressing the first and second fusion proteins as separate and distinct molecules. More specifically, a single mRNA comprises, in 5' to 3' orientation, a nucleic acid sequence encoding said second fusion protein, a self-cleavage sequence encoding a self-cleavage peptide, and said first fusion. and a nucleic acid sequence that encodes the protein.
  • the 5'UTR and 3'UTR can be designed in the same way as the first or second mRNA above. and the open reading frame is, in the 5′ to 3′ direction, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, a self-cleavage sequence encoding the self-cleavage peptide, and a nucleic acid encoding the first fusion protein.
  • Arrays can be designed to contain, in that order.
  • the self-cleaving peptide may be a viral 2A peptide or a 2A-like peptide with similar functions. Examples include, but are not limited to, F2A, E2A, T2A, P2A, and the like. Modifications of sugar residues in the design of mRNA molecules may be modified as described in the first embodiment.
  • the method for selecting living cells according to the second embodiment includes the step of introducing into cells a single mRNA expressing the first and second fusion proteins, and and culturing in the presence of a drug corresponding to said drug resistance protein. And each process can be implemented similarly to 1st Embodiment. Further applications can be implemented in the same manner as the first embodiment.
  • the system and method for sorting living cells according to the second embodiment eliminates the need to separately prepare and introduce the first and second mRNAs, and yields cells that express only either the first or second fusion protein. It has the advantage of eliminating possibilities.
  • the pDNA sequences are SEQ ID NO: 3 (pUTR2-PuroR(1-84)-eNpuNcage-Nb113), SEQ ID NO: 4 (pUTR2-CA1698-NpuCcage-PuroR(85-199)), SEQ ID NO: 5 (pUTR2-PuroR(1 -84)-eNpuNcage-Lag16), SEQ ID NO: 6 (pUTR2-GFPenhancerNb-NpuCcage-PuroR(85-199)), SEQ ID NO: 13 (pUTR2-PuroR(1-32)-eNpuNcage-Nb113), SEQ ID NO: 14 (pUTR2 -CA1698-NpuCcage-PuroR(33-199)), SEQ ID NO: 15 (pUTR2-PuroR(1-119)-eNpuNcage-Nb113), SEQ ID NO: 16 (pUTR2-CA1698-NpuCcage-PuroR(120
  • Template DNA was prepared by PCR using PrimeSTAR Max DNA Polymerase and purified with Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (New England Biolabs).
  • the sequences of the template DNA of the first mRNA and the second mRNA are SEQ ID NO: 7 (PuroR(1-84)-eNpuNcage-Nb113 template DNA for in vitro transcription), SEQ ID NO: 8 (CA1698-NpuCcage-PuroR(85- 199) template DNA for in vitro transcription), SEQ ID NO:9 (PuroR(1-84)-eNpuNcage-Lag16 template DNA for in vitro transcription), SEQ ID NO:10 (GFPenhancerNb-NpuCcage-PuroR(85-199) template DNA for in vitro transcription) vitro transcription), SEQ ID NO: 17 (PuroR(1-32)-eNpuNcage-Nb113 template DNA for in vitro transcription), SEQ ID NO: 18 (PuroR
  • RNACleanXP Nippon Genetics
  • Quick CIP Quick CIP
  • RNeasy Mini Kit Qiagen
  • the medium was replaced with a medium containing 0.5 ⁇ g/ml puromycin (invivogen), and the culture was continued in a CO 2 incubator at 37°C.
  • Two or three days after transfection dilute the Cell Counting Kit-8 (Dojindo) with 10 times the volume of medium, replace the medium in each well with 110 ⁇ l of this Cell Counting Kit-8-containing medium, and incubate for about 1 hour.
  • absorbance at 450 nm and 630 nm was measured using an 800 TS absorbance dedicated plate reader (BioTek), and the difference between the former and the latter was calculated. Cell viability was evaluated with a value of 100%.
  • Example 1 Selection of cells expressing E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR) protein. Caged eNpu N-intein and eDHFR-binding nanobody Nb113 were added to the C-terminal side of the N-terminal fragment, and Nb113, a nanobody that binds to eDHFR, was added to the N-terminal side of the C-terminal fragment. constructed a fusion of CA1698, a nanobody that also binds to eDHFR, and a caged Npu C-intein. After introducing mRNA expressing these split puromycin resistance genes into HeLa cells, the cells were treated with puromycin.
  • eDHFR E. coli dihydrofolate reductase
  • Example 2 Selection of Cells Expressing Green Fluorescent Protein (EGFP)
  • EGFP Green Fluorescent Protein
  • the sorting method presented in this study requires the simultaneous processing of a large number of cells, as opposed to identifying the cells with antibodies and analyzing them one by one with a flow cytometer to isolate the cells, thus avoiding contamination. No need for expensive equipment that poses a risk of infection. Therefore, the cell sorting method according to the present invention is suitable for scale-up.
  • the selection method according to the present invention can provide a versatile technique for preparing cells for transplantation and regenerative medicine in the future.

Abstract

フローサイトメーター等の細胞選別機器を用いることなく実施することができ、細胞内に存在する分子を標的として、所望の細胞を生きたまま残すことが可能な細胞選別システムを提供する。　以下の（I）及び（II）：　（I）標的分子の第１の部分を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、　（II）標的分子の第２の部分を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、 またはこれらをコードするDNAを含む、生細胞の選別システム及びこれを用いた方法。

Description

生細胞の選別システム
　本発明は、標的分子が存在する生細胞を選別する方法及びシステムに関する。
　多細胞生物の組織や器官は、多種類の細胞で構成されている。ヒトを構成する細胞の種類は、成熟細胞だけでも約４００種にも及ぶ。異なる性質を持った細胞種の集団の中から、目的とする所望の細胞を選別する技術は、再生医療にとって非常に重要である。
　細胞選別技術として、フローサイトメーターを用いた方法が知られている。フローサイトメーターを用いる細胞選別方法では、表面抗原を蛍光標識し、１細胞ずつセルソーターで分取する。そのため、各細胞が発現する多様なタンパク質のうち、細胞表面に出ているものしか選別基準として利用できない。また、大量の細胞の選別には不向きであった。これに加えて、フローサイトメーターは高額である点でも不利益であった。
　フローサイトメーターを用いる方法に代わる細胞選別技術として、細胞内在性のmiRNAに応答して翻訳が制御されるmiRNAスイッチ技術が知られている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１では、miRNA標的配列を有するmRNAを用いて、miRNA特異的に細胞死滅タンパク質の発現を制御することを開示している。また、細胞内在性のmiRNAに応答してピューロマイシンを発現するmRNAであるmiRNAスイッチが市販されている。miRNAスイッチを異なる複数種の細胞が混合した細胞集団に導入すると、特定のmiRNAの活性が高い細胞種では、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするmRNAが分解される。そのため、当該細胞集団をピューロマイシン処理することによりその細胞種は除去される。
国際公開WO2015/105172
　miRNAスイッチ技術を用いた細胞選別技術は、特定の細胞種の選択的除去には適している。しかし、特定の細胞種を選択的に生存させるのには不向きである。これは、目的とする細胞以外のあらゆる細胞種で高活性なmiRNAというのは考えづらいためである。また、miRNAスイッチ技術において、特定の細胞種を選択的に残すには、ピューロマイシン耐性遺伝子のリーク発現を防げるほど十分に高活性なmiRNAを探す必要がある。しかし、miRNAは転写量が多くても活性は低いものも多く、miRNA活性についての情報はまだ乏しい。
　特定の細胞種を選択的に残すことができ、細胞種に固有の情報に基づき、幅広い細胞種を生きた状態で選別可能な細胞選別方法が求められる。
　本発明者らは鋭意検討の結果、細胞内に存在する分子に応答して、薬剤耐性タンパク質の再構成を制御するシステムにより、高い精度で生細胞の選別が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下を含む。
［１］　以下の（I）及び（II）：
　（I）標的分子の第１の部分を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（II）標的分子の第２の部分を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
　またはこれらをコードするDNAを含む、生細胞の選別システム。
　［２］　前記（I）のmRNAが、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、前記（II）のmRNAが、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである、［１］に記載のシステム。
　［３］
　前記（I）のmRNAと、前記（II）のmRNAが、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む単一のmRNAである、［１］に記載のシステム。
　［４］　前記薬剤耐性タンパク質が、ピューロマイシン耐性タンパク質、ブラストサイジン耐性タンパク質、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性タンパク質、ハイグロマイシン耐性タンパク質、及びゼオシン耐性タンパク質から選択される、［１］～［３］のいずれか１項に記載のシステム。
　［５］　前記ケージドインテインのN末端ドメインが、ケージドeNpu N-インテインもしくはその変異体であり、前記ケージドインテインのC末端ドメインが、ケージドNpu C-インテインもしくはその変異体である、［１］～［４］のいずれか１項に記載のシステム。
　［６］　前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤をさらに含む、［１］～［５］のいずれか１項に記載のシステム。
　［７］　標的分子を指標として生細胞を選別する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）［１］～［５］のいずれか１項に記載のシステムを細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた細胞を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程
を含む方法。
　［８］　標的分子を指標として選別された生細胞集団を製造する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）［１］～［５］のいずれか１項に記載のシステムを細胞集団に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた細胞集団を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程
を含む方法。
　本発明によれば、細胞内に存在する分子を標的として薬剤耐性タンパク質を再構成することで、任意の目的の細胞種を大量に選別し、当該細胞種を生きたまま残すことが可能になる。これによって、ヒトを中心とする哺乳動物への移植のために必要な大量な細胞の調製を、短時間で、かつ低価格で安全に行うことが可能になる。本発明に係る細胞選別システムは、表面抗原しか選別の基準として使えない、セルソーターなどの選別機器を用いた既存の生細胞選別手法と異なり、細胞内の多様な標的分子に基づいた選別が可能である。また、特に選別の基準がタンパク質である場合は、miRNA活性を基準とする手法よりも利用できる情報が多く、結果として、精確な細胞選別が可能となる。また、標的分子に結合する標的結合分子を交換することで、理論上はどのような細胞内タンパク質にも対応可能である。
図１は、標的分子の一例である標的タンパク質、及び本発明に係る生細胞選別方法により細胞内で発現される融合タンパク質の細胞内における挙動を模式的に示す概念図であって、（ａ）は、導入工程後の細胞内における第１の融合タンパク質（左）、第２の融合タンパク質（中）、及び標的タンパク質（右）を模式的に表し、（ｂ）は、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質の両者が標的タンパク質に結合した状態を表し、（ｃ）は再構成された薬剤耐性タンパク質（右）と、ケージドインテインの作用により脱離したケージドインテイン、標的結合分子、及び標的タンパク質に由来する複合体（左）を表す。 図２は、本発明に係る生細胞選別方法を模式的に示す概念図であって、導入されるmRNAと標的タンパク質、非標的細胞と標的細胞、並びに生きて選別された標的細胞を表す。 図３は、本発明に係る生細胞の選別方法の応用形態について説明する図であって、３種の異なる遺伝子を組み込んだ細胞と、組み込まれた遺伝子の確認方法を模式的に示す概念図である。 図４は、本発明に係る生細胞の選別方法の実施例１の結果を示すグラフであって、標的タンパク質としてeDHFRを発現させた細胞の選別方法の結果を示す。 図５は、本発明に係る生細胞の選別方法の実施例２の結果を示すグラフであって、標的タンパク質としてEGFPを発現させた細胞の選別方法の結果を示す。
　以下に、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
　本発明は、標的分子を指標として生細胞を選別するシステム及び方法に関する。本発明に係る生細胞の選別システムは、以下の（I）及び（II）：
　（I）標的分子の第１の部分を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（II）標的分子の第２の部分を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
　またはこれらをコードするDNA
を含む。
　また、本発明に係る生細胞の選別方法は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）： 
（ａ）（I）のmRNA及び（II）のmRNA、またはこれらをコードするDNAを細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた細胞を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程
を含む。
　本発明においては、第１の融合タンパク質を発現するmRNA（上記（I）のmRNA）と、第２の融合タンパク質を発現するmRNA（上記（II）のmRNA）が、別個のｍRNA 分子である場合を含む。また、１分子のmRNAが、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を、別個の分子として発現する場合も含む。（I）のmRNAと（II）のmRNAが別個のRNA分子である場合を第１実施形態、（I）のmRNAと（II）のmRNAが同一のRNA分子である場合を第２実施形態として、以下に説明する。
　［第１実施形態］
　本発明の第１実施形態においては、本発明に係るシステム及び方法は、（I）のmRNAが、標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、（II）のmRNAが、標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである。すなわち、第１実施形態においては、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むmRNAと、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むmRNAとを別個の分子として含む。
　以下、第１実施形態による、生細胞の選別システム及び方法を説明する。
　本明細書において、生細胞を選別するとは、目的とする一種または二種以上の細胞以外の細胞を死滅させ、目的とする一種または二種以上の細胞を生存した状態に保持することをいう。ある実施形態においては、生細胞を選別するとは、二種以上の細胞が含まれうる生きた異種細胞集団から、目的とする一種または二種以上の細胞を生きたまま分離することをいう。別のある実施形態においては、生細胞を選別するとは、ある１つの細胞が目的とする細胞である場合に、当該細胞を生存した状態に保持することをいう。当該方法は、特にはフローサイトメーターなどの高度な選別機器を用いることなく実施する。本明細書において、目的とする細胞種を標的細胞とも指称する。また、それ以外の細胞種を総称して非標的細胞とも指称する。
　本明細書においては、標的分子が存在する細胞においてのみ薬剤耐性タンパク質を再構成し、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、標的分子が存在する細胞を選別することを可能にする。
　標的分子とは、本発明に係る方法の実施の時点において標的細胞内に存在する分子をいうものとし、ある実施態様においては、標的細胞の細胞質内もしくは核内に存在する分子をいうことができる。標的分子は、他の分子により特異的に認識可能な、第１の結合部位と、第２の結合部位を持つものであれば特には限定されない。ただし、標的分子上の第１の結合部位と、第２の結合部位は、別個の部位であることが好ましい。標的分子はまた、細胞に対する毒性がないものが好ましい。標的分子の具体例としては、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物、またはこれらの断片などが例示される。選別対象となる細胞に応じて、適宜標的分子を選択することができる。また、細胞内における、天然もしくは人工的な反応の結果として生じる代謝産物を標的分子とすることもでき、この場合の代謝産物は、低分子化合物等であってもよい。
　以下、本発明においては、主として標的分子がタンパク質またはその断片である場合について説明する。タンパク質またはその断片からなる標的分子を以下、標的タンパク質ともいう。本発明に係る方法においては、標的タンパク質が存在する細胞において特異的に薬剤耐性タンパク質を再構成することを目的として、標的タンパク質を選択、決定し、標的タンパク質に基づいて、（ａ）及び（ｂ）のmRNAを設計することができる。標的タンパク質は、例えば、標的細胞と非標的細胞の間で発現量や存在量に大きな差があるタンパク質を選択することが好ましい。標的タンパク質以外の標的分子についても、標的細胞と非標的細胞の間で存在する量に大きな差がある分子を選択することが好ましい。
　標的タンパク質の例としては、特定の細胞に内在するタンパク質が挙げられる。特定の細胞に内在するタンパク質としては、当該細胞の分化の段階に応じて発現されるタンパク質、当該細胞の疾患の状態に応じて発現されるタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。これらの標的タンパク質の存在に応じて薬剤耐性タンパク質を再構成することで、各標的タンパク質により特徴づけられる分化段階にある細胞、あるいは疾患状態にある細胞に対して、選択的に薬剤耐性を付与することができる。標的タンパク質の別の例としては、細胞に外部から導入された物質に起因して生成されるタンパク質が挙げられる。外部から導入された物質に起因して生成されるタンパク質としては、ゲノム編集により修復された遺伝子に起因して当該細胞において生成し得るタンパク質、mRNAワクチン接種やmRNA医薬によって当該細胞において生成され得るタンパク質、プラスミドDNAやウイルスベクターなどによって当該細胞において生成され得るタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。また、標的タンパク質以外の標的分子は、特定の疾患の状態において細胞内で産生される分子や、細胞中で人工的に産生した分子が挙げられ、その種類は限定されない。これらの標的分子、特には標的タンパク質の存在を指標として、薬剤耐性タンパク質を再構成することで、標的分子が存在する細胞において、選択的に薬剤耐性を付与することができる。
　（ａ）導入工程
　生細胞を選別する方法の工程（ａ）は、第１のmRNA、及び第２のmRNAを細胞に導入する工程である。
　本明細書において、「細胞」とは、特に限定されるものではなく任意の細胞であってよい。細胞は、単一の細胞であってもよく、２以上の細胞の集まりである「細胞集団」であってもよい。「細胞集団」には理論上の数の上限はないが、例えば、１×１０４～１×１０６個程度の細胞からなる集団をいうものとする。
　「細胞」は、単細胞生物種もしくは多細胞生物種から採取した細胞であってもよく、さらに人為的な操作を加えた細胞（細胞株を含む）であってもよい。例えば、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられるが、中でも動物細胞が好ましい。動物細胞としては、例えば、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト等）に由来する細胞が挙げられる。哺乳動物に由来する細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（例：HEK293細胞）、ヒト肝癌由来細胞（例：HepG2）、ヒトFL細胞などの細胞株であってもよく、ヒト及び他の哺乳動物の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
　細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、（A）幹細胞、（B）前駆細胞、（C）最終分化した体細胞、（D）そのほかの細胞のいずれであってもよい。（A）幹細胞の例としては、以下のものに限定されないが、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞などが挙げられる。（B）前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。（C）体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、中枢・抹消神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。（D）そのほかの細胞としては、例えば、分化誘導を経た細胞が挙げられ、多能性幹細胞から分化誘導した前駆細胞及び体細胞も含まれる。また、体細胞または前駆細胞から未分化な状態を経ることなく直接所望の細胞に分化した、いわゆる「ダイレクトコンバージョン（direct reprogramming、trans-differentiationともいう）」により誘導された細胞であってもよい。
　「生細胞」とは、生きた状態にある細胞であって、代謝の有無や細胞膜透過性の違いによって死細胞と区別することができる。
　本工程において、細胞に導入する第１及び第２のmRNAは、それぞれ、第１及び第２の融合タンパク質を発現するmRNAである。第１及び第２の融合タンパク質は、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメイン、C末端ドメインを含有し、導入された細胞内に標的分子が存在する場合に会合して、当該細胞内で、薬剤耐性タンパク質を生成する。
　図１を参照して、本発明に係る各工程について説明する。図１（ａ）は、導入工程（ａ）後の細胞内における第１の融合タンパク質（左）、第２の融合タンパク質（中）、及び標的分子の一例である標的タンパク質（右）を模式的に表す。第１の融合タンパク質は、第１のmRNAが細胞内で翻訳されて生成する物質であり、N末端から、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメイン、ケージドインテインのN末端ドメイン、及び第１の標的結合分子がこの順に結合されている。第２の融合タンパク質は、第２のmRNAが細胞内で翻訳されて生成する物質であり、N末端から、第２の標的結合分子、ケージドインテインのC末端ドメイン、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインがこの順に結合されている。
　細胞内に標的タンパク質などの標的分子が存在する場合、第１の融合タンパク質の第１の標的結合分子が標的タンパク質の第１の部分に結合し、第２の融合タンパク質の第２の標的結合分子が標的タンパク質の第２の部分に結合する。図１（ｂ）は、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質の両者が標的タンパク質に結合した状態を示す。これにより、ケージドインテインのN末端ドメインと、ケージドインテインのC末端ドメインが結合する。次いで、ケージドインテインの作用により、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとC末端ドメインが結合し、薬剤耐性タンパク質を再構成する。図１（ｃ）は再構成された薬剤耐性タンパク質（右）と、ケージドインテインの作用により脱離したケージドインテイン、標的結合分子、及び標的タンパク質に由来する複合体（左）を示す。
　これらの融合タンパク質の設計について説明する。薬剤耐性タンパク質は、任意の薬剤耐性タンパク質であってよく、例えば、ピューロマイシン耐性タンパク質（ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ）、ブラストサイジン耐性タンパク質（ブラストサイジンＳデアミナーゼ）、ネオマイシン（ジェネティシン／Ｇ４１８）耐性タンパク質（アミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ）、ハイグロマイシン耐性タンパク質（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ）、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性タンパク質（Ｓｈ　ｂｌｅ）が挙げられるが、これらには限定されない。薬剤耐性タンパク質は、市販のものを用いることができるが、薬剤耐性を損なわない限りにおいて、それらの変異体を用いることもできる。変異体としては、例えば、既知の、あるいは市販の薬剤耐性タンパク質のアミノ酸配列に対し、アミノ酸配列に保存的置換を行った変異体、アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は８５％以上（例：９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体が挙げられるが、これらには限定されない。アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。
　薬剤耐性タンパク質をN末端ドメインとC末端ドメインとに分割する箇所は、薬剤耐性タンパク質が再構成され、かつ再構成後に薬剤耐性タンパク質の本来の機能が維持される限りにおいて特には限定されない。例えば、薬剤耐性タンパク質の三次元構造を解析した場合に、αヘリックスやβシートを構成しないループ部分にてN末端ドメインとC末端ドメインとに分割することができる。例えば、薬剤耐性タンパク質がピューロマイシンである場合に、分割箇所は、３２残基目のアラニンと３３残基目のトレオニンの間、８４残基目のアラニンと８５残基目のグリシンの間、１１９残基目のリジンと１２０残基目のグルタミン酸の間であってよい。あるいは、これらの分割箇所からN末端側もしくはC末端側へ５アミノ酸残基以内であれば分割箇所を変更してもよいが、その場合はαヘリックスやβシートを構成しない部位を選択することが望ましい。８４残基目のアラニンと８５残基目のトレオニンの間とすることが特に好ましい。適切な分割箇所は、当業者による事前実験やシミュレーションにより確認することができる。
　ケージドインテインは、通常のインテインと異なり、他のドメインを介した相互作用がある場合にのみ再構成を引き起こすタンパク質であり、他のドメインを介した相互作用非依存的な再構成を妨げるためのケージ構造が融合されたインテインとして定義される。また、Nインテインに対するケージ構造としてはCインテイン類似配列を有するタンパク質またはペプチドが、Cインテインに対するケージ構造としてはNインテイン類似配列を有するタンパク質またはペプチドがそれぞれ利用可能である。本発明においては、他のドメインは第１及び第２の標的結合分子である。ケージドインテインは、任意のものを用いることができる。例えば、Gramespacher J. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 35, 13708-13712に開示された、ケージドインテインのN末端ドメインであるケージドeNpu N-インテイン（配列番号１）及びＣ末端ドメインであるケージドNpu C-インテイン（配列番号２）を用いることができるが、これらには限定されない。各配列を表１に示す。表中、ボールド体は、Nインテイン由来配列（配列番号１中）、Cインテイン由来配列（配列番号２中）下線部はリンカー配列、四角で囲んだ部分は、Cインテイン類似配列（配列番号１中）、Nインテイン類似配列（配列番号２中）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１中、本来のNインテイン由来の配列は、１残基目から１０２残基目までである。１２５残基目から１５４残基目までの３０残基からなる配列と、１６０残基目から１８９残基目までの３０残基からなる配列は、同一であり、Cインテイン類似配列である。１０３残基目から１２４残基目までの２２残基からなる配列は、Nインテイン由来配列とCインテイン類似配列のリンカー配列である。１５５残基目から１５９残基目までの５残基からなる配列は、Cインテイン類似配列間のリンカー配列である。配列番号１に示すケージドeNpu N-インテインは、Cインテイン類似配列を２リピート含む配列であるが、Cインテイン類似配列を１リピートにした配列、３リピート以上にした配列、並びにリンカー配列のアミノ酸の種類を変更した配列も、ケージドeNpu N-インテインと同様に用いることができる。同様に、配列番号２中、１残基目から５２残基目までの５２残基からなる配列は、Nインテイン類似配列であり、５３残基目から７４残基目までの２２残基からなる配列は、Nインテイン類似配列とCインテイン由来配列とのリンカー配列であり、７５残基目から１０９残基目までの３５残基からなる配列は、Cインテイン由来配列である。ケージドNpu C-インテイン中のNインテイン類似配列を２リピート、または３リピート以上にした配列、並びにリンカー配列のアミノ酸の種類を変更した配列も、ケージドNpu C-インテインと同様に用いることができる。
　ケージドインテインの活性を損なわない限り、ケージドeNpu N-インテインの変異体、及びケージドNpu C-インテインの変異体も用いることができる。変異体としては、例えば、配列番号１、２のアミノ酸配列に対し、アミノ酸配列に保存的置換を行った変異体、アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１、２で示されるアミノ酸配列と８５％以上（例：９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体が挙げられるが、これらには限定されない。
　第１及び第２の標的結合分子は、それぞれ、標的分子、例えば標的タンパク質の第１及び第２部位を特異的に認識する分子である。第１及び第２の標的結合分子は、標的タンパク質に適合するように選択し、あるいは設計することができる。標的結合分子は、標的分子に対する結合能を持つ分子であればよく、標的分子が抗原の場合には、抗体やペプチドアプタマー、フィブロネクチン由来の人工ペプチド、DARPinなどが挙げられる。標的分子が、タンパク質以外の分子である場合にも、標的分子に特異的に結合する分子を適宜決定することができる。例えば、低分子化合物に対しては、ラパマイシンを介したFKBP（FK506-binding protein）とFRB（FKBP-rapamycin binding protein）の結合などの相互作用を利用した標的結合分子が挙げられる。
　本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではなく、フルボディ抗体であっても、フラグメント抗体（例：ナノボディ抗体、Fab、F(ab')2等であっても、それらの改変体（例：scFv等）であってもよく、本明細書では、これらを包含するものとして、「抗体」との用語を用いる。本発明で用いるペプチドアプタマーは、アミノ酸残基又は両末端部分に修飾が加えられたペプチドであってもよい。ペプチドアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、酵母のTwo-hybrid法により選別することができる。その他の分子についても、自体公知の方法に基づき、適宜作製することができる。標的結合分子は、抗体とは別種のタンパク質を改変して抗体と同様の抗原結合能を持たせた人工分子であってもよく、モノボディ、アフィボディ、アンチカリンなどが挙げられるが、これらには限定されない。
　標的タンパク質の異なる箇所を特異的に認識する２以上の標的結合分子が、データベースや文献から既知の場合には、既知の標的結合分子の中から、第１及び第２の標的結合分子を選択することができる。標的タンパク質において、第１部位と、第２部位は異なる部分であり、かつ第１部位と、第２部位とが、それぞれへの標的結合分子の結合を互いに阻害しない限りにおいて近位であることが好ましい。標的タンパク質の第１部位と第１の標的結合分子の相互作用、標的タンパク質の第２部位と第２の標的結合分子の相互作用により、ケージドインテインの再構成を生じさせるためである。
　標的タンパク質を特異的に認識する標的結合分子が未知の場合や、標的結合分子が１つしか知られていない場合には、標的タンパク質またはその断片を抗原として、アルパカなどのラクダ科動物を免疫して抗体を作らせ、その抗原認識部位の配列を入手する。これにより、標的タンパク質の異なる部位を特異的に認識する２以上のナノボディなどの標的結合分子を設計することができる。
　このようにして、薬剤耐性タンパク質のＮ末端ドメイン、ケージドインテインのＮ末端ドメイン、第１の標的結合分子を選択し、第１の融合タンパク質を設計し、構造を決定することができる。同様に、第２の標的結合分子、ケージドインテインのＣ末端ドメイン、薬剤耐性タンパク質のＣ末端ドメインを選択し、第２の融合タンパク質を設計し、構造を決定することができる。第１及び第２の融合タンパク質において、各ドメイン間は、直接結合されていてもよく、２～３０アミノ酸程度のリンカーにより結合されていてもよい。
　第１及び第２の融合タンパク質の構造が決定されれば、これらを発現する第１及び第２のmRNAの構造を決定することができる。第１のmRNAは、5’末端から3’末端の向きに、［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］、［第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。
　第１のmRNAの5'UTRは、5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む。Cap構造は、７メチルグアノシン５’リン酸であってよい、CapアナログはCap構造と同様に翻訳開始因子であるeIF4Eによって認識される修飾構造であって、Ambion製のAnti-Reverse Cap Analog(ARCA)、New England Biolabs製の、m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog、TriLink製のCleanCapなどが挙げられるが、これらには限定されない。Capアナログは、翻訳開始因子により認識されるその他の修飾構造であってもよい。Cap構造もしくはCapアナログの3'側であって、開始コドンの5’側には、例えば０～３００塩基程度、好ましくは２０～２００塩基程度の任意核酸配列が含まれていてもよい。これらの任意核酸配列は、二次構造を形成せず、第２のmRNAと特異的に相互作用しない核酸配列であることが好ましい。また、5'UTR内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。
　第１のmRNAのコーディング領域であるオープンリーディングフレームは、開始コドン、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列、及び終始コドンを含む。第１の融合タンパク質をコードする核酸配列は、開始コドンAUGの3’側から、終止コドンの5’側の向きに、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインをコードする核酸配列、ケージドインテインのN末端ドメインをコードする核酸配列、及び第１の標的結合分子をコードする核酸配列をこの順に含む。各ドメインをコードする核酸配列は、先に設計した第１の融合タンパク質の構造から決定することができる。
　第１のmRNAの3'UTRは、PolyA tailを含む。PolyA tailは、約５０～２５０のアデニン塩基を結合した配列であってよい。しかし、約５０～２５０のアデニン塩基が連続して結合している必要はなく、mRNAの安定性を保持できる限り、アデニン塩基の間に他の核酸塩基が含まれていてもよい。
　第２のmRNAは、5’末端から3’末端の向きに、［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］、［第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］及び［PolyAを含む3'UTR］の構成は、第１のmRNAと同じとすることができる。5’UTR及び3'UTRの核酸塩基配列や核酸塩基数は、第１のmRNAと、第２のmRNAで同一であってもよく、異なっていてもよいが、同一とすることが好ましい。
　第２のmRNAのコーディング領域であるオープンリーディングフレームは、開始コドン、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列、及び終始コドンを含む。第２の融合タンパク質をコードする核酸配列は、開始コドンAUGの3’側から、終止コドンの5’側の向きに、第２の標的結合分子をコードする核酸配列、ケージドインテインのC末端ドメインをコードする核酸配列、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインをコードする核酸配列をこの順に含む。各ドメインをコードする核酸配列は、先に設計した第２の融合タンパク質の構造から決定することができる。
　以上に説明した第１、第２のmRNAは、いずれも細胞毒性を低減させるため等の目的で、各ヌクレオチドの糖残基（リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び／又は4’位のヒドロキシ基または水素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化（例、メトキシ化、エトキシ化）、O-アリル化、S-アルキル化（例、S-メチル化、S-エチル化）、S-アリル化、アミノ化（例、-NH2）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145参照)。
　また、第１、第２のmRNAの糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997);Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)など参照）。また、第１、第２のmRNAは、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、6及び／又は8位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンでの置換、5-ブロモ又は5-ヨード－ウラシルでの置換が挙げられる。また、細胞毒性を低減させること等を目的として、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン（Ψ）、N1-メチルシュードウリジン（N1mΨ）、5-メチルシチジン（5mC）等の修飾塩基を含んでいてもよい。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　ヌクレアーゼ及び加水分解に対する耐性等を高めるため、本発明の第１、第２のmRNAに含まれるリン酸基（例えば、末端のリン酸残基）が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるP(O)O基が、P(O)S（チオエート）、P(S)S（ジチオエート）、P(O)NR2（アミデート）、P(O)R、R(O)OR’、CO又はCH2（ホルムアセタール）又は3’-アミン（-NH-CH2-CH2-）で置換されていてもよい〔ここで各々のR又はR’は独立して、Hであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。連結基としては、-O-、-N-又は－Ｓ－が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
　第１のmRNA、及び第２のmRNAは、上記に従って、分子構造、核酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。例えば、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro転写法により、合成mRNA分子として得ることができる。
　　第１のmRNA、第２のmRNAの細胞への導入は、in vitroでRNAを細胞に導入する方法として一般に用いられる任意の方法を用いることができる。RNA分子を直接、細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、ポリマー法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などの導入法を用いて、RNA分子を直接、細胞に導入することができる。合成RNA分子の導入による利点は、導入されたmRNAは数日以内程度の半減期で分解されるため、ゲノムへの組み込みがなく、導入した後の細胞を医療応用などに使用しやすいことが挙げられる。また、合成mRNAは、トランスフェクション効率が高いため、細胞内で所定の量の第１及び第２の融合タンパク質を発現させることができる点で有利である。
　第１のmRNA、第２のmRNAは、細胞に共導入することが好ましい。共導入した２以上のmRNAから発現するタンパク質の活性比は、細胞内において一定となるため、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質を、一定の比率で導入することができるためである。
　細胞への第１のmRNA、及び第２のmRNAの導入は、RNA発現ベクター等のDNA構築物を用いることもできる。この場合、第１のmRNA、及び第２のmRNAをコードする発現ベクターを別個に設計し、上記と同様の導入法にて、２種の発現ベクターを直接、細胞に導入することができる。第１のmRNA、及び第２のmRNAの配列をコードする発現ベクターは、当該分野において周知慣用のものを用いることができ、例えば、ウイルスベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、トランスポゾンを用いた発現システム（トランスポゾンベクターと呼ばれる場合がある）等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、哺乳動物用プラスミド全般を使用することができ、例えば、エピソーマルベクターであってもよい。トランスポゾンベクターとしては、piggyBacトランスポゾンを用いた発現ベクター等が例示される。第１のmRNAと、第２のmRNAとの両方を、単一のRNA発現ベクターから、別個のmRNAとして発現させるDNA構築物を設計することも可能である。
　第１のmRNAと、第２のmRNAをコードするDNA構築物を細胞に導入することで、発現ベクターから転写され、細胞内で転写されて生成した第１のmRNAと、第２のmRNAを、直接導入した合成mRNA分子と同様に機能させ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質を発現させることができる。DNA構築物を細胞に導入する方法は、例えば、細胞のゲノムに組み込んで、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質を安定的に発現する細胞を調製する場合に有利であり、多能性幹細胞やトランスジェニック動物などに予め組込んでおき、分化誘導や体細胞の採取などをした後、それらから目的の細胞を分離して基礎研究に用いる場合などにおいて有利である。
　細胞への第１のmRNA、及び第２のmRNAの導入量は、標的細胞の種類や、mRNAの構造によっても異なり、特定の量に限定されるものではない。例えば、後述する薬剤存在下での培養により、標的細胞の生存並びに非標的細胞の死滅が所定の閾値以下になる導入量を、予備実験等により決定することができる。
　本工程により、細胞を構成する各細胞に導入された第１のmRNAと、第２のmRNAは、細胞内で第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質を生成する（図１（ａ））。そして、細胞内に標的タンパク質などの標的分子が存在する場合、第１の標的結合分子と、第２の標的結合分子がそれぞれ、標的タンパク質の第１部位と、第２部位に結合する。これにより、第１の融合タンパク質のケージドインテインＮ末端ドメインと、第２の融合タンパク質のケージドインテインＣ末端ドメインが結合した複合体を形成する（図１（ｂ））。次いで、図１（ｂ）の複合体から、標的タンパク質、第１の標的結合分子、第２の標的結合分子、結合されたケージドインテインからなる複合体が脱離して、薬剤耐性タンパク質が再構成される（（図１（ｃ））。再構成された薬剤耐性タンパク質は、当該細胞に選択的に薬剤耐性を付与することができる。一方、細胞内に標的タンパク質などの標的分子が存在しない場合、第１のmRNAと、第２のmRNAから発現する第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質は、結合することなく、別個のタンパク質として細胞内に存在する。すなわち、薬剤耐性タンパク質が再構成されることはないため、当該細胞においては、薬剤耐性は付与されない。
　（ｂ）培養工程
　導入工程に次いで、培養工程を実施することができる。培養工程は、第１のmRNA、及び第２のmRNAを導入した細胞を薬剤の存在下で培養する工程である。薬剤は、第１のmRNA、及び第２のmRNAがコードする薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を用いる。
　培養条件は、標的細胞を含みうる細胞または細胞集団によって異なり、適切な培地を用いて、適切な温度、雰囲気にて１～１４日程度、好ましくは１～５日程度培養することができる。動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5～約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などを用いることができる。培地のpHは、好ましくは約6～約8である。培養は、通常約30℃～約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　本工程により、薬剤耐性タンパク質が再構成された細胞は、薬剤存在下での培養を経ても生きたまま維持される。一方、薬剤耐性タンパク質が再構成されない細胞は、薬剤存在下での培養により死滅する。死細胞は、培養皿等に接着できないため、培地交換や細胞の継代などにより除去することができる。あるいは、浮遊細胞の場合、遠心分離などで生細胞と死細胞を分離することができる。これらの手段により、生細胞を選別することができる。
　本発明に係る生細胞の選別方法によれば、標的細胞を特異的に生存させ、非標的細胞を特異的に死滅させることができ、セルソーターなどの機器を使用することなく、大量の標的細胞を一度に、短時間で選別することが可能になる。図２は、導入工程、及び培養工程、並びにこれらを経て選別される生細胞の集団を概念的に示す図である。
　なお、本発明に係る生細胞の選別方法は、細胞集団に第１のmRNA及び第２のmRNAを導入する場合には特に、選別された生細胞集団の製造方法とも捉えることができる。選別された生細胞集団を製造する方法は、選別方法と同様の工程を備えることができる。生細胞集団の製造方法によれば、特定の標的分子が存在する、特定の生細胞集団を製造することができる。
　本発明に係る生細胞の選別システムは、第１のmRNA及び第２のmRNA、またはこれらをコードするDNAを含む選別キットとして提供することもできる。この場合、選別キットは、工程（ｂ）で用いる薬剤、標的細胞を含む細胞または細胞集団の培養に適した培地、及び／または第１のmRNA及び第２のmRNA、またはこれらをコードするDNAの取り扱いのための説明書を含んでいてもよい。説明書には、特定の細胞における好適なmRNAの導入量を決定するための実験方法や、細胞種による適切な導入量などの情報を含んでいてもよい。本実施形態による生細胞の選別システムを備えるキットによれば、細胞選択的に生細胞を選別することが可能になる。
　本発明に係る生細胞のシステム及び方法を利用した、さらなる応用形態について説明する。一例として、複数の遺伝子を組み込んだ細胞株の樹立において、目的の細胞株が樹立されたことの確認に、本発明に係る選別方法を、第１及び第２のmRNAのセットを用いて、複数回繰り返して実施することができる。
　図３は、３種の遺伝子を組み込んだ細胞と、その確認方法を模式的に示す概念図である。細胞には、酵素Ａを発現する遺伝子、酵素Ｂを発現する遺伝子、酵素Ｃを発現する遺伝子を組み込むことを目的とする。これらの３種の遺伝子が組み込まれた細胞株を選別するために、酵素Ａを標的分子とする選別システムＡ、酵素Ｂを標的分子とする選別システムＢ、酵素Ｃを標的分子とする選別システムＣを構築する。選別システムＡにおいて、第１のmRNA及び第２のmRNAの設計のために、酵素Ａの第１部分及び第２部分に結合する第１の標的結合分子及び第２の標的結合分子を設計する。また、ケージドインテイン及び薬剤耐性タンパク質を設計する。これにより、酵素Ａの存在下で薬剤耐性タンパク質を生成する第１のmRNA及び第２のmRNAのセットＡを構築することができる。次に、選別システムＢにおいて、第１のmRNA及び第２のmRNAの設計のために、酵素Ｂの第１部分及び第２部分に結合する第１の標的結合分子及び第２の標的結合分子を設計する。ケージドインテイン及び薬剤耐性タンパク質は、選別システムＡと同様に設計することができる。これにより、酵素Ｂの存在下で薬剤耐性タンパク質を生成する第１のmRNA及び第２のmRNAのセットＢを構築することができる。同様にして、選別システムＣにおいて、第１のmRNA及び第２のmRNAの設計のために、酵素Ｃの第１部分及び第２部分に結合する第１の標的結合分子及び第２の標的結合分子を設計し、酵素Ｃの存在下で薬剤耐性タンパク質を生成する第１のmRNA及び第２のmRNAのセットＣを構築することができる。本発明の方法においては、第１の標的結合分子と、第２の標的結合分子を標的分子に適合するように設計すれば、ケージドインテイン及び薬剤耐性タンパク質は同じ構造とすることができる。
　そして、例えば、第１及び第２のmRNAのセットＡを、３種の遺伝子を組み込む操作を行った細胞集団に導入して、酵素Ａ遺伝子が組み込まれた細胞を選別する（ステップ１）。次いで、セットＡのmRNAが分解されてなくなった後に、第１及び第２のmRNAのセットBを、ステップ１で生存した細胞集団に導入して、酵素A、B遺伝子が組み込まれた細胞集団を選別する（ステップ２）。さらに、セットBのmRNAが分解されてなくなった後に、第１及び第２のmRNAのセットCを、ステップ２で生存した細胞集団に導入して、酵素A、B、C遺伝子が組み込まれた細胞集団を選別する（ステップ３）。セットＡ、B、Cの導入順序は、限定されず、いずれのセットを導入しても理論的には同じ結果が得られると考えられる。
　近年、細胞に多数の遺伝子を導入することで複雑な反応経路を経て合成される化合物等を産生させる研究が進められている。従来、遺伝子の導入は、一般的に選別マーカーにより確認されてきた。しかし、選別マーカーの種類には限りがあるため、より複雑な生体分子の合成を目指して、遺伝子のコンポーネント数を増やしていくと、全てのコンポーネントが組込まれた細胞の選別が困難になるという問題があった。本発明の選別方法、システムを応用することにより、複数セットの第１及び第２のmRNAを設計することができる。特には、導入される遺伝子が発現する標的タンパク質に合わせて、標的結合分子部分のみを設計変更した複数セットの第１及び第２のmRNAを設計することができる。そのため、理論的には、数の制限なく、標的タンパク質の数に合わせた選別用のmRNAを設計可能である。また、mRNAで導入された分割薬剤耐性遺伝子は一過性で消えるため、第１及び第２のmRNAのセットを変更して、選別を繰り返し行うことができる。
　［第２実施形態］
　本発明の第２実施形態においては、本発明に係るシステムは、（I）のmRNAと、（II）のmRNAとが単一のmRNAであってよい。この単一のmRNAは、１つのmRNA分子が、第１及び第２の融合タンパク質を、分離した別個の分子として発現可能なものであってよい。より具体的には、単一のmRNAは、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
　単一のmRNAにおいても、5'UTR、3'UTRを、先の第１または第２のmRNAと同様に設計することができる。そして、オープンリーディングフレームが、5’末端から3’末端の向きに、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とをこの順に含むように設計することができる。自己切断ペプチドとしては、ウイルスの２Ａペプチド、またはこれと同様の機能を備える２Ａ様ペプチドであってよい。例えば、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ等が挙げられるが、これらには限定されない。mRNA分子の設計における糖残基の修飾態様などは、第１実施形態において説明した変形態様を備えていてよい。
　第２実施形態による生細胞の選別方法も、第１実施形態と同様に、第１及び第２の融合タンパク質を発現する単一のmRNAを細胞に導入する工程と、mRNAが導入された細胞を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程とを含んでよい。そして、各工程は、第１実施形態と同様に実施することができる。さらなる応用形態についても、第１実施形態と同様に実施することができる。
　第２実施形態による生細胞の選別システム及び方法は、第１及び第２のmRNAを別個に調製し、導入する必要がなく、第１または第２いずれか一方の融合タンパク質しか発現しない細胞が出る可能性を排除できるといった利点がある。
　以下に、本発明の実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
　［実験方法］
〈pDNAの構築〉
　PCRによるインサートの作製はPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて行い、Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（New England Biolabs）にて精製した。また、クローニングはIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて行った。pDNAは大腸菌DH5α株またはHST08株にて増幅し、Monarch plasmid miniprep kit （New England Biolabs）を用いて精製した。DNAの濃度測定にはNanodrop ONE（Thermo Fisher Scientific）を用いた。構築したプラスミドの配列はサンガーDNAシーケンシングサービス（Genewiz）にて確認した。pDNAの配列は、配列番号３（pUTR2-PuroR(1-84)-eNpuNcage-Nb113）、配列番号４（pUTR2-CA1698-NpuCcage-PuroR(85-199)）、配列番号５（pUTR2-PuroR(1-84)-eNpuNcage-Lag16）、配列番号６（pUTR2-GFPenhancerNb-NpuCcage-PuroR(85-199)）、配列番号１３（pUTR2-PuroR(1-32)-eNpuNcage-Nb113）、配列番号１４（pUTR2-CA1698-NpuCcage-PuroR(33-199)）、配列番号１５（pUTR2-PuroR(1-119)-eNpuNcage-Nb113）、配列番号１６（pUTR2-CA1698-NpuCcage-PuroR(120-199)）に示す。
　〈mRNAのin vitro転写〉
　テンプレートDNAはPrimeSTAR Max DNA Polymeraseを用いたPCRにて作製し、Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（New England Biolabs）にて精製した。第１のmRNA、第２のmRNAのテンプレートDNAの配列は、配列番号７（PuroR(1-84)-eNpuNcage-Nb113 template DNA for in vitro transcription）、配列番号８（CA1698-NpuCcage-PuroR(85-199) template DNA for in vitro transcription）、配列番号９（PuroR(1-84)-eNpuNcage-Lag16 template DNA for in vitro transcription）、配列番号１０（GFPenhancerNb-NpuCcage-PuroR(85-199) template DNA for in vitro transcription）、配列番号１７（PuroR(1-32)-eNpuNcage-Nb113 template DNA for in vitro transcription）、配列番号１８（PuroR(1-119)-eNpuNcage-Nb113 template DNA for in vitro transcription）、配列番号１９（CA1698-NpuCcage-PuroR(33-199) template DNA for in vitro transcription）、配列番号２０（CA1698-NpuCcage-PuroR(120-199) template DNA for in vitro transcription）に示す。また、eDHFR及びEGFPを発現するmRNAのテンプレートDNAの配列は、配列番号１１（eDHFR-DYKtag template DNA for in vitro transcription）、配列番号１２（EGFP template DNA for in vitro transcription）に示す。
　このテンプレートDNAを鋳型として、MEGAscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて37℃の転写反応を約6時間行った。またこの際、6 mMのATP、CTP、GTP、N1-メチルシュードUTPならびに4.8 mMのCleanCap Reagnt AG (3’OMe)（TriLink）をNTPならびにCapアナログとして用いた。反応終了後、RNACleanXP（日本ジェネティクス）にて精製し、Quick CIP（New England Biolabs）にて37℃脱リン酸化反応を30分間行ってから、RNeasy Mini Kit（Qiagen）にて精製した。RNA濃度はNanodrop ONEにて測定した。また、精製後のmRNAのサイズはBioanalyzerとRNA 6000ナノキット（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて確認した。
　〈細胞生存率の評価〉
　96ウェル平底プラスチックプレートの各ウェルに1×104個のHeLa細胞を撒き、37℃のCO2インキュベーターにて一日間培養した。その後、ピューロマイシン耐性遺伝子mRNA 90 ng（分割ピューロマイシン耐性遺伝子の場合はN末端側とC末端側各45 ng）ならびに標的タンパク質をコードするmRNA 10 ngをLipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific）0.2 μlにて各ウェルの細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞は37℃のCO2インキュベーターにて再度、一日間培養した。その後、培地を0.5 μg/mlのピューロマイシン（invivogen）を含有する培地へと交換して更に37℃のCO2インキュベーターにて培養を続けた。トランスフェクションから二または三日後、Cell Counting Kit-8（Dojindo）を10倍量の培地にて希釈し、各ウェルの培地をこのCell Counting Kit-8含有培地110 μlに交換して約1時間、37℃のCO2インキュベーターにてインキュベートした。その後、800 TS吸光度専用プレートリーダー（BioTek）を用いて450 nmならびに630 nmの吸光度を測定して前者と後者の差を算出し、mRNAのトランスフェクションとピューロマイシン処理のいずれも行っていない細胞における値を100％として細胞生存率を評価した。
　実施例1：大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（eDHFR）タンパク質を発現している細胞の選別
　ピューロマイシン耐性遺伝子を32残基目と33残基目の間、84残基目と85残基目の間、119残基目と120残基目の間でそれぞれ分割し、N末端側断片のC末端側にはケージドeNpu N-インテインとeDHFRに結合するナノボディであるNb113を、C末端側断片のN末端側には同じくeDHFRに結合するナノボディであるCA1698とケージドNpu C-インテインを融合させたものを構築した。これらの分割ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するmRNAをHeLa細胞に対し導入した後、それらの細胞に対しピューロマイシン処理を行った。
　標的タンパク質であるeDHFRの発現が無い条件では、いずれの分割ピューロマイシン耐性遺伝子もmRNAをトランスフェクションしていない細胞と同程度の細胞生存率しか示さなかった。一方、eDHFRを発現させた細胞では、84残基目と85残基目の間で分割したピューロマイシン耐性遺伝子が約90%の細胞生存率を示した。32残基目と33残基目の間で分割したもの、ならびに119残基目と120残基目の間で分割したものでもeDHFRによる細胞生存率の上昇は見られたが、その上昇率は84残基目と85残基目の間で分割したものと比べると明らかに小さかった（図４）。
　実施例2：緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現している細胞の選別
　ナノボディ部分を変更することで理論上はどのような細胞内タンパク質にも対応可能という本システムの汎用性について検討した。実施例1で最も高い効果が得られた、ピューロマイシン耐性遺伝子の84残基目と85残基目の間で分割したペア（PuroR(1-84)-eNpuNcage-Nb113、CA1698-NpuCcage-PuroR(85-199)）のeDHFR結合ナノボディ部分であるNb113ならびにCA1698を、それぞれEGFP結合ナノボディであるLag16ならびにGFPenhancerNbに交換したものを構築した。実施例１の場合と同様、これらの分割ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するmRNAをHeLa細胞に対し導入した後、それらの細胞に対しピューロマイシン処理を行ったところ、同様に標的タンパク質であるEGFP依存的に高い細胞生存率が示された（図５）。
　本研究で示した選別方法は、抗体で細胞を識別し、フローサイトメーターで１つずつ分析して細胞を分離するのとは対照的に、大量の細胞を同時に処理する必要があるため、コンタミネーションのリスクがある高価な装置は必要ない。そのため、本発明による細胞選別方法はスケールアップに適している。本発明による選別方法は、将来的に移植や再生医療のための細胞を調整するための汎用的な技術を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　以下の（I）及び（II）：
    　（I）標的分子の第１の部分を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
    　（II）標的分子の第２の部分を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、薬剤耐性タンパク質のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
    　またはこれらをコードするDNA
    を含む、生細胞の選別システム。
  2. 　前記（I）のmRNAが、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、前記（II）のmRNAが、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである、請求項１に記載のシステム。
  3. 　前記（I）のmRNAと、前記（II）のmRNAが、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む単一のmRNAである、請求項１に記載のシステム。
  4. 　前記薬剤耐性タンパク質が、ピューロマイシン耐性タンパク質、ブラストサイジン耐性タンパク質、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性タンパク質、ハイグロマイシン耐性タンパク質、及びゼオシン耐性タンパク質から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 　前記ケージドインテインのN末端ドメインが、ケージドeNpu N-インテインもしくはその変異体であり、前記ケージドインテインのC末端ドメインが、ケージドNpu C-インテインもしくはその変異体である、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 　前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
  7. 　標的分子を指標として生細胞を選別する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載のシステムを細胞に導入する工程、
    （ｂ）工程（ａ）において得られた細胞を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程
    を含む方法。
  8. 　標的分子を指標として選別された生細胞集団を製造する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載のシステムを細胞集団に導入する工程、
    （ｂ）工程（ａ）において得られた細胞集団を、前記薬剤耐性タンパク質に対応する薬剤存在下で培養する工程
    を含む方法。
     
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