ES2949163T3 - Inteínas divididas con actividad de corte y empalme excepcional - Google Patents

Inteínas divididas con actividad de corte y empalme excepcional Download PDF

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Abstract

Las realizaciones de la presente invención se refieren a inteínas, inteínas divididas, composiciones que comprenden inteínas y métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inteínas divididas con actividad de corte y empalme excepcional
Antecedentes
1. Campo técnico
El campo de las realizaciones actualmente reivindicadas de la presente invención se refiere a inteínas, inteínas divididas, composiciones que comprenden inteínas y métodos para el uso de las mismas para la ingeniería de proteínas.
2. Discusión de la técnica relacionada
El corte y empalme de proteínas es un evento de autoprocesamiento postraduccional en el que un dominio proteico intermedio denominado inteína se escinde a sí mismo de una proteína huésped sin dejar rastro, de modo que las secuencias polipeptídicas flanqueantes (exteínas) se ligan entre sí por medio de un enlace peptídico normal.1 Mientras que el corte y empalme de proteínas normalmente se produce espontáneamente después de la traducción de un polipéptido contiguo, algunas inteínas existen de manera natural en forma dividida.1 Los dos trozos de la inteína dividida se expresan por separado y permanecen inactivos hasta encontrarse con su compañero complementario, tras lo cual se pliegan cooperativamente y experimentan corte y empalme en trans. Esta actividad se ha aprovechado en una serie de métodos de ingeniería de proteínas que proporcionan control sobre la estructura y la actividad de las proteínas tanto in vitro como in vivo.1 Las dos primeras inteínas divididas en caracterizarse, de las especies de cianobacterias Synechocystis PCC6803 (Ssp) y Nostoc punctiforme PCC73102 (Npu), son ortólogos que se encuentran de manera natural insertados en la subunidad alfa de la ADN polimerasa III (DnaE).2-4 Npu es especialmente notable debido a su velocidad notablemente rápida de corte y empalme en trans de proteínas (PTS) (t1/2=50 s a 30 °C).5 Esta semivida es significativamente más corta que la de Ssp (t1/2=80 min a 30 °C),5 un atributo que ha ampliado la gama de aplicaciones abiertas a PTS.1
A pesar del descubrimiento continuo de nuevas inteínas rápidas,67 se sabe poco sobre qué las separa de sus homólogas más lentas. Tal comprensión debe ayudar a identificar nuevas inteínas que probablemente experimenten corte y empalme rápidamente y permitan potencialmente la ingeniería de inteínas divididas con propiedades de PTS superiores.
Sumario
En un aspecto, la invención se refiere a un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000002_0001
En otro aspecto, la invención se refiere a un complejo que comprende el fragmento N de inteína dividida de la invención y un compuesto.
En otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000002_0002
En otro aspecto, la invención se refiere a un complejo que comprende el fragmento C de inteína dividida de la invención y un compuesto.
Un complejo de la estructura
Figure imgf000003_0001
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida de la invención y en donde n es de 0 a 8, la estructura
Figure imgf000003_0002
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida de la invención y en donde n es de 0 a 8,
o la estructura
Figure imgf000003_0003
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida de la invención y en donde X es azufre (S) u oxígeno (O).
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende:
el fragmento N de inteína dividida de la invención; y el fragmento C de inteína dividida de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un plásmido de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento N de inteína dividida de la invención o el fragmento C de inteína dividida de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para cortar y empalmar dos complejos que comprende: poner en contacto un primer complejo que comprende un primer compuesto y el fragmento N de inteína dividida de la invención y un segundo complejo que comprende un segundo compuesto y el fragmento C de inteína dividida de la invención,
en donde la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
hacer reaccionar el producto intermedio de inteína para formar un conjugado del primer compuesto con el segundo compuesto.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método seleccionado del grupo que comprende:
(i) un método que comprende
poner en contacto un primer complejo que comprende un primer compuesto y el fragmento N de inteína dividida de la invención y un segundo complejo que comprende un segundo compuesto y el fragmento C de inteína dividida de la invención,
en donde la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
hacer reaccionar el producto intermedio de inteína con un nucleófilo para formar un conjugado del primer compuesto con el nucleófilo y
(ii) un método que comprende
fusionar una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento N de inteína dividida de la invención, con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento C de inteína dividida de la invención, de modo que la fusión de la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos codifica una inteína contigua.
En otro aspecto, la invención se refiere a una inteína que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000004_0001
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para cortar y empalmar dos complejos juntos que comprende: el fragmento N de inteína dividida de la invención;
el fragmento C de inteína dividida de la invención;
un reactivo para unir el fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
un agente nucleófilo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una alineación y un modelo generado por ordenador del diseño de la inteína dividida Cfa de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 2 muestra gráficos que muestran la caracterización de la inteína Cfa de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 3 muestra la expresión y modificación de un anticuerpo monoclonal de ratón usando la inteína Cfa de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 4 muestra la identificación de residuos “aceleradores” de la segunda cubierta importantes para el corte y empalme en trans rápido de proteínas de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 5 muestra el análisis cinético de mutaciones del lote 2 y modelos generados por ordenador de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 6 muestra un análisis de mutaciones del lote 1 y modelos generados por ordenador de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 7A y la figura 7B muestran una alineación y el refinamiento de la familia de inteínas DnaE de acuerdo con el aspecto divulgado de la invención (aspecto no cubierto por la invención reivindicada);
la figura 8 es una imagen de un análisis de SDS-PAGE de la expresión de prueba de His6-SUMO-NpuN e His6-SUMO-CfaN de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 9 muestra un esquema y gráfico que muestran una mayor promiscuidad de CfaGEP de acuerdo con una realización de la invención;
la figura 10 muestra gráficos y esquemas que muestran la ciclación de eGFP en E. coli con residuos variables de acuerdo con una realización de la invención; y
la figura 11 muestra una tabla que ilustra varios complejos y compuestos de acuerdo con una realización de la invención.
Descripción detallada
A continuación se comentan realizaciones de la invención en detalle.
Las realizaciones de la invención incluyen un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000005_0001
Las realizaciones de la invención incluyen un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000005_0002
Las realizaciones de la invención incluyen un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000005_0004
Las realizaciones de la invención incluyen un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos de dicho fragmento C comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con MVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN (SEQ ID NO: 4).
Las realizaciones de la invención incluyen una composición que comprende lo siguiente: un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con CLS YDTEILT VE Y GFLPIGKIVEERIEC T V YT VDKN GF VYTQPIAQ WHNRGEQE VFE Y CLED G SIIRATK DH K FM TTDG Q M LPIDEIFERG L (SEQ ID NO: 1);, y un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN (SEQ ID NO: 3).
Las realizaciones de la invención incluyen un plásmido de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLED
GSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGL (SEQ ID NO: 1).
Las realizaciones de la invención incluyen un plásmido de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Las realizaciones de la invención incluyen un método para cortar y empalmar dos complejos que comprende: poner en contacto un primer complejo que comprende un primer compuesto y un fragmento N de inteína dividida y un segundo complejo que comprende un segundo compuesto y un fragmento C de inteína dividida, en donde la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y hacer reaccionar el producto intermedio de inteína para formar un conjugado del primer compuesto con el segundo compuesto, en donde dicho fragmento N de inteína dividida comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con CL S YD TEILT VE Y GFLPIGKIVEERIEC T V YT VDKN GF VYT QPIAQ WHNRGEQE VFE Y CLED G SIIRA TKD HK FM TTDG QM LPID EIFERG L (SEQ ID NO: 1) y en donde dicho fragment0 c de inteína dividida comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN (SEQ ID NO: 3) En algunas realizaciones, hacer reaccionar el producto intermedio de inteína comprende poner en contacto el producto intermedio de inteína con un nucleófilo. En algunas realizaciones, dicho primer compuesto es un polipéptido. En algunas realizaciones, dicho primer compuesto es un anticuerpo.
Las realizaciones de la invención incluyen una inteína que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000005_0003
NFLLKNGLVASN (SEQ ID NO: 390).
Las realizaciones de la invención incluyen un kit para cortar y empalmar dos complejos juntos que comprende lo siguiente: un fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99% o 100 % de identidad de secuencia con CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLED G SIIR A TK D H K FM TTD G Q M LPID EIFER G L (SEQ ID NO: 1) - un fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN (SEQ ID NO: 3}- reactivos para permitir la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y un agente nucleófilo.
Se da a conocer un método para generar una secuencia peptídica de inteína consenso sintética (aspecto no cubierto por la invención reivindicada) que comprende: generar una población de una pluralidad de secuencias peptídicas de inteína homólogas; identificar aminoácidos asociados con el corte y empalme rápido dentro de dicha población de una pluralidad de secuencias peptídicas de inteína homólogas; generar una subpoblación de una segunda pluralidad de secuencias peptídicas de inteína homólogas, en donde dicha segunda pluralidad de secuencias peptídicas de inteína homólogas comprende aminoácidos asociados con el corte y empalme rápido; crear un alineamiento de al menos tres secuencias peptídicas de dicha subpoblación; determinar un residuo de aminoácido que aparece con mayor frecuencia en cada posición de dichas al menos tres secuencias peptídicas; y generar una secuencia peptídica de inteína consenso sintética basándose en dicho residuo de aminoácido que aparece con mayor frecuencia en cada posición de dichas al menos tres secuencias peptídicas.
Las realizaciones de la invención incluyen un método que comprende: fusionar una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un primer fragmento de inteína que comprende C L SY D T E E L T V E Y G FL PIG K IV E E R IE C T V Y T V D K N G FV Y T Q PIA Q W H N R G E Q E V FE Y C L E D GSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGL (SEQ ID NO: 1) COn una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un segundo fragmento de inteína que comprende V K IISR K SL G T Q N V Y D IG V E K D H N FL L K N G L V A SN (SEQ ID NO: 3), de modo que la fusión de la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos codifica una inteína contigua.
Las realizaciones de la invención incluyen una fusión génica que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un primer fragmento de inteína que comprende C LSY D TEILTV EY G FLPIG K rV EER IEC TV Y TV D K N G FV Y TQ PIA Q W H N R G EQ EV FEY C LED GSIIRAFK DH K FM TTDG Q M LPIDEIFERG L (SEQ ID NO: 1) fusionado con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un segundo fragmento de inteína que comprende V K IIS R K S L G T Q N V Y D IG V E K D H N F L L K N G L V A SN (SEQ ID NO: 3).
Las realizaciones de la invención incluyen una inteína contigua que puede usarse, por ejemplo, en aplicaciones de semisíntesis tradicionales tales como ligamiento de proteínas expresadas.
En algunas realizaciones, los diversos fragmentos de inteína descritos se unen, se fusionan, se enlazan químicamente, se complejan o se acoplan por métodos convencionales conocidos en la técnica a polímeros, péptidos, polipéptidos, oligopéptidos, moléculas pequeñas, nucleótidos, polinucleótidos, oligonucleótidos, fármacos, moléculas citotóxicas o combinaciones de los mismos.
Ejemplo 1
En algunos aspectos, se investigó la base del corte y empalme rápido de proteínas a través de un estudio comparativo de las dos primeras inteínas divididas caracterizadas, Npu y Ssp. La diferencia sustancial en la velocidad de corte y empalme entre estas dos proteínas es especialmente desconcertante dada sus secuencias altamente similares (63 % de identidad) y estructuras de sitio activo casi superponibles. Estudios previos de mutagénesis en Npu y Ssp sugieren que la diferencia en la actividad entre los dos probablemente se deba a los efectos combinados de varios residuos, en lugar de un solo sitio.68 Sin embargo, sigue sin estar claro cuántos residuos son responsables de las velocidades de reacción rápidas frente a lentas y, por extensión, si estos residuos “aceleradores” de proteínas contribuyen por igual a las etapas químicas individuales en el proceso global de corte y empalme de proteínas. En consecuencia, los inventores comenzaron su estudio explorando estas preguntas, con la esperanza de que esto proporcionara un punto de partida para desarrollar un sistema de PTS mejorado.
El alto nivel de conservación dentro de los sitios activos de Npu y Ssp sugiere que las diferencias de aminoácidos más distales explican la disparidad en la velocidad de corte empalme entre las dos. Por lo tanto, la atención se centró en los residuos de la “segunda cubierta”, aquellos directamente adyacentes al sitio activo. Para simplificar este análisis, se empleó una estrategia de mutagénesis por lotes junto con un ensayo de PTS in vitro previamente notificado.5 Este ensayo usa constructos de inteína dividida con secuencias de exteína nativa cortas y permite que las velocidades de formación de productos intermedios ramificados (k1, k2) y su resolución a los productos finales de corte y empalme (k3) se determinen usando un modelo cinético de tres estados.
La reactividad cruzada conocida de los fragmentos de inteína Npu y Ssp sirvió como plataforma conveniente para evaluar qué mitad de la inteína dividida contribuye más significativamente a la diferencia de actividad.3 Ambas quimeras SspN-NpuC (quimera 1) y NpuN-SspC (quimera 2) muestran una disminución en las velocidades de formación y resolución de la ramificación en comparación con la de Npu nativa (figuras 4C, 4D). Esto indica que los residuos en ambos fragmentos de inteína N y C de Npu y Ssp contribuyen a la diferencia en su velocidad de corte y empalme. A continuación, se eligieron cuatro grupos de posiciones de la segunda cubierta en cada una de estas quimeras basándose en su proximidad al sitio activo, y los residuos de Ssp correspondientes se mutaron a los de Npu (figuras 4A y 4B). A partir de los mutantes de la quimera 1, el lote 2 (L56F, S70K, A83P, E85D) restableció completamente la actividad de formación de ramificaciones a la de Npu nativa (figura 4C), mientras que el lote 1 (R73K, L75M, Y79G, L81M) restableció la mayor parte de la actividad de resolución de ramificaciones (figura 4D). Los efectos de las mutaciones sobre los antecedentes de la quimera 2 fueron más prosaicos, sin un solo lote capaz de restablecer la actividad de corte y empalme a la de Npu nativa (figura 4C y 4D). Por último, previamente se ha demostrado que la mutación A136S en SspC acelera el corte y empalme de proteínas y se examinó por separado.8 Esta mutación A136S aumenta la velocidad de resolución de ramificaciones dos veces, pero no tiene impacto sobre la formación de ramificaciones (figuras 4C y 4D).
La figura 4 muestra la identificación de residuos “aceleradores” de la segunda cubierta importantes para el corte y empalme en trans rápido de proteínas de acuerdo con una realización de la invención. En los paneles A y B, se muestra el diseño de mutantes de lote de la segunda cubierta en la quimera 1 (SspN-NpuC) y la quimera 2 (NpuN-SspC). En cada caso, la ubicación de los mutantes (representados como barras) se muestra usando la estructura cristalina de Npu (pdb = 4kl5). Los residuos catalíticos se muestran en negro (representados como barras). El panel C muestra las velocidades hacia adelante (k-i, azul) y hacia atrás (k2, rojo) de formación de productos intermedios ramificados a partir de materiales de partida para los diversos constructos descritos en este estudio (error = DE (n = 3)). El panel D muestra la velocidad de resolución de ramificaciones (k3) de los diversos constructos (error = DE (n = 3)).
A continuación, se investigaron las contribuciones individuales de los residuos dentro de los mutantes de lote 1 y 2, ya que estos tuvieron el efecto más profundo sobre la actividad de corte y empalme. Para el lote 2, la mutagénesis adicional muestra que la interacción entre F56, K70 y D85 es probablemente responsable de la mayor velocidad de formación de ramificaciones en NpuN (figura 5A). Pruebas estructurales respaldan estos datos, ya que K70 es una parte del bucle B del bloque TXXH altamente conservado en NpuN (residuos 69-72) que cataliza el desplazamiento inicial de acilo de N a S en el corte y empalme de proteínas.9 Por lo tanto, la posición y la dinámica de K70 (empaquetado contra F56 y D85) deben tener un impacto directo en los residuos catalíticos T69 y H72 (figura 5B).10-12 Del lote 1, K73, M75 y M81 son responsables de la velocidad más rápida de resolución de ramificaciones en NpuN (figura 6A). Estos residuos se empaquetan alrededor de la asparagina terminal de la C-inteína, que debe experimentar la formación de succinimida en la etapa final del corte y empalme de proteínas (figura 6B). Tomados en conjunto, los datos de mutagénesis apuntan al papel clave que desempeñan los residuos “aceleradores” de la segunda cubierta en el ajuste de la actividad de las inteínas divididas.
La figura 5 muestra el análisis cinético de mutaciones del lote 2 y modelos generados por ordenador de acuerdo con una realización de la invención. El panel A muestra las velocidades de equilibrio de la formación de ramificaciones (k1, k2) y las velocidades de resolución de ramificaciones (k3) para los mutantes puntuales individual (A83P), doble (A83P, S70K) y triple (L56F, S70K, A83P) de SspN que comprenden el lote 2 (L56F, S70K, A83P, E85D) (error = DE (n=3)). El panel B muestra una vista ampliada del lote 2 (barras verdes junto a las etiquetas F56, K70, P83 y D85) en el sitio activo de Npu (pdb = 4kl5). Los residuos catalíticos se presentan como barras negras.
La figura 6 muestra un análisis de mutaciones del lote 1 y modelos generados por ordenador de acuerdo con una realización de la invención. El panel A muestra las velocidades de equilibrio de la formación de ramificaciones (k1, k2) y las velocidades de resolución de ramificaciones (k3) para los mutantes puntuales individual (R73K), doble (R73K, Y79G) y triple (R73K, Y79G, L81M) que comprenden el lote 1 (error = DE (n=3)). El panel B muestra una vista ampliada del lote 1 (barras rojas junto a las etiquetas K73, M75, G79 y M81) en la estructura de Npu (pdb = 4kl5). Los residuos catalíticos se presentan como barras negras.
Los residuos “aceleradores” que se encuentra que afectan a la velocidad de corte y empalme permiten un enfoque guiado por la actividad para diseñar una inteína DnaE consenso. La ingeniería de proteínas de consenso es una herramienta aplicada a un conjunto homólogo de proteínas para crear una variante termoestable derivada de la familia original.1314 En primer lugar, se genera una alineación de secuencias múltiples (MSA) a partir de homólogos de una proteína particular, de la cual se elige el residuo más frecuente estadísticamente en cada posición como representante en la secuencia consenso. Para las inteínas DnaE, se identificaron 105 secuencias a través de una búsqueda BLAST15 de las bases de datos JGI16 y NCBI17 (figura 7A). A continuación, la alineación se filtró para que contuviera solo secuencias que portaban los indicadores de segunda cubierta de corte y empalme rápido: k7o, M75, M81 y S136. Las 73 inteínas teóricamente rápidas que quedaban en la MSA (figura 7B) se usaron entonces para generar una secuencia de inteína DnaE rápida consenso (Cfa) (figura 1). Las diversas secuencias divulgadas en las figuras 7A y 7B se presentan a continuación:
>NpuPCC73102/1-137
CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTYYSYDNNGMYTQPYAQWHDRGEQE
VFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN (SEQ ID NO: 5) IKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN (SEQ ID NO: 6) >CthPCC7203:/1-137 Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKIVEERIECTVYSVDNNGFIYTQPIAQWHNRGQQEV
FEYCLEDGSIIRATKDHKFMTFEGKMLPIDEIFEQELDLKQVKSIQN (SEQ ID NO: 7) VKnSRKSLGIQPVYDIGVERDHKFVLKNGLVASN (SEQ ID NO:8) >NspCCY9414:/1-137 genoma de Nodularia spumigena CCY9414
CLS YDTEILTVEY GYIPIGEIVEKAIEC S VY S VDNN GNVYTQPIAQWHNRGEQE
VFEYSLEDGSTIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFAQELDLLQVHGLPK (SEQ ID NO: 9) VKITARKFVGRENVYDIGVERYHNFAIKNGLIASN (SEQ ID NO: 10)
>AcyPCC7122:/1-137 Anabaena cylindrica PCC 7122
CLSYDTEVLTVEYGFMGEIVEKRIECSIFSVDKNGNVYTQPIAQWHNRGRQEI
YEYCLDDGSKIRATKDHKFMTTAGEMLPIDEIFERDLDLLKVEGLPE (SEQ ID NO: 11) VKIISRQYLGQADVYDIGVEEDHNFAIKNGFIASN (SEQ ID NO: 12) >CspPCC7507:/1-137 Calothrix sp. PCC 7507, genoma completo
CLSYDTEVLTVEYGLLPIGEIVEKGIECRWSVDNHGNVYTQPIAQWHNRGQQE
WEYGLDDGSVIRATKDHKFMTTDGKMLPIDEIFERGLDLLQVQGLPE (SEQ ID NO: 13) VKVITRKYIGKENVYDIGVELDIINFAIRNGLVASN (SEQ ID NO: 14) >NspPCC7524:/1-137 Nostoc sp. PCC 7524
CLSYDTEILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTVFSVASNGIVYTQPIAQWHNRGQQEIF
EYCLEDGSIIRATKDHKFMTQDGQMLPIDEIFACELDLLQVQGLPE (SEQ ID NO: 15) VKVVTRKYIGKENVYDIGVERDHNFVIRNGLVASN (SEQ ID NO: 16) >Naz0708:/1-137 'Nostoc azollae ' 0708
CLS YKTE VLT VE Y GLIPIGEIVEKRIEC SLF S VDEN GNIYT QPIAQ WHHRGVQE V
YEYCLDDGTIIRATKDHKFMTTIGEMLPIDEIFERDLNLLQVNGLPT (SEQ ID NO: 17) VKÜSRQFLGPANVYDIGVAQDHNFAIKNGLIASN (SEQ ID NO: 18) >NspPCC7120:/1-137 ADN de Nostoc sp. PCC 7120
CLSYDTEVLTVEYGFVPIGEIVEKGIECSVFSINNNGIVYTQPIAQWHHRGKQEV
FEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPE (SEQ ID NO: 19) IKIASRKFLGVENVYDIGVRRDHNFFIKNGLIASN (SEQ ID NO: 20) >AvaATCC29413/1-137 Anabaena variabilis ATCC 29413
CLS YDTE VLT VE Y GF VPIGEIVDKGIEC S VF SE) SNGIVYT QPIAQWHHRGKQE V
FEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPE (SEQ ID NO: 21) IKIASRKFLGVENVYDIGVGRDHNFFVKNGLIASN (SEQ ID NO: 22)
>PspPCC7327:/1-135 Pleurocapsa sp. PCC 7327.
CLSYDTKILTVEYGAMPIGKIVEEQIDCTVYTVNQNGFVYTQPIAQWHDRGKQ
EIFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDKIFEKGLDLKTINCD (SEQ ID NO: 23) VKILSRKSLGIQSVYDIGVEKDFiNFLLANGLVASN (SEQ ID NO: 24)
>CspPCC7424:/1-135 Cyanothece sp. PCC 7424
CLSYETQIMTVEYGLMPIGKIVEEQIDCTVYTVNKNGFVYTQPIAQWHYRGEQ
EVFEYCLEDGSTIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFEQGLELKQIHLS (SEQ ID NO: 25)
V K I1SR Q SLG IQ PV Y D IG V E K D H N FLISD G L IA SN (SEQ ID NO : 26)
>CspPCC7822:/1-134 Cyanothece sp. PCC 7822
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEEQIECTVYTVDKNGLVYTQPIAQWHHRGQQE
VFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTDDGQMLPIEEIFEKGLELKQIIL (SEQ ID NO: 27) VKIISRQLAGNQTVYDLGVEKDHNFLLANGLIASN (SEQ ID NO: 28)
>NspPCC7107:/1-137 Nostoc sp. PCC 7107
CLSYDTQVLTVEYGLVPIGEIVEKQLECSVFTIDGHGYVYTQAIAQWHNRGQQ
EVFEYGLEDGSVIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERELDLLQVQGLRW (SEQ ID NO: 29) VKIITRKYIGQANVYDIGVAQDHNFVIENRLIASN (SEQ ID NO: 30)
>TboIicb1/1-136 Tolypothrix bouteillei Iicb1
CLS YDTEILTVEY GFLPIGKIVEKGIECNVY S VDKNGNIYTQPIAQWHDRGEQE
VFEYCLENGSVIRATKDHKFMTTSGEMLPIDEIFERGLDLIRVEDLP (SEQ ID NO: 31) VKILTRKSIGKQTVYDTGVERDHNFVIKNGSVASN (SEQ ID NO: 32)
>Aov:/1-136 gen precursor de DnaE (dnaE) de Aphanizomenon ovalisporum
CLSADTEILTVEYGFLPIGEIVGKAIECRVYSVDGNGNIYTQSIAQWHNRGEQEV
FEYTLEDGSIIRATKDHKFMTTDGEMLPIDEXFARQLDLMQVQGLH (SEQ ID NO: 33) V K ITA RK FV G REN V Y D IG V EH H H N FA IK N G LIA SN (SEQ ID NO: 34) >OnvPCC7112:/1-137 Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112
CLSYDTKILTVEYGPMAIGKIVEEKIECTVYSVDSNGYIYTQSIAQWHRRGQQE
VFE Y CLEDGSIIRATKDHKFMT VGGQMLPIDEIFEQGLDLKQIN S S SD (SEQ ID NO: 35) >RspPCC7116:/1-135 Rivularia sp. PCC 7116, genoma completo
CLS YDTEVLTEEF GLIPIGKIVEEKIDCT VY S VD VNGNVYSQPIAQWHNRGMQE
VFEYELEDGSTIRATKDHKFMTVDGEMLAIDEIFEKGLELKRVGIY (SEQIDNO: 37) VKIISRKVLKTENVYDIGLEGDHNFIIKDGLIASN (SEQ ID NO: 38) >TerIMS101:/1-137 Trichodesmium erythraeum IMS101
CLTYETEIMTVEYGPLPIGKIVEYRIECTYYTVDKNGYIYTQPIAQWHNRGMQE
VYEYSLEDGTVIRATPEHKFMTEDGQMLPIDEIFERNLDLKCLGTLEL (SEQ ID NO: 39) VKIVSRKLAKTENVYDIGVTKDHNFVLANGLIASN (SEQ ID NO: 40) >MspPCC7113:/1-137 Microcoleus sp. PCC 7113,
CLS YD SEILTVE Y GLMPIGKIVEEGIEC TV Y S VD SHGYL YTQPIAQ WHHRGQQE
VFEYDLEDGSVIRATKDHKFMTSEGQMLAIDEIFERGLELKQVKRSQP (SEQ ID NO: 41) VKIVRRKSLGIQTVYDIGVERDHNELLANGLVASN (SEQ ID NO: 42) >ScyPCC7437:/1-137 Stanieria cyanosphaera PCC 7437
CLSYDTEILTVEYGAMPIGKIVKEQIECNVYTVNQNGFIYPQAIAQWHERGKQE
IFEYTLDNGLVIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFERGLELQRINDYSN (SEQ ID NO: 43) VKIVSRKSLGKQPVYDIGVTKDHNFLLSNGW ASN (SEQ ID NO: 44) >CspPCC6303:/1-137 Calothrix sp. PCC 6303
CLS YDTEILTWE Y GFLKIGEIVEKQILC S W S VDEQGNVYTQPIAQWHNRGLQE
LFAYQLEDGGVIRATKDHKFMTTDGQMLAIDEIFERQLDLFQVKGLPE (SEQ ID NO: 45) VKnSRKVLKTENYYDIGLEGDHNFIIKDGLIASN (SEQ ID NO: 46)
>Cst/1-134 PCC7202: Cyanobacterium stanieri PCC 7202
CLSYDTEVLTVEYGVLPIGKIVEEQIQCTVYSVDQYGFVYTQAIAQWHDRGEQ
EWEYELENGATIKATKDHKMMTSDGQMLPIDQIFEQGLDLFMVSF (SEQ ID NO: 47) VKIVKRRSHGIQKVYDIGVAKDHNFLLHNGLVASN (SEQ ID NO: 48) >CspATCC51142:/1-134 Cyanothece sp. ATCC 51142
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCTVYTVDPNGFVYTQAIAQWHYRGEQE
IFEYYLEDGATIRATKDHKFMTMEGKMLPIDEIFENNLDLKQLTL (SEQ ID NO: 49) VKIIGRQSLGVQKVYDIGVEKEHNFLLHNGLIASN (SEQ ID NO: 50) >CspPCC8801:/1-134 Cyanothece sp. PCC 8801
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKVVEENIDCTVYTVDKNGFVYTQNIAQWHLRGQQE
VFEYYLDDGSILRATKDHQFMTLEGEMLPIHEIFERGLELKKIKI (SEQIDNO: 51) VKIVSYRSLGKQFVYDIGVAQDHNFLLANGSIASN (SEQ ID NO: 52)
>Asp:/1-136 cromosoma 90 de Anabaena sp.
CLSYDTEILTVEYGFLEIGEIVEKQffiCKVYTIDSNGMLYTQSIAQWHNRGQQE VYEYLLENGAIIRATKDHKFMTEAGQMLPIDEIFAQGLDLLQVGVAE (SEQ ID NO: 53)
VKIVSRTYVGQANVYDIGVESDHNFVIKNGFIASN (SEQ ID N 0 54)
>Aha:/1-137 Aphanothece halophytica
CLSYDTEIWTVEYGAMPIGKIVEEKIECSVYTVDENGFVYTQPIAQWHPRGQQE
IIEYTLEDGRKIRATKDHKMMTESGEMLPIEEIFQRELDLKVETFHEM (SEQ ID NO: 55) VKIIKRQSLGRQNVYDVCVETDHNFVLANGCVASN (SEQ ID NO; 56)
>HspPCC7418:/1-137 Halothece sp. PCC 7418
CLS YDTEIWTVE Y GAMPIGKIVEEKIEC S VYTVDENGF VYT QPIAQWHPRGQQE
IIEYTLEDGRKIRATKDHKMMTESGEMLPIEEIFQRELDLKVETFHEM (SEQ ID NO: 57)
VKIIKRQSLGRQNVYDIGVETDHNFVLANGCVASN (SEQ ID NO:58)
>CapPCC10605:/1-137 Cyanobacterium aponinum PCC 10605
CLSYDTEILTVEYGAISIGKIVEEKINCQVYSVDKNGFIYTQNIAQWHDRGSQEL
FEYEFEDGRIIKATKDHKMMTKDGQMFAINDIFEQEFEFYSVDDMGV (SEQ ID NO:59)
VKIVKRRSFGVQPVYDIGVEKDHNFIFANGFVASN (SEQ ID NO 60)
>Cat:/1-133 aislado de Candidatus Atelocyanobacterium thalassa
CLSYDTKVLTVEYGPLPIGKWQENIRCRVYTTNDQGLIYTQPIAQWHNRGKQ
EIFEYHLDDKTIIRATKEHQFMTVDHVMMPIDEIFEQGLELKKIK (SEQ ID NO:61)
LKIIRRKSLGMHEVFDIGLEKDHNFVLSNGLIASN (SEQ ID NO: 62)
>Oli:/1-137 precursor de DnaE 'Solar Lake' de Oscilatoria limnetica
CLS YNTE VLT VE Y GPLPIGKIVDEQIHCRVY S VDEN GF V YT Q AI AQ WHDRGY Q
EIFAYELADGSVIRATKDHQFMTEDGQMFPIDEIWEKGLDLKKLPTVQD (SEQ ID NO:63)
VKIVRRQSLGVQNVYDIGVEKDHNFLLASGEIASN (SEQ ID NO 64)
>Cen:/1-137 Cianobacteria endosimbionte de Epithemia túrgida
CLSYDTEVLTVEYGAIPIGRMVEESLDCTVYTVDKNGFVYTQSIQQWHSRGQQ
EIFEY CFEDGSIIRATKDHKFMTAEGKMS SIHDIFEQGLELKKIIPW SG (SEQ ID NO:65) AKnSCKSLGKQSVYDIGW QDHNFLLANGW ASN (SEQ ID NO 66)
>SspPCC7502:/1-133 Synechococcus sp. PCC 7502
CLGYDTPVLTVEY GFMPIGKIVEEKIQCHVY S VDQNGLVFTQAIAQWHNRGQQ
EVWEYNLDNGDIVRATKDHKFMTIDGQMLPINQIFEQGLELKVIA (SEQ ID NO:67) VKIVSCKPLRVQTVYDIGVEKDHNF1LDNGLVASN (SEQ ID NO 68) >DsaPCC8305:/1-134 Dactylococcopsis salina PCC 8305
CLS YDTEVLTEE Y GAIPIGKIVEERMNCHVY S VDENGFIY SQPIAQWHPRGEQE
WEYTLEDGKIIRATADHKMMTETGEMLPffiQIFQQQLDLKISNQ (SEQ ID NO:69) VKIINRQSLGKQTVYDIGVEKDHNFILGNGLVASN (SEQ ID NO 70) >CstPCC7417:/1-137 Cylindrospermum stagnate PCC 7417
CLS YDTEILTVE Y GFIPIGEIVEKRIEC S VY S VDNHGNVYTQPIAQWHNRGLQE V
FEYCLEDGSTIRATKDHKFMTTDKEMLPIDEIFERGLDLLRVEGLPI (SEQ ID NO:71) VKIIMRSYVGRENVYDIGVERDHNFVAKNGLIAAN (SEQ ID N 0 72) >SsPCC6803:/1-137 Synechocystis sp. PCC 6803
CLSF GTEILTVE Y GPLPIGKIV SEEINC S VY S VDPEGRVYTQAIAQWHDRGEQE V
LEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQ (SEQ IDNO:73) VKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIAAN (SEQ ID NO:74) >GspPCC7407:/1-137 Geitlerinema sp. PCC 7407
CLSYETPVMTVEYGPLPIGRTVEEQLDCTVYSVDEQGHVYTQPVAQWHHRGL
QEWEYELEDGRRLRATADHRFMTETGEMLPLAEIFERGLELRQVALRVP (SEQ ID NO: 75)
VKIVSRRSLGMQLVYDIGVAADHNFVLADGLIAAN (SEQ ID N 0 76) >SspPCC6714:/1-137 Synechocystis sp. PCC 6714
CLSFD AEILT VE Y GPL SIGKIVGEEINC S VY S VDPQGRIYT Q AI AQ WHDRGV QE V
FEYELEDGSVTRATPDHRFLTTDYELLAIEEIFARQMDLLTLTNLKL (SEQ IDNO:77) VKWRRRSLGMHRVFDIGLAQDHNFLLANGAIAAN (SEQ ID NO 78) >MaePCC7806:/1-135 Microcystis aeruginosa PCC 7806
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEVNCT VY S VDKNGF VYSQPISQWHERGLQE
VFEYTLENGQTIQATKDHKFMTNDGEMLAIDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ ID NO: 79) VKIISRQSLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID NO:80) >MaeNIES843:/1-135 ADN de Microcystis aeruginosa NIES-843 DNA
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEINCTVYTVDQNGF VYSQPISQWHERGLQE V
FEYTLENGQTIQATKDHKFMTSDGEMLAIDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ ID NO:81) VKIIGRQSLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID N 0 82) >AmaMBIC11017:/1-137 Acaryochloris marina MBIC11017,
CLSYDTPVLTLEYGWLPIGQWQEQIECQVFSINERGHLYTQPIAQWHHRGQQ
EVFEYTLADGSTIQATAEHQFMTTDGQMYPVQQIFEEGLSLKQLPLPWQ (SEQ ID NO:83)
VKIIQRRSLGLQSVYDIGLAQDHNFVMANGWVAAN (SEQ ID N 0 84)
>LspPCC7376:/1-137 Leptolyngbya sp. PCC 7376
CLDGETPIVT VE Y GVLPIREIVEKELLC S VY SIDEN GF VYT QP VEQWHQRGDRQ
MFEYQLDNGGVIRATPDHKFLTTEGEMVAIDEIFEKGLNLAEFAPADL (SEQ ID NO:85)
VKILRRHSIGKAKTYDIGVSKNHNFLLANGLFASN (SEQ ID NO:86)
>SelPCC6301:/1-137 Synechococcus elongatus PCC 6301
CLAADTEVLTVEYGPIAIGKLVEENIRCQVYCCNPDGYIYSQPIGQWHQRGEQE
VIEYELSDGRIIRATADHRFMTEEGEMLSLDEIFERSLELKQIPTPLL (SEQ ID NO:87) VKIVRRRSLGVQPVYDLGVATVHNFVLANGLVASN (SEQ ID NO 88)
>SspPCC6312:/1-137 Synechococcus sp. PCC 6312
CLSADTELYTVEYGWLPIGRLVEEQIECQVLSVNAHGHVYSQPIAQWHRRAW
QEVFEYQLETGGTIKATTDHQFLTTDGQMYRIEDIFQRGLDLWQLPPDRF (SEQ ID NO:89) VKnSRCSLGIQPVYDIGVAQDHNFVIRGGLVASN (SEQ ID NO:90)
>Tel:/1-137 ADN de Thermosynechococcus elongatus BP-1
CLSGETAVMTVEYGAVPIRRLVQERLSCHVYSLDGQGHLYTQPIAQWHFQGFR
P V YE Y QLEDGSTICATPDHRFMTTRGQMLPIEQIFQEGLELWQVAIAPR (SEQ ID NO:91)
GKIVGRRLMGWQAVYDIGLAADHNFVLANGAIAAN (SEQ ID NO 92)
>Tsp:/1-137 genoma de Thermosynechococcus sp. NK55
CLSGET AVMT VE Y GA VPIRRL V QERLT CHV Y SLD AQGHL YTQPIAQWHF QGF
RPVYEYQLEDGSTIWATPDHRFMTTRGQMLPIEQIFQEGLELWQGPIAPS (SEQ ID NO:93)
CKIVGRQLVGWQAVYDIGVARDHNFLLANGAIAAN (SEQ ID NO:94)
>Tvu:/1-137 precursor de DnaE de Thermosynechococcus vulcanus
CLSGET AVMTVE Y GAIPIRRL VQERLICQ VY SLDPQGHL YTQPIAQWHF QGFRP
VYAYQLEDGSTICATPDHRFMTTSGQMLPIEQIFREGLELWQVAIAPP (SEQ IDNO:95)
CKIVGRRLVGWQAVYDIGLAGDHNFLLANGAIAAN (SEQ ID NO:96)
>SspPCC7002:/1-137 Synechococcus sp. PCC 7002
CLAGGTPWTVEYGVLPIQTIVEQELLCHVYSVDAQGLIYAQLIEQWHQRGDR
LLYEYELENGQMIRATPDHRFLTTTGELLPIDEIFTQNLDLAAWAVPDS (SEQ IDNO:97) VKIIRRKFIGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLIAAN (SEQ ID N 0 98)
>ShoPCC7110:/1-136 Scytonema hofmanni PCC 7110 contig00136
CLSYDTEVLTAEYGFLPIGKIVEKAIECTVYSVDNDGNIYTQPIAQWHDRGQQE
WEYSLDDGSVIRATKDHKFMTTGGQMLPIDEIFERGLDLMRIDSLP (SEQ IDNO:99) VKILTRKSIGKQTVYDIGVERDEINFVTKNGLVASN (SEQ ID NO 100) >WinUHHT291/1-136 Westiella intricata UH HT-29-1
CLSYDTEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECTVYTVDTNGYVYTQAIAQWHNRGEQE
VFEYALEDGSIIRATKDHKFMTSEGQMLPIDEIFYKGLDLLQVQGLP (SEQ ID NO: 101) VKIITRKFLGIQNVYD1GVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 102) >FspPCC9605:/1-136 Fischerella sp. PCC 9605 FIS9605DRAFT
CLSYDTEILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTVYTVDNNGNVYTQTIAQWHNRGQQE
VFE Y CLEDGS VIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIF ARGLDLLQ VKNLP (SEQ ID NO: 103) VKTVTRRPLGTQNVYDIGVESDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 104) >MrePCC10914:/1-137 Mastigocladopsis repens PCC 10914
CLSYDTEVLTVEYGFLPIGEIVEKSIECSVYTVDSNGNVYTQPIAQWHNRGQQE
VFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTIHGQMLPIDEIFERGLELMKIQGLPE (SEQ ID NO: 105) AKIITRKSLGTQNVYDIGVERDHNFVTRDGFIASN (SEQ ID NO: 106) >ShoUTEX2349:/1-137 [Scytonema hofmanni ] UTEX 2349
CLS YN SEVLT VE Y GFLPIGKIVEKGIEC S VY S VD S Y GKIYT Q VIAQ WHNRGQQE
VFEYCLEDGTIIQATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERGLDLMQVQGLPD (SEQ ID NO: 107) VKIITRKSLGTQNVYDIGVSSDHNFVMKNGLIASN (SEQ ID NO: 108) >AspPCC7108:/1-137 Anabaena sp. PCC 7108 Ana7108scaffold_2_Cont3
CLS SDTEVLTVE Y GLIPIGEIIEKRIDC S VF S VDKNGNIYT QPIAQWHDRGIQEL Y
EYCLDDGSTIRATKDHKFMTTAGEMLPIDEIFERGLDLLKVHNLPQ (SEQ ID NO: 109) VKIITRNYVGKENVYDIGVERDHNFAIKNGLIASN (SEQ ID NO: 110) >FspPCC9339:/1-137 Fischerella sp. PCC 9339 PCC9339DRAFT CLSYDTEVLTVEYGFLPIGErVEKRIECTVYTVDHNGYVYTQPIAQWHNRGYQ E VFE Y GLEDGS VTRATKDHKFMTSEGQMLPIDEIF ARELDLLQ VT GL VN (SEQ ID NO: 111) VKIVTRRLLGIQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 112) >Csp336:/1-137 Calothrix sp. 336/3
CLSYDTEIFTVEYGFLPIGEIVEKRLECTVLTVDNHGNIYSQPIAQWHHRGQQQI
YEYGLEDGSVTRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLLQVTNLDN (SEQ ID NO: 113) VKVITRKLADTENVYDIGVENHHNFLIKNGLVASN (SEQ ID NO: 114) >FthPCC7521:/1-136 Fischerella thermalis PCC 7521
CLSYETEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECSVYTVDNNGYYCTQPIAQWHNRGYQE
VFEYGLEDGSVTRATKDHKFMTIDRQMLPIDEIFARGLDLLQVTGLP (SEQ ID NO: 115)
VKIITRKSLGTQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 116)
>CyaPCC7702/1-137 Cyanobacterium PCC 7702 Chl7702
CLSYDTEILTVEYGFLSIGEIVEKEIECTVYTVDSNGYIYTQPIAQWHEQGEQEIF
EYSLEDGSTIRATKDHKFMTIEGEMLPIDQIFARQLDLMQITGLPQ (SEQ ID NO:l 17)
VKISTKKSLGKQKVYDIGVVRDHNFIIKNGFVASN (SEQ ID NO: 118)
>FspPCC943171-136 Fischerella sp. PCC 9431
CLSYDTEVLTVEYGFLPIGEIVEKRIECTVYTVDTNGYVYTQAIAQWHNRDEQE
VFE YALEDGSIIRATKDHKFMT SEGQMLPIDEIF AKGLDLLQ VQGLP (SEQ ID NO: 119)
VKIVTRKFLGIQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 120)
>FmuPCC7414:/1-137 Fischerella muscicola PCC 7414
CLSYETEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECSVYTVDNNGYVCTQTIAQWHNRGYQE
VFE Y GLEDGS VIRATKDHKFMTIDRQMLPIDEIF ARGLDLLQ VKGLPE (SEQ ID NO: 121)
VKnTRQSLGTQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 122)
>FmuPCC73103:/1-137 Fischerella muscicola SAG 1427-1 = PCC 73103
CLS YDTEVLTVE Y GFLPIGEIVEKTIECNVFTVD SNGYVYTQPIAQWHNRGY QE
VFE Y GLEDGS VIRATKDHKFMT SEGKMLPIDEIF ARELDLLQ VT GLIN (SEQ ID NO: 123)
VKIVTRKFLGIQNVYDIGVEQNHNF VIKNGLV ASN (SEQ ID NO: 124)
>Lae:/1-137 Lyngbya aestuarii BL J laest3.contig.3
CLSYDTEILTVEYGAMGKWDEKIECTVYSVDKNGLIYTQPIAQWHNRGKQE
VFEYSLEDGSTIRATKDHKFMTMDNQMLPIDEILEKGLELKQVNADSV (SEQ ID NO: 125)
VKIVSRKSLDSQTVYDIGVETDHNFLLANGSVASN (SEQ ID NO: 126)
>MspPCC7126:/1-135 Microchaete sp. PCC 7126
CLS YKTQ VLTVE Y GLL AIGEIVEKNIEC S VF S VDIHGNV YT QPIAQWHHRGQQE
VFE Y GLEDGSnRATKDHKFMTT QGEMLPIDEIF ARGLDLLQ VKGV (SEQ ID NO: 127)
VKIITRKYIGKENVYDIGVEQDHNFAIKNGLIAAN (SEQ ID NO: 128)
>Lsp:/1-137 Leptolyngbya sp. JSC-1
CLSYDTEILTVEYGALPIGKrVENQMICSVYSIDNNGYIYIQPIAQWHNRGQQEV FEYILEDGSIIRSTKDHKFMTKGGEMLPIDEIFERGLELAQVTRLEQ (SEQ ID NO: 129)
VKÜSRRSVGVQSVYDIGVKQDHNFFLRNGLIASN (SEQ ID NO: 130) >CwaWH8501:/1-137 Crocosphaera watsonii WH8501
CLSYDTEILTVEYGAMYIGKIVEENINCTVYTVDKNGFVYTQTIAQWHNRGEQ
EIFEYDLEDGSKIKATKDHKFMTIDGEMLPIDEIFEKNLDLKQWSHPD (SEQ ID NO: 131)
VKIIGCRSLGTQKVYDIGVEKDHNFLLANGSIASN (SEQ ID NO: 132)
>CchPCC7420:/1-135 Coleofasciculus chthonoplastes PCC 7420 (Mcht)
CLSYDTQILTVEYGAVAIGEIVEKQIECTVYSVDENGYVYTQPIAQWHNRGEQE
VFEYLLEDGATIRATKDHKFMTDEDQMLPIDQIFEQGLELKQVEVL (SEQ ID NO: 133)
VKIIGRKPLGTQPVYDIGVERDHNFLLFNGSVASN (SEQ ID NO: 134)
>CspPCC6712/1-133
CLSYDTEVLTVEYGAMGKIVEEKIACNVYSVDKNGFVYTQPIAQYHDRGIQE
VFEYRLENGSVIRATKDHKMMTADGQMLPIDEIFKQNLDLKQLN (SEQ ID NO: 135)
VKIISRQSLGKQSVFDIGVAKDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO: 136)
>AflNIES81:/1-132 Aphanizomenon flos-aquae NIES-81
CLSYDTEILTVEYGFLQIGEIVEKQIECKVYTVDSNGILYTQSIAQWHNRGQQEV
YEYLLENGAIIRATKDHKFMTEEGQMLPIDEIFSQGLDLLQV (SEQ ID NO: 137)
VKIISRTYVGQANVYDIGVENDHNFVIKNGFIAAN (SEQ ID NO: 138)
>Rbr:/1-137 Raphidiopsis brookii D9 D9_5,
CLSYETEVLTLEYGFLPIGEIVDKQMVCTWSVNDSGNVYTQPIGQWHDRGVQ
ELYEY CLDDGSTIRATKDHKFMTTQGEMVPIDEIFHQGWEL VQ VSGTMN (SEQ ID NO: 139)
VK TV SRR YLGK A DVYDIGVAKDHNFIIKNGLVASN (SEQ ID NO: 140)
>CspCCy0110:/1-134 Cyanothece sp. CCY0110 1101676644604
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCSVYTVNKNGFVYTQSIAQWHHRGEQE
VFEYYLEDGETIRATKDHKFMTTEGKMLPIDEIFENNLDLKKLTV (SEQ ID NO: 141)
VKHERRSLGKQNVYDIGVEKDHNFLLSNNLIASN (SEQ ID NO 142)
>XspPCC7305:/1-135 Xenococcus sp. PCC 7305
CLSADTEVLTVEYGAISIGKIVEERIECTVYSVDANGFVYTQEIAQWHNRGEQE
VFEYMLDDGSVIRATKDHKLMTIDGQMVAIDEIFSQGLELKQVLGL (SEQ ID NO: 143) VKIVSRKSLGTQTVYDLGVARDHNFLLANGTVASN (SEQ ID NO: 144)
>PspPCC7319:/1-135 Pleurocapsa sp. PCC 7319
CLSYDTEIYTVEYGALPIGKIVESRIKCTVLTVDKNGLVYSQPIVQWHDRGIQEV
FEYTLDNGATIRATKDHKFMTVEGQMLPIDEIFELGLELKEIQQF (SEQ ID NO: 145) VKIISRQSLGKQSVYDIGVAKDHNFLLANGMVASN (SEQ ID NO: 146)
>CraCS505:/1-137 Cylindrospermopsis raciborskii CS-505
CLSYETEVLTLEYGFVPIGEIVNKQMVCTVFSLNDSGNVYTQPIGQWHDRGVQ
DLYEYCLDDGSTIRATKDHKFMTTQGEMVPIDEIFHQGWELVQVSGISK (SEQ ID NO: 147)
VKIVSRRYLGKADVYDIGVAKDHNFIIKNGLVASN (SEQ ID NO: 148)
>SmaPCC6313/1-129 Spirulina major PCC 6313
CLTYDTLVLTVEYGPVPIGKLVEAQINCQVYSVDANGFIYTQAIAQWHDRGQR
QYYEYTLEDGSTIRATPDHKFMTATGEMLPIDQIFEQGLDL (SEQ ID NO: 149)
VKUHRRALPPQSVYDIGVERDHNFLLPSGWVASN (SEQ ID NO: 150)
>SsuPCC9445:/1-131 Spirulina subsalsa PCC 9445
CLSYDTKIITVEYGAIAIGTIVEQGLHCHVYSVDPNGFIYTQPIAQWHQRGEQEV
FAYTLENGSIIQATKDHKFMTQQGKMLPIDTIFEQGLDLLQ (SEQ ID NO: 151)
VKIIKRTSLGVRPVYDIGVIQDHNFLLENGLVASN (SEQ ID NO: 152)
>MaePCC9807:/1-135 Microcystis aeruginosa 9807
CLGGETLILTEEYGLLPIAKIVSEEINCTVYSVDKNGFIYSQPISQWHERGLQEVF
EYTLENGQTIQATKDHKFMTSDGEMLAFDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ ID NO: 153) VKIISRQFLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID NO: 154)
>MspGI1:/1-130 Myxosarcina sp. GI1 contig_13
CLSYDTEVLTLKYGALPIGEIVEKRINCHVYTRAESGFFYIQSIEQWHDRGEQEV
FEYTLENGATIKATKDHKFMTSGGQMLPIDEIFERGLDLL (SEQ ID NO: 155)
VKIVSRKSLGKQPVYDLGVAKDHNFLLANGTVASN (SEQ ID NO: 156)
>LspPCC6406:/1-136 Leptolyngbya sp. PCC 6406
CLSADTQLLTVEYGPLEIGRFVEEQIACHVYSVDANGFVYTQPIAQWHSRGEQE
IFEYQLEDGRTLRATADHKFMTTTGEMGRINDIFEQGLDLKQIDLPQ (SEQ ID NO: 157) VKVVSRQSLGVQPVYDIGVATDHNFLLADGLVASN (SEQ ID NO: 158)
>AspCCMEE5410:/1-132 Acaryochloris sp. CCMEE 5410
CLSYDTPVLTLEYGWLPIGQWQEQIECQVFSINERGHLYTQPIAQWHHRGQQ
EWEYTLTDGSTIQATAEHQFMTTDGQMYPIQQIFEEGLSLKQL (SEQ ID NO: 159)
VKITQRRSLGLQSVYDIGLAQDIINFVIANGWVAAN (SEQ ID NO: 160)
>GhePCC6308:/1-133 Geminocystis herdmanii PCC 6308
CLSYDTEVLTVEFGAIPMGKIVEERLNCQVYSVDKNGFIYTQNIAQWHDRGVQ
EVFEYELEDGRIIKATKDHKMMIENCEMVEIDRIFEEGLELFEVN (SEQ ID NO: 161) VKILKRRSISSQQVYDIGVEKDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO: 162) >NnoPCC7104:/1-133 Nodosilinea nodulosa PCC 7104
CLS ADTELLTLE Y GPLTIGEIVAKRIPCHVF S VDE S GYVYTQP VAQWHQRGHQE
VFEYQLDDGTTIRATADHQFMTELGEMMAIDEIFQRGLELKQVE (SEQ ID NO: 163) VKnSRQSLGVQPVYDIGVARDHNFLLADGQVASN (SEQ ID NO: 164) >RlaKORDI51-271-137 Rubidibacterlacunae KORDI 51-2
CLS YDTEVLTVE Y GPLAIGTIY SERL ACT YYTVDRSGFLY AQ AISQWHERGRQD
VFEYALDNGMTIRATKDHKLMTADGQMVAIDDIFTQGLTLKAIDTAAF (SEQ ID NO: 165) MKIVSRKSLGVQHVYDIGVARDHNFLLANGAIASN (SEQ ID NO: 166) >CfrPCC9212/1-136 Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212
CLSYDTAILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTVYTVDSNGYIYTQPIAQWHNRGEQEL
FE Y SLEDGSIIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIF ARKLELMQ VFCGLP (SEQ ID NO: 167) VKIIAKKSLGTQNVYDIGVERDHNFVTKNGLVASN (SEQ ID NO: 168) >RinHH01:/1-137 Richelia intracellularis HH01 WGS project
CLSYDTQILTVEHGPMSIGEIVEKCLECHVYTVNKNGNICIQTITQWHFRGEQEI
FEYELEDGSFIQATKDHKFMTTTGEMLPIHEIFTNGLEILQLSKSLL (SEQ ID NO: 169) VKILARKSLGTQKVYDIGVNDDHNFALSNSFIASN (SEQ ID NO: 170) >SspPCC7117/1-137
CL AGDTP W T VE Y GVLPIQTIVEQELLC Q VY S VD AQGLIYTQPIEQWHNRGDR
LLYEYELENGQMIRATPDHKFLTTTGELLPIDEIFTQNLDLAAWAVPDS (SEQ ID NO: 171) VKIIRRKFIGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLIAAN (SEQ ID NO: 172) >SspPCC8807/1-137
CLAGDTPWTVE Y GVLPIQTIVEQELLCHVY S VD AQGLIYTQPIEQWHQRGDRF
LYEYELENGQMIRATPDHKFLTTTGKLLPIDEIFTQNLDLAAWAVPDS (SEQ ID NO: 173) VKIIRRKFIGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGFIAAN (SEQ ID NO: 174) >SspNκΒG042902:/1-137 Synechococcus sp. NκΒG 042902
CLAGDTPWTVEYGVLPIQTIVEQELLCHVYSVDAQGLIYTQPIEQWHQRGDR
LLYEYELENGQMIRATPDHKFLTTTGELLPIDEIFTQNLDLAAWAVPDS (SEQ ID NO: 175) VKILRRKFIGRAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLVAAN (SEQ ID NO: 176) >SspNκΒG15041:/1-129 Synechococcus sp. NκΒG15041
CL AGDTP W T VE Y GVLPIRTIVDQELLCH VY SLDPQGFIY AQP VEQ WHRRGDR
LLYEYELETGAVIRATPDHKFLTATGEMLPIDEIFVRNLDL (SEQ ID NO: 177)
VKIIRRNLIGEAATYDIGLGKDHNFLLGQGLIASN (SEQ ID NO: 178)
>SspPCC73109/1-130
CL AGGTP W T VE Y GVLPIQTIVEQELLCHVY S VD AQGLIYTQPIEQWHQRGDR
LLYEYELENGQMIRATPDHKFLTTTGELLPIDEIFTQNLDLL (SEQ ID NO: 179)
VKnRRKFIGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLIAAN (SEQ ID NO: 180)
>SspPCC7003/1-130
CL AGDTP W T VE Y GVLPIQTIVEQELLCHW SVD AQGLI YT QPIEQWHKRGDR
LLYEYELENGQIIRATPDHKFLTTTGEMRPIDEIFAKNLSLL (SEQ ID NO: 181)
VKIIRRKFVGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLIAAN (SEQ ID NO: 182)
>CspPCC8802/1-134: Cyanothece sp. PCC 8802
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKWEENIDCTVYTVDKNGFVYTQNIAQWHLRGQQE
VFEYYLDDGSILRATKDHQFMTLEGEMLPIHEIFERGLELKKIKI (SEQ ID NO: 183)
VKIVSYRSLGKQFVYDIGVAQDHNFLLANGSIASN (SEQ ID NO : 184)
>SelPCC7942:/1-137 Synechococcus elongatus PCC 7942
CLAADTEVLTVEYGPIAIGKLVEENIRCQWCCNPDGYIYSQPIGQWHQRGEQE
VIEYELSDGRIIRATADHRFMTEEGEMLSLDEIFERSLELKQIPTPLL (SEQ ID NO: 185)
VKIVRRRSLGVQPVYDLGVATVHNFVLANGLVASN (SEQ ID NO: 186)
>CfrPCC6912:/1-137 Chlorogloeposis fritschii PCC 6912
CLSYDTAILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTWTVDSNGYIYTQPIAQWHNRGEQEL
FEYSLEDGSIIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFARKLELMQVKGLPE (SEQ ID NO: 187) VKHAKKSLGTQNVYDIGVERDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO: 188)
>CspATC51472:/1-132 Cyanothece sp. ATCC 51472
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCTVYTVDPNGFVYTQAIAQWHYRGEQE
IFEYYLEDGATIRATKDHKFMTMEGKMLPIDEIFENNLDLKQL (SEQ ID NO: 189)
VKIIGRQSLGVQKVYDIGVEKEHNFLLHNGLIASN (SEQ ID NO: 190)
>Lma:/1-132 Lyngbya majuscula
CLS YDTEIITVE Y GPIAIGEIVEKGIPC TV Y SVD SN GYV YT QPIAQWHNRGEQE V
FEYTLDDGSVIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFEGGLELKQL (SEQ ID NO: 191) VKIISRKSLGTQPVYDIGVKDDHNFILANGMVASN (SEQ ID NO: 192)
>CspESFC/1-137
CLS YDTEVLTVE Y GAVPIGKLVEEKLNC S YYTVDPNGYIYTQ AIAQWHDRGIQ
EVFEYQLEDNTIIRATKDHKFMTEDHQMLPIDEIFERGLELKKCPQPQQ (SEQ ID NO: 193)
VKIIRRRSLGFQPVYDIGLEQDHNFLLNQGAIASN (SEQ ID NO: 194)
>SspPCC7002:/1-129 Synechococcus sp. PCC 7002
CLAGGTPWTVEYGVLPIQTIVEQELLCHVYSVDAQGLIYAQLIEQWHQRGDR
LLYEYELENGQMIRATPDHRFLTTTGELLPIDEIFTQNLDL (SEQ ID NO: 195)
VKIIRRKFIGHAPTYDIGLSQDHNFLLGQGLIAAN (SEQ ID NO: 196)
>AmaMBIC11017:/1-132 Acaryochloris marina MBIC11017
CLSYDTPVLTLEYGWLPIGQWQEQIECQWSINERGHLYTQPIAQWHHRGQQ
EVFEYTLADGSTIQATAEHQFMTTDGQMYPVQQIFEEGLSLKQL (SEQ ID NO: 197) V K11Q R R S L G L Q S V Y DIG L A Q D H N F V M A N G W V A A N (SEQ ID NO: 198)
>Mae905:/1-129 Microcystis aeruginosa DIANCHI905
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEVNCT VY S VDKNGF VYSQPISQWHERGLQE
VFEYTLENGQTIQATKDHKFMTNDGEMLAIDTIFERGLDL (SEQ ID NO: 199)
VKIISRQSLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID N0:200)
>AciAWQC310F:/1-125 AWQC: Anabaena circinalis AWQC310F
CLSYDTEILTVEYGFLEIGEIVEKQIECKVYTVDSNGILYTQPIAQWHHRGQQEV
YEYLLENGAIIRATKDHKFMTEAGEMLPIDDIFTQ (SEQ ID NO:201)
VKIISRTYVGQANVYDIGVF.NDHNFVIKNGFVAAN (SEQ ID NO 202)
>AciAWQC131C:/1-125 Anabaena circinalis AWQC131C
CLSYDTEILTVEYGFLEIGEIVEKQIECRVYTVDSNGILYTQPIAQWHYRGQQEV
YEYLLENGAIIRATKDHNFMTEAGEMLPIDDIFTQ (SEQ ID NO: 203)
LKIISRKY VGQ AN V YDIG VENDI INF V1KNGF VAAN (SEQ ID NO: 204)
>CspUCYN:/1-124 Cyanobacterium sp. UCYN-A2
CLSYDTKVLTVEYGPLPIGKWQENIRCRVYTTNDQGLIYTQPIAQWHNRGKQ
EIFEYHLDDKTIIRATKEHQFMTVDHVMMPIDEIFEQ (SEQ ID NO:205)
KIIRRKSLGMHEVFDIGLEKDHNFVLSNGLIASN (SEQ ID NO:206)
>Pst:/1-129 Planktothrix st147: st147 cleanDRAFT c6
CLSYDTEVLTVEYGLIPISKIVEEKIECTVYTVNNQGYVYTQPIAQWHNRGEQE
VFEYYLEDGSVIRATKDHKFMTVEGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:207) VKIISRKSLGTQPVYDIGVQEDHNFVLNNGLVASN (SEQ ID NO 208) >PlaCYA98/1-129: Planktothrix NIVA-CYA 98 CLSYDTEILTVEYGLMPIGKIVKEKffiCTVYTVNNQGYVYTQPIAQWHHRGEQ E VFE YCLEDGSVIRATKDHKFMTVQGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:209) VKIISRKSLGTQPVYDIGVQEDHNFLLNNGLVASN (SEQ ID NO 210)
>FdiUTEX481:/1-137 Fremyella diplosiphon UTEX 481
CLS YDTEVLTVE Y GLIPIGEIVEKRLEC S VY S VDINGNVYTQPIAQWHHRGQQE
VFEYALEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLLQVPHLPE (SEQ ID N 0 :211) VKIVTRRAIGAANVYDIGVEQDHNFAIKNGL1AAN (SEQ ED N 0:212)
> Pst585:/1-129 Planktothrix sp. 585: Longitud=1586997
CLSYDTEILTVEYGLIPISKIVEEKIECTVYTVNNQGYYYTQPIAQWHNRGEQEV
FEYYLEDGSVIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:213)
VKIISRKSLGTQPVYDIGVQEDHNFVLNNGLYASN (SEQ ID N 0 :214)
>NpuPCC73102/1-137
CLS YETEILT VE Y GLLPIGKIVEKRIEC TV Y S VDNN GNIYT QP V AQWHDRGEQE
VFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN (SEQ ID NO:215)
FK IATRK YLG K Q NVYDIG VERDFíNFALK NG FIASN (SEQ ID N O :216)
>CthPCC7203:/1-137 Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKIVEERIECTVYSVDNNGFIYTQPIAQWHNRGQQEV
FEYCLEDGSIIRATKDHKFMTFEGKMLPIDEIFEQELDLKQVKSIQN (SEQ ID NO:217)
V K nSRK SLG IQ PVYDIG VERDH K FVLK NG LVASN (SEQ ID NO 218)
>NspCCY9414:/1-137 genoma de Nodularia spumigena CCY9414
CLS YDTEILT VE Y GYIPIGEIVEK AIEC S V Y S VDNN GN VYT QPIAQWHNRGEQE
VFEYSLEDGSTIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFAQELDLLQVHGLPK (SEQ ID NO:219)
V K IT A R K FV G R E N V Y D IG V E R Y H N FA IK N G L IA SN (SEQ ID N O :220)
>AcyPCC7122:/1-137 Anabaena cylindrica PCC 7122
CLSYDTEVLTVEYGFMGEIVEKRIECSIFSVDKNGNVYTQPIAQWHNRGRQEI
YEYCLDDGSKIRATKDHKFMTTAGEMLPIDEIFERDLDLLKVEGLPE (SEQ ID NO:221)
VK IISR Q Y LG Q A D V Y D IG V EED H N FA IK N G FIA SN (SEQ ID N O :222)
>CspPCC7507:/1-137 Calothrix sp. PCC 7507, genoma completo
CLSYDTEVLTVEYGLLPIGEIVEKGIECRVFSVDNHGNVYTQPIAQWHNRGQQE
VFE Y GLDDGS VTRATKDHKFMTTDGKMLPIDEIFERGLDLLQ V QGLPE (SEQ ID NO:223) VKVITRKYIGKENVYDIGVELDHNFAIRNGLVASN (SEQ ID N 0 224) >NspPCC7524:/1-137 Nostoc sp. PCC 7524
CLSYDTEILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTVFSYASNGIYYTQPIAQWHNRGQQEIF
EYCLEDGSIIRATKDHKFMTQDGQMLPIDEIFACELDLLQVQGLPE (SEQ ID NO:225) V K V VT RK YIGK E N Y Y DIG VE RD H N F YIRN GL V A S N (SEQ ID NO:226) >Naz0708:/1-137 Nostoc azollae' 0708
CLS YKTE VLT VE Y GLIPIGEIVEKRIEC SLF S VDEN GNIYT QPIAQ WHHRGVQE V
YEYCLDDGTIIRATKDHKFMTTIGEMLPIDEIFERDLNLLQVNGLPT (SEQ ID NO:227) VKnSRQFLGPANYYDIGVAQDHNFAIKNGLIASN (SEQ ID N 0 228) >NspPCC7120:/1-137 ADN de Nostoc sp. PCC 7120
CLSYDTEVLTVEYGFVPIGEIVEKGIECSVFSINNNGIVYTQPIAQWHHRGKQEV
FEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPE (SEQ ID NO:229) IKIASRKFLGVENVYDIGVRRDHNFFIKNGLIASN (SEQ ID NO 230) >AvaATCC29413/1-137 Anabaena variabilis ATCC 29413
CLS YD TE VLT VE Y GF VPIGEIVDKGIEC S VF SID SNGIVYT QPI AQWHHRGKQE V
FEYCLEDGSIIKATKDHKFMTQDGKMLPIDEIFEQELDLLQVKGLPE (SEQ ID NO:231) EKIASRKFLGVENVYDIGVGRDHNFFVKNGLIASN (SEQ ID NO 232) >PspPCC7327:/1-135 Pleurocapsa sp. PCC 7327.
CLSYDTKILTVEYGAMPIGKIVEEQIDCTVYTVNQNGFVYTQPIAQWHDRGKQ
EIFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDKIFEKGLDLKTINCD (SEQ ID NO: 233) VKILSRKSLGIQSVYDIGVEKDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO:234)
>CspPCC7424:/1-135 Cyanothece sp. PCC 7424
CLSYETQIMTVEYGLMPIGKIVEEQIDCTVYTVNKNGFVYTQPIAQWHYRGEQ
EVFEYCLEDGSTIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFEQGLELKQIHLS (SEQ ID NO:235) VKIISRQSLGIQPVYDIGVEKDHNFLISDGLIASN (SEQ ID N0 236)
>CspPCC7822:/1-134 Cyanothece sp. PCC 7822
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEEQIECTVYTVDKNGLVYTQPIAQWHHRGQQE
VFEYCLEDGSnRATKDHKFMTDDGQMLPIEEIFEKGLELKQIIL (SEQ ID NO:237) VKnSRQLAGNQTVYDLGVEKDHNFLLANGLIASN (SEQ ID N 0 238) >NspPCC7107:/1-137 Nostoc sp. PCC 7107
CLS YDTQ VLTVEY GLVPIGEIVEKQLEC S VFTIDGHGYVYTQAIAQWHNRGQQ
EVFEYGLEDGSVIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERELDLLQVQGLRW (SEQ IDNO:239) VKIITRKY1GQANVYDIGVAQDHNFVTENRLIASN (SEQ ID NO 240) >TboIicbl/1-136 Tolypothrix bouteillei Iicb1
CLS YDTEILTVEY GFLPIGKIVEKGIECNVY S VDKNGNIYTQPIAQWHDRGEQE
VFEYCLENGSYIRATKDHKFMTTSGEMLPIDEIFERGLDLIRVEDLP (SEQ ID NO:241) VKILTRKSIGKQTVYDIGVERDHNFYIKNGSVASN (SEQ ID N 0 242)
>Aov:/1-136 gen de precursor de DnaE (dnaE) de Aphanizomenon ovalisporum
CLSADTEILTVEYGFLPIGEIVGKAIECRVYSVDGNGNIYTQSIAQWHNRGEQEV
FEYTLEDGSIIRATKDHKFMTTDGEMLPIDEXFARQLDLMQYQGLH (SEQ ID NO:243) VKITARKFVGRENVYDIGVEHHHNFAIKNGLIASN (SEQ ID NO:244) >OnvPCC7112:/1-137 Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112
CLSYDTKILTVEYGPMAIGKIVEEKIECTVYSVDSNGYIYTQSIAQWHRRGQQE
VFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTVGGQMLPIDEIFEQGLDLKQINSSSD (SEQ ID NO:245) VKIISRKSLGTQEVYDIGVEREHNFILENSLVASN (SEQ ID NO:246)
>RspPCC7116:/1-135 Rivularia sp. PCC 7116, genoma completo
CLSYDTEVLTEEFGLTPTGKTVEEKIDCTVYSVDVNGNVYSQPTAQWHNRGMQE
WEYELEDGSTIRATKDHKFMTVDGEMLAIDEIFEKGLELKRVGIY (SEQ ID NO:247) VKIISRKVLKTENVYDIGLEGDEINFIIKDGLIASN (SEQ ID NO:248) >MspPCC7113:/1-137 Microcoleus sp. PCC 7113,
CLS YD SEILTVE Y GLMPIGKIVEEGIEC TV Y S VD SHGYL YT QPIAQ WHHRGQQE
VFEYDLEDGSVIRATKDHKFMTSEGQMLAIDEIFERGLELKQVKRSQP (SEQ ID NO:249) VKIVRRKSLGIQTVYDIGVERDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO 250) >ScyPCC7437:/1-137 Stanieria cyanosphaera PCC 7437
CLSYDTEILTVEYGAMPIGKIVKEQIECNVYTVNQNGFIYPQAIAQWHERGKQE
IFEYTLDNGLVIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFERGLELQRINDYSN (SEQ ID NO:251) VKIY SRKSLGKQPVYDIGVTKDHNFLLSNGW ASN (SEQ ID NO:252) >CspPCC6303:/1-137 Calothrix sp. PCC 6303
CLS YDTEILTWE Y GFLKIGEIVEKQILC S W S VDEQGNVYTQPIAQWHNRGLQE
LF AY QLEDGGVIRATKDHKFMTTDGQML AIDEIFERQLDLF Q VKGLPE (SEQ ID NO:253) VKIISRKVLKTENVYDIGLEGDHNFIIKDGLIASN (SEQ ID NO:254)
>Cst:/1-134 PCC7202: Cyanobacterium stanieri PCC 7202
CLSYDTEVLTVEYGVLPIGKIVEEQIQCTVYSVDQYGFVYTQAIAQWHDRGEQ
EWEYELENGATIKATKDHKMMTSDGQMLPIDQIFEQGLDLFMVSF (SEQ ID NO:255) VKIVKRRSHGIQKVYDIGVAKDHNFLLHNGLVASN (SEQ ID NO:256) >CspATCC51142:/1-134 Cyanothece sp. ATCC 51142
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCTVYTVDPNGFVYTQAIAQWHYRGEQE
IFEYYLEDGATIRATKDHKFMTMEGKMLPIDEIFENNLDLKQLTL (SEQ ID NO:257) VKIIGRQSLGVQKVYDIGVEKEHNFLLHNGLIASN (SEQ ID N 0 258) >CspPCC8801:/1-134 Cyanothece sp. PCC 8801
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKVVEENIDCTVYTVDKNGFVYTQNIAQWHLRGQQE
VFEYYLDDGSILRATKDHQFMTLEGEMLPIHEIFERGLELKKIKI (SEQ ID NO:259) VKIVSYRSLGKQFVYDIGVAQDHNFLLANGSIASN (SEQ ID NO 260)
>Asp:/1-136 cromosoma 90 de Anabaena sp.
CLSYDTEILTVEYGFLEIGEIVEKQIECKVYTIDSNGMLYTQSIAQWHNRGQQE
VYEYLLENGAIIRATKDHKFMTEAGQMLPIDEIFAQGLDLLQVGVAE (SEQ ID NO:261) VKIVSRTYVGQANVYDIGVESDHNFVIKNGFIASN (SEQ ID N 0 262)
>Aha:/1-137 Aphanothece halophytica
CLSYDTEIWTVEYGAMPIGKIVEEKIECSVYTVDENGFVYTQPIAQWHPRGQQE
IIEYTLEDGRKIRATKDHKMMTESGEMLPIEEIFQRELDLKVETFHEM (SEQ ID NO:263) VKIIKRQSLGRQNYYDVCVETDHNFVLANGCVASN (SEQ ID NO 264) >HspPCC7418:/1-137 Halothece sp. PCC 7418
CLS YDTEIWTVE Y GAMPIGKIVEEKIEC S VYTVDENGF VYT QPIAQWHPRGQQE
IIEYTLEDGRKIRATKDHKMMTESGEMLPIEEIFQRELDLKVETFHEM (SEQ ID NO:265) VKIIKRQSLGRQNVYDIGVETDHNFVLANGCVASN (SEQ ID NO 266) >CapPCC10605:/1-137 Cyanobacterium aponinum PCC 10605
CLSYDTEILTVEYGAISIGKIVEEKINCQVYSVDKNGFIYTQNIAQWHDRGSQEL
FEYELEDGRIIKATKDHKMMTKDGQMLAINDIFEQELELYSVDDMGV (SEQ ID NO:267) V K IV K R R SLG V Q PV Y D IG V EK D H N FILA N G LV A SN (SEQ ID N 0 268)
>Cat:/1-133 aislado de Candidatus Atelocyanobacterium thalassa
CLSYDTKVLTVEYGPLPIGKWQENIRCRVYTTNDQGLIYTQPIAQWHNRGKQ
EIFEYHLDDKTIIRATKEHQFMTVDHVMMPIDEIFEQGLELKKIK (SEQ ID NO:269) LKIIRRKSLGMHEVFDIGLEKDHNFVLSNGLIASN (SEQ ID NO:270)
>Oli:/1-137 precurosr de DnaE 'Solar Lake' de Oscilatoria limnetica
CLSYNTEVLTVEYGPLPIGKIVDEQIHCRVYSVDENGFVYTQAIAQWHDRGYQ
EIFAYELADGSVIRATKDHQFMTEDGQMFPIDEIWEKGLDLKKLPTVQD (SEQ ID NO:271) VKIVRRQSLGVQNVYDIGVEKDHNFLLASGEIASN (SEQ ID N 0 272) >Cen:/1-137 Cianobacteria endosimbionte de Epithemia túrgida
CLSYDTEVLTVEYGAMGRMVEESLDCTVYTVDKNGFVYTQSIQQWHSRGQQ
EIFEY CFEDGSIIRATKDHKFMTAEGKMS SIHDIFEQGLELKKIIPW SG (SEQ ID NO:273)
A K IISC K SL G K Q SV Y D IG W Q D H N FL L A N G W A SN (SEQ ID N 0 274)
>SspPCC7502:/1-133 Synechococcus sp. PCC 7502
CLGYDTPVLTVEY GFMPIGKIVEEKIQCHVY S VDQNGLVFTQAIAQWHNRGQQ
EVWEYNLDNGDIVRATKDHKFMTIDGQMLPINQIFEQGLELKVIA (SEQ ID NO:275)
VKIVSCKPLRVQTVYDIGVEKDHNFILDNGLVASN (SEQ ID N 0 276)
>CspUCYN:/1-124 Cyanobacterium sp. UCYN-A2
CLSYDTKVLTVEYGPLPIGKWQENIRCRVYTTNDQGLIYTQPIAQWHNRGKQ
EIFEYHLDDKTIIRATKEHQFMTVDHVMMPIDEIFEQ (SEQ ID NO:277)
KIIRRKSLGMHEVFDIGLEKDHNFVLSNGLIASN (SEQ ID N 0 278)
>Pst:/1-129 Planktothrix st147: st147 cleanDRAFT c6
CLSYDTEVLTVEYGLIPISKIVEEKIECTVYTVNNQGYVYTQPIAQWHNRGEQE
VFEYYLEDGSVIRATKDHKFMTVEGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:279)
VKIISRKSLGTQPVYDIGVQEDHNFVLNNGLVASN (SEQ ID NO 280)
>PlaCYA98/1-129: Planktothrix NIVA-CYA 98
CLSYDTEILTVEYGLMPIGKIVKEKIECTVYTVNNQGYVYTQPIAQWHHRGEQ
EWEYCLEDGSVIRATKDHKFMTVQGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:281)
VKII SRKSLGT QP VYDIG V QEDHNFLLNNGL V A SN (SEQ ID NO:282)
>Pst585:/1-129 Planktothrix sp. 585: longitud=1586997
CLS YDTEILTVE Y GLIPISKIVEEKIEC T YYT VNN QGYY YT QPIAQWHNRGEQE Y
FEYYLEDGSVIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFEKELDL (SEQ ID NO:283) VKIISRKSLGTQPVYDIGVQEDHNFVLNNGLVASN (SEQ ID NO:284)
>CspPCC8802/1-134: Cyanothece sp. PCC 8802
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKVVEENIDCTVYTVDKNGFVYTQNIAQWHLRGQQE
VFEYYLDDGSILRATKDHQFMTLEGEMLPIHEIFERGLELKKIKI (SEQ ID NO:285)
VKIVSYRSLGKQFVYDIGVAQDHNFLLANGSIASN (SEQ ID N 0 286)
>CfrPCC6912:/1-137 Chlorogloeposis fritschii PCC 6912
CLSYDTAILTVEYGFLPIGEIVEKGIECTVYTVDSNGYIYTQPIAQWHNRGEQEL
FEYSFEDGSIIRATKDHKFMTIDGQMFPIDEIFARKFEFMQVKGFPE (SEQ ID NO:287) VKIIAKKSLGTQNVYDIGVERDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:288) >CspATC51472:/1-132 Cyanothece sp. ATCC 51472
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCTVYTVDPNGFVYTQAIAQWHYRGEQE
IFEYYLEDGATIRATKDHKFMTMEGKMLPIDEIFENNLDLKQL (SEQ ID NO:289) VKIIGRQSLGVQKVYDIGVEKEHNFLLHNGLIASN (SEQ ID NO:290)
>Lma:/1-132 Lyngbya majuscula
CLSYDTEIITVEYGPIAIGEIVEKGIPCTVYSVDSNGYVYTQPIAQWHNRGEQEV
FEYTLDDGSVIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFEGGLELKQL (SEQ ID NO:291) VKIISRKSLGTQPVYDIGVKDDHNFILANGMVASN (SEQ ID N 0 292)
>CspESFC/1-137
CLS YDTEVLTYE Y GAVPIGKLVEEKLNC S YYTVDPNGYIYTQ AIAQWHDRGIQ
EVFEYQLEDNTIIRATKDHKFMTEDHQMLPIDEIFERGLELKKCPQPQQ (SEQ ID NO:293) VKIIRRRSLGF QP VYDIGLEQDHNFLLNQG AI A SN (SEQ ID N 0294 )
>Mae905:/1-129 Microcystis aeruginosa DIANCHI905
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEVNCT VY S VDKNGF VYSQPISQWHERGLQE
VFEYTLENGQTIQATKDHKFMTNDGEMLAIDTIFERGLDL (SEQ ID NO:295) VKnSRQSLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID N 0 296)
>RlaKORDI51-2:/1-137 Rubidibacterlacunae KORDI 51-2
CLSYDTEVLTVEYGPLAIGTIVSERLACTVYTVDRSGFLYAQAISQWHERGRQD
VFEYALDNGMTIRATKDHKLMTADGQMVAIDDIFTQGLTLKAIDTAAF (SEQ ID NO:297) M KIVSRKSLGVQHVYDIGVARDHNFLLANGAIASN (SEQ ID N 0 298) >CfrPCC9212/1-136 Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212
CLSYDTAILTVEYGFLPIGEIVEKGffiCTWTVDSNGYIYTQPIAQWHNRGEQEL FEYSLEDGSIIRATKDHKFMTIDGQMLPIDEIFARKLELMQVKGLP (SEQ ID NO:299) VKIIAKKSLG I QNVYDIGVERDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:300) >RinHH01:/1-137 Richelia intracellularis HH01 WGS project
CLSYDTQILTVEHGPMSIGEIVEKCLECHVYTVNKNGNICIQTITQWHFRGEQEI
FEYELEDGSFIQATKDHKFMTTTGEMLPIHEIFTNGLEILQLSKSLL (SEQ ID NO:301) V K ILARK SLG TQ K VYDIG VNDDH NFALSNSFIASN (SEQ ID NO:302) >GhePCC6308:/1-133 Geminocystis herdmanii PCC 6308
CLSYDTEVLTVEFGAIPMGKIVEERLNCQVYSVDKNGFIYTQNIAQWHDRGVQ
EVFEYELEDGRIIKATKDHKMMIENCEMVEIDRIFEEGLELFEVN (SEQ ID NO:303) VKILKRRSISSQQVYDIGVEKDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO 304) >SsuPCC9445:/1-131 Spirulina subsalsa PCC 9445
CLSYDTKnTVEYGAIAIGTIVEQGLHCHVYSVDPNGFIYTQPIAQWHQRGEQEV FAYTLENGSIIQATKDHKFMTQQGKMLPIDTIFEQGLDLLQV (SEQ ID NO:305) KIIKRTSLGVRPVYDIGVIQDHNFLLENGLVASN (SEQ ID NO:306) >MaePCC9807:/1-135 Microcystis aeruginosa 9807
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEINCTVY SVDKNGFIYSQPISQWHERGLQEW
EYTLENGQTIQATKDHKFMTSDGEMLAIDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ ID NO:307) VKIISRQFLGRKPVYDIGVEKDHNFLLGNGLLASN (SEQ ID NO:308)
>MspGI1:/1-130 Myxosarcina sp. GI1 contig_13
CLSYDTEVLTLKYGALPIGEIVEKRINCHVYTRAESGFFYIQSIEQWHDRGEQEV
FEYTLENGATIKATKDHKFMTSGGQMLPIDEIFERGLDLL (SEQ ID NO:309) VKIVSRKSLGKQPVYDLGVAKDHNFLLANGTVASN (SEQ ID NO:310) >ShoPCC7110:/1-136 Scytonema hofmanni PCC 7110 contig00136
CLS YDTE VLT AE Y GFLPIGKIVEK AIEC T VY S VDNDGNIYT QPIAQWHDRGQQE
VFEYSLDDGSVIRATKDHKFMTTGGQMLPIDEIFERGLDLMRIDSLP (SEQ ID NO:311) VKILTRKSIGKQTVYDIGVERDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:312) >WinUHHT291/1-136 Westiella intricata UH HT-29-1
CLSYDTEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECTVYTVDTNGYVYTQAIAQWHNRGEQE
WEYALEDGSIIRATKDHKFMTSEGQMLPIDEIFYKGLDLLQYQGLP (SEQ ID NO:313) VKIITRKFLGIQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:314) >FspPCC9605:/1-136 Fischerella sp. PCC 9605 FIS9605DRAFT
CLSYDTEILTYEYGFLPIGEIVEKGIECTYYTVDNNGNVYTQTIAQWHNRGQQE
WEYCLEDGSVIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFARGLDLLQVKNLP (SEQ ID NO:315) VKIVTRRPLGTQNVYDIGVESDHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:316) >MrePCC10914:/1-137 Mastigocladopsis repens PCC 10914
CLSYDTEVLTVEYGFLPIGEIVEKSIECSVYTVDSNGNVYTQPIAQWHNRGQQE
WEYCLEDGSIIRATKDHKFMTIHGQMLPIDEIFERGLELMKIQGLPE (SEQ ID NO:317) AKIITRKSLGTQNVYDIGVERDHNFVTRDGFIASN (SEQ ID NO:318) >ShoUTEX2349:/1-137 [Scytonema hofmanni] UTEX 2349
CLS YN SEVLT VE Y GFLPIGKIVEKGIEC S VY S VD S Y GKIYT Q VIAQ WHNRGQQE
VFE YCLEDGTIIQATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERGLDLMQVQGLPD (SEQ ID NO:319) VKnTRK SLG TQ NVYDIG VSSDH NFVM K NG LIASN (SEQ ID NO 320) >AspPCC7108:/1-137 Anabaena sp. PCC 7108 Ana7108scaffold_2_Cont3
CLS SDTE VLT VE Y GLIPIGEIIEKRIDC S VF S VDKN GNIYT QPI AQ WHDRGIQEL Y
EYCLDDGSTIRATKDHKFMTTAGEMLPIDEIFERGLDLLKVHNLPQ (SEQ ID NO:321) VKIITRNYVGKENVYDIGVERDHNEAIKNGLIASN (SEQ ID NO 322) >FspPCC9339:/1-137 Fischerella sp. PCC 9339 PCC9339DRAFT
CLS YDTEVLTVE Y GFLPIGEIVEKRIECT VYTVDHNGYVYTQPIAQWHNRGY Q
E VFE Y GLEDGS VTRATKDHKFMTSEGQMLPIDEIF ARELDLLQ VT GL VN (SEQ ID NO:323) VKIVTRRLLGIQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID N 0 324)
>Csp336:/1-137 Calothrix sp. 336/3
CLS YDTEIFTVE Y GFLPIGEIVEKRLECTVLTVDNHGNIYSQPIAQWHHRGQQQI
YEYGLEDGSVIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLLQVTNLDN (SEQ ID NO:325) VKVITRKLADTENVYDIGVENHHNFLIKNGLVASN (SEQ ID NO:326) >FthPCC7521:/1-136 Fischerella thermalis PCC 7521
CLSYETEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECSVYTVDNNGYVCTQPIAQWHNRGYQE
VFE Y GLEDGS VIRATKDHKFMTIDRQMLPIDEIF ARGLDLLQ VT GLP (SEQ ID NO:327) VKIITRKSLGTQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:328) >CyaPCC7702/1-137 Cyanobacterium PCC 7702 Chl7702
CLSYDTEILTVEYGFLSIGEIVEKEIECTVYTVDSNGYIYTQPIAQWHEQGEQEIF
EYSLEDGSTIRATKDHKFMTIEGEMLPIDQIFARQLDLMQITGLPQ (SEQ ID NO:329) VKISTKKSLGKQKVYDIGW RDHNFIIKNGFVASN (SEQ ID NO 330) >FspPCC9431:/1-136 Fischerella sp. PCC 9431
CLSYDTEVLTVEYGFLPIGEIVEKRIECTVYTVDTNGYVYTQAIAQWHNRDEQE
VFEYALEDGSIIRATKDHKFMTSEGQMLPIDEIFAKGLDLLQVQGLP (SEQ ID NO:331) VKIVTRKFLGIQNVYDIGVEQNHNFVTKNGLVASN (SEQ ID N 0 332) >FmuPCC7414:/1-137 Fischerella muscicola PCC 7414
CLSYETEILTVEYGFLPIGEIVEKRIECSVYTVDNNGYVCTQTIAQWHNRGYQE
VFEYGLEDGSVIRATKDHKFMTIDRQMLPIDEIF ARGLDLLQ VKGLPE (SEQ ID NO:333) VK nTRQSLGTQNVYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO :334) >FmuPCC73103:/1-137 Fischerella muscicola SAG 1427-1 = PCC 73103
CLS YDTEVLTVE Y GFLPIGEIVEKTIECNVFTVD SNGYYYTQPIAQWHNRGY QE
VFE YGLEDGSVIRATKDHKFMTSEGKMLPIDEIFARELDLLQVTGLIN (SEQ ID NO:335) VKIVTRKFLGIQNYYDIGVEQNHNFVIKNGLVASN (SEQ ID NO:336)
>Lae:/1-137 Lyngbya aestuarii BL J laest3.contig.3
CLSYDTEILTVEYGAIPIGKWDEKIECTVYSVDKNGLIYTQPIAQWHNRGKQE
VFEYSLEDGSTIRATKDHKFMTMDNQMLPIDEILEKGLELKQVNADSV (SEQ ID NO:337) VKIVSRKSLDSQTVYDIGVETDHNFLLANGSVASN (SEQ ID N 0 338)
>Lsp:/1-137 Leptolyngbya sp. JSC-1
CLSYDTEILTVEYGALPIGKIVENQMICSVYSIDNNGYIYIQPIAQWHNRGQQEV
FEYILEDGSIIRSTKDHKFMTKGGEMLPIDEIFERGLELAQVTRLEQ (SEQ ID NO:339) VKIISRRSVGVQSVYDIGVKQDHNFFLRNGLIASN (SEQ ID NO 340) >CwaWH8501:/1-137 Crocosphaera watsonii WH8501
CLSYDTEILTVEYGAMYIGKIVEENINCTVYTVDKNGFVYTQTIAQWHNRGEQ
EIFEYDLEDGSKIKATKDHKFMTIDGEMLPIDEIFEKNLDLKQWSHPD (SEQ ID NO:341) VKIIGCRSLGTQKVYDIGVEKDHNFLLANGSIASN (SEQ ID NO:342) >CchPCC7420:/1-135 Coleofasciculus chthonoplastes PCC 7420
CLSYDTQILTVEYGAVAIGEIVEKQIECTVYSVDENGYVYTQPIAQWHNRGEQE
WEYLLEDGATIRATKDHKFMTDEDQMLPIDQIFEQGLELKQVEVL (SEQ ID NO:343) VKIIGRKPLGT QP VYDIGVERDHNFLLFNGS V A SN (SEQ ID NO:344) >CspPCC6712/1-133
CLSYDTEVLTVEYGAIPIGKIVEEKIACNVYSVDKNGFVYTQPIAQYHDRGIQE
VFEYRLENGSVIRATKDHKMMTADGQMLPIDEIFKQNLDLKQLN (SEQ ID NO:345) VKIISRQSLGKQSVFDIGVAKDHNFLLANGLVASN (SEQ ID NO:346)
>Rbr:/1-137 Raphidiopsis brookii D9 D9_5,
CLSYETEVLTLEYGFLPIGEIVDKQMYCTVFSVNDSGNVYTQPIGQWHDRGVQ
ELYEY CLDDGSTIRATKDHKFMTTQGEMVPIDEIFHQGWEL VQ VSGTMN (SEQ ID NO:347)
VKIVSRRYLGK ADVYDIGVAKDHNFIIKNGLVASN (SEQ ID NO:348) >CspCCy0110:/1-134 Cyanothece sp. CCY0110 1101676644604
CLSYDTEILTVEYGPMPIGKIVEENINCSVYTVNKNGFVYTQSIAQWHHRGEQE
VFEYYLEDGETIRATKDHKFMTTEGKMLPIDEIFENNLDLKKLTV (SEQ ID NO:349) VKIIERRSLGKQNVYDIGVEKDHNFLLSNNLIASN (SEQ ID NO 350) >XspPCC7305:/1-135 Xenococcus sp. PCC 7305
CLSADTEVLTVEYGAISIGKIVEERIECTVYSVDANGFVYTQEIAQWHNRGEQE
VFEYMLDDGSVIRATKDHKLMTIDGQMVAIDEIFSQGLELKQVLGL (SEQ IDNO:351) VKIVSRKSLGTQTVYDLGVARDHNFLLANGTVASN (SEQ ID NO:352)
>PspPCC7319:/1-135 Pleurocapsa sp. PCC 7319
CLSYDTEIYTVEYGALPIGKIVESRIKCTVLTVDKNGLVYSQPIVQWHDRGIQEV
FEYTLDNGATIRATKDHKFMTVEGQMLPIDEIFELGLELKEIQQF (SEQ ID NO:353) VKnSRQSLGKQSVYDIGVAKDHNFLLANGMVASN (SEQ ID N 0 354)
>CraCS505:/1-137 Cylindrospermopsis raciborskii CS-505
CLSYETEVLTLEYGFVPIGEIVNKQMVCTVFSLNDSGNVYTQPIGQWHDRGVQ
DLYEYCLDDGSTIRATKDHKFMTTQGEMVPIDEIFHQGWELVQVSGISK (SEQ ID NO:355) VKIVSRRYLGKADVYDIGVAKDIINFIIKNGLVASN (SEQ ID NO:356)
>MaePCC7806:/1-135 Microcystis aeruginosa PCC 7806
CLGGETLILTEEY GLLPIAKIV SEEVNCT VY S VDKNGF VYSQPISQWHERGLQE
WEYTLENGQTIQATKDHKFMTNDGEMLAIDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ IDNO:357)
VKIISRQ SLGRKP V YDIG VEKDHNFLLGNGLIASN (SEQ ID NO:358)
>MaeNIES843 :/1-135 ADN de Microcystis aeruginosa NIES-843
CLGGETLILTEEYGLLPIAKIVSEEINCTVYTVDQNGFVYSQPISQWHERGLQEV
FEYTLENGQTIQATKDHKFMTSDGEMLAIDTIFERGLDLKSSDFS (SEQ ID NO:359)
La figura 1 muestra una alineación y un modelo generado por ordenador del diseño de la inteína dividida Cfa según una realización de la invención. El panel A muestra una alineación de secuencias de Npu DnaE y Cfa DnaE. Las secuencias comparten un 82 % de identidad con las diferencias (subrayadas, cian) distribuidas uniformemente a través de la secuencia primaria. Los residuos catalíticos y los residuos “aceleradores” de la segunda cubierta se muestran en signo de intercalación, naranja y asterisco, verde, respectivamente. El panel B muestra los mismos residuos resaltados en el panel que se mapearon en la estructura de Npu (pdb = 4kl5).
La inteína Cfa tiene una alta similitud de secuencia con Npu (82 %), y los residuos no idénticos se extienden por toda la estructura 3D de la proteína.
Se generaron fragmentos de inteína Cfa fusionados con exteínas modelo y se midió su actividad de PTS usando el ensayo in vitro mencionado anteriormente (figura 2). Esto reveló que la inteína Cfa experimenta corte y empalme 2,5 veces más rápido a 30 °C que Npu (t1220 s frente a 50 s), una mejora notable en la actividad ya que esta última es la inteína dividida DnaE más rápida caracterizada (figura 2A). Esta velocidad acelerada se manifiesta tanto en la formación de ramificaciones (aumento de 3 veces) como en la resolución de ramificaciones (aumento de 2 veces). En línea con las inteínas DnaE originales, Cfa retiene la preferencia por un residuo hidrófobo voluminoso en la posición 2 de la C-exteína. Sorprendentemente, Cfa muestra una mayor velocidad de corte y empalme en función de la temperatura y es consistentemente más rápida que Npu (figura 2A). La inteína Cfa incluso mantiene la actividad a 80 °C, aunque con un rendimiento reducido de productos de corte y empalme, mientras que Npu es inactiva a esta temperatura. Estos resultados demuestran que la ingeniería de consenso es eficaz en la producción de una inteína que es altamente activa en un amplio intervalo de temperaturas.
Las aplicaciones de PTS normalmente requieren la fisión de una proteína diana y la fusión de los fragmentos resultantes con los segmentos de inteína dividida apropiados.1 Como consecuencia, la solubilidad de estas proteínas de fusión a veces puede ser escasa. Debido a que se usan con frecuencia desnaturalizantes de proteínas tales como clorhidrato de guanidina (GuHCl) y urea para mantener estos fragmentos menos solubles en disolución, se sometió a prueba la capacidad de Cfa para experimentar corte y empalme en presencia de estos agentes caotrópicos. Se encontró que la inteína Cfa experimenta corte y empalme en presencia de GuHCl hasta 4 M (con poca disminución en la actividad observada hasta 3 M), mientras que no se observó actividad para Npu en GuHCl >3 M (figura 2B). Sorprendentemente, el corte y empalme de Cfa no se ve afectado en gran medida hasta urea 8 M, mientras que el corte y empalme de Npu disminuye drásticamente por encima de urea 4 M (figura 2C).
La figura 2 muestra gráficos que muestran la caracterización de la inteína Cfa de acuerdo con una realización de la invención. En el panel A, se muestran las velocidades de corte y empalme para Cfa y Npu en función de la temperatura. Npu es inactiva a 80 °C (error = DE (n=3)). En los paneles B y C, se muestran las velocidades de corte y empalme para Cfa y Npu en función del caotropo añadido. Npu es inactiva en GuHCl 3 M o urea 8 M. Obsérvese que Cfa tiene actividad residual en GuHCl 4 M (k = 7 x 10-5) (error = DE (n = 3)).
La tolerancia sin precedentes e inesperada de Cfa a altas concentraciones de GuHCl y urea sugiere que la inteína podría retener la actividad directamente después de la extracción caotrópica de proteínas insolubles de cuerpos de inclusión bacterianos, acelerando así los estudios basados en PTS. En consecuencia, la proteína de fusión modelo, His6-Sumo-CfaN, se sobreexpresó en células de E. coli y se extrajo la proteína de los cuerpos de inclusión con urea 6 M. La proteína se purificó a partir de este extracto mediante cromatografía de afinidad de níquel y luego se modificó directa y eficientemente por PTS en condiciones desnaturalizantes, es decir, sin la necesidad de etapas de replegamiento intermedias. En general, se espera que la actividad robusta de Cfa en presencia de agentes caotrópicos resulte útil cuando se trabaja con fragmentos de proteínas que demuestran poca solubilidad en condiciones nativas.
La fusión de una proteína de interés a una inteína dividida puede dar como resultado una reducción marcada en los niveles de expresión celular en comparación con la proteína sola.6 Esta situación se encuentra con mayor frecuencia para fusiones a N-inteínas que a C-inteínas, lo que probablemente se deba al mayor tamaño de las primeras y a su estado parcialmente plegado.18 Por lo tanto, se investigó si la estabilidad térmica y caotrópica mejorada de Cfa se traduciría en niveles de expresión aumentados de fusiones de CfaN. De hecho, estudios modelo en E. coli revelaron un aumento significativo (30 veces) en la expresión de proteína soluble para una fusión de CfaN en comparación con la fusión de NpuN correspondiente (figura 8). Dado este resultado, se investigó si las fusiones de CfaN también presentarían niveles de expresión de proteína aumentados en células de mamífero. En particular, las fusiones de inteínas a la cadena pesada (HC) de anticuerpos monoclonales (mAb) se han convertido en una herramienta poderosa para la conjugación específica de sitio de cargas sintéticas.19-21 Se exploraron los niveles de expresión en células HEK293 de un mAb (aDec205) en función de la N-inteína fusionada a su HC. De acuerdo con los resultados de la expresión bacteriana, la producción de la fusión HC-CfaN fue significativamente mayor que para las otras inteínas examinadas; por ejemplo, los niveles secretados del constructo mAb-Cfa fueron ~10 veces más altos que para la fusión de Npu correspondiente (figuras 3A y 3B). De manera importante, mAb-Cfa retuvo la actividad de PTS y pudo modificarse de manera específica de sitio con un péptido sintético mediante corte y empalme directamente en el medio de crecimiento después de la expresión de cuatro días a 37 °C.
La figura 8 es un análisis de SDS-PAGE de la expresión de prueba de His6-SUMO-NpuN e His6-SUMO-CfaN. Gel teñido con azul brillante de Coomassie a partir de una purificación con Ni-NTA en un volumen de columna (CV) de 4 ml de la fracción soluble de 1 l de cultivo de E. coli. Los carriles corresponden a (P) el sedimento de cuerpo de inclusión, (FT) fracción no retenida de la disolución de Ni-NTA unida al lote, (W1) un lavado de 5 CV con imidazol 5 mM, (W2) un lavado de 5 CV con imidazol 25 mM, (E1-E4) y cuatro eluciones de 1,5 CV de imidazol 250 mM.
Finalmente, para explorar adicionalmente la utilidad de la inteína Cfa en el contexto de la conjugación de anticuerpos, se investigó si el sistema de PTS podría usarse para unir múltiples copias de una carga sintética a la cadena pesada del mAb. En consecuencia, se usó semisíntesis para preparar un constructo en la que la mitad C-terminal de Cfa (CfaC) se fusionó con una C-exteína que contenía un andamio dendrimérico que permite la unión multimérica de la carga, en este caso, fluoresceína (figura 3C). Esta carga dendrítica se unió con éxito al anticuerpo aDec205 por medio de PTS mediada por Cfa, nuevamente realizada directamente in situ dentro del medio de crecimiento celular (figuras 3D y 3E). Esto representa la primera vez que se ha usado PTS para unir un constructo de exteína ramificada a una proteína diana, resaltando el potencial del sistema para manipular la cantidad de carga útil de conjugados de anticuerpo-fármaco.22
La figura 3 muestra la expresión y modificación de un anticuerpo monoclonal de ratón usando la inteína Cfa de acuerdo con una realización de la invención. El panel A muestra la expresión de prueba en células HEK293T de diversos homólogos de IntN (Npu, Mcht, Ava y Cfa) fusionados al extremo C terminal de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal de ratón aDec205. Parte superior: Análisis de inmunotransferencia de tipo Western (IgG de ratón a) de los niveles de anticuerpos presentes en el medio después de la expresión de 96 horas. Parte inferior: inmunotransferencia de tipo Western de a-actina del lisado celular como control de carga. El panel B muestra la cuantificación del rendimiento de expresión normalizado por densitometría de la señal de aDEC205 HC-IntN en el panel A (error = DE (n=4)). El panel C muestra la estructura del constructo de CfaC-dendrímero usado en las reacciones de PTS con la fusión de aDEC205 HC-IntN. Por simplicidad, la secuencia peptídica de CfaC se representa simbólicamente en verde (como un rectángulo con un corte triangular a la izquierda). El panel D es un esquema del enfoque de PTS in situ usado para modificar la HC de un mAb con una carga multivalente. El panel E es un análisis de SDS-PAGE de la reacción de PTS. Carril 1: mAB aDEC205 de ratón de tipo silvestre. Carril 2: Fusión de mAB de aDEC205 de ratón-CfaN Carril 3: adición del CfaC-dendrímero a los medios que contienen el mAB aDEC205-CfaN La reacción de corte y empalme se analizó por fluorescencia (parte inferior) e inmunotransferencia de tipo Western (parte superior, IgG de ratón a).
El descubrimiento de inteínas divididas rápidas ha revolucionado las aplicaciones del corte y empalme en trans de proteínas. La notable robustez de la inteína Cfa descrita en este estudio debe ampliar la utilidad de muchas de estas tecnologías al permitir que se realice PTS en un intervalo más amplio de condiciones de reacción. Además, la capacidad de Cfa para aumentar los rendimientos de expresión de fusiones de N-inteína debe fomentar el uso adicional de inteínas divididas para la semisíntesis de proteínas. El enfoque guiado por la actividad que se usa para diseñar por ingeniería genética esta inteína puede aplicarse a otras familias de inteínas o actuar como estrategia general para el refinamiento de múltiples alineamientos de secuencias usadas para la ingeniería de consenso.
Materiales y métodos
Materiales
Se adquirieron oligonucleótidos y genes sintéticos de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL II y la polimerasa de fusión Pfu Ultra II Hotsart se adquirieron de Agilent (La Jolla, CA). Todas las enzimas de restricción y 2x Gibson Assembly Master Mix se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA). Las células “internas” de alta competencia usadas para la clonación y expresión de proteínas se generaron a partir de E. coli One Shot Bl21 (DE3) químicamente competente y células competentes DH5a con eficiencia de subclonación adquiridas de Invitrogen (Carlsbad, CA). Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Lipofectamine 2000 y suero bovino fetal con bajo contenido en IgG se adquirieron también de Invitrogen. Se adquirieron kits de purificación de ADN de Qiagen (Valencia, CA). Todos los plásmidos se secuenciaron por GENEWIZ (South Plainfield, NJ). Se adquirieron N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), medio Luria Bertani (LB) y todas las sales tamponantes de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Se adquirieron dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), azul brillante de Coomassie, triisopropilsilano (TIS), p-mercaptoetanol (BME), DL-ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanosulfonato de sodio (MESNa), tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (Pd(PPh3)4) y 5(6)-carboxifluoresceína de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) y se usaron sin purificación adicional. Se adquirieron clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) de Gold Biotechnology (St. Louis, MO). El inhibidor de proteasa usado fue el inhibidor de proteasa Roche Complete (Roche, Branchburg, NJ). Se adquirió resina de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) de Thermo Scientific (Rockford, IL). Se adquirieron aminoácidos Fmoc de Novabiochem (Darmstadt, Alemania) o Bachem (Torrance, CA). Se adquirieron hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyAOP) y hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) de Genscript (Piscataway, NJ). Se adquirió la resina Rink Amide-ChemMatrix de Biotage (Charlotte, NC). Se adquirió ácido trifluoroacético (TFA) de Halocarbon (North Augusta, SC). Se adquirieron la membrana de PVDF de inmunotransferencia (0,2 |im) y los geles Criterion XT Bis-Tris (poliacrilamida al 12 %) de Bio-Rad (Hercules, CA). El tampón de ejecución de MES-SDS se adquirió de Boston Bioproducts (Ashland, MA). El anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (Licor mouse 800) y el anticuerpo primario de aActina de ratón se adquirieron de Li-COR biotechnology (Lincoln, NE).
Equipo
La RP-HPLC analítica se realizó en instrumentos Hewlett-Packard series 1100 y 1200 equipados con una columna C18 Vydac (5 |im, 4,6 x 150 mm) a un caudal de 1 ml/min. La RP-HPLC preparativa se realizó en un sistema de LC preparativa Waters compuesto por un módulo de gradiente binario Waters 2545 y un detector UV Waters 2489. Las purificaciones se llevaron a cabo en una columna C18 Vydac 218TP1022 (10 |iM; 22 x 250 mm) a un caudal de 18 ml/min. Todas las ejecuciones usaron TFA al 0,1 % (ácido trifluoroacético) en agua (disolvente A) y acetonitrilo al 90 % en agua con TFA al 0,1 % (disolvente B). A menos que se indique lo contrario, los péptidos y las proteínas se analizaron usando el siguiente gradiente: 0 % de B durante 2 minutos (isocrático) seguido del 0-73 % de B durante 30 minutos. El análisis espectrométrico de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) se realizó en un espectrómetro de masas Bruker Daltonics MicroTOF-Q II. La cromatografía de exclusión molecular se llevó a cabo en un sistema AKTA FPLC (GE Healthcare) usando una columna Superdex S75 16/60 (CV = 125 ml). Se obtuvieron imágenes de geles teñidos con Coomassie e inmunotransferencias de tipo Western usando un generador de imágenes de infrarrojo LI-COR Odyssey. Se obtuvieron imágenes de geles fluorescentes usando un generador de imágenes GE ImageQuant LAS 4000. El ensayo de crecimiento de E. coli dependiente de corte y empalme se realizó en un lector de microplacas sintonizable VersaMax de Molecular Devices. La lisis celular se llevó a cabo usando un sonificador digital S-450D Branson.
Clonación de plásmidos de ADN
Todos los constructos de N-inteína para la expresión en E. coli. se clonaron en los vectores pET y pTXBI usados previamente.1 Los plásmidos que codifican para WT pet30-His6-SUMO-AEY-SspN, pet30-His6-SUMO-AEY-NpuN, pTXB1-SspC-MxeGyrA-His6 y pTXB1-NpuC-MxeGyrA-His6 se clonaron como se describió anteriormente1 y codifican las siguientes secuencias de proteínas. Los productos proteicos después de la escisión de SUMO (N-inteínas) o tiólisis (C-inteínas) se muestran en negrita para todos los plásmidos.
Plásmido 1:
WT SspN: pet30-His6-SUMO-AEY-SspN
Figure imgf000033_0001
Plásmido 2:
WT NpuN: pet30-His6-SUMO-AEY-NpuN
Figure imgf000033_0002
Plásmido 3:
WT SspC: pTXB1-SspC-MxeGyrA-His6
Figure imgf000033_0003
Plásmido 4:
WT NpuC: pTXB1-NpuC-MxeGyrA-His6
Figure imgf000033_0004
Todos los mutantes del lote SspN se clonaron usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange usando el plásmido 1 como molde y codifican las secuencias de proteínas que se muestran a continuación. La secuencia de N-inteína se muestra en negrita con los residuos correspondientes a la mutación del lote subrayada.
Plásmido 5:
Lote 1: Pet30-His6-SUMO-AEY-SspN (R73K, L75M, Y79G, L81M)
Figure imgf000034_0001
Plásmido 6:
SspN R73K: Pet30-Hisfi-SUMQ-AEY-SspN (R73K)
Figure imgf000034_0002
Plásmido 7:
SspN R73K Y79G: Pet3Q-Hisfi-SUMO-AEY-SspN (R73K, Y79G)
Figure imgf000034_0003
Plásmido 8:
SspN R73K Y79G L81M: Pet30-Hisfi-SUMQ-AEY-SspN (R73K, Y79G, L81M)
Figure imgf000034_0004
Plásmido 9:
Lote 2: Pet30-Hisfi-SUMQ-AEY-SspN (L56F, S70K, A83P, E85D)
Figure imgf000034_0005
Plásmido 10:
SspN A83P: Pet30-His6-SUMQ-AEY-SspN (A83P)
Figure imgf000035_0001
Plásmido 11:
SspN S70K A83P: Pet30-Hisfi-SUMQ-AEY-SspN (S70K, A83P)
Figure imgf000035_0002
Plásmido 12:
SspN L56, S70K, A83P: Pet3Q-Hisfi-SUMO-AEY-SspN (L56F, S70K, A83P)
Figure imgf000035_0003
Plásmido 13:
Lote 3: Pet30-His6-SUMQ-AEY-SspN (S23E, E24K, E25R, N27E)
Figure imgf000035_0004
Plásmido 14:
Lote 4: Pet30-His6-SUMQ-AEY-SspN (P35N, E36N, R38N, V39I)
Figure imgf000035_0005
Los cuatro mutantes de lote (lotes 5-8) y mutante puntual A136S en la inteína SspC se clonaron por PCR inversa usando polimerasa Pfu Ultra II HS (Agilent) usando el plásmido 3 como molde y codifican las secuencias de proteínas que se muestran a continuación:
Plásmido 15:
Lote 5: pTXB1-SspC-MxeGvrA-Hisfi (V103I, V105I, I106A, G107T)
Figure imgf000036_0001
Plásmido 16:
Lote 6: pTXB1-SspC-MxeGyrA-His6 (R115N, 1116V, F117Y)
Figure imgf000036_0002
Plásmido 17:
Lote 7 pTXB1-SspC-MxeGvrA-His6 (L121V, P122E, Q123R)
Figure imgf000036_0003
Plásmido 18:
Lote 8: pTXB1-SspC-MxeGvrA-His6 (L128A, A130K, A133F)
Figure imgf000036_0004
Plásmido 19:
SspC A136S: pTXB1-SspC-MxeGvrA-His6 (A136S)
Figure imgf000036_0005
Se optimizaron los codones del gen para la secuencia de DnaE consenso fusionada para la expresión en E. coli a través de ADN IDT y se adquirió como gBlock. La secuencia de ADN gBlock se muestra a continuación:
Figure imgf000037_0001
El plásmido de expresión para CfaN se clonó usando ensamblaje de Gibson en el plásmido 1, produciendo un vector que codifica para la siguiente proteína que se muestra a continuación:
Plásmido 20:
CfaN: pET30-Hisfi-SUMQ-AEY-CfaN
Figure imgf000037_0002
El plásmido de expresión para la C-inteína consenso se clonó usando ensamblaje de Gibson en el plásmido 3, produciendo un vector que codifica para el siguiente gen:
Plásmido 21:
CfaC: pTXB1-CfaC-MxeGyrA-H6
Figure imgf000037_0003
Constructos de Cfa usados para el examen de crecimiento de E. coli.
Los plásmidos Cfa usados para examinar la dependencia del corte y empalme en la posición 2 de la C-exteína se generaron usando clonación por restricción en un plásmido generado previamente2 que contiene un sistema de expresión doble del gen de aminoglucósido fosfotransferasa dividida (KanR). El constructo de expresión doble de Cfa se muestra a continuación:
Plásmidos 22-25
[Promotor de KanR1-[RBS1-[KanRN1-[CfaN1-[iRBS1-[CfaC-[CXN-KanRC1
Después de la secuencia promotora, hay dos sitios de unión al ribosoma de E. coli separados en este vector (RBS e iRBS). Cada RBS va seguido por una mitad del constructo de KanR-inteína dividida, cuyas secuencias de proteínas se muestran a continuación (la inteína Cfa se resalta en negrita).
KanRN-CfaN:
Figure imgf000038_0001
CfaC-KanRC
Figure imgf000038_0002
La posición 2 de la C-exteína está subrayada, y es o bien fenilalanina, DGGMR, glicina, arginina o bien glutamato. aDEC205-HC-CfaN
Los plásmidos de pCMV que contienen la cadena ligera (LC), la cadena pesada (HC) y fusiones de HC-inteína (HC-NpuN, HC-MchtN, HC-AvaN) del anticuerpo aDEC205 se obtuvieron como se describió anteriormente.3 Se generó una secuencia de Cfa DnaE con codones optimizados para la expresión en células de mamífero usando JCAT4 y se adquirió como gBlock a través de ADN IDT. La secuencia se muestra a continuación:
Figure imgf000038_0003
La secuencia de CfaN con codones optimizados para mamíferos se clonó luego en el plásmido pCMV HC-NpuN usando clonación por restricción para dar una secuencia que codifica la siguiente proteína:
Plásmido 26:
HC-CfaN: pCMV-HC-CfaN
Figure imgf000039_0001
Inteína CfaC para el ligamiento del dendrímero:
Un plásmido que contenía la C-inteína Cfa con un enlazador de C-exteína se clonó por PCR inversa en el plásmido 21 y codifica la secuencia de proteína que se muestra a continuación:
Plásmido 27:
CfaC-link: pTXB1 -H6-CfaC-CFNSGG-MxeGyrA-H6
Figure imgf000039_0002
Los protocolos de expresión y purificación de todos los constructos His6-SUMO-AEY-IntN (plásmidos 1,2, 5-14, 20) e IntC-GyrAHis6 (plásmidos 3, 4, 15-19, 21,27) se adaptaron a partir de métodos previamente descritos.1 Expresión de todos los constructos His6-SUMO-AEY-IntN
Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con un plásmido de N-inteína y se hicieron crecer a 37 °C en 1 l de LB que contenía 50 ^g/ml de kanamicina. Una vez que el cultivo había alcanzado una DO600=0,6, se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión (concentración final 0,5 mM, 3 h a 37 °C). Las células se sedimentaron mediante centrifugación (10.500 rcf, 30 min) y se almacenaron a -80 °C.
Purificación de todos los constructos His6-SUMO-AEY-IntN
Purificación de constructos de N-inteína para mutagénesis por lotes
Los sedimentos celulares (de la expresión de los plásmidos 1,2, 5-14) se resuspendieron en 30 ml de tampón de lisis (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH 8,0) que contenía cóctel inhibidor de proteasa Roche Complete. Las células resuspendidas se lisaron luego por sonicación en hielo (amplitud del 35 %, 8 pulsos de 20 segundos de encendido / 30 segundos de apagado). El cuerpo de inclusión insoluble que contenía la N-inteína se recuperó por centrifugación (35.000 rcf, 30 min). El sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 30 ml de tampón de lavado Triton (tampón de lisis con tritón X-100 al 0,1 %) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lavado con Triton se centrifugó a continuación a 35.000 rcf durante 30 minutos. El sobrenadante se desechó, el sedimento de cuerpos de inclusión se resuspendió en 30 ml de tampón de lisis que contenía urea 6 M, y la suspensión se incubó durante la noche a 4 °C para extraer y resolubilizar la proteína. Esta mezcla se centrifugó luego a 35.000 rcf durante 30 minutos.
El sobrenadante se mezcló luego con 4 ml de resina Ni-NTA (para purificación por afinidad usando la etiqueta His6) y se incubó a 4 °C durante 30 minutos para unir por lotes la proteína. Esta mezcla se cargó en una columna con frita, se recogió la fracción no retenida y se lavó la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis con urea 6 M y 5 CV de tampón de lisis con imidazol 25 mM y urea 6 M. La proteína se eluyó entonces en cuatro fracciones de 1,5 CV de tampón de lisis con imidazol 250 mM y urea 6 M. Se encontró generalmente por SDS-PAGE (gel Bis-Tris al 12 %, ejecutado durante 50 minutos a 170 V) que las dos primeras fracciones de elución contenían la proteína expresada y se combinaron para el replegamiento.
Las N-inteínas se replegaron por diálisis gradual en tampón de lisis con DTT 0,5 mM a 4 °C. Esta proteína replegada se trató luego con TCEP 10 mM y proteasa Ulp1 (durante la noche, TA) para escindir la etiqueta de expresión His6-SUMO. Después, la disolución se mezcló con 4 ml de resina de Ni-NTA y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. La suspensión se aplicó a una columna con frita y se recogió la fracción no retenida junto con un lavado de 3 CV con tampón de lisis. La proteína se trató luego con TCEP 10 mM, se concentró hasta 10 ml y se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión molecular usando una columna de filtración en gel S75 16/60 empleando tampón de corte y empalme desgasificado (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) como fase móvil. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE, RP-HPLC analítica y ESI-MS. La proteína pura se almacenó mediante congelación instantánea en N2 líquido después de la adición de glicerol (20 % v/v). Nota: durante la etapa de replegamiento, se observó una precipitación significativa de proteínas para el lote 3, lo que sugiere que es propenso a la agregación.
Purificación de CfaN:
El sedimento celular (de la expresión del plásmido 20) se resuspendió en primer lugar en 30 ml de tampón de lisis (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH 8,0) que contenía el cóctel inhibidor de proteasa Roche Complete. Las células se lisaron luego por sonicación (amplitud del 35 %, 8 pulsos de 20 segundos de encendido / 30 segundos de apagado), y el lisado se sedimentó por centrifugación (35.000 rcf, 30 min). El sobrenadante se incubó con 4 ml de resina Ni-NTA durante 30 minutos a 4 °C para enriquecer la proteína CfaN soluble. A continuación, la suspensión se cargó en una columna con frita, y la columna se lavó con 20 ml de tampón de lavado 1 (tampón de lisis) seguido de 20 ml de tampón de lavado 2 (tampón de lisis con imidazol 25 mM). Finalmente, la proteína se eluyó de la columna con 4 x 1,5 CV de tampón de elución (tampón de lisis imidazol 250 mM).
La proteína deseada, que estaba presente en las fracciones de elución 1 y 2 tal como se determinó por SDS-PAGE (gel de bis-tris al 12 % ejecutado en tampón de ejecución MES-SDS a 170 V durante 50 minutos), se dializó entonces en tampón de lisis durante 4 horas a 4 °C. Después de la diálisis, la proteína se trató con TCEP 10 mM y proteasa Ulp1 durante la noche a temperatura ambiente para escindir la etiqueta de expresión His6-SUMO. A continuación, la disolución se incubó con 4 ml de resina de Ni-NTA durante 30 minutos a 4 °C. La suspensión se aplicó a una columna con frita y se recogió la fracción no retenida junto con un lavado de 3 CV con tampón de lisis. La proteína se trató luego con TCEP 10 mM, se concentró hasta 10 ml y se purificó sobre una columna de filtración en gel S75 16/60 empleando tampón de corte y empalme desgasificado (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) como fase móvil. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE (gel de bis-tris al 12 % ejecutado en tampón de ejecución MES-SDS a 170 V durante 60 minutos), RP-HPLC analítica y ESI-MS. La proteína pura se almacenó en glicerol (20 % v/v) y se congeló instantáneamente en N2 líquido.
Semisíntesis de constructos de IntC-CFN
Se transformaron células E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pTXB1-IntC-GyrA-H6 apropiado (plásmidos 3, 4, 15-19, 21) y se hicieron crecer en 2 l de medio LB que contenía ampicilina (100 |ig/ml) a 37 °C. Una vez que el cultivo había alcanzado una DO600 = 0,6, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG (0,5 mM, 3 horas, 37 °C). Los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación (10.500 rcf, 30 min), se resuspendieron en tampón de lisis y se lisaron por sonicación en hielo (amplitud del 35 %, 10 pulsos de 20 segundos de encendido / 30 segundos de apagado). La proteína en la fracción soluble se aisló por centrifugación (35.000 rcf, 30 min) y después se enriqueció mediante purificación con Ni-NTA (4 ml de perlas, llevado a cabo como se describe para constructos de N-inteína). Después de la elución en tampón de lisis con imidazol 250 mM, se retiró el imidazol por diálisis en tampón de lisis nuevo. Entonces se llevó a cabo el ligamiento durante la noche a temperatura ambiente con la adición de TCEP 10 mM, el cóctel inhibidor de proteasa Roche Complete, MESNa 100 mM, EDTA 5 mM y CFN-NH25 mM (pH 7,0). El péptido de IntC-CFN ligado se acidificó con TFA al 0,5 % y se purificó mediante RP-HPLc en una columna preparativa C-is: Gradiente = 10 % de B durante 10 minutos (isocrático) seguido del 20-60 % de B durante 60 minutos. La pureza de cada proteína se determinó mediante RP-HPLC analítica y su identidad se confirmó mediante ESI-MS.
Aislamiento de CfaC-link-MESNa
El péptido CfaC-link-MESNa usado para la semisíntesis de la fusión inteína-dendrímero se expresó y purificó exactamente como se describió anteriormente para los constructos IntC-CFN (expresión del plásmido 27). Sin embargo, no se añadió tripéptido durante la etapa de ligamiento final, dando como resultado en su lugar tiólisis de la inteína y formación de un a-tioéster. Este a-tioéster de CfaC-MESNa se purificó luego por RP-HPLC preparativa. Las fracciones se analizaron por ESI-MS, se combinaron y se liofilizaron.
Análisis del corte y empalme en trans de proteínas mediante RP-HPLC y ESI-MS para mutantes de lote.
Se llevaron a cabo reacciones de corte y empalme según una adaptación de un protocolo descrito anteriormente.1 Brevemente, se preincubaron N- y C-inteínas (IntN 15 |iM, IntC 10 |iM) individualmente en tampón de corte y empalme (fosfatos de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) con TCEP 2 mM durante 15 minutos. Todas las reacciones de corte y empalme se llevaron a cabo a 30 °C a menos que se indicara lo contrario. Las reacciones de corte y empalme que comparaban la tolerancia de Npu y Cfa a agentes caotrópicos se llevaron a cabo con la concentración indicada de o bien urea o bien clorhidrato de guanidina. El corte y empalme se inició mezclando volúmenes iguales de N- y C-inteínas con alícuotas retiradas en los momentos indicados y se extinguió mediante la adición de clorhidrato de guanidina 8 M, TFA al 4 % (3:1 v/v). Para todas las reacciones de corte y empalme que contenían NpuC-CFN o CfaC-CFN, el progreso de la reacción se monitorizó mediante RP-HPLC. Para todas las reacciones de corte y empalme que contenían SspC-CFN, el progreso de la reacción se monitorizó mediante ESI-MS (muestras desalinizadas con ZipTip antes de la inyección) debido a la mala resolución cromatográfica de cada estado como se observó anteriormente.1 Se observó que el corte y empalme tanto para el lote 3 como para Cfa a 80 °C (preincubación de 15 minutos) era ineficaz, alcanzando ~50 % de finalización. Esto probablemente se deba a agregación (e inactivación) de la N-inteína. Obsérvese que preincubaciones más cortas de Cfa a 80 °C condujeron a un corte y empalme más eficaz.
Análisis cinético de reacciones de corte y empalme en trans de mutantes de lote:
El análisis cinético se llevó a cabo como se describió anteriormente.1 Brevemente, se separan cinco especies (1-5) por RP-HPLC, y se determinan las áreas de los picos. Para ESI-MS, se calculan las áreas de los picos para las especies 1-4. Cada pico individual se normalizó frente al área total de todos los picos combinados y se representaron gráficamente las curvas de progreso de la reacción (n=3). Los datos se ajustaron entonces en ProFit a la solución analítica de la ecuación de velocidad diferencial acoplada para el modelo de corte y empalme cinético de tres estados. Debido a que el material de partida no puede separarse del tioéster lineal usando este ensayo, el modelo cinético de tres estados colapsa la etapa de unión y las dos primeras etapas de la reacción de corte y empalme en un equilibrio. Cada reacción de corte y empalme se llevó a cabo por triplicado con cada réplica analizada por separado. Se notifican la media y la desviación estándar para todos los valores (n = 3).
Análisis cinético de reacciones de corte y empalme en trans globales para Npu y Cfa
Todas las reacciones de corte y empalme que comparaban Npu y Cfa se separaron por RP-HPLC con áreas de los picos una vez más calculadas usando el software del fabricante. Para estas reacciones, se calcularon las áreas de los picos para el material de partida y producto intermedio ramificado (especie 1 y 2) y producto (especie 3, 4, 5). Los datos se ajustaron a continuación a la ecuación de velocidad de primer orden usando el software GraphPad Prism.
[Í’KO = [P U x ■ (1 - e~kt)
Donde [P] es la intensidad normalizada del producto, [P]máx es este valor a t=» (la meseta de reacción) y k es la constante de velocidad (s_1). Se notifican la media y la desviación estándar (n = 3).
Generación y refinamiento de la alineación de secuencias múltiples de inteína DnaE.
Se identificaron homólogos de Npu DnaE a través de una búsqueda BLAST5 de las bases de datos NCBI6 (colección de nucleótidos) y JGI7 usando las secuencias de proteínas Npu DnaE. Esto condujo a la identificación de 105 proteínas con >60 % de identidad de secuencia. Para N-inteínas con colas C-terminales largas, las proteínas se truncaron a 102 residuos, la longitud de Npu. Para las N-inteínas de la base de datos JGI, el punto de truncamiento se determinó mediante los resultados del programa BLAST (el último residuo identificado en la búsqueda Blast se seleccionó como punto de truncamiento). A continuación, se generó una alineación de secuencias múltiples (MSA) de la secuencia fusionada (es decir, la N-inteína conectada a la C-inteína) de las 105 inteínas en Jalview (figura 7A).8 Para refinar el MSA para inteínas que se predice que experimentan corte y empalme rápido, se eliminaron todas las secuencias que no contenían K70, M75, m81 y S136 (los residuos “aceleradores”) de la alineación, dejando 73 inteínas que se predice que tienen una cinética de corte y empalme rápida (figura 7B). La secuencia consenso de esta alineación refinada de inteínas rápidas (Cfa) se calculó en Jalview determinando el aminoácido que aparecía con mayor frecuencia en cada posición. No se identificó un residuo consenso en las posiciones 98 y 102 debido a la falta de homología en la alineación y, por lo tanto, la secuencia consenso se truncó a 101 aminoácidos y la posición 98 se fijó al residuo encontrado en Npu DnaE. Esta secuencia consenso se alineó luego con Npu DnaE en Jalview para calcular su porcentaje de identidad. Se mapearon residuos no idénticos sobre la estructura cristalina de Npu DnaE (pdb = 4K15) (figura 1).
Las figuras 7A y 7B muestran una alineación y refinamiento de la familia de inteínas DnaE. La figura 7A muestra la alineación de secuencias múltiples (MSA) de los 105 miembros de la familia de inteínas DnaE encontradas a partir de una búsqueda BLAST de las bases de datos de secuencias JGI y NCBI. Las ubicaciones de los residuos “aceleradores” usados para filtrar la alineación se indican con flechas negras. La figura 7B muestra la MSA de las 73 inteínas DnaE que se predice que demuestran una cinética de corte y empalme rápida debido a la presencia de los cuatro residuos “aceleradores”.
Examen de E. coli KanR para determinar la dependencia de Cfa exteína.
El ensayo de resistencia a la kanamicina acoplado al corte y empalme de proteínas (KanR) se llevó a cabo como se describió anteriormente.29 Brevemente, un plásmido que codifica una aminoglucósido fosfotransferasa fragmentada fusionada a una inteína dividida (Cfa) con cualquiera de F, G, R o E presente en la posición 2 de la C-exteína (plásmidos 22-25) se transformó en células competentes DH5a y se cultivó en cultivos iniciadores durante la noche (caldo LB, 100 |ig/ml de ampicilina, 18 h). Estos cultivos se diluyeron luego veinte veces en una placa de 96 pocillos, y se midió el crecimiento de E. coli a diversas concentraciones de kanamicina (2,5, 10, 25, 50, 100, 250, 1000 |ig/ml de kanamicina con 100 |ig/ml de ampicilina). La densidad óptica celular a 650 nm (DO650) en el punto final de 24 horas se ajustó a una curva de respuesta a la dosis con pendiente variable.
Figure imgf000042_0001
Donde la DOmín se fijó a la absorbancia del fondo a 650 nm. Cada ensayo se llevó a cabo por triplicado, se ajustó por separado y los valores de CI50 se notifican como la media y la desviación estándar de CI50 para estas tres mediciones separadas.
Corte y empalme en trans de proteínas del cuerpo de inclusión extraído
Los cuerpos de inclusión de E. coli que contenían expresión de His6-Sumo-CfaN (plásmido 20) se resuspendieron y se extrajeron durante la noche a 4 °C en tampón de lisis que contenía urea 6 M. Después de la centrifugación (35.000 rcf, 30 min), se retiró el sobrenadante y se enriqueció la proteína enriquecida con Ni-NTA en condiciones desnaturalizantes (como se describió anteriormente). Sin embargo, en lugar de replegar la proteína, se inició directamente el corte y empalme en trans mediante la adición de CfaC-CFN (CfaC 10 |iM, TCEP 2 mM, EDTA 2 mM, 2 horas, TA). El progreso de la reacción se monitorizó mediante SDS-PAGE.
Expresión de la prueba de aDec205-HC-IntN y corte y empalme
Prueba de expresión de HC-NpuN, HC-MchtN, HC-AvaN, HC-CfaN
La expresión de todos los constructos de mAb se llevó a cabo como se describió anteriormente.3 Brevemente, se cotransfectaron plásmidos que codificaban el aDec205-LC y el aDec205-HC-IntN en células HEK293T y se incubaron durante 96 h (5 % de CO2). Las células se centrifugaron (5 minutos, 1.000 rcf), se mezclaron 15 |il de medio para cada fusión de inteína con 5 |il de colorante de carga 4x y se ejecutaron en un gel Bis-Tris al 12 % en tampón de ejecución MES-SDS (170 V durante 50 minutos). Entonces, se analizó la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western (transferida a una membrana de PVDF, transferencia frente a IgG de ratón a). El rendimiento de expresión se midió como la cantidad de HC-IntN en los medios tal como se determinó por densitometría. Para tener en cuenta el crecimiento y la supervivencia variables de las células, el rendimiento se normalizó usando una transferencia de aactina del lisado de células HEK293T (sonicación de 5 s, amplitud del 35 %, en colorante de carga 1x) y después se representó en relación con la expresión de HC-CfaN. Se llevaron a cabo cuatro réplicas de esta expresión de prueba, y se calculó la media con el error representado como la desviación estándar.
Corte y empalme en trans de proteínas en medios de crecimiento
Después de la expresión de 96 h a 37 °C de los constructos mAB-AvaN y mAB-CfaN descritos anteriormente, el medio se centrifugó (1.000 rcf, 5 minutos). El sobrenadante se mezcló luego con el péptido CfaC-CFN (semisíntesis del plásmido expresado 21) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente (CfaC-CFN 1 |iM, TCEP 2 mM, EDTA 2 mM). Las reacciones de corte y empalme se analizaron mediante SDS-PAGE (Bis-Tris al 12 % en tampón de ejecución MES-SDS a 170 V durante 50 minutos) seguido de inmunotransferencia de tio Western (IgG de ratón a).
Síntesis de péptidos y dendrímeros
Cys-Gly-Lys (fluoresceína). Este péptido se sintetizó mediante la adición manual de reactivos en la resina Rink Amide de acuerdo con un procedimiento publicado anteriormente.2
Figure imgf000043_0001
Esquema complementario 1
Compuesto 2 (tioéster de dendrímero). Este compuesto se sintetizó en la fase sólida usando la ruta descrita en el esquema complementario 1 en una escala de 400 mg de resina Rink Amide (sustitución: 0,47 mmol/g, 188 |imol). En primer lugar se proporcionan los procedimientos generales, seguido de cualquier método específico para este péptido. El grupo Fmoc se retiró con 3 ml de piperidina al 20 % en DMF y se realizó dos veces (una desprotección durante 30 segundos seguido de una desprotección adicional durante 15 minutos). Después de cada etapa de desprotección, así como todas las etapas de síntesis posteriores, se usaron lavados de flujo (3 x 5 s con ~5 ml de DMF cada uno). El acoplamiento se realizó usando 4 eq. de monómero, 4 eq. de HBTU y 8 eq. de DIPEA sin preactivación a menos que se indique lo contrario. Se usaron acoplamientos dobles para todos los residuos para garantizar la acilación completa.
El grupo protector de tritilo se retiró selectivamente usando TFA al 1 %, TIS al 5 % en DCM usando un total de 30 ml (10x 3 ml) de cóctel de desprotección. Un lavado exhaustivo de la resina con DCM tanto durante como después de estos ciclos garantizó la eliminación de cualquier especie de tritilo liberada. La resina también se neutralizó con DIPEA al 5 % en DMF antes de que se realizara el siguiente acoplamiento. El grupo Alloc se desprotegió usando 0,1 eq. de tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0), 20 eq. de fenilsilano en DCM durante 3x 45 min cada uno. Se usó un lavado exhaustivo de la resina con DCM durante y después de estos ciclos, así como un lavado con DIPEA al 5 % en DMF antes del siguiente acoplamiento. El monómero de anhídrido glutárico se usó como ácido dicarboxílico preactivado para permitir la formación de los tioésteres (es decir, para funcionalizar un ácido carboxílico unido a resina libre). Se añadieron 20 eq. de anhídrido glutárico y 10 eq. de DIPEA (en relación con el número de aminas que van a acilarse) a la resina y se dejó reaccionar durante una hora. Después, se lavó la resina y se repitió el acoplamiento para garantizar la reacción completa de las aminas primarias unidas a la resina. Para formar los tioésteres unidos a resina, se añadieron 30 eq. de tioglicolato de metilo, 5 eq. de PyAOP y 10 eq. de DIPEA (en relación con el número de carboxilatos) en DMF a la resina y se dejó reaccionar durante una hora. La resina se lavó con DMF en exceso y el procedimiento de acoplamiento se repitió dos veces más.
La escisión se realizó con el 95 % de TFA, el 2,5 % de TIS y el 2,5 % de H2O durante dos horas a temperatura ambiente. Después, el péptido se precipitó con dietil éter, se disolvió en agua con TFA al 0,1 % y se analizó mediante RP-HPLC. El material bruto se purificó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa, y se analizaron las fracciones deseadas, se agruparon y se liofilizaron. Caracterización por RP-HPLC: gradiente 0-73 % de B, tr = 18,4 min. Masa esperada: 2198,86 Da. Hallada: 2198,82 Da.
Compuesto 3 (dendrímero fluoresceína).
El compuesto 3 se sintetizó mediante ligamiento químico nativo (esquema 2). El compuesto 2 se disolvió en tampón de ligamiento y se mezcló con cinco eq. de Cys-Gly-Lys(fluoresceína) (21 mM, péptido 5 mM, guanidina 4 M, fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, MPAA 100 mM, TCEP 20 mM, pH 7,0) y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. La desprotección de la tiazolidina se logró mediante la adición de metoxiamina 0,1 M (concentración final) y disminuyendo el pH del tampón de ligamiento hasta 4,0 (durante la noche, TA).
Al intentar purificar el compuesto 3 por RP-HPLC, los inventores notaron que presentaba poca solubilidad cuando se acidificó y se diluyó en agua. Sin embargo, Cys-Gly-Lys(fluoresceína), MPAA y metoxiamina permanecieron en disolución. A partir de esta observación, se purificó 3 por precipitación selectiva después de una dilución de 10 veces en agua con TFA al 0,1 %. El polvo precipitado se aisló por centrifugación (17.000 rcf, 5 min) y luego se redisolvió (fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) para eliminar por lavado cualquier contaminante restante. Una vez más, la disolución se precipitó por acidificación y se aisló por centrifugación (17.000 rcf, 5 min). Este polvo aislado se liofilizó después. Masa esperada: 4417,8 Da. Hallada: 4417,5 Da.
Figure imgf000045_0001
Compuesto 3
Esquema complementario 2. El ligamiento químico nativo se usó para elaborar el compuesto 2 que contiene tetratioéster con un tripéptido fluorescente. La desprotección posterior usando metoxilamina se usó para exponer la cisteína N-terminal para ligamientos adicionales que produjeron dendrímero tetrafuncionalizado, compuesto 3. Compuesto 1: (CfaC-dendrímero)
El compuesto 1 se sintetizó mediante ligamiento de proteínas expresadas. El compuesto 3 se disolvió en tampón de ligamiento y se mezcló con 1,5 eq. de tioéster de CfaC-MESNa (3100 |iM, CfaC-MESNa 150 |iM, guanidina 4 M, fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, TCEP 20 mM, MPAA 100 mM). Se dejó que la reacción prosiguiera durante la noche a temperatura ambiente. El producto ligado se purificó luego por RP-HPLC semipreparativa. Las fracciones deseadas se agruparon y se liofilizaron. Masa esperada: 9860,8 Da. Hallada: 9860,3 Da.
Corte y empalme en trans de proteínas de dendrímero con mAb aDec205
El mAb aDec205 con CfaN fusionado a su extremo C-terminal se expresó como se describió anteriormente. Después de la expresión de 96 h, el medio se concentró 10 veces en un concentrador Amicon 30K (0,5 ml). El compuesto 1 se disolvió en tampón de corte y empalme (fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) y después se mezcló con los medios concentrados (compuesto 12 p,M, TCEP 2 mM, EDTA 1 mM) y dejó que la reacción prosiguiera durante 2 horas a temperatura ambiente. Entonces se analizó la mezcla de corte y empalme por SDS-PAGE (Bis-Tris al 12 % ejecutado en tampón de ejecución MES-SDS a 170 V durante 50 minutos) y se obtuvieron imágenes en un generador de imágenes de fluorescencia. A esto le siguió la transferencia a una membrana de PVDF y el análisis de inmunotransferencia de tipo Western (IgG de ratón a).
La invención permite la formación de diversos complejos entre un fragmento de inteína dividida y un compuesto. Varios de tales complejos y compuestos se ilustran en la tabla de la figura 11. IntC es un fragmento de inteína dividida, por ejemplo, un fragmento C de inteína dividida. Por ejemplo, el dendrímero puede tener la forma del compuesto 2, compuesto 3, o porciones de estos. Por ejemplo, la carga puede ser un colorante (por ejemplo, fluoresceína), otra molécula marcadora, un fármaco (por ejemplo, una molécula citotóxica, tal como se usa en el tratamiento del cáncer) o un nucleótido. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido total o parcialmente sintético o de origen natural o una porción del mismo. Un dendrímero puede ser una molécula que tiene una estructura química ramificada sobre la que pueden “cargarse” una o más moléculas de “carga”. Una molécula de “carga” puede ser una molécula sintética de origen natural. La molécula de carga puede estructurarse para que no tenga 1,2-aminotioles o 1,2-aminoalcoholes libres. Cuando la inteína se une a través de un aminotiol o aminoalcohol a un polipéptido, como se muestra en la fila 3 de la tabla de la figura 11, el complejo formado puede considerarse como una proteína de fusión recombinante.
Ejemplo 2
Una advertencia importante para los métodos basados en corte y empalme es que todas las inteínas caracterizadas presentan una preferencia de secuencia en los residuos de exteína adyacentes al sitio de corte y empalme. Además de un residuo de Cys, Ser o Thr catalítico obligatorio en la posición 1 (es decir, el primer residuo dentro de la C-exteína), existe un sesgo para residuos que se asemejan a la secuencia de N- y C-exteína proximal encontrada en el sitio de inserción nativo. La desviación de este contexto de secuencia preferido conduce a una marcada reducción en la actividad de corte y empalme, lo que limita la aplicabilidad de los métodos basados en PTS.23, 24 En consecuencia, existe la necesidad de inteínas divididas cuyas actividades se vean mínimamente afectadas por el entorno de secuencia local. Para las inteínas DnaE, las preferencias de secuencia de exteína se limitan en gran medida a la cisteína catalítica en la posición 1 y los residuos hidrófobos grandes que se prefieren en la posición 2.25
En este ejemplo, se diseñó una mutación de bucle “EKD” a “GEP” en los residuos 122-124 de Cfa (CfaGEP) y dio como resultado una mayor promiscuidad en la posición 2 de la C-exteína en un ensayo de resistencia a kanamicina (figura 9). La mutación EKD ^ GEP aumenta la actividad de Cfa en una amplia gama de contextos de exteína. Además, puede esperarse razonablemente que estas mismas mutaciones (o similares) aumenten la promiscuidad entre otros miembros de la familia de inteínas DnaE (incluidas Npu y las enumeradas en las figuras 7A y 7B).
Las siguientes secuencias representan las inteínas modificadas por ingeniería genética:
La C-inteína Cfa con la mutación “GEP” que confiere más actividad “promiscua” de acuerdo con una realización de la invención es:
Figure imgf000046_0002
Un ejemplo de una inteína de fusión de la N-inteína Cfa y la C-inteína Cfa con la mutación “GEP” de SEQ ID: 389) es:
Figure imgf000046_0001
La figura 9 muestra un esquema y una tabla que muestran el aumento de la promiscuidad de CfaGEP. El panel A muestra un esquema que representa el sistema de selección de E. coli dependiente de PTS con la inteína dividida Cfa. La proteína de resistencia a kanamicina, KanR, se divide y se fusiona con fragmentos de N- y C-inteína (CfaN y CfaC). El residuo de C-exteína 2 (X roja) varía en el sistema. En el panel B, se muestran los valores de CI50 para la resistencia a kanamicina de las inteínas CfaEKD (WT) y CfaGEP (GEP) con el residuo de C-exteína 2 indicado (error = error estándar (n = 3)).
Además, esta misma tolerancia para secuencias de exteína variables también se observó en la ciclación de eGFP en E. coli (figura 10). La inteína CfaGEP demostró rendimientos mejorados del producto ciclado en todos los contextos desfavorables de C-exteína 2 sometidos a prueba (figura 10 panel A, figura 10 panel B). Además, CfaGEP mantiene esta actividad de ciclación mejorada incluso cuando las posiciones de exteína -1 y 3 varían (figura 10 panel C, figura 10 panel D). Esta secuencia de bucle “GEP” modificada por ingeniería genética, que no se ha identificado en una inteína DnaE dividida de manera natural de tipo silvestre, por lo tanto, debe expandir la amplitud de las proteínas y péptidos accesibles a las tecnologías basadas en PTS.
La figura 10 muestra esquemas y gráficos que muestran la ciclación de eGFP con la inteína dividida CfaGEP. El panel A es un esquema que representa la ciclación de eGFP en E. coli con residuos variables en la posición de C-exteína 2 (X roja). En el panel B, se muestra la fracción de eGFP ciclada formada después de la expresión durante la noche en E. coli para CfaEKD (WT) y CfaGEP (GEP) con el residuo de C-exteína 2 indicado (media desviación estándar, n = 3). El panel C es un esquema que representa la ciclación de eGFP en E. coli con residuos variables en la posición de C-exteína 3 (X azul) y la posición de N-exteína -1 (X roja). El panel D muestra una fracción de eGFP ciclada formada después de la expresión durante la noche en E. coli para CfaEKD (WT) y CfaGEP (GEP) con los residuos de C-exteína 3 y N-exteína -1 indicados (media desviación estándar, n = 3).
Los expertos en la técnica apreciarán que pueden configurarse diversas adaptaciones y modificaciones de la realización preferida recién descrita sin apartarse del alcance de la invención. La realización ilustrada se ha expuesto solo con fines de ejemplo y no debe tomarse como limitativa de la invención. Por lo tanto, debe entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de forma distinta a la descrita específicamente en el presente documento.
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(23) Iwai, H.; Zuger, S.; Jin, J.; Tam, P. H. FEBS Lett. 2006, 580, 1853.
(24) Amitai, G.; Callahan, B. P.; Stanger, M. J.; Belfort, G.; Belfort, M. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106, 11005. (25) Cheriyan, M.; Pedamallu, C. S.; Tori, K.; Perler, F. J Biol Chem 2013, 288, 6202.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Fragmento N de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000049_0001
2. Complejo que comprende el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1 y un compuesto.
3. Complejo según la reivindicación 2, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en un péptido o un polipéptido, una cadena de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, un péptido, un oligonucleótido, un fármaco o una molécula citotóxica.
4. Fragmento C de inteína dividida que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000049_0002
5. Complejo que comprende el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4 y un compuesto.
6. Complejo según la reivindicación 5, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: (i) un péptido o un polipéptido,
(ii) un compuesto que comprende un péptido, un oligonucleótido, un fármaco o una molécula citotóxica, (iii) un 1,2-aminotiol unido a un péptido, un oligonucleótido, un fármaco o una molécula citotóxica, (iv) un 1,2-aminoalcohol unido a un péptido, un oligonucleótido, un fármaco o una molécula citotóxica y (v) un dendrímero,
(vi) un dendrímero que tiene la estructura
Figure imgf000050_0001
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H) y moléculas de carga.
7. Complejo según la reivindicación 6, en donde R1, R2, R3 y R4 son cada uno una molécula de colorante o en donde R1, R2, R3 y R4 son cada uno un derivado de fluoresceína que tiene la estructura
Figure imgf000050_0002
8. Complejo de la estructura
Figure imgf000050_0003
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4 y
en donde n es de 0 a 8,
la estructura
Figure imgf000050_0004
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4 y
en donde n es de 0 a 8,
o la estructura
Figure imgf000051_0001
en donde IntC es el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4 y
en donde X es azufre (S) u oxígeno (O).
Composición que comprende:
el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1; y
el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4.
Plásmido de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1 o el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4.
Método para cortar y empalmar dos complejos que comprende:
poner en contacto un primer complejo que comprende un primer compuesto y el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1 y un segundo complejo que comprende un segundo compuesto y el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4,
en donde la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
hacer reaccionar el producto intermedio de inteína para formar un conjugado del primer compuesto con el segundo compuesto.
Método seleccionado del grupo que comprende:
(i) un método que comprende
poner en contacto un primer complejo que comprende un primer compuesto y el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1 y un segundo complejo que comprende un segundo compuesto y el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4,
en donde la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la unión del fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
hacer reaccionar el producto intermedio de inteína con un nucleófilo para formar un conjugado del primer compuesto con el nucleófilo
y
(ii) un método que comprende
fusionar una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1,
con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4,
de modo que la fusión de la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos codifica una inteína contigua.
13. Método según la reivindicación 12, en el que el primer compuesto es un polipéptido o un anticuerpo y/o en el que el segundo compuesto es un dendrímero o un polipéptido.
14. Inteína que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con
Figure imgf000052_0001
15. Kit para cortar y empalmar dos complejos entre sí que comprende:
el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1;
el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4;
un reactivo para unir el fragmento N de inteína dividida al fragmento C de inteína dividida para formar un producto intermedio de inteína; y
un agente nucleófilo.
16. Fusión génica que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1
fusionada con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4.
17. Polinucleótido que codifica el fragmento N de inteína dividida según la reivindicación 1 o que codifica el fragmento C de inteína dividida según la reivindicación 4.
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