KR102140557B1

KR102140557B1 - 단백질-단백질 결합체를 형성 매개 펩타이드 및 이를 이용한 단백질-단백질 결합체 형성 방법

Info

Publication number: KR102140557B1
Application number: KR1020180037451A
Authority: KR
Inventors: 이지오; 이혜림; 김지원; 조근영
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-08-03
Also published as: KR20190114550A; WO2019190022A1

Abstract

본 발명은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것으로, 구체적으로 인간 유래의 단백질인 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 이용하여, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 형성할 수 있고, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 이용한 결합은 항원-항체 반응으로 결합하여 특이적이고, 이황화 결합을 포함하여 견고한 결합을 형성할 수 있으므로 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 형성하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단백질-단백질 결합체를 형성 매개 펩타이드 및 이를 이용한 단백질-단백질 결합체 형성 방법{Peptides for forming protein-protein conjugate and the method for forming protein-protein conjugate using the same}

본 발명은 단백질-단백질 결합체(conjugate) 형성 매개 펩타이드 및 이를 이용한 단백질-단백질 결합체 형성 방법에 관한 것이다.

바이오컨쥬게이션(bioconjugation)은 적어도 하나 이상의 생체물질을 포함한 두 분자를 결합시키는 기술로서, 효과적인 백신, 친화성 기질, 약물 전달 시스템 등의 개발에 중요한 역할을 한다.

가장 대표적인 바이오 컨쥬게이트(conjugate)로는 치료제로 쓰이는 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate, ADC)가 있다. ADC는 항체의 장점을 최대로 활용하여 약물이 특정 세포만 타켓팅하는데 초점을 맞춘 기술로, 약물, 단클론 항체, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커(linker)를 포함한 세 가지 구성 요소로 구성되어 있다. ADC는 주로 암 세포의 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 항암제를 종양세포에 전달하는 데 가장 많이 이용되고 있다.

그 외에도 신약 개발을 위한 표적 단백질 발굴 방법으로, 단백질-단백질 결합(protein-protein conjugation)이 이용되고 있다. 생체 내에서 단백질은 다른 단백질과의 결합을 통해 기능을 나타낸다. 단백질의 발현 변화, 세포 내 위치의 변화, 번역 후 수식(post-translational modification)을 통한 구조의 변화는 단백질 결합의 변화를 유도하게 된다. 이러한 변화로 나타난 단백질 상호 작용의 이상은 질병과 연관되어 있기 때문에, 단백질-단백질 결합을 이용한 단백질 상호작용에 대한 규명 및 이를 기반으로 한 질병과 관련된 표적 단백질 발굴은 신약 개발에 중요한 과정이다.

단백질 성분을 결합(conjugation)시키기 위한 방법들로, 마오(Mao) 등(문헌[Mao, H., et al., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2670-2671])은 C-말단 변형을 위한, 소르타제(sortase) 매개 단백질 라이게이션(ligation) 방법을 개발하였고, 사토(Sato)(문헌[Sato, H., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 487-504])등은 키메라 단백질 내에 부위 특이적으로 폴리에틸렌 글리콜을 도입시키기 위해, 트랜스글루타미나제(transglutaminase, TGase)를 사용하는 시스템을 정립하였다. 트랜스글루타미나아제는 글루타민 잔기의 감마-카르복사미드 그룹과 라이신의 일차 입실론 아미노 그룹 간의 아실 트랜스퍼 반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 스플릿 인테인(split inteins)은 생물체에서 자연적으로 일어나는 과정인 단백질 트랜스-스플라이싱(protein trans-splicing)을 수행하는데, 이는 펩타이드 결합의 절단 및 형성으로 이루어진 다단계 생화학 반응이다. 구체적으로 스플릿 인테인을 포함하는 두 개의 단백질 단편이 결합하여 효소를 형성한 다음, 인테인 스스로를 삭제(excision)하고 플랭킹 서열(flanking sequence)의 연결을 촉매하는 과정을 거친다. 인테인은 외인성(exogenous) 환경에서도 기능적이며 사실상 모든 폴리펩타이드 백본을 화학적으로 조작하는 데 사용할 수 있어, 치료제 개발 분야 뿐만 아니라 기본적인 생물학적 연구에 적용되고 있다(Shah, N.H. & Muir, T.W., Chem. Sci. 5, 446-461(2014)). 상기와 같은 반응을 통해 형성된 결합은 프로테아제에 대해 내성을 가지는 등 상당히 안정한 결합으로 알려져 있다.

그러나 이러한 단백질 성분을 결합시키기 위한 방법들은 인간 기원이 아닌 단백질이 적용하기 때문에, 면역 반응을 유발할 가능성이 있어 치료제로의 적용이 제한적이다.

이에 본 발명자들은 바이오컨쥬게이션(bioconjugation)을 형성하는 데에 면역 반응을 유발할 수 있는 요인을 제거하기 위하여, 인간 유래의 단백질인 3LRH 인트라바디(intrabody)의 변이체와 3LRH 인트라바디의 변이체와 특이적인 결합을 형성하는 펩타이드를 제조하였고, 이들이 2개 이상 단백질의 특이적이고 견고한 결합을 매개할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 이용한 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법 및 상기 형성 방법으로 형성된 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 제1 목적 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질 및, 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 제2 목적 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 제조하는 단계; 및 2) 상기 제조된 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 혼합하여 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 간 결합을 형성시키는 단계를 포함하는, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체 형성 방법으로 형성된 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 제공한다.

본 발명은 인간 유래의 단백질인 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 이용하여, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 형성할 수 있고, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 이용한 결합은 항원-항체 반응으로 결합하여 특이적이고, 이황화 결합을 포함하여 견고한 결합을 형성할 수 있으므로 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체를 형성하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 헌팅틴 펩타이드-3LRH 항체 구조와 단백질 A를 분자 모델링 프로그램을 이용하여 도킹시킨 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 헌팅틴 펩타이드와 단백질 A의 겹침 영역(overlapped regions)의 아미노산 서열과 #8188 단백질 A의 조작된 에피토프의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 단백질 A와 헌팅틴 펩타이드의 나선(helice)을 구조 정렬한 모습을 나타낸 것이다(붉은 색은 헌팅틴 아미노산, 회색은 단백질 A 도메인의 아미노산을 나타낸다.).
도 4는 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A 간의 이황화 다리 형성을 위해, 3LRH^cys 항체와 #8188 단백질 A에 시스테인이 도입된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 3LRH 항체와 #8188 단백질 A의 결정 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 도 5의 #8188 단백질 A의 조작된 에피토프 부분을 확대한 것이다(3LRH 항체와 상호작용하는 #8188 단백질 A와 헌팅틴 펩타이드의 아미노산 잔기를 각각 회색 및 빨간색으로 표시).
도 7은 천연 단백질 A(native protein A)와 조작된 단백질 A인 #8188 단백질 A의 구조를 비교한 것이다.
도 8은 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A의 이황화 다리 형성 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 3LRH^cys 항체에 결합된 #8188^cys 단백질 A의 결정 구조를 나타낸 것이다(이황화 다리는 노란색 선으로 표시, 이황화 다리 주변에 전자 밀도 지도는 회색 메쉬로 표시).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.

상기 단백질은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 N-말단, 내부 또는 C-말단에 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단백질은 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열과 임의의 목적 단백질의 융합 단백질일 수 있다.

상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 3LRH 항체의 변이체인 3LRH^cys 항체로서, 본 발명에서 3LRH 항체는 인간 헌팅틴(huntingtin) 단백질에 존재하는 짧은 알파 나선의 펩타이드에 결합하는, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 면역글로불린 경쇄를 의미한다. 상기 3LRH^cys 항체는 3LRH 항체의 53번째 아미노산인 티로신(tyrosine, Y)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이 시킨 것이다.

본 발명에서 #8188 단백질 A는 상기 3LRH 항체가 결합할 수 있는 나선형의 에피토프를 가진, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 의미하고, #8188^cys 단백질 A는 상기 #8188 단백질 A의 변이체로, 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 의미한다. 구체적으로, 상기 #8188^cys 단백질 A는 상기 #8188 단백질 A의 51번째 아미노산인 알라닌(alanine, A)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이 시킨 것일 수 있다.

상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 상기 펩타이드 간의 결합을 형성할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열 중, 46번째 아미노산부터 59번째 아미노산까지의 서열(서열번호 9) 영역이 3LRH^cys 항체와 결합을 형성하는 영역이고, 더 구체적으로는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열 중, 2번째(K, 라이신), 6번째(C, 시스테인), 9번째(S, 세린), 10번째(L, 류신) 및 13번째(F, 페닐알라닌) 아미노산은 3LRH^cys 항체와의 결합 형성에 중요한 아미노산이다. 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열 중, 2번째(K, 라이신), 6번째(C, 시스테인), 9번째(S, 세린), 10번째(L, 류신) 및 13번째(F, 페닐알라닌) 아미노산만 보존된 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 3LRH^cys 항체와 결합을 형성할 수 있다. 단백질 내에서 항체와 결합하는 영역의 아미노산 서열 중, 항체를 향하여 항체와의 결합에 직접적으로 관여하는 특정 아미노산들을 보존한다면, 나머지 아미노산 서열을 다른 아미노산으로 치환하더라도 본래의 항원-항체 결합과 유사한 결합력으로 결합될 수 있다.

상기 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 경우, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 경우, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명자들은 단백질 A에 3LRH 항체가 결합할 수 있는 나선형의 에피토프가 도입된 #8188 단백질 A를 제작하였다. 구체적으로, 단백질 A 및 헌팅틴 펩타이드의 나선을 구조 정렬하여, 단백질 A에서 3LRH 항체를 향하고 항체와의 결합에 중요한 아미노산(K47(미도시), E50, S51, P54(미도시) 및 K55(미도시))을 확인하였고 (도 3 참조), 단백질 A의 상기 아미노산들을 헌팅틴 펩타이드의 상응하는 아미노산으로 치환하여, 조작된 에피토프(engineered epitope)를 가지는 #8188 단백질 A를 제작하였다 (도 2 및 표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 #8188 단백질 A와 3LRH 항체가 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 항원-항체 반응에 의해 결합하는 본래의 헌팅틴 펩타이드-3LRH 항체의 복합체의 구조와 실질적으로 동일함을 확인하였다 (도 5 내지 도 7 참조).

또한, 본 발명자들은 인간 헌팅틴(huntingtin) 단백질에 존재하는 짧은 알파 나선의 펩타이드에 결합하는 3LRH 항체의 53번째 아미노산인 티로신(tyrosine, Y)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이 시킨 3LRH^cys 항체를 제작하고, 3LRH 항체가 결합할 수 있는 나선형의 에피토프를 가진 #8188 단백질 A의 51번째 아미노산인 알라닌(alanine, A)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이 시킨 #8188^cys 단백질 A를 제작하였다(표 3 및 표 4 참조).

또한, 본 발명자들은 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A를 이용하여 3LRH^cys 항체-#8188^cys 항원 단백질의 복합체(complex)를 제조하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 SDS-PAGE 분석을 실시한 결과, 비환원성 겔에서 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A 사이의 이황화 다리가 형성되어 밴드가 이동됨을 확인하였으며, 결정화 구조를 분석한 결과, 전자 밀도 지도를 통해 이황화 다리가 형성됨을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조).

따라서, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 인간 유래로서 면역 반응 유도와 같은 부작용이 없고, 상기 펩타이드 간의 결합은 항원-항체 반응으로 결합하기 때문에 특이적으로 결합이 가능하며, 이황화 결합을 통해 견고한 결합을 형성할 수 있으므로, 이들 펩타이드를 각각 포함하는 융합 단백질 간의 바이오컨쥬게이션에 유용한 시스템으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 "목적 단백질"은 컨쥬게이션 시킬 단백질 또는 펩타이드를 의미하는 것으로서, 단백질 또는 펩타이드라면 종류나 크기의 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 "융합 단백질"은 2개 이상의 단백질 또는 펩타이드가 서로 연결된 인위적으로 합성된 단백질로서, 구체적으로는 상기 목적 단백질 및 본 발명의 서열번호 6 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "제1 융합 단백질"은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드(3LRH^cys 항체)와 제1 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 의미하고, "제2 융합 단백질"은 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 제2 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 의미한다.

상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 상기 제1 목적 단백질 서열의 N-말단, 내부 또는 C-말단에 존재할 수 있다. 또한 상기 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 상기 제2 목적 단백질의 서열의 N-말단, 내부 또는 C-말단에 존재할 수 있다.

본 발명에서 "제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate)"는 임의의 제1 목적 단백질과 제2 목적 단백질을 결합시키기 위하여, 상기 제1 융합 단백질 및 상기 제2 융합 단백질을 제조하고, 제조한 상기 제1 융합 단백질과 상기 제2 융합 단백질을 결합시킨 결합체를 의미한다. 구체적으로, 상기 결합체는 제1 융합 단백질에 포함된 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드(3LRH^cys 항체) 및 상기 제2 융합 단백질에 포함된 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 간의 결합으로 형성된 것이다.

상기 단계 1)의 융합 단백질을 제조하는 단계에서 상기 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

상기 단계 2)의 결합은 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 상기 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 간의 결합일 수 있다.

상기 펩타이드 간의 결합은 항원-항체 반응으로 결합된 것일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 간의 결합은 상기 항원-항체 반응으로 결합된 것에 이황화 결합(disulfide bond)을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체 형성 방법으로 형성된 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate)를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명자들은 3LRH^cys 항체 및 #8188^cys 단백질 A를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 E. coli에 형질전환하여 3LRH^cys 항체 및 #8188^cys 단백질 A를 제조하였으며, 3LRH^cys 항체-#8188^cys 항원 단백질의 복합체 제조하였다(표 3, 표 4 및 도 4 참조). 따라서, 3LRH^cys 항체와 제1 목적 단백질의 융합 단백질과 #8188^cys 단백질 A와 제2 목적 단백질의 융합 단백질을 혼합하는 경우, 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A 간의 결합을 통해 목적 단백질 간의 결합체를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 3LRH 항체의 제작

3LRH 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 PDB 데이터베이스에 저장된 아미노산 서열 정보를 기반으로 합성하였다.

서열번호	항체 이름	서열 종류	서열
1	3LRH	아미노산 서열	MGSQPVLTQSPSVSAAPRQRVTISVSGSNSNIGSNTVNWIQ QLPGRAPELLMYDDDLLAPGVSDRFSGSRSGTSASLTISGLQSE DEADYYAATWDDSLNGWVFGGGTKVTVLSA
2	3LRH	염기서열 (5'→3')	ATGGGTAGTCAACCAGTACTTACACAAAGCCCGTCTGTGTCTGCCGCTCCACG TCAGAGAGTCACCATCTCAGTTAGTGGTTCTAATTCAAATATAGGATCGAACA CAGTGAACTGGATTCAGCAGTTGCCTGGCCGTGCCCCGGAGTTATTAATGTAT GATGATGATTTATTAGCACCCGGAGTATCAGATCGCTTTTCAGGAAGCCGTAG TGGCACTAGTGCGTCCTTAACCATTAGCGGGTTACAGTCTGAAGACGAAGCGG ACTATTACGCAGCTACGTGGGATGATAGTTTAAATGGCTGGGTTTTTGGTGGT GGTACTAAAGTTACGGTGCTGTCCGCA

3LRH 항체를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 pET28a 벡터에 클로닝한 후, 단백질 생산을 위해, E. coli strain BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli BL21(DE3)를 50㎍/mL의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 배양하였다. OD₆₀₀의 값이 0.7에 도달하였을 때, 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하고, 21℃에서 밤새 배양하였다. E. coli를 수득한 후, 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 0.5 mM PMSF를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)에 수확한 세포 펠릿을 재현탁시키고, 마이크로플루이다이저(microfluidizer, Microfluidics)로 균질화시켰다. 원심분리를 통해 제거하고, 상등액을 Ni-NTA 금속 친화성 컬럼(metal affinity column)에 로딩한 후, 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0를 포함하는 버퍼를 이용하여 6XHis-태그된 단백질을 용출시켰다.

6XHis 태그를 제거하기 위해, 용출된 항체 단백질에 트롬빈(Sigma, Cat#. T4648)을 함께 밤새 처리하였다. 이를 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl로 평형화된 Superdex 200 크기-배제 컬럼(size-exclusion column, GE Healthcare)에 로딩하여 절단된 3LRH 항체를 정제하였다.

< 실시예 2> 에피토프가 도입된 #8188 단백질 A의 제작

단백질 A에 3LRH 항체가 결합할 수 있는 에피토프를 도입하고자 하였다. 3LRH 항체는 인간 헌팅틴 단백질내의 14개 아미노산으로 구성된 알파 나선형 스트레치(alpha helical stretch)에 결합한다.

3LRH 항체에 결합된 헌팅틴 펩타이드 구조를 단백질 A의 C 말단 헬릭스에 오버랩(overlap)시켰다(도 1 참조). 도 2는 분자 모델링 프로그램으로 오버랩된 헌팅틴 펩타이드의 처음 10개의 아미노산과 단백질 A의 C 말단 헬릭스의 마지막 10개의 아미노산을 나타낸 것이다 (도 2 참조).

단백질 A에 에피토프를 설계하기 위해, 단백질 A와 헌팅틴 단백질의 나선을 구조 정렬(structural alignment)한 결과, 단백질 A에서 47번째 아미노산인 라이신(K47) (미도시), 50번째 아미노산인 글루타민(E50) 및 51번째 아미노산인 세린(S51)은 항체를 향하고 결합에 중요한 것으로 확인되었다(도 3 참조). 이외에도 단백질 A에서 54번째 아미노산인 프롤린(P54) (미도시), 및 55번째 아미노산인 라이산(K55) (미도시) 또한 항체를 향하고 결합에 중요한 것으로 확인되었다.

이에 라이신을 제외한 단백질 A의 상기 아미노산들을 헌팅틴 펩타이드의 상응하는 아미노산으로 치환하여, 조작된 에피토프(engineered epitope)를 가지는 #8188 단백질 A를 제작하였다 (도 2 및 표 2 참조). 라이신(K47)은 헌팅틴 펩타이드와 단백질 A 서열의 상응하는 위치에서 모두 발견되었기 때문에, 변경할 필요가 없었고, 단백질 A의 N말단 영역인 54번째 및 55번째 아미노산은 헌팅틴 펩타이드의 N말단 영역인 13 내지 18번째 아미노산 서열로 치환하였다.

서열번호	단백질 이름	서열 종류	서열
3	단백질 A	아미노산 서열	MFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA KKLNESQAPK
4	#8188 단백질 A	아미노산 서열	MFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA KKLNKAQASLKSFQ
5	#8188 단백질 A	염기서열 (5'→3')	ATGTTCAACAAGGATCAGCAGAGCGCCTTCTACGAGATCCTGAACATGCCGA ACCTGAACGAGGCCCAGCGCAACGGCTTCATCCAGAGCCTGAAGGATGATCC AGCCAGAGCACGAACGTGCTGGGTGAAGCTAAGAAACTGAACAAAGCTCAGG CTTCTCTGAAATCTTTCCAG

구체적인 #8188 단백질 A의 제작 과정은 다음과 같다. #8188 단백질 A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5)는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR을 통해 수득하였다. 구체적인 PCR 과정은 다음과 같다. 단백질 A를 암호화하는 유전자를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머 (서열번호 12)과 역방향 프라이머 (서열번호 13)을 이용하여 변성(denaturation) 단계(95℃)에서 20초; 어닐링(annealing) 단계(56℃)에서 20초; 연장(extension step) 단계(72℃)에서 30초 조건에 따라 PCR(총 30 cycle)을 수행하였다. (정방향 프라이머 (서열번호 12): ACTACCATATGTTCAACAAGGATCAGCAGAGCGCC; 역방향 프라이머 (서열번호 13): ACTACGCGGCCGCTCACTGGAAAGATTTCAGAGAAGCCTGAGCTTTGTTCAGTTTCTTAGCTTCACCCAGCACGTTC)

증폭된 #8188의 폴리뉴클레오티드(서열번호 5)를 pET28a 벡터에 클로닝한 후, 단백질 생산을 위해, E. coli strain BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli BL21(DE3)를 50㎍/mL의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 배양하였다. OD₆₀₀의 값이 0.6에 도달했을 때, 0.5 mM IPTG를 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. E. coli를 수득한 후, 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 0.5 mM PMSF를 포함한 용해 완충액(lysis buffer)에 재현탁시키고, 마이크로플루이다이저(microfluidizer, Microfluidics)로 균질화시켰다. 원심분리를 통해 세포 부유물을 제거하고, 상등액을 Ni-NTA 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0를 포함하는 버퍼를 이용하여 6XHis-태그된 단백질을 용출시키고, 이미다졸은 PD-10 탈염 컬럼(desalting column, GE Healthcare)를 이용하여 제거하여, 정제된 #8188 단백질 A를 수득하였다.

< 실시예 3> 3LRH ^cys 항체 및 # 8188 ^cys 단백질 A의 제작

3LRH 항체와 #8188 단백질 A 간의 항원-항체 결합 반응을 나노구조체의 제조 등에 적용하기 위하여 상기 두 폴리펩타이드 분자를 이황화 다리(disulfide bridge)로 연결하고자 하였다. Design 2.0 프로그램을 사용하여 3LRH의 경우 53번째 아미노산인 티로신, #8188 단백질 A의 경우 51번째 아미노산인 알라닌을 시스테인(Cys)을 도입할 위치(site)로 결정하였다.

< 실시예 3-1> 3LRH ^cys 항체의 제작

3LRH의 53번째 아미노산인 티로신(tyrosine, Y)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이시킨 3LRH^cys 항체(표 3)을 제작하기 위해, 오버랩 PCR을 수행하였다.

3LRH 항체를 암호화하는 유전자를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머 1(서열번호 14)과 역방향 프라이머 1(서열번호 15)을 이용하여 PCR을 수행하여 템플릿(template) 1을 얻었다. 그 다음, 정방향 프라이머 2(서열번호 16)와 역방향 프라이머 2(서열번호 17)를 이용하여 PCR을 하여 템플릿 2를 얻었다. 정방향 프라이머 1과 역방향 프라이머 2로 템플릿 1과 템플릿 2를 동시에 PCR을 수행하여 오버랩 PCR을 완성하였다.

(정방향 프라이머 1(서열번호 14): ACTACCATATGGGTAGTCAACCAGTACTTACACAA;

역방향 프라이머 1(서열번호 15): ATCATCATCACACATTAATAACTCCGGGGCACGGC;

정방향 프라이머 2(서열번호 16): TTATTAATGTGTGATGATGATTTATTAGCACCCG;

역방향 프라이머 2(서열번호 17): ACTACGCGGCCGCTCATGCGGACAGCACCGTAACT)

서열번호	항체 이름	서열 종류	서열
1	3LRH	아미노산 서열	MGSQPVLTQSPSVSAAPRQRVTISVSGSNSNIGSNTVNWIQ QLPGRAPELLM Y DDDLLAPGVSDRFSGSRSGTSASLTISGLQSE DEADYYAATWDDSLNGWVFGGGTKVTVLSA
6	3LRH^cys	아미노산 서열	MGSQPVLTQSPSVSAAPRQRVTISVSGSNSNIGSNTVNWIQ QLPGRAPELLM C DDDLLAPGVSDRFSGSRSGTSASLTISGLQSE DEADYYAATWDDSLNGWVFGGGTKVTVLSA
7	3LRH^cys	염기서열 (5'→3')	ATGGGTAGTCAACCAGTACTTACACAAAGCCCGTCTGTGTCTGCCGCTCCACG TCAGAGAGTCACCATCTCAGTTAGTGGTTCTAATTCAAATATAGGATCGAACA CAGTGAACTGGATTCAGCAGTTGCCTGGCCGTGCCCCGGAGTTATTAATGTGT GATGATGATTTATTAGCACCCGGAGTATCAGATCGCTTTTCAGGAAGCCGTAG TGGCACTAGTGCGTCCTTAACCATTAGCGGGTTACAGTCTGAAGACGAAGCGG ACTATTACGCAGCTACGTGGGATGATAGTTTAAATGGCTGGGTTTTTGGTGGT GGTACTAAAGTTACGGTGCTGTCCGCA

증폭된 3LRH^cys 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 7)를 pET28a 벡터에 클로닝한 후, 실시예 1에 기재된 방법으로 3LRH^cys 항체를 얻었다.

< 실시예 3-2> # 8188 ^cys 단백질 A의 제작

#8188 단백질 A의 51번째 아미노산인 알라닌(alanine, A)을 시스테인(cystein, C)으로 돌연변이시키기 위해, #8188 단백질 A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 주형으로 PCR을 수행하여 #8188^cys 단백질 A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다.

서열번호	단백질 이름	서열 종류	서열
4	#8188 단백질 A	아미노산 서열	MFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA KKLNK A QASLKSFQ
8	#8188^cys 단백질 A	아미노산 서열	MFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA KKLNK C QASLKSFQ
9	#8188^cys 단백질 A 내 결합펩타이드	아미노산 서열	KKLNKCQASLKSFQ
10	#8188^cys 단백질 A 내 결합펩타이드	아미노산 서열	xKxxxCxxSLxxFx
11	#8188^cys 단백질 A	염기서열 (5'→3')	ATGTTCAACAAGGATCAGCAGAGCGCCTTCTACGAGATCCTGAACATGCCGA ACCTGAACGAGGCCCAGCGCAACGGCTTCATCCAGAGCCTGAAGGATGATCC GAGCCAGAGCACGAACGTGCTGGGTGAAGCTAAGAAACTGAACAAATGTCAG GCTTCTCTGAAATCTTTCCAG

구체적으로 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR을 통해 수득하였다. 구체적인 PCR 과정은 다음과 같다. #8188 단백질 A를 암호화하는 유전자를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머 (서열번호 18)과 역방향 프라이머 (서열번호 19)을 이용하여 변성(denaturation) 단계(95℃)에서 20초; 어닐링(annealing) 단계(56℃)에서 20초; 연장(extension step) 단계(72℃)에서 30초 조건에 따라 PCR(총 30 cycle)을 수행하였다. (정방향 프라이머 (서열번호 18): ACTACCATATGTTCAACAAGGATCAGCAGAGCGCC; 역방향 프라이머 (서열번호 19): ACTACGCGGCCGCTCACTGGAAAGATTTCAGAGAAGCCTGACATTTGTTCAGTTTCTTAGCTTCACC)

증폭된 #8188^cys 단백질 A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)를 pET28a 벡터에 클로닝한 후, 단백질 생산을 위해, E. coli strain BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli BL21(DE3)를 50㎍/mL의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 배양하였다. OD₆₀₀의 값이 0.6에 도달했을 때, 0.5 mM IPTG를 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. E. coli를 수득한 후, 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 0.5 mM PMSF를 포함한 용해 완충액(lysis buffer)에 재현탁시키고, 마이크로플루이다이저(microfluidizer, Microfluidics)로 균질화시켰다. 원심분리를 통해 세포 부유물을 제거하고, 상등액을 Ni-NTA 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0를 포함하는 버퍼를 이용하여 6XHis-태그된 단백질을 용출시키고, 이미다졸은 PD-10 탈염 컬럼(desalting column, GE Healthcare)를 이용하여 제거하여, 정제된 #8188^cys 단백질 A를 수득하였다.

< 실시예 4> 3LRH 항체-#8188 단백질 A의 복합체(complex) 제작

3LRH 항체-#8188 단백질 A의 복합체를 제작하기 위해, 실시예 1에서 제작한 3LRH 항체와 실시예 2에서 제작한 #8188 단백질 A를 1:1 몰비(molar ratio)로 4℃에서 1시간 동안 혼합하였다.

Superdex 200 겔-여과 크로마토그래피(gel-filtration chromatography)를 이용하여 3LRH 항체-#8188 단백질 A의 복합체만을 정제하였다.

< 실시예 5> 3LRH ^cys 항체-# 8188 ^cys 항원 단백질의 복합체(complex) 제작

3LRH^cys 항체-#8188^cys 단백질 A의 복합체를 제작하기 위해, 실시예 3에서 제작한 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A를 비환원 환경(non-reducing conditions) 하에서 1:1 몰비(molar ratio)로 4℃에서 밤새 혼합하였다.

Superdex 200 겔-여과 크로마토그래피(gel-filtration chromatography)를 이용하여 3LRH^cys 항체-#8188^cys 항원 펩타이드의 복합체만을 정제하였다.

< 실험예 1> 3LRH 항체-#8188 단백질 A의 복합체의 결정 구조 확인

35% PEG 4000, 0.1 M MOPS pH 6.5를 포함하는 결정화 용액(crystallization solution)과 동결보호제인 30% 글리세롤을 이용하여 실시예 4에서 제작한 3LRH 항체-#8188 단백질 A의 복합체를 결정화시켰다. 결정체(crystal)는 -170℃의 액체 질소에서 급속 동결시켰다.

회절 데이터는 포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory)의 7A와 5C 빔 라인에서 수집하였고, 회절 데이터의 처리에는 패키지 HKL2000를 사용하였다(HKL research).

구조의 확인과 개선(refinement)의 초기 단계는 PHASER 프로그램을 이용한 분자 대체 기법(molecular replacement technique)으로 계산되었다. 원자 모델은 프로그램 COOT 및 PHENIX를 이용, 반복적인 모델링과 개선(refinement)에 의해 구축되었다.

결정 구조에서, #8188 단백질 A의 변형된 C 말단 나선은 예상대로 3LRH 항체와 상호 작용하였다(도 5 참조). 에피토프 생성을 위해 변이된 아미노산 잔기는 빨간색으로 표시되어 있다.

3LRH 항체와 상호 작용하는 아미노산의 구조는 본래의 헌팅틴 펩타이드-3LRH 항체의 복합체의 구조와 실질적으로 동일하고, #8188 단백질 A 및 천연 단백질 A의 전체 구조는 0.408 Å의 Cα r.m.s.d로 겹쳐질 수 있다(도 6 및 도 7).

< 실험예 2> SDS-PAGE를 이용한 3LRH ^cys 항체-# 8188 ^cys 단백질 A 간의 이황화 다리(disulfide bridge)의 형성 확인

실시예 5에 기재된 바와 같이, 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A를 혼합하였을 때, 이황화 다리가 제대로 형성되는지를 환원성 및 비환원성 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 모니터링하였다.

도 8을 참고하면, 비환원성 겔에서 3LRH^cys 항체와 #8188^cys 단백질 A 사이의 이황화 다리가 형성되어 밴드가 이동됨을 확인하였으며, 밤새 배양 후(16 hr) 거의 100% 효율로 이황화 다리가 형성되는 것을 확인되었다. 결합할 항체 없이, #8188^cys 단백질 A만 있는 경우, 비환원성 조건에서 동형이량체(homodimer)를 형성하였다.

시스테인 돌연변이는 복합체의 안정성을 증가시킬 수 있다. 뿐만 아니라 이황화 다리는 두 개의 시스테인이 서로 충분히 가까울 때만 형성될 수 있기 때문에, 에피토프의 성공적인 설계와 복합체의 형성을 확인할 수 있는 편리한 도구가 될 수있다. 따라서 3LRH^cys 항체에 대한 #8188^cys 단백질 A의 결합은 정제 없이도 단백질 최소량만 사용하여, 비환원성 SDS-PAGE에 의해 빠르게 모니터링될 수 있다.

< 실험예 3> 3LRH ^cys 항체-# 8188 ^cys 항원 단백질의 복합체의 결정화(crystallization) 구조 확인

45% PEG 4000, 0.1 M HEPES pH 7.5를 포함하는 결정화 용액(crystallization solution)과 동결보호제인 30% 글리세롤을 이용하여 실시예 5에서 제작한 3LRH^cys 항체-#8188^cys 단백질 A의 복합체를 결정화시켰다. 결정체(crystal)는 -170℃의 액체 질소에서 급속 동결시켰다.

3LRH^cys 항체-#8188^cys 단백질 A의 복합체의 구조에서, 전자 밀도 지도(electron density map)는 이황화 다리를 분명하게 나타낸다 (도 9). 이황화 다리는 도 9에 노란색 선으로 표시하였고, 이황화 다리 주변에 전자 밀도 지도는 회색 메쉬로 표시하였다. 또한 이 이황화 다리 자체는 3LRH^cys 항체-#8188^cys 단백질 A 사이의 상호작용을 방해하지 않음을 보여준다.

이황화 다리로 안정화된 3LRH^cys 항체-#8188^cys 단백질 A의 복합체 시스템은 바이오컨쥬게이션에 유용한 도구가 될 수 있다. 3LRH와 #8188 단백질 A는 인간 단백질로부터 유래된 것이기 때문에, 기존에 면역학적 합병증과 같은 부작용으로 치료제로서 적용이 제한되어 온 종래의 바이오컨쥬게이션 방법의 한계점을 해결할 수 있다. 또한 3LRH^cys 항체 또는 #8188^cys 단백질 A는 사이즈가 작으므로, E. coli에서 퓨전 태그(fusion tag)로 쉽게 다량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) <120> Peptides for forming protein-protein conjugate and the method for forming protein-protein conjugate using the same <130> 2017P-11-031 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRH antibody <400> 1 Met Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Val Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Ile Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro 35 40 45 Glu Leu Leu Met Tyr Asp Asp Asp Leu Leu Ala Pro Gly Val Ser Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Ala Thr Trp Asp 85 90 95 Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Ser Ala 115 <210> 2 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRH antibody <400> 2 atgggtagtc aaccagtact tacacaaagc ccgtctgtgt ctgccgctcc acgtcagaga 60 gtcaccatct cagttagtgg ttctaattca aatataggat cgaacacagt gaactggatt 120 cagcagttgc ctggccgtgc cccggagtta ttaatgtatg atgatgattt attagcaccc 180 ggagtatcag atcgcttttc aggaagccgt agtggcacta gtgcgtcctt aaccattagc 240 gggttacagt ctgaagacga agcggactat tacgcagcta cgtgggatga tagtttaaat 300 ggctgggttt ttggtggtgg tactaaagtt acggtgctgt ccgca 345 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein A <400> 3 Met Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 20 25 30 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu 35 40 45 Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188 Protein A <400> 4 Met Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 20 25 30 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu 35 40 45 Asn Lys Ala Gln Ala Ser Leu Lys Ser Phe Gln 50 55 <210> 5 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188 Protein A <400> 5 atgttcaaca aggatcagca gagcgccttc tacgagatcc tgaacatgcc gaacctgaac 60 gaggcccagc gcaacggctt catccagagc ctgaaggatg atccagccag agcacgaacg 120 tgctgggtga agctaagaaa ctgaacaaag ctcaggcttc tctgaaatct ttccag 176 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody <400> 6 Met Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala 1 5 10 15 Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Val Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Ile Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro 35 40 45 Glu Leu Leu Met Cys Asp Asp Asp Leu Leu Ala Pro Gly Val Ser Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Ala Thr Trp Asp 85 90 95 Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Ser Ala 115 <210> 7 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody <400> 7 atgggtagtc aaccagtact tacacaaagc ccgtctgtgt ctgccgctcc acgtcagaga 60 gtcaccatct cagttagtgg ttctaattca aatataggat cgaacacagt gaactggatt 120 cagcagttgc ctggccgtgc cccggagtta ttaatgtgtg atgatgattt attagcaccc 180 ggagtatcag atcgcttttc aggaagccgt agtggcacta gtgcgtcctt aaccattagc 240 gggttacagt ctgaagacga agcggactat tacgcagcta cgtgggatga tagtttaaat 300 ggctgggttt ttggtggtgg tactaaagtt acggtgctgt ccgca 345 <210> 8 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A <400> 8 Met Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 20 25 30 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu 35 40 45 Asn Lys Cys Gln Ala Ser Leu Lys Ser Phe Gln 50 55 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A - peptide <400> 9 Lys Lys Leu Asn Lys Cys Gln Ala Ser Leu Lys Ser Phe Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A - peptide <400> 10 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Leu Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 <210> 11 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A <400> 11 atgttcaaca aggatcagca gagcgccttc tacgagatcc tgaacatgcc gaacctgaac 60 gaggcccagc gcaacggctt catccagagc ctgaaggatg atccgagcca gagcacgaac 120 gtgctgggtg aagctaagaa actgaacaaa tgtcaggctt ctctgaaatc tttccag 177 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188 Protein A - Forward primer <400> 12 actaccatat gttcaacaag gatcagcaga gcgcc 35 <210> 13 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188 Protein A - Reverse primer <400> 13 actacgcggc cgctcactgg aaagatttca gagaagcctg agctttgttc agtttcttag 60 cttcacccag cacgttc 77 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody - Forward primer1 <400> 14 actaccatat gggtagtcaa ccagtactta cacaa 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody - Reverse primer1 <400> 15 atcatcatca cacattaata actccggggc acggc 35 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody - Forward primer2 <400> 16 ttattaatgt gtgatgatga tttattagca cccg 34 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LRHcys antibody - Reverse primer2 <400> 17 actacgcggc cgctcatgcg gacagcaccg taact 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A - Forward primer <400> 18 actaccatat gttcaacaag gatcagcaga gcgcc 35 <210> 19 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8188cys Protein A - Reverse primer <400> 19 actacgcggc cgctcactgg aaagatttca gagaagcctg acatttgttc agtttcttag 60 cttcacc 67

Claims

서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질.
제1항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
1) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 제1 목적 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질 및, 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 제2 목적 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 제조하는 단계; 및
2) 상기 제조된 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 혼합하여 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 간 결합을 형성시키는 단계를 포함하는, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 상기 제1 목적 단백질 서열의 N-말단, 내부 또는 C-말단에 존재하며,
상기 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 상기 제2 목적 단백질의 서열의 N-말단, 내부 또는 C-말단에 존재하는 것인, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 단계 2)의 결합은 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 상기 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 간의 결합인, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 펩타이드 간의 결합은 항원-항체 반응으로 결합된 것인, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 펩타이드 간의 결합은 이황화 결합(disulfide bond)을 더 포함하는 것인, 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate) 형성 방법.
삭제
청구항 4의 방법으로 형성된 제1 목적 단백질 및 제2 목적 단백질의 결합체(conjugate).