ES2709333T3 - Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas - Google Patents

Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2709333T3
ES2709333T3 ES13809861T ES13809861T ES2709333T3 ES 2709333 T3 ES2709333 T3 ES 2709333T3 ES 13809861 T ES13809861 T ES 13809861T ES 13809861 T ES13809861 T ES 13809861T ES 2709333 T3 ES2709333 T3 ES 2709333T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
internal
fragment
divided
protein
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13809861T
Other languages
English (en)
Inventor
Tom W Muir
Miquel Vila-Perello
Zhihua Liu
Neel H Shah
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Princeton University
Original Assignee
Princeton University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Princeton University filed Critical Princeton University
Application granted granted Critical
Publication of ES2709333T3 publication Critical patent/ES2709333T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain

Abstract

Un método que comprende (a) poner en contacto (1) una proteína de fusión que comprende un polipéptido y un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-19, o una variante de la misma, en el que la variante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21-38 y 761 y (2) un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-74, en el que el contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de la inteína dividida al fragmento C de la inteína dividida para formar un intermedio de inteína; y (b) poner en contacto el intermedio de inteína con un nucleófilo para formar un conjugado de la proteína y el nucleófilo.

Description

DESCRIPCION
Intemas divididas, conjugados y usos de las mismas
Antecedentes
El empalme de protemas es un proceso postraduccional catalizado por una familia de protemas conocidas como intemas. (1) Durante este proceso, un dominio de interna cataliza su propia escision de una protema precursora mas grande y simultaneamente une las dos secuencias polipeptidicas flanqueantes (extemas). Mientras que la mayona de las intemas catalizan el empalme en cis, existe un pequeno subconjunto de estas protemas como dominios fragmentados de manera natural que se expresan por separado pero se asocian rapidamente y catalizan el empalme en trans. Dada su capacidad para crear y romper enlaces polipeptfdicos (las intemas se pueden considerar ligasas de protemas), tanto las intemas en empalmes en cis como en trans han encontrado un uso generalizado como herramientas biologicas qmmicas. (2)
A pesar del uso creciente de las intemas en la biologfa qmmica, su utilidad practica se ha visto limitada por dos caractensticas comunes de la familia, a saber: (i) cineticas lentas y (ii) eficacia dependiente del contexto con respecto a las secuencias de extemas flanqueantes inmediatas. (3,4) Recientemente, se demostro que una interna dividida de la cianobacteria Nostoc punctiforme (Npu) cataliza el empalme en trans de protemas en el orden de un minuto, en lugar de horas como la mayona de las intemas de empalme en cis o trans. (5) Ademas, esta interna fue ligeramente mas tolerante de la variacion de la secuencia en el resto 2 de C-extema cntico que otras intemas (6).
Ademas de este hallazgo, los siguientes documentos desvelan datos sobre las intemas y sus usos. Neel H. Shah et al., (Journal of the American Chemical Society, 2012, vol. 134 n.° 28, paginas 11338-11341) desvela un analisis cinetico de la familia de intemas DnaE divididas y demuestra que algunas de estas intemas pueden catalizar el empalme en trans de la protema en decenas de segundos. El documento de patente WO 2009/132455 A1 revela metodos para producir protemas de fusion que comprenden un fragmento N de interna dividida y un polipeptido. Yang J et al. (PNAS, 2002, vol. 100, n.° 6, paginas 3513-3518) se refiere a protemas de fusion entre una betaglucuronidasa y fragmentos N y/o fragmentos C de una interna DnaE de la cepa PCC6B03 de Synechocystis sp. Neel H. Shah et al. (Angewandte Chemie International Edition, 2011 vol. 50, n.° 29, paginas 6511-6515) desvela el uso de intemas Nputs y una Npumut para la generacion de la protema de mairnfero activa PARP1 de longitud completa a traves de una union de tres piezas en un solo paso y demuestra que las interacciones electrostaticas pueden generar control cinetico en un sistema enzimatico complejo. Por ultimo, los documentos de patente WO2011057163 y CN101333555 desvelan protemas de fusion entre un polipeptido y un fragmento N de interna dividida y metodos para utilizar intemas divididas en modificaciones de polipeptidos. Sin embargo, todavfa existe una necesidad de intemas divididas mas robustas y mas eficaces para su uso en una variedad de aplicaciones de purificacion de protemas y modificacion de protemas.
Sumario
La invencion se refiere a un metodo que comprende (a) poner en contacto (1) una protema de fusion que comprende un polipeptido y un fragmento N de interna dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1-19, o una variante de la misma, en el que la variante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 21-38 y 761 y (2) un fragmento C de interna dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57-74; en el que el contacto se realiza en condiciones que permiten la union del fragmento N de la interna dividida al fragmento C de la interna dividida para formar un intermedio de interna; y (b) poner en contacto el intermedio de interna con un nucleofilo para formar un conjugado de la protema y el nucleofilo
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra el empalme en trans de las intemas DnaE divididas. (a) Esquema que representa el empalme en trans de la protema KanR con una secuencia de C-extema local variable. (b) Eficacias relativas de empalme en trans in vivo a 30 °C con la secuencia de C-extema "CFN" endogena y las secuencias "CGN", "c En" y "CRN" exogenas. Los valores de CI50 (± SE, n = 3-4) se normalizan con respecto a las protemas KanR intactas con el tripeptido de C-extema apropiado.
La Figura 2 muestra las semividas in vitro de reacciones de empalme en trans. Los pares de intemas divididas indicados fusionados con las extemas modelo Ub o SUMO (Ub-IntN e IntC-SUMO) se mezclaron a 30 °C o 37 °C, y la formacion de productos se controlo con el tiempo mediante electroforesis en gel. (a) Las semividas se extrajeron de las curvas de progreso de la reaccion ajustadas a una ecuacion de velocidad de primer orden estandar (± SE, n = 3). Geles representativos de SDS-PAGE tenidos con Coomassie que muestran (b) empalme Ava rapido a 37 °C y (c) empalme Ssp ineficaz a 37 °C.
La Figura 3 muestra las relaciones de secuencia-actividad en las intemas DnaE divididas. (a) Intemas en orden de actividad de empalme in vivo con cortes seleccionados de la correspondiente alineacion de secuencias multiples. (b) Representacion de la estructura Npu que resalta la proximidad de la posicion 120 a los restos catalfticos terminales C1 y N137. (c) Analisis in vivo de la mutacion C120G en la interna Aha (± DE, n = 3). (d) Representacion de la estructura Npu que resalta los restos catalfticos clave (barras) y las posiciones no catalfticas importantes (esferas) que modulan la actividad de Ssp. (e) Analisis in vivo de mutaciones puntuales de Ssp a Npu que mejoran la actividad de Ssp (± DE, n = 4). Hay que tener en cuenta que todas las numeraciones de restos corresponden a las posiciones relevantes en Npu segun lo definido por la estructura de NMR (PDB: 2KEQ).(21)
La Figura 4 muestra versiones disenadas de las intemas DnaE ultrarrapidas que soportan la union de protemas expresada de manera eficaz. (a) Esquema que representa la formacion del intermedio tioester lineal y su uso para generar un a-tioester de protema para EPL. (b) Gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie que muestra la tiolisis MESNa eficaz de la ubiquitina de una interna AvaDnaE fusionada para producir el tioester Ub-MES, 4. (c) Geles de SDS-PAGE fluorescentes que muestran la formacion del producto ligado con Ub-CGK(Fluorescema) (6) a partir de reacciones de tiolisis en un solo paso y de union qmmica nativa utilizando las intemas indicadas. (d) Cromatograffas de HPLC de fase inversa que muestran la dependencia del pH de las poblaciones relativas de precursor de amida (1) y tioester lineal (2).
La Figura 5 muestra las alineaciones de secuencia de las intemas DnaE divididas. La numeracion sigue a la de Npu asignada para la estructura de NMR (PDB 2KEQ). Los restos catalfticos crfticos estan marcados con un asterisco.
La Figura 6 muestra los logotipos de secuencia para intemas de alta y baja actividad. Las intemas se clasifican segun la actividad in vivo con una secuencia de C-extema "CFN". Las intemas de alta y baja actividad se distinguen en base a un valor de CI50 de 350 pg/ml de kanamicina, y la interna Aha se incluye en el conjunto de alta actividad, dado que la mutacion C120G restaura considerablemente la actividad alta.
La Figura 7 muestra la purificacion de los a-tioesteres C-terminales utilizando intemas divididas. A) Esquema de la purificacion basada en interna dividida de a-tioesteres de protema C-terminales. B) Secuencia de NpuC TS y su mutante NpuC-AA que tiene un enlazador para inmovilizarlo sobre un soporte solido (subrayado). Para los experimentos de tiolisis en solucion, el resto de Cys C-terminal fue alquilado previamente con yodoacetamida. La Figura 8 muestra la purificacion de a-tioesteres de protemas solubles utilizando la columna de afinidad NpuC-AA. A) Esquema de la estrategia de purificacion utilizando interna Npu DnaE dividida. B) Purificacion de Ubtioester (Ub-COSR) a partir de lisados celulares. C) Purificacion de MBP-tioester (MBP-COSR) a partir de lisados celulares. Ambas purificaciones se monitorizaron mediante analisis SDS PAGE tenido con Coomassie (arriba) o transferencia de Western utilizando un anticuerpo a-His.
La Figura 9 muestra el analisis RP-HPLC y MS de los a-tioesteres Ub y MBP. A) El analisis RP-HPLC (arriba) y MS (abajo) de Ub-COSR se eluyo a partir de la columna NpuC-AA. B) El analisis RP-HPLC (arriba) y m S (abajo) de MBP-COSR se eluyo a partir de la columna NpuC-AA.
La Figura 10 muestra el efecto del resto -1 sobre la eficacia de la tiolisis en resina. Se expresaron 20 protemas Ub-NpuN diferentes que conteman cada uno de los 20 aminoacidos proteinogenicos en el extremo C de Ub (resto -1) y se purificaron sobre columnas NpuC-AA. Los rendimientos de escision de la columna NpuC-AA se estimaron mediante electroforesis en gel y las cantidades de tioester frente a reacciones secundarias (principalmente hidrolisis) se determinaron mediante analisis RP-HPLC y MS.
La Figura 11 muestra la purificacion del a-tioester H2B(1-116) en condiciones de desnaturalizacion. A) Analisis SDS PAGE de la purificacion del a-tioester H2B(1-116) sobre la columna NpuC-AA en presencia de urea 3 M. El analisis RP-HPLC (B) y MS (C) de E1 a partir del panel A confirmo la presencia del tioester H2B deseado.
La Figura 12 muestra la purificacion de los tioesteres aDEC expresados en celulas 293T utilizando la columna de interna dividida. A) Los niveles de expresion de aDEC se fusionaron con diferentes intemas en las celulas 293T. B) Purificacion del a-tioester aDEC a traves de la columna de afinidad NpuC-AA. C) Ligadura de protemas expresadas (EPL, de sus siglas en ingles) de aDEC-tioester con un Cys N-terminal que contiene peptido fluorescente.
La Figura 13 muestra la EPL directamente utilizando tioesteres eluidos con columna IntC . Analisis RP-HPLC (gradiente B al 30-73 %, deteccion de 214 nm y 440 nm) y MS de las reacciones entre el peptido H-CGK(Fl)-NH2 y los tioesteres MES MBP (A) y PHPT1 (B), purificados de E. coli utilizando la columna IntC .
La Figura 14 muestra un experimento de purificacion/ligacion en un solo paso de ubiquitina al peptido H-CGK(Fluorescema)-NH2 (CGK(Fl)). Se unio Ub-NpuN a partir de los lisados celulares de E. coli a la columna IntC , y despues de la eliminacion de contaminantes a traves de lavados extensos, la escision de interna y la ligadura se activaron mediante la adicion de MES 200 mM y peptido CGK(Fl) 1 mM. Analisis de SDS-PAGE tenido con Coomassie y en gel fluorescente de la purificacion/ligadura (izquierda). RP-HPLC (deteccion a 214 y 440 nm) y ESI-TOF MS (derecha) de las fracciones eluidas confirman que la protema ligada deseada se obtuvo en un paso directamente a partir de los lisados celulares con un rendimiento de ligamiento cercano al 95 % (cuantificado mediante RP-HpLC).
La Figura 15 muestra la semismtesis de H2B-K120Ac en condiciones de desnaturalizacion. A) Analisis de SDS-PAGE tenido con Coomassie de la generacion de a-tioester H2B(1-116) en presencia de urea 2 M (sup: sobrenadante de lisado celular, trit: lavado de triton al 1 % de los cuerpos de inclusion, inp: cuerpos de inclusion solubilizados utilizados como entrada para la columna IntC). E1-E6 se agruparon, se concentraron a 150 pM y se ligaron al peptido H-CVTK(Ac)YTSAK-OH a 1 mM durante 3 horas a la temperatura ambiente. B) RP-HpLC (izquierda) de la mezcla de reaccion de ligacion y MS (derecha) del producto H2B-K120Ac ligado.
La Figura 16 muestra la caracterizacion de aDEC205 ligado al peptido H-CGK(Fluorescema)-NH2 (CGK(Fl)). Las fracciones de elucion de la columna NpuC que conteman el tioester aDEC205-MES se concentraron a 20 pM y se ligaron al peptido fluorescente CGK(Fl) a 1 mM durante 48 horas a temperatura ambiente. A) El analisis por MS ESI-TOF de HC desglicosilado y totalmente reducido despues de la ligadura, muestra que el 75 % de los HC estan marcados. Masa esperada para el producto de ligadura = 50221,2 Da. HC libre = 49575,0 Da. B) Analisis SEC-MALS del anticuerpo ligado que muestra que conserva su estructura tetramerica despues de la tiolisis y la ligadura (MW = 151 kDa, MW calc = 148 kDa). C) Union de aDEC205-CGK(Fl) al receptor DEC205. Union dependiente de la dosis de aDEC205-CGK(Fl) (izquierda) o un anticuerpo control a-DEC205 (derecha) a celulas CHO que expresan el receptor DEC205 de raton monitoreado mediante citometna de flujo utilizando una a-IgG de raton marcada con PE. La union para controlar las celulas CHO/NEO, que no expresan el receptor, se muestra en gris.
La Figura 17 muestra la purificacion de los tioesteres aDEC expresados en celulas CHO utilizando la columna de interna dividida. Arriba) Gel de SDS PAGE tenido con Coomassie de la purificacion del tioester aDEC-MES a partir de celulas CHO utilizando una columna NpuC . Abajo) Analisis de transferencia Western de la misma purificacion.
La Figura 18 muestra la purificacion de los tioesteres aDEC utilizando una columna de la interna divida AvaC y el analisis de transferencia Western de la purificacion de los tioesteres aDEC a partir de sobrenadantes de celulas de mairnferos utilizando una columna AvaC .
La Figura 19 muestra las pruebas de expresion del anticuerpo aDEC205 fusionado con la interna dividida AvaN a traves del extremo C de la cadena ligera del anticuerpo y el analisis de transferencia Western de los sobrenadantes de celulas CHO que expresan la fusion aDEC205-AvaN en diferentes momentos.
Descripcion detallada
De las aproximadamente 600 intemas actualmente catalogadas, (7) menos del 5 % son intemas divididas, principalmente de una familia conocida como las intemas DnaE divididas de cianobacterias (8). Sorprendentemente, solo seis de estas, incluida Npu, se han analizado experimentalmente en alguna medida, (6,9,10) y solo Npu y su ortologo de baja eficacia y ampliamente estudiado de PCC6803 de Synechocystis species (Ssp) se han caracterizado rigurosamente in vitro. (5,11)
Se realizo un estudio rapido de 18 intemas DnaE divididas utilizando un metodo de seleccion in vivo para comparar con precision las eficacias de las intemas divididas (12,13). En este ensayo, los dos fragmentos de una interna dividida se expresan conjuntamente en E. coli como fusiones a una enzima aminoglucosido fosfotransferasa (KanR) fragmentada. Tras el empalme en trans, la enzima activa se ensambla y las bacterias se vuelven resistentes al antibiotico kanamicina (Figura 1a). Las intemas mas activas confieren mayor resistencia a la kanamicina y, por lo tanto, tienen un mayor valor de CI50 para el crecimiento bacteriano en funcion de la concentracion de kanamicina. Este ensayo se puede llevar a cabo en el fondo de diversas secuencias locales de C-extema sin perturbar significativamente el intervalo dinamico. Dado que todas las intemas DnaE empalman las mismas secuencias de extemas locales en su contexto endogeno, esta prueba se llevo a cabo originalmente en un fondo de C-extema de tipo silvestre (CFN) dentro de la enzima KanR. Como cabfa esperar, las bacterias que expresaban la interna Npu teman una CI50 relativa alta, mientras que los clones que expresaban Ssp mostraron una resistencia pobre a la kanamicina. De manera destacable, mas de la mitad de las protemas DnaE mostraron una eficacia de empalme comparable a Npu in vivo a 30 °C (Figura 1b).
Para confirmar que los altos valores de CI50 observados in vivo reflejaron un rapido empalme en trans, se realizaron una serie de estudios cineticos en condiciones estandarizadas in vitro. Para ello, se hicieron fragmentos de interna DnaE dividida expresados y purificados individualmente para modelar los dominios de N- y C-extema, ubiquitina y SUMO. Los restos de externa local endogenos se conservaron como enlazadores entre los dominios de externa y los fragmentos de interna para recapitular un contexto de empalme de tipo salvaje. Los fragmentos de interna afm se mezclaron a 1 pM, y la formacion del producto empalmado Ub-SUMO a 30 °C y 37 °C se controlo mediante electroforesis en gel. Estos ensayos validaron que las nuevas intemas con alta actividad in vivo podnan catalizar el empalme en trans in vitro en decenas de segundos, sustancialmente mas rapido que Ssp (Figura 2a). Curiosamente, todas las intemas analizadas excepto Ssp mostraron tasas de empalme aumentadas a 37 °C. Ademas, todas las intemas de empalme rapido mostraron niveles bajos de reacciones secundarias no detectables (Figura 2b), de nuevo en contraste con la Ssp (Figura 2c).
Se investigo la tolerancia de las intemas divididas a la variacion de la secuencia de C-extema. Previamente, se notaba que la sensibilidad de las intemas DnaE cambiaba en la posicion 2 en la C-extema. (6,12). Por lo tanto, todas las intemas DnaE divididas se analizaron en presencia de una glicina 2 (CGN), acido glutamico (CEN) o arginina (CRN) en el ensayo de seleccion in vivo (Figura 1b). Al igual que Npu y Ssp, la mayona de las intemas mostraron una disminucion drastica de la actividad en presencia de las tres mutaciones 2. De los aminoacidos probados, el acido glutamico fue mejor tolerado por cada interna, lo que sugiere un mecanismo conservado para acomodar una carga negativa en esta posicion. Para evaluar con mayor precision la magnitud del efecto de las mutaciones de C-extema en el empalme en trans, las intemas Npu, Cra(CS505) e Cwa se analizaron in vitro en presencia de una glicina 2. Las tres de estas reacciones se caracterizaron por la rapida acumulacion de productos intermedios de tioester, que se resolvieron lentamente durante decenas de minutos en el producto empalmado y el producto de escision de N-extema. De acuerdo con las observaciones informadas anteriormente, estos datos indican que las intemas DnaE divididas requieren una masa esterica en la posicion 2 para una resolucion intermedia ramificada y un empalme eficaz. (12) Es importante mencionar que las intemas Cra(CS505) y Cwa mostraron una mayor promiscuidad de C-extema in vivo, mientras que Ssp(PCC7002) no tolero ninguna de las mutaciones probadas. Esto demuestra que la variacion de la secuencia sutil entre las intemas divididas puede permitir la promiscuidad diferencial. Por tanto, esta propiedad puede optimizarse aun mas a traves de la evolucion dirigida (12) o el diseno racional.
Estos datos indican que las intemas DnaE divididas son altamente divergentes en actividad, a pesar de que todas han evolucionado para catalizar el empalme en trans en sustratos virtualmente identicos. Curiosamente, los restos catalfticos clave involucrados en el empalme se conservan en toda la familia (Figura 5). Por tanto, los restos que afectan la actividad de empalme no son catalfticos y quizas solo se conservan moderadamente. Las mediciones de la actividad relativa pueden facilitar el descubrimiento de caractensticas de secuencia espedficas que diferencian las intemas de actividad alta de las ineficaces. De hecho, el analisis de homologfa de secuencia indica que las intemas con alta actividad son mas homologas entre sf que las intemas de baja actividad. Un valor atfpico significativo para esta observacion es la interna de Aphanothece halophytica (Aha), que a pesar de tener mas del 65 % de identidad de secuencia con las intemas de alta actividad, estaba inactiva con el motivo de C-extema "CFN" de tipo silvestre in vivo. Una inspeccion mas cercana de una alineacion de secuencia multiple indico que esta interna tiene una cistema no catalftica (posicion 120) en lugar de una glicina que de otra manera sena absolutamente conservada (Figura 3a). Ademas, esta posicion esta cerca del sitio activo de interna, donde un nucleofilo adicional puede facilitar reacciones secundarias indeseables (Figura 3b). De manera gratificante, la mutacion de esta cistema a glicina restablecio una alta actividad en la interna Aha mientras que la mutacion inversa destruyo la actividad de empalme de Npu (Figura 3c), validando la capacidad predictiva de estos datos.
Un analisis adicional de la alineacion de la secuencia de interna dividida indico que varias posiciones tienen una fuerte conservacion de aminoacidos entre las intemas de alta actividad, pero divergen para las intemas de baja actividad (Figuras 3a, 6). Estos pueden ser sitios donde las intemas rapidas han retenido interacciones beneficiosas que se han perdido en las lentas. Para analizar esta idea, se eligieron varias posiciones donde esta correlacion secuencia-actividad fue evidente y reemplazo el resto en Ssp con el aminoacido correspondiente encontrado en las intemas rapidas. De acuerdo con esta hipotesis, varias mutaciones puntuales aumentaron la actividad de Ssp in vivo (Figuras 3e). Si bien los roles espedficos de estos restos no estan expftcitamente claros, especialmente dado que se encuentran fuera del sitio activo (Figura 3d), sus ubicaciones en el pliegue interior (14) pueden proporcionar informacion sobre su funcion. Por ejemplo, en la posicion 56, se prefiere un resto aromatico en las intemas de alta actividad. Esta posicion es adyacente al motivo TXXH catalftico conservado (posiciones 69-72), y un resto aromatico puede facilitar las interacciones de empaquetamiento para estabilizar esos restos. De manera similar, se prefiere un glutamato en la posicion 122, proximal a la histidina catalftica 125. El glutamato en la posicion 89 esta involucrado en un grupo de iones mtimos que previamente se demostro que es importante para estabilizar el complejo de interna dividida. (13) Es interesante que, E23 esta lejos del sitio catalftico y no tiene un papel estructural evidente. Esta posicion es posiblemente importante para la estabilidad o la dinamica del pliegue, como se ha observado anteriormente para activar mutaciones puntuales en otras intemas. (15,16)
El descubrimiento de nuevas intemas de empalme en trans rapido tiene amplias implicaciones para la qmmica de protemas. De hecho, el descubrimiento de Npu alimento un resurgimiento en la utilizacion de tecnologfas basadas en intemas divididas. (13,17,18) Si bien ninguna interna individual puede ser ideal para cada esfuerzo de qmmica proteica, la disponibilidad de varias intemas divididas de empalme rapido nuevas puede proporcionar opciones para mejorar la eficacia de la mayona de las aplicaciones de empalme en trans. Por ejemplo, un problema comun al trabajar con intemas divididas es el bajo rendimiento de expresion o la escasa solubilidad de una fusion de fragmentos de interna con una protema de interes. De hecho, los esfuerzos de sobreexpresion y purificacion aqm muestran que las fusiones Ub-IntN e IntC-SUMO tienen rendimientos de expresion soluble notablemente diferentes, dependiendo de la interna. Por tanto, una lista corta de intemas divididas altamente activas con comportamiento variable servira como punto de partida para la optimizacion empftica de una aplicacion de empalme en trans dada.
Ademas, los fragmentos de las diferentes intemas divididas de empalme rapido se pueden mezclar como pares no afines y aun conservan una actividad de empalme altamente eficaz, expandiendo aun mas las opciones disponibles para cualquier aplicacion de empalme en trans. Por ejemplo, la interna dividida del fragmento N de Npu o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Npu o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes que se describen a continuacion. De manera similar, el fragmento N de Ssp o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Ssp o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Aha o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Aha o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Aov o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Aov o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Asp o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Asp o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Ava o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Ava o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Cra(CS5505) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Cra(CS5505) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Csp(CCY0110) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Csp(CCY0110) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Csp(PCC8801) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Csp(PCC8801) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Cwa o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Cwa o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Maer(NIES843) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Maer(NIES843) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Mcht(PCC7420) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Mcht(PCC7420) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Oli o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Oli o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Sel(PC7942) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Sel(PC7942) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Ssp(PCC7002) o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Ssp(PCC7002) o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Tel o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Tel o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; el fragmento N de Ter o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Ter o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion; y el fragmento N de Tvu o variante del mismo puede unirse al fragmento C de Tvu o variante del mismo o cualquiera de los otros fragmentos C de interna dividida o variantes de los mismos que se describen a continuacion.
La tecnologfa basada en intemas mas ampliamente utilizada, la ligacion de protemas expresadas, explota las intemas que actuan como c/s para generar derivados a-tioester de protemas recombinantes. (2) En principio, cualquier interna dividida se puede fusionar artificialmente y luego utilizarse como una interna de empalme en cis en esta aplicacion (1 en la Figura 4a). Las intemas divididas ultrarrapidas son especialmente atractivas en este sentido debido a su velocidad y eficacia. Para analizar esta nocion, se generaron variantes fusionadas artificialmente de Npu, Ava y Mcht con un dominio de ubiquitina N-terminal. Para evitar el empalme, se mutaron a Ala una escision C-terminal prematura o altos niveles no deseados de restos de hidrolisis competitivos Asn137 y Cys+1. Tras la reaccion con el tiol 2-mercaptoetanosulfonato de sodio exogeno (MESNa), las intemas DnaE fusionadas se escindieron rapidamente para generar el a-tioester de ubiquitina, 4, en unas pocas horas (Figuras 4b). Por el contrario, la tiolisis MESNa de la interna MxeGyrA utilizada comunmente no se complete incluso despues de un dfa en condiciones identicas. Las intemas DnaE fusionadas fueron lo suficientemente rapidas para permitir una reaccion de tiolisis en un solo paso y de ligacion qmmica nativa con un peptido fluorescente que contiene cistema N-terminal, 5, para dar la protema semisintetica 6 (Figura 4c). Ademas, estas intemas podnan utilizarse para generar eficazmente los a-tioesteres de otros cuatro dominios de protemas estructuralmente unicos con diferentes restos de aminoacidos C-terminales. Estos resultados demuestran que las versiones fusionadas de las intemas DnaE divididas seran de utilidad general para la semismtesis de protemas.
La rapida tasa de tiolisis observada para las intemas DnaE fusionadas tiene implicaciones mecanicistas y practicas. Sin pretender quedar ligados a teona alguna, una posible explicacion para su reactividad mejorada sobre la interna MxeGyrA es que estas intemas impulsan la reaccion de cambio de acilo N a S de manera mas eficaz, generando una poblacion mas grande de las especies reactivas de tioester lineal 2 (Figura 4a). En general, se piensa que este intermedio tioester esta poblado de manera transitoria en el empalme de protemas y, por lo que sabemos, nunca se ha observado directamente. (1) Sorprendentemente, al analizar las fusiones de interna DnaE-ubiquitina mediante HPLC de fase inversa, se observaron, a menudo, dos picos principales y un tercer pico menor, todos con la misma masa. La abundancia relativa de estas especies podna modularse desplegando las protemas o mediante cambios en el pH, y las dos especies principales se poblaron casi por igual desde pH 4-6 (Figura 4d). Los picos principales corresponden probablemente a la amida precursora, 1, y al tioester lineal, 2, y al pico menor como el intermedio tetraedrico de oxitiazolidina. De manera importante, solo se observo un pico de HPLC para la fusion ubiquitina-MxeGyrA en condiciones identicas. Estas observaciones, junto con las tasas de tiolisis mejoradas, apoyan firmemente la idea de que estas intemas DnaE tienen una union de empalme N-terminal hiperactivada.
Se han caracterizado las actividades de empalme en una familia entera de intemas divididas. El empalme en trans de protemas ultrarrapido puede ser la norma, y no la excepcion, en esta familia. Ademas, las diferentes intemas divididas tienen diferentes grados de tolerancia para las mutaciones de C-extema, lo que sugiere que el empalme de protemas sin rastro se puede lograr mediante el diseno modestamente de cualquier interna altamente activa. Se puede utilizar una comparacion minuciosa de las actividades de una pequena familia de protemas homologas para identificar posiciones no cataltticas importantes que modulan la actividad. Por ultimo, mediante la fusion artificialmente de fragmentos de interna DnaE dividida, se han proporcionado nuevos constructos para la smtesis eficaz de a-tioesteres de protema utilizados en la ligadura de protemas expresadas. Estos resultados guiaran el desarrollo de tecnologfas mejoradas de qmmica de protemas y debenan sentar las bases hacia una comprension mas fundamental de un empalme de protemas eficaz.
Protemas de fusion de fragmento N de interna dividida
En el presente documento se desvelan protemas de fusion de un polipeptido y un fragmento N de interna dividida. Como se utiliza en el presente documento, el termino "polipeptido" se refiere a cualquier polfmero a base de aminoacidos, intercambiable denominado "protema", y puede incluir glicoprotemas y lipoprotemas. En algunos casos, el polipeptido es un polipeptido excretado de una celula (por ejemplo, una celula de mairnfero). En varios casos, el polipeptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo. El polipeptido puede ser cualquier polipeptido de interes de origen natural o sintetico, incluyendo polipeptidos que tengan uno o mas restos de aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos de origen natural.
En algunos casos, el polipeptido tiene un peso molecular de 45 kDa o superior, 50 kDa o superior, 60 kDa o superior, 75 kDa o superior, 100 kDa o superior, 120 kDa o superior o 150 kDa o superior. El polipeptido puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo. En casos de anticuerpos, el fragmento N de interna dividida se puede fusionar con una o ambas de las cadenas pesadas, y/o con una o ambas de las cadenas ligeras. En algunos casos, el polipeptido es una protema secretada de una celula, por ejemplo, una celula de mam êra.
El fragmento N de interna dividida comprende una secuencia como se muestra en la Figura 5, por ejemplo, Npu (SEQ ID NO: 1), Ssp (SEQ ID NO: 2), Aha (SEQ ID NO: 3), Aov (SEQ ID NO: 4), Asp (SEQ ID NO: 5), Ava (SEQ ID NO: 6), Cra(CS505) (SEQ ID NO: 7), Csp(CCY0110) (SEQ ID NO: 8), Csp(PCC8801) (SEQ ID NO: 9), Cwa (SEQ ID NO: 10), Maer(NIES843) (SEQ ID NO: 11), Mcht(PCC7420) (SEQ ID NO: 12), Oli (SEQ ID NO: 13), Sel(PC7942) (SEQ ID NO: 14), Ssp(PCC7002) (SEQ ID NO: 15), Tel (SEQ ID NO: 16), Ter (SEQ ID NO: 17), Tvu (SEQ ID NO: 18), o una variante del mismo. En algunos casos, la secuencia del fragmento N de interna dividida comprende una secuencia distinta de Npu (SEQ ID NO: 1) o Ssp (SEQ ID NO: 2), y en otros casos, comprende una secuencia distinta de Npu (SEQ iD NO: 1), Ssp (SeQ ID NO: 2), o Aha (SEQ ID NO: 3). En algunos casos espedficos, la secuencia del fragmento N de interna dividida comprende una secuencia de Ava (SEQ ID NO: 6), Cra (SEQ ID NO: 7), Csp(PCC8801) (SEQ ID NO: 9), Cwa (SEQ ID NO: 10), Mcht(PCC7420) (SEQ ID NO: 12), Oli (SEQ ID NO: 13), Ter (SEQ ID NO: 17) y Tvu (SEQ ID NO: 18). En algunos casos, el fragmento N de interna dividida tiene una secuencia que comprende una secuencia consenso de SEQ ID NO: 19: (CLSYDTEILTVEYGAVPIGKIVEENIECTVYSVDENGFVYTQPIAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSTIRATKDHKFMTED GEMLPIDEIFEQGLDLKQVKGLPD).
Como se utiliza en el presente documento, una variante de un fragmento N de interna dividida es un fragmento N de interna dividida mutada como se describe en el presente documento que mantiene la actividad del fragmento N de interna dividida (por ejemplo, su capacidad para unirse a un fragmento C de interna dividida y/o catalizar el ataque nucleofilo del polipeptido fusionado a el). Las variantes contempladas de los fragmentos N de interna dividida desvelados en el presente documento incluyen la mutacion de uno o mas restos C, excepto para Cys1, a un resto alifatico, como A, I, L o F, o a un resto S. Una de dichas variantes contempladas es un Npu mutante con Cys28 y Cys59 mutado a Ser, SEQ ID NO: 20 (CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIESTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYSLEDGSLIRATKDHKFMTVDG QMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN).
Fragmentos C de intemas divididas mutados y union a un soporte
Los fragmentos C de interna dividida desvelados en el presente documento se mutan de las secuencias de origen natural para mutar los restos N137 y C+1 en un resto distinto de Asn o Gln para N137 y un resto distinto de Cys para C+1 (s Eq ID NO: 129-146). En algunos casos, las mutaciones en estas dos posiciones son a un resto hidrofobo, por ejemplo, que no contiene un tiol SH (Cys) libre, un acido carboxflico (Asp, Glu) o una base (Arg, His, Lys) u otro grupo no deseado (por ejemplo, Asn, Gln) en la cadena lateral. En varios casos, los dos restos alifaticos mutados pueden ser iguales o diferentes y pueden ser A, V, I, S, M, H, L, F, Y, G o W o pueden ser un resto de aminoacido alifatico no natural (por ejemplo, no codificado por el codigo genetico), como norleucina, acido 2-aminobutmco, norvalina, acido 2-aminopentoico o acido 2-aminohexaanoico (SEQ ID NO: 219-236). Se contemplan espedficamente mutaciones donde ambos restos se seleccionan de A, I, V, L, Y, G y F (SEQ ID NO: 309-326). En varios casos, al menos uno de los dos restos mutados es A.
Por tanto, en el presente documento se proporciona un fragmento C de interna dividida mutado que comprende una mutacion en N137 y Cys+1 de Npu (SEQ ID NO: 129, 147, 165, 183, 201, 219, 237, 255, 273, 291, 309, 327, 345, 363, 381 y 399), Ssp (SEQ ID NO: 130, 148, 166, 184, 202, 220, 238, 256, 274, 292, 310, 328, 346, 364, 382 y 400), Aha (SEQ ID NO: 131, 149, 167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, 293, 311, 329, 347, 365, 383 y 401), Aov (SEQ ID NO: 132, 150, 168, 186, 204, 222, 240, 258, 276, 294, 312, 330, 348, 366, 384 y 402), Asp (SEQ ID NO: 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385 y 403), Ava (SEQ ID NO: 134, 152, 170, 188, 206, 224, 242, 260, 278, 296, 314, 332, 350, 368, 386 y 404), Cra(CS505) (SEQ ID NO: 135, 153, 171, 189, 207, 225, 243, 261, 279, 297, 315, 333, 351, 369, 387 y 405), Csp (CCY0110) (SEQ ID NO: 136, 154, 172, 190, 208, 226, 244, 262, 280, 298, 316, 334, 352, 370, 388 y 406), Csp(PCC8801) (SEQ ID NO: 137, 155, 173, 191, 209, 227, 245, 263, 281,299, 317, 335, 353, 371, 389 y 407), Cwa (SEQ ID NO: 138, 156, 174, 192, 210, 228, 246, 264, 282, 300, 318, 336, 354, 372, 390 y 408), Maer(NIES843) (SEQ ID NO: 139, 157, 175, 193, 211, 229, 247, 265, 283, 301, 319, 337, 355, 373, 391 y 409), Mcht(PCC7420) (SEQ ID NO: 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, 374, 392 y 410), Oli (SEQ ID NO: 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, 375, 393 y 411), Sel(PC7942) (SEQ ID NO: 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394 y 412), Ssp(PCC7002) (SEQ ID NO: 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 305, 323, 341, 359, 377, 395 y 413), Tel (SEQ ID NO: 144, 162, 180, 198, 216, 234, 252, 270, 288, 306, 324, 342, 360, 378, 396 y 414), Ter (SEQ ID NO: 145, 163, 181, 199, 217, 235, 253, 271, 289, 307, 325, 343, 361, 379, 397 and 415), o Tvu (SEQ ID NO: 146, 164, 182, 200, 218, 236, 254, 272, 290, 308, 326, 344, 362, 380, 398 y 416), donde la mutacion en N137 y Cys+1 es un resto hidrofobo de origen natural o no natural. En algunos casos espedficos, al menos una de las mutaciones es A (SEQ ID NO: 183-200, 255-272, 327-344, y 345-416) y en casos mas espedficos, ambas mutaciones son A (SEQ ID NO: 399-416).
Se puede utilizar una variedad de soportes. En general, el soporte solido es un polfmero o sustancia que permite el enlace del fragmento C de interna dividida, opcionalmente a traves de un enlazador. El enlazador puede ser restos de aminoacidos adicionales disenados para el extremo C del fragmento C de interna dividida o pueden ser otros enlazadores conocidos para la union de un peptido a un soporte. Un enlazador contemplado es un peptido pequeno -SGGC (SEQ ID NO: 705), donde el tiol de la Cys C-terminal se puede utilizar para unir el fragmento C de interna dividida al soporte. Por tanto, se contemplan espedficamente los fragmentos C de interna dividida mutados de las secuencias Npu, Ssp, etc. anotadas anteriormente que tienen un enlazador peptfdico -SGGC (SEQ ID NO: 705) (por ejemplo, especificando los restos que comienzan en la posicion N137: AAFN-SGGC) (SEQ ID NO:706). La longitud de un enlazador peptfdico puede modificarse para proporcionar longitudes y flexibilidad variables en cualquier ubicacion individual (por ejemplo, mas de 2 restos de Gly). Tambien sera evidente que el resto del extremo C de un enlazador peptfdico se puede modificar para introducir un grupo funcional reactivo apropiado para unir el fragmento C de interna dividida a una superficie de eleccion (por ejemplo, Lys para reaccionar a traves de una amina, Cys para reaccionar a traves de un tiol, o Asp o Glu para reaccionar a traves de un acido carboxflico). Tambien se contemplan otros restos de aminoacidos no naturales para su uso en un enlazador peptfdico para proporcionar otras fracciones de grupos funcionales para permitir una qrnmica de union diferente del fragmento C a un soporte de interes (por ejemplo, azida, alquinos, carbonilos, amino-oxi, ciano-benzotiazoles, tetrazoles, alquenos, haluros de alquilo). El enlazador puede ser alternativamente un enlazador polimerico.
Sobre la base de un analisis de las secuencias de los fragmentos C de interna dividida altamente activos investigados, procede una secuencia consenso para el fragmento C de interna dividida: SEQ ID NO: 707 (VKIISRQSLGKQNVYDIGVEKDHNFLLANGLIASN), asf como una version mutada en la que el N137 esta mutado a otro que no sea Asn o Gln (SEQ ID NO: 708), o mas espedficamente, N137 se muta a un resto hidrofobo de origen natural o no natural, tal como A, V, I, M, H, L, F, Y, G, S, H o W o pueden ser un resto de aminoacido alifatico no natural (por ejemplo, no codificado por el codigo genetico), como norleucina, acido 2-aminobutmco, nor-valina, acido 2-aminopentanoico o acido 2-aminohexanoico (SEQ ID NO: 709). Las mutaciones contempladas espedficamente en N137 para las secuencias consenso incluyen A, I, V, L, Y, G, y F (SEQ ID NO: 710). Tambien se contempla cuando N137 se muta a A (SEQ ID NO: 711).
Tambien se contemplan variantes de la secuencia consenso que tiene un resto en la posicion 1 que no sea Cys (SEQ ID NO: 712, 716, 720 y 724). Mas espedficamente, la posicion 1 puede ser un resto hidrofobo de origen natural o no natural tal como A, V, I, M, H, L, F, Y, G, S, H o W o pueden ser un resto de aminoacido alifatico no natural (por ejemplo, no codificado por el codigo genetico), como norleucina, acido 2-aminobutmco, nor-valina, acido 2-aminopentanoico o acido 2-aminohexanoico (SEQ ID NO: 713, 717, 721 y 725). Se contemplan espedficamente la mutacion en la posicion 1 que se selecciona de A, I, V, L, Y, G y F (SeQ ID NO: 714, 718, 722 y 726). En varios casos, al menos una de los restos mutados de la secuencia consenso es A (SEQ ID NO: 715, 719 y 723). En algunos casos, la secuencia consenso del fragmento C tiene ambas mutaciones como Ala (SEQ ID NO: 727). Ademas, se contempla una secuencia consenso que comprende FN en las posiciones 2 y 3 (SEQ ID NO: 728­ 743). Tambien se contempla una secuencia consenso que comprende un enlazador peptfdico para unirse a un soporte solido, y un ejemplo es -SGGC en las posiciones 4-+7 (sEq ID NO: 744-759).
El fragmento C de interna dividida o variante del mismo, como se desvela en el presente documento, puede unirse a un soporte solido a traves de un enlazador. En varios casos, el enlazador es un polfmero, que incluye, pero no de forma limitativa, a un polfmero soluble en agua, un acido nucleico, un polipeptido, un oligosacarido, un hidrato de carbono, un lfpido o combinaciones de los mismos. No es importante cual es la estructura qmmica del enlazador, ya que sirve principalmente como un enlazador. El enlazador debe elegirse para no interferir con la actividad del fragmento C. El enlazador puede estar formado por aminoacidos unidos entre sf mediante enlaces peptidicos. Por tanto, en algunos aspectos, el enlazador comprende Yn, en el que Y es un aminoacido de origen natural o un esteroisomero del mismo y "n" es uno cualquiera de 1 a 20. El enlazador, por lo tanto, puede estar formado por 1 a 20 aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos, en el que los aminoacidos se seleccionan entre los 20 aminoacidos de origen natural. En algunos casos, los 1 a 20 aminoacidos se seleccionan de Gly, Ala, Ser, Cys. En algunos casos, el enlazador esta formado por una mayona de aminoacidos que no tienen impedimentos estericos, como Gly.
Tambien son posibles enlazadores no peptfdicos. Por ejemplo, se pueden utilizar enlazadores de alquilo tales como --HN-(CH2)s-CO--, en donde s = 2-20. Estos enlazadores de alquilo pueden estar ademas sustituidos por cualquier grupo que no sea estericamente obstaculizado, tal como alquilo inferior (por ejemplo, C-i-Ca), halogeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2 , fenilo, etc.
Otro tipo de enlazador no peptfdico es un grupo de polietilenglicol, tal como: --HN-(CH2)2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CO, en el que n es tal que el peso molecular total del enlazador vana de aproximadamente 101 a 5000, preferentemente de 101 a 500.
En algunos casos, el enlazador tiene una longitud de aproximadamente 0-14 subunidades (por ejemplo, aminoacidos).
En los casos en que el enlazador es un polinucleotido, la longitud del enlazador en varios aspectos es de al menos aproximadamente 10 nucleotidos, 10-30 nucleotidos, o incluso mas de 30 nucleotidos. En diversos aspectos, las bases del enlazador polinucleotfdico son todas adeninas, todas tirinas, todas citidinas, todas guaninas, todas uracilos o todas las otras bases modificadas.
En otro aspecto, un enlazador no nucleotfdico desvelado comprende un nucleotido basico, polieter, poliamina, poliamida, peptido, hidrato de carbono, lfpido, polihidrocarburo, u otros compuestos polimericos. Incluyen ejemplos espedficos aquellos descritos por Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353 and Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585 y Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301; Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al., publicacion internacional n.° WO 89/02439; Usman et al., publicacion internacional n.° WO 95/06731; Dudycz et al., publicacion internacional WO 95/11910 y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000. Un "no nucleotido" significa ademas cualquier grupo o compuesto que pueda incorporarse en una cadena de acido nucleico en lugar de una o mas unidades de nucleotidos, incluidas las sustituciones de azucar y/o fosfato, y permite que las bases restantes muestren su actividad enzimatica. El grupo o compuesto puede ser abasico porque no contiene una base de nucleotidos comunmente reconocida, como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, por ejemplo, en la posicion C1 del azucar.
En diversos aspectos, los enlazadores contemplados incluyen polfmeros lineales (por ejemplo, polietilenglicol, polilisina, dextrano, etc.), polfmeros de cadena ramificada (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.289.872 para Denkenwalter et al., publicada el martes, 15 de septiembre de 1981; la 5.229.490 para Tam, publicada el martes, 20 de julio de 1993; el documento WO 93/21259 de Frechet et al., publicado el 28 de octubre de 1993); lfpidos; grupos de colesterol (como un esteroide); o hidratos de carbono u oligosacaridos. Otros enlazadores incluyen uno o mas anexos de polfmeros solubles en agua, tales como polioxietilenglicol o polipropilenglicol como se describe en las patentes de Estados Unidos numeros: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. Otros polfmeros utiles como enlazadores conocidos en la tecnica incluyen monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polfmeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolfmeros de propilenglicol, un copolfmero de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivimlico, asf como mezclas de estos polfmeros.
En otros aspectos mas, se contemplan oligonucleotidos tales como poli-A o polfmeros hidrofilos o anfifflicos como enlazadores, que incluyen, por ejemplo, anfffilos (incluyendo oligonucleotidos).
Los soportes solidos contemplados incluyen resinas, partfculas y perlas. Los soportes solidos mas espedficos incluyen polfmeros polihidroxilados, por ejemplo, a base de polisacaridos, tales como agarosa, dextrano, celulosa, almidon, pullulan o similares, y polfmeros sinteticos, tales como amida poliacnlica, amida polimetacnlica, poli(hidroxialquilvinil eteres), poli(hidroxialquilacrilatos) y polimetacrilatos (por ejemplo, poliglicidilmetacrilato), alcoholes polivimlicos y polfmeros basados en estirenos y divinilbencenos, y copolfmeros en los que se incluyen dos o mas de los monomeros correspondientes a los polfmeros mencionados anteriormente. Los soportes solidos espedficos contemplados incluyen agarosa, sefarosa, celulosa, poliestireno, polietilenglicol, agarosa derivatizada, acrilamida, sefadex, sefarosa, polietilenglicol (PEG)-acrilamida y soportes a base de poliestireno-PEG. En algunos casos, el soporte solido puede ser una resina como la resina de p-metilbenzhidrilamina (pMBHA) (Peptides International, Louisville, Ky.), poliestirenos (por ejemplo, resina PAM obtenida de Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), que incluye clorometilpoliestireno, hidroximetilpoliestireno y aminometilpoliestireno, poli (dimetilacrilamida) y estireno co-divinil-benceno injertado (por ejemplo, resina POLYHIPE, obtenida de Aminotech, Canada), resina de poliamida (obtenida de Peninsula Laboratories), resina de poliestireno injertada con polietilenglicol (por ejemplo, TENTAGEL o ARGOGEL, Bayer, Tubingen, Alemania) resina de polidimetilacrilamida (obtenida de Milligen/Biosearch, California) o Sepharose (Pharmacia, Suecia). En diversos aspectos, el soporte solido puede ser una perla magnetica, un portaobjetos de vidrio, una perla de vidrio, o una partmula de metal o inorganica (por ejemplo, oro, sflice, hierro o mezclas de los mismos ).
Metodos de purificacion y modificacion de polipeptidos
La modificacion de protemas espedfica del sitio es una herramienta inestimable para estudiar los detalles moleculares de la funcion de protemas (19). Por otra parte, su potencial para el descubrimiento y desarrollo de terapias de protemas tambien se ha reconocido recientemente (20). Se han desarrollado varios metodos a lo largo de los anos para generar protemas modificadas espedficamente para el sitio; uno de los mas utilizados es la ligadura de protemas expresadas (EPL), que se ha aplicado a muchas protemas diferentes en diversos estudios para abordar cuestiones fundamentales de la funcion de las protemas. La EPL se describio por primera vez en 1998 (21), como una expansion a protemas recombinantes de ligadura qmmica nativa (NCL, de sus siglas en ingles) (19,22), y consiste en la reaccion entre un a-tioester de protema recombinante C-terminal con un peptido sintetico que contiene una Cys en su extremo N a traves de la formacion de un nuevo enlace peptfdico nativo entre los dos fragmentos. La naturaleza sintetica del peptido que contiene Cys permite la incorporacion de casi cualquier modificacion qmmica en la protema de interes.
Para aplicar EPL a cualquier protema dada, la generacion de tioesteres C-terminales de protemas con buenos rendimientos y alta pureza es un requisito absoluto. Se ha utilizado una familia de enzimas de rotacion unica, llamadas intemas, desde los albores de la EPL para la generacion de tales tioesteres. Las intemas son capaces de catalizar el empalme de protemas, una modificacion postraduccional que se produce de forma natural mediante la cual se escinden del polipeptido en el que estan incrustadas, formando concomitantemente un nuevo enlace peptfdico entre sus regiones de protemas flanqueantes (23). De manera importante, esta reaccion se produce a traves de varios a-tioesteres de protema, que pueden atraparse a traves de una reaccion de trans-tioesterificacion con un tiol exogeno.
Las intemas, como GyrA o VMA, se han aprovechado con exito para preparar una amplia variedad de tioesteres de protemas. Con el fin de aislar los tioesteres de protema deseados, las intemas se fusionan generalmente con marcadores de afinidad, como el dominio bidireccional de quitina o el marcador hexa-His. Sin embargo, a pesar del notable exito de esta estrategia, las condiciones de reaccion requeridas para la tiolisis eficaz (agentes reductores, gran concentracion de tioles y largos tiempos de incubacion) afectan el rendimiento de dichos marcadores y, a menudo, se requieren etapas de purificacion adicionales posteriores para obtener el producto puro deseado para la ligadura (24-26). Por otra parte, dependiendo de la identidad del resto C-terminal de la protema de interes, pueden ocurrir niveles significativos de escision prematura in vivo, reduciendo significativamente el rendimiento del producto final.
Un sistema ideal debena combinar las capacidades de formacion de tioester de las intemas con una estrategia de purificacion por afinidad (totalmente compatible con las condiciones de reaccion de la tiolisis) y reducir el riesgo de escision prematura. Naturalmente, se investigaron las intemas divididas, que pueden realizar una reaccion analoga al empalme de protemas, pero en la que la propia interna se divide en dos polipeptidos diferentes. Cada uno de los dos fragmentos de interna son completamente inactivos por sf mismos, pero tienen una fuerte afinidad entre sf y, al unirse, adoptan su conformacion activa competente de empalme y son capaces de llevar a cabo el empalme en trans de la protema. Recientemente, se ha informado una version dividida artificialmente de la protema DnaB para la purificacion de protemas no modificadas (27). Por tanto, se proporciona una estrategia de purificacion utilizando intemas naturalmente divididas en su lugar y para aprovecharlas para la purificacion en un solo paso y la generacion de a-tioesteres de protema recombinantes (Figura 7) directamente de los lisados celulares.
Debido a las cineticas de reaccion extremadamente rapida de las intemas naturalmente divididas, se introdujeron varias mutaciones para permitir la formacion eficaz de tioester y minimizar las reacciones de escision in vivo e in vitro no deseadas. De manera espedfica, tanto los restos cataltticos C-terminal de C-intemas Asn137 como Cys+1 tuvieron que mutarse a Ala para prevenir la escision prematura del extremo C y N, respectivamente. Tambien se espera que la mutacion a dos restos alifaticos secuenciales, naturales o no naturales, produzca resultados comparables como la mutacion AA. En los metodos de purificacion y/o modificacion descritos se pueden utilizar otros fragmentos C de interna dividida mutados, como se describio anteriormente, y se contemplan espedficamente.
Para desarrollar una estrategia de purificacion y formacion de tioester basada en intemas divididas, se eligio la interna dividida Npu, que es una de las intemas divididas DnaE mas rapidas conocidas previamente [10]. Inicialmente, la capacidad de la Npu dividida para generar tioesteres de protemas en solucion se probo mezclando la protema modelo ubiquitina fusionada a NpuN con un NpuC mutante (Asn137 y Cys+1 a Ala) en presencia (y ausencia) del tiol MESNa. El analisis de SDS PAGE, HPLC y MS de las reacciones mostro la formacion del atioester C-terminal de ubiquitina deseado en unas pocas horas. Alentado por estos resultados, se diseno una estrategia de purificacion por afinidad basada en la inmovilizacion covalente del mutante de interna NpuC en un soporte solido. La NpuC mutada inmovilizada se podna utilizar luego para purificar protemas marcadas con NpuN a partir de mezclas complejas y la adicion de un tiol exogeno escindina el a-tioester de protema deseado, que se eluina de la columna en una forma altamente purificada. Otros fragmentos N de interna dividida, como se describe anteriormente, se pueden utilizar en los metodos desvelados en el presente documento, y se contemplan espedficamente.
Se preparo un mutante NpuC (Asn137 y Cys+1 mutado a Ala, NpuC-AA (SEQ ID NO: 777) con un resto Cys en el extremo C de su C-extema, que se utilizo para inmovilizar el peptido en un resina de yodoacetilo. Con la resina de afinidad NpuC-AA en la mano, se demostro que varios a-tioesteres de protema C-terminal (Ubiquitina, MBP, PHPT1) podfan producirse y purificarse facilmente a partir de lisados celulares (Figura 8). El analisis de HPLC y MS confirmo la formacion de los tioesteres de protemas deseados con niveles muy bajos de hidrolisis no deseada (Figura 9). Los rendimientos de recuperacion variaron entre el 75 y 95 % y la resina NpuC-AA tema una capacidad de carga constante de 3-6 mg de protema por ml.
La utilidad de los derivados de a-tioester de Ub, MBP y PHPT1 obtenidos de la columna se demostro ligando cada uno de ellos a un peptido fluorescente que contema Cys N-terminal (CGK(Fl)) para obtener los productos semisinteticos correspondientes en excelente rendimiento (Figura 13). De manera importante, se pueden llevar a cabo reacciones de tiolisis/ligamiento en un solo paso, que proporcionan una protema modificada espedficamente para el sitio directamente de los lisados celulares sin aislar el tioester intermedio (Figura 14).
Una preocupacion cuando se trabaja con intemas divididas (y tambien intemas) es el efecto de las secuencias de aminoacidos flanqueantes en la actividad de empalme y/o tiolisis. Aunque la union N-terminal se considera mas tolerante a las desviaciones de los restos de N-extema nativos, fue importante evaluar el efecto que tendna el aminoacido C-terminal de la protema de interes (resto -1 de acuerdo con las convenciones de numeracion de intemas) en los rendimientos de la formacion de tioesteres. Se construyo una biblioteca completa de protemas de fusion Ub-X-NpuN donde el resto (X) de Ub C-terminal se vario de su Gly nativo a todos los otros 19 aminoacidos proteinogenicos. Las protemas se expresaron en E. coli y lisados celulares, se aplicaron a la resina de afinidad NpuC-AA y se purificaron. Los rendimientos de protema se estimaron a partir del analisis SDS PAGE para cada purificacion y los niveles de hidrolisis de analisis MS y RP-HPLC de las fracciones de elucion (Figura 10). Los resultados muestran tendencias similares a las conocidas para intemas no divididas, como GyrA (29), y la mayona de los aminoacidos muestran altos rendimientos de escision despues de la incubacion durante la noche con MESNa, con las excepciones Pro y Glu, para las cuales la recuperacion fue del 49 y 50 %, respectivamente. Como cada esperar, el a-tioester de Asn no pudo aislarse debido a la reaccion bien conocida de su cadena lateral con el atioester adyacente para formar una succinimida.
Esta estrategia de purificacion fue muy exitosa para la purificacion de varias protemas solubles en condiciones nativas. Sin embargo, los fragmentos de protemas requeridos para la EPL a veces sufren de escasa solubilidad y alta toxicidad y tienden a acumularse en los cuerpos de inclusion celulares durante la expresion. Se ha demostrado que la interna dividida Npu conserva un nivel significativo de actividad en presencia de desnaturalizantes (28), lo que sugiere que esta estrategia sena compatible en tales condiciones. Usando el modelo de fusion de protemas Ub-NpuN, se confirmo que, tanto la union a la resina NpuC-AA como la formacion de tioester, funcionaban bien en presencia de urea 2 y 4 M. Se obtuvieron niveles similares de ambos, union y tiolisis, que en ausencia de desnaturalizante y las mismas condiciones de reaccion.
A continuacion se probo el sistema para la purificacion a partir de cuerpos de inclusion de un fragmento de la histona H2B. La preparacion de histonas modificadas espedficamente para el sitio utilizando EPL es un tema de gran interes debido a su papel crucial en la comprension de la regulacion epigenetica. Sin embargo, los fragmentos de histonas tienen un comportamiento notablemente deficiente y la preparacion de sus a-tioesteres C-terminales recombinantes es particularmente diffcil. Un fragmento H2B (1-116) fusionado a NpuN se expreso en E. coli y los cuerpos de inclusion se extrajeron con urea 6 M. La fusion H2B-NpuN se diluyo posteriormente en un tampon de urea 3 M y el correspondiente a-tioester C-terminal generado concomitante con la purificacion sobre la resina de afinidad NpuC-AA (Figura 11). Debido a su tendencia a la agregacion, las soluciones de protemas muy diluidas se unieron mas eficazmente a la resina, y tambien se requirieron tiempos de reaccion mas largos para la generacion eficaz del tioester, obviamente, estos son parametros que debenan optimizarse en una protema a base de protemas. Usando estas condiciones, se obtuvo tioester C-terminal H2B (1-116) con excelente pureza (> 90 % mediante RP-HPLC) y rendimiento aislado (~ 20 mg por l de cultivo). Esto representa una mejora significativa con respecto a los protocolos anteriores que producen menos protema (4 mg por l de cultivo) y requieren el uso de multiples etapas de purificacion cromatografica, incluida la RP-HPLC. De manera importante, el tioester H2B(1-116)-MES obtenido de la columna IntC se puede utilizar directamente en reacciones de EPL sin purificacion adicional. Por consiguiente, la protema se ligo con exito a un peptido H2B sintetico (117-125) que contema una Lys acetilada en la posicion 120 para producir H2B-K120Ac semisintetico (Figura 15).
El potencial de esta estrategia de purificacion de la formacion de tioesteres se demostro mediante la aplicacion a la modificacion espedfica del sitio de un anticuerpo monoclonal. Por tanto, se contempla espedficamente un metodo para purificar un anticuerpo mediante la utilizacion de una protema de fusion de un anticuerpo y un fragmento N de interna dividida como se desvela en el presente documento y un fragmento C de interna dividida mutado como se describe en el presente documento.
La modificacion de los anticuerpos es un campo de investigacion intensa, especialmente centrado en el desarrollo de conjugados de anticuerpos y farmacos terapeuticos (30). La identidad de la N-intema podna tener un efecto significativo en los niveles de expresion de su fusion a una protema de interes dada. El fragmento N de varias de las intemas DnaE divididas mas rapidas reaccionaron de forma cruzada con NpuC, lo que permite utilizar cualquiera de ellas con la misma columna de afinidad basada en NpuC. Por consiguiente, los niveles de expresion de un anticuerpo modelo (aDEC, anticuerpo contra el receptor DEC205) se analizaron y encontraron que los niveles mas altos de expresion se obtuvieron cuando aDEC se fusiono con la interna AvaN (Figura 12A). Las fusiones aDEC-AvaN se transfectaron en celulas 293T y, despues de 4 dfas de cultivo, los sobrenadantes se recogieron y se purificaron sobre la columna NpuC-AA. La presencia de un tioester C-terminal en el aDEC purificado se confirmo mediante su reaccion con un peptido fluorescente corto con un resto Cys N-terminal (Figura 12B y C). Se utilizo MS del conjugado aDEC-fluoroforo desglicosilado y reducido para confirmar su identidad y SEC-MALS demuestra que el producto fue monodisperso y del tamano esperado para un anticuerpo IgG.
Las intemas divididas pueden disenarse para la preparacion de a-tioesteres de protema y que la fuerte afinidad entre los dos fragmentos de interna dividida proporciona un mango poderoso para su purificacion. La generalidad del enfoque se demuestra al utilizarlo para generar tioesteres altamente puros de protemas tanto solubles (ubiquitina, MBP, PHPT) e insolubles (fragmento H2B) como de anticuerpos monoclonales (aDEC). Por otra parte, varias N-intemas se pueden analizar para niveles de expresion optimos de la protema de interes y utilizarse con una sola columna NpuC.
Por tanto, las intemas divididas desveladas en el presente documento se pueden utilizar para purificar y modificar un polipeptido de interes. Se proporciona un polipeptido de interes en una protema de fusion con un fragmento N de interna dividida, por ejemplo, a traves de metodos de protema recombinante bien conocidos. La protema de fusion luego se pone en contacto con un fragmento C de interna dividida correspondiente en condiciones que permiten la union del fragmento N y el fragmento C para formar un intermedio de interna. El fragmento C de interna dividida se puede unir a un soporte (por ejemplo, un soporte solido como una resina) o posteriormente (por ejemplo, despues de unirse al fragmento N de interna dividida para formar el intermedio de interna) puede unirse a un soporte. Esto permite la eliminacion mediante el lavado de los componentes que estaban en la mezcla debido a la smtesis de protemas recombinantes, lo que permite que la protema de fusion se aisle de los otros componentes. Los lavados pueden incluir detergentes, agentes desnaturalizantes y soluciones salinas (por ejemplo, NaCl).
Despues, el intermedio de interna se puede hacer reaccionar con un nucleofilo para liberar el polipeptido de interes de las intemas de los fragmentos N y C unidos en donde el extremo C del polipeptido se modifica por la adicion del nucleofilo. El nucleofilo puede ser un tiol para obtener el polipeptido como un a-tioester, que a su vez puede modificarse aun mas, por ejemplo, con un nucleofilo diferente (por ejemplo, un farmaco, un polfmero, otro polipeptido, un oligonucleotido) o cualquier otra fraccion utilizando la bien conocida qmmica del a-tioester para la modificacion de protemas en el extremo C. Una ventaja de esta qmmica es que solo el extremo C se modifica con un tioester para una modificacion adicional, permitiendo asf una modificacion selectiva solo en el extremo C y no en ningun otro resto acido en el polipeptido.
El nucleofilo que se usa en los metodos desvelados en el presente documento con el intermedio de interna o como un nucleofilo posterior que reacciona con, por ejemplo, un a-tioester, puede ser cualquier compuesto o material que tenga una fraccion nucleofila adecuada. Por ejemplo, para formar un a-tioester, una fraccion tiol se contempla como el nucleofilo. En algunos casos, el tiol es un 1,2-aminotiol o un 1,2-aminoselenol. Un a-selenotioester se puede formar usando un selenotiol (R-SeH). Los nucleofilos alternativos contemplados incluyen aminas (es decir, aminolisis para dar amidas directamente), hidrazinas (para dar hidrazidas), grupos amino-oxi (para dar acidos hidroxamicos). De manera adicional, el nucleofilo puede ser un grupo funcional dentro de un compuesto de interes para la conjugacion con el polipeptido de interes (por ejemplo, un farmaco para formar un conjugado protema-farmaco) o, como alternativa, podna llevar un grupo funcional adicional para las siguientes reacciones bioortogonales conocidas, tales como una azida o un alquino (para una reaccion qmmica de clic entre los dos grupos de funciones para formar un triazol), un tetrazol, un a-cetoacido, un aldeddo o cetona, o un cianobenzotiazol.
Los aspectos y detalles adicionales de la invencion seran evidentes a partir de los siguientes ejemplos, que pretenden ser ilustrativos en lugar de limitativos.
Ejemplos
Materiales
Todas las sales tamponantes, isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) se adquirieron de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Kanamicina sulfato (Kan), p-Mercaptoetanol (BME), DL-ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanosulfonato de sodio (MESNa), etanoditiol (EDT), Coomassie azul brillante, N,N-dimetilformamida (DMF), Tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (Pd(PPh3)4), fenilsilano, triisopropilsilano (TIS), dietilditiocarbamato sodico trihidrato y 5(6)-carboxifluorescema se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se adquirio de Thermo Scientific (Rockford, IL). Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH y Boc-Cys(Trt)-OH se adquirieron de Novabiochem (Laufelfingen, Suiza). La piperidina se adquirio de Alfa Aesar (Ward Hill, Ma). El diclorometano (DCM) y la resina de amida de Rink se adquirieron de EMD Chemicals (Billerica, MA). El hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) se adquirio de AnaSpec (Fremont, Ca). El acido trifluoroacetico (TFA) se adquirio de Halocarbon (North Augusta, SC). Los comprimidos inhibidores de proteasa completos se adquirieron de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). La resina de acido mquel-nitrilotriacetico (Ni-NTA) fue de Novagen (Gibbstown, NJ). El kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange XL II fue de Agilent (La Jolla, CA). DpnI y el kit de PCR Phusion de alta fidelidad fueron de New England Biolabs (Ipswich, MA). Los kits de purificacion de ADN (QIAprep spin minikit, kit de extraccion de gel QIAquick, kit de PCR de purificacion QIAquick) fueron de Qiagen (Valencia, CA). Las celulas competentes DH5^ de eficacia de subclonacion y E. coli qmmicamente competente One Shot BL21(DE3) se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se utilizaron para generar lmeas celulares de alta competencia "internas". Los oligonucleotidos se adquirieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Los nuevos genes de interna se generaron sinteticamente y se adquirieron de GENEWIZ (South Plainfield, NJ). Todos los plasmidos utilizados en este estudio fueron secuenciados por GENEWIZ.
Los geles Bis-Tris Criterion XT (12 %), la membrana de PVDF de inmunotransferencia (0,2 pm) y el concentrado de colorante reactivo de Bradford se adquirieron de Bio-Rad (Hercules, CA). Se adquirio tampon MES-SDS 20x de Boston Bioproducts (Ashland, MA). El anticuerpo monoclonal anti-myc de raton (a-myc) se adquirio de Invitrogen (Carlsbad, CA). El anticuerpo monoclonal de raton Anti-marcador His, clon HIS.H8 (a-His6) se adquirio de Millipore (Billerica, MA). El anticuerpo monoclonal HA.11 de raton (a-HA) se adquirio de Covance (Princeton, NJ). El anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de raton IRDye 800CW (Licor mouse 800) y el tampon de bloqueo Licor se adquirieron de LI-COR Biotechnology (Lincoln, NE).
Equipo
La cromatograffa de exclusion por tamano se llevo a cabo en un sistema AKTA FPLC de GE Healthcare. Tanto la FPLC preparativa como la analttica se llevaron a cabo en una columna Superdex 75 10/300 o S200 10/300. Para todas las ejecuciones, las protemas se eluyeron en 1,35 volumenes de columna de tampon (caudal: 0,5 ml/min). La RP-HPLC analftica se realizo en los instrumentos de las series Hewlett-Packard 1100 y 1200 equipados con una columna Vydac C18 (5 pm, 4,6 x 150 mm) a un caudal de 1 ml/min. La RP-HPLC preparativa se realizo en un sistema LC de preparacion Waters compuesto por un modulo de gradiente binario Waters 2545 y un detector UV Waters 2489. Las purificaciones se llevaron a cabo en una columna C18 Vydac 218TP1022 (10 pM; 22 x 250 mm). Todas las ejecuciones utilizaron TFA al 0,1 % (acido trifluoroacetico) en agua (disolvente A) y acetonitrilo al 90 % en agua con TFA al 0,1 % (disolvente B). Para todas las ejecuciones, un penodo isocratico de dos minutos en las condiciones iniciales fue seguido por un gradiente lineal de 30 minutos al aumentar la concentracion del tampon B. El analisis espectrometrico de masas por ionizacion por electropulverizacion (ESI-MS) se realizo en un espectrometro de masas Micrukof-Q II de Bruker Daltonics. Los ensayos de actividad de internas in vivo se llevaron a cabo en un lector de microplacas sintonizable VersaMax de Molecular Devices. Las celulas se lisaron utilizando un S-450D Branson Digital Sonifier. Las transferencias de Western y los geles de ensayo de empalme in vitro tenidos con coomassie se obtuvieron en una camara de imagenes de infrarrojos LI-COR Odyssey. Se tomaron imagenes de geles fluorescentes que conteman fluorescema utilizando el generador de imagenes GE ImageQuant LAS 4000.
Recopilacion de la biblioteca de secuencias DnaE y analisis de secuencias
Las secuencias de protemas de las internas DnaE divididas se obtuvieron de NEB InBase1. Esta lista constaba de 23 entradas a partir de mayo de 2011. De estas entradas, dos se descartaron del estudio ya que no teman una secuencia de C-intema: Csp(PCC7822) y Nosp(CCY9414). Dos pares de internas teman secuencias identicas: Nsp(PCC7120) con Asp (probablemente son el mismo organismo con dos nombres diferentes) y Sel(PCC6301) con Sel(PC7942). Por tanto, Nsp(PCC7120) y Sel(PCC6301) se eliminaron de la biblioteca. Las secuencias de las C-intemas Mcht(PCC7420) y Oli fueron identicas, pero ambas internas se mantuvieron en la biblioteca ya que sus secuencias de N-intemas fueron diferentes. En InBase, la interna Aov tema una "X" en la posicion 87 en lugar de una isoleucina (I) absolutamente conservada, por lo que se utilizo 187 en esta posicion. El plasmido para los ensayos de resistencia a kanamicina que contienen la interna Csp(PCC7424) demostro ser inestable y produjo resultados altamente variables; por lo tanto esta interna fue excluida de los analisis. La biblioteca final contema 18 internas, Tabla 1.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Dada la alta homologfa de las secuencias de interna DnaE, las intemas N y C se alinearon manualmente utilizando el software de alineacion multiple Jalview2. Todas las secuencias de N-intema se "justificaron a la izquierda" para alinear el primer resto de cistema, y la region variable de la cola de N-intema no se alineo. Todas las secuencias de C-intema se "justificaron a la derecha" para alinear la asparagina C-terminal. La numeracion de restos utilizada en este estudio se basa en la numeracion de la estructura de NMR de una interna Npu fusionada (codigo PDB 2KEQ). Por tanto, la region variable de la cola de N-intema despues del resto 102 (el ultimo resto de NpuN) se excluye de la numeracion, como lo es la metionina N-terminal de la C-intema. La numeracion de C-intema comienza en 103, excepto para las intemas Tel y Tvu, que tienen un hueco en esta posicion y comienzan en 104. Para los logotipos de secuencia (Figura 6), las alineaciones de N y C-intema se separaron en dos alineaciones basadas en actividad alta y baja. Los logotipos de secuencias de alta actividad estaban formados por Cwa, Cra(CS505), Csp(PCC8801), Ava, Npu, Csp(CCY0l10), Mcht(PCC7420), Maer(NIES843), Asp, Oli y Aha (que se incluyeron en funcion de la alta actividad del mutante C120G). Los logotipos de secuencias de baja actividad estaban formados por Aov, Ter, Ssp(PCC7002), Tvu, Tel, Ssp, y Sel(PC7942). Los logotipos de secuencia fueron generados usando WebLogo. (4) Los mapas de calor se generaron utilizando el programa estadfstico de estadfstica y graficos "R".
Clonacion de plasmidos para seleccion in vivo
Los fragmentos del gen aminoglucosido fosfotransferasa (KanR) y Npu se clonaron en un vector pBluescript KS (+) entre los sitios de restriccion Kpnl y SacI como se describio anteriormente (36,37). Este constructo contema la siguiente arquitectura:
[promotor KanR]-[RBS]-[myc-KanRN]-[IntN]-[iRBS]-[IntC]-[CFN-KanRC] donde el promotor KanR es el promotor constitutivo que se encuentra en la mayona de los plasmidos resistentes a Kanamicina, RBS es un sitio de union ribosomal de E. coli comun, iRBS es un sitio de union ribosomal intermedio precedido por un enlazador, myc codifica un marcador de epftopo c-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 760), KanRN y KanRC son fragmentos de la protema KanR, e IntN y IntC son fragmentos de interna dividida. Tambien se construyo un plasmido Ssp analogo como se describio anteriormente (36,37). Estos plasmidos se conocen como myc-KanR-NpuDnaE-Split y myc-KanR-SspDnaE-Split. Para generar los vectores de seleccion para las restantes intemas divididas, los genes sinteticos se disenaron y adquirieron de GENEWIZ que contiene la siguiente arquitectura:
[saliente 5']-[IntN]-[iRBS]-[IntC]-[saliente 3'] donde los salientes 5'y 3' fueron las 39 pb exactas encontradas cadena arriba de NpuN y las 25 pb encontradas cadena abajo de NpuC, respectivamente, en el plasmido myc-KanR-NpuDnaE-Split. Para todas las intemas, las secuencias de genes compradas se optimizaron con codones con la tabla de uso de codones de E. coli predeterminada generada en base a todas las secuencias de codificacion de E. coli en GenBank8. Los genes sinteticos fueron recibidos en vectores pUC57.
Para clonar los plasmidos de seleccion, se amplifico todo el gen sintetico con polimerasa Phusion de alta fidelidad utilizando cebadores de recocido a los salientes 5' y 3'. El megacebador resultante se inserto en el plasmido myc KanR en lugar de Npu mediante PCR de superposicion con polimerasa Phusion (39). Esto dio como resultado 18 plasmidos homologos que conteman esqueletos, promotores y genes KanR identicos, pero con diferentes genes de interna optimizados con codones. Los plasmidos se denominan como: myc-KanR-XyzDnaE-Split (donde Xyz indica el nombre de la interna como se indica en la Tabla 1). Se realizaron mutaciones puntuales espedficas a varias intemas utilizando un kit de mutagenesis dirigida al sitio de QuikChange con el protocolo estandar recomendado.
Seleccion in vivo de las actividades relativas de interna
Ensayo en placa de 96 pocillos: Los ensayos de resistencia a kanamicina (KanR) acoplada a actividad de interna se realizaron en un formato de placa de 96 pocillos como se describio anteriormente (36,37). Normalmente, los plasmidos se transformaron en 15 pl de celulas DH5a de eficacia de subclonacion mediante choque termico, y las celulas transformadas se cultivaron durante 18 horas a 37 °C en 3 ml de medio Luria-Bertani (LB) con 100 pg /ml de ampicilina (LB/amp). Los cultivos de una noche se diluyeron 250 veces en soluciones LB/amp que conteman 8 concentraciones diferentes de kanamicina (150 pl por cultivo). Las celulas se cultivaron a 30 °C en una placa de 96 pocillos, controlando la densidad optica (DO) a 650 nm cada 5 minutos durante 24 horas mientras se agitaba durante un minuto antes de cada medicion. El punto final de esta curva de crecimiento (normalmente en la fase estacionaria) se represento en funcion de la concentracion de kanamicina para visualizar la relacion dosis-respuesta y se ajusto a una ecuacion de dosis-respuesta de pendiente variable para determinar los valores de CI50.
Figure imgf000015_0001
En cada analisis de regresion, normalmente tres o cuatro curvas independientes de respuesta a la dosis se ajustaron colectivamente a la ecuacion anterior utilizando el software GraphPad Prism. En cada ajuste, DOMin se fijo a la absorbancia de fondo a 650 nm, y se permitio que todos los demas parametros variaran. Las barras de error informadas para los graficos de barras CI50 (Figura 1b) representan el error estandar en el valor CI50 de mejor ajuste de tres o cuatro curvas de dosis-respuesta de ajuste colectivo.
Analisis de transferencia Western del empalme in vivo: Para los analisis de transferencia Western, las celulas DH5a se transformaron con los plasmidos del ensayo de forma identica a la configuracion de la placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 18 horas a 37 °C mientras se agitaban. Los cultivos durante la noche se utilizaron para inocular 3 ml de LB/amp fresco a una dilucion de 1:300, y las celulas se incubaron a 30 °C durante 24 horas. Las DO de los cultivos a 30 °C se midieron a 650 nm para evaluar los niveles bacterianos relativos, luego se transfirieron 150 pl de cada cultivo a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 17.000 rcf durante 2 minutos. El sobrenadante se retiro por aspiracion, y los sedimentos celulares se resuspendieron/lisaron en ~ 200 pl de colorante de gel de SDS 2x que contema BME al 4 % (los volumenes de resuspension se variaron ligeramente para normalizar las diferencias en DO). Las muestras se hirvieron durante 10 minutos, luego se centrifugaron a 17.000 rcf durante 1 minuto. Cada muestra (5 pl) se cargo en un gel de Bis-Tris al 12 % y se corrio en un tampon de ejecucion MES-SDS. Las protemas se transfirieron a la membrana de PVDF en un tampon de transferencia de Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 15 %) a 100 V durante 90 minutos. Las membranas se bloquearon con leche al 4 % en TBST, luego el anticuerpo primario (a-myc, 1:5000) y el anticuerpo secundario (Licor mouse 800, 1:15.000) se aplicaron secuencialmente en leche al 4 % en TBST. Se tomaron imagenes de las transferencias con el escaner Licor Odyssey.
Clonacion de plasmidos para ensayos de empalme in vitro
Plasmidos Ub-IntN: Los plasmidos de expresion de N-intema procedfan de un plasmido NpuN descrito previamente, pMR-Ub-NpuN(TS) (36,37). Este plasmido codifico para la siguiente secuencia de protemas:
Figure imgf000015_0002
donde la secuencia NpuN se presenta en negrita, los restos de externa locales nativos inmediatos estan subrayados y estos restos estan precedidos por His6-Ub con un enlazador Gly4. Se observo previamente una importante proteolisis in vivo durante la expresion de este constructo, por lo que este plasmido se modifico utilizando QuikChange para eliminar la secuencia Gly4. El plasmido resultante, pMR-Ub-NpuN-AGly4 se utilizo como plantilla para todos los demas plasmidos Ub-IntN y se codifico para la siguiente secuencia de protemas:
Figure imgf000016_0001
Todos los demas plasmidos IntN se clonaron utilizando una PCR de superposicion para generar los genes de fusion Ub-IntN en plasmidos homologos de una manera sin rastro (39). De manera espedfica, los genes de N-intema se amplificaron mediante polimerasa Phusion a partir de los plasmidos geneticos sinteticos utilizando cebadores con salientes que se aparean a las secuencias de plasmidos que rodean NpuN en pMR-Ub-NpuN-AGly4. El megacebador resultante se utilizo luego para insertar el nuevo gen N-intema en lugar de NpuN para generar un nuevo plasmido llamado pMR-Ub-IntN que era identico al plasmido NpuN, excepto el gen N-intema.
Plasmidos IntC-SUMO: Todos los plasmidos C-intema procedian de un plasmido NpuC descrito previamente, pET-NpuC(WT)-SUMO (37). Este plasmido codifico para la siguiente secuencia de protemas:
Figure imgf000016_0002
donde la secuencia de NpuC se da en negrita, y los restos de externa locales nativos inmediatos estan subrayados, seguidos de una secuencia enlazadora y SUMO-HA. Este constructo esta precedido por una secuencia de reconocimiento de la proteasa del marcador His6 y del virus del grabado del tabaco (TEV, de sus siglas en ingles). El sitio de escision de la proteasa TEV esta indicado por "|" y deja un resto de glicina en lugar de una metionina IntC N-terminal.
Todos los demas plasmidos IntC se clonaron utilizando una PCR de superposicion para generar los genes de fusion IntC-SUMO en plasmidos homologos de una manera sin rastro (39). De manera espedfica, los genes de C-intema se amplificaron mediante polimerasa Phusion a partir de los plasmidos geneticos sinteticos utilizando cebadores con salientes que se aparean a las secuencias de plasmidos que rodean NpuC en pET-NpuC(TS)-SUMO. El megacebador resultante se utilizo luego para insertar el nuevo gen C-intema en lugar de NpuC para generar un nuevo plasmido llamado pET-IntC-SUMO que era identico al plasmido NpuC, excepto el gen C-intema.
Purificacion de protemas para ensavos de empalme in vitro
Sobreexpresion y purificacion de constructos Ub-IntN (excepto Ub-CwaN): Las celulas BL21(DE3) de E. coli transformadas con cada plasmido N-intema se cultivaron en 1 l de LB que contema 100 ^g/ml de ampicilina a 37 °C hasta una DO600 = 0,6. Las celulas se enfriaron entonces a 18 °C y se indujo la expresion mediante la adicion de IPTG 0,5 mM durante 16 horas a 18 °C. Despues de recoger las celulas mediante centrifugacion (10.500 rcf, 30 min), los sedimentos celulares se transfirieron a tubos conicos de 50 ml con 5 ml de tampon de lisis (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, BME 2 mM, pH 8,0) y almacenado a -80 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron anadiendo 15 ml adicionales de tampon de lisis complementado con un coctel inhibidor de la proteasa completa. Las celulas se lisaron mediante sonicacion (35 % de amplitud, 8x pulsos de 20 segundos separados por 30 segundos en hielo). La fraccion soluble se recupero mediante centrifugacion (35.000 rcf, 30 min). La fraccion soluble se mezclo con 2 ml de resina de Ni-NTA y se incubo a 4 °C durante 30 minutos. Despues de la incubacion, la suspension se cargo sobre una columna fritada. Despues de descartar el flujo, la columna se lavo con 5 volumenes de columna (CV, de sus siglas en ingles) de tampon de lisis, 5 CV de tampon de lavado 1 (tampon de lisis con imidazol 20 mM) y 3 CV de tampon de lavado 2 (tampon de lisis con imidazol 50 mM). La protema se eluyo con tampon de elucion (tampon de lisis con imidazol 250 mM) en cuatro fracciones de elucion de 1,5 CV. Las fracciones de lavado y elucion se analizaron por SDS-PAGE.
Despues del enriquecimiento sobre la columna de Ni-NTA, las protemas se purificaron por filtracion en gel. Las fracciones de lavado y elucion se trataron todas con DTT 50 mM durante 30 minutos en hielo. Para las protemas que expresan bien, la primera fraccion de elucion se inyecto directamente en una columna de filtracion de gel S7510/300 (3x inyecciones de 1 ml) y se eluyo sobre 1,35 CV en tampon de empalme desgasificado recien preparado (fosfatos 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2). Para las protemas mas diluidas y de bajo rendimiento, normalmente, la fraccion de lavado de imidazol 50 mM y las dos primeras fracciones de elucion se agruparon y se concentraron cuatro veces en 3 ml. Despues, la protema concentrada se purifico mediante filtracion en gel de forma identica a los constructos de alto rendimiento. Las fracciones de FPLC se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones mas puras se agruparon y analizaron mediante filtracion analftica en gel, RP-HPLC analftica y espectrometna de masas. La concentracion de protemas puras se determino mediante UV A280nm y mediante el ensayo de Bradford.
Sobreexpresion y purificacion de Ub-CwaN: La protema Ub-CwaN no se expreso bien en la fraccion soluble, y toda la protema enriquecida se agrego, como se observo en el analisis de filtracion en gel. Por tanto, despues de la expresion, la lisis celular y el fraccionamiento, tal como se han descrito anteriormente, se extrajo la protema de la fraccion insoluble del lisado de la siguiente manera. En primer lugar, el sedimento de lisado se resuspendio en 20 ml de tampon de lavado Triton (tampon de lisis con Triton X-100 al 0,1 %) y se incubo a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lavado con Triton se centrifugo a 35.000 rcf durante 30 minutos y se desecho el sobrenadante. A continuacion, el sedimento se resuspendio en 20 ml de tampon de lisis que contema urea 6 M y la mezcla se incubo durante la noche a 4 °C. La mezcla se centrifugo a 35.000 rcf durante 30 minutos, y luego el sobrenadante se mezclo con 2 ml de resina NiNTA. La columna de Ni se ejecuto de manera identica a las purificaciones nativas descritas anteriormente, excepto que cada tampon tema un fondo de urea 6 M. Despues del enriquecimiento sobre una columna de Ni-NTA, el lavado de imidazol 50 mM y las dos primeras fracciones de elucion se agruparon y se diluyeron a 0,2 mg/ml. La protema diluida se replego en tampon de lisis (sin urea) mediante la eliminacion por dialisis gradual de la urea a 4 °C. La protema se concentro cuatro veces a 3 ml y se purifico inmediatamente mediante filtracion en gel como se indica para las purificaciones nativas anteriores. La protema pura se analizo mediante filtracion analftica en gel, RP-HpLC analftica y espectrometna de masas. Hay que tener en cuenta que este constructo fue altamente susceptible a la agregacion. Cuando se volvio a plegar a 2 mg/ml en lugar de 0,2 mg/ml, menos del 10 % de la protema obtenida fue monomerica, mientras que el repliegue mas diluido produjo aproximadamente el 50 % de protema monomerica. La protema obtenida fue 80 % monomerica y la proporcion de monomero a agregado no cambio despues de 24 horas de almacenamiento a 4 °C. La concentracion de protema pura se determino mediante el ensayo de Bradford.
Sobreexpresion y purificacion de constructos IntC-SUMO: Se cultivaron celulas BL21(DE3) de E. coli transformadas con cada plasmido de N-intema en 1 l de medio LB que contema kanamicina (50 pg/ml) a 37 °C hasta una DO600 = 0,6. Despues, se indujo la expresion mediante la adicion de IPTG 0,5 mM durante 3 horas a 37 °C. Las celulas se lisaron y la protema deseada se enriquecio sobre resina Ni-NTA de manera identica a las protemas Ub-IntN purificadas de forma nativa. Las protemas AvaC-SUMO y Csp(PCC8801)C-SUMO no se expresaron bien a 37 °C, por lo que las protemas se volvieron a expresar mediante induccion a 18 °C durante 16 horas. Para cada protema, el lavado de imidazol 50 mM y las dos primeras fracciones de elucion se agruparon y se dializaron en tampon de escision TEV (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, EDTA 0,5 mM, DTT 0,5 mM, pH 8,0) y luego se trataron con 40 pg de proteasa TEV marcada con His durante la noche a temperatura ambiente. La escision se confirmo mediante RP-HPLC/MS, despues de lo cual la solucion de reaccion se incubo con resina de Ni-NTA a temperatura ambiente durante 30 min. Se recogieron y se agruparon el flujo continuo y dos lavados de 1,5 CV con tampon de lavado 1. La protema se concentro luego a 3-4 ml, se inyecto en la columna de filtracion de gel S75 10/300 (3x en inyecciones de 1 ml) y se eluyo sobre 1,35 CV en tampon de empalme desgasificado recien preparado (fosfatos 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2). Las fracciones de FPLC se analizaron mediante SdS-PAGE y las fracciones mas puras se agruparon y analizaron mediante filtracion analftica en gel, RP-HPLC analftica y espectrometna de masas. La concentracion de protemas puras se determino mediante UV A280nm y mediante el ensayo de Bradford.
Uso y almacenamiento de los constructos Ub-IntN e IntC-SUMO: Todas las protemas purificadas se almacenaron a 4 °C y se utilizaron dentro de dos dfas para empalmar los ensayos con sus IntC-SUMO afines. La protema restante (2 vol. eq.) se mezclo con un tampon de empalme que contema glicerol al 60 % (1 vol. eq.) para producir un stock de glicerol al 20 % que se dividio en aftcuotas y se congelo rapidamente en N2 ftquido. Las aftcuotas de protemas se almacenaron a -80 °C. Las protemas eran completamente funcionales despues de descongelarse en hielo y podfan congelarse rapidamente y volver a descongelarse al menos una vez sin una perdida de funcion detectable.
Ensayos de empalme in vitro
Procedimiento de ensayo cinetico: Para un ensayo tfpico, se prepararon soluciones madre de protemas individuales de constructos Ub-IntN e IntC-SUMO en tampon de empalme filtrado (fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) a 2x la concentracion final (por ejemplo, solucion madre 2,0 pM para una reaccion 1,0 pM). Se anadio TCEP 1 mM (de una solucion madre 100 mM con pH neutralizado) a cada solucion de protema, y las protemas se incubaron a 30 °C o 37 °C durante 5 minutos, dependiendo de la temperatura de reaccion. Para iniciar una reaccion, la N y C interna se mezclaron en volumenes iguales (es decir, proporciones equimolares). Un volumen de reaccion normal fue de 300 pl y se llevo a cabo en un tubo Eppendorf en un bloque de calor. Durante la reaccion, se eliminaron aftcuotas de 20 pl de la solucion de reaccion en los puntos de tiempo deseados y se inactivaron en 20 |j| de colorante de carga de gel de SDS concentrado 2x en hielo para proporcionar una solucion final inactivada con Tris 40 mM (~ pH 7,0), glicerol al 10 % (v/v), SDS al 1 % (p/v), azul de bromofenol al 0,02 % (p/v) y BME al 2 % (v/v). Para cada reaccion, se tomo un punto de tiempo cero artificial mezclando cantidades equivalentes de materiales de partida directamente en la solucion de inactivacion. Las muestras se hirvieron durante 10 minutos y luego se centrifugaron a 17.000 rcf durante 1 minuto. Se cargaron partes almuotas de los materiales de partida y los puntos de tiempo (15 jl) en geles Bis-Tris y se ejecutaron en tampon de ejecucion MES-SDS. Los geles se tineron con Coomassie y luego se tomaron imagenes con el escaner Licor Odyssey.
Hay que tener en cuenta que para las reacciones con una secuencia de C-extema CGN, no se utilizo BME en la solucion de inactivacion. Ademas, antes de hervir las muestras, cada muestra se trato con 1 j l de HCl 2 N. Despues de hervir y enfriar las muestras, se trataron con 1 j l de NaOH 2 N. Este procedimiento evito la hidrolisis o la tiolisis no deseadas del intermedio ramificado.
Determinacion de parametros cineticos: Para determinar las velocidades de reaccion, cada carril de un gel se analizo utilizando la funcion de cuantificacion Licor Odyssey o ImageJ. Dada la proximidad de las bandas de material de partida, estas bandas se integraron normalmente juntas. Para normalizar el error de carga, la intensidad integrada de cada banda en un carril se expreso como una intensidad de fraccion de la intensidad de banda total en ese carril (que se mantuvo relativamente constante entre los carriles). Estas intensidades normalizadas se representaron graficamente como una funcion del tiempo, y los datos de tres reacciones independientes se ajustaron colectivamente a las ecuaciones de velocidad de primer orden utilizando el software GraphPad Prism:
Para el agotamiento de reactivos: Y = S(e-kobst) Z
Para la formacion de producto: Y = Ymax(1 -e-kobst)
Y es la intensidad fraccional de una especie, t es el tiempo en minutos, S es un factor de escala para el agotamiento del reactivo (se permite que vane), Z indica la fraccion de reactante que queda en el punto final de la reaccion (se permite que vane, Ymax es un factor de escala para la formacion del producto, y kobs es la constante de velocidad de primer orden observada para la reaccion de empalme (se permite que vane). Las semividas se calcularon a partir del valor de mejor ajuste para la constante de velocidad de primer orden:
ln2
t l / 2 _ k obs
Para las reacciones sin formacion de producto secundario detectable, la velocidad de producto (Ub-SUMO) y la formacion de IntN fueron consistentes con la velocidad de agotamiento del material de partida.
Analisis de transferencia Western de reacciones: Se realizaron transferencias Western del punto de tiempo cero y el punto final de la reaccion para confirmar las identidades de las bandas observadas. Los puntos de tiempo de inactivacion de las reacciones descritas anteriormente se cargaron en geles Bis-Tris al 12 % (5 j l por muestra, dos geles identicos) y se ejecutaron en tampon de ejecucion MES-SDS. Las protemas resueltas se transfirieron del gel a la membrana de PVDF en un tampon de transferencia CAPS (acido W-ciclohexil-3-aminopropanosulfonico 10 mM, metanol al 10 % (v/v), pH 10,5) a 100 V durante 60 minutos. Las membranas se bloquearon con el tampon de bloqueo de Licor, luego se aplico el anticuerpo primario (a-His6, 1:3000 o a-HA, 1:25.000) en el tampon de bloqueo de Licor. El anticuerpo secundario (Licor mouse 800, 1:15.000) se aplico en leche al 4 % en TBSt . Se tomaron imagenes de las transferencias con el escaner Licor Odyssey. Las transferencias de las reacciones a 30 °C y 37 °C fueron virtualmente identicas.
Analisis HPLC/MS de las reacciones Npu-CGN y Cra(CS505)-CGN
Para el analisis HPLC/MS de Npu-CGN y Cra(CS505)-CGN, se prepararon soluciones madre de protemas individuales de Ub-IntN e IntC-CGN-SUMO en tampon de empalme filtrado (fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) a 8,0 jM. Se anadio Tc Ep 1 mM (de una solucion madre 100 mM con pH neutralizado) a cada solucion de protema, y las protemas se incubaron a 30 °C durante 5 minutos. Para iniciar una reaccion, la N y C interna se mezclaron en volumenes iguales (es decir, proporciones equimolares) y se incubaron a 30 °C. Durante la reaccion, se eliminaron almuotas de 90 j l de la solucion de reaccion en los puntos de tiempo deseados y se inactivaron en 30 j l de una solucion de inactivacion rapida (hidrocloruro de guanidina 6 M con acido trifluoroacetico al 4 %). Se inyectaron 100 j l de cada punto de tiempo inactivado en una columna analttica C18 RP-HPLC y se eluyeron en un gradiente de tampon B al 25-73 % en 30 minutos, precedidos por una fase isocratica de dos minutos en tampon B al 25 % (vease la seccion Equipo para la columna y especificaciones del tampon de ejecucion). En diferentes puntos de tiempo, se recogieron varios picos de HPLC y se confirmaron sus identidades mediante espectrometna de masas. Las especies IntC-(Ub)SUMO se identificaron mediante MS, verificando la formacion y el agotamiento de intermedios ramificados.
Modelado cinetico
Cuando se compararon las reacciones de Npu, Cra(CS505) y Cwa en presencia de CGN, se obtuvieron mayores cantidades de ubiquitina escindida (es decir, escision de N-extema) que el producto de empalme, a pesar del hecho de que la tasa de la primera fue mas lenta que la ultima. Esta observacion es inconsistente con la escision de N-extema y la formacion del producto de empalme que solo ocurre a partir del intermedio ramificado, ya que en este escenario el empalme y la escision senan reacciones de primer orden que compiten con el mismo reactivo (el intermediario ramificado), lo que lleva a un mayor producto de empalme que de escision (lo contrario a lo observado). En un intento por conciliar estas observaciones, se llevaron a cabo una serie de simulaciones de modelado cinetico. Todo el modelado se llevo a cabo utilizando el applet de modelado cinetico de BPReid (40). Los modelos tienen tres suposiciones basicas sobre la ruta de empalme:
1. Las reacciones directas e inversas en el primer equilibrio son rapidas. Ademas, la posicion de este equilibrio se encuentra ligeramente hacia la amida.
2. El segundo equilibrio tambien es rapido y debena tener Keq cerca de 1, ya que ambos intermedios son tioesteres de cisteinilo.
3. Para intemas rapidas, la tasa de resolucion intermedia ramificada (ks) es del mismo orden de magnitud que las tasas de las dos primeras etapas reversibles, mientras que las tasas de escision de L (k6) y B (k7) son relativamente lentas. Para intemas lentas, la resolucion intermedia ramificada (ks) tambien es lenta, en el mismo orden de magnitud que la escision.
Con estas suposiciones, se disenaron seis escenarios que evaluan como las tasas relativas de escision y la resolucion intermedia ramificada y el equilibrio entre los intermedios lineales y ramificados podnan afectar las tasas y extensiones de formacion de la escision y los productos empalmados. Para intemas lentas, como las que contienen restos exogenos de C-extema, la tasa de resolucion intermedia ramificada es similar a la tasa de escision de N-extema. Bajo estas circunstancias, tres factores son importantes:
1. Las tasas relativas de escision de L frente a B (k6 frente a k7).
2. Las tasas relativas de resolucion intermedia ramificada frente a escision (ks frente a k6 k7).
3. Lo que es mas importante, las tasas de intercambio entre los intermedios lineales y ramificados (k3/k4). Estos analisis sugieren no solo que la escision debe llevarse a cabo tanto desde el intermedio lineal como el intermedio ramificado, sino que tambien puede favorecerse la escision en el intermedio lineal.
Tiolisis y ligadura de proteinas a partir de intemas DnaE fusionadas y MxeGyrA
Smtesis en fase solida y purificacion de H-Cvs-Glv-Lvs (Fluoresceina)-NH? (CGK-Fluorescema): La smtesis de peptidos en fase solida (SPPS, de sus siglas en ingles) basada en Fmoc se utilizo para producir un peptido con la secuencia H-Cys-Gly-Lys(Fluorescema)-NH2. El peptido se sintetizo en resina de amida de Rink a una escala de 0,2 mmol de la siguiente manera: se utilizo piperidina al 20 % en DMF para la desproteccion de Fmoc usando un equilibrio de un minuto de la resina seguido de una incubacion de 20 minutos. Despues de la desproteccion de Fmoc, los aminoacidos se acoplaron utilizando DIC/HOBt como agentes activadores. En primer lugar, el aminoacido (1,1 mmol) se disolvio en DCM:DMF 50:50 (2 ml) y se activo con DIC (1,0 mmol) y HOBt (1,2 mmol) a 0 °C durante 15 minutos. La mezcla se anadio a la resina desprotegida en el extremo N y se acoplo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Despues de acoplar la cistema, la cadena lateral de lisina se desprotegio mediante tratamiento con Pd(Ph3)4 (0,1 eq.) y fenilsilano (25 eq.) en DCM seco durante 30 minutos. La resina de peptidilo se lavo con DCM (2 x 5 ml) y DMF ( 2 x 5 ml) seguido de dos lavados con DIPEA al 0,5 % en DMF (v/v) y dos lavados con trihidrato de dietilditiocarbamato de sodio al 0,5 % en DMF (p/v) para eliminar cualquier traza restante del catalizador de Pd. La 5(6)-carboxifluorescema se acoplo luego a la cadena lateral de lisina usando el metodo de activacion DIC/HOBt durante la noche a temperatura ambiente. Por ultimo, el peptido se escindio de la resina utilizando TFA al 94 %, TIS al 1 %, EDT al 2,5 % y H2O al 2,5 % (6,5 ml) durante una hora. Despues de la escision, aproximadamente la mitad del TFA se evaporo bajo una corriente de nitrogeno. El peptido en bruto se precipito con eter fno y se lavo con eter fno dos veces. Por ultimo, el peptido se purifico mediante RP-HPLC en una columna de preparacion C18 sobre un gradiente de tampon B del 15-80 % en 40 minutos. El peptido purificado se analizo mediante RP-HPLC analftica y ESI-MS para confirmar su identidad. Hay que tener en cuenta que no se intento aislar por separado los conjugados 5-carboxifluorescema y 6-carboxifluorescema, por lo que el peptido es una mezcla de estos dos isomeros.
Clonacion de fusiones de Ub-Intema: Todas las fusiones de Ub-Intema se clonaron en un vector pTXB1 modificado de NEB que contiene ubiquitina en la que se insertaron un marcador His6 y un codon de parada entre la interna MxeGyrA y el dominio de union a quitina. Esto dio como resultado un plasmido, pTXB1-Ub-MxeGyrA-ATEA-H6 que codifica la siguiente protema, llamada Ub-MxeGyrA-ATEA-H6:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCITGDALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHG
NP
VLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDY
AV
IQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADEPTDGRFY
YA
KVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHATEAHHHHHH (SEQ ID NO: 764)
en la cual la secuencia de interna para MxeGyrA (N198A) se muestra en negrita, precedida por ubiquitina y seguida por la secuencia local endogena C-extema (subrayada) y un marcador His6.
Este plasmido se modifico para reemplazar la interna MxeGyrA con una interna Npu fusionada. En primer lugar, el plasmido myc-KanR-NpuDnaE-Split se modifico mediante QuikChange para eliminar la secuencia iRBS que separa los genes NpuN y NpuC. El plasmido resultante, myc-KanR-NpuDnaE-Fused, se utilizo luego como plantilla para amplificar megacebadores que llevan la interna Npu fusionada con salientes homologos a las secuencias que rodean MxeGyrA en el vector pTXBI modificado. El gen Npu con la mutacion N137A se inserto en lugar de MxeGyrA utilizando una PCR de superposicion con la polimerasa Phusion. (39) De manera importante, esta construccion se modifico para incluir los restos de C-extema nativos de Npu (CFN) en lugar de los de MxeGyrA (TEA). El plasmido resultante, pTXB1-Ub-NpuDnaE-ACFN-H6 codifico para la siguiente protema:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQ
PV
AQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN
IK IATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASACFNHHHHHH (SEQ ID NO:
765)
Esta fusion mostro una importante hidrolisis in vivo de la ubiquitina cuando se expreso en E. coli. Por tanto, se modifico aun mas utilizando la mutagenesis QuikChange mediante la mutacion de la cistema 1 en alanina, generando el plasmido pTXB1-Ub-NpuDnaE-AAFN-H6. Este plasmido codifico la siguiente protema (Ub-NpuDnaE-AAFN-H6) que se utilizo para experimentos de tiolisis in vitro:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQ
PV
AQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN
IK
IATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 766)
Los plasmidos pTXB1-Ub-AvaDnaE-AAFN-H6 y pTXB1-Ub-MchtDnaE-AAFN-H6 , que codifican las siguientes secuencias de protemas (Ub-AvaDnaE-AAFN-H6 y Ub-MchtDnaE-AAFN-H6, respectivamente), fueron clonados analogamente mediante la modificacion del plasmido pTXB1-Ub-NpuDnaE-AAFN-H6.
Ub-AvaDnaE-AAFN-H6
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCLSYDTEVLTVEYGFVPIGEIVDKGIECSVFSIDSNGIVYTQ
P I
AQWHHRGKQEVFEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPE
IK
IASRKFLGVENVYDIGVGRDHNFFVKNGLIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 767)
Ub-MchtDnaE-AAFN-H 6
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCLSYDTQILTVEYGAVAIGEIVEKQIECTVYSVDENGYVYTQ
P I
AQWHNRGEQEVFEYLLEDGATIRATKDHKFMTDEDQMLPIDQIFEQGLELKQVEVLQP
VF
VKIVRRQSLGVQNVYDIGVEKDHNFCLASGEIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 768)
Como control para la eliminacion del resto Cys 1 en los constructos de interna DnaE, el resto Thr 1 se muto a partir del plasmido pTXB1-Ub-MxeGyrA-ATEA-H6 mediante la mutagenesis QuikChange para producir el plasmido pTXB1-Ub-MxeGyrA-AAEA-H6, que codifica la protema Ub-MxeGyrA-AAEA-H6.
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSD
YN
IQKESTLHLVLRLRGGCITGDALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHG
NP
VLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDY
AV
IQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADELTDGRFY
YA
KVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHAAEAHHHHHH (SEQ ID NO: 769)
Clonacion de fusiones adicionales para inteinas DnaE fusionadas: Varias otras protemas se fusionaron a AvaDnaE o MchtDnaE para probar la dependencia de secuencia de la tiolisis de estas intemas. Las protemas utilizadas fueron el dominio SH3 N-terminal de Grb2 humana (AAs 1-55 /- una Gly C-terminal exogena), el dominio SH2 de la quinasa Abl humana (AAs 122-217), eGFP, y el dominio catalttico de pAr P1 humana (AAs 657-1015). Todos los plasmidos se clonaron utilizando los metodos mencionados anteriormente para producir plasmidos que codifican las siguientes protemas:
SH3-AvaDnaE-AAFN-H6
MEAIAKYDFKATADDELSFKRGDILKVLNEECDQNWYKAELNGKDGFIPKNYIEMCLS
YD
TEVLTVEYGFVPIGEIVDKGIECSVFSIDSNGIVYTQPIAQWHHRGKQEVFEYCLEDG
SI
IKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPEIKIASRKFLGVENVYDIGVGR
DH NFFVKNGLIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 770)
SH3-Gly-AvaDnaE-AAFN-H6
MEAIAKYDFKATADDELSFKRGDILKVLNEECDQNWYKAELNGKDGFIPKNYIEMGCL
SY
DTEVLTVEYGFVPIGEIVDKGIECSVFSIDSNGIVYTQPIAQWHHRGKQEVFEYCLED
GS
IIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPEIKIASRKFLGVENVYDIGVG
RD HNFFVKNGLIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 771)
SH3-MchtDnaE-AAFN-H6
MEAIAKYDFKATADDELSFKRGDILKVLNEECDQNWYKAELNGKDGFIPKNYIEMCLS
YD
TQILTVEYGAVAIGEIVEKQIECTVYSVDENGYVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYLLEDG
AT
IRATKDHKFMTDEDQMLPIDQIFEQGLELKQVEVLQPVFVKIVRRQSLGVQNVYDIGV
EK DHNFCLASGEIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 772)
SH2-AvaDnaE-AAFN-H6
MLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINT
AS
DGKLYVSSESRFNTLAE LVHHHSTVADGLITTLHYPACLSYDTEVLTVEYGFVPIGEI
VD
KGIECSVFSIDSNGIVYTQPIAQWHHRGKQEVFEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKM
LP
IDEIFEQELDLLQVKGLPEIKIASRKFLGVENVYDIGVGRDHNFFVKNGLIASAAFNH
HH
hhh (SEQ ID NO: 773)
eGFP-AvaDnaE-AAFN-H6
MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPW
PT
LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGD
TL
VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQ
LA
DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELY
KC
LSYDTEVLTVEYGFVPIGEIVDKGIECSVFSIDSNGIVYTQPIAQWHHRGKQEVFEYC
LE
DGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPEIKIASRKFLGVENVYDI
GV GRDHNFFVKNGLIASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 774)
PARPc-AvaDnaE-AAFN-H6
MVNPGTKSKLPKPVQDLIKMIFDVESMKKAMVEYEIDLQKMPLGKLSKRQIQAAYSIL SE VQQAVSQGSSDSQILDLSNRFYTLIPHDFGMKKPPLLNNADSVQAKAEMLDNLLDIEV AY SLLRGGSDDSSKDPIDVNYEKLKTDIKVVDRDSEEAEIIRKYVKNTHATTHNAYDLEV ID
IFKIEREGECQRYKPFKQLHNRRLLWHGSRTTNFAGILSQGLRIAPPEAPVTGYMFGK
GI YFADMVSKSANYCHTSQGDPIGLILLGEVALGNMYELKHASHISKLPKGKHSVKGLGK TT PDPSANISLDGVDVPLGTGISSGVNDTSLLYNEYIVYDIAQVNLKYLLKLKFNFKTSL WC
LSYDTEVLTVEYGFVPIGEIVDKGIECSVFSIDSNGIVYTQPIAQWHHRGKQEVFEYC
LE
DGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPEIKIASRKFLGVENVYDI
GV GRDHNFFVKNGLI ASAAFNHHHHHH (SEQ ID NO: 775)
Purificacion de diversas fusiones de protema-intema: Se cultivaron celulas BL21(DE3) de E. coli transformadas con cada plasmido de fusion de protema-intema en 1 l de medio LB que contema ampicilina (100 pg/ml) a 37 °C hasta una DO600 = 0,6. Despues, se indujo la expresion mediante la adicion de IPTG 0,5 mM y la incubacion durante 3 horas a 37 °C o la incubacion durante 16 horas a 18 °C. Todas las fusiones Ub se expresaron a 37 °C, la fusion eGFP se expreso a 18 °C y las fusiones SH3, SH2 y PARPc se expresaron a ambas temperaturas. Despues de recoger las celulas mediante centrifugacion (10.500 rcf, 30 min), los sedimentos celulares se transfirieron a tubos conicos de 50 ml con 5 ml de tampon de lisis (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, sin BME, pH 8,0) y se almacenaron a -80 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron anadiendo 15 ml adicionales de tampon de lisis complementado con un coctel inhibidor de protemas completo. Las celulas se lisaron mediante sonicacion (35 % de amplitud, 8x pulsos de 20 segundos separados por 30 segundos en hielo). La fraccion soluble se recupero mediante centrifugacion (35.000 rcf, 30 min). La fraccion soluble se mezclo con 2 ml de resina de Ni-NTA y se incubo a 4 °C durante 30 minutos. Despues de la incubacion, la suspension se cargo sobre una columna fritada. Despues de descartar el flujo, la columna se lavo con 5 volumenes de columna (CV, de sus siglas en ingles) de tampon de lisis, 5 CV de tampon de lavado 1 (tampon de lisis con imidazol 20 mM) y 3 CV de tampon de lavado 2 (tampon de lisis con imidazol 50 mM). La protema se eluyo con tampon de elucion (tampon de lisis con imidazol 250 mM) en cuatro fracciones de elucion de 1,5 CV. Las fracciones de lavado y elucion se analizaron mediante SDS-PAGE con colorante de carga que no contema tioles. Las fracciones mas limpias se agruparon y se trataron con TCEP 10 mM durante 20 minutos en hielo. Despues, la solucion se inyecto en una columna de filtracion de gel S75 o S20010/300 (2x en inyecciones de 1 ml) y se eluyo sobre 1,35 CV en tampon de tiolisis (fosfatos 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, TCEp 1 mM, pH 7,2). Las fracciones de FPLC se analizaron mediante SDS-PAGE con un colorante de carga que no contema tioles, y las fracciones mas puras se agruparon y analizaron mediante RP-HPLC analttica y espectrometna de masas. La concentracion de protemas puras se determino mediante UV A280nm.
Tiolisis de fusiones de Ub-intema y ligadura de ubiquitina a un pequeno peptido fluorescente: Para cada protema de fusion Ub-Intema, se llevaron a cabo cuatro reacciones en una escala de 100 pl a 30 °C. En la primera reaccion para controlar la hidrolisis de fondo, la protema de fusion (50 pM) se incubo en un tampon de tiolisis (fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, TCEP 1 mM, pH 7,2) complementado con TCEP recien agregado (5 mM adicional). En la segunda y tercera reaccion, la protema se incubo de manera identica a la de la primera reaccion, excepto que cada reaccion tuvo MESNa 100 mM o CGK-Fluorescema 1 mM. En la cuarta reaccion, se anadieron tanto MESNa como el peptido. En diversos puntos temporales, se eliminaron 5 pl de solucion de reaccion y se inactivaron en 30 pl de colorante de carga SDS 2x que no contema tioles. A medida que se recogieron los puntos de tiempo, se almacenaron a -20 °C hasta el final de la reaccion. Despues de la reaccion, los 35 pl de los puntos de tiempo de inactivacion se descongelaron, se trataron con 1 pl de una solucion madre de TCEP 1 M, se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron a 17.000 rcf durante 1 minuto. Los puntos de tiempo (5 pl) se cargaron en geles Bis-Tris al 12 % y se ejecutaron en tampon de ejecucion MES-SDS. Se tomaron imagenes por primera vez de los geles en un generador de imagenes de fluorescencia para visualizar el producto de ligadura Ub-CGK-Fluorescema. Luego, los geles se tineron con Coomassie y se tomaron imagenes con el escaner Licor Odyssey. Ademas, los puntos finales de la reaccion se inactivaron mediante dilucion 20 veces en H2O con TFA al 0,1 % y se inyectaron en una columna analttica C18 RP-HPLC. La mezcla se separo en una fase isocratica de 2 minutos en B al 0 %, seguido de un gradiente lineal de B al 0-73 % en 30 minutos. Los principales picos se recogieron y analizaron mediante MS.
Tiolisis de fusiones de SH3-, SH2-, eGFP- y PARPr-Inteina: Se llevaron a cabo reacciones de tiolisis con varias otras protemas fusionadas a las intemas fusionadas AvaDnaE y MchtDnaE de manera analoga a las reacciones de ubiquitina descritas anteriormente. En una reaccion tfpica, llevada a cabo en una escala de 300 pl a 30 °C, se trato una protema de fusion 10 pM con TCEP 5 mM en tampon de tiolisis y luego se incubo en presencia o ausencia de MESNa (ya sea 100 mM o 200 mM) agregado a partir de una solucion madre 1 M de pH ajustado. En diversos puntos temporales, se inactivaron partes almuotas (15 pl) de la solucion de reaccion en 30 pl de colorante de carga de gel SDS 2x que no contema tioles y se almacenaron a -20 °C hasta el final de la reaccion. Despues de la reaccion, los 45 pl de los puntos de tiempo de inactivacion se descongelaron, se trataron con 1 pl de una solucion madre de TCEP 1 M, se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron a 17.000 rcf durante 1 minuto. Los puntos de tiempo (15 pl) se cargaron en geles Bis-Tris al 12 % y se ejecutaron en tampon de ejecucion MES-SDS. Luego, los geles se tineron con Coomassie y se tomaron imagenes con el escaner Licor Odyssey. Ademas, los puntos finales de la reaccion se inactivaron mediante dilucion 4 veces en H2O con TFA al 0,1 % y se inyectaron en una columna analttica C18 RP-HPLC. La mezcla se separo en una fase isocratica de 2 minutos en B al 0 %, seguido de un gradiente lineal de B al 0-73 % en 30 minutos. Los picos de productos se recogieron y analizaron mediante MS.
Observacion del intermedio de tioester lineal en intemas DnaE fusionadas
Para las fusiones de Npu, Ava y Mcht con la ubiquitina, tres picos fueron visibles para la protema purificada cuando se inyectaron directamente en una columna C18 de RP-HPLC desde un tampon neutro. Todos estos picos teman la misma masa de la protema deseada. Cuando se diluyeron 20 veces en H2O que contema TFA al 0,1 % (pH 2) y se incubaron durante al menos dos horas a temperatura ambiente, los dos primeros picos se fusionaron en el tercer pico (Figura 4d). La misma observacion no se pudo hacer para MxeGyrA en condiciones identicas. Para confirmar adicionalmente que se estaba produciendo un equilibrio entre la amida precursora y el tioester lineal, la protema Ub-NpuDnaE-AAFN-H6 se diluyo 20 veces en tampon de tiolisis que contema SDS al 1 %. Antes de hervir, los dos picos principales eran visibles. Despues de hervir durante 10 minutos, cuando se desplego la protema, el primer pico principal convergio parcialmente en el segundo pico principal, lo que sugiere que esta ultima fue la amida, que debena ser mas estable en la protema desplegada. La evidencia adicional de que los tres picos estaban en equilibrio provino de las titulaciones de pH. La protema se diluyo 20 veces en tampones de acido cftrico/fosfato de pH 2 a pH 8, se incubo a temperatura ambiente durante 3-4 horas, luego se analizo mediante HPLC en un gradiente de B al 30­ 73 % en 30 minutos (Figura 4d). La abundancia relativa de las tres especies se modulo y mostro una dependencia del pH en forma de campana, similar a las actividades de las enzimas que contienen multiples grupos funcionales ionizables en sus sitios activos.
Ademas de observar la masa proteica deseada de los tres picos de HPLC observados, se observo la presencia de una especie de -18 Da en los dos primeros picos. Este cambio de masa es caractenstico de una reaccion de deshidratacion, y tal reaccion ha sido informada previamente por Mootz et. al. para una forma mutante de la interna SspDnaB que no puede catalizar de manera eficaz el cambio de acilo de N a S inicial. (41) De manera espedfica, el intermedio tetraedrico de las reacciones de acilacion directa e inversa puede sufrir deshidratacion catalizada por acido para producir un producto secundario de tiazolina. Para Mootz y colaboradores, esta especie fue un producto secundario irreversible para su interna mutante en condiciones de reaccion normales, y dio lugar a bajos rendimientos. En los sistemas del presente documento, donde las intemas DnaE pueden reaccionar hasta completarse, esta especie es un artefacto de acidificacion durante RP-HPLC o es completamente reversible en condiciones de reaccion normales. Es de destacar que la observacion de la tiazolina mediante MS valida aun mas la presencia de niveles detectables del intermedio tetraedrico en las presentes mezclas de reaccion.
Para las fusiones de interna DnaE con protemas distintas de la ubiquitina, se observaron perfiles de HPLC similares con multiples picos a pH neutro, sin embargo, las relaciones de los tres picos variaron segun la secuencia. De manera adicional, para secuencias mas similares a la N-extema DnaE "A-E-Y" endogena (como las fusiones SH3 con una secuencia "I-E-M"), se observo una acumulacion sustancial de un producto deshidratado (hasta un 50 % mediante HPLC/MS), similar a lo observado por Mootz et. al. para la division de la interna SspDnaE. (41) Para estos constructos, esta especie parece acumularse durante la expresion de protemas dando como resultado una mezcla de protemas de fusion "atrapadas" (deshidratadas) y "libres" (nativas, hidratadas). Tras la adicion de MESNa a pH neutro, la protema "libre" se somete rapidamente a la tiolisis para producir el producto deseado, y la protema "atrapada" se rehidrata lentamente y tambien se tioliza para producir el mismo producto deseado. Por tanto, en las curvas de progreso de la reaccion, se observo una fase de "descarga" seguida de una fase mas lenta. De manera importante, la acumulacion de protema de fusion deshidratada podna reducirse mediante la expresion a temperaturas mas bajas (18 °C en lugar de 37 °C), y estas reacciones podnan ser mas rapidas y cercanas a la finalizacion mediante el aumento de la concentracion de MESNa de 100 mM a MESNa 200 mM. Ademas, cabe destacar que para la reaccion de la tiolisis SH3, la interna MchtDnaE fue sustancialmente mas eficaz que la interna AvaDnaE, lo que sugiere que las diferentes intemas DnaE fusionadas pueden ser preferibles, dependiendo de la protema de interes.
Se espera que se produzcan numerosas modificaciones y variaciones en la invencion como se expone en los ejemplos ilustrativos anteriores para los expertos en la tecnica. Por consiguiente, solo las limitaciones que aparecen en las reivindicaciones adjuntas deben colocarse en la invencion.
Referencias
(1) Mills, K. V.; Perler, F. B. Protein Pept. Lett. 2005, 12, 751-5.
(2) Vila-Perello, M.; Muir, T. W. Cell 2010, 143, 191-200.
(3) Southworth, M.; Amaya, K.; Evans, T.; Xu, M.; Perler, F. Biotechniques 1999, 27, 110-120.
(4) Amitai, G.; Callahan, B. P.; Stanger, M. J.; Belfort, G.; Belfort, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 11005-10.
(5) Zettler, J.; Schutz, V.; Mootz, H. D. FEBS Lett. 2009, 583, 909-14.
(6) Iwai, H.; Zuger, S.; Jin, J.; Tarn, P.-H. FEBS Lett. 2006, 580, 1853-8.
(7) Perler, F. B. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 383-4.
(8) Caspi, J.; Amitai, G.; Belenkiy, O.; Pietrokovski, S. Mol. Microbiol. 2003, 50, 1569-77.
(9) Dassa, B.; Amitai, G.; Caspi, J.; Schueler-Furman, O.; Pietrokovski, S. Biochemistry 2007, 46, 322-330.
(10) Chen, L.; Zhang, Y.; Li, G.; Huang, H.; Zhou, N. Anal. Biochem. 2010, 407, 180-7.
(11) Martin, D. D.; Xu, M. Q.; Evans, T. C. Biochemistry 2001, 40, 1393-402.
(12) Lockless, S. W.; Muir, T. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 10999-1004.
(13) Shah, N. H.; Vila-Perello, M.; Muir, T. W. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, 50, 6511-5.
(14) Oeemig, J. S.; Aranko, A. S.; Djupsjobacka, J.; Heinamaki, K.; Iwai, H. FEBS Lett. 2009, 583, 1451-1456.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo que comprende
(a) poner en contacto (1) una protema de fusion que comprende un polipeptido y un fragmento N de interna dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-19, o una variante de la misma, en el que la variante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21-38 y 761 y (2) un fragmento C de interna dividida que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-74,
en el que el contacto se realiza en condiciones que permiten la union del fragmento N de la interna dividida al fragmento C de la interna dividida para formar un intermedio de interna; y
(b) poner en contacto el intermedio de interna con un nucleofilo para formar un conjugado de la protema y el nucleofilo.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el fragmento C de interna dividida se une a un soporte.
3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la protema de fusion esta en un lisado celular completo o es de un sobrenadante celular.
4. El metodo de la reivindicacion 3, que comprende ademas lavar el intermedio de interna para separar el intermedio de interna de los componentes del lisado celular completo o del sobrenadante celular.
5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipeptido tiene un peso molecular de 40 kDa o superior, en el que el polipeptido es un anticuerpo, o fragmento del mismo o en el que el polipeptido se secreta de una celula.
6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende ademas aislar el conjugado.
7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el nucleofilo comprende un segundo polipeptido, un oligonucleotido, una nanopartmula, un farmaco o un polfmero.
8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el nucleofilo comprende un tiol y el conjugado comprende un tioester, en el que opcionalmente el tiol es 2-mercaptoetansulfonato, un alquiltiol, o un ariltiol.
9. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas hacer reaccionar el tioester con un segundo nucleofilo para formar un segundo conjugado.
10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que el segundo nucleofilo comprende una amina, una hidrazina o una fraccion amino-oxi.
ES13809861T 2012-06-27 2013-06-24 Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas Active ES2709333T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261665215P 2012-06-27 2012-06-27
PCT/US2013/047235 WO2014004336A2 (en) 2012-06-27 2013-06-24 Split inteins, conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2709333T3 true ES2709333T3 (es) 2019-04-16

Family

ID=49783989

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13809861T Active ES2709333T3 (es) 2012-06-27 2013-06-24 Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas
ES18192415T Active ES2930185T3 (es) 2012-06-27 2013-06-24 Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18192415T Active ES2930185T3 (es) 2012-06-27 2013-06-24 Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas

Country Status (10)

Country Link
US (4) US20150344549A1 (es)
EP (3) EP4219549A1 (es)
JP (2) JP2015522020A (es)
AU (1) AU2013280693B2 (es)
CA (1) CA2877882A1 (es)
DK (2) DK3431497T3 (es)
ES (2) ES2709333T3 (es)
PL (1) PL2877490T3 (es)
PT (1) PT2877490T (es)
WO (1) WO2014004336A2 (es)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN104263747B (zh) * 2014-09-22 2017-03-15 程永升 一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法
PL3215614T3 (pl) 2014-11-03 2019-12-31 Merck Patent Gmbh Rozpuszczalne białka fuzyjne inteiny i sposoby oczyszczania biocząsteczek
WO2017070633A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
HUE062276T2 (hu) * 2016-01-29 2023-10-28 Univ Princeton Kivételes splicing aktivitású osztott inteinek
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3039928A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11939385B2 (en) * 2017-05-16 2024-03-26 ALX Oncology Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
RU2021123421A (ru) 2017-06-30 2021-09-10 Инскрипта, Инк. Автоматизированные способы обработки клеток, модули, инструменты и системы
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
EP3813974A4 (en) 2018-06-30 2022-08-03 Inscripta, Inc. INSTRUMENTS, MODULES AND METHODS FOR ENHANCED DETECTION OF EDITED SEQUENCES IN LIVING CELLS
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) * 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US10815467B2 (en) 2019-03-25 2020-10-27 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020210751A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 The Broad Institute, Inc. System for genome editing
EP3953477A4 (en) 2019-06-06 2022-06-22 Inscripta, Inc. HARDENING FOR RECURSIVE NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDITING
JP2022542839A (ja) 2019-07-19 2022-10-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
US20220315906A1 (en) 2019-08-08 2022-10-06 The Broad Institute, Inc. Base editors with diversified targeting scope
WO2021040703A1 (en) * 2019-08-28 2021-03-04 The Trustees Of Princeton University Atypical split inteins and uses thereof
CN114450406A (zh) * 2019-09-09 2022-05-06 武汉友芝友生物制药股份有限公司 一种断裂型内含肽、使用其的重组多肽的制备方法
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
GB201917046D0 (en) 2019-11-22 2020-01-08 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Improved protein production
CA3157127A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Aamir MIR Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
WO2021154706A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
WO2021158999A1 (en) 2020-02-05 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Gene editing methods for treating spinal muscular atrophy
US20230127008A1 (en) 2020-03-11 2023-04-27 The Broad Institute, Inc. Stat3-targeted base editor therapeutics for the treatment of melanoma and other cancers
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
WO2021222318A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
EP4214314A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US20230357766A1 (en) 2020-09-24 2023-11-09 The Broad Institute, Inc. Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
EP4274894A2 (en) 2021-01-11 2023-11-15 The Broad Institute, Inc. Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
US20240124850A1 (en) 2021-03-03 2024-04-18 Shape Therapeutics Inc. Auxotrophic Cells for Virus Production and Compositions and Methods of Making
CA3216901A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Cytiva Bioprocess R&D Ab Improved protein purification
CA3227004A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 The Broad Institute, Inc. Improved prime editors and methods of use
WO2023027169A1 (ja) * 2021-08-27 2023-03-02 国立大学法人 東京医科歯科大学 生細胞の選別システム
WO2023076898A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase
WO2023102538A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 The Broad Institute, Inc. Self-assembling virus-like particles for delivery of prime editors and methods of making and using same
WO2023205687A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 The Broad Institute, Inc. Improved prime editing methods and compositions
CN114606252A (zh) * 2022-04-20 2022-06-10 广州市乾相生物科技有限公司 一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法
WO2023250174A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Prime Medicine, Inc. Split prime editors
WO2024077267A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 The Broad Institute, Inc. Prime editing methods and compositions for treating triplet repeat disorders

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
JP3012244B2 (ja) 1987-09-21 2000-02-21 ジェン―プローブ インコーポレイテッド ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド連結試薬
WO1993021259A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
DE69431669T2 (de) 1993-09-02 2003-10-23 Ribozyme Pharm Inc Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet
CA2174339A1 (en) 1993-10-27 1995-05-04 Lech W. Dudycz 2'-amido and 2'-peptido modified oligonucleotides
DK1141250T3 (da) * 1998-12-18 2006-07-10 Penn State Res Found Intein-formidler cyklisering af peptider
EP1339427A4 (en) * 2000-11-01 2004-09-15 Elusys Therapeutics Inc PROCESS FOR PRODUCING BISPECIFIC MOLECULES BY TRANSEPISSANCE OF PROTEINS
CN101333555B (zh) * 2007-12-25 2012-03-21 浙江大学 新型的g蛋白偶联受体细胞水平筛选系统构建与应用
WO2009132455A1 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Paul Xiang-Qin Liu Protein splicing using short terminal split inteins
CN101281201A (zh) * 2008-05-07 2008-10-08 南京大学 利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法
US8420387B2 (en) * 2009-11-06 2013-04-16 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
EP2665744B1 (en) * 2011-01-20 2015-04-08 University Of Rochester Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation
ES2618632T3 (es) * 2011-09-28 2017-06-21 Zera Intein Protein Solutions, S.L. Inteínas divididas y usos de éstas

Also Published As

Publication number Publication date
PT2877490T (pt) 2019-02-12
EP3431497B1 (en) 2022-07-27
EP2877490A4 (en) 2016-07-06
AU2013280693B2 (en) 2018-01-04
WO2014004336A3 (en) 2014-03-27
JP6591511B2 (ja) 2019-10-16
US20220098293A1 (en) 2022-03-31
ES2930185T3 (es) 2022-12-07
EP2877490B1 (en) 2018-09-05
US10526401B2 (en) 2020-01-07
EP3431497A1 (en) 2019-01-23
US20180057577A1 (en) 2018-03-01
JP2015522020A (ja) 2015-08-03
EP2877490A2 (en) 2015-06-03
WO2014004336A2 (en) 2014-01-03
PL2877490T3 (pl) 2019-03-29
US11161899B2 (en) 2021-11-02
US20150344549A1 (en) 2015-12-03
JP2018111685A (ja) 2018-07-19
US20200087388A1 (en) 2020-03-19
EP4219549A1 (en) 2023-08-02
AU2013280693A1 (en) 2015-02-12
DK2877490T3 (en) 2018-12-17
CA2877882A1 (en) 2014-01-03
DK3431497T3 (da) 2022-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2709333T3 (es) Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas
ES2880336T3 (es) Métodos y productos para la síntesis de proteínas de fusión
ES2949163T3 (es) Inteínas divididas con actividad de corte y empalme excepcional
ES2928475T3 (es) Composiciones de ARN de alta pureza y métodos para su preparación
ES2383191T3 (es) Métodos y composiciones
ES2900612T3 (es) Péptido ligasa y su uso
Gunasekera et al. Making ends meet: microwave-accelerated synthesis of cyclic and disulfide rich proteins via in situ thioesterification and native chemical ligation
ES2813867T3 (es) Biblioteca de péptidos y su uso
CA2964837C (en) Means and methods for site-specific functionalization of polypeptides
ES2321058T3 (es) Purificacion de proteinas recombinantes fusionadas con epitopos multiples.
Wang et al. Engineering protein theranostics using bio-orthogonal asparaginyl peptide ligases
Cheng et al. Enzymatic on-resin peptide cleavage and in situ cyclization one-pot strategy for the synthesis of cyclopeptide and cyclotide
Shen et al. Chemical synthesis of integral membrane proteins: methods and applications
ES2323706T3 (es) Metodo de ligacion.
US20170204445A1 (en) In vivo site-specific protein tagging using engineered sortase variants
Wang et al. PAL-Mediated Ligation for Protein and Cell-Surface Modification
WO2021100833A1 (ja) Ｎ－メチルアミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＴステムの改変
WO2005012902A1 (ja) 有用タンパク質のスクリーニング方法
KR20230165919A (ko) 루프 또는 말단에서 펩티드 태그와 상호작용하는 폴리펩티드 및 그의 용도
Guzzo-Pernell et al. Triple helical DNA formation by a hydrophobic oligonucleotide-peptide hybrid molecule
Li Screening of Cysteine-Rich Backbone Cyclized Peptide Libraries for Inhibitors Against Disease-Related Proteases
Stankiewicz Protein semi-synthesis in vivo