KR20190013970A - 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 iii 형 도메인 - Google Patents

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Abstract

혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 III 형 도메인 (FN3), 혈청 알부민 특이성 FN3 도메인을 코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, FN3 도메인을 발현하는 세포 및 관련 벡터, 검출가능하게 표지된 FN3 도메인 및 이종 모이어티에 융합된 FN3 도메인은 진단 및 치료 응용분야에서 분자의 반감기를 연장하는데 유용하다.

Description

혈청 알부민 결합 피브로넥틴 III 형 도메인
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 본 명세서에 참고로 포함된다. 2017년 5월 31일에 작성된 이 ASCII 사본 명칭은 JBI5089WOPCT.txt이며 크기는 49,228 바이트이다.
기술분야
본 발명은 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인에 관한 것이다. 이러한 FN3 도메인은 예를 들어, 그에 접합된 약물 또는 단백질의 생체 내 혈청 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다. 상기 분자의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다.
혈류에서 생물치료 분자의 신속한 제거는 이들 분자의 제한된 임상적 유효성에 기여할 수 있거나, 환자에 대한 더 빈번한 투여의 원인이 된다. 보통 발생하는 제거 방법 중 하나는 사구체 여과로 인한 신 클리어런스이다. 분자량이 50,000 달톤 초과인 분자의 경우 신장 여과 속도가 크게 감소되므로, 상기 제거 경로는 더 작은 생물치료제와 주로 관련된다 (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 2011). 몇몇 승인된 생물치료 약물은 자체로 여과 한계에 미치지 않는 활성 부분을 함유하므로 신속하게 제거된다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 신장 여과를 감소시키도록 치료 분자의 크기를 효과적으로 증가시키기 위한 다수의 기술이 도입되었다.
인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin, HSA)을 첨가하기 위한 치료용 단백질의 변형은 단백질의 유체역학 반경을 증가시키고 사구체 여과를 감소시키기 위한 효과적인 방법인 것으로 나타났다. HSA는 FcRn 리사이클링으로 인해 생체 내에서 긴 반감기를 나타내며 약 40 g/L의 농도로 HSA는 혈액에서 발견되는 가장 풍부한 단백질이다. FcRn 리사이클링은 인간에서 약 19일의 긴 반감기를 초래한다. 또한, 생체 분포 연구 결과 알부민은 체 내에서 염증 관절이나 종양과 같은 질환을 표적으로 삼기에 중요한 영역에 분포할 수 있는 것으로 알려졌다 (Wunder, Muller-Ladner, Stelzer, Funk, Neumann, Stehle, Pap, Sinn, Gay and Fiehn, J Immunol 170: 4793-4801 2003). 이와 같이, 많은 단백질의 혈청 반감기가 이들을 HSA에 대한 C-말단 또는 N-말단 융합체로서 생성함으로써 증가되어 왔다. 성공적인 융합체는 특히 인터페론 알파 (Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10: 1509-1515 2010), 인간 성장 호르몬 (Osborn, Sekut, Corcoran, Poortman, Sturm, Chen, Mather, Lin and Parry, Eur J Pharmacol 456: 149-158 2002), 종양 괴사 인자 (Muller, Schneider, Pfizenmaier and Wajant, Biochem Biophys Res Commun 396: 793-799 2010), 응고 인자 IX (Metzner, Weimer, Kronthaler, Lang and Schulte, Thromb Haemost 102: 634-644 2009), 응고 인자 VIIa (Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19 2008), 인슐린 (Duttaroy, Kanakaraj, Osborn, Schneider, Pickeral, Chen, Zhang, Kaithamana, Singh, Schulingkamp, Crossan, Bock, Kaufman, Reavey, Carey-Barber, Krishnan, Garcia, Murphy, Siskind, McLean, Cheng, Ruben, Birse and Blondel, Diabetes 54: 251-258 2005), 유로키나제 (Breton, Pezzi, Molinari, Bonomini, Lansen, Gonzalez De Buitrago and Prieto, Eur J Biochem 231: 563-569 1995), 히루딘 (Sheffield, Smith, Syed and Bhakta, Blood Coagul Fibrinolysis 12: 433-443 2001), 및 이중특이성 항체 단편 (Muller, Karle, Meissburger, Hofig, Stork and Kontermann, J Biol Chem 282: 12650-12660 2007)을 포함한다. HSA 융합 단백질은 긴 혈청 반감기를 가질 수 있지만, 그러한 융합 단백질의 대규모 생산은 진핵생물 발현 시스템으로 제한된다. 또한, HSA의 큰 크기는 입체 장애로 인하여 치료제의 활성 상실로 이어질 수 있다.
알부민의 긴 혈청 반감기의 이점을 취하기 위한 또 다른 방법은 혈액 내 혈청 알부민에 결합하는 펩티드 또는 단백질 도메인에 대한 융합체로서 치료용 단백질을 생성하는 것이다. 이들 분자는 융합 단백질이 생체 내에서 정의된 속도 및 체류 시간으로 알부민에 결합 및 방출되게 하기 위해 다양한 친화성을 가지고 알부민에 결합하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이는 상이한 종의 알부민에 결합하는 일련의 시스테인-제한 펩티드를 선택하는데 사용되었다. 이 펩티드에 대한 융합체로서의 Fab 항체 단편의 발현은 마우스 및 토끼에서 Fab의 혈청 반감기를 현저히 증가시켰다 (Dennis, Zhang, Meng, Kadkhodayan, Kirchhofer, Combs and Damico, J Biol Chem 277: 35035-35043 2002) (US 20040253247A1). 후속 연구는 항원 단편에 대한 상기 펩티드의 융합이 동일한 항원을 표적으로 하는 Fab 및 mAb 분자에 비해 더 우수한 피크 종양 축적 및 더 균일한 종양 분포를 유도한다는 것을 보여 주었다 (Dennis, Jin, Dugger, Yang, McFarland, Ogasawara, Williams, Cole, Ross and Schwall, Cancer Res 67: 254-261 2007) (US20050287153A1). 알부민에 특이적으로 결합하는 다수의 항체 단편이 유사한 방식으로 선택되었다. HSA에 결합하는 낙타과 VHH 항체 단편 (나노바디)을 TNF-α에 결합하는 다른 나노바디에 융합시켰다. 이 분자의 혈청 반감기는 마우스에서 54분에서 2.2일로 연장되었으며, 류마티스 관절염의 마우스 모델에서 염증 관절에 축적과 효능을 보여 주었다 (Coppieters, Dreier, Silence, de Haard, Lauwereys, Casteels, Beirnaert, Jonckheere, Van de Wiele, Staelens, Hostens, Revets, Remaut, Elewaut and Rottiers, Arthritis Rheum 54: 1856-1866 2006). 동일한 알부민 결합 나노바디를 항-EGFR 나노바디에 융합시켜 이종이식 모델에서 반감기 증가 및 더 나은 종양 축적을 이루었다 (Tijink, Laeremans, Budde, Stigter-van Walsum, Dreier, de Haard, Leemans and van Dongen, Mol Cancer Ther 7: 2288-2297 2008). 유사하게, 알부민에 결합하는 항-알부민 도메인 항체 (dAb)가 생성되었다. 인터류킨-1 수용체에 대한 이들 dAb의 융합은 래트에서 반감기를 2분에서 4.3시간으로 증가시켰다 (Holt, Basran, Jones, Chorlton, Jespers, Brewis and Tomlinson, Protein Eng Des Sel 21: 283-288 2008). 이 기술은 또한 인터페론 알파 2b와의 융합에도 적용되었다 (Walker, Dunlevy, Rycroft, Topley, Holt, Herbert, Davies, Cook, Holmes, Jespers and Herring, Protein Eng Des Sel 23: 271-278 2010). 유사한 방식으로, 알부민에 대해 친화력을 갖는 박테리아로부터의 자연 발생 알부민 결합 도메인이 생체 내 반감기 연장을 위해 제기되었다 (Anderson et al. 2011, Orlova et al., 2013, Malm et al., 2014). 야콥스 등 (Jacobs et al.)은 최근 합의에 의해 설계된 알부민 결합 도메인을 기술하고 알부민 친화성에 대한 혈청 노출 프로파일 베이스 조정 가능성을 입증하였다 (Jacobs, Gibbs, Conk, Yi, Maguire, Kane, O'Neil, Protein Eng Des Sel 10:385-93, 2015). 연구 도구로서의 유용성에도 불구하고, 치료 응용에 대한 이러한 박테리아 유래 도메인의 유용성은 생성된 항체에 의한 면역원성 및 약물 제거성에 대한 그의 잠재성으로 제한될 수 있다.
따라서, 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있고, 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있는 바람직한 생체물리학적 특성 (예를 들어, 실질적으로 단량체, 잘 접힌 등)을 가질 수 있고 조직 침투를 허용하기에 충분히 작은 혈청 알부민 결합 분자에 대한 필요성이 있다.
개요
본 발명은 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인을 포함한다. 제공된 FN3 도메인을 코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 FN3 도메인을 발현하는 세포 및 관련 벡터가 또한 기재되어 있다. 또한, 제공된 FN3 도메인을 사용하는 방법이 기재되어 있다. 예를 들어 알부민의 혈청 반감기가 길면 알부민 결합 펩티드는 혈청 반감기가 긴 치료용 단백질을 만드는데 이상적인 융합 파트너가된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 FN3 도메인이 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 결합하고, FN3 도메인의 혈청 반감기가 서열 번호 67의 텐콘 (Tencon) 서열의 것의 적어도 10배 초과인 단리된 FN3 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민 및 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘 서열에 기초한다. 추가의 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 4의 텐콘27 서열에 기초한다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 임의로 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 및/또는 86에 치환을 갖는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4에 기초한다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 2, 3, 5, 6, 7 또는 8의 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다.
일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘 서열에 비해 C, CD, F 및 FG 루프에서 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 51 내지 53으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 사이노몰거스 원숭이에서 적어도 약 25시간의 혈청 반감기를 갖는다.
기술된 알부민-특이적 FN3 도메인 외에, 기술된 항체 및 항원-결합 단편을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 본원에서 알부민-특이적 FN3 도메인을 발현하는 세포와 함께 제공된다. 또한 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 기재되어 있다. 이들 세포는 포유동물 세포 (예: 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포 (예: Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포 또는 박테리아 세포 (예: 대장균)일 수 있다. 기재된 FN3 도메인의 생성 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 기술된 알부민-특이적 FN3 도메인을 상기 분자의 반감기를 연장시키기 위해 다양한 분자에 융합시키거나 다르게 결합시키는 방법을 포함한다. 예를 들어 혈청 알부민의 혈청 반감기가 길어지면 혈장 반감기가 긴 치료용 단백질을 만드는데 이상적인 융합 파트너가 된다. 이와 같이, 알부민-특이적 FN3 도메인은 치료 약물의 반감기 연장에 유용하다.
일 구체예에 있어서, 치료 파트너의 생체 내 반감기를 개선시키기 위해 알부민-특이적 FN3 도메인을 포함하는 약학 조성물이 투여된다. 이러한 반감기 연장은 예를 들어 알부민 결합 FN3 도메인의 약물동태를 모니터링하는 것을 포함하여 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 이들 방법에 대한 특이적 검정은 실시예에서 제공된다.
본 발명의 범위 내에 개시된 알부민-특이적 (결합) FN3 도메인을 포함하는 키트가 있다. 이 키트는 본원에 제공된 알부민-특이적 FN3 도메인을 사용하는 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 수행하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 기술된 키트는 본원에 기재된 FN3 도메인 및 생물학적 샘플에서 인간 혈청 알부민의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 기재된 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 FN3 도메인 및 사용하지 않을 때 FN3 도메인을 함유하기 위한 용기, 고체 지지체에 부착된 FN3 도메인의 사용에 대한 설명 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 검출 가능하게 표지된 형태의 FN3 도메인을 포함할 수 있다.
도 1은 알부민 결합 FN3 도메인을 사용한 사이노몰거스 원숭이 및 인간 혈청 유래 내인성 알부민의 간접 풀다운을 보여준다. 알부민의 도메인 1에 결합하는 FN3 도메인은 점선으로 표시되어 있다; 알부민의 도메인 3에 결합하는 FN3 도메인은 실선으로 둘러싸여 있다. 모든 구조물은 하나의 눌 (null) FN3 도메인 (TC25)과 하나의 알부민 결합 FN3 도메인을 갖는 이중 특이적 유전 융합체로서 제조된다. * ABD는 알부민 결합 도메인을 의미한다 (J.T. Andersen, R. Pehrson, V. Tolmachev, M.B. Daba, L. Abrahmsen, C. Ekblad, J. Biol. Chem. 286:5234-5241 2011 참조).
도 2는 1 mg/kg (H9) 또는 2 mg/kg (ALB18 또는 ALB33)의 단일 IV 투여 후, 사이노몰거스 원숭이에서 알부민 결합 FN3 도메인의 약물동태 프로파일을 나타낸다.
예시적인 구체예의 상세한 설명
정의
설명의 측면과 관련된 다양한 용어가 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어들은 달리 지시되지 않는 한 당 업계에서 통상적인 의미로 받아들여지는 것이다. 다른 특별히 정의된 용어는 본원에서 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포들의 조합 등을 포함한다.
양, 시간의 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 개시된 방법을 수행하기에 적절하므로 특정 값으로부터 ±10%까지의 변동을 포함하는 것으로 한다. 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분의 양, 분자량과 같은 성질, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에서 얻고자 요구되는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구범위의 균등론의 적용을 제한하려는 시도는 아닌 것으로, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값 임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 반드시 발생하는 특정 오차를 포함한다.
"단리된"은 성분이 자연적으로 존재하는 생물체의 다른 생물학적 성분, 즉 다른 염색체 및 염색체 외 DNA와 RNA 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 분리되어 생성되거나, 정제된 생물학적 성분 (예컨대 핵산, 펩티드 또는 단백질)을 의미한다. 따라서 "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질에는 표준 정제 방법으로 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 조성물이 핵산, 펩티드 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리된 것일 수 있다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산뿐만 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 "단리된" FN3 도메인은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 FN3 도메인이 실질적으로 없는 FN3 도메인을 의미하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 실질적으로 인간 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인이 없다). 그러나, 인간 혈청 알부민의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 예를 들어 다른 종 (예컨대 혈청 알부민 종 동족체)으로부터의 다른 관련 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인"(FN3 도메인)이란 용어는 피브로넥틴, 테나신, 세포 내 세포 골격 단백질, 사이토카인 수용체 및 원핵 효소를 비롯한 단백질에서 빈번하게 발생하는 도메인을 말한다 (Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테네신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 피브로넥틴 (FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인 및 예를 들어 미국 특허 제8,278,419호에 기재된 비천연 합성 FN3 도메인이다. 개개의 FN3 도메인은 도메인 번호 및 단백질 명, 예컨대 테나신 (TN3)의 제3 FN3 도메인 또는 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인 (FN10)으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인 결합"은 본 발명의 FN3 도메인이 약 1x10- 6 M 이하, 예를 들어 약 1x10-7 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 또는 약 1x10-13 M 이하의 해리 상수 (KD)로 예정 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 전형적으로 기재된 FN3 도메인은 예를 들어 Proteon Instrument (BioRad)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 경우 비특이적 항원 (예를 들어, 카제인)에 대한 KD보다 적어도 10배 적은 KD로 예정 항원 (즉, 인간 혈청 알부민)에 결합한다. 그러나, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 기재된 FN3 도메인은 다른 관련 항원, 예를 들어 Macaca Fascicularis (사이노몰거스 원숭이, cyno) 또는 Pan troglodytes (침팬지)와 같은 다른 종 (동족체)으로부터의 동일한 예정 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 "혈청 반감기"는 일반적으로 자연적인 메카니즘에 의한 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 서열 또는 화합물의 클리어런스 또는 격리로 인해, 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체 내에서 50% 감소되는데 걸리는 시간으로 정의될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체 내 반감기는 약물동태 분석과 같이 그 자체로 공지된 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 적절한 기술은 당업자가 잘 알고 있을 것이고, 예를 들어 일반적으로 온혈 동물 (즉, 인간 또는 다른 적합한 포유동물, 예컨대 마우스, 토끼, 래트, 돼지, 개 또는 영장류, 예를 들어 Macaca 속 원숭이 (예컨대 특히 사이노몰거스 원숭이 (Macaca fascicularis) 및/또는 붉은털 원숭이 (Macaca mulatta) 및 개코 원숭이 (Papio ursinus))에게 본원의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 적합한 용량을 적절히 투여하는 단계; 상기 동물로부터 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 측정하는 단계; 및 상기 수득된 데이터 (의 플롯)으로부터, 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 투여시 초기 수준과 비교하여 50% 감소될 때까지의 시간을 계산하는 단계를 포함한다. 예를 들어 아래 실험 부분, 및 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]과 같은 표준 핸드북을 참조한다. "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]이 또한 참조된다.
또한 당업자에게 명백한 바와 같이 (예를 들어 WO 04/003019의 페이지 6 및 7 및 그 안에 인용된 다른 참고 문헌 참조), 반감기는 t½-알파, t½-베타 및 곡선 아래 면적 (AUC)과 같은 파라미터를 사용해 표시될 수 있다. 본 명세서에서, "반감기"는 이들 파라미터 중 어느 하나, 예컨대 이들 파라미터 중 어느 2개, 또는 본질적으로 이들 3개 파라미터 모두의 감소를 나타낸다.
약물동태학" 또는 "약물동태"란 용어는 당해 기술 분야에서 인정된 의미에 따라 사용되며, 체 내 약물 작용 연구, 예를 들어 약물 작용의 효과 및 지속 기간, 신체에 의해 흡수, 분포, 대사 및 제거되는 속도를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치환" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이" 또는 "돌연변이화"는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실 또는 삽입하여 그 서열의 변이체를 생성하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "랜덤" 또는 "랜덤화" 또는 "다양화된" 또는 "다양화"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에서 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 만드는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 "변이체"는 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 삽입 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"라이브러리"라는 용어는 변이체 집합을 나타낸다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변이체로 구성될 수 있다.
본원에 사용된 "텐콘"은 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지며 미국 특허 공보 제US2010/0216708호에 기재된 합성 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인을 지칭한다.
"핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"과 동의어로 사용되는 "폴리뉴클레오티드"는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리 리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 제한 없이 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA를 둘 다 포함하는 삼중 가닥 영역을 의미한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 주쇄를 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들면, 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특이한 염기를 포함한다. DNA와 RNA에는 다양한 변형이 있을 수 있다; 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 자연에서 일반적으로 발견되는 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징인 화학적 형태를 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 비교적 짧은 핵산 사슬을 포함하며, 종종 올리고뉴클레오티드라고 불린다.
"벡터"는 다른 핵산 세그먼트가 작동 가능하게 삽입되어 상기 세그먼트의 복제 또는 발현을 유도할 수 있는 플라스미드, 파지, 코스미드 또는 바이러스와 같은 레플리콘 (replicon)이다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 임의 유형의 세포, 예를 들어 일차 세포, 배양 세포 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 특정 구체예에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 그러한 세포의 자손은 예를 들어, 숙주 세포 게놈으로의 핵산 분자의 통합 또는 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수 있다. "발현" 및 "생성"이라는 용어는 본원에서 동의어로 사용되며 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 이 용어들은 유전자의 RNA로의 전사를 포함한다. 이들 용어는 또한 RNA를 하나 이상의 폴리펩티드로 번역하는 것을 포함하며, 또한 모든 자연 발생 전사 후 및 번역 후 변형을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현 또는 생성은 세포의 세포질 내 또는 세포 배양의 성장 배지와 같은 세포 외 환경 내에 있을 수 있다. "실질적으로 동일한"의 의미는 용어가 사용된 문맥에 따라 다를 수 있다. 중쇄 및 경쇄 및 이들을 코딩하는 유전자 사이에 존재할 수 있는 자연 서열 변화로 인해, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 아미노산 서열 또는 유전자 내에 약간의 변화가 발견될 수 있는 것이 기대되지만, 이는 그의 고유 특성 (예: 특이성 및 친화성)에 영향을 미치지 않는다. 이러한 기대는 부분적으로 유전자 코드의 축퇴뿐만 아니라 코딩된 단백질의 특성을 인식할 수 없게 변화시키는 보존적 아미노산 서열 변화의 진화적 성공에 기인한다.
개시된 FN3 도메인에 대한 개요
텐콘 (서열 번호 1)은 인간 테나신-C에서 유래한 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된 비자연 발생적 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인이다 (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; 미국 공개 특허 공보 제2010/0216708호). 텐콘의 결정 구조는 A, B, C, D, E, F 및 G로 불리는 베타 가닥인 FN3 도메인에 특징적인 7개의 베타 가닥을 연결하는 6개의 표면 노출 루프, 및 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프로 불리는 루프를 나타낸다 (Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; 미국 특허 제6,673,901호). 이들 루프 또는 각 루프 내의 선택된 잔기는 혈청 알부민에 결합하는 신규 분자를 선택하는데 사용될 수 있는 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위해 랜덤화될 수 있다. 표 1은 텐콘 (서열 번호 1)에서 각 루프 및 베타-가닥의 위치 및 서열을 나타낸다.
따라서, 텐콘 서열을 기반으로 설계된 라이브러리는 랜덤 FG 루프 또는 후술하는 라이브러리 TCL1 또는 TCL2와 같은 랜덤 BC 및 FG 루프를 가질 수 있다. 텐콘 BC 루프는 7개의 아미노산 길이를 가지므로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산이 BC 루프에서 다양화된 라이브러리에서 랜덤화될 수 있으며 텐콘 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 텐콘 FG 루프는 길이가 7개 아미노산이므로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산이 FG 루프에서 다양화된 라이브러리에서 랜덤화될 수 있으며 텐콘 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 텐콘 라이브러리의 루프에서의 추가적인 다양성은 루프에서 잔기의 삽입 및/또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, FG 및/또는 BC 루프는 1-22개의 아미노산으로 확장되거나 1-3개의 아미노산에 의해 감소될 수 있다. 텐콘에서 FG 루프는 길이가 7 아미노산인 반면, 항체 중쇄에서 상응하는 루프는 4 내지 28 잔기 범위이다. 최대 다양성을 제공하기 위해, FG 루프는 4 내지 28 잔기의 항체 CDR3 길이 범위에 상응하도록 길이뿐만 아니라 서열에서 다양화될 수 있다. 예를 들어, FG 루프는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산으로 루프를 확장함으로써 길이가 더 다양해질 수 있다.
텐콘 서열을 기반으로 설계된 라이브러리는 또한 FN3 도메인 측면에 형성되고 2 이상의 베타 가닥 및 적어도 하나의 루프를 포함하는 랜덤화 대체 표면을 가질 수 있다. 하나의 그러한 대체 표면은 C 및 F 베타-가닥 및 CD 및 FG 루프에서의 아미노산 (C-CD-F-FG 표면)에 의해 형성된다. 텐콘 대안의 C-CD-F-FG 표면을 기반으로 한 라이브러리 설계는 미국 특허 공보 제US2013/0226834호에 기술되어 있다. 텐콘 서열을 기반으로 설계된 라이브러리는 또한 텐콘 변이체에 기초하여 설계된 라이브러리, 예를 들어 11, 14, 17, 37, 46, 73 또는 86 잔기 위치에 치환을 갖는 텐콘 변이체 (서열 번호 1에 상응하는 잔기 번호 매김)를 기반으로 설계된 라이브러리를 포함하며, 어떤 변이체가 열 안정성을 개선시키는지를 보여준다. 예시적인 텐콘 변이체는 미국 특허 공보 제2011/0274623호에 기술되어 있으며, 서열 번호 1의 텐콘과 비교하여 치환 E11R, L17A, N46V 및 E86I를 갖는 텐콘27 (서열 번호 4)을 포함한다.
FN3 도메인 텐콘 (서열 번호 1)
A 가닥 1-12
AB 루프 13-16
B 가닥 17-21
BC 루프 22-28
C 가닥 29-37
CD 루프 38-43
D 가닥 44-50
DE 루프 51-54
E 가닥 55-59
EF 루프 60-64
F 가닥 65-74
FG 루프 75-81
G 가닥 82-89
텐콘 및 다른 FN3 서열 기반 라이브러리는 랜덤 또는 한정된 아미노산 세트를 사용하여 선택된 잔기 위치에서 랜덤화될 수 있다. 예를 들어, 랜덤 치환을 갖는 라이브러리에서 변이체는 20개의 모든 자연 발생 아미노산을 코딩하는 NNK 코돈을 사용하여 생성될 수 있다. 다른 다양화 계획에서, DVK 코돈은 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly 및 Cys를 코딩하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈은 20개의 아미노산 잔기 모두를 발생시키고 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 다양화될 위치에서 편향된 아미노산 분포를 갖는 FN3 도메인의 라이브러리는 예를 들어 Slonomics® 기술 (http://www_sloning_com)을 사용하여 합성될 수 있다. 이 기술은 수천 가지의 유전자 합성 과정에 충분한 보편적인 빌딩 블록으로 작용하는 사전 작제된 이중 가닥 삼중체 라이브러리를 사용한다. 삼중체 라이브러리는 원하는 DNA 분자를 만들기 위해 필요한 모든 서열 조합을 나타낸다. 코돈 지정은 잘 알려진 IUB 코드에 따른다.
본원에 기재된 인간 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 시험관 내에서 번역 후 형성된 단백질-DNA 복합체 풀을 생성시키기 위해 시스-디스플레이를 사용하여 스캐폴드 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 RepA를 코딩하는 DNA 단편에 결찰시켜 텐콘 라이브러리와 같은 FN3 라이브러리를 생성하고 [여기서, 각각의 단백질은 그를 코딩하는 DNA와 안정적으로 결합되어 있다] (미국 특허 제7,842,476 호, Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004), 당 업계에 공지되고 실시예에 기재된 임의의 방법에 의해 인간 혈청 알부민에 대한 특이적 결합에 대해 라이브러리를 분석함으로써 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 잘 알려진 방법은 ELISA, 샌드위치 면역측정법 및 경쟁적 및 비경쟁적 검정법이다 (예를 들어, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 참조). 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 동정된 FN3 도메인은 원하는 특성에 따라 추가로 특정화된다.
본원에 기술된 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 임의의 FN3 도메인을 주형으로 사용하여 라이브러리를 생성하고, 그 안에 제공된 방법을 사용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 분자에 대해 라이브러리를 스크리닝하여 생성될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 FN3 도메인은 테나신 C의 제3 FN3 도메인 (TN3) (서열 번호 68), 피브콘 (서열 번호 69146) 및 피브로넥틴 (FN10)의 제10 FN3 도메인 (서열 번호 70)이다. 표준 클로닝 및 발현 기술이 라이브러리를 벡터로 클로닝하거나 또는 라이브러리의 이중 가닥 cDNA 카세트를 합성하고, 시험관 내에서 라이브러리를 발현시키거나 또는 번역하는데 사용된다. 예를 들어, 리보솜 디스플레이 (Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), mRNA 디스플레이 (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997), 또는 다른 무세포 시스템 (미국 특허 제5,643,768호)이 사용될 수 있다. FN3 도메인 변이체의 라이브러리는 예를 들어 임의의 적합한 박테리오파지의 표면상에 디스플레이된 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리오파지의 표면상에 융합 폴리펩티드를 디스플레이하는 방법은 잘 알려져 있다 (미국 특허 공개 제2011/0118144호, 국제 특허 공개 제WO2009/085462호, 미국 특허 제6,969,108호, 미국 특허 제6,172,197호, 미국 특허 제5,223,409호, 미국 특허 제6,582,915호; 미국 특허 제6,472,147호).
본원에 기술된 일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘 서열 또는 서열 번호 4의 텐콘27 서열, 임의로 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 및/또는 86에 치환을 갖는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4에 기초한다.
본 개시의 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 열 안정성 및 열 폴딩 및 언폴딩의 가역성을 개선시키는 것과 같이 그의 특성을 개선하도록 변형될 수 있다. 매우 유사한 열 안정성 서열과의 비교, 디설파이드 브릿지의 안정화 설계, 알파-나선 성향의 증가를 위한 돌연변이, 염 다리의 공학적 조작, 단백질의 표면 전하 변화, 지시된 진화 및 공통 서열의 조성에 기반한 합리적 설계를 비롯해 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위해 여러 방법이 적용되어 왔다 (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). 고도의 열 안정성은 발현된 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 향상시키며, 면역원성을 감소시키고, 제조시 콜드 사슬의 필요성을 최소화할 수 있다. 텐콘 (서열 번호 1)의 열 안정성을 개선시키기 위해 치환될 수 있는 잔기는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 또는 86이며, 미국 특허 공보 제2011/0274623호에 기술되었다. 이들 잔기에 상응하는 치환은 본 발명의 분자를 함유하는 FN3 도메인에 도입될 수 있다.
단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 측정은 단백질 완전성의 동일 또는 상이한 측면으로 고찰될 수 있다. 단백질은 열, 자외선 또는 이온화 방사선, 액체 용액인 경우 주변 삼투압 및 pH 변화, 소기공 크기 여과, 자외선, 이온화 방사선, 예컨대 감마 조사, 화학적 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 파괴를 유발할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 부과되는 기계적 전단력에 의해 유발되는 변성에 민감하거나 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 분자의 반이 펼쳐지는 온도인 열 용융 온도 ("Tm") (섭씨 온도, ℃)를 측정하여 결정할 수 있다. 전형적으로, Tm이 높을수록 분자는 더 안정하다. 열 외에, 화학적 환경이 또한 특정 3차원 구조를 유지하기 위한 단백질의 능력을 변화시킨다.
일 구체예에서, 본 개시의 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 Tm의 증가로 측정된 조작전 동일한 도메인에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상으로 증가된 안정성을 나타낼 수 있다.
마찬가지로 화학적 변성을 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 화학 변성제에는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매 (DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염 (황산암모늄, 브롬화리튬, 염화리튬, 브롬화나트륨, 염화칼슘, 염화나트륨); 환원제 (예: 디티오트레이톨, 베타-머캅토에탄올, 디니트로티오벤젠 및 소듐 보로하이드라이드와 같은 수소화물), 비이온성 및 이온성 세제, 산 (예: 염산 (HCl), 아세트산 (CH3COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자 (예: 포스포리피드), 표적 변성제 등이 포함된다. 변성 정도의 정량화는 표적 분자를 결합시키는 능력과 같은 기능적 특성의 손실 또는 응집 경향, 이전 용매의 접근 불가능한 잔기의 노출, 또는 디설파이드 결합의 파괴 또는 형성과 같은 물리화학적 특성에 의존할 수 있다.
본 개시의 FN3 도메인은 예를 들어, 원자가 및 따라서 표적 분자 결합의 결합력을 증가시키는 수단으로서, 또는 2 이상의 상이한 표적 분자와 동시에 결합하는 이중 또는 다중 특이성 스캐폴드를 생성시키기 위해, 모노머, 다이머 또는 멀티머로서 생성될 수 있다. 다이머 및 멀티머는 단일 특이성, 이중 또는 다중 특이성 단백질 스캐폴드를 연결함으로써, 예를 들어 아미노산 링커, 예컨대 폴리-글리신, 글리신 및 세린 또는 알라닌 및 프롤린을 함유하는 링커를 포함시킴으로써 생성될 수 있다. 예시적인 링커는 (GS)2, (서열 번호 54), (GGGS)2 (서열 번호 55), (GGGGS)5 (서열 번호 56), (AP)2 (서열 번호 57), (AP)5 (서열 번호 58), (AP)10 (서열 번호 59), (AP)20 (서열 번호 60) 및 A(EAAAK)5AAA (서열 번호 61)를 포함한다. 다이머 및 멀티머는 N-에서 C-방향으로 서로 연결될 수 있다. 폴리펩티드를 신규 연결된 융합 폴리펩티드에 연결시키기 위한 천연 펩티드 링커뿐만 아니라 인공 펩티드 링커의 사용이 문헌 [Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; 미국 특허 제5,856,456호]에 익히 공지되었다.
인간 혈청 알부민 결합제
FN3 도메인은 ~10 kDa의 작은 크기로 인해 신장 여과 및 분해를 통해 순환에서 빠르게 제거된다. 특정 측면에서, 본 개시는 FN3 도메인의 반감기를 연장시키기 위해 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA)에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 제공한다.
기술된 알부민-특이적 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 결합하고 서열 번호 67의 텐콘 서열의 혈청 반감기와 비교하여 적어도 10배 더 높은 혈청 반감기를 가지며, 따라서 그에 접합된 약물 또는 단백질의 생체 내 혈청 반감기를 연장시키기 위한 효율적인 방식을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 62의 인간 혈청 알부민의 도메인 I에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 62의 인간 혈청 알부민의 도메인 III에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 항체는 서열 번호 67의 텐콘 서열의 혈청 반감기와 비교하여 적어도 10배 높은 혈청 반감기를 갖는다.
일부 구체예에서, 기재된 FN3 도메인은 서열 번호 63의 Macaca Fascicularis (사이노몰거스 원숭이) 혈청 알부민과 교차 반응한다.
일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민-결합 FN3 도메인은 분자의 N-말단에 연결된 개시제 메티오닌 (Met)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민-결합 FN3 도메인은 FN3 도메인의 C-말단에 연결된 시스테인 (Cys)을 포함한다.
N-말단 Met 및/또는 C-말단 Cys의 첨가는 반감기 연장 분자의 발현 및/또는 접합을 촉진시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 51, 52 또는 53의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열과 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열과 비교하였을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 1의 잔기 위치 6, 11, 22, 25, 26, 52, 53, 61에 상응하는 적어도 하나의 잔기 위치 또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 51-53에 기재된 바와 같은 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 C-가닥, CD-루프, F-가닥 및 FG-루프는 임의의 기재된 알부민-특이적 FN3 도메인 서열 (즉, 서열 번호 51-53)로부터의 특정 C-가닥, CD-루프, F-가닥 및 FG-루프의 각 세트, 또는 4개의 코어 FN3 도메인 서열의 C-가닥, CD-루프, F-가닥 및 FG-루프 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열로 대체된다.
일부 구체예에서, 단리된 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 51에 기재된 서열을 포함한다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 결합할 수 있다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 67의 텐콘 서열의 혈청 반감기와 비교하여 적어도 10배 이상의 혈청 반감기를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 단리된 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 52에 기재된 서열을 포함한다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 결합할 수 있다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 67의 텐콘 서열의 혈청 반감기와 비교하여 적어도 10배 이상의 혈청 반감기를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 단리된 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 53에 기재된 서열을 포함한다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 결합할 수 있다. 이 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호 67의 텐콘 서열의 혈청 반감기와 비교하여 적어도 10배 이상의 혈청 반감기를 가질 수 있다.
인간 혈청 알부민-특이적 FN3 영역의 융합
본 개시의 일 측면은 혈청 알부민 결합 FN3 도메인 및 적어도 하나의 추가 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다. 추가 모이어티는 임의의 진단, 영상 또는 치료 목적에 유용할 수 있다.
특정 구체예에서, 기재된 FN3 도메인에 융합된 모이어티의 혈청 반감기는 FN3 도메인에 접합되지 않은 경우의 모이어티의 혈청 반감기에 비해 증가된다. 특정 구체예에서, FN3 도메인 융합체의 혈청 반감기는 기재된 FN3 도메인 융합체에 접합되지 않은 경우의 모이어티 혈청 반감기에 비해 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500, 또는 3000% 더 길다. 다른 구체예에서, FN3 도메인 융합체의 혈청 반감기는 기재된 FN3 도메인 융합체에 접합되지 않은 경우의 모이어티 혈청 반감기에 비해 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5 배, 4-배, 4.5- 배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 10-배, 12-배, 13-배, 15-배, 17-배, 20-배, 22-배, 25 -배, 27-배, 30-배, 35 -배, 40-배, 또는 50-배 더 크다. 일부 구체예에서, FN3 도메인 융합체의 혈청 반감기는 사이노몰거스 원숭이에서 적어도 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간 또는 40시간이다.
따라서, 본원에 기재된 FN3 도메인 융합 분자는 치료 모이어티와 기재된 FN3 도메인 사이에 융합을 생성시킴으로써 치료 모이어티의 반감기를 증가시키는데 유용하다. 이러한 융합 분자는 융합체에 함유된 치료 모이어티의 생물학적 활성에 반응하는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 하기 단백질 또는 분자 중 임의의 것의 조절장애에 의해 야기되는 질병에서 기재된 FN3 도메인 융합 분자의 사용을 고려한다.
이종 모이어티
일부 구체예에서, 기재된 FN3 도메인은 작은 유기 분자, 핵산 또는 단백질인 제2 모이어티에 융합된다. 일부 구체예에서, 기재된 FN3 도메인은 수용체, 수용체 리간드, 바이러스 외피 단백질, 면역계 단백질, 호르몬, 효소, 항원 또는 세포 신호 전달 단백질을 표적으로 하는 치료 모이어티에 융합된다. 융합은 기재된 FN3 도메인, 즉 FN3 도메인-치료용 분자 또는 치료용 분자-FN3 도메인 배열 중 어느 하나의 말단에 제2 모이어티를 부착시킴으로써 형성될 수 있다.
다른 예시적인 구체예에서, 기재된 FN3 도메인은 하나 이상의 추가 FN3 도메인에 융합된다. 예를 들어, 기재된 FN3 도메인은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 추가 FN3 도메인에 융합될 수 있다. 추가의 FN3 도메인은 혈청 알부민 이외의 동일하거나 상이한 표적에 결합할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 출원은 식 FN3-X Y 또는 Y-X FN3으로 나타낼 수 있는 FN3-Y 융합체를 제공하며, 여기서 FN3은 본원에 기재된 FN3 도메인 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장 포함)이고, Xi는 폴리펩티드 링커 (적합한 링커는 예를 들어, 서열 번호 54 내지 61 중 임의의 하나를 포함함)이며, Y는 본원에 기재된 바와 같은 치료 모이어티이다.
특정 구체예에서, 본 출원은 식 FN3-Xi-Cys-X2-Y 또는 Y-Xi-Cys-X2-FN3으로 나타낼 수 있는 FN3-Y 융합체를 제공하며, 여기서 FN3는 본원에 기술된 바와 같은 단리된 FN3 도메인 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장 포함)이고, Xi는 임의적인 폴리펩티드 링커 (적절한 링커는 예를 들어 서열 번호 54 내지 61 중 임의의 하나를 포함함)이며, Cys는 시스테인 잔기이고, X2는 화학적으로 유도된 스페이서이고, Y는 본원에 기재된 바와 같은 치료 모이어티이다. 예시적인 구체예에서, 화학적으로 유도된 스페이서는 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 마이클 부가에 의해 기재된 FN3 도메인의 C-말단 Cys에 치료 모이어티를 접합시키는데 사용되거나 또는 치료 모이어티의 C-말단 Cys에 기재된 FN3 도메인을 접합시키는데 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 함유한다. 다른 측면에서, 기재된 FN3 도메인은 2 이상의 치료 모이어티에 결합될 수 있다. 예를 들어, 2개의 모이어티는 다음과 같이 융합 서열의 N-말단에서 C-말단으로의 배열과 같은 다양한 배열로 기재된 FN3 도메인에 결합될 수 있다: X-Y-FN3, X-FN3-Y, 또는 FN3-X-Y, 여기서 X 및 Y는 2개의 상이한 치료 모이어티를 나타낸다. 2개의 상이한 치료 모이어티는 본원에 개시된 임의의 모이어티로부터 선택될 수 있다.
결합 폴리펩티드의 탈면역화
혈청 알부민 결합제 및 이의 융합체의 아미노산 서열은 하나 이상의 B- 또는 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 변경될 수 있다. 본원에 기재된 FN3 도메인 융합체를 포함하는 단백질은 탈면역화되어 주어진 종에 비면역원성 또는 적은 면역원성을 부여할 수 있다. 탈면역화는 단백질의 구조적 변경을 통해 이루어질 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈면역화 기술이 사용될 수 있다 (예를 들어, 그의 개시 전체가 본원에 참고로 포함되는 WO 00/34317호 참조).
일 구체예에서, 혈청 알부민 결합체 및 이의 융합체의 서열이 MHC 클래스 II 결합 모티프의 존재에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 월드와이드 웹으로 sitewehil.wehi.edu.au에서 "모티프" 데이터베이스를 검색함으로써, MHC 결합 모티프의 데이터베이스로 비교가 이루어질 수 있다. 대안적으로, MHC 클래스 II 결합 펩티드는 Altuvia 등이 고안한 컴퓨터 쓰레딩 방법 (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995))을 사용하여 동정될 수 있으며, 여기서는 폴리펩티드로부터 연속적으로 겹치는 펩티드가 MHC 클래스 II 단백질에 대한 결합 에너지에 대해 시험된다. 컴퓨터 결합 예측 알고리즘에는 iTopeTM, Tepitope, SYFPEITHI, EpiMatrix (EpiVax), 및 MHCpred가 포함된다. MHC 클래스 II 결합 펩티드의 동정을 돕기 위해, 양친매성 및 로스바드 모티프와 같은 성공적으로 제시된 펩티드에 관한 관련 서열 특징 및 카텝신 B 및 다른 프로세싱 효소에 대한 절단 부위를 검색할 수 있다.
잠재적인 (예를 들어, 인간) T-세포 에피토프가 동정되면, T-세포 에피토프를 제거하기 위해 요구되는 바와 같이, 이들 에피토프는 하나 이상의 아미노산의 변경에 의해 제거된다. 보통, 이것은 T-세포 에피토프 자체 내에서 하나 이상의 아미노산의 변경을 수반할 것이다. 이것은 단백질의 1차 구조 또는 1차 구조에서 인접하지 않고 분자의 2차 구조에서 인접한 것의 측면에서 에피토프에 인접한 아미노산을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 고려된 통상적인 변경은 아미노산 치환일 것이지만, 특정 상황에서는 아미노산 첨가 또는 결실이 적절할 수도 있다. 모든 변경은 재조합 DNA 기술에 의해 달성될 수 있고, 따라서 최종 분자는 재조합 숙주로부터의 발현, 예를 들어 잘 확립된 방법에 의해 제조될 수 있지만, 단백질 화학 또는 임의의 다른 분자 변경 수단의 사용도 또한 이용될 수 있다.
동정된 T 세포 에피토프가 제거되면 탈면역화된 서열을 다시 분석하여 새로운 T 세포 에피토프가 생성되지 않았는지 확인하고, 존재한다면 에피토프(들)를 결실시킬 수 있다.
모든 T 세포 에피토프가 계산상 제거될 필요는 없다. 당업자는 특정 에피토프의 "강도" 또는 다소 잠재적인 면역원성의 중요성을 인식할 것이다. 다양한 계산 방법은 잠재적인 에피토프에 대한 점수를 생성한다. 당업자는 높은 점수의 에피토프만이 제거될 필요가 있음을 인식할 것이다. 당업자는 또한 잠재적인 에피토프의 제거와 단백질의 결합 친화도 또는 다른 생물학적 활성을 유지하는 사이에 균형이 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 하나의 전략은 서술된 FN3 도메인 또는 FN3 도메인 융합 단백질에 치환을 순차적으로 도입한 다음, 표적 결합 또는 다른 생물학적 활성 및 면역원성에 대해 시험하는 것이다.
추가적인 변형
특정 구체예에서, 혈청 알부민 결합제 및 이들의 융합체는 번역 후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 번역 후 단백질 변형은 인산화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글리코실화, 카보닐화, 수모일화, 비오티닐화 또는 폴리펩티드 측쇄 또는 소수성 그룹의 첨가를 포함한다. 그 결과, 변형된 혈청 알부민 결합제 및 이들의 융합체는 지질, 폴리사카라이드 또는 모노사카라이드 및 포스페이트와 같은 비아미노산 요소들을 함유할 수 있다. 글리코실화의 바람직한 형태는 하나 이상의 시알산 모이어티를 폴리펩티드에 접합시키는 시알릴화이다. 시알산 모이어티는 용해도 및 혈청 반감기를 개선시키면서 단백질의 가능한 면역원성을 감소시킨다. 예를 들어, [Raju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31;40(30):8868-76] 참조. 이러한 비아미노산 요소가 혈청 알부민 결합제 또는 이의 융합체의 기능에 미치는 영향은 특정 혈청 알부민 (예: HSA 또는 RhSA)에 결합하기 위한 그의 능력 및/또는 융합과 관련하여 특이적 비-FN3 모이어티에 의해 부여되는 기능적 역할 (예: 글루코스 흡수에 대한 FGF21의 효과)로 시험할 수 있다.
벡터 및 폴리뉴클레오티드 구체예
본원에 기재된 임의의 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 또한 본 개시에 포함된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 3차 염기 축퇴 때문에, 거의 모든 아미노산은 코딩 뉴클레오티드 서열에서 복수의 삼중체 코돈으로 나타낼 수 있다. 또한, 미미한 염기쌍 변화는 코딩된 아미노산 서열에서 보존적 치환으로 이어질 수 있지만, 유전자 산물의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 본원에 기재된 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열에 약간의 변형이 있을 수 있지만 여전히 그의 각 유전자 산물을 코딩한다. 본원에 기술된 혈청 알부민 결합제 및 이의 융합체를 코딩하는 특정의 예시적인 핵산은 서열 번호 69 내지 72에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
본원에 개시된 다양한 단백질 또는 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다. 코돈 사용은 세포에서의 발현을 향상시키도록 선택될 수 있다. 이러한 코돈 사용은 선택된 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 대장균 및 기타 박테리아뿐만 아니라 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포를 위한 특수화된 코돈 사용 패턴이 개발되었다. 예를 들어 [Mayfield et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 100(2):438- 42; Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9; Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38; 및 Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78]을 참조바람.
핵산 조작을 위한 일반적인 기술은 당업자의 권한 내에 있으며, 또한 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, 또는 F. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)] 및 정기적인 업데이트물에 기술되어 있다. 단백질을 코딩하는 DNA는 포유동물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의적 조작 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 통상적으로 복제의 기원에 의해 부여되는 숙주에서의 복제 능력 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 도입된다. 적합한 조절 요소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
본원에 기재된 단백질 및 융합 단백질은 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)된 것이다. 원시 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실린 분해 효소, lpp 또는 열 안정성 장 독소 II 리더의 그룹에서 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비의 경우, 원시 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타아제 리더, 인자 리더 (Saccharomyces 및 Kluyveromyces 알파 인자 리더 포함), 또는 산 포스파타아제 리더, C. albicans 글루코아밀라아제 리더 또는 PCT 공개 번호 WO 90/13646호에 기재된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물의 세포 발현에서, 포유동물의 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다. 그러한 전구체 영역을 위한 DNA는 판독 프레임에서 상기 단백질을 코딩하는 DNA에 결찰될 수 있다.
진핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물 유래 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 다가 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. PCT 공개 번호 WO 94/11026호 및 그 문헌에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
재조합 DNA는 또한 단백질 정제에 유용할 수 있는 임의 유형의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그 또는 GST 태그를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)]에서 찾을 수 있으며, 그의 관련 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 발현 구조물은 숙주 세포에 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 숙주 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며, 전기천공법; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스 트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미립자가속장치 충격; 리포펙션; 및 감염 (벡터가 감염제인 경우)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다. 적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균 또는 바실러스 종 (Bacillus spp.)을 포함한다. 바람직하게는 S. cerevisiae와 같은 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종으로부터의 효모가 또한 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있다. 또한 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수도 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질 생성을 위한 바큘로바이러스 시스템은 [Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)]에 의해 검토되었다. 일부 경우에는, 예컨대 글리코실화를 위해 척추동물 세포에서 단백질을 생성하는 것이 바람직할 것이고, 배양 (조직 배양)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T 및 BHK 세포주를 들 수 있다. 많은 응용을 위해, 본원에 기재된 작은 크기의 단백질 멀티머는 대장균을 발현에 바람직한 방법으로 만들 것이다.
단백질 생성
숙주 세포는 단백질 생성을 위한 본원에서 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변경된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 발명의 단백질을 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, [Ham et al, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem.102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호;　4,657,866호;　4,927,762호;　4,560,655호; 또는　5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제 Re. 30,985호에 기술된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCINTM 약물), (마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의되는) 미량 원소 및 글루코스 또는 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요한 보충물도 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 당업자에게는 명백할 것이다.
본원에 개시된 단백질은 또한 세포 번역 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 시험관 내 전사가 mRNA를 생성하고 이용되는 특정 무세포 시스템에서 mRNA의 무세포 번역을 허용하도록 변형되어야 한다. 예시적인 진핵 무세포 번역 시스템은 예를 들어 포유동물 또는 효모 무 세포 번역 시스템을 포함하고, 예시적인 원핵 무세포 번역 시스템은 예를 들어 박테리아 무세포 번역 시스템을 포함한다.
본원에 개시된 단백질은 또한 화학 합성 (예를 들어, (Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL)에 기재된 방법)에 의해 제조될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학 합성에 의해 생성될 수 있다.
본원에 개시된 단백질은 단백질 화학 분야에서 일반적으로 공지된 단백질에 대한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비제한적인 예로서 추출, 재결정, 염석 (예를 들면 황산암모늄 또는 황산나트륨을 사용), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 역류 분배 또는 이들의 임의 조합을 들 수 있다. 정제 후, 단백질은 여과 및 투석을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 상이한 완충액에서 교환 및/또는 농축될 수 있다.
정제된 단백질은 바람직하게는 적어도 85% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 98% 순수하다. 순도의 정확한 수치 값에 관계없이 단백질은 의약품으로 사용하기에 충분히 순수하다.
이미징 , 진단 및 기타 응용
본원에서 제공된 FN3 도메인 융합체는 기재된 FN3 도메인에 융합된 이종 분자의 정체성에 기초하여 다양한 질병 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. FN3 도메인 융합에 대한 적용은 당 업계의 지식 및 본원에 제공된 정보에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 다양한 FN3 도메인 융합 단백질에 대한 용도가 본원에 상세하게 기재되어 있다. FN3 도메인 융합은 인간 및 비인간 생물을 포함하여 모든 포유동물 대상 또는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 기술된 혈청 알부민 결합제 및 융합 분자는 검출가능하게 표지될 수 있고, 예를 들어 이미징 또는 진단 용도로 융합 분자에 의해 결합된 단백질을 발현하는 세포를 접촉시키는데 사용될 수 있다. [Hunter, et al, Nature 144:945 (1962); David, et al, Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 포함하여, 단백질을 검출 가능한 모이어티에 접합시키는 당 업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합제 및 융합 분자는 추가로 검출될 수 있는 표지 (예를 들어, 표지는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자일 수 있다)에 부착된다. 표지는 방사성 중금속, 예컨대 철 킬레이트, 가돌리늄 또는 망간의 방사성 킬레이트, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출 물질, 43K,　52Fe,　57Co,　67Cu,　67Ga,　68Ga,　123I,　125I,　13　T,　132I, 또는　99Tc 등의 방사성 시약일 수 있다. 이러한 모이어티에 부착된 혈청 알부민 결합제 또는 융합 분자는 이미징제로서 사용될 수 있고, 인간과 같은 포유동물에서의 진단 용도에 효과적인 양으로 투여되며, 이어서 이미징제의 국소화 및 축적이 검출된다. 이미징제의 국소화 및 축적은 라디오신티그라피 (radioscintigraphy), 핵자기 공명 이미징, 컴퓨터 단층 촬영 또는 양전자 방출 단층 촬영에 의해 검출될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 투여될 방사성 동위원소의 양은 방사성 동위원소에 좌우된다. 당 업계에서 통상의 지식을 가진자는 활성 모이어티로서 사용된 주어진 방사핵종의 비활성 및 에너지에 기초하여 투여될 이미징제의 양을 용이하게 공식화할 수 있다.
혈청 알부민 결합제 및 융합 분자는 또한 친화성 정제화제로서 유용하다. 이 공정에서, 단백질은 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 적합한 지지체, 예컨대 세파덱스 (Sephadex) 수지 또는 여과지상에 고정된다. 단백질은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에서 사용될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
치료 제형 및 투여 방식
본 발명은 기재된 FN3 도메인에 융합된 치료 모이어티를 투여하는 방법을 제공하며, 여기서 치료 모이어티의 반감기는 기재된 FN3 도메인에 융합되는 경우 연장된다. 융합 구조물의 투여를 위한 기술 및 용량은 기재된 FN3 도메인에 융합된 치료 모이어티의 유형 및 치료되는 특정 조건에 따라 달라질 것이지만, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 규제 당국은 치료제로 사용되는 단백질 시약을 발열 물질을 허용가능하게 낮은 수준으로 함유하도록 제형화할 것을 요구한다. 따라서, 치료 제형은 일반적으로 실질적으로 발열 물질이 없거나 발열 물질을 적어도 적절한 규제 기관 (예: FDA)에서 결정한 허용가능한 수준 이하로 함유한다는 점에서 다른 제형과 차별된다. 특정 구체예에서, 기재된 FN3 도메인 및 이의 융합 분자의 약학 제형은 예를 들어, pH 4.0 내지 7.0에서 1 내지 20 mM 숙신산, 2 내지 10% 소르비톨 및 1 내지 10% 글리신을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 기재된 FN3 도메인 및 이의 융합 분자의 약학 제형은 예를 들어, pH 6.0에서 10 mM 숙신산, 8% 소르비톨 및 5% 글리신을 포함한다.
일부 구체예에서, 기재된 FN3 도메인 및 이의 융합체는 포유동물, 특히 인간에게 약학적으로 허용가능하다. "약학적으로 허용가능한" 폴리펩티드란 심각한 유해한 의학적 결과 없이 동물에게 투여되는 폴리펩티드를 말한다. 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 FN3 도메인 및 이의 융합체의 예에는 인테그린-결합 도메인 (RGD)이 없는 FN3 도메인 및 본질적으로 내독소가 없거나 내독소 수준이 매우 낮은 조성물이 포함된다.
치료 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 투여는 비제한적인 예로서 비경구 (예를 들어, 정맥 내, 피하), 경구 또는 국소 투여될 수 있다. 조성물은 경구 투여용 알약, 정제, 캡슐, 액체 또는 서방형 정제; 정맥 내, 피하 또는 비경구 투여용 액체; 또는 겔, 로션, 연고, 크림, 또는 국소 투여를 위한 중합체 또는 기타 서방성 비히클의 형태일 수 있다.
당 업계에 잘 알려져 있는 제형의 제조 방법은 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)에서 확인할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 예를 들어 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원 오일 또는 수소화 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜라이드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 사용하여 화합물의 방출을 조절할 수 있다. 화합물의 생체 분포를 제어하기 위해 나노입자 제형 (예를 들어, 생분해성 나노입자, 고체 지질 나노입자, 리포좀)을 사용할 수 있다. 잠재적으로 유용한 기타 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식형 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 제형 중의 화합물의 농도는 투여될 약물의 용량 및 투여 경로를 포함하는 다수의 요인에 따라 달라진다.
폴리펩티드는 임의로 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 무독성 산부가염 또는 금속 착물과 같이 약학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있다. 산부가염의 예로는 아세트산, 락트산, 팜산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 팔미트산, 수베린산, 살리실산, 타르타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산 또는 트리플루오로아세트산 등의 유기산; 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로오스 등의 중합산; 및 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등의 무기산을 들 수 있다. 금속 착물은 아연, 철 등을 포함한다. 일례에서, 폴리펩티드는 열 안정성을 증가시키기 위해 아세트산나트륨의 존재하에 제형화된다. 경구용 제제는 무독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로 활성 성분(들)을 함유하는 정제를 포함한다. 이러한 부형제는 예를 들어, 비활성 희석제 또는 충전제 (예: 수크로오스 및 솔비톨), 윤활제, 활택제 및 항-접착제 (예: 스테아르산마그네슘, 스테아르산아연, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성 오일 또는 활석)일 수 있다.
경구용 제형은 또한 저작가능한 정제 또는 활성 성분이 불활성 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
치료 유효량은 투여에 대해 치료 효과를 산출하는 투여량을 지칭한다. 정확한 투여량은 치료될 질환에 의존할 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, FN3 도메인 융합체는 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 50 mg/kg/일, 바람직하게는 0.01 mg/kg/일 내지 약 30 mg/kg/일, 가장 바람직하게는 0.1 mg/kg/일 내지 약 20 mg/kg/일로 투여된다. 폴리펩티드는 매일 (예를 들어, 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회) 또는 덜 빈번하게 (예를 들어, 1일 간격으로, 매주 1회 또는 2회, 또는 매달) 투여될 수 있다. 또한, 당 업계에 공지된 바와 같이, 연령뿐 아니라 체중, 일반 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질병의 중증도에 따라 조정이 필요할 수 있으며 당업자에 의해 일상적인 실험으로 확인될 수 있다.
인간 혈청 알부민 검출용 키트
생물학적 샘플에서 인간 혈청 알부민을 검출하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 이들 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 혈청 알부민-특이적 FN3 도메인 및 키트의 사용 설명서를 포함한다.
제공된 혈청 알부민-특이적 FN3 도메인은 용액; 동결건조; 기질, 담체 또는 플레이트에 부착된 상태; 또는 검출가능하게 표지된 것일 수 있다.
기술된 키트는 또한 본원에 기술된 방법을 수행하는데 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 대상으로부터 샘플을 얻기 위한 수단, 대조 또는 기준 샘플, 예를 들어 서서히 진행하는 암을 가진 대상 및/또는 암을 가지지 않은 대상으로부터의 샘플, 하나 이상의 샘플 구획, 및/또는 본 발명의 방법 및 조직 특이적 조절 또는 표준의 수행을 기술하는 지침물을 포함할 수 있다.
혈청 알부민의 수준을 결정하는 수단은 예를 들어, 혈청 알부민의 수준 결정을 위한 분석에 사용하기 위한 완충액 또는 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 지침은 예를 들어 분석을 수행하기 위한 인쇄된 지침 및/또는 혈청 알부민의 수준을 평가하기 위한 지침일 수 있다.
기술된 키트는 또한 대상으로부터 샘플을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이들 수단은 대상으로부터 유체 또는 조직을 얻기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 장비 또는 시약 품목을 포함할 수 있다. 대상으로부터 샘플을 얻는 수단은 또한 혈액 샘플로부터 혈청과 같은 혈액 성분을 분리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 인간 대상과 함께 사용하도록 고안된다.
실시예
하기의 실시예는 앞서 개시된 내용을 보완하고 본원에 기술된 주제를 더 잘 이해할 목적으로 제공된다. 이들 실시예는 설명된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시적인 목적을 위한 것으로서, 그에 대한 다양한 수정 또는 변경은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 진정한 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1. 랜덤 루프를 갖는 텐콘 라이브러리의 작제
텐콘 (서열 번호 1)은 인간 테나신-C 유래의 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된 면역 글로불린 유사 스캐폴드, 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인이다 (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; 미국 특허 제8,278,419호). 텐콘의 결정 구조는 7개의 베타 가닥을 연결하는 6개의 표면 노출 루프를 보여준다. 이들 루프 또는 각 루프 내의 선택된 잔기는 특정 표적에 결합하는 새로운 분자를 선택하는데 사용될 수 있는 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위해 랜덤화될 수 있다.
텐콘:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (서열 번호 1):
텐콘 스캐폴드 및 다양한 설계 전략을 사용하여 다양한 라이브러리를 생성하였다. 일반적으로, 라이브러리 TCL1 및 TCL2가 우수한 결합제를 생성하였다. TCL1 및 TCL2 라이브러리의 생성은 국제 특허 공개 제WO2014081944A2호에 상세히 기재되어 있다
TCL1 라이브러리의 작제
시스-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위해 텐콘 (서열 번호 1)의 FG 루프인 TCL1만을 랜덤화하도록 설계된 라이브러리가 작제되었다 (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). 이 시스템에서, Tac 프로모터, 텐콘 라이브러리 코딩 서열, RepA 코딩 서열, 시스-요소 및 ori 요소에 대한 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA가 생성된다. 시험관 내 전사/번역 시스템에서의 발현시, 코딩되는 DNA에 시스 (cis)로 결합된 텐콘-RepA 융합 단백질의 복합체가 생성된다. 표적 분자에 결합하는 복합체는 이후에 기술된 바와 같이 단리되어 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭된다.
시스-디스플레이와 함께 사용하기 위한 TCL1 라이브러리의 작제는 두 부분으로 최종 선형, 이중 가닥 DNA 분자를 생성하기 위해 PCR의 연속적인 수행으로 달성되었다. 5' 단편은 프로모터 및 텐콘 서열을 함유하는 반면, 3' 단편은 repA 유전자 및 시스- 및 ori 요소를 함유한다. 이들 두 부분은 전체 구조물을 생성하기 위해 제한 효소에 의해 결합된다. TCL1 라이브러리는 텐콘의 FG 루프 KGGHRSN (서열 번호 32)에서만 랜덤 아미노산을 도입하도록 설계되었다. NNS 코돈을 이 라이브러리의 작제에 사용함으로써 FG 루프에 20개의 모든 아미노산과 하나의 정지 코돈이 포함 가능하였다. TCL1 라이브러리는 다양성을 더 높이기 위해 각각 7 내지 12 잔기의 상이한 랜덤화 FG 루프 길이를 가지는 6개의 분리된 서브-라이브러리를 포함한다.
TCL1 라이브러리 (서열 번호 2)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고;
X8, X9, X10, X11 및 X12는 임의의 아미노산 또는 결실이다.
TCL2 라이브러리의 작제
텐콘의 BC 루프와 FG 루프가 모두 랜덤화되고 각 위치에서의 아미노산 분포가 엄격하게 통제된 TCL2 라이브러리가 작제되었다. 표 2는 TCL2 라이브러리에서 원하는 루프 위치에서의 아미노산 분포를 보여준다. 설계된 아미노산 분포에는 두 가지 목적이 있다. 첫째, 라이브러리는 텐콘 결정 구조의 분석에 기초하고/하거나 상동성 모델링으로부터 텐콘 폴딩 및 안정성에 구조적으로 중요하다고 예측된 잔기로 편향되었다. 예를 들어, 위치 29는 소수성 아미노산의 부분집합으로만 고정되었는데, 이는 이 잔기가 텐콘 폴드의 소수성 코어에 묻혔기 때문이다. 제2 설계 층은 고친화성 결합제를 효율적으로 생성하기 위해, 아미노산 분포를 항체의 중쇄 HCDR3에서 우선적으로 발견되는 잔기의 것으로 편향시키는 것을 포함한다 (Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). 이 목표를 위해, 표 1에서 "설계된 분포"는 다음과 같은 분포에 관한 것이다: 6% 알라닌, 6% 아르기닌, 3.9% 아스파라긴, 7.5% 아스파르트산, 2.5% 글루탐산, 1.5% 글루타민, 15% 글리신, 2.3% 히스티딘, 2.5% 이소류신, 5% 류신, 1.5% 리신, 2.5% 페닐알라닌, 4% 프롤린, 10% 세린, 4.5% 트레오닌, 4% 트립토판, 17.3% 티로신 및 4% 발린. 이 분포에는 메티오닌, 시스테인 및 정지 코돈이 없다.
TCL2 라이브러리 (서열 번호 3)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
상기에서,
X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고;
X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
잔기 위치* WT 잔기 TCL2 라이브러리에서의 분포
22 T 설계된 분포
23 A 설계된 분포
24 P 50% P + 설계된 분포
25 D 설계된 분포
26 A 20% A + 20% G + 설계된 분포
27 A 설계된 분포
28 F 20% F, 20% I, 20% L, 20% V, 20% Y
29 D 33% D, 33% E, 33% T
75 K 설계된 분포
76 G 설계된 분포
77 G 설계된 분포
78 H 설계된 분포
79 R 설계된 분포
80 S 100% S
81 N 설계된 분포
82 P 50% P + 설계된 분포
* 잔기 번호 매김은 서열 번호 1의 텐콘 서열에 기초한다.
이어, 이들 라이브러리를 BC 및 FG 루프에서 랜덤화된 위치의 변경뿐 아니라 야생형 텐콘과 비교하였을 때 치환 E11R/L17A/N46V/E86I (텐콘27; 서열 번호 4)이 도입된 안정화된 텐콘 프레임워크 (미국 특허 제8,569,227호) 상에 라이브러리의 구축을 비롯해 다양한 방식으로 개선시켰다. 텐콘27은 국제 특허 공개 제WO2013049275호에 기재되어 있다. 이로부터 텐콘의 FG 루프 (라이브러리 TCL9) 또는 BC와 FG 루프의 조합 (라이브러리 TCL7) 만을 랜덤으로 배정하도록 설계된 새로운 라이브러리가 생성되었다. 이들 라이브러리는 시스-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위해 작제되었다 (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004). 이 설계의 세부 사항은 아래와 같다.
안정화된 텐콘 ( 텐콘27 ) (서열 번호 4)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL7 (랜덤 화된 FG 및 BC 루프) (서열 번호 5)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;
X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 또는 결실이다.
TCL9 ( 랜덤화된 FG 루프) (서열 번호 6)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;
X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 또는 결실이다.
라이브러리의 작제를 위해, Slonomics 기술 (Sloning Biotechnology GmbH)을 사용하여 라이브러리의 아미노산 분포를 제어하고 정지 코돈을 제거하여 랜덤화된 BC 루프 (길이 6-9 위치) 또는 FG 루프 (길이 7-12 위치)를 코딩하는 DNA 단편을 합성하였다. BC 루프 또는 FG 루프 중 하나를 랜덤화한 2개의 상이한 DNA 분자 세트를 독립적으로 합성하고 나중에 PCR에 의해 결합시켜 전체 라이브러리 산물을 생성하였다.
FG 루프 라이브러리 ( TCL9 )의 작제
FG 루프에서 랜덤화된 코돈을 제외하고 텐콘의 완전한 유전자 서열이 이어지는 5' Tac 프로모터로 구성된 합성 DNA 분자 집합이 생성되었다 (서열 번호 26 내지 31). FG 루프 랜덤화를 위해, 시스테인과 메티오닌을 제외한 모든 아미노산이 동등한 비율로 코딩되었다. 다양화된 부분의 길이는 FG 루프에서 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 아미노산을 코딩하는 정도이다. 각 길이 변이체의 서브-라이브러리를 2 ug의 규모로 개별적으로 합성한 다음, 올리고 Sloning-FOR (서열 번호 9) 및 Sloning-Rev (서열 번호 10)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
라이브러리의 3' 단편은 PspOMI 제한 부위, repA 유전자의 코딩 영역 및 시스- 및 ori 요소를 포함하는, 디스플레이용 요소를 함유하는 불변 DNA 서열이다. M13 Forward 및 M13 Reverse 프라이머와 함께 주형으로 플라스미드 (pCR4Blunt) (Invitrogen)를 사용하여 PCR 반응으로 상기 단편을 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 밤새 PspOMI로 소화시키고 겔-정제하였다. 라이브러리 DNA의 5' 부분을 repA 유전자를 포함하는 3' DNA에 결찰시키기 위해, 2 pmol (약 540 ng 내지 560 ng)의 5' DNA를 NotI 및 PspOMI 효소 및 T4 리가제의 존재하에 37 ℃에서 밤새 동일 몰 (약 1.25 μg)의 3' repA DNA에 결찰시켰다. 결찰된 라이브러리 산물을 oligos POP2250 (서열 번호 11) 및 DigLigRev (서열 번호 12)와 12 사이클의 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 각 서브-라이브러리에 대해 12 PCR 반응으로 얻은 DNA를 조합하여 Qiagen 스핀 컬럼으로 정제하였다. TCL9의 각 서브-라이브러리의 수율은 32-34 μg 범위였다.
FG/BC 루프 라이브러리 ( TCL7 )의 작제
TCL7 라이브러리는 랜덤화된 텐콘 BC 및 FG 루프가 있는 라이브러리를 제공한다. 이 라이브러리에서는, 길이 6-9 아미노산의 BC 루프가 7-12 아미노산 길이의 랜덤화 FG 루프와 조합으로 혼합되었다. BC 루프가 6, 7, 8 또는 9개의 랜덤화 아미노산으로 대체될 수 있게 잔기 VX까지로 단백질의 N 말단 부분을 코딩하는 텐콘 유전자를 포함하도록 합성 텐콘 단편 BC6, BC7, BC8 및 BC9 (서열 번호 13-16)를 생성하였다. 이들 단편은 L17A, N46V 및 E83I 돌연변이 (CEN5243)의 발견 이전에 합성되었지만, 이들 돌연변이는 후술하는 분자 생물학적 단계에서 도입되었다. 이 단편과 랜덤화 FG 루프를 코딩하는 단편을 결합하기 위해 다음 단계가 수행되었다.
우선, oligos POP2222ext (서열 번호 18) 및 LS1114 (서열 번호 19)를 사용하여 PCR에 의해 아미노산 A17 (130mer-L17A, 서열 번호 17)을 코딩하는 뉴클레오까지의 텐콘의 5' 서열 및 Tac 프로모터를 코딩하는 DNA 단편을 제조하였다. 이것은 라이브러리에 L17A 돌연변이를 포함시키기 위해 수행되었다 (CEN5243). 다음으로, 주형으로 BC6, BC7, BC8 또는 BC9 및 oligos LS1115 (서열 번호 20) 및 LS1117 (서열 번호 21)을 사용하여 PCR에 의해 랜덤화된 BC 루프를 포함하는 텐콘 잔기 R18-V75를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 PCR 단계는 3' 말단에 BsaI 부위를 도입하였다. 이어 이들 DNA 단편을 oligos POP2222ext 및 LS1117을 프라이머로 사용하여 중첩 PCR에 의해 결합시켰다. 생성된 240bp의 PCR 산물을 풀링하고 Qiagen PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제된 DNA를 BsaI-HF로 소화시키고 겔 정제하였다.
BsaI 제한 효소 부위 및 N46V 및 E86I 변이체 (CEN5243)를 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드 SDG10 (서열 번호 22) 및 SDG24 (서열 번호 23)와 주형으로 FG7 (서열 번호 31), FG8 (서열 번호 30), FG9 (서열 번호 29), FG10 (서열 번호 28), FG11 (서열 번호 27), 및 FG12 (서열 번호 26)를 사용하여 PCR에 의해 FG 루프를 코딩하는 단편을 증폭시켰다.
소화된 BC 단편과 FG 단편을 3-way 결찰을 사용하여 단일 단계에서 함께 결찰시켰다. 16가지 가능한 조합에서 4가지 결찰 반응이 설정되었는데, 각각의 결찰 반응은 2개의 BC 루프 길이와 2개의 FG 루프 길이를 결합시킨다. 각 결찰은 약 300 ng의 총 BC 단편과 300 ng의 FG 단편을 함유하고 있다. 이어 이들 4개의 결찰 풀을 oligos POP2222 (서열 번호 24) 및 SDG28 (서열 번호 25)을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 7.5 μg의 각 반응 산물을 Not1으로 소화시키고, Qiagen PCR 정제 컬럼으로 정제하였다. 이 DNA 5.2 μg을 PspOMI로 소화시킨 동 몰량의 RepA DNA 단편 (약 14 μg)에 결찰시키고, 산물을 oligos POP2222를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
실시예 2: 대체 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 생성
특정 라이브러리 설계에서 랜덤화될 잔기의 선택이 생성된 상호작용 표면의 전체 모양을 좌우한다. BC, DE 및 FG 루프가 랜덤화된 라이브러리로부터 말토오스 결합 단백질 (MBP)의 결합을 위해 선택된 스캐폴드 단백질 함유 FN3 도메인의 X-선 결정학적 분석 결과 MBP의 활성 부위에 맞는 크게 만곡진 인터페이스를 가지는 것으로 나타났다 (Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104: 6632-6637, 2007). 대조적으로, MBP의 결합을 위해 선택된 안키린 반복 스캐폴드 단백질은 훨씬 더 평탄한 상호작용 표면을 가지며 활성으로부터 떨어진 MBP의 외부 표면에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Binz et al., Nat Biotechnol 22: 575-582, 2004). 이러한 결과는 스캐폴드 분자의 결합 표면의 형태 (만곡 대 평탄)가 어떤 표적 단백질 또는 그 표적 단백질상의 특정 에피토프가 스캐폴드에 의해 효과적으로 결합될 수 있는지 좌우할 수 있음을 시사한다. 단백질 결합을 위한 FN3 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드 조작을 중심으로 공표된 노력은 표적 결합을 위한 인접 루프 조작, 이에 따라 만곡진 결합 표면의 생성에 의존한다. 이러한 접근은 그러한 스캐폴드에 의해 접근 가능한 표적 및 에피토프의 수를 제한할 수 있다.
텐콘 및 다른 FN3 도메인은 분자의 반대면에 놓인 두 세트의 CDR 유사 루프를 포함하는데, 상기 두 세트는 BC, DE 및 FG 루프에 의해 형성된 첫 번째 세트와 AB, CD 및 EF 루프에 의해 형성된 두 번째 세트로 이루어진다. 두 세트의 루프는 FN3 구조의 중심으로부터 베타-가닥에 의해 분리된다. 텐콘의 이미지를 90도 회전하면 대체 표면을 시각화할 수 있다. 이 약간 오목한 표면은 CD 및 FG 루프와 2개의 역평행 베타-가닥인 C 및 F 베타 가닥에 의해 형성되며, 본원에서는 C-CD-F-FG 표면으로 지칭된다. C-CD-F-FG 표면은, 표면을 형성하는 잔기의 부분 집합을 랜덤화하여 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 베타-가닥은 단백질의 표면에 노출된 모든 나머지 잔기의 측쇄를 가진 반복 구조를 갖는다. 따라서, 라이브러리는 베타 가닥의 일부 또는 모든 표면 노출된 잔기를 랜덤화하여 만들 수 있다. 베타-가닥에서 적절한 잔기를 선택하는 것으로, 다른 단백질과의 상호작용에 독특한 스캐폴드 표면을 제공하면서도 텐콘 스캐폴드의 고유한 안정성은 최소한으로 손상된다.
라이브러리 TCL14 (서열 번호 7)는 텐콘27 스캐 폴드 (서열 번호 4)로 설계되었다.
이 라이브러리를 작제하기 위해 사용된 방법의 전체 설명은 미국 특허 공개 US2013/0226834호에 설명되어 있다.
TCL14 라이브러리 (서열 번호: 7):
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10 GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 또는 M이다.
텐콘27에서 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 두개의 베타 가닥은 랜덤화될 수 있는 총 9개의 표면 노출된 잔사; C-가닥: S30, L32, Q34, Q36; F-가닥: E66, T68, S70, Y72, 및 V74를 가지고 있는데 반해, CD 루프는 6개의 잠재적 잔기 S38, E39, K40, V41, G42, 및 E43을 갖고, FG 루프는 7개의 잠재적 잔기 K75, G76, G77, H78, R79, S80, 및 N81을 가진다. 모든 22개의 잔기가 랜덤화된 경우, 라이브러리의 이론적 크기가 더 크기 때문에 선택 잔기는 TCL14 설계에 포함되도록 선택되었다.
텐콘에서 13개의 위치가 다음과 같이 랜덤화로 선택되었다: C-가닥에서 L32, Q34 및 Q36, CD-루프에서 S38, E39, K40 및 V41, F-가닥에서 T68, S70 및 Y7, FG-루프에서 H78, R79, 및 N81. C 및 F 가닥에서 S30 및 E66은 CD 및 FG 루프 바로 뒤에 놓여 있고 C-CD-F-FG 표면의 일부처럼 보이지 않으므로 랜덤화되지 않았다. CD 루프의 경우 G42와 E43은 글리신으로 랜덤화되지 않아 유연성을 제공하고, 루프 영역에서 유용할 수 있으며, E43은 표면 접합부에 놓인다. FG 루프에는 K75, G76, G77 및 S80이 제외되었다. 결정 구조의 신중한 검사 결과 글리신은 S80을 코어와 주요 접촉시켜 안정한 FG 루프의 형성을 돕는 것으로 밝혀졌지만 상기 이유로 제외되었다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면에서 방향이 빗겨있어 랜덤화에 덜 매력적인 후보였다. 위에서 언급한 잔기들은 원래의 TCL14 설계에서 랜덤화되지 않았지만, 데노보 선택을 위해, 또는 예를 들어 선택된 TCL14 표적 특이적 히트에 대한 친화성 성숙에 추가적인 다양성을 제공하기 위해 후속 라이브러리 설계에 포함될 수 있다.
TCL14의 생성에 이어, 유사 설계의 3개 추가의 텐콘 라이브러리가 생성되었다. 이들 두 라이브러리 TCL19, TCL21 및 TCL23은 TCL14와 동일한 위치에서 랜덤화되지만 (위 참조), 이 위치에서 발생하는 아미노산의 분포가 변경된다 (표 3). TCL19 및 TCL21은 시스테인과 메티오닌만 제외하고 모든 위치에서 동등한 분포의 18개의 천연 아미노산 (각각 5.55%)을 포함하도록 설계되었다. TCL23은 각 랜덤화 위치가 표 2에 설명된 바와 같이 기능성 항체의 HCDR3 루프에서 발견되는 아미노산 분포와 비슷하도록 설계되었다 (Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008). TCL21 라이브러리와 마찬가지로 시스테인과 메티오닌은 제외되었다.
다른 라이브러리에서 라이브러리의 잠재적인 표적 결합 표면을 확장하기 위해 세 번째 추가 라이브러리를 작제하였다. 이 라이브러리, TCL24에서는 라이브러리 TCL14, TCL19, TCL21과 비교하여 4개의 추가 텐콘 위치가 랜덤화되었다. 이들 위치는 D 가닥으로부터의 N46 및 T48 및 G 가닥으로부터의 S84 및 I86을 포함한다. 특히, 잔기의 측쇄가 β-가닥 D 및 G로부터 표면 노출되고 C 및 F 가닥의 랜덤화된 부분에 구조적으로 인접하여 위치하여 있고 따라서 표적 단백질에 결합이 가능한 표면적을 증가시키기 때문에, 위치 46, 48, 84 및 86이 선택되었다. TCL24에 대해 각 위치에서 사용된 아미노산 분포는 표 2에서 TCL19 및 TCL21에 대해 기술된 것과 동일하다.
TCL24 라이브러리 (서열 번호 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W이다.
TCL21, TCL23 및 TCL24에 대한 각 랜덤화 위치에서의 아미노산 빈도 (%).
아미노산 TCL19 TCL21 TCL23 TCL24
Ala 5.6 5.6 6.0 5.6
Arg 5.6 5.6 6.0 5.6
Asn 5.6 5.6 3.9 5.6
Asp 5.6 5.6 7.5 5.6
Cys 0.0 0.0 0.0 0.0
Gln 5.6 5.6 1.5 5.6
Glu 5.6 5.6 2.5 5.6
Gly 5.6 5.6 15.0 5.6
His 5.6 5.6 2.3 5.6
Ile 5.6 5.6 2.5 5.6
Leu 5.6 5.6 5.0 5.6
Lys 5.6 5.6 1.5 5.6
Met 0.0 0.0 0.0 0.0
Phe 5.6 5.6 2.5 5.6
Pro 5.6 5.6 4.0 5.6
Ser 5.6 5.6 10.0 5.6
Thr 5.6 5.6 4.5 5.6
Trp 5.6 5.6 4.0 5.6
Tyr 5.6 5.6 17.3 5.6
Val 5.6 5.6 4.0 5.6
TCL21 , TCL23 및 TCL24 라이브러리의 생성
아미노산 분포를 조절하기 위해 Colibra 라이브러리 기술 (Isogenica)을 사용하여 TCL21 라이브러리를 생성하였다. 아미노산 분포를 조절하기 위해 Slonomics 기술 (Morphosys)을 사용하여 TCL19, TCL23 및 TCL24 유전자 단편을 생성하였다. 초기 합성 후 PCR을 사용하여 각 라이브러리를 증폭시킨 후, 루프 라이브러리에 대해 위에서 설명한 바와 같이 CIS 디스플레이 시스템 (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004)을 사용하여 선별에서의 사용을 위해 RepA 유전자에 결찰시켰다.
실시예 3: 인간 혈청 알부민과 결합하는 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인의 선별
라이브러리 스크리닝
TCL14, TCL19, TCL21, TCL23, 및 TCL24 라이브러리로부터 인간 혈청 알부민 결합 도메인을 선택하기 위해 시스 디스플레이를 사용하였다. 혈청으로부터 정제된 인간 및 토끼 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 표준 방법을 사용하여 비오티닐화하고 패닝에 사용하였다. 시험관 내 전사 및 번역 (ITT)을 위해 3 μg의 라이브러리 DNA를 0.1 mM의 완전 아미노산, 1X S30 프리믹스 성분 및 15 μL의 S30 추출물 (Promega)과 함께 총 50 μL의 부피로 인큐베이션하고 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 375 μL의 블로킹 용액 ((0.1% 카제인 (Thermo Fisher, Rockford, IL), 100 mg/ml Herring Sperm DNA (Promega, Madison, WI), 1 mg/ml 헤파린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))을 첨가하고 반응물을 얼음상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 선택을 위해, 비오티닐화 항원을 400 nM (라운드 1), 200 nM (라운드 2 및 3) 및 100 nM (라운드 4 및 5)의 농도로 첨가하였다. 뉴트라비딘 자석 구슬 (Thermo Fisher, Rockford, IL) (라운드 1, 3, 5) 또는 스트렙타비딘 자석 구슬 (Promega, Madison, WI) (라운드 2 및 4)을 사용하여 결합된 라이브러리 구성원을 회수하고, 비드를 500 μL PBST로 5-14회 세척한 후 500 μL PBS로 2회 세척하여 비결합 라이브러리 구성원을 제거하였다. 친화성이 향상된 스캐폴드 분자를 확인하기 위해 추가적인 선택 라운드를 수행하였다. 요약하면, 라운드 5로부터의 산출물을 상술된 바와 같이 제조하고, 다음의 변경과 함께 추가적인 선택 반복 라운드를 수행하였다: 비오티닐화된 항원과의 인큐베이션은 1시간에서 15분으로 감소, 비드 포획은 20분에서 15분으로 감소, bt-HSA는 25 nM (라운드 6 및 7) 또는 2.5 nM (라운드 8 및 9)로 감소, 과량의 비-비오티닐화 표적 단백질의 존재하에 추가로 1시간의 세척 수행. 이렇게 변경시키는 목적은 잠재적으로 더 빠른 온-레이트 (on-rate)와 더 느린 오프-레이트 (off-rate)를 갖는 결합제를 동시에 선택하여 실질적으로 더 낮은 KD를 산출하는 것이었다.
패닝 후, 선택된 FN3 도메인을 oligos Tcon6 (서열 번호 33) 및 Tcon5shortE86I (서열 번호 34)을 사용하여 PCR로 증폭시키고, pET15-LIC로 어닐링하여 서브클로닝한 후, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 대장균에서의 가용성 발현을 위해 BL21-GOLD (DE3) 세포 (Agilent, Santa Clara, CA)로 형질전환시켰다. 단일 클론을 취하고 96 딥웰 플레이트에서 37 ℃에서 암피실린이 첨가된 1 mL LB에서 포화될 때까지 성장시켰다. 다음날, 25 uL을 96개의 딥웰 플레이트 중의 새로운 LB-Amp 배지 1 mL로 옮기고 37 ℃에서 2시간 동안 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고 단백질 발현을 30 ℃에서 16시간 동안 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 0.2 mg/mL 최종 닭 난백 리소자임 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 보충한 Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)로 용해시켰다. 박테리아 용해물을 원심분리에 의해 정화시킨 뒤, 상등액을 새로운 96 딥웰 플레이트로 옮기고 ELISA에 의해 표적 단백질에 대한 결합에 대해 시험하였다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 FN3 도메인의 선택
인간 혈청 알부민 결합제를 확인하기 위해 선택된 패닝 산출물로부터의 개별 클론에 대해 ELISA (효소결합면역흡착측정법)를 수행하였다. Maxisorp 플레이트 (Nunc, Rochester, NY)를 5 ug HSA, rabSA 또는 5 ug/ml 오브알부민 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 코팅하고, 0.05% Tween-20 (TBST)이 함유된 Tris-완충 염수, pH 7.4로 세척한 후, 출발 블록 T20 (Thermo Fisher, Rockford, IL)을 사용하여 차단하였다. 정화된 박테리아 용해물 (상기 기재)을 코팅된 HSA, rabSA 및 오브알부민 플레이트의 웰에 적용하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, TBST로 세척한 후, Molecular Devices M5 플레이트 판독기를 사용하여 pAb25-HRP (Janssen R & D, Springhouse PA) 및 POD 화학발광 기질 (Roche, Indianapolis, IN)로 결합된 센티린을 검출하였다. 히트는 > 10의 오브알부민의 결합 신호에 대한 인간 혈청 알부민의 결합 신호로서 정의된다.
클론을 상술된 ELISA 분석에서 상이한 인간 혈청 알부민 도메인 구조물에 대한 결합 및 다양한 종으로부터의 알부민에 대한 교차-반응에 대해 추가로 특정화하였다: 알부민 도메인 I (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), 도메인 II (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), 도메인 III (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), 도메인 I-II (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), 붉은털원숭이 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 마우스 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 도메인 I, II 및 III은 1 ug/ml, 도메인 I-II는 2 ug/ml의 농도로, 전장 붉은털원숭이 및 마우스 알부민은 3 ug/ml의 농도로 코팅되었고, 인간 혈청 알부민이 3 ug/ml의 농도로 양성 결합 대조군으로 제공되었다. 선택된 FN3 도메인의 알부민 결합 도메인 특이성을 표 4에 나타내었다. 표 5는 선택된 FN3 도메인의 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
선택된 FN3 도메인의 알부민 결합 도메인 특이성
클론 ID 알부민 결합 도메인 특이성
ALB-E05 III
ALB-E07 I
ALB-H9 III
선택된 FN3 도메인의 아미노산 서열
클론 ID 서열 번호: 서열
ALB-E05 51 LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFQIEYWEDDVGGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYDVYILGVKGGWESGPLSAIFTT
ALB-E07 52 LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFKILYEEYLVFGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVAIWGVKGGQVSGTLSAIFTT
ALB-H9 53 LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFHIEYWEQSIVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYRVWIYGVKGGNDSWPLSAIFTT
소규모 발현 및 정제로 인간 혈청 알부민에 결합하는 FN3 도메인 규명
선택된 FN3 도메인 클론을 취하고 96 딥웰 플레이트에서 37 ℃에서 100 ug/mL 암피실린 (LB-Amp media)이 첨가된 1 mL LB (Luria Broth)에서 포화될 때까지 성장시켰다. 다음날, 25 uL을 24개의 딥웰 플레이트 중의 새로운 LB-Amp 배지 5 mL로 옮기고 37 ℃에서 2시간 동안 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고 단백질 발현을 30 ℃에서 16시간 동안 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 0.2 mg/mL 최종 닭 난백 리소자임 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 보충한 Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)로 용해시켰다. 박테리아 용해물을 원심분리에 의해 정화시킨 뒤, 상등액을 새로운 96 딥웰 플레이트로 옮겼다. His-태깅된 FN3 도메인을 제조업자의 권고 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ)에 따라 96 웰 Ni-NTA 멀티트랩 플레이트를 사용하여 정제하였다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 인간 혈청 알부민에 결합하는 FN3 도메인의 응집 상태를 결정하였다. 정제된 각 FN3 도메인의 분취량 (10 μL)을 PBS pH 7.4의 이동상에서 0.3 mL/분의 유속으로 Superdex 75 5/150 컬럼 (GE Healthcare)에 주입하였다. 칼럼으로부터의 용출을 280 nm에서의 흡광도로 모니터하였다. SEC에 의해 높은 수준의 응집을 나타내는 FN3 도메인은 추후 분석에서 제외시켰다.
실시예 4: 인간 혈청 알부민 결합 FN3 도메인의 특성 규명
인간 혈청 알부민-FN3 도메인 복합체의 면역침전
결합제의 기능을 평가하기 위해, 선택된 FN3 도메인을 정상 혈청에서 내인성 알부민과 복합체로 되는 능력에 대해 시험하였다. 선택된 FN3 도메인이 또 다른 FN3 도메인의 아미노 또는 카복시 말단에 부착될 때 알부민 결합이 보존되는 것을 확보하기 위해, 2가 FN3 유전자를 ALB18, ALB 30, ALB 21, ALB33, ALB34 및 ALB35 구조물을 생성하도록 준비하였다 (표 6).
알부민 결합 보존을 위해 시험된 2가 구조물
클론 ID FN3 도메인 1 링커 FN3 도메인 2
ALB18 Tc25 (G4S)4 (서열 번호: 71) ALB-E05
ALB30 ALB-E05 (G4S)4 (서열 번호: 71) Tc25
ALB21 ALB-E07 (G4S)4 (서열 번호: 71) Tc25
ALB33 Tc25 (G4S)4 (서열 번호: 71) ALB-E07
ALB34 Tc25 (G4S)4 (서열 번호: 71) ALB-H9
ALB35 ALB-H9 (G4S)4 (서열 번호: 71) Tc25
C-말단 His6-태그 (서열 번호 72) 2가 FN3 도메인 (칼슘 또는 마그네슘 없이 1X DPBS 중 0.25-2.0 mg/mL)을 1:1 부피비로 정상 혈청과 혼합하고, 혈청 내 내인성 알부민에 결합을 허용하도록 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. His6-태그된 (서열 번호 72) FN3 도메인-알부민 복합체를 500 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris, pH 7.0으로 사전평형화시킨 5 μL 수지 베드 (Rainin Instrument LLC (Oakland, Oakland) 제의 PureSpeedTM Protein Tip IMAC)를 함유하는 200+ PhyTip 컬럼을 사용하여 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)를 통해 혈청으로부터 회수하였다. 수지를 평형 완충액으로 철저히 세척하여 결합되지 않은 혈청 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질을 용리 완충액 (500 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸, pH 7.5를 함유하는 50 mM Tris, pH 7.0) 25-100 μL로 용출시켰다. 용출액을 SDS-PAGE로 알부민을 공침전에 대해 분석하였다. SDS-PAGE 겔을 콜로이드성 쿠마시로 염색하였다. 알부민 결합 FN3 도메인을 함유하는 레인은 혈청 알부민 + FN3 도메인의 분자량과 일치하는 강한 밴드를 가졌다. 대조적으로, 알부민은 IMAC 정제를 통해 혈청으로부터 혈청 알부민에 대한 친화력이 없는 FN3 도메인인 텐콘25 (서열 번호 73)가 추출되었을 때 복합체를 형성하지 않았다 (도 2 참조).
사이노몰거스 원숭이에서 알부민 결합 FN3 도메인의 약물동태학 :
ALB18 및 ALB33으로 생체 내 연구를 수행하였다. 시험 물질은 2.0 mg/mL로 시험 시설에 공급되었고 -70±10 ℃에서 보관되었다. FN3 도메인은 투약 24시간 전에 실온에서 해동되고 2-8 ℃에서 보관되었다. 투약 당일 시험 물질을 실온으로 가온시켰다. 투약 시점에 2.0 내지 4.0 kg 범위에 있는 9 마리의 처치 받은 적이 없는 암컷 사이노몰거스 원숭이를 3 그룹으로 나누었다. FN3 도메인은 1일에 2 mg/kg으로 정맥 내 (IV) 볼루스 주사 (전체 투여 부피를 기준으로 1 내지 3분의 목표 시간)에 의해 투여되었다. 전달된 각 용량의 부피 (mL)는 투약 1 내지 2일 전에 기록된 개별 동물의 체중을 기준으로 하였다. 투여 전 1일, 투여 후 10분, 6시간 및 24시간에 말초 혈관으로부터 약 1 mL의 전혈을 수집하였다. 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14 및 21일에 거의 같은 시간대에 추가 샘플을 수집하였다. 모든 혈액 샘플을 항응고제가 없는 혈청 분리기 튜브에 수집하였다. 혈액 샘플을 30분 동안 응고시킨 다음 냉장 원심분리기에서 15분간 원심분리하였다. 약 1mL의 혈청을 2개의 Eppendorf 튜브 (각각 0.5 mL)에 옮기고 스폰서에 선적될 때까지 -65 ℃에서 보관하였다.
H9를 다음과 같이 평가하였다. 2.2-4.4 kg 범위의 3 마리의 처치 받은 적이 없는 수컷 사이노몰거스 원숭이에게 1 mg/kg H9 (PBS에서 제조된 0.5 mg/mL)를 2 mL/kg IV 볼루스 주입으로 투여하였다. 혈액 샘플 (약 1 mL)을 요골측 피부정맥 또는 대퇴정맥으로부터 항응고제 없이 BD Vacutainer® SSTTM 3.5 mL 튜브 (Cat. No. 367957)에 수집하였다. 샘플을 다음 시점에 취하였다: 투여 전 (t=0), 및 투여 후 10분, 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 (4일), 168시간 (8일), 240시간 (11일), 336시간 (33일) 15) 및 504시간 (22일). 각 시점의 혈액 샘플을 실온에서 30분 내지 60분 동안 응고시킨 후 실온에서 15분간 원심분리하였다. 약 0.5 mL의 혈청을 미리 라벨을 붙여놓은 폴리프로필렌 마이크로 튜브로 옮기고 즉시 70 ℃ 이하에서 보관하기 전에 드라이아이스 위에 두었다. 혈청 샘플은 드라이아이스에서 수송되었다.
혈청 샘플에 존재하는 FN3 도메인의 농도를 결정하기 위해, 알부민 결합 FN3 도메인 H9, ALB18 및 ALB33에 대한 표준 곡선을 300 ng/ml에서 만들고, 11pt 곡선을 위해 분석 완충액 (Super Block T20 (TBS) 블로킹 완충액 (Thermo Scientific) 중의 10% 처치 받은 적이 없는 사이노몰거스 원숭이 대조 혈청 (Bioreclamation))에서 3-배 연속 희석하였다. 모든 연구 혈청 샘플을 실온에서 해동시키고 분석 완충액에서 1:10 희석액으로 준비한 후 분석 완충액에서 5배 희석액을 사용하여 추가로 연속 희석시켰다. Super Block에서 0.625 μg/ml로 준비된 비오티닐화 포획 및 루테늄 표지된 검출 항체 (폴리클로날 항-FN3 도메인 항체 pab139, Janssen Pharmaceuticals)를 사용하여 포획 및 검출을 위한 균질 마스터 믹스를 생성하였다. 마스터 믹스 40 μL 및 희석 샘플 10 μL, 표준 또는 대조군을 96-웰 스트렙타비딘 골드 플레이트 (Mesoscale Discovery)에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 광 보호하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL TBS-T, 0.05% Tween-20 (Sigma)을 사용하여 세척하고 건조 블롯팅하였다 (blotted dry). 계면활성제 (Mesoscale Discovery)가 첨가된 판독 완충액 T의 1X 용액을 증류수에서 제조하였다. 판독 완충액을 분석 플레이트에 150 μL/웰로 첨가하고 전기화학발광을 QuickPlex SQ 120 판독기 (Mesoscale Discovery)를 사용하여 측정하였다.
GraphPad Prism에서 X 및 Y 축을 X = log(X) 및 Y = log(Y)로 변환하여 표준 곡선을 생성하였다. S 자형 용량 반응 (가변 기울기)을 사용하여 비선형 회귀 (곡선 적합)를 수행하였다; 미지의 것은 표준 곡선으로부터 내삽하였다. 초기 변형을 보정하기 위해 평균 내삽 결과를 X = 10^X 및 Y = 10^Y를 사용하여 변환시켰다. 표준 곡선의 선형 부분을 눈어림으로 결정하였다. 내삽된 모든 농도를 분석에 사용된 희석 배율에 대해 보정하였다. 최종 농도는 모든 희석에 대한 유효 결과를 평균하고 ng/ml에서 nM으로 전환시켜 결정하였다.
PK 분석에 Excel용 PKSolver 부속 프로그램 (Zhang, Y. et al. (2010) Comput. Methods Programs Biomed., 99 306-314)을 사용하였다. 비구획 분석을 각 동물에 대해 수행하였다. 각 구조물에 대해 3 마리의 동물에 대한 반감기 및 클리어런스를 평균하여 최종 결과를 결정하였다. 알부민 결합 FN3 도메인에 대한 약물동태 데이터는 도 2 및 표 7에 나타내었다. 알부민 도메인 3 결합제인 H9 및 ALB18은 유사한 노출 프로파일과 종말 반감기 값 (33-47시간)을 보였다. 알부민 도메인 1 결합제 ALB33은 중간 노출 및 약 26시간의 종말 반감기를 나타내었다.
Figure pct00001
서열 정보
서열 번호 1 = 원 (Original) 텐콘 서열
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
서열 번호 2 = TCL1 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7-12PLSAEFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고;
X8, X9, X10, X11 및 X12은 임의의 아미노산 또는 결실이다.
서열 번호 3 = TCL2 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
상기에서,
X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고;
X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
서열 번호 4 = 안정화 텐콘 (텐콘 27)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
서열 번호 5 = TCL7 (FG 및 BC 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;
X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 또는 결실이다.
서열 번호 6 = TCL9 (FG 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;
X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 또는 결실이다.
서열 번호 7 = TCL14 라이브러리
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 또는 M이다.
서열 번호 8 = TCL24 라이브러리
TCL24 라이브러리 (서열 번호 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
상기에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. DIEM, MICHAEL JACOBS, STEVEN O'NEIL, KARYN RUTKOSKI, THOMAS <120> SERUM ALBUMIN-BINDING FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS <130> JBI5089WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2017-06-01 <150> 62/345,190 <151> 2016-06-03 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (76)..(80) <223> Any amino acid or deleted <400> 2 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 3 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(27) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Phe, Ile, Leu, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Asp, Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(79) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(82) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <400> 3 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Xaa Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(27) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(30) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or deleted <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(84) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(87) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or deleted <400> 5 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 85 90 95 Thr <210> 6 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or deleted <400> 6 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 95 <210> 7 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(40) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <400> 7 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 8 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(40) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> Any amino acid <400> 8 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu Xaa 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Phe Thr Thr 85 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 gtgacacggc ggttagaac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gcctttggga agcttctaag 20 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 catgattacg ccaagctcag aa 22 <210> 13 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(224) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 13 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttygac tctttcctga 240 tccagtacca ggaatctgaa aaagttggtg aagcgatcaa cctgaccgtt ccgggttctg 300 aacgttctta cgacctgacc ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg 360 gtgttcttag aagcttccca aaggc 385 <210> 14 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(221) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 14 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttygactct ttcctgatcc 240 agtaccagga atctgaaaaa gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac 300 gttcttacga cctgaccggt ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg 360 ttcttagaag cttcccaaag gc 382 <210> 15 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(218) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 15 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ygactctttc ctgatccagt 240 accaggaatc tgaaaaagtt ggtgaagcga tcaacctgac cgttccgggt tctgaacgtt 300 cttacgacct gaccggtctg aaaccgggta ccgaatacac cgtttctatc tacggtgttc 360 ttagaagctt cccaaaggc 379 <210> 16 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(215) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnttyga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatca acctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttctta 360 gaagcttccc aaaggc 376 <210> 17 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cggcggttag aacgcggcta caattaatac ataaccccat ccccctgttg acaattaatc 60 atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacaggat 120 ctaccatgct g 131 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 ccaagacaga cgggcagagt cttcggtaac gcgagaaaca accaggtttt tcggcgccgg 60 cagcatggta gatcctgttt c 81 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccgaagactc tgcccgtctg tcttgg 26 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 cagtggtctc acggattcct ggtactggat caggaaagag tcgaa 45 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 catgcggtct cttccgaaaa agttggtgaa gcgatcgtcc tgaccgttcc gggt 54 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ggtggtgaag atcgcagaca gcgggttag 29 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cggcggttag aacgcggcta c 21 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 aagatcagtt gcggccgcta gactagaacc gctgccaccg ccggtggtga agatcgcaga 60 c 61 <210> 26 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(392) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 26 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntctaaccc gctgtctgcg atcttcacca 420 ccggcggtca ccatcaccat caccatggca gcggttctag tctagcggcc gcaactgatc 480 ttggc 485 <210> 27 <211> 482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(389) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 27 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt ctaacccgct gtctgcgatc ttcaccaccg 420 gcggtcacca tcaccatcac catggcagcg gttctagtct agcggccgca actgatcttg 480 gc 482 <210> 28 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(386) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 28 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntcta acccgctgtc tgcgatcttc accaccggcg 420 gtcaccatca ccatcaccat ggcagcggtt ctagtctagc ggccgcaact gatcttggc 479 <210> 29 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(383) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 29 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntctaacc cgctgtctgc gatcttcacc accggcggtc 420 accatcacca tcaccatggc agcggttcta gtctagcggc cgcaactgat cttggc 476 <210> 30 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(380) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 30 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tctaacccgc tgtctgcgat cttcaccacc ggcggtcacc 420 atcaccatca ccatggcagc ggttctagtc tagcggccgc aactgatctt ggc 473 <210> 31 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(377) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 31 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnntct aacccgctgt ctgcgatctt caccaccggc ggtcaccatc 420 accatcacca tggcagcggt tctagtctag cggccgcaac tgatcttggc 470 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Lys Gly Gly His Arg Ser Asn 1 5 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 aagaaggaga accggtatgc tgccggcgcc gaaaaac 37 <210> 34 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 gagccgccgc caccggttta atggtgatgg tgatggtgac caccggtggt gaagatcgca 60 gacag 65 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Ser Phe Gln Ile Glu Tyr Trp Glu 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ser Phe Lys Ile Leu Tyr Glu Glu 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ser Phe His Ile Glu Tyr Trp Glu 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ser Glu Lys Val Gly Glu 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Asp Asp Val Gly Gly Glu 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Tyr Leu Val Phe Gly Glu 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gln Ser Ile Val Gly Glu 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Glu Tyr Asp Val Tyr Ile Leu Gly Val Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Glu Tyr Trp Val Ala Ile Trp Gly Val Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Glu Tyr Arg Val Trp Ile Tyr Gly Val Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Gly His Arg Ser Asn Pro 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gly Gly Trp Glu 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<400> 52 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Lys 20 25 30 Ile Leu Tyr Glu Glu Tyr Leu Val Phe Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Ala Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Gln Val Ser 65 70 75 80 Gly Thr Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 53 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe His 20 25 30 Ile Glu Tyr Trp Glu Gln Ser Ile Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Arg Val Trp Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Asn Asp Ser 65 70 75 80 Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ala Pro Ala Pro 1 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro 20 <210> 60 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 35 40 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 20 25 <210> 62 <211> 608 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His 20 25 30 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile 35 40 45 Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 65 70 75 80 Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys 85 90 95 Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 100 105 110 Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His 115 120 125 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 130 135 140 Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys 180 185 190 Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 195 200 205 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 210 215 220 Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 225 230 235 240 Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys 245 250 255 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp 260 265 270 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 275 280 285 Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys 290 295 300 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu 305 310 315 320 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys 325 330 335 Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 340 345 350 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu 355 360 365 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe 385 390 395 400 Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu 405 410 415 Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 420 425 430 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 450 455 460 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 465 470 475 480 Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 485 490 495 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510 Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 515 520 525 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 530 535 540 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro 545 550 555 560 Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala 565 570 575 Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala 580 585 590 Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 595 600 605 <210> 63 <211> 607 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 63 Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Val Ala His 20 25 30 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu Val 35 40 45 Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Glu His Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 65 70 75 80 Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys 85 90 95 Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 100 105 110 Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His 115 120 125 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 130 135 140 Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Ala Thr Phe Leu Lys Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Phe Phe Ala Ala Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Ala Glu Cys Cys 180 185 190 Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 195 200 205 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 210 215 220 Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 225 230 235 240 Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys 245 250 255 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp 260 265 270 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met Cys 275 280 285 Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys 290 295 300 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Leu Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu 305 310 315 320 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Tyr Val Glu Ser Lys 325 330 335 Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 340 345 350 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Met Leu 355 360 365 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe 385 390 395 400 Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu 405 410 415 Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 420 425 430 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ala Lys Cys Cys Lys Leu Pro 450 455 460 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 465 470 475 480 Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val 485 490 495 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510 Ala Leu Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asn Ala Glu 515 520 525 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Met Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Lys 530 535 540 Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro 545 550 555 560 Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Gly Val Met Asp Asn Phe Ala Ala 565 570 575 Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala 580 585 590 Glu Glu Gly Pro Lys Phe Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala 595 600 605 <210> 64 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 ttgccggccc cgaagaacct ggtcgtgagc cgtgttaccg aggacagcgc gcgtctgagc 60 tggaccgcac cggacgcggc gtttgattcg tttcagattg agtattggga agatgacgtg 120 ggtggtgagg ctatcgtgct gaccgtcccg ggtagcgagc gcagctacga tctgacgggt 180 ctgaaaccgg gtaccgagta cgacgtgtac attttgggtg ttaaaggtgg ctgggagagc 240 ggtccgctgt cagcaatctt tacgacg 267 <210> 65 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 ctgccggccc cgaagaacct ggtcgtgagc cgtgttaccg aggacagcgc gcgtctgagc 60 tggaccgcac cggacgcggc gtttgattcg tttaagattc tgtatgaaga atacctggtg 120 ttcggtgagg ctatcgtgct gaccgtcccg ggtagcgagc gcagctacga tctgacgggt 180 ctgaaaccgg gtaccgagta ctgggtggcg atttggggtg ttaaaggtgg ccaggtgagc 240 ggcaccctga gcgcaatctt tacgacg 267 <210> 66 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 atgttgccgg ccccgaagaa cctggtcgtg agccgtgtta ccgaggacag cgcgcgtctg 60 agctggaccg caccggacgc ggcgtttgat tcgtttcaca ttgagtattg ggaacagagc 120 atcgtgggtg aggctatcgt gctgaccgtc ccgggtagcg agcgcagcta cgatctgacg 180 ggtctgaaac cgggtaccga gtaccgcgtg tggatttacg gtgttaaagg tggcaatgac 240 agctggccgc tgtcagcaat ctttacgacg 270 <210> 67 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 68 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu 35 40 45 Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 69 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Leu Asp Ala Pro Thr Asp Leu Gln Val Thr Asn Val Thr Asp Thr Ser 1 5 10 15 Ile Thr Val Ser Trp Thr Pro Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Pro Gly Glu Pro Lys Glu Leu Thr 35 40 45 Val Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Thr Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly 50 55 60 Val Glu Tyr Val Val Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Gln Glu Ser 65 70 75 80 Pro Pro Leu Val Gly Thr Gln Thr Thr 85 <210> 70 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 72 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 72 His His His His His His 1 5

Claims (16)

  1. FN3 도메인이 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 III에 특이적으로 결합하고, FN3 도메인의 혈청 반감기가 서열 번호 67의 아미노산 서열을 갖는 텐콘25 단백질의 혈청 반감기보다 적어도 10배 더 큰, 단리된 피브로넥틴 III 형 (FN3) 도메인.
  2. 제1항에 있어서, FN3 도메인이 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민과 교차 반응하는, 단리된 FN3 도메인.
  3. 제1항에 있어서,
    a. FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 텐콘27 아미노산 서열, 임의로 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 및/또는 86에 치환을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열에 기초하거나; 또는
    b. FN3 도메인은 서열 번호 2, 3, 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된 것인,
    단리된 FN3 도메인.
  4. 제1항에 있어서, FN3 도메인이 서열 번호 1의 텐콘 아미노산 서열에 대해 C-가닥, CD-루프, F-가닥 및/또는 FG-루프에 변형된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 FN3 도메인.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, FN3 도메인이 서열 번호 51의 아미노산 서열과 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 55의 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 치환을 가지는, 단리된 FN3 도메인.
  6. 제4항에 있어서, FN3 도메인이 서열 번호 51 내지 53으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 FN3 도메인.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, FN3 도메인의 혈청 반감기가 서열 번호 67의 텐콘25 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 혈청 반감기보다 적어도 10배 더 큰, 단리된 FN3 도메인.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, FN3 도메인의 혈청 반감기가 사이노몰거스 원숭이에서 적어도 약 25시간인, 단리된 FN3 도메인.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 FN3 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  12. 제11항의 단리된 숙주 세포를 FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고, 상기 FN3 도메인을 정제하는 것을 포함하는 FN3 도메인의 생성 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 FN3 도메인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  14. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 FN3 도메인과 접촉시키고, FN3 도메인에 대한 생물학적 샘플의 결합을 평가하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 인간 혈청 알부민의 존재를 검출하는 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 FN3 도메인을 포함하는 키트.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 FN3 도메인을 포함하는 제1 FN3 도메인 및 인간 혈청 이외의 표적 단백질에 결합하는 제2 FN3 도메인을 포함하는 단리된 이중 특이성 FN3 분자.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USD1021702S1 (en) * 2021-10-20 2024-04-09 GM Global Technology Operations LLC Vehicle center grille

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014334627B2 (en) 2013-10-14 2019-07-25 Janssen Biotech, Inc. Cysteine engineered fibronectin type III domain binding molecules
UA126021C2 (uk) * 2016-06-03 2022-08-03 Янссен Байотек, Інк. Домен фібронектину типу ііі, що зв'язується із сироватковим альбуміном
EP3471750A4 (en) * 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES
US10597438B2 (en) 2016-12-14 2020-03-24 Janssen Biotech, Inc. PD-L1 binding fibronectin type III domains
CA3046963A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
CN110724198B (zh) * 2018-07-17 2023-05-26 上海一宸医药科技有限公司 长效纤连蛋白iii型结构域融合蛋白
CN114786682A (zh) * 2019-10-14 2022-07-22 Aro生物疗法公司 结合cd71的纤维粘连蛋白iii型结构域
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013049275A1 (en) * 2011-09-27 2013-04-04 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces
WO2015143199A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Serum albumin-binding fibronectin type iii domains

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) * 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) * 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) * 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
ES2118066T3 (es) 1989-10-05 1998-09-16 Optein Inc Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos.
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DK1024191T3 (da) * 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
AU5670194A (en) * 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
AU776910B2 (en) * 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6472147B1 (en) 1999-05-25 2002-10-29 The Scripps Research Institute Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries
US20050287153A1 (en) * 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
ATE337403T1 (de) 1999-12-24 2006-09-15 Genentech Inc Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
US20130226834A1 (en) 2000-04-27 2013-08-29 Networth Services, Inc. Systems and methods for determining the financial status of bonds
JP4602614B2 (ja) 2001-09-26 2010-12-22 アイシン精機株式会社 自動車用ドア
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
DE60335000D1 (de) * 2002-09-06 2010-12-30 Isogenica Ltd In vitro peptid-expressionsbank
US20110118144A1 (en) * 2007-12-19 2011-05-19 Linus Hyun Engineered phage vectors for the design and the generation of a human non-antibody peptide or protein phage library via fusion to pix of m13 phage
CN101970730A (zh) * 2007-12-19 2011-02-09 森托科尔奥索生物科技公司 通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法
CA2741834C (en) * 2008-10-31 2022-04-05 Centocor Ortho Biotech Inc. Fibronectin type iii domain based scaffold compositions, methods and uses
EP2396011B1 (en) * 2009-02-12 2016-04-13 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii domain based scaffold compositions, methods and uses
AU2011245225B2 (en) * 2010-04-30 2015-09-17 Janssen Biotech, Inc. Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
TW201138808A (en) * 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
ES2573108T3 (es) * 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
US9695228B2 (en) * 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
KR20160097294A (ko) * 2013-12-09 2016-08-17 뉴욕 유니버시티 항-포도상구균 제제의 식세포 전달을 위한 조성물 및 방법
US10781246B2 (en) * 2015-06-05 2020-09-22 New York University Compositions and methods for anti-staphylococcal biologic agents
UA126021C2 (uk) * 2016-06-03 2022-08-03 Янссен Байотек, Інк. Домен фібронектину типу ііі, що зв'язується із сироватковим альбуміном
EP3471750A4 (en) * 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013049275A1 (en) * 2011-09-27 2013-04-04 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces
WO2015143199A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Serum albumin-binding fibronectin type iii domains

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USD1021702S1 (en) * 2021-10-20 2024-04-09 GM Global Technology Operations LLC Vehicle center grille

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