JP2018111685A - スプリットインテイン、複合体およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)により与えられた助成番号GM086868の下、米国政府の支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
タンパク質スプライシングは、インテインとして知られるタンパク質ファミリーにより触媒される翻訳後プロセスである(1)。このプロセスでは、インテインドメインがより大きな前駆体タンパク質からのその自己切断を触媒し、同時に2つの隣接するポリペプチド 配列(エクステイン)を相互に連結する。ほとんどのインテインはスプライシングをシスに触媒するが、これらのタンパク質の少数のサブセットは自然に断片化されたドメインとして存在し、これらは別々に発現されるが、速やかに会合してスプライシングをトランスに触媒する。ポリペプチド結合を形成および破壊するそれらの能力を考えて(インテインはタンパク質リガーゼと考えることができる)、シススプライシングインテインおよびトランススプライシングインテインは両方ともケミカルバイオロジーツールとして幅広い用途を見出した(2)。
スプリットインテインN末端断片およびC末端断片、それらの変異体、ならびにポリペプチド精製および修飾においてこれらのスプリットインテインを使用する方法が開示される。
このアッセイでは、スプリットインテインの2つの断片を、断片化されたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(KanR)酵素との融合物として大腸菌で共発現させる。
トランススプライシング時、活性酵素が組み立てられ、細菌が抗生物質カナマイシン耐性となる(図1a)。活性の高いインテインほどより大きなカナマイシン耐性を付与することから、カナマイシン濃度の関数として、細菌増殖により高いIC50値を有する。このアッセイは、ダイナミックレンジを有意に混乱することなく変化するローカルC−エクステイン配列のバックグラウンドで行うことができる。総てのDnaEインテインはそれらの内在コンテキスト中の同じローカルエクステイン配列をスプライシングするので、このスクリーニングは最初、野生型C−エクステインバックグラウンド(CFN)にてKanR酵素内で行った。予想されたように、Npuインテインを発現する細菌は高い相対的IC50を持っていたが、Sspを発現するクローンはカナマイシンに不十分な耐性を示した。注目すべきは、これらのDnaEインテインのうち半数を超えるものが、in vivoにおいて30℃で、Npuに匹敵するスプライシング効率を示した(図1b)。
本明細書では、ポリペプチドとスプリットインテインN末端断片の融合タンパク質が開示される。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、あまねく「タンパク質」と互換的に呼ばれるアミノ酸に基づくポリマーを意味し、糖タンパク質およびリポタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、本ポリペプチドは、細胞(例えば、哺乳類細胞)から放出されるポリペプチドである。様々な場合において、本ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。本ポリペプチドは目的の天然または合成のどのようなポリペプチドであってもよく、20種の天然アミノ酸以外の1以上のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。
本明細書で開示されるスプリットインテインC末端断片は、N137残基およびC+1残基が、N137ではAsnまたはGln以外の残基に、C+1ではCys以外の残基に変異するように天然配列から変異させる(配列番号129〜146)。いくつかの場合では、これらの2か所での突然変異は、疎水性残基、例えば、側鎖に遊離SHチオール(Cys)、カルボン酸(Asp、Glu)、または塩基(Arg、His、Lys)または他の望ましくない基(例えば、Asn、Gln)を含まない残基へのものである。様々な場合において、これら2つの変異した脂肪族残基は同じであっても異なっていてもよく、A、V、I、S、M、H、L、F、Y、G、もしくはWであり得るか、またはノルロイシン、2−アミノ酪酸、ノルバリン、2−アミノペンタン酸(aminopentoic acid)、または2−アミノヘキサン酸(aminohexaanoic acid)などの非天然型の(例えば、遺伝コードによりコードされていない)脂肪族アミノ酸残基であり得る(配列番号219〜236)。
具体的には、両残基がA、I、V、L、Y、GおよびFから選択される突然変異が企図される(配列番号309〜326)。様々な場合では、これら2つの変異残基のうち少なくとも1つはAである。
タンパク質の部位特異的修飾は、タンパク質機能の分子詳細を研究するための極めて貴重なツールである(19)。さらに、タンパク質治療薬の創薬および開発に対するその可能性も最近承認された(20)。部位特異的修飾タンパク質を作製するためのいくつかの方法が長年かけて開発され、最も広く使用されているものの1つが発現タンパク質ライゲーション(EPL)であり、様々な研究でタンパク質機能の基本的疑問に取り組むために多くの異なるタンパク質に適用されている。EPLは、ネイティブケミカルライゲーション(NCL)(19、22)の組換えタンパク質への拡張として1998に初めて記載され(21)、C末端組換えタンパク質α−チオエステルと、N末端にCysを含む合成ペプチドとの間の、これら2つの断片の間での新たなネイティブペプチド結合の形成を介した反応からなる。Cys含有ペプチドの合成特性は、目的タンパク質へのほとんどどんな化学修飾の組み込みも可能とする。
N末端ジャンクションは天然N−エクステイン残基からの逸脱に対する許容性がより高いとみなされるが、目的タンパク質のC末端アミノ酸(インテインナンバリング慣例に従って−1残基)がチオエステル形成の収率に及ぼす影響を評価することが重要であった。C末端Ub残基(X)がその天然Glyから他の19のタンパク質構成アミノ酸の総てに変更された、Ub−X−NpuN融合タンパク質の完全ライブラリーを構築した。タンパク質を大腸菌および細胞溶解液で発現させ、NpuC−AAアフィニティー樹脂に適用し、精製した。タンパク質収量は、各精製に関するSDSPAGE分析から、また、加水分解
レベルは溶出画分のRP−HPLCおよびMS分析から評価した(図10)。結果はGyrAなどの非スプリットインテインに関して知られているもの(29)と同様の傾向を示し、ほとんどのアミノ酸は、MESNaとともに一晩インキュベートした後に高い切断収率を示す(例外はProおよびGluであり、これらに関する回収率はそれぞれ49および50%であった)。予測されたように、Asn α−チオエステルは、その側鎖の隣接するα−チオエステルとの周知の反応によるスクシンイミドの形成のために単離できなかった。
総てのバッファー塩、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)、およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)は、Fisher Scientific(ピッツバーグ、PA)から購入した。硫酸カナマイシン(Kan)、β−メルカプトエタノール(BME)、DL−ジチオトレイトール(DTT)、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム(MESNa)、エタンジチオール(EDT)、クーマシーブリリアントブルー、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(Pd(PPh3)4)、フェニルシラン、トリイソプロピルシラン(TIS)、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物、および5(6)−カルボキシフルオレセインは、Sigma−Aldrich(セントルイス、MO)から購入した。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロリド(TCEP)は、Thermo Scientific(ロックフォード、IL)から購入した。Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(Alloc)−OH、およびBoc−Cys(Trt)−OHは、Novabiochem(レウフェルフィンゲン、スイス)から購入した(purchasd)。ピペリジンは、Alfa Aesar(ワールド・ヒル、MA)から購入した。ジクロロメタン(DCM)およびリンクアミド樹脂は、EMD Chemicals(ビレリカ、MA)から購入した。1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)は、AnaSpec(フリーモント、Ca)から購入した。トリフルオロ酢酸(TFA)は、ハロ炭素(ノース・オーガスタ、SC)から購入した。完全プロテアーゼインヒビタータブレットは、Roche Diagnostics(マンハイム、ドイツ)から購入した。ニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni−NTA)樹脂は、Novagen(ギブズタウン、NJ)からのものであった。QuikChange XL II部位特異的突然変異誘発キットは、Agilent(ラホヤ、CA)からのものであった。DpnIおよびPhusion High−Fidelity PCRキットは、New England Biolabs(イプスウィッチ、MA)からのものであった。DNA精製キット(QIAprepスピンミニキット、QIAquickゲル抽出キット、QIAquick PCR精製キット)は、Qiagen(バレンシア、CA)からのものであった。サブクローニング・エフィシェンシーDH5コンピテントセルおよびOne Shot BL21(DE3)化学コンピテント大腸菌(E. coli)は、Invitrogen(カールスバッド、CA)から購入し、「インハウス」高コンピテンシー細胞株を作製するために使用した。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(コーラルビル、IA)から購入した。新規インテイン遺伝子は、合成により作製され、GENEWIZ(サウス・プレインフィールド、NJ)から購入した。本研究で使用したプラスミドは総て、GENEWIZにより配列決定が行われた。
サイズ排除クロマトグラフィーは、GE HealthcareからのAKTA FPLCシステムで実施した。分取および分析の両FPLCは、Superdex 75 10/300またはS200 10/300カラムで行った。総ての実施で、タンパク質を1.35カラム容量のバッファーで溶出させた(流速:0.5mL/分)。分析的RP−HPLCは、C18 Vydacカラム(5μm、4.6×150mm)を装備したHewlett−Packard 1100および1200シリーズ装置で、流速1mL/分にて実施した。分取RP−HPLCは、Waters 2545バイナリー・グラジェント・モジュールおよびWaters 2489 UV検出器から構成されるWaters
prep LCシステムで実施した。精製は、C18 Vydac 218TP1022カラム(10μM;22×250mm)にて実施した。総ての実施で、水中0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)(溶媒A)および0.1%TFAを含有する水中90%アセトニトリル(溶媒B)を使用した。総ての実施で、初期条件で2分の無勾配期間の後、バッファーB濃度を漸増して30分の直線的勾配とした。エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)は、Bruker Daltonics MicrOTOF−Q II質量分析計で実施した。in vivoインテイン活性アッセイは、Molecular DevicesからのVersaMax tunableマイクロプレートリーダーで実施した。細胞は、S−450D Branson Digital Sonifierを用いて溶解させた。ウエスタンブロットおよびクーマシー染色in vitroスプライシングアッセイゲルは、LI−COR Odyssey赤外線イメージャーで画像化した。蛍光フルオレセイン含有ゲルは、GE ImageQuant LAS 4000イメージャーを用いて画像化した。
スプリットDnaEインテインのタンパク質配列は、NEB InBase1から取得した。このリストは、2011年5月時点での23エントリーからなった。これらのエントリーのうち、Csp(PCC7822)およびNosp(CCY9414)の2つは、C−インテイン配列を持たなかったので本研究から除いた。2対のインテインは同一の配列を持っていた:Nsp(PCC7120)とAsp(これらは、2つの異なる名称を有する同じ生物である可能性が最も高い)およびSel(PCC6301)とSel(PC7942)。従って、Nsp(PCC7120)およびSel(PCC6301)は、ライブラリーから除いた。Mcht(PCC7420)およびOli C−インテイン配列も同一であったが、それらのN−インテイン配列が異なっていたので、両インテインともライブラリーで維持した。InBaseでは、Aovインテインは、87位に絶対的に保存されているイソロイシン(I)の代わりに「X」を持っており,従って、この位置においてI87が用いられた。Csp(PCC7424)インテインを有するカナマイシン耐性アッセイ用プラスミドは不安定であることが分かり、変動の大きい結果をもたらしたことから、このインテインは分析から除いた。最終的なライブラリーは18のインテインを含んだ(表1)。
C−インテインのナンバリングは、TelおよびTvuインテイン(この位置にギャップを有し、104番から始まる)を除き、103から始まる。配列ロゴ(図6)については、N−インテインアラインメントおよびC−インテインアラインメントはそれぞれ、高活性と低活性に基づいて2つのアラインメントに分けた。高活性の配列ロゴは、Cwa、Cra(CS505)、Csp(PCC8801)、Ava、Npu、Csp(CCY0110)、Mcht(PCC7420)、Maer(NIES843)、Asp、Oli、およびAha(高活性のC120G突然変異に基づいて含めた)から構成された。低活性の配列ロゴは、Aov、Ter、Ssp(PCC7002)、Tvu、Tel、Ssp、およびSel(PC7942)から構成された。配列ロゴは、WebLogoを用いて作成した(4)。ヒートマップは、統計コンピューター・グラフィックスプログラム「R」を用いて作成した。
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(KanR)およびNpu遺伝子断片を、従前に記載されたように(36、37)、pBluescript KS(+)ベクターのKpnI制限部位とSacI制限部位の間にクローニングした。この構築物は下記の構造を含んだ。
[KanRプロモーター]−[RBS]−[myc−KanRN]−[IntN]−[iRBS]−[IntC]−[CFN−KanRC]
ここで、KanRプロモーターは、ほとんどのカナマイシン耐性プラスミドに見られる構成プロモーターであり、RBSは、共通の大腸菌(E. coli)リボゾーム結合部位であり、iRBSは、前にリンカーを持つ介在リボゾーム結合部位であり、mycは、c−mycエピトープタグ(EQKLISEEDL)(配列番号760)をコードし、KanRNおよびKanRCは、KanRタンパク質の断片であり、IntNおよびIntCは、スプリットインテイン断片である。類似のSspプラスミドも、従前に記載されたように(36、37)構築した。これらのプラスミドを、myc−KanR−NpuDnaEスプリットおよびmyc−KanR−SspDnaEスプリットと呼称する。残りのスプリットインテインのスクリーニングベクターを作製するために、以下の構造を含む合成遺伝子を設計し、GENEWIZから購入した。
[5’オーバーハング]−[IntN]−[iRBS]−[IntC]−[3’オーバーハング]
ここで、5’および3’オーバーハングはそれぞれ、myc−KanR−NpuDnaEスプリットプラスミドにおいてNpuNの上流に見られる正確に39bpおよびNpuCの下流に見られる25bpであった。総てのインテインについて、購入した遺伝子配列は、GenBank8の総ての大腸菌コード配列に基づいて作成されたデフォルト大腸菌コドン使用頻度表を用いてコドンの最適化を行った。これらの合成遺伝子は、pUC57ベクターに受容された。
96ウェルプレートアッセイ: インテイン活性共役カナマイシン耐性(KanR)アッセイを、従前に記載されたように(36、37)に、96ウェルプレート形式で行った。
一般に、プラスミドを熱ショックにより15μLのサブクローニング・エフィシェンシーDH5α細胞に形質転換し、形質転換細胞を、100μg/mLのアンピシリン(LB/amp)を含む3mLのLuria−Bertani(LB)培地中、37℃で18時間増殖させた。一晩培養物を8種類の異なるカナマイシン濃度を含有するLB/amp溶液(培養物当たり150μL)で250倍希釈した。細胞を96ウェルプレートにて30℃で、5分ごとに650nmで光学密度(OD)をモニタリングしながら24時間培養した(なお、各測定の前には1分間振盪した)。この増殖曲線(一般に、固定相)のエンドポイントをカナマイシン濃度の関数としてプロットして用量反応相を可視化し、変数勾配用量応答方程式に当てはめてIC50値を計算した。
Ub−IntNプラスミド: N−インテイン発現プラスミドは、従前に記載のNpuNプラスミドpMR−Ub−NpuN(WT)(36、37)に由来した。このプラスミドは、以下のタンパク質配列をコードした。
Ub−IntN構築物(Ub−CwaNを除く)の過剰発現および精製: 各N−インテインプラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)細胞を、100μg/mLのアンピシリンを含有する1LのLB中、37℃で、OD600=0.6まで増殖させた。次に、これらの細胞を18℃に冷却し、0.5mM IPTGの添加により18℃で16時間、発現を誘導した。遠心分離(10,500rcf、30分)により細胞を採取した後、細胞ペレットを、5mLの溶解バッファー(50mMリン酸塩、300mM NaCl、5mMイミダゾール、2mM BME、pH8.0)の入った50mLコニカル管に移し、−80℃で保存した。細胞ペレットを、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した15mLの溶解バッファーを追加することにより再懸濁させた。細胞を音波処理(35%振幅、氷上、30秒間隔で8×20秒のパルス)により溶解した。可溶性画分を遠心分離(35,000rcf、30分)により回収した。可溶性画分を2mLのNi−NTA樹脂と混合し、4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、スラリーをフリット付きカラムにロードした。通過画分を廃棄した後、カラムを5カラム容量(CV)の溶解バッファー、5CVの洗浄バッファー1(20mMイミダゾールを含む溶解バッファー)、および3CVの洗浄バッファー2(50mMイミダゾールを含む溶解バッファー)で洗浄した。タンパク質を溶出バッファー(250mMイミダゾールを含む溶解バッファー)で4つの1.5CV溶出画分に溶出した。洗浄液および溶出画分をSDS−PAGEにより分析した。
FPLC画分をSDS−PAGEにより分析し、最も純度の高い画分をプールし、分析的ゲル濾過、分析的RP−HPLC、および質量分析により分析した。純粋なタンパク質の濃度は、UV A280nmおよびブラッドフォードアッセイにより決定した。
動態アッセイ手順: 典型的なアッセイでは、Ub−IntN構築物およびIntC−SUMO構築物の個々のタンパク質原液を、濾過したスプライシングバッファー(100mMリン酸塩、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、pH7.2)中に終濃度の2倍で(例えば、1.0μMの反応のためには2.0μM原液)調製した。
各タンパク質溶液に1mM TCEPを加え(pHを中性にした100mM原液から)、これらのタンパク質を30℃または37℃で、反応温度にもよるが5分間インキュベートした。反応を開始させるために、N−インテインとC−インテインを等容量(すなわち、等モル比)で混合した。典型的な反応容量は300μLであり、ヒートブロック上のエッペンドルフ管で実施した。反応中、20μLアリコートの反応溶液を所望の時点で取り出し、氷上、20μLの2倍濃縮SDSゲルローディング色素中で急冷し、40mMトリス(pH約7.0)、10%(v/v)グリセロール、1%(w/v)SDS、0.02%(w/v)ブロモフェノールブルー、および2%(v/v)BMEを含む最終クエンチング溶液を得た。各反応について、等量の出発材料をクエンチャー溶液に直接混合することにより、人為的ゼロ時点を取った。サンプルを10分間煮沸した後、17,000rcfで1分間遠心分離した。出発材料および時点のアリコート(15μL)をBis−Trisゲルにロードし、MES−SDSランニングバッファーで泳動させた。ゲルをクーマシー染色した後、Licor Odysseyスキャナを用いて画像化した。
Odyssey定量機能またはImageJを用いて分析した。出発材料バンドの密な近接が見られたので、これらのバンドを一般に積分した。ローディング誤差に関して正規化するために、あるレーンの各バンドの積分強度を、そのレーンの総バンド強度(レーン間で比較的一定を維持していた)の分数強度として表した。これらの正規化強度を時間の関数としてプロットし、GraphPad Prismソフトウエアを用い、3回の独立した反応からのデータをまとめて一次速度方程式に当てはめた。
反応物の消耗については:
Npu−CGNおよびCra(CS505)−CGNのHPLC/MS分析のため、Ub−IntNおよびIntC−CGN−SUMOの個々のタンパク質原液を、濾過したスプライシングバッファー(100mMリン酸塩、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、pH7.2)中に8.0μMで調製した。各タンパク質溶液に1mM TCEPを加え(pHを中性とした100mM原液から)、これらのタンパク質を30℃で5分間インキュベートした。反応を開始させるために、N−インテインおよびC−インテインを等容量(すなわち、等モル比)で混合し、30℃でインキュベートした。反応中、反応溶液の90μLアリコートを所望の時点で取り出し、30μLのクエンチング溶液(4%トリフルオロ酢酸を含む6M塩酸グアニジン)中で急冷した。各急冷時点のもの100μLを分析的C18 RP−HPLCカラムに注入し、25%バッファーBで2分間の無勾配期の後、25%から73%のバッファーB勾配で30分間溶出させた(カラムおよびランニングバッファーの詳細に関しては器具の節を参照)。種々の時点で、様々なHPLCピークを収集し、それらの同一性を質量分析により確認した。IntC−(Ub)SUMO種をMSにより同定し、分岐型中間体形成および消耗を確認した。
CGNの存在下でNpu、Cra(CS505)、およびCwaの反応を比較したところ、スプライス産物よりも切断ユビキチンの速度が遅いにもかかわらず、スプライス産物よりも高い量の切断ユビキチン(すなわち、N−エクステイン切断)が見られた。この筋書きでは、スプライシングおよび切断は同じ反応物(分岐型中間体)から起こる競合一次反応であって、切断よりも多くのスプライス産物をもたらす(観察とは逆)ので、この所見は分岐型中間体からのみ起こるN−エクステイン切断およびスプライス産物形成と一致しない。これらの所見を一致させる試みとして、一連の動態モデリングシミュレーションを行った。総てのモデリングは、BPReidからの動態モデリングアプレットを用いて行った(40)。これらのモデルはスプライシング経路に関して3つの基本的仮定を持つ。
1.第1の平衡では正および逆反応が速い。さらに、この平衡の位置はややアミド側にある。
2.第2の平衡も速く、両中間体はシステイニルチオエステルであるので、Keqは1に近いはずである。
3.高速インテインでは、分岐型中間体の分割(k5)は最初の2つの可逆的段階の速度と同桁であるが、L(k6)およびB(k7)からの切断速度は比較的遅い。遅いインテインでは、分岐型中間体の分割(k5)も遅く、切断と同桁であった。
1.LとBからの切断の相対的速度(k6とk7)。
2.分岐型中間体の分割と切断の相対的速度(k5とk6+k7)。
3.最も重要には、直鎖型中間体と分岐型中間体の間の交換速度(k3/k4)。
これらの分析は、切断が直鎖型中間体および分岐型中間体の両方から起こるはずであることだけでなく、直鎖中間体における切断が有利であり得ることを示唆する。
H−Cys−Gly−Lys(フルオレセイン)−NH 2 (CGK−フルオレセイン)の固相合成および精製: Fmocに基づく固相ペプチド合成(SPPS)を用いて、配列H−Cys−Gly−Lys(フルオレセイン)−NH2を有するペプチドを生産した。
このペプチドを下記のように0.2mmolスケールにてRinkアミド樹脂上で合成した:DMF中20%のピペリジンを用い、1分間の樹脂の平衡化の後に20分のインキュベーションを用いてFmocの脱保護を行った。Fmoc脱保護の後、活性化剤としてDIC/HOBtを用いてアミノ酸をカップリングした。まず、アミノ酸(1.1mmol)を50:50 DCM:DMF(2mL)に溶かし、0℃にて15分間、DIC(1.0 mmol)およびHOBt(1.2mmol)で活性化した。この混合物を、N末端を脱保護した樹脂に加え、室温で10分間カップリングした。
重要なこととしては、この構築物をNpuの天然C−エクステイン残基(CFN)をMxeGyrAのそれ(TEA)の代わりに含むように改変した。得られたプラスミドpTXB1−Ub−NpuDnaE−ACFN−H6は、下記のタンパク質をコードした。
主要ピークを回収し、MSにより分析した。
ユビキチンとのNpu、Ava、およびMcht融合物について、中性バッファーからC18 RP−HPLCカラムに直接注入した場合、精製されたタンパク質に3つのピークが見られた。これらのピークは総て、同じ質量の目的タンパク質を持っていた。0.1%TFAを含有するH2O(pH2)で20倍希釈し、室温で少なくとも2時間インキュベートした場合、最初の2つのピークは第3のピークに重なった(図4d)。MxeGyrAでは同じ条件で同じ観察はできなかった。前駆体アミドと直鎖チオエステルの間の平衡が生じていたことをさらに確認するために、Ub−NpuDnaE−AAFN−H6タンパク質を、1%SDSを含有するチオ溶解バッファーで20倍希釈した。煮沸前には、これら2つの主要ピークが見られた。10分間煮沸した後、このタンパク質がアンフォールド(unfolded)されると、第1の主要ピークは一部が第2の主要ピークに変換したが、このことは前記ピークが、アンフォールドした(unfolded)インテインにおいてより安定であるはずのアミドであったことを示唆する。3つのピークが平衡状態であったというさらなる証拠は、pH滴定から得られた。このタンパク質をpH2〜pH8の範囲のクエン酸/リン酸塩バッファーで20倍希釈し、室温で3〜4時間インキュベートした後、30分かけて30%から73%Bの勾配のHPLCにより分析した(図4d)。これら3つの種の相対的存在量を調整したところ、それらの活性部位に複数のイオン性官能基を含む酵素の活性と類似のベル型のpH依存性を示した。
Claims (34)
- スプリットインテインN末端断片とポリペプチドとを含んでなり、前記スプリットインテインN末端断片が、配列番号1〜19からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、融合タンパク質。
- 前記スプリットインテインN末端断片が配列番号19の配列またはその変異体を含んでなる、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記スプリットインテインN末端断片が配列番号20〜38および761からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドが40kDa以上の分子量を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体がIgG抗体またはそのフラグメントである、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体の重鎖がスプリットインテインN末端断片に融合されている、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体の各重鎖がスプリットインテインN末端断片に融合されている、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体の軽鎖がスプリットインテインN末端断片に融合されている、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドが細胞から分泌される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質と請求項12〜18のいずれか一項に記載のスプリットインテインC末端断片とを含んでなる、複合体。
- 配列番号57〜74からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、スプリットインテインC末端断片。
- 配列番号75〜128からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、請求項12に記載のスプリットインテインC末端断片。
- 配列番号707の配列またはその変異体を含んでなる、請求項12に記載のスプリットインテインC末端断片。
- 配列番号708〜711からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、請求項14に記載のスプリットインテインC末端断片。
- 支持体に結合している請求項12〜15のいずれか一項に記載のスプリットインテインC末端断片。
- 前記支持体が粒子、ビーズ、樹脂、またはスライドグラスを含んでなる、請求項16に記載のスプリットインテインC末端断片。
- 配列番号417〜704および745〜759からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなる、請求項17に記載のスプリットインテインC末端断片。
- (a)(1)ポリペプチドと、配列番号1〜19からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなるスプリットインテインN末端断片とを含んでなる融合タンパク質と、(2)配列番号57〜74からなる群から選択される配列またはその変異体を含んでなるスプリットインテインC末端断片とを接触させること、ここで、接触は、前記スプリットインテインN末端断片と前記スプリットインテインC末端断片が結合してインテイン中間体を形成することを可能とする条件下で行われる;および
(b)前記インテイン中間体を求核試薬と接触させて、タンパク質と求核試薬の複合体を形成すること
を含んでなる、方法。 - 前記スプリットインテインC末端断片が支持体に結合されている、請求項19に記載の方法。
- 前記支持体がビーズ、樹脂、粒子またはスライドグラスを含んでなる、請求項20に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が全細胞溶解液中にある、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インテイン中間体を洗浄して全細胞溶解液の成分からインテイン中間体を分離することをさらに含んでなる、請求項22に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が細胞上清に由来する、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インテイン中間体を洗浄して細胞上清の成分からインテイン中間体を分離することをさらに含んでなる、請求項24に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが40kDa以上の分子量を有する、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項26に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが細胞から分泌される、請求項19〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合体を単離することをさらに含んでなる、請求項19〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記求核試薬が第2のポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、薬物、またはポリマーを含んでなる、請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記求核試薬がチオールを含んでなり、前記複合体がチオエステルを含んでなる、請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記チオールが2−メルカプトエタンスルホネート、アルキルチオール、またはアリールチオールである、請求項31に記載の方法。
- 前記チオエステルを第2の求核試薬と反応させて第2の複合体を形成することをさらに含んでなる、請求項31または32に記載の方法。
- 前記第2の求核試薬がアミン、ヒドラジン、またはアミノ−オキシ部分を含んでなる、請求項33に記載の方法。
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