KR102663243B1 - 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102663243B1
KR102663243B1 KR1020210115020A KR20210115020A KR102663243B1 KR 102663243 B1 KR102663243 B1 KR 102663243B1 KR 1020210115020 A KR1020210115020 A KR 1020210115020A KR 20210115020 A KR20210115020 A KR 20210115020A KR 102663243 B1 KR102663243 B1 KR 102663243B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
trypsin
fluorescent probe
arginine
lysine
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020210115020A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20230032320A (ko
Inventor
장동조
모레 꾸날
Original Assignee
국립순천대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립순천대학교산학협력단 filed Critical 국립순천대학교산학협력단
Priority to KR1020210115020A priority Critical patent/KR102663243B1/ko
Publication of KR20230032320A publication Critical patent/KR20230032320A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102663243B1 publication Critical patent/KR102663243B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 트립신의 활성에 반응하여 형광 발광을 조절할 수 있는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물, 이를 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물, 이를 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법, 및 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서에 관한 것이다.
본 발명에 따른 트립신 특이적 형광 프로브를 이용함에 따라 트립신과 같은 효소를 이용하여 정제되는 펩타이드 약물의 부생성물 생성을 감소킬 수 있으므로, 펩타이드 약물을 효과적이며 경제적으로 높은 수율로 생산할 수 있다. 또한, 상기 트립신 특이적 형광 프로브를 이용하여 아미노산 특이적 차단제를 개발할 수 있고, 이를 이용하여 효과적으로 펩타이드 약물을 생산 및 정제할 수 있다.

Description

트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도{TRYPSIN SPECIFIC FLUORESCENT PROBE AND USES THEREOF}
본 발명은 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 트립신의 활성에 반응하여 형광 발광을 조절할 수 있는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물, 이를 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물, 이를 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법, 및 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서에 관한 것이다.
인슐린 글라진(Lantus®, Sanofi)은 당뇨병에 사용하는 약물로서, 짧은 작용시간을 보이는 인슐린의 단점을 보완하여 오랜 시간 약효가 유지되는 지속형 인슐린 유도체이다. 인슐린 글라진은 인슐린 A-사슬의 Gly21을 Asn21로 치환하고 B-사슬 말단에 2개의 Arg(Arg31-Arg32)을 도입하여, 약효를 오래 유지할 수 있도록 설계되었다.
인슐린 글라진을 포함하는 유전자 재조합 인슐린 유도체들은 E. Coli 또는 효모(yeast)와 같은 균을 이용한 배양 및 발효를 통해 고리 구조의 프로인슐린 형태로 얻어지며, 트립신(trypsin)과 같은 단백질 가수분해 효소를 사용하여 정제하여 생산된다. 트립신을 사용한 프로인슐린의 정제 과정은 다양한 시퀀스를 갖는 부생성물들과 인슐린 글라진의 혼합물로 얻어지게 되며, B-사슬 말단에 한 개의 Arg을 갖는 부생성물(Arg31-Glargine)이 글라진 보다 더 많은 주생성물로 만들어진다.
글라진의 생산 및 정제에 사용되는 트립신 효소는 프롤린을 제외한 라이신과 아르기닌과 같이 양으로 하전된 아미노산 잔기의 C-말단 펩타이드 결합을 가수분해하는 세린 프로테아제이다.
많은 펩타이드-기반 약물들은 인슐린 글라진과 같은 방법으로 정제되며, 이러한 트립신과 같은 효소를 이용한 정제 방법은 부생성물과의 혼합물을 생성하는 단점을 보이며 약물의 생산 단가를 높이는 요인이다. 이에, 펩타이드 의약품을 포함한 생물의약품을 효과적이며 경제적으로 생산할 수 있는 기술 개발이 요구된다.
또한, 인슐린 글라진과 같은 펩타이드 약물의 정제 과정에서 발생하는 부생성물 펩타이드를 생성하지 않고, 높은 수율로 약물을 생산하기 위해서는 아르기닌 또는 라이신을 선택적으로 차단하여 트립신이 단백질 또는 펩타이드의 원하는 부위만을 인식하여 절단할 수 있는 기술이 필요하다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 활성-기반 형광 프로브를 이용하여 아미노산-특이적 차단제를 개발하고, 이를 이용하여 효과적으로 펩타이드 약물을 생산 및 정제할 수 있는 고부가가치 기술을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 단백질 활성에 반응하여 형광 발광을 조절할 수 있는 활성-기반 형광 프로브 및 이를 이용한 특정 아미노산-특이적 차단제를 개발하였다. 구체적으로는, 트립신이 인식할 수 있는 아르기닌 또는 라이신이 도입된 트립신-특이적 형광 프로브 및 이를 이용하여 아르기닌 또는 라이신의 측쇄에 있는 염기를 차단하여 트립신의 인식을 억제하는 다양한 차단제를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 특허공개 제10-2017-0036643호(2017.04.03.공개) 대한민국 특허공개 제10-2017-0026284호(2017.03.08.공개)
본 발명의 하나의 목적은 트립신 특이적 형광 프로브 화합물 및 이를 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시험관 내(in vitro)에서 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 라이신 또는 아르기닌의 선택적 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
식 중,
R은 또는 이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 라이신 또는 아르기닌의 선택적 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서를 제공한다.
본 발명에 따른 트립신 특이적 형광 프로브를 이용함에 따라 트립신과 같은 효소를 이용하여 정제되는 펩타이드 약물, 예컨대 인슐린 글라진의 부생성물 생성을 감소킬 수 있으므로, 펩타이드 약물을 효과적이며 경제적으로 높은 수율로 생산할 수 있다.
또한, 상기 트립신 특이적 형광 프로브를 이용하여 아미노산 특이적 차단제, 구체적으로 아르기닌 또는 라이신 특이적 차단제를 개발할 수 있고, 이를 이용하여 효과적으로 펩타이드 약물을 생산 및 정제할 수 있다.
도 1은 트립신에 의한 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 형광 프로브의 효소적 절단 개념을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 트립신 농도 의존적 처리(0.025, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10, 25 ㎍/mL) 조건 하에서 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 형광 프로브인 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)의 부위 특이적 절단 후 형광 강도를 나타낸 도이다. 여기서, (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac)는 라이신 특이적 형광 프로브(LysFB)이고, (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)는 아르기닌 특이적 형광 프로브(ArgFB)이다.
도 3은 트립신 농도 의존적 처리(0.25, 0.45, 0.65, 0.85, and 1 μg/ mL) 조건 하에서 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 형광 프로브인 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)의 부위 특이적 절단 후 형광 강도를 나타낸 도이다. 여기서, (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac)는 라이신 특이적 형광 프로브(LysFB)이고, (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)는 아르기닌 특이적 형광 프로브(ArgFB)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 형광 프로브를 사용한 아미노산 차단 및 차단제의 억제 활성 평가 개념을 개략적으로 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) 트립신에 의한 펩타이드 형광 프로브의 부위-특이적 절단 후 형광 강도 변화; 및 (B) 트립신에 의한 펩타이드 형광 프로브의 절단에 대한 아미노산 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 아세트산 무수물(acetic anhydride)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 아세트산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 벤조산 무수물(benzoic anhydride)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 벤조산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 디에틸 피로카보네이트의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 p-톨루엔 설폰산 무수물(p-toluenesulfonic anhydried)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 p-톨루엔 설폰산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 말레산 무수물(maleic anhydride)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 말레산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 시트라콘산 무수물(citraconic anhydride)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 시트라콘산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 프탈산 무수물(phtalic anhydride)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 프탈산 무수물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 페닐 글리옥살(phenyl glyoxal)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 페닐 글리옥살의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 4-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살(4-(trifluoromethyl)phenyl glyoxal)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 4-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 2-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살(2-(trifluoromethyl)phenyl glyoxal)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 2-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 4-니트로 페닐 글리옥살(4-nitro phenyl glyoxal)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 4-니트로 페닐 글리옥살의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 4-메톡시 페닐 글리옥살(4-methoxy phenyl glyoxal)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 4-메톡시 페닐 글리옥살의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 6-메톡시-2-나프틸 글리옥살 수화물(6-methoxy-2-naphthylglyoxal hydrate)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 6-메톡시-2-나프틸 글리옥살 수화물의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 벤즈알데히드(benzaldehyde)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 벤즈알데히드의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 1,2 사이클로헥사디온(1,2 cyclohexadione)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 1,2 사이클로헥사디온의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 2,3-부타디온(2,3-butanedione)의 아미노산 차단 활성 정도를 나타낸 도이다. 구 체적으로, 트립신 존재 하에서 펩타이드 형광 프로브로서 (A) Rh-Lys-Gly-Leu (Ac) 및 (B) Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)를 각각 사용하여 2,3-부타디온의 라이신 및 아르기닌 차단 활성 정도를 확인한 도이다.
도 21은 트립신에 의한 본 발명의 일 실시예에 따른 14-mer 펩타이드 표준물질(Leu-Leu-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Arg-Lys-Ala-Glu-Asp-Leu-Leu-NH2; LLTPETRRKAEDLL-NH2)의 펩타이드 부위 1(아르기닌 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
도 22는 트립신에 의한 본 발명의 일 실시예에 따른 14-mer 펩타이드 표준물질의 펩타이드 부위 2(아르기닌 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
도 23은 트립신에 의한 본 발명의 일 실시예에 따른 14-mer 펩타이드 표준물질의 펩타이드 부위 3(라이신 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 14-mer 펩타이드 표준물질의 RP-HPLC-MS(reversed-phase-high-performance liquid chromatograpy-mass spectrometry) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 14-mer 펩타이드 표준물질을 트립신으로 분해한 후 얻은 분획물(fraction)의 RP-HPLC-MS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 시트라콘산 무수물로 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 표준물질의 펩타이드 부위 1(아르기닌 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 시트라콘산 무수물로 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 표준물질의 펩타이드 부위 2(아르기닌 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 시트라콘산 무수물로 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 표준물질의 분해 후 얻어진 분획물의 RP-HPLC-MS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 페닐 글리옥살로 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 표준물질의 펩타이드 부위 3(라이신 부위)에서의 절단에 대한 분해 패턴을 개념적으로 나타낸 도이다.
본 발명은 트립신-특이적 형광 프로브 및 이를 사용하여 펩타이드 또는 단백질 내의 아르기닌 및 라이신 같은 특정 아미노산을 선택적으로 차단하는 트립신-활성 조절이 가능한 아미노산-특이적 차단제(amino acid-specific masking agnets) 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 트립신의 활성에 반응하여 형광 발광을 조절할 수 있는 트립신-특이적 형광 프로브 및 이를 이용하여 개발된 아르기닌 및 라이신에 대한 차단 효과를 나타내는 신규한 아미노산 차단제에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
식 중,
R은 또는 이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트립신(trypsin)"은 단백질을 구성하는 아미노산인 아르기닌(arginine) 혹은 라이신(lysine)의 C-말단(c-term)을 특이적으로 가수분해하기 때문에, 단백질체 분석에 필요한 펩타이드를 얻기 위한 필수 효소이다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 프로브 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시될 수 있다:
[화학식 2]
[화학식 3]
.
또한, 상기 형광 프로브 화합물은 트립신과 반응하여 형광 켜짐 현상을 나타내는 것을 특징으로 한다. 상기 형광 프로브 화합물은 트립신에 의한 아르기닌 또는 라이신의 절단 활성에 의해 형광 강도가 증가되는 특징을 지닌다(도 1 및 4 참조).
또한, 상기 형광 프로브 화합물은 특정 아미노산, 구체적으로 아르기닌 또는 라이신의 차단에 의해 트립신과의 반응을 일으키지 않으며, 이에 따라 형광이 형성되지 않는 특징을 지닌다(도 1 및 4 참조).
본 발명에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 형광 프로브 화합물은 라이신을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 상기 화학식 3으로 표시되는 형광 프로브 화합물은 아르기닌을 특이적으로 검출할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 형광 프로브 화합물은 화학식 1으로 표시되는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물로, 트립신에 의해 형광 프로브 화합물의 C-말단에 위치한 아르기닌 또는 라이신 부위가 절단됨에 따라 형광 강도가 증가되는 특징을 지닌다. 이에 따라, 형광 강도의 증가 여부에 따라 대상 시료 내 라이신 또는 아르기닌의 존재 여부 및 함유 정도를 확인할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 라이신 또는 아르기닌의 선택적 검출 방법을 제공한다.
상기 형광 프로브 화합물 및 그 특징은 전술한 바와 같다.
상기 형광 프로브 화합물과 트립신의 반응에 의한 형광 세기를 측정함에 의해 라이신 또는 아르기닌을 선택적으로 검출할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법을 제공한다.
상기 형광 프로브 화합물 및 그 특징은 전술한 바와 같다.
상기 형광 프로브 화합물과 후보 아미노산 차단제를 혼합하여 특정 아미노산의 차단에 의해 트립신과의 반응을 일으키지 않음을 확인, 즉 형광이 형성되지 않음을 확인함으로써 아미노산 차단제를 스크리닝할 수 있다.
상기 특정 아미노산은 이에 제한되지는 않으나, 라이신 또는 아르기닌일 수 있다.
상기 아미노산 차단제로는 이에 제한되지는 않으나, 라이신 특이적 억제제 및 아르기닌 특이적 억제제일 수 있다.
상기 라이신 특이적 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 무수물 억제제 또는 고리형 무수물 억제제일 수 있다.
상기 무수물 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 아세트산 무수물, 벤조산 무수물, 디에틸 피로카보네이트 또는 p-톨루엔 설폰산 무수물일 수 있다.
상기 고리형 무수물 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 말레산 무수물, 시트라콘산 무수물 또는 프탈산 무수물일 수 있다.
상기 아르기닌 특이적 억제제는 이에 제한되지는 않으나, α,β-케톤 알데히드 억제제, 모노알데히드 억제제 또는 α,β-디케톤 억제제일 수 있다.
상기 α,β-케톤 알데히드 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 페닐 글리옥살, 4-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살, 2-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살, 4-니트로 페닐 글리옥살, 6-메톡시-2-나프틸 글리옥살 또는 4-메톡시 페닐 글리옥살일 수 있다.
상기 모노알데히드 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 벤즈알데히드일 수 있다.
상기 α,β-디케톤 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 1,2 사이클로헥사디온 또는 2,3-부타디온일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서를 제공한다.
상기 형광 프로브 화합물 및 그 특징은 전술한 바와 같다.
트립신 농도 의존적 처리 조건하에서 상기 형광 프로브 화합물, 즉 라이신-검출용 형광 프로브 및 아르기닌-검출용 형광 프로브의 부위 특이적 절단 후 형광 강도 측정이 가능하므로, 부산물(by products) 생성을 감소시키고 주생성물 생성 효율 증가를 목적으로 하는 단백질 또는 펩타이드 의약품 제조 분야에 폭넓게 적용 가능할 수 있다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
I. 트립신-특이적 형광 프로브의 제조
트립신-특이적 형광 프로브, 구체적으로 라이신-반응성 형광 프로브(Lysine-responsive fluorescent probe; LysFB) 및 아르기닌-반응성 형광 프로브(Arginine-responsive fluorescent probe; ArgFB)는 하기 일반 절차 A 내지 C에 따라 수행되었다.
[합성 절차]
1. 일반 절차 A: 아미드 커플링
CH2Cl2 중의 아닐린 또는 아민 (1.0 당량) 및 AA (1.2당량) 용액에 DIC (1.2당량) 및 HOBt (1.2 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온 (rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 용매를 증발시키고 생성된 고체를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물을 수득하였다.
2. 일반 절차 B: Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl) 탈보호
Fmoc 보호화된 화합물 (1.0당량) 용액에 무수 CH3CN 중의 피페리딘 (1.2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 용매를 증발시켰다. 생성된 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물을 수득하였다.
3. 일반 절차 C: 산 불안정기 탈보호 (Boc/Pbf)
Boc/Pbf 보호된 화합물 (1.0 당량) 용액에 무수 CH2Cl2 중의 TFA (용매 중 10%)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 1N NaOH를 사용하여 반응 혼합물을 염기성화시켰다. 화합물을 유기 용매 혼합물 (DCM:MeOH = 90:10)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 생성된 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물을 수득하였다.
실시예 1. 라이신-검출용 형광 프로브[Rh-Lys-Gly-Leu (Ac)]의 합성
[반응식 1]
상기 [반응식 1]에 나타난 화합물들의 합성 과정을 하기에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1-1. 화합물 1의 합성
(9 H -플루오렌-9-일)메틸 tert -부틸((5 R )-6-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디일)디카르바메이트(1)
클로로포름 (8 mL) 중의 메톡시로돌 (100 mg, 0.29 mmol) 및 Fmoc-Lys(Boc)-OH (163 mg, 0.35 mmol) 용액에 EEDQ (86 mg, 0.35 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온 (rt) 에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용매를 증발시키고, 생성된 고체를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 1을 82% 수율 (190 mg)로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.87 (s, 1H), 8.01 (dd, J = 6.6, 1.1 Hz, 1H), 7.75-7.71 (m, 3H), 7.65-7.59 (m, 2H), 7.57-7.51 (m, 2H), 7.37-7.33 (m, 2H), 7.29-7.23 (m, 3H), 7.08 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.66-6.63 (m, 2H), 6.57 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.38 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 4.31 (s, 1H), 4.17 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.13-3.02 (m, 2H), 1.94 (s, 1H), 1.83 (s, 2H), 1.71 (s, 1H), 1.56-1.44 (m, 1H), 1.40 (s, 9H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 172.4, 169.2, 161.6, 156.6, 156.1, 153.1, 152.3, 151.4, 144.4, 144.3, 141.6, 141.3, 136.3, 130.8, 129.5, 129.0, 128.2, 127.6, 126.3, 125.9, 125.3, 124.5, 120.6, 115.9, 113.8, 112.7, 111.3, 106.8, 101.4, 82.6, 77.9, 66.2, 56.2, 56.1, 55.4, 47.2, 31.9, 29.8, 28.8, 23.5; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C47H46N3O9 [M+H]+: 796.3234, Found: 796.3229.
실시예 1-2. 화합물 2의 합성
Tert -부틸(5-아미노-6-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(2)
화합물 2 (174 mg)는 일반 절차 B에 따라 무수 CH3CN 중의 피페리딘 (32 mg, 0.38 mmol)을 사용하여 화합물 1 (250 mg, 0.31 mmol)로부터 Fmoc의 탈보호를 통해 96% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.74 (s, 1H), 8.00 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 5.7, 1.6 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.06 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.54 (s, 1H), 3.10 (s , 2H), 1.94 (s, 1H), 1.65-1.56 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.41 (s, 9H); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 169.6, 161.5, 156.3, 153.3, 152.5, 151.9, 139.8, 135.1, 129.8, 129.0, 128.6, 126.7, 125.1, 124.0, 115.3, 114.5, 111.8, 111.0, 107.5, 100.9, 83.0, 79.3, 55.7, 55.2, 53.5, 40.0, 29.8, 28.5, 22.6; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C32H36N3O7 [M+H]+: 574.2553, Found: 574.2546.
실시예 1-3. 화합물 3의 합성
(9 H -플루오렌-9-일)메틸(2-(((2 R )-6-(( tert -부톡시카르보닐)아미노)-1-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트(3)
화합물 3 (130 mg)은 일반 절차 A에 따라 Fmoc-Gly-OH (62.14 mg, 0.21 mmol), DIC (28.78 mg, 0.23 mmol) 및 HOBT (30.80 mg, 0.23 mmol)를 사용하여 화합물 2 (109 mg, 0.19 mmol)의 아미드 커플링을 통해 80% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.26 (s, 1H), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.85-7.81 (m, 3H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.53 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 7.36 (td, J = 7.3, 4.1 Hz, 2H), 7.27 (td, J = 7.4, 2.7 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.19-7.13 (m, 1H), 6.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.71-6.63 (m, 4H), 4.35 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 4.25-4.16 (m, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.65 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.84 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 1.67-1.64 (m, 1H), 1.57-1.55 (m, 1H), 1.33 (s, 2H), 1.29-1.19 (m, 11H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 171.8, 169.7, 169.2, 161.6, 157.1, 156.1, 153.1, 152.3, 151.4, 144.4, 141.5, 141.2, 136.3, 130.8, 129.5, 129.0, 128.1, 127.6, 126.3, 125.8, 125.3, 124.5, 120.6, 116.0, 113.9, 112.6, 111.3, 106.9, 101.4, 82.6, 77.8, 66.3, 56.2, 54.0, 47.2, 43.8, 32.3, 29.8, 28.8, 23.2; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C49H49N4O10 [M+H]+: 853.3449, Found: 853.3448.
실시예 1-4. 화합물 4의 합성
Tert -부틸((5 R )-5-(2-아미노아세트아미도)-6-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(4)
화합물 4는 일반 절차 B에 따라 무수 CH3CN (726 μL) 중의 피페리딘 (3.59 mg, 0.042 mol)을 사용하여 Fmoc의 탈보호를 통해 화합물 3 (30 mg, 0.035 mmol)으로부터 합성되었다. 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4 (21 mg)를 95% 수율로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.37 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 16.2, 2.1 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.8, 2.7 Hz, 1H), 7.16 (ddd, J = 13.7, 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.72-6.63 (m, 4H), 4.40 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.12 (s, 2H), 2.84 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 1.71-1.64 (m, 1H), 1.62-1.51 (m, 1H), 1.30 (s, 12H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 173.2, 171.8, 169.2, 161.7, 156.1, 153.1, 152.3, 151.4, 141.5, 136.3, 130.8, 129.5, 129.0, 126.3, 125.3, 124.5, 116.0, 113.9, 112.7, 111.3, 106.9, 101.4, 82.6, 77.8, 63.3, 56.2, 55.4, 53.6, 44.9, 32.7, 29.8, 28.8, 23.1; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C34H39N4O8 [M+H]+: 631.2768, Found: 631.2768.
실시예 1-5. 화합물 5의 합성
Tert -부틸((5 R )-5-(2-(( R )-2-아세트아미도-4-메틸펜탄아미도)아세트아미도)-6-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(5)
화합물 5 (20 mg)는 일반 절차 A에 따라 Ac-Leu-OH (6.34 mg, 0.037 mmol), DIC (5.04 mg, 0.04 mmol) 및 HOBT (5.40 mg, 0.04 mmol)를 사용하여 화합물 4 (21 mg, 0.033 mmol)의 아미드 커플링을 통해 76% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.18 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.28 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.84 (dd, J = 17.2, 2.1 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.93 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.74-6.63 (m, 4H), 4.29 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.67 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.84 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 9.1 Hz, 3H), 1.66-1.51 (m, 3H), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.34-1.30 (m, 12H), 0.81 (dd, J = 17.2, 6.2 Hz, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 173.5, 173.4, 171.7, 170.1, 169.5, 169.2, 161.6, 156.1, 153.1, 152.3, 151.3, 141.5, 136.3, 130.8, 129.5, 129.0, 126.3, 125.3, 124.5, 116.0, 113.9, 112.6, 111.3, 106.9, 101.4, 82.6, 77.8, 56.2, 55.4, 54.1, 51.9, 42.6, 32.0, 29.8, 28.8, 24.7, 23.5, 23.3, 23.0, 22.1; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C42H52N5O10 [M+H]+: 786.3714, Found: 786.3710.
실시예 1-6. 화합물 6의 합성
(2 R )-2-(2-(( R )-2-아세트아미도-4-메틸펜탄아미도)아세트아미도)-6-아미노- N -(3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)헥산아미드(6)
화합물 6은 일반 절차 C에 따라 무수 CH2Cl2 (8 mL) 중의 TFA (10%, 0.8 mL)를 사용하여 Boc의 탈보호를 통해 화합물 5 (40 mg, 0.050 mmol)로부터 합성되었다. 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 6 (16 mg)을 45% 수율로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.22 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 8.32 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 8.08-7.97 (m, 3H), 7.85 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.24-7.20 (m, 2H), 6.93 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.72-6.63 (m, J = 18.9, 8.5 Hz, 3H), 4.32 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 2.70 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 10.5 Hz, 3H), 1.74-1.68 (m, 1H), 1.61-1.54 (m, 3H), 1.50-1.37 (m, 3H), 1.35-1.30 (m, 2H), 0.84-0.78 (m, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 173.5, 173.5, 171.7, 170.2, 169.5, 169.2, 161.6, 158.9, 158.6, 158.3, 158.0, 153.1, 152.3, 151.3, 141.5, 136.3, 132.2, 132.1, 130.8, 129.5, 129.2, 128.9, 126.3, 125.3, 124.5, 122.3, 119.3, 116.3, 116.1, 113.9, 112.6, 111.3, 106.9, 101.4, 82.6, 63.3, 56.2, 54.0, 52.0, 42.7, 41.0, 39.0, 31.6, 29.5, 29.4, 29.2, 27.1, 24.7, 23.5, 23.0, 22.8, 22.6, 22.1; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C37H44N5O8 [M+H]+: 686.3190, Found: 686.3187.
실시예 2. 아르기닌-검출용 형광 프로브[Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)]의 합성
[반응식 2]
상기 [반응식 2]에 나타난 화합물들의 합성 과정을 하기에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1-7. 화합물 7의 합성
(9 H -플루오렌-9-일)메틸((2 R )-1-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-1-옥소-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디히드로벤조푸란-5-일)설포닐)구아니디노)펜탄-2-일)카르바메이트(7)
CH2Cl2 (10 mL) 중의 메톡시 로돌 (50 mg, 0.15 mmol) 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (122 mg, 0.19 mmol) 용액에 EDC (111 mg, 0.58 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온 (rt)에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 용매를 증발시키고, 생성된 고체를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 7을 64% 수율 (90 mg)로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.36 (s, 1H), 8.01 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 7.79 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 7.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.19-7.16 (m, 1H), 6.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.75-6.66 (m, 4H), 4.27 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.13 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.06 (s, 2H), 2.91 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.38 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.51-1.42 (m, 2H), 1.36 (s, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 172.1, 169.2, 161.7, 158.0, 156.6, 153.1, 152.3, 151.4, 144.4, 144.3, 141.5, 141.3, 137.8, 136.3, 132.0, 130.8, 129.5, 129.0, 128.2, 127.6, 126.3, 125.8, 125.3, 124.8, 124.5, 120.6, 116.8, 116.0, 113.9, 112.7, 111.3, 106.8, 101.4, 86.8, 82.6, 66.2, 63.3, 56.2, 55.7, 55.4, 47.2, 43.0, 28.8, 19.4, 18.1, 12.8; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C55H54N5O10S [M+H]+: 976.3591, Found: 976.3586.
실시예 1-8. 화합물 8의 합성
(2 R )-2-아미노- N -(3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조푸란-5-일)설포닐)구아니디노)펜탄아미드(8)
화합물 8 (90 mg)은 일반 절차 B에 따라 무수 CH3CN (2.6 mL) 중의 피페리딘 (12.77 mg, 0.15 mmol)을 사용하여 화합물 7 (122 mg, 0.13 mmol)로부터 Fmoc의 탈보호를 통해 96% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.90 (dd, J = 6.4, 1.8 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.20-7.16 (m, 1H), 6.95 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.71-6.63 (m, 4H), 6.33 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.01 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.89 (s, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.57-1.55 (m, 1H), 1.49-1.44 (m, 1H), 1.42-1.38 (m, 2H), 1.34 (s, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 175.5, 169.2, 161.6, 157.9, 156.6, 153.1, 152.3, 151.4, 141.6, 137.8, 136.3, 132.0, 130.8, 129.5, 128.9, 126.3, 125.3, 124.8, 124.5, 116.8, 116.0, 113.7, 112.6, 111.3, 106.7, 101.4, 86.8, 82.7, 56.2, 55.9, 43.0, 28.8, 19.5, 18.1, 12.8; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C40H44N5O8S [M+H]+: 754.2911, Found: 754.2908.
실시예 1-9. 화합물 9의 합성
(9 H -플루오렌-9-일)메틸(2-(((2 R )-1-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일))아미노)-1-옥소-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조푸란-5-일)설포닐)구아니디노)펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트(9)
화합물 9 (90 mg)는 일반 절차 A에 따라 Fmoc-Gly-OH (22.27 mg, 0.13 mmol), DIC (17.71 mg, 0.14 mmol) 및 HOBT (18.97 mg, 0.14 mmol)를 사용하여 화합물 8 (90 mg, 0.12 mmol)의 아미드 커플링을 통해 73% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.29 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 7.76 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.53 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 7.38-7.34 (m, 2H), 7.28-7.22 (m, 3H), 7.17 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.72-6.63 (m, 3H), 6.33 (s, 1H), 4.38 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.18 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.01 (s, 2H), 2.86 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.70-1.65 (m, 1H), 1.56-1.50 (m, 1H), 1.46-1.36 (m, 2H), 1.33 (s, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 171.6, 169.7, 161.6, 158.0, 157.1, 156.6, 153.1, 152.3, 151.4, 144.3, 141.4, 141.2, 137.8, 136.3, 132.0, 130.8, 129.5, 129.0, 128.1, 127.6, 126.3, 125.8, 125.3, 124.8, 124.5, 120.6, 116.8, 116.0, 114.0, 112.7, 111.2, 101.4, 86.8, 82.6, 66.3, 56.2, 47.1, 43.8, 42.9, 28.8, 19.5, 18.1, 12.8; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C57H57N6O11S [M+H]+: 1033.3806, Found: 1033.3805.
실시예 1-10. 화합물 10의 합성
(2 R )-2-(2-아미노아세트아미도)- N -(3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조푸란-5-일)설포닐)구아니디노)펜탄아미드(10)
화합물 10은 일반 절차 B에 따라 무수 CH3CN (1.7 mL) 중의 피페리딘 (8.4 mg, 0.099 mmol)을 사용하여 Fmoc의 탈보호를 통해 화합물 9 (85 mg, 0.082 mmol)로부터 합성되었다. 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 10 (65 mg)을 97% 수율로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.45 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.99 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.3, 2.3 Hz, 1H), 7.18 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.73-6.63 (m, 3H), 6.34 (s, 1H), 4.44 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.15 (s, 2H), 3.01 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.88 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.72-1.64 (m, 1H), 1.60-1.49 (m, 1H), 1.44-1.38 (m, 2H), 1.34 (s, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 171.6, 169.2, 161.6, 158.0, 156.6, 153.1, 152.3, 151.3, 141.4, 137.8, 136.3, 132.0, 130.8, 129.5, 129.1, 126.3, 125.3, 124.8, 124.5, 116.8, 116.0, 114.0, 112.7, 111.2, 106.9, 101.4, 86.8, 82.6, 56.2, 53.2, 44.5, 43.0, 30.4, 28.8, 19.5, 18.1, 12.8; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C42H47N6O9S [M+H]+: 811.3125, Found: 811.3124.
실시예 1-11. 화합물 11의 합성
(2 R )-2-아세트아미도- N -(2-(((2 R )-1-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6')-일)아미노)-1-옥소-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조푸란-5-일)설포닐)구아니디노)펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄아미드(11)
화합물 11 (45 mg)은 일반 절차 A에 따라 Ac-Leu-OH (11.75 mg, 0.068 mmol), DIC (9.39 mg, 0.074 mmol) 및 HOBT (10.00 mg, 0.074 mmol)를 사용하여 화합물 10 (50 mg, 0.062 mmol)의 아미드 커플링을 통해 76% 수율로 합성되었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.20 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.30 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 8.06-8.00 (m, 2H), 7.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23-7.19 (m, 2H), 6.93 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.72-6.63 (m, 3H), 6.32 (s, 1H), 4.32 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.67 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.00 (pent, J = 6.3 Hz, 2H), 2.87 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.77 (d, J = 9.1 Hz, 3H), 1.71-1.53 (m, 2H), 1.41-1.37 (m, 4H), 1.33 (s, 6H), 0.80 (dd, J = 17.4, 5.9 Hz, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 171.5, 169.5, 169.2, 161.7, 158.0, 157.3, 156.6, 153.1, 152.3, 151.3, 141.4, 137.8, 136.3, 132.0, 130.8, 129.5, 129.0, 126.3, 125.3, 124.8, 124.6, 124.5, 119.4, 116.8, 116.1, 114.0, 112.7, 111.3, 106.9, 101.4, 86.8, 82.6, 56.2, 53.7, 43.0, 41.2, 29.5, 29.2, 28.8, 24.7, 23.8, 23.4, 22.9, 22.6, 22.2, 19.4, 18.1, 14.5, 12.8; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C50H60N7O11S [M+H]+: 966.4072, Found: 966.4066.
실시예 1-12. 화합물 12의 합성
(2 R )-2-아세트아미도- N -(2-(((2 R )-5-구아니디노-1-((3'-메톡시-3-옥소-3 H -스피로[이소벤조푸란-1,9'-크산텐]-6'-일)아미노)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄아미드(12)
화합물 12는 일반 절차 C에 따라 무수 CH2Cl2 (8 mL) 중의 TFA (10%, 0.8 mL)를 사용하여 Pbf의 탈보호를 통해 화합물 11 (45 mg, 0.047 mmol)로부터 합성되었다. 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 12 (15 mg)를 45% 수율로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.28 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 8.33 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 8.08 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.70 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.26-7.20 (m, 2H), 7.09 (s, 4H), 6.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.37 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.68 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.07 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 10.1 Hz, 3H), 1.74-1.70 (m, 1H), 1.63-1.53 (m, 2H), 1.51-1.38 (m, 4H), 0.81 (ddd, J = 17.7, 6.5, 1.5 Hz, 6H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 173.5, 173.5, 171.4, 170.2, 169.6, 169.2, 161.7, 158.3, 157.3, 153.1, 152.3, 151.3, 141.4, 136.3, 130.8, 129.5, 129.0, 126.3, 125.3, 124.5, 116.1, 114.0, 112.6, 111.3, 106.9, 101.4, 82.6, 56.2, 55.4, 53.7, 51.9, 49.1, 42.7, 29.5, 29.4, 25.6, 24.7, 23.5, 23.0, 22.1; HRMS (ESI+): m/z Calcd for C37H44N7O8 [M+H]+: 714.3251, Found: 714.3247.
II. 펩타이드 형광 프로브를 이용한 트립신의 효소적 절단 활성 측정
펩타이드 형광 프로브로서 라이신-검출용 형광 프로브[Rh-Lys-Gly-Leu (Ac)] 및 아르기닌-검출용 형광 프로브[Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)]를 이용하여 트립신의 효소적 절단 활성을 측정하였다.
실시예 2. 트립신에 의한 펩타이드 형광 프로브의 효소적 절단 활성 측정
트립신의 효소적 촉매 활성은 도 1에 나타난 바와 같이 펩타이드 형광 프로브에서의 특정 부위가 절단된 후 형광 강도 증가를 기준으로 측정하였다. 농도 의존적 트립신 촉매 활성 연구는 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더를 사용하여 수행하였다. 스톡 용액(stock solution)은 펩타이드 형광 프로브 (DMSO 중 20 μM), 트립신 (50 mM HEPES 버퍼 중 특정 농도, pH8.3)으로 준비하였다.
트립신 반응은 마이크로리더 96웰 플레이트의 웰에서 수행되었다. 먼저, 100 ㎕의 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)를 10 ㎕의 프로브 스톡 용액 (최종 농도 1 μM)과 혼합하였다. 적절한 양의 트립신 효소 스톡을 첨가하여 농도 의존적 연구를 수행하였다. 최종 부피는 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)를 이용하여 200 ㎕로 조정하였다. 마이크로플레이트를 30℃에서 30분 동안 쉐이킹하면서 인큐베이션하고, 형광 강도를 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더를 사용하여 2분마다 λex/em = 476/516 (메틸로돌의 λmax)으로 측정하였다.
다양한 농도(0.025, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10, 25 ㎍/mL)의 트립신을 사용하여 펩타이드 형광 프로브에서 부위-특이적 절단에 대한 트립신 농도 의존적 촉매 활성을 평가하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다. 펩타이드 형광 프로브의 경우 트립신에 의한 절단에 대한 최상의 결과는 0.25 ~ 1 ㎍/mL 범위에서 얻어졌다.
다음으로, 0.25 내지 1 ㎍/mL 범위의 농도에 대해 트립신 농도 의존적 촉매 활성을 수행하였다(도 3). 이 실험에서 1 ㎍/mL 트립신 농도는 고속 카이네틱(fast kinetic), 높은 형광 및 안정적인 절단 속도를 제공하는 최상의 결과를 보여주었다. 따라서, 트립신 농도를 1 ㎍/mL로 유지하는 모든 추가 실험을 수행하였다.
III. 펩타이드 형광 프로브를 이용한 아미노산 차단제의 억제 활성 측정
펩타이드 형광 프로브로서 라이신-검출용 형광 프로브[Rh-Lys-Gly-Leu (Ac)] 및 아르기닌-검출용 형광 프로브[Rh-Arg-Gly-Leu (Ac)]를 이용하여 아미노산(라이신 또는 아르기닌) 차단제의 억제 활성을 측정하였다(표 1 및 표 2 참조).
구체적으로, 아미노산 차단제는 라이신 특이적 억제제 및 아르기닌 특이적 억제제를 사용하였다. 라이신 특이적 억제제 후보 화합물로 무수물 억제제(아세트산 무수물, 벤조산 무수물, 디에틸 피로카보네이트, p-톨루엔 설폰산 무수물) 및 고리형 무수물 억제제(말레산 무수물, 시트라콘산 무수물, 프탈산 무수물)를 사용하였으며, 아르기닌 특이적 억제제 후보 화합물로 α,β-케톤 알데히드 억제제(페닐 글리옥살, 4-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살, 2-(트리플루오로메틸)페닐 글리옥살, 4-니트로 페닐 글리옥살, 4-메톡시 페닐 글리옥살, 6-메톡시-2-나프틸 글리옥살), 모노알데히드 억제제(벤즈알데히드) 및 α,β-디케톤 억제제(1,2 사이클로헥사디온, 2,3-부타디온)]를 사용하였다.
실시예 3. 펩타이드 형광 프로브를 이용한 아미노산-특이적 차단제의 억제 활성 측정
아미노산-특이적 차단제(amino acid-specific masking agents)의 억제 활성은 도 4에 나타낸 바와 같이 펩타이드 형광 프로브를 사용하여 평가하였다. 농도 의존적 차단 활성은 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더를 사용하여 수행하였다. 스톡 용액은 펩타이드 형광 프로브 (DMSO 중 20 μM), 트립신 (50 mM HEPES 버퍼 중 20 ㎍/mL, pH8.3), 억제제 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 mM), NaOH (0.002, 0.02, 0.2, 2, 20, 200, 2000 mM)로 준비하였다.
아미노산 차단제의 억제 활성은 마이크로플레이트 리더 96웰 플레이트의 웰에서 평가되었다. 먼저, 100 ㎕의 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)를 10 ㎕의 프로브 스톡 용액 (최종 농도 1 μM)과 혼합하였다. 상기 용액에 2 ㎕의 억제제를 스톡 용액과 다양한 농도 (최종 농도 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 mM)로 첨가하였다. 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)로 최종 부피를 190 ㎕로 조정하였다. 혼합물을 마이크로플레이트 리더에서 30분 동안 쉐이킹하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 트립신 (최종 농도 1 ㎍/mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 쉐이킹하면서 30℃에서 30분 동안 더 인큐베이션하였다. 형광 강도는 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더를 사용하여 30분에 λex/em = 476/516 (메틸로돌의 λmax)으로 측정하였다.
이때, 고리형 무수물 (즉, 시트라콘산 무수물, 말레산 무수물 및 프탈산 무수물)의 경우 억제제와 더불어 2 ㎕의 NaOH (최종 농도 0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2, 2, 20 mM)를 첨가하였다.
각 억제제에 대한 IC50은 도 5 내지 도 20에 나타낸 바와 같이 반대수 플롯(semilogarithmic plot)을 플로팅하여 계산하였다.
IV. 아미노산 차단제에 의한 펩타이드 기질 내 아미노산의 선택적 차단 평가
후보 아미노산 차단제에 의한 펩타이드 기질 내 특정 아미노산의 선택적 차단을 평가하였다.
실시예 4. 아미노산 차단 전 트립신에 의한 절단에 대한 14-mer 펩타이드의 분해 패턴
특정 아미노산, 라이신 또는 아르기닌에 대한 아미노산 차단제의 선택성을 평가하기 위해, 14-mer 펩타이드 LLTPETRRKAEDLL-NH2을 펩타이드 기질로 사용하였다. 14-mer 펩타이드의 분해 패턴을 초기 단계로 평가하였다. 아미노산 차단 전의 분해 패턴은 도 21 내지 도 23과 같다.
트립신(trypsin)에 의한 14-mer 펩타이드의 분해 패턴을 평가하기 위해, 실험은 하기와 같이 수행되었다.
구체적으로, 연구용 스톡 용액은 펩타이드 (1 mg/1 mL, 50 mM HEPES 버퍼 중 604 μM, pH8.3), 트립신 (50 mM HEPES 버퍼 중 3 mg/mL, pH8.3)으로 준비하였다. 펩타이드의 분해는 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더 상의 마이크로리더 96웰 플레이트의 웰 내에서 수행되었다. 먼저, 100 ㎕의 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)를 40 ㎕의 펩타이드 스톡 용액 (최종 농도 121 μM)과 혼합하였다. 상기 용액에 40 ㎕의 트립신 (최종 농도 600 ㎍)을 첨가하였다. 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)로 최종 부피를 200 ㎕로 조정하였다. 혼합물을 60분 동안 쉐이킹하였다.
트립신에 의한 절단에서 형성된 분획물의 특성화는 RP-HPLC-MS 분석에 의해 수행되었다. 분석은 0~20분 동안 5~35% 용매 B (용매 A: 물 중의 0.05% TFA 및 용매 B: AcCN 중의 0.05% TFA)의 구배 시스템으로 수행하였다 (컬럼: Agilant ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6ㅧ250 mm, 5 μM, 유속: 1 mL/min, 주입량: 10 ㎕, UV 파장: 206 nm). 먼저 14-mer 펩타이드 표준 물질의 RP-HPLC-MS 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 24에 나타내었다.
다음으로, 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 기질의 다른 위치에서 절단에 의해 형성된 분획물의 RP-HPLC-MS 분석을 평가하고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
실시예 5. 아미노산 차단 후 트립신에 의한 절단에 대한 14-mer 펩타이드의 분해 패턴
후보 아미노산 차단제 중 시트라콘산 무수물을 사용하여 라이신을 차단한 후의 분해 패턴은 도 26 및 도 27과 같다.
시트라콘산 무수물을 사용하여 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드의 분해 패턴을 평가하기 위해, 실험은 하기와 같이 수행되었다.
구체적으로, 연구용 스톡 용액은 펩타이드 (1 mg/1 mL, 50 mM HEPES 버퍼 중 604 μM, pH8.3), 트립신 (50 mM HEPES 버퍼 중 3 mg/mL, pH8.3), 시트라콘산 (DMSO 중 2000 mM), NaOH (탈이온수 중 4000 mM)로 준비되었다. 펩타이드의 분해는 BioTek Synergy™ H1 마이크로플레이트 리더 상의 마이크로리더 96웰 플레이트의 웰 내에서 수행되었다. 먼저, 100 ㎕의 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)를 40 ㎕의 펩타이드 스톡 용액 (최종 농도 121 μM)과 혼합하였다. 상기 용액에 2 ㎕의 시트라콘산 무수물과 2 ㎕의 NaOH를 첨가하였다. 50 mM HEPES 버퍼 (pH8.3)로 최종 부피를 160 ㎕로 조정하였다. 혼합물을 60분 동안 쉐이킹하였다. 마지막으로 40 ㎕의 트립신을 첨가하고 혼합물을 60분 동안 더 쉐이킹하였다.
트립신에 의한 절단에서 형성된 분획물의 특성화는 RP-HPLC-MS 분석에 의해 수행되었다. 분석은 0~20분 동안 5~35% 용매 B (용매 A: 물 중의 0.05% TFA 및 용매 B: AcCN 중의 0.05% TFA)의 구배 시스템으로 수행하였다 (컬럼: Agilant ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6ㅧ250 mm, 5 μM, 유속: 1 mL/min, 주입량: 10 ㎕, UV 파장: 206 nm).
시트라콘산 무수물을 사용하여 라이신을 차단한 후 트립신에 의한 14-mer 펩타이드 기질의 다른 위치에서 절단에 의해 형성된 분획물의 RP-HPLC-MS 분석을 평가하고, 그 결과를 도 28에 나타내었다.
한편, 후보 아미노산 차단제 중 페닐 글리옥살을 사용하여 아르기닌을 차단한 후의 분해 패턴은 도 29와 같다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 트립신 특이적 형광 프로브 화합물:
    [화학식 1]

    식 중,
    R은 또는 이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 형광 프로브 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것인, 형광 프로브 화합물:
    [화학식 2]

    [화학식 3]
    .
  3. 제1항에 있어서, 상기 형광 프로브 화합물은 트립신과 반응하여 형광 켜짐 현상을 나타내는 것인, 형광 프로브 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 형광 프로브 화합물은 라이신 검출용인 것인, 형광 프로브 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 화학식 3으로 표시되는 형광 프로브 화합물은 아르기닌 검출용인 것인, 형광 프로브 화합물.
  6. 제1항의 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 조성물.
  7. 시험관 내(in vitro)에서 제1항의 형광 프로브 화합물을 이용한 라이신 또는 아르기닌의 선택적 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제1항의 형광 프로브 화합물과 트립신의 반응에 의한 형광 세기를 측정함에 의해 이루어지는 것인, 검출 방법.
  9. 제1항의 형광 프로브 화합물을 이용한 아미노산 차단제 탐색 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아미노산은 라이신 또는 아르기닌인, 아미노산 차단제 탐색 방법.
  11. 제1항에 따른 형광 프로브 화합물을 포함하는 라이신 또는 아르기닌 검출용 형광 센서.
KR1020210115020A 2021-08-30 2021-08-30 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도 Active KR102663243B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210115020A KR102663243B1 (ko) 2021-08-30 2021-08-30 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210115020A KR102663243B1 (ko) 2021-08-30 2021-08-30 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230032320A KR20230032320A (ko) 2023-03-07
KR102663243B1 true KR102663243B1 (ko) 2024-05-03

Family

ID=85513386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210115020A Active KR102663243B1 (ko) 2021-08-30 2021-08-30 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102663243B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019506163A (ja) 2016-01-29 2019-03-07 ザ・トラスティーズ・オブ・プリンストン・ユニバーシティＴｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ Ｏｆ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 例外的なスプライシング活性を有するスプリットインテイン

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
JP2018531007A (ja) 2015-09-24 2018-10-25 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリンの製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019506163A (ja) 2016-01-29 2019-03-07 ザ・トラスティーズ・オブ・プリンストン・ユニバーシティＴｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ Ｏｆ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 例外的なスプライシング活性を有するスプリットインテイン

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230032320A (ko) 2023-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7202332B2 (en) Methods for preparing internally constrained peptides and peptidomimetics
Schirmeister New peptidic cysteine protease inhibitors derived from the electrophilic α-amino acid aziridine-2, 3-dicarboxylic acid
Rut et al. Engineered unnatural ubiquitin for optimal detection of deubiquitinating enzymes
US10557129B2 (en) Peptides derived from human PCSK9 catalytic domain and uses thereof for promoting LDL-R activity
Brynes et al. Sensitive fluorogenic substrates for the detection of trypsinlike proteases and pancreatic elastase
Ede et al. Solid phase synthesis of peptide aldehyde protease inhibitors. Probing the proteolytic sites of hepatitis C virus polyprotein
JPS6126558B2 (ko)
KR102663243B1 (ko) 트립신 특이적 형광 프로브 및 이의 용도
KR102574341B1 (ko) 아미노산 특이적 차단제 및 이의 용도
Verhelst et al. Solid-phase synthesis of double-headed epoxysuccinyl activity-based probes for selective targeting of papain family cysteine proteases
Patthy et al. Remarkable phylum selectivity of a Schistocerca gregaria trypsin inhibitor: the possible role of enzyme–inhibitor flexibility
EP1511765B1 (en) Par-2-activating peptide derivative and pharmaceutical composition using the same
Krafft et al. [6] Synthetic approaches to continuous assays of retroviral proteases
EP2812345B1 (en) Method of synthesizing peptides, proteins and bioconjugates
US20020102533A1 (en) Hepatitis C protease exosite for inhibit or design
Podversnik et al. Design and synthesis of efficient fluororethylene-peptidomimetic inhibitors of dipeptidyl peptidase iii (dpp3)
CN112898293B (zh) 一种检测成纤维细胞活化蛋白的生物发光探针、及其制备方法和应用
EP2266963A1 (en) Fluorogenic peptidase substrate
US9593142B2 (en) Aldehyde capture ligation technology for synthesis of amide bonds
Limbach et al. Synthesis of β3‐Homophenylalanine‐Derived Amino Acids and Peptides by Suzuki Coupling in Solution and on Solid Support
JPH05137599A (ja) 蛍光基質
Li Stereoselective peptide modification through 8-aminoquinoline controlled β‑C (sp3)‑H arylation at the C-terminal dipeptide
D'Amico et al. Advancing the Exploration of the Ubiquitin‐like Protein FUBI with Synthetic Chemical Tools
JPH0755942B2 (ja) 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法
Vathipadiekal et al. Molecular cloning, over expression, and activity studies of a peptidic HIV-1 protease inhibitor: Designed synthetic gene to functional recombinant peptide

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20210830

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20240121

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20240423

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20240429

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20240430

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration