JP7290305B2

JP7290305B2 - 例外的なスプライシング活性を有するスプリットインテイン

Info

Publication number: JP7290305B2
Application number: JP2018539361A
Authority: JP
Inventors: ミューア、トム、ダブリュー; スティーブンス、アダム、ジェイ; シャー、ニール、エイチ
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2037-01-27
Also published as: DK3408292T3; JP2019506163A; EP4234689A2; ES2949163T3; PT3408292T; EP3408292A2; WO2017132580A2; US20200055900A1; AU2017211395B2; EP4234689A3; EP3408292B1; FI3408292T3; US11142550B2; PL3408292T3; SI3408292T1; CN108884154A; WO2017132580A3; US20210371467A1; CA3051195A1; HUE062276T2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／２８８，６６１号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された助成金ＧＭ０８６８６８のもと政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

１．技術分野
本発明の特許請求の範囲に記載されている実施形態の分野は、インテイン、スプリットインテイン、インテインを含んでなる組成物、およびタンパク質エンジニアリングのためのそれらの使用方法に関する。

２．関連技術の考察
タンパク質スプライシングは、隣接するポリペプチド配列（エクステイン）が通常のペプチド結合を介して一緒にライゲーションされるように、インテインと呼ばれる介在タンパク質ドメインが宿主タンパク質から無傷で自己切断される翻訳後自己分解事象である^１。タンパク質スプライシングは、典型的には、連続したポリペプチドの翻訳後に自発的に起こるが、いくつかのインテインは分割された形態で自然に存在する^１。スプリットインテインの２つの断片は別々に発現され、それらの相補的なパートナーに遭遇するまで不活性のままであり、遭遇したら協調的に折り畳まれてトランススプライシングされる。この活性は、インビトロおよびインビボの両方でタンパク質の構造および活性の制御を提供する多数のタンパク質エンジニアリング方法において利用されている^１。シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）およびＮｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＰＣＣ７３１０２（Ｎｐｕ）から特徴付けられる最初の２つのスプリットインテインは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＤｎａＥ）のα－サブユニットに挿入された天然に存在するオルソログである^２－４。Ｎｐｕは、タンパク質トランス－スプライシング（ＰＴＳ）（３０℃でｔ_１／２＝５０秒）の顕著に速い速度のために特に注目に値する^５。この半減期は、Ｓｓｐ（３０℃でｔ_１／２＝８０分）の半減期よりもかなり短いことから、ＰＴＳの適用範囲が広がることになる^１。

新しい高速インテインの発見が続いているにもかかわらず^６，７、より遅いホモログからそれらを分離することについてはほとんど知られていない。そのような理解は、速やかにスプライシングする可能性の高い新規のインテインを同定するのに役立ち、優れたＰＴＳ特性を有するスプリットインテインのエンジニアリングを潜在的に可能にするはずである。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片と、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列と
を含むスプリットインテインＣ断片と
を含んでなる組成物が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミドが含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミドが含まれる。

本発明の実施形態には、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、２つの複合体をスプライシングするための方法が含まれる：第１の化合物と、スプリットインテインＮ断片とを含む第１の複合体と、第２の化合物と、スプリットインテインＣ断片とを含む第２の複合体とを接触させる工程であって、当該接触が、スプリットインテインＮ断片とスプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成する条件下で実施されることを特徴とする工程；インテイン中間体を反応させて第１の化合物と第２の化合物とのコンジュゲートを形成する工程。スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつスプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の実施形態には、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法が含まれる：第１の化合物と、スプリットインテインＮ断片とを含む第１の複合体と、第２の化合物と、スプリットインテインＣ断片とを含む第２の複合体とを接触させる工程であって、当該接触が、スプリットインテインＮ断片とスプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成する条件下で実施されることを特徴とする工程；インテイン中間体と求核剤とを反応させて第１の化合物と求核剤とのコンジュゲートを形成する工程。スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつスプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

いくつかの実施形態において、化合物、第１の化合物または第２の化合物は、ペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはペプチドもしくはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、化合物、第１の化合物または第２の化合物は、抗体、抗体鎖もしくは抗体重鎖であるか、または抗体、抗体鎖もしくは抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、化合物、第１の化合物または第２の化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物もしくは細胞傷害性分子であるか、またはペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物もしくは細胞傷害性分子を含むものである。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３９０）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるインテインが含まれる。

本発明の実施形態には、２つの複合体を一緒にスプライシングするためのキットであって、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片；
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片；
スプリットインテインＮ断片のスプリットインテインＣ断片への結合を可能にしてインテイン中間体を形成するための試薬；および求核剤
を含んでなる、キットが含まれる。

本発明の実施形態には、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、合成コンセンサスインテインペプチド配列を生成するための方法が含まれる：複数の相同インテインペプチド配列の集団を生成する工程；複数の相同インテインペプチド配列の集団内の高速スプライシングに関連するアミノ酸を同定する工程；第２の複数の相同インテインペプチド配列の亜集団を生成し、当該第２の複数の相同インテインペプチド配列が高速スプライシングに関連するアミノ酸を含むことを特徴とする工程；亜集団の少なくとも３つのペプチド配列のアライメントを作製する工程；少なくとも３つのペプチド配列の各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸残基を決定する工程；および少なくとも３つのペプチド配列の各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸残基に基づいて合成コンセンサスインテインペプチド配列を生成する工程。

本発明の実施形態には、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との融合物が隣接インテインをコードするように、第１のインテイン断片（スプリットインテインＮ断片）のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を、第２のインテイン断片（スプリットインテインＣ断片）のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合させる工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法が含まれる。スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつスプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の実施形態には、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法が含まれる：第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との融合物が隣接インテインをコードするように、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）を含んでなる第１のインテイン断片（スプリットインテインＮ断片）のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）を含んでなる第２のインテイン断片（スプリットＣ断片）のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合させる工程。

本発明の実施形態には、第１のインテイン断片（スプリットインテインＮ断片）のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のインテイン断片（スプリットインテインＣ断片）のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列とを含んでなる遺伝子融合物が含まれる。スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつスプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）を含んでなる第２のインテイン断片（スプリットインテインＣ断片）のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合してなる、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）を含んでなる第１のインテイン断片（スプリットインテインＮ断片）のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子融合物が含まれる。

本発明の実施形態には、スプリットインテインＮ断片と化合物とを含んでなる複合体（例えば融合タンパク質）が含まれる。例えば、この化合物は、ペプチド、ポリペプチドもしくは抗体鎖、例えば抗体重鎖であってもよいか、またはペプチド、ポリペプチドもしくは抗体鎖、例えば抗体重鎖を含んでいてもよい。例えば、この化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物または細胞毒性分子を含んでいてもよい。例えば、この化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物または細胞毒性分子に結合した１，２－アミノチオールまたは１，２－アミノアルコールであってもよい。スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の実施形態には、スプリットインテインＣ断片と化合物とを含んでなる複合体（例えば融合タンパク質）が含まれる。例えば、この化合物は、デンドリマー、ペプチドもしくはポリペプチドであってもよいか、またはデンドリマー、ペプチドもしくはポリペプチドを含んでいてもよい。例えば、この化合物は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、薬物または細胞毒性分子に結合した１，２－アミノチオールまたは１，２－アミノアルコールであってもよい。スプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。デンドリマーは、下記構造を有する化合物であってもよい：

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ（独立して）、水素（Ｈ）またはカーゴ分子（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４上のカーゴ分子は互いに異なっていてもよい）である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ色素分子であってもよい。例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ下記構造を有するフルオレセイン誘導体であってもよい：

本発明の実施形態には、下記構造を有する複合体が含まれる：

式中、ＩｎｔＣは、スプリットインテインＣ断片であり、ｎは０～８である。

式中、ＩｎｔＣはスプリットインテインＣ－断片であり、Ｘは硫黄（Ｓ）または酸素（Ｏ）である。スプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

本発明の実施形態には、例えば、発現タンパク質ライゲーションなどの従来の半合成用途に使用することができる隣接インテインが含まれる。

本発明の一つの実施形態によるＣｆａスプリットインテインの設計のアライメントおよびコンピュータ生成モデルを示す。本発明の一つの実施形態によるＣｆａインテインの特徴を示すグラフを示す。本発明の一つの実施形態によるＣｆａインテインを用いたマウスモノクローナル抗体の発現および修飾を示す。本発明の一つの実施形態による速やかなタンパク質トランススプライシングに重要な第２のシェルの「アクセラレータ(accelerator)」残基の同定を示す。本発明の一つの実施形態によるバッチ２変異体およびコンピュータ生成モデルの動態分析を示す。本発明の一つの実施形態によるバッチ１変異体およびコンピュータ生成モデルの分析を示す図である。図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の一つの実施形態によるＤｎａＥインテインファミリーのアライメントおよび精製を示す。本発明の一つの実施形態によるＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ－Ｎｐｕ^ＮおよびＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ－Ｃｆａ^Ｎの試験発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。本発明の一つの実施形態によるＣｆａ_ＧＥＰの乱雑さ増大を示す概略図およびグラフを示す。本発明の一つの実施形態による可変残基を有する大腸菌におけるｅＧＦＰの環化を示すグラフおよび概略図を示す。本発明の一つの実施形態によるいくつかの複合体および化合物を示す表を示す。

詳細な説明
本発明の実施形態を以下に詳細に説明する。分かりやすくする意味で、実施形態を説明する際には特定の用語を使用する。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではない。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の均等部分を用いて、他の方法を開発できることを認識するであろう。本明細書に引用される全ての参考文献は、各々が個々に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片と、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片と
を含んでなる組成物が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミドが含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミドが含まれる。

本発明の実施形態には、第１の化合物と、スプリットインテインＮ断片とを含む第１の複合体と、第２の化合物と、スプリットインテインＣ断片とを含む第２の複合体とを接触させる工程であって、当該接触が、スプリットインテインＮ断片とスプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成する条件下で実施されることを特徴とする工程；および
インテイン中間体を反応させて第１の化合物と第２の化合物とのコンジュゲートを形成する工程を少なくとも含んでなる、２つの複合体をスプライシングするための方法が含まれ、ここで、前記スプリットインテインＮ断片は、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、前記スプリットインテインＣ断片は、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの実施形態において、インテイン中間体を反応させることは、インテイン中間体と求核剤とを接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記第１の化合物はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、前記第１の化合物は抗体である。

本発明の実施形態には、２つの複合体を一緒にスプライシングするためのキットであって、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ断片；
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＣ断片；
スプリットインテインＮ断片のスプリットインテインＣ断片への結合を可能にしてインテイン中間体を形成するための試薬；および
求核剤を含んでなる、キットが含まれる。

本発明の実施形態には、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、合成コンセンサスインテインペプチド配列を生成するための方法が含まれる：複数の相同インテインペプチド配列の集団を生成する工程；複数の相同インテインペプチド配列の集団内の高速スプライシングに関連するアミノ酸を同定する工程；第２の複数の相同インテインペプチド配列の亜集団を生成し、当該第２の複数の相同インテインペプチド配列が高速スプライシングに関連するアミノ酸を含むことを特徴とする工程；前記亜集団の少なくとも３つのペプチド配列のアライメントを作製する工程；前記少なくとも３つのペプチド配列の各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸残基を決定する工程；および前記少なくとも３つのペプチド配列の各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸残基に基づいて合成コンセンサスインテインペプチド配列を生成する工程。

本発明の実施形態には、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との融合物が隣接インテインをコードするように、下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）を含んでなる第１のインテイン断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）を含んでなる第２のインテイン断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合させる工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法が含まれる。

本発明の実施形態には、下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）を含んでなる第２のインテイン断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合してなる、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）を含んでなる第１のインテイン断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子融合物が含まれる。

いくつかの実施形態において、記載される種々のインテイン断片は、当技術分野で公知の従来の方法によって、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、細胞傷害性分子またはそれらの組み合せ物に連結、融合、化学結合、複合体化またはカップリングされる。

実施例１：
いくつかの実施形態において、最初の２つの特徴付けられたスプリットインテインであるＮｐｕおよびＳｓｐの比較研究を通じて、速やかなタンパク質スプライシングの基礎を調べた。これらの２つのタンパク質間のスプライシング速度の実質的差異は、それらの非常に類似した配列（６３％の同一性）およびほぼ重ね合わせることができる活性部位構造を考慮に入れると、特に判別しにくい。ＮｐｕおよびＳｓｐに関する以前の突然変異誘発研究は、２つの間の活性の差異が、単一の部位ではなく、いくつかの残基の複合効果に起因する可能性が高いことを示唆している^６，８。しかしながら、速い反応速度と緩慢な反応速度に関与する残基の数や、その延長線上で考えて、これらの「アクセラレータ」残基がタンパク質スプライシングプロセス全体の個々の化学的ステップに等しく寄与しているかどうかは、はっきりしないままである。したがって、これらの疑問点を調査し、これがＰＴＳシステム改善の出発点を提供するという期待を抱いて研究を開始した。

ＮｐｕおよびＳｓｐの活性部位内の高レベルの保存は、より遠位のアミノ酸の差異が２つの間のスプライシング速度の不一致につながることを示唆している。したがって、活性部位に直接隣接する「第２のシェル」残基に着目した。この分析を単純化するために、バッチ突然変異誘発戦略を、以前に報告されたインビトロＰＴＳアッセイと共に用いた^５。このアッセイは、短いネイティブなエクステイン配列を有するスプリットインテイン構築物を使用し、スリーステート動態モデルを使用して分岐状中間体形成（ｋ_１、ｋ_２）速度およびその最終スプライス産物（ｋ_３）へのその分解能を決定することを可能にする。

ＮｐｕおよびＳｓｐインテイン断片の公知の交差反応性は、スプリットインテインのどの半分が活性の差異に最も有意に寄与するかを評価するための有益なプラットフォームとして役立った^３。Ｓｓｐ^Ｎ－Ｎｐｕ^Ｃ（キメラ１）およびＮｐｕ^Ｎ－Ｓｓｐ^Ｃ（キメラ２）キメラの両方とも、ネイティブなＮｐｕのものと比較して分岐形成および分解速度の低下を示す（図４Ｃ、４Ｄ）。これは、ＮｐｕおよびＳｓｐのＮ－およびＣ－インテイン断片の両方の残基がそれらのスプライシング速度の差異に寄与していることを示す。次に、これらの各キメラの第２のシェル位置の４つのグループを活性部位へのそれらの近接度合いに基づいて選択し、対応するＳｓｐ残基をＮｐｕのものに突然変異させた（図４Ａおよび４Ｂ）。キメラ１変異体から、バッチ２（Ｌ５６Ｆ、Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ、Ｅ８５Ｄ）は、ネイティブなＮｐｕのものへの分岐形成活性を完全に回復したが（図４Ｃ）、バッチ１（Ｒ７３Ｋ、Ｌ７５Ｍ、Ｙ７９Ｇ、Ｌ８１Ｍ）は、分岐分解活性の大部分を回復した（図４Ｄ）。キメラ２のバックグラウンドに及ぼす突然変異の効果は、ネイティブなＮｐｕのものへのスプライシング活性を回復することができない単一のバッチでは、より単調であった（図４Ｃおよび４Ｄ）。最後に、Ｓｓｐ^ＣのＡ１３６Ｓ突然変異はタンパク質スプライシングを促進することが以前に示されており、別々に試験した^８。このＡ１３６Ｓ突然変異は、分岐分解速度を２倍に増加させるが、分岐形成には影響を及ぼさない（図４Ｃおよび４Ｄ）。

図４は、本発明の一つの実施形態による、速やかなタンパク質トランススプライシングに重要な第２のシェルの「アクセラレータ」残基の同定を示す。パネルＡおよびＢには、キメラ１（Ｓｓｐ^Ｎ－Ｎｐｕ^Ｃ）およびキメラ２（Ｎｐｕ^Ｎ－Ｓｓｐ^Ｃ）上の第２シェルバッチ変異体の設計が示されている。それぞれの場合において、Ｎｐｕ（ｐｄｂ＝４ｋ１５）の結晶構造を使用して変異体（スティック状に描写される）の位置が示されている。触媒残基は黒色で示されている（スティック状に描写される）。パネルＣは、本研究において記載される種々の構築物（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））の出発物質からの分岐状中間体形成の順方向（ｋ_１、青色）および逆方向（ｋ_２、赤色）速度を示す。パネルＤは、種々の構築物（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））の分岐分解（ｋ_３）速度を示す

次に、バッチ変異体１および２内の残基の個々の寄与はスプライシング活性に最も深刻な影響を及ぼすため、これらについて調べた。バッチ２について、更なる突然変異誘発は、Ｆ５６、Ｋ７０およびＤ８５の間の相互作用がＮｐｕ^Ｎにおける分岐形成速度の増加に関与する可能性が高いことを示す（図５Ａ）。Ｋ７０は、Ｎｐｕ^Ｎ（残基６９～７２）における高度に保存されたＴＸＸＨブロックＢループの一部であって、タンパク質スプライシングにおける最初のＮ→Ｓアシルシフトを触媒することから、構造的証拠がこのデータを支持する^９。したがって、（Ｆ５６およびＤ８５に対して充填された）Ｋ７０の位置および動態は、触媒残基Ｔ６９およびＨ７２に直接影響を及ぼすはずである（図５Ｂ）^{１０－１２}。バッチ１から、Ｋ７３、Ｍ７５およびＭ８１は、Ｎｐｕ^Ｎにおけるより速い分岐分解速度に関与する（図６Ａ）。これらの残基は、タンパク質スプライシングの最終段階においてスクシンイミド形成を経なければならないＣ－インテインの末端アスパラギンの周囲を充填する（図６Ｂ）。総合すると、突然変異誘発データは、第２のシェルの「アクセラレータ」残基がスプリットインテインの活性を調整する際に果たす重要な役割を指し示す。

図５は、本発明の一つの実施形態によるバッチ２変異体およびコンピュータ生成モデルの動態分析を示す。パネルＡは、バッチ２（Ｌ５６Ｆ、Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ、Ｅ８５Ｄ）（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））を含むＳｓｐ^Ｎの単一（Ａ８３Ｐ）、二重（Ａ８３Ｐ、Ｓ７０Ｋ）および三重（Ｌ５６Ｆ、Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ）点変異体についての分岐形成の平衡速度（ｋ_１、ｋ_２）および分岐分解速度（ｋ_３）を示す。パネルＢは、Ｎｐｕ活性部位（ｐｄｂ＝４ｋｌ５）におけるバッチ２（ラベルＦ５６、Ｋ７０、Ｐ８３およびＤ８５に接する緑色のスティック）の拡大表示を示す。触媒残基は黒色のスティックとして描写される。

図６は、本発明の一つの実施形態によるバッチ１変異体およびコンピュータ生成モデルの動態分析を示す。パネルＡは、バッチ１（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））を含む単一（Ｒ７３Ｋ）、二重（Ｒ７３Ｋ、Ｙ７９Ｇ）および三重（Ｒ７３Ｋ、Ｙ７９Ｇ、Ｌ８１Ｍ）点変異体についての分岐形成の平衡速度（ｋ_１、ｋ_２）および分岐分解速度（ｋ_３）を示す。パネルＢは、Ｎｐｕ構造（ｐｄｂ＝４ｋｌ５）におけるバッチ１（ラベルＫ７３、Ｍ７５、Ｇ７９およびＭ８１に接する赤色のスティック）の拡大表示を示す。触媒残基は黒色のスティックとして描写される。

スプライシング速度に影響を与えることが見出された「アクセラレータ」残基は、コンセンサスＤｎａＥインテインをエンジニアリングするための活性誘導アプローチを可能にする。コンセンサスタンパク質エンジニアリングは、親ファミリーに由来する熱安定性変異体を作製するためにタンパク質のホモログ・セットに適用されるツールである^{１３，１４}。特定のタンパク質のホモログから多配列アライメント（ＭＳＡ）が最初に生成され、そこから各位置で最も統計的に頻繁な残基がコンセンサス配列の代表として選択される。ＤｎａＥインテインについて、ＪＧＩ^１６およびＮＣＢＩ^１７データベースのＢＬＡＳＴ^１５検索により１０５の配列を同定した（図７Ａ）。次に、高速スプライシングの第２のシェルインジケーターを持つ配列：Ｋ７０、Ｍ７５、Ｍ８１およびＳ１３６のみを含むようにアライメントをフィルタリングした。次いで、ＭＳＡ中に残った７３個の理論上高速のインテイン（図７Ｂ）を使用して、コンセンサス高速ＤｎａＥインテイン配列（Ｃｆａ）を生成した（図１）。図７Ａおよび図７Ｂに開示された種々の配列を以下に示す：

＞ＮｐｕＰＣＣ７３１０２／１－１３７

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号５）

ＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号６）

＞ＣｔｈＰＣＣ７２０３：／１－１３７ＣｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓｔｈｅｒｍａｌｉｓＰＣＣ７２０３

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＦＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＦＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＫＱＶＫＳＩＱＮ（配列番号７）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＩＱＰＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＫＦＶＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号８）

＞ＮｓｐＣＣＹ９４１４：／１－１３７ＮｏｄｕｌａｒｉａｓｐｕｍｉｇｅｎａＣＣＹ９４１４ｇｅｎｏｍｅ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＹＩＰＩＧＥＩＶＥＫＡＩＥＣＳＶＹＳＶＤＮＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＱＥＬＤＬＬＱＶＨＧＬＰＫ（配列番号９）

ＶＫＩＴＡＲＫＦＶＧＲＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＹＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１０）

＞ＡｃｙＰＣＣ７１２２：／１－１３７ＡｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａＰＣＣ７１２２

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＩＦＳＶＤＫＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＲＱＥＩＹＥＹＣＬＤＤＧＳＫＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＡＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＤＬＤＬＬＫＶＥＧＬＰＥ（配列番号１１）

ＶＫＩＩＳＲＱＹＬＧＱＡＤＶＹＤＩＧＶＥＥＤＨＮＦＡＩＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１２）

＞ＣｓｐＰＣＣ７５０７：／１－１３７Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７５０７，ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅ

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＲＶＦＳＶＤＮＨＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＧＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰＥ（配列番号１３）

ＶＫＶＩＴＲＫＹＩＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＬＤＨＮＦＡＩＲＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１４）

＞ＮｓｐＰＣＣ７５２４：／１－１３７Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７５２４

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＦＳＶＡＳＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＩＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＣＥＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰＥ（配列番号１５）

ＶＫＶＶＴＲＫＹＩＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＲＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６）

＞Ｎａｚ０７０８：／１－１３７ ’Ｎｏｓｔｏｃａｚｏｌｌａｅ’０７０８

ＣＬＳＹＫＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＬＦＳＶＤＥＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＶＱＥＶＹＥＹＣＬＤＤＧＴＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＩＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＤＬＮＬＬＱＶＮＧＬＰＴ（配列番号１７）

ＶＫＩＩＳＲＱＦＬＧＰＡＮＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１８）

＞ＮｓｐＰＣＣ７１２０：／１－１３７Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０ＤＮＡ

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＳＶＦＳＩＮＮＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＫＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号１９）

ＩＫＩＡＳＲＫＦＬＧＶＥＮＶＹＤＩＧＶＲＲＤＨＮＦＦＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２０）

＞ＡｖａＡＴＣＣ２９４１３／１－１３７ＡｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓＡＴＣＣ２９４１３

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＤＫＧＩＥＣＳＶＦＳＩＤＳＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＫＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号２１）

ＩＫＩＡＳＲＫＦＬＧＶＥＮＶＹＤＩＧＶＧＲＤＨＮＦＦＶＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２２）

＞ＰｓｐＰＣＣ７３２７：／１－１３５Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｓｐ．ＰＣＣ７３２７．

ＣＬＳＹＤＴＫＩＬＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＤＣＴＶＹＴＶＮＱＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＫＱＥＩＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＫＩＦＥＫＧＬＤＬＫＴＩＮＣＤ（配列番号２３）

ＶＫＩＬＳＲＫＳＬＧＩＱＳＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２４）

＞ＣｓｐＰＣＣ７４２４：／１－１３５Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＰＣＣ７４２４

ＣＬＳＹＥＴＱＩＭＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＤＣＴＶＹＴＶＮＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＥＬＫＱＩＨＬＳ（配列番号２５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＩＱＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＩＳＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号２６）

＞ＣｓｐＰＣＣ７８２２：／１－１３４Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＰＣＣ７８２２

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＬＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＤＤＧＱＭＬＰＩＥＥＩＦＥＫＧＬＥＬＫＱＩＩＬ（配列番号２７）

ＶＫＩＩＳＲＱＬＡＧＮＱＴＶＹＤＬＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２８）

＞ＮｓｐＰＣＣ７１０７：／１－１３７Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１０７

ＣＬＳＹＤＴＱＶＬＴＶＥＹＧＬＶＰＩＧＥＩＶＥＫＱＬＥＣＳＶＦＴＩＤＧＨＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＬＱＶＱＧＬＲＷ（配列番号２９）

ＶＫＩＩＴＲＫＹＩＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＶＩＥＮＲＬＩＡＳＮ（配列番号３０）

＞ＴｂｏＩｉｃｂ１／１－１３６ＴｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘｂｏｕｔｅｉｌｌｅｉＩｉｃｂ１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＧＩＥＣＮＶＹＳＶＤＫＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＮＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＳＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＩＲＶＥＤＬＰ（配列番号３１）

ＶＫＩＬＴＲＫＳＩＧＫＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号３２）

＞Ａｏｖ：／１－１３６ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍＤｎａＥｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ｄｎａＥ）ｇｅｎｅ

ＣＬＳＡＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＧＫＡＩＥＣＲＶＹＳＶＤＧＮＧＮＩＹＴＱＳＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＥＭＬＰＩＤＥＸＦＡＲＱＬＤＬＭＱＶＱＧＬＨ（配列番号３３）

ＶＫＩＴＡＲＫＦＶＧＲＥＮＶＹＤＩＧＶＥＨＨＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３４）

＞ＯｎｖＰＣＣ７１１２：／１－１３７Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｎｉｇｒｏ－ｖｉｒｉｄｉｓＰＣＣ７１１２

ＣＬＳＹＤＴＫＩＬＴＶＥＹＧＰＭＡＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＳＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＳＩＡＱＷＨＲＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＤＬＫＱＩＮＳＳＳＤ（配列番号３５）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＥＶＹＤＩＧＶＥＲＥＨＮＦＩＬＥＮＳＬＶＡＳＮ（配列番号３６）

＞ＲｓｐＰＣＣ７１１６：／１－１３５Ｒｉｖｕｌａｒｉａｓｐ．ＰＣＣ７１１６，ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅ

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＥＥＦＧＬＩＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＤＣＴＶＹＳＶＤＶＮＧＮＶＹＳＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＭＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＥＭＬＡＩＤＥＩＦＥＫＧＬＥＬＫＲＶＧＩＹ（配列番号３７）

ＶＫＩＩＳＲＫＶＬＫＴＥＮＶＹＤＩＧＬＥＧＤＨＮＦＩＩＫＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号３８）

＞ＴｅｒＩＭＳ１０１：／１－１３７ＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍｅｒｙｔｈｒａｅｕｍＩＭＳ１０１

ＣＬＴＹＥＴＥＩＭＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＥＹＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＭＱＥＶＹＥＹＳＬＥＤＧＴＶＩＲＡＴＰＥＨＫＦＭＴＥＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＮＬＤＬＫＣＬＧＴＬＥＬ（配列番号３９）

ＶＫＩＶＳＲＫＬＡＫＴＥＮＶＹＤＩＧＶＴＫＤＨＮＦＶＬＡＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号４０）

＞ＭｓｐＰＣＣ７１１３：／１－１３７Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓｓｐ．ＰＣＣ７１１３，

ＣＬＳＹＤＳＥＩＬＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＥＥＧＩＥＣＴＶＹＳＶＤＳＨＧＹＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＤＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＡＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＱＶＫＲＳＱＰ（配列番号４１）

ＶＫＩＶＲＲＫＳＬＧＩＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４２）

＞ＳｃｙＰＣＣ７４３７：／１－１３７ＳｔａｎｉｅｒｉａｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａＰＣＣ７４３７

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＫＥＱＩＥＣＮＶＹＴＶＮＱＮＧＦＩＹＰＱＡＩＡＱＷＨＥＲＧＫＱＥＩＦＥＹＴＬＤＮＧＬＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＱＲＩＮＤＹＳＮ（配列番号４３）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＫＱＰＶＹＤＩＧＶＴＫＤＨＮＦＬＬＳＮＧＶＶＡＳＮ（配列番号４４）

＞ＣｓｐＰＣＣ６３０３：／１－１３７Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ６３０３

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＷＥＹＧＦＬＫＩＧＥＩＶＥＫＱＩＬＣＳＶＦＳＶＤＥＱＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＬＱＥＬＦＡＹＱＬＥＤＧＧＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＡＩＤＥＩＦＥＲＱＬＤＬＦＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号４５）

ＶＫＩＩＳＲＫＶＬＫＴＥＮＶＹＤＩＧＬＥＧＤＨＮＦＩＩＫＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号４６）

＞Ｃｓｔ／１－１３４ＰＣＣ７２０２：ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｎｉｅｒｉＰＣＣ７２０２

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＶＬＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＱＣＴＶＹＳＶＤＱＹＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＥＬＥＮＧＡＴＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＴＳＤＧＱＭＬＰＩＤＱＩＦＥＱＧＬＤＬＦＭＶＳＦ（配列番号４７）

ＶＫＩＶＫＲＲＳＨＧＩＱＫＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＨＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４８）

＞ＣｓｐＡＴＣＣ５１１４２：／１－１３４Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＡＴＣＣ５１１４２

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＰＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＩＦＥＹＹＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＱＬＴＬ（配列番号４９）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＶＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＥＨＮＦＬＬＨＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号５０）

＞ＣｓｐＰＣＣ８８０１：／１－１３４Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＰＣＣ８８０１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＥＥＮＩＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＮＩＡＱＷＨＬＲＧＱＱＥＶＦＥＹＹＬＤＤＧＳＩＬＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＬＥＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＩＫＩ（配列番号５１）

ＶＫＩＶＳＹＲＳＬＧＫＱＦＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号５２）

＞Ａｓｐ：／１－１３６Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．９０ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＥＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＫＶＹＴＩＤＳＮＧＭＬＹＴＱＳＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＹＥＹＬＬＥＮＧＡＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＡＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＱＧＬＤＬＬＱＶＧＶＡＥ（配列番号５３）

ＶＫＩＶＳＲＴＹＶＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＥＳＤＨＮＦＶＩＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号５４）

＞Ａｈａ：／１－１３７Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＷＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＳＶＹＴＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＰＲＧＱＱＥＩＩＥＹＴＬＥＤＧＲＫＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＥＳＧＥＭＬＰＩＥＥＩＦＱＲＥＬＤＬＫＶＥＴＦＨＥＭ（配列番号５５）

ＶＫＩＩＫＲＱＳＬＧＲＱＮＶＹＤＶＣＶＥＴＤＨＮＦＶＬＡＮＧＣＶＡＳＮ（配列番号５６）

＞ＨｓｐＰＣＣ７４１８：／１－１３７Ｈａｌｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＰＣＣ７４１８

ＣＬＳＹＤＴＥＩＷＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＳＶＹＴＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＰＲＧＱＱＥＩＩＥＹＴＬＥＤＧＲＫＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＥＳＧＥＭＬＰＩＥＥＩＦＱＲＥＬＤＬＫＶＥＴＦＨＥＭ（配列番号５７）

ＶＫＩＩＫＲＱＳＬＧＲＱＮＶＹＤＩＧＶＥＴＤＨＮＦＶＬＡＮＧＣＶＡＳＮ（配列番号５８）

＞ＣａｐＰＣＣ１０６０５：／１－１３７ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｐｏｎｉｎｕｍＰＣＣ１０６０５

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＳＩＧＫＩＶＥＥＫＩＮＣＱＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＴＱＮＩＡＱＷＨＤＲＧＳＱＥＬＦＥＹＥＬＥＤＧＲＩＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＴＫＤＧＱＭＬＡＩＮＤＩＦＥＱＥＬＥＬＹＳＶＤＤＭＧＶ（配列番号５９）

ＶＫＩＶＫＲＲＳＬＧＶＱＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＩＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号６０）

＞Ｃａｔ：／１－１３３ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＡｔｅｌｏｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈａｌａｓｓａｉｓｏｌａｔｅ

ＣＬＳＹＤＴＫＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＶＶＱＥＮＩＲＣＲＶＹＴＴＮＤＱＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＩＦＥＹＨＬＤＤＫＴＩＩＲＡＴＫＥＨＱＦＭＴＶＤＨＶＭＭＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＥＬＫＫＩＫ（配列番号６１）

ＬＫＩＩＲＲＫＳＬＧＭＨＥＶＦＤＩＧＬＥＫＤＨＮＦＶＬＳＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号６２）

＞Ｏｌｉ：／１－１３７Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｉｍｎｅｔｉｃａ ’ＳｏｌａｒＬａｋｅ’ ＤｎａＥｐｒｅｃｕｒｓｏｒ

ＣＬＳＹＮＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＤＥＱＩＨＣＲＶＹＳＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＹＱＥＩＦＡＹＥＬＡＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＥＤＧＱＭＦＰＩＤＥＩＷＥＫＧＬＤＬＫＫＬＰＴＶＱＤ（配列番号６３）

ＶＫＩＶＲＲＱＳＬＧＶＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＳＧＥＩＡＳＮ（配列番号６４）

＞Ｃｅｎ：／１－１３７ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔｏｆＥｐｉｔｈｅｍｉａｔｕｒｇｉｄａ

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＲＭＶＥＥＳＬＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＳＩＱＱＷＨＳＲＧＱＱＥＩＦＥＹＣＦＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＡＥＧＫＭＳＳＩＨＤＩＦＥＱＧＬＥＬＫＫＩＩＰＷＳＧ（配列番号６５）

ＡＫＩＩＳＣＫＳＬＧＫＱＳＶＹＤＩＧＶＶＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＶＶＡＳＮ（配列番号６６）

＞ＳｓｐＰＣＣ７５０２：／１－１３３Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７５０２

ＣＬＧＹＤＴＰＶＬＴＶＥＹＧＦＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＱＣＨＶＹＳＶＤＱＮＧＬＶＦＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＷＥＹＮＬＤＮＧＤＩＶＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＮＱＩＦＥＱＧＬＥＬＫＶＩＡ（配列番号６７）

ＶＫＩＶＳＣＫＰＬＲＶＱＴＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＩＬＤＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号６８）

＞ＤｓａＰＣＣ８３０５：／１－１３４ＤａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓｓａｌｉｎａＰＣＣ８３０５

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＥＥＹＧＡＩＰＩＧＫＩＶＥＥＲＭＮＣＨＶＹＳＶＤＥＮＧＦＩＹＳＱＰＩＡＱＷＨＰＲＧＥＱＥＶＶＥＹＴＬＥＤＧＫＩＩＲＡＴＡＤＨＫＭＭＴＥＴＧＥＭＬＰＩＥＱＩＦＱＱＱＬＤＬＫＩＳＮＱ（配列番号６９）

ＶＫＩＩＮＲＱＳＬＧＫＱＴＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＩＬＧＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号７０）

＞ＣｓｔＰＣＣ７４１７：／１－１３７ＣｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍｓｔａｇｎａｌｅＰＣＣ７４１７

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＳＶＤＮＨＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＬＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＫＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＲＶＥＧＬＰＩ（配列番号７１）

ＶＫＩＩＭＲＳＹＶＧＲＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＡＫＮＧＬＩＡＡＮ（配列番号７２）

＞ＳｓｐＰＣＣ６８０３：／１－１３７Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６８０３

ＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱ（配列番号７３）

ＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮ（配列番号７４）

＞ＧｓｐＰＣＣ７４０７：／１－１３７Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａｓｐ．ＰＣＣ７４０７

ＣＬＳＹＥＴＰＶＭＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＲＩＶＥＥＱＬＤＣＴＶＹＳＶＤＥＱＧＨＶＹＴＱＰＶＡＱＷＨＨＲＧＬＱＥＶＶＥＹＥＬＥＤＧＲＲＬＲＡＴＡＤＨＲＦＭＴＥＴＧＥＭＬＰＬＡＥＩＦＥＲＧＬＥＬＲＱＶＡＬＲＶＰ（配列番号７５）

ＶＫＩＶＳＲＲＳＬＧＭＱＬＶＹＤＩＧＶＡＡＤＨＮＦＶＬＡＤＧＬＩＡＡＮ（配列番号７６）

＞ＳｓｐＰＣＣ６７１４：／１－１３７Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６７１４

ＣＬＳＦＤＡＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＳＩＧＫＩＶＧＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＱＧＲＩＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＶＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＰＤＨＲＦＬＴＴＤＹＥＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＭＤＬＬＴＬＴＮＬＫＬ（配列番号７７）

ＶＫＶＶＲＲＲＳＬＧＭＨＲＶＦＤＩＧＬＡＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮ（配列番号７８）

＞ＭａｅＰＣＣ７８０６：／１－１３５ＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＣＣ７８０６

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＶＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＮＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号７９）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号８０）

＞ＭａｅＮＩＥＳ８４３：／１－１３５ＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＮＩＥＳ－８４３ＤＮＡ

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＩＮＣＴＶＹＴＶＤＱＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号８１）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号８２）

＞ＡｍａＭＢＩＣ１１０１７：／１－１３７ＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａＭＢＩＣ１１０１７，

ＣＬＳＹＤＴＰＶＬＴＬＥＹＧＷＬＰＩＧＱＶＶＱＥＱＩＥＣＱＶＦＳＩＮＥＲＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＴＬＡＤＧＳＴＩＱＡＴＡＥＨＱＦＭＴＴＤＧＱＭＹＰＶＱＱＩＦＥＥＧＬＳＬＫＱＬＰＬＰＷＱ（配列番号８３）

ＶＫＩＩＱＲＲＳＬＧＬＱＳＶＹＤＩＧＬＡＱＤＨＮＦＶＭＡＮＧＷＶＡＡＮ（配列番号８４）

＞ＬｓｐＰＣＣ７３７６：／１－１３７Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａｓｐ．ＰＣＣ７３７６

ＣＬＤＧＥＴＰＩＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＲＥＩＶＥＫＥＬＬＣＳＶＹＳＩＤＥＮＧＦＶＹＴＱＰＶＥＱＷＨＱＲＧＤＲＱＭＦＥＹＱＬＤＮＧＧＶＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＥＧＥＭＶＡＩＤＥＩＦＥＫＧＬＮＬＡＥＦＡＰＡＤ（配列番号８５）

ＶＫＩＬＲＲＨＳＩＧＫＡＫＴＹＤＩＧＶＳＫＮＨＮＦＬＬＡＮＧＬＦＡＳＮ（配列番号８６）

＞ＳｅｌＰＣＣ６３０１：／１－１３７ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＰＣＣ６３０１

ＣＬＡＡＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＩＡＩＧＫＬＶＥＥＮＩＲＣＱＶＹＣＣＮＰＤＧＹＩＹＳＱＰＩＧＱＷＨＱＲＧＥＱＥＶＩＥＹＥＬＳＤＧＲＩＩＲＡＴＡＤＨＲＦＭＴＥＥＧＥＭＬＳＬＤＥＩＦＥＲＳＬＥＬＫＱＩＰＴＰＬＬ（配列番号８７）

ＶＫＩＶＲＲＲＳＬＧＶＱＰＶＹＤＬＧＶＡＴＶＨＮＦＶＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号８８）

＞ＳｓｐＰＣＣ６３１２：／１－１３７Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ６３１２

ＣＬＳＡＤＴＥＬＹＴＶＥＹＧＷＬＰＩＧＲＬＶＥＥＱＩＥＣＱＶＬＳＶＮＡＨＧＨＶＹＳＱＰＩＡＱＷＨＲＲＡＷＱＥＶＦＥＹＱＬＥＴＧＧＴＩＫＡＴＴＤＨＱＦＬＴＴＤＧＱＭＹＲＩＥＤＩＦＱＲＧＬＤＬＷＱＬＰＰＤＲＦ（配列番号８９）

ＶＫＩＩＳＲＣＳＬＧＩＱＰＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＶＩＲＧＧＬＶＡＳＮ（配列番号９０）

＞Ｔｅｌ：／１－１３７ＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ－１ＤＮＡ

ＣＬＳＧＥＴＡＶＭＴＶＥＹＧＡＶＰＩＲＲＬＶＱＥＲＬＳＣＨＶＹＳＬＤＧＱＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＦＱＧＦＲＰＶＹＥＹＱＬＥＤＧＳＴＩＣＡＴＰＤＨＲＦＭＴＴＲＧＱＭＬＰＩＥＱＩＦＱＥＧＬＥＬＷＱＶＡＩＡＰＲ（配列番号９１）

ＧＫＩＶＧＲＲＬＭＧＷＱＡＶＹＤＩＧＬＡＡＤＨＮＦＶＬＡＮＧＡＩＡＡＮ（配列番号９２）

＞Ｔｓｐ：／１－１３７Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＮＫ５５ｇｅｎｏｍｅ

ＣＬＳＧＥＴＡＶＭＴＶＥＹＧＡＶＰＩＲＲＬＶＱＥＲＬＴＣＨＶＹＳＬＤＡＱＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＦＱＧＦＲＰＶＹＥＹＱＬＥＤＧＳＴＩＷＡＴＰＤＨＲＦＭＴＴＲＧＱＭＬＰＩＥＱＩＦＱＥＧＬＥＬＷＱＧＰＩＡＰＳ（配列番号９３）

ＣＫＩＶＧＲＱＬＶＧＷＱＡＶＹＤＩＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮ（配列番号９４）

＞Ｔｖｕ：／１－１３７ＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｖｕｌｃａｎｕｓＤｎａＥｐｒｅｃｕｒｓｏｒ

ＣＬＳＧＥＴＡＶＭＴＶＥＹＧＡＩＰＩＲＲＬＶＱＥＲＬＩＣＱＶＹＳＬＤＰＱＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＦＱＧＦＲＰＶＹＡＹＱＬＥＤＧＳＴＩＣＡＴＰＤＨＲＦＭＴＴＳＧＱＭＬＰＩＥＱＩＦＲＥＧＬＥＬＷＱＶＡＩＡＰＰ（配列番号９５）

ＣＫＩＶＧＲＲＬＶＧＷＱＡＶＹＤＩＧＬＡＧＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮ（配列番号９６）

＞ＳｓｐＰＣＣ７００２：／１－１３７Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７００２

ＣＬＡＧＧＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＡＱＬＩＥＱＷＨＱＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＲＦＬＴＴＴＧＥＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬＡＡＷＡＶＰＤＳ（配列番号９７）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＩＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＡＮ（配列番号９８）

＞ＳｈｏＰＣＣ７１１０：／１－１３６ＳｃｙｔｏｎｅｍａｈｏｆｍａｎｎｉＰＣＣ７１１０ｃｏｎｔｉｇ００１３６

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＡＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＡＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＤＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＱＱＥＶＦＥＹＳＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＭＲＩＤＳＬＰ（配列番号９９）

ＶＫＩＬＴＲＫＳＩＧＫＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１００）

＞ＷｉｎＵＨＨＴ２９１／１－１３６ＷｅｓｔｉｅｌｌａｉｎｔｒｉｃａｔａＵＨＨＴ－２９－１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＴＮＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＡＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＶＫＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰ（配列番号１０１）

ＶＫＩＩＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１０２）

＞ＦｓｐＰＣＣ９６０５：／１－１３６Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｓｐ．ＰＣＣ９６０５ＦＩＳ９６０５ＤＲＡＦＴ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＮＮＧＮＶＹＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＫＮＬＰ（配列番号１０３）

ＶＫＩＶＴＲＲＰＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＳＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１０４）

＞ＭｒｅＰＣＣ１０９１４：／１－１３７ＭａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓｒｅｐｅｎｓＰＣＣ１０９１４

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＳＩＥＣＳＶＹＴＶＤＳＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＨＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＭＫＩＱＧＬＰＥ（配列番号１０５）

ＡＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＴＲＤＧＦＩＡＳＮ（配列番号１０６）

＞ＳｈｏＵＴＥＸ２３４９：／１－１３７［Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｈｏｆｍａｎｎｉ］ＵＴＥＸ２３４９

ＣＬＳＹＮＳＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＧＩＥＣＳＶＹＳＶＤＳＹＧＫＩＹＴＱＶＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＴＩＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＭＱＶＱＧＬＰＤ（配列番号１０７）

ＶＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＳＳＤＨＮＦＶＭＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１０８）

＞ＡｓｐＰＣＣ７１０８：／１－１３７Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．ＰＣＣ７１０８Ａｎａ７１０８ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２＿Ｃｏｎｔ３

ＣＬＳＳＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＧＥＩＩＥＫＲＩＤＣＳＶＦＳＶＤＫＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＩＱＥＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＡＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＫＶＨＮＬＰＱ（配列番号１０９）

ＶＫＩＩＴＲＮＹＶＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１１０）

＞ＦｓｐＰＣＣ９３３９：／１－１３７Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｓｐ．ＰＣＣ９３３９ＰＣＣ９３３９ＤＲＡＦＴ

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＨＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＥＬＤＬＬＱＶＴＧＬＶＮ（配列番号１１１）

ＶＫＩＶＴＲＲＬＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１１２）

＞Ｃｓｐ３３６：／１－１３７Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．３３６／３

ＣＬＳＹＤＴＥＩＦＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＬＥＣＴＶＬＴＶＤＮＨＧＮＩＹＳＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＱＩＹＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＱＶＴＮＬＤＮ（配列番号１１３）

ＶＫＶＩＴＲＫＬＡＤＴＥＮＶＹＤＩＧＶＥＮＨＨＮＦＬＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１１４）

＞ＦｔｈＰＣＣ７５２１：／１－１３６ＦｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｔｈｅｒｍａｌｉｓＰＣＣ７５２１

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＴＶＤＮＮＧＹＶＣＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＲＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＴＧＬＰ（配列番号１１５）

ＶＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１１６）

＞ＣｙａＰＣＣ７７０２／１－１３７ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＰＣＣ７７０２Ｃｈｌ７７０２

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＳＩＧＥＩＶＥＫＥＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＥＱＧＥＱＥＩＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＥＧＥＭＬＰＩＤＱＩＦＡＲＱＬＤＬＭＱＩＴＧＬＰＱ（配列番号１１７）

ＶＫＩＳＴＫＫＳＬＧＫＱＫＶＹＤＩＧＶＶＲＤＨＮＦＩＩＫＮＧＦＶＡＳＮ（配列番号１１８）

＞ＦｓｐＰＣＣ９４３１：／１－１３６Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｓｐ．ＰＣＣ９４３１

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＴＮＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＤＥＱＥＶＦＥＹＡＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＫＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰ（配列番号１１９）

ＶＫＩＶＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１２０）

＞ＦｍｕＰＣＣ７４１４：／１－１３７ＦｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｍｕｓｃｉｃｏｌａＰＣＣ７４１４

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＴＶＤＮＮＧＹＶＣＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＲＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号１２１）

ＶＫＩＩＴＲＱＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１２２）

＞ＦｍｕＰＣＣ７３１０３：／１－１３７ＦｉｓｃｈｅｒｅｌｌａｍｕｓｃｉｃｏｌａＳＡＧ１４２７－１＝ＰＣＣ７３１０３

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＴＩＥＣＮＶＦＴＶＤＳＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＥＬＤＬＬＱＶＴＧＬＩＮ（配列番号１２３）

ＶＫＩＶＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１２４）

＞Ｌａｅ：／１－１３７ＬｙｎｇｂｙａａｅｓｔｕａｒｉｉＢＬＪｌａｅｓｔ３．ｃｏｎｔｉｇ．３

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＤＥＫＩＥＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＶＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＤＮＱＭＬＰＩＤＥＩＬＥＫＧＬＥＬＫＱＶＮＡＤＳＶ（配列番号１２５）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＤＳＱＴＶＹＤＩＧＶＥＴＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号１２６）

＞ＭｓｐＰＣＣ７１２６：／１－１３５Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅｓｐ．ＰＣＣ７１２６

ＣＬＳＹＫＴＱＶＬＴＶＥＹＧＬＬＡＩＧＥＩＶＥＫＮＩＥＣＳＶＦＳＶＤＩＨＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＱＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＫＧＶ（配列番号１２７）

ＶＫＩＩＴＲＫＹＩＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＱＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＡＮ（配列番号１２８）

＞Ｌｓｐ：／１－１３７Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａｓｐ．ＪＳＣ－１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＬＰＩＧＫＩＶＥＮＱＭＩＣＳＶＹＳＩＤＮＮＧＹＩＹＩＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＩＬＥＤＧＳＩＩＲＳＴＫＤＨＫＦＭＴＫＧＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＡＱＶＴＲＬＥＱ（配列番号１２９）

ＶＫＩＩＳＲＲＳＶＧＶＱＳＶＹＤＩＧＶＫＱＤＨＮＦＦＬＲＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１３０）

＞ＣｗａＷＨ８５０１：／１－１３７ＣｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａｗａｔｓｏｎｉｉＷＨ８５０１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＭＹＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＩＦＥＹＤＬＥＤＧＳＫＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＮＬＤＬＫＱＶＶＳＨＰＤ（配列番号１３１）

ＶＫＩＩＧＣＲＳＬＧＴＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号１３２）

＞ＣｃｈＰＣＣ７４２０：／１－１３５ＣｏｌｅｏｆａｓｃｉｃｕｌｕｓｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓＰＣＣ７４２０（Ｍｃｈｔ）

ＣＬＳＹＤＴＱＩＬＴＶＥＹＧＡＶＡＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＴＶＹＳＶＤＥＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＬＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＤＥＤＱＭＬＰＩＤＱＩＦＥＱＧＬＥＬＫＱＶＥＶＬ（配列番号１３３）

ＶＫＩＩＧＲＫＰＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＦＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号１３４）

＞ＣｓｐＰＣＣ６７１２／１－１３３

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＡＣＮＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＹＨＤＲＧＩＱＥＶＦＥＹＲＬＥＮＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＡＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＫＱＮＬＤＬＫＱＬＮ（配列番号１３５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＫＱＳＶＦＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１３６）

＞ＡｆｌＮＩＥＳ８１：／１－１３２Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｆｌｏｓ－ａｑｕａｅＮＩＥＳ－８１

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＱＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＫＶＹＴＶＤＳＮＧＩＬＹＴＱＳＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＹＥＹＬＬＥＮＧＡＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＳＱＧＬＤＬＬＱＶ（配列番号１３７）

ＶＫＩＩＳＲＴＹＶＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＥＮＤＨＮＦＶＩＫＮＧＦＩＡＡＮ（配列番号１３８）

＞Ｒｂｒ：／１－１３７ＲａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓｂｒｏｏｋｉｉＤ９Ｄ９＿５，

ＣＬＳＹＥＴＥＶＬＴＬＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＤＫＱＭＶＣＴＶＦＳＶＮＤＳＧＮＶＹＴＱＰＩＧＱＷＨＤＲＧＶＱＥＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＱＧＥＭＶＰＩＤＥＩＦＨＱＧＷＥＬＶＱＶＳＧＴＭＮ（配列番号１３９）

ＶＫＩＶＳＲＲＹＬＧＫＡＤＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＩＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１４０）

＞ＣｓｐＣＣｙ０１１０：／１－１３４Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＣＣＹ０１１０１１０１６７６６４４６０４

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＳＶＹＴＶＮＫＮＧＦＶＹＴＱＳＩＡＱＷＨＨＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＥＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＫＬＴＶ（配列番号１４１）

ＶＫＩＩＥＲＲＳＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＳＮＮＬＩＡＳＮ（配列番号１４２）

＞ＸｓｐＰＣＣ７３０５：／１－１３５Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７３０５

ＣＬＳＡＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＩＳＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＡＮＧＦＶＹＴＱＥＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＭＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＬＭＴＩＤＧＱＭＶＡＩＤＥＩＦＳＱＧＬＥＬＫＱＶＬＧＬ（配列番号１４３）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＴＱＴＶＹＤＬＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＴＶＡＳＮ（配列番号１４４）

＞ＰｓｐＰＣＣ７３１９：／１－１３５Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｓｐ．ＰＣＣ７３１９

ＣＬＳＹＤＴＥＩＹＴＶＥＹＧＡＬＰＩＧＫＩＶＥＳＲＩＫＣＴＶＬＴＶＤＫＮＧＬＶＹＳＱＰＩＶＱＷＨＤＲＧＩＱＥＶＦＥＹＴＬＤＮＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＬＧＬＥＬＫＥＩＱＱＦ（配列番号１４５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＫＱＳＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＭＶＡＳＮ（配列番号１４６）

＞ＣｒａＣＳ５０５：／１－１３７ＣｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉＣＳ－５０５

ＣＬＳＹＥＴＥＶＬＴＬＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＮＫＱＭＶＣＴＶＦＳＬＮＤＳＧＮＶＹＴＱＰＩＧＱＷＨＤＲＧＶＱＤＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＱＧＥＭＶＰＩＤＥＩＦＨＱＧＷＥＬＶＱＶＳＧＩＳＫ（配列番号１４７）

ＶＫＩＶＳＲＲＹＬＧＫＡＤＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＩＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１４８）

＞ＳｍａＰＣＣ６３１３／１－１２９ＳｐｉｒｕｌｉｎａｍａｊｏｒＰＣＣ６３１３

ＣＬＴＹＤＴＬＶＬＴＶＥＹＧＰＶＰＩＧＫＬＶＥＡＱＩＮＣＱＶＹＳＶＤＡＮＧＦＩＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＱＲＱＶＹＥＹＴＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＰＤＨＫＦＭＴＡＴＧＥＭＬＰＩＤＱＩＦＥＱＧＬＤＬ（配列番号１４９）

ＶＫＩＩＨＲＲＡＬＰＰＱＳＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＰＳＧＷＶＡＳＮ（配列番号１５０）

＞ＳｓｕＰＣＣ９４４５：／１－１３１ＳｐｉｒｕｌｉｎａｓｕｂｓａｌｓａＰＣＣ９４４５

ＣＬＳＹＤＴＫＩＩＴＶＥＹＧＡＩＡＩＧＴＩＶＥＱＧＬＨＣＨＶＹＳＶＤＰＮＧＦＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＱＲＧＥＱＥＶＦＡＹＴＬＥＮＧＳＩＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＱＧＫＭＬＰＩＤＴＩＦＥＱＧＬＤＬＬＱ（配列番号１５１）

ＶＫＩＩＫＲＴＳＬＧＶＲＰＶＹＤＩＧＶＩＱＤＨＮＦＬＬＥＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１５２）

＞ＭａｅＰＣＣ９８０７：／１－１３５Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ９８０７

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＩＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号１５３）

ＶＫＩＩＳＲＱＦＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１５４）

＞ＭｓｐＧＩ１：／１－１３０Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａｓｐ．ＧＩ１ｃｏｎｔｉｇ＿１３

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＬＫＹＧＡＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＮＣＨＶＹＴＲＡＥＳＧＦＦＹＩＱＳＩＥＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＡＴＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬ（配列番号１５５）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＫＱＰＶＹＤＬＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＴＶＡＳＮ（配列番号１５６）

＞ＬｓｐＰＣＣ６４０６：／１－１３６Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａｓｐ．ＰＣＣ６４０６

ＣＬＳＡＤＴＱＬＬＴＶＥＹＧＰＬＥＩＧＲＩＶＥＥＱＩＡＣＨＶＹＳＶＤＡＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＳＲＧＥＱＥＩＦＥＹＱＬＥＤＧＲＴＬＲＡＴＡＤＨＫＦＭＴＴＴＧＥＭＧＲＩＮＤＩＦＥＱＧＬＤＬＫＱＩＤＬＰＱ（配列番号１５７）

ＶＫＶＶＳＲＱＳＬＧＶＱＰＶＹＤＩＧＶＡＴＤＨＮＦＬＬＡＤＧＬＶＡＳＮ（配列番号１５８）

＞ＡｓｐＣＣＭＥＥ５４１０：／１－１３２Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｓｐ．ＣＣＭＥＥ５４１０

ＣＬＳＹＤＴＰＶＬＴＬＥＹＧＷＬＰＩＧＱＶＶＱＥＱＩＥＣＱＶＦＳＩＮＥＲＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＴＬＴＤＧＳＴＩＱＡＴＡＥＨＱＦＭＴＴＤＧＱＭＹＰＩＱＱＩＦＥＥＧＬＳＬＫＱＬ（配列番号１５９）

ＶＫＩＴＱＲＲＳＬＧＬＱＳＶＹＤＩＧＬＡＱＤＨＮＦＶＩＡＮＧＷＶＡＡＮ（配列番号１６０）

＞ＧｈｅＰＣＣ６３０８：／１－１３３ＧｅｍｉｎｏｃｙｓｔｉｓｈｅｒｄｍａｎｉｉＰＣＣ６３０８

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＦＧＡＩＰＭＧＫＩＶＥＥＲＬＮＣＱＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＴＱＮＩＡＱＷＨＤＲＧＶＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＲＩＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＩＥＮＣＥＭＶＥＩＤＲＩＦＥＥＧＬＥＬＦＥＶＮ（配列番号１６１）

ＶＫＩＬＫＲＲＳＩＳＳＱＱＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６２）

＞ＮｎｏＰＣＣ７１０４：／１－１３３ＮｏｄｏｓｉｌｉｎｅａｎｏｄｕｌｏｓａＰＣＣ７１０４

ＣＬＳＡＤＴＥＬＬＴＬＥＹＧＰＬＴＩＧＥＩＶＡＫＲＩＰＣＨＶＦＳＶＤＥＳＧＹＶＹＴＱＰＶＡＱＷＨＱＲＧＨＱＥＶＦＥＹＱＬＤＤＧＴＴＩＲＡＴＡＤＨＱＦＭＴＥＬＧＥＭＭＡＩＤＥＩＦＱＲＧＬＥＬＫＱＶＥ（配列番号１６３）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＶＱＰＶＹＤＩＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＤＧＱＶＡＳＮ（配列番号１６４）

＞ＲｌａＫＯＲＤＩ５１－２：／１－１３７ＲｕｂｉｄｉｂａｃｔｅｒｌａｃｕｎａｅＫＯＲＤＩ５１－２

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＬＡＩＧＴＩＶＳＥＲＬＡＣＴＶＹＴＶＤＲＳＧＦＬＹＡＱＡＩＳＱＷＨＥＲＧＲＱＤＶＦＥＹＡＬＤＮＧＭＴＩＲＡＴＫＤＨＫＬＭＴＡＤＧＱＭＶＡＩＤＤＩＦＴＱＧＬＴＬＫＡＩＤＴＡＡＦ（配列番号１６５）

ＭＫＩＶＳＲＫＳＬＧＶＱＨＶＹＤＩＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＳＮ（配列番号１６６）

＞ＣｆｒＰＣＣ９２１２／１－１３６ＣｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓｆｒｉｔｓｃｈｉｉＰＣＣ９２１２

ＣＬＳＹＤＴＡＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＬＦＥＹＳＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＫＬＥＬＭＱＶＫＧＬＰ（配列番号１６７）

ＶＫＩＩＡＫＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６８）

＞ＲｉｎＨＨ０１：／１－１３７ＲｉｃｈｅｌｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓＨＨ０１ＷＧＳｐｒｏｊｅｃｔ

ＣＬＳＹＤＴＱＩＬＴＶＥＨＧＰＭＳＩＧＥＩＶＥＫＣＬＥＣＨＶＹＴＶＮＫＮＧＮＩＣＩＱＴＩＴＱＷＨＦＲＧＥＱＥＩＦＥＹＥＬＥＤＧＳＦＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＴＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＴＮＧＬＥＩＬＱＬＳＫＳＬＬ（配列番号１６９）

ＶＫＩＬＡＲＫＳＬＧＴＱＫＶＹＤＩＧＶＮＤＤＨＮＦＡＬＳＮＳＦＩＡＳＮ（配列番号１７０）

＞ＳｓｐＰＣＣ７１１７／１－１３７

ＣＬＡＧＤＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＱＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＴＱＰＩＥＱＷＨＮＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＴＧＥＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬＡＡＷＡＶＰＤＳ（配列番号１７１）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＩＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＡＮ（配列番号１７２）

＞ＳｓｐＰＣＣ８８０７／１－１３７

ＣＬＡＧＤＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＴＱＰＩＥＱＷＨＱＲＧＤＲＦＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＴＧＫＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬＡＡＷＡＶＰＤＳ（配列番号１７３）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＩＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＦＩＡＡＮ（配列番号１７４）

＞ＳｓｐＮＫＢＧ０４２９０２：／１－１３７Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＮＫＢＧ０４２９０２

ＣＬＡＧＤＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＴＱＰＩＥＱＷＨＱＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＴＧＥＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬＡＡＷＡＶＰＤＳ（配列番号１７５）

ＶＫＩＬＲＲＫＦＩＧＲＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＶＡＡＮ（配列番号１７６）

＞ＳｓｐＮＫＢＧ１５０４１：／１－１２９Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＮＫＢＧ１５０４１

ＣＬＡＧＤＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＲＴＩＶＤＱＥＬＬＣＨＶＹＳＬＤＰＱＧＦＩＹＡＱＰＶＥＱＷＨＲＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＴＧＡＶＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＡＴＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＶＲＮＬＤＬ（配列番号１７７）

ＶＫＩＩＲＲＮＬＩＧＥＡＡＴＹＤＩＧＬＧＫＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＳＮ（配列番号１７８）

＞ＳｓｐＰＣＣ７３１０９／１－１３０

ＣＬＡＧＧＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＴＱＰＩＥＱＷＨＱＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＴＧＥＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬＬ（配列番号１７９）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＩＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＡＮ（配列番号１８０）

＞ＳｓｐＰＣＣ７００３／１－１３０

ＣＬＡＧＤＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＴＱＰＩＥＱＷＨＫＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＩＩＲＡＴＰＤＨＫＦＬＴＴＴＧＥＭＲＰＩＤＥＩＦＡＫＮＬＳＬＬ（配列番号１８１）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＶＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＡＮ（配列番号１８２）

＞ＣｓｐＰＣＣ８８０２／１－１３４：Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＰＣＣ８８０２

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＥＥＮＩＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＮＩＡＱＷＨＬＲＧＱＱＥＶＦＥＹＹＬＤＤＧＳＩＬＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＬＥＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＩＫＩ（配列番１８３）

ＶＫＩＶＳＹＲＳＬＧＫＱＦＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号１８４）

＞ＳｅｌＰＣＣ７９４２：／１－１３７ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＰＣＣ７９４２

ＣＬＡＡＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＩＡＩＧＫＬＶＥＥＮＩＲＣＱＶＹＣＣＮＰＤＧＹＩＹＳＱＰＩＧＱＷＨＱＲＧＥＱＥＶＩＥＹＥＬＳＤＧＲＩＩＲＡＴＡＤＨＲＦＭＴＥＥＧＥＭＬＳＬＤＥＩＦＥＲＳＬＥＬＫＱＩＰＴＰＬＬ（配列番号１８５）

ＶＫＩＶＲＲＲＳＬＧＶＱＰＶＹＤＬＧＶＡＴＶＨＮＦＶＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１８６）

＞ＣｆｒＰＣＣ６９１２：／１－１３７ＣｈｌｏｒｏｇｌｏｅｐｏｓｉｓｆｒｉｔｓｃｈｉｉＰＣＣ６９１２

ＣＬＳＹＤＴＡＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＬＦＥＹＳＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＫＬＥＬＭＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号１８７）

ＶＫＩＩＡＫＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１８８）

＞ＣｓｐＡＴＣ５１４７２：／１－１３２Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．ＡＴＣＣ５１４７２

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＰＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＩＦＥＹＹＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＱＬ（配列番号１８９）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＶＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＥＨＮＦＬＬＨＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号１９０）

＞Ｌｍａ：／１－１３２Ｌｙｎｇｂｙａｍａｊｕｓｃｕｌａ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＩＴＶＥＹＧＰＩＡＩＧＥＩＶＥＫＧＩＰＣＴＶＹＳＶＤＳＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＧＧＬＥＬＫＱＬ（配列番号１９１）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＫＤＤＨＮＦＩＬＡＮＧＭＶＡＳＮ（配列番号１９２）

＞ＣｓｐＥＳＦＣ／１－１３７

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＶＰＩＧＫＬＶＥＥＫＬＮＣＳＶＹＴＶＤＰＮＧＹＩＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＩＱＥＶＦＥＹＱＬＥＤＮＴＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＤＨＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＣＰＱＰＱＱ（配列番号１９３）

ＶＫＩＩＲＲＲＳＬＧＦＱＰＶＹＤＩＧＬＥＱＤＨＮＦＬＬＮＱＧＡＩＡＳＮ（配列番号１９４）

＞ＳｓｐＰＣＣ７００２：／１－１２９Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７００２

ＣＬＡＧＧＴＰＶＶＴＶＥＹＧＶＬＰＩＱＴＩＶＥＱＥＬＬＣＨＶＹＳＶＤＡＱＧＬＩＹＡＱＬＩＥＱＷＨＱＲＧＤＲＬＬＹＥＹＥＬＥＮＧＱＭＩＲＡＴＰＤＨＲＦＬＴＴＴＧＥＬＬＰＩＤＥＩＦＴＱＮＬＤＬ（配列番号１９５）

ＶＫＩＩＲＲＫＦＩＧＨＡＰＴＹＤＩＧＬＳＱＤＨＮＦＬＬＧＱＧＬＩＡＡＮ（配列番号１９６）

＞ＡｍａＭＢＩＣ１１０１７：／１－１３２ＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａＭＢＩＣ１１０１７

ＣＬＳＹＤＴＰＶＬＴＬＥＹＧＷＬＰＩＧＱＶＶＱＥＱＩＥＣＱＶＦＳＩＮＥＲＧＨＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＴＬＡＤＧＳＴＩＱＡＴＡＥＨＱＦＭＴＴＤＧＱＭＹＰＶＱＱＩＦＥＥＧＬＳＬＫＱＬ（配列番号１９７）

ＶＫＩＩＱＲＲＳＬＧＬＱＳＶＹＤＩＧＬＡＱＤＨＮＦＶＭＡＮＧＷＶＡＡＮ（配列番号１９８）

＞Ｍａｅ９０５：／１－１２９ＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＤＩＡＮＣＨＩ９０５

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＶＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＮＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬ（配列番号１９９）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２００）

＞ＡｃｉＡＷＱＣ３１０Ｆ：／１－１２５ＡＷＱＣ：ＡｎａｂａｅｎａｃｉｒｃｉｎａｌｉｓＡＷＱＣ３１０Ｆ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＥＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＫＶＹＴＶＤＳＮＧＩＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＹＥＹＬＬＥＮＧＡＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＡＧＥＭＬＰＩＤＤＩＦＴＱ（配列番号２０１）

ＶＫＩＩＳＲＴＹＶＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＥＮＤＨＮＦＶＩＫＮＧＦＶＡＡＮ（配列番号２０２）

＞ＡｃｉＡＷＱＣ１３１Ｃ：／１－１２５ＡｎａｂａｅｎａｃｉｒｃｉｎａｌｉｓＡＷＱＣ１３１Ｃ

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＥＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＲＶＹＴＶＤＳＮＧＩＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＹＲＧＱＱＥＶＹＥＹＬＬＥＮＧＡＩＩＲＡＴＫＤＨＮＦＭＴＥＡＧＥＭＬＰＩＤＤＩＦＴＱ（配列番号２０３）

ＩＫＩＩＳＲＫＹＶＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＥＮＤＨＮＦＶＩＫＮＧＦＶＡＡＮ（配列番号２０４）

＞ＣｓｐＵＣＹＮ：／１－１２４Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＵＣＹＮ－Ａ２

ＣＬＳＹＤＴＫＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＶＶＱＥＮＩＲＣＲＶＹＴＴＮＤＱＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＩＦＥＹＨＬＤＤＫＴＩＩＲＡＴＫＥＨＱＦＭＴＶＤＨＶＭＭＰＩＤＥＩＦＥＱ（配列番号２０５）

ＫＩＩＲＲＫＳＬＧＭＨＥＶＦＤＩＧＬＥＫＤＨＮＦＶＬＳＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２０６）

＞Ｐｓｔ：／１－１２９Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘｓｔ１４７：ｓｔ１４７＿ｃｌｅａｎＤＲＡＦＴ＿ｃ６

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＳＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２０７）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＶＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２０８）

＞ＰｌａＣＹＡ９８／１－１２９：ＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘＮＩＶＡ－ＣＹＡ９８

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＫＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＱＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２０９）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＬＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２１０）

＞ＦｄｉＵＴＥＸ４８１：／１－１３７ＦｒｅｍｙｅｌｌａｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎＵＴＥＸ４８１

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＬＥＣＳＶＹＳＶＤＩＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＡＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＱＶＰＨＬＰＥ（配列番号２１１）

ＶＫＩＶＴＲＲＡＩＧＡＡＮＶＹＤＩＧＶＥＱＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＡＮ（配列番号２１２）

＞Ｐｓｔ５８５：／１－１２９Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘｓｐ．５８５：Ｌｅｎｇｔｈ＝１５８６９９７

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＳＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２１３）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＶＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２１４）

＞ＮｐｕＰＣＣ７３１０２／１－１３７

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号２１５）

ＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号２１６）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＦＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＦＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＫＱＶＫＳＩＱＮ（配列番号２１７）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＩＱＰＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＫＦＶＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２１８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＹＩＰＩＧＥＩＶＥＫＡＩＥＣＳＶＹＳＶＤＮＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＱＥＬＤＬＬＱＶＨＧＬＰＫ（配列番号２１９）

ＶＫＩＴＡＲＫＦＶＧＲＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＹＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２２０）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＩＦＳＶＤＫＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＲＱＥＩＹＥＹＣＬＤＤＧＳＫＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＡＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＤＬＤＬＬＫＶＥＧＬＰＥ（配列番号２２１）

ＶＫＩＩＳＲＱＹＬＧＱＡＤＶＹＤＩＧＶＥＥＤＨＮＦＡＩＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号２２２）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＲＶＦＳＶＤＮＨＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＧＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰＥ（配列番号２２３）

ＶＫＶＩＴＲＫＹＩＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＬＤＨＮＦＡＩＲＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２２４）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＦＳＶＡＳＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＩＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＣＥＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰＥ（配列番号２２５）

ＶＫＶＶＴＲＫＹＩＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＲＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２２６）

＞Ｎａｚ０７０８：／１－１３７ ’Ｎｏｓｔｏｃａｚｏｌｌａｅ’ ０７０８

ＣＬＳＹＫＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＬＦＳＶＤＥＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＶＱＥＶＹＥＹＣＬＤＤＧＴＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＩＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＤＬＮＬＬＱＶＮＧＬＰＴ（配列番号２２７）

ＶＫＩＩＳＲＱＦＬＧＰＡＮＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２２８）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＳＶＦＳＩＮＮＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＫＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号２２９）

ＩＫＩＡＳＲＫＦＬＧＶＥＮＶＹＤＩＧＶＲＲＤＨＮＦＦＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２３０）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＤＫＧＩＥＣＳＶＦＳＩＤＳＮＧＩＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＫＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＤＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＥＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号２３１）

ＩＫＩＡＳＲＫＦＬＧＶＥＮＶＹＤＩＧＶＧＲＤＨＮＦＦＶＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２３２）

ＣＬＳＹＤＴＫＩＬＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＤＣＴＶＹＴＶＮＱＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＫＱＥＩＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＫＩＦＥＫＧＬＤＬＫＴＩＮＣＤ（配列番号２３３）

ＶＫＩＬＳＲＫＳＬＧＩＱＳＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２３４）

ＣＬＳＹＥＴＱＩＭＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＤＣＴＶＹＴＶＮＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＥＬＫＱＩＨＬＳ（配列番号２３５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＩＱＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＩＳＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号２３６）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＬＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＤＤＧＱＭＬＰＩＥＥＩＦＥＫＧＬＥＬＫＱＩＩＬ（配列番号２３７）

ＶＫＩＩＳＲＱＬＡＧＮＱＴＶＹＤＬＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２３８）

ＣＬＳＹＤＴＱＶＬＴＶＥＹＧＬＶＰＩＧＥＩＶＥＫＱＬＥＣＳＶＦＴＩＤＧＨＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＬＱＶＱＧＬＲＷ（配列番号２３９）

ＶＫＩＩＴＲＫＹＩＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＶＩＥＮＲＬＩＡＳＮ（配列番号２４０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＧＩＥＣＮＶＹＳＶＤＫＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＮＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＳＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＩＲＶＥＤＬＰ（配列番号２４１）

ＶＫＩＬＴＲＫＳＩＧＫＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号２４２）

ＣＬＳＡＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＧＫＡＩＥＣＲＶＹＳＶＤＧＮＧＮＩＹＴＱＳＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＥＭＬＰＩＤＥＸＦＡＲＱＬＤＬＭＱＶＱＧＬＨ（配列番号２４３）

ＶＫＩＴＡＲＫＦＶＧＲＥＮＶＹＤＩＧＶＥＨＨＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２４４）

ＣＬＳＹＤＴＫＩＬＴＶＥＹＧＰＭＡＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＳＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＳＩＡＱＷＨＲＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＤＬＫＱＩＮＳＳＳＤ（配列番号２４５）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＥＶＹＤＩＧＶＥＲＥＨＮＦＩＬＥＮＳＬＶＡＳＮ（配列番号２４６）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＥＥＦＧＬＩＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＤＣＴＶＹＳＶＤＶＮＧＮＶＹＳＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＭＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＥＭＬＡＩＤＥＩＦＥＫＧＬＥＬＫＲＶＧＩＹ（配列番号２４７）

ＶＫＩＩＳＲＫＶＬＫＴＥＮＶＹＤＩＧＬＥＧＤＨＮＦＩＩＫＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号２４８）

ＣＬＳＹＤＳＥＩＬＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＥＥＧＩＥＣＴＶＹＳＶＤＳＨＧＹＬＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＥＶＦＥＹＤＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＡＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＱＶＫＲＳＱＰ（配列番号２４９）

ＶＫＩＶＲＲＫＳＬＧＩＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２５０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＫＥＱＩＥＣＮＶＹＴＶＮＱＮＧＦＩＹＰＱＡＩＡＱＷＨＥＲＧＫＱＥＩＦＥＹＴＬＤＮＧＬＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＱＲＩＮＤＹＳＮ（配列番号２５１）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＫＱＰＶＹＤＩＧＶＴＫＤＨＮＦＬＬＳＮＧＶＶＡＳＮ（配列番号２５２）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＷＥＹＧＦＬＫＩＧＥＩＶＥＫＱＩＬＣＳＶＦＳＶＤＥＱＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＬＱＥＬＦＡＹＱＬＥＤＧＧＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＡＩＤＥＩＦＥＲＱＬＤＬＦＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号２５３）

ＶＫＩＩＳＲＫＶＬＫＴＥＮＶＹＤＩＧＬＥＧＤＨＮＦＩＩＫＤＧＬＩＡＳＮ（配列番号２５４）

＞Ｃｓｔ：／１－１３４ＰＣＣ７２０２：ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｎｉｅｒｉＰＣＣ７２０２

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＶＬＰＩＧＫＩＶＥＥＱＩＱＣＴＶＹＳＶＤＱＹＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＥＬＥＮＧＡＴＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＴＳＤＧＱＭＬＰＩＤＱＩＦＥＱＧＬＤＬＦＭＶＳＦ（配列番号２５５）

ＶＫＩＶＫＲＲＳＨＧＩＱＫＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＨＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２５６）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＰＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＩＦＥＹＹＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＱＬＴＬ（配列番号２５７）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＶＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＥＨＮＦＬＬＨＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２５８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＥＥＮＩＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＮＩＡＱＷＨＬＲＧＱＱＥＶＦＥＹＹＬＤＤＧＳＩＬＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＬＥＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＩＫＩ（配列番号２５９）

ＶＫＩＶＳＹＲＳＬＧＫＱＦＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号２６０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＥＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＫＶＹＴＩＤＳＮＧＭＬＹＴＱＳＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＹＥＹＬＬＥＮＧＡＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＡＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＱＧＬＤＬＬＱＶＧＶＡＥ（配列番号２６１）

ＶＫＩＶＳＲＴＹＶＧＱＡＮＶＹＤＩＧＶＥＳＤＨＮＦＶＩＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号２６２）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＷＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＳＶＹＴＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＰＲＧＱＱＥＩＩＥＹＴＬＥＤＧＲＫＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＥＳＧＥＭＬＰＩＥＥＩＦＱＲＥＬＤＬＫＶＥＴＦＨＥＭ（配列番号２６３）

ＶＫＩＩＫＲＱＳＬＧＲＱＮＶＹＤＶＣＶＥＴＤＨＮＦＶＬＡＮＧＣＶＡＳＮ（配列番号２６４）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＷＴＶＥＹＧＡＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＥＣＳＶＹＴＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＰＲＧＱＱＥＩＩＥＹＴＬＥＤＧＲＫＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＥＳＧＥＭＬＰＩＥＥＩＦＱＲＥＬＤＬＫＶＥＴＦＨＥＭ（配列番号２６５）

ＶＫＩＩＫＲＱＳＬＧＲＱＮＶＹＤＩＧＶＥＴＤＨＮＦＶＬＡＮＧＣＶＡＳＮ（配列番号２６６）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＳＩＧＫＩＶＥＥＫＩＮＣＱＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＴＱＮＩＡＱＷＨＤＲＧＳＱＥＬＦＥＹＥＬＥＤＧＲＩＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＴＫＤＧＱＭＬＡＩＮＤＩＦＥＱＥＬＥＬＹＳＶＤＤＭＧＶ（配列番号２６７）

ＶＫＩＶＫＲＲＳＬＧＶＱＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＩＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２６８）

ＣＬＳＹＤＴＫＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＶＶＱＥＮＩＲＣＲＶＹＴＴＮＤＱＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＩＦＥＹＨＬＤＤＫＴＩＩＲＡＴＫＥＨＱＦＭＴＶＤＨＶＭＭＰＩＤＥＩＦＥＱＧＬＥＬＫＫＩＫ（配列番号２６９）

ＬＫＩＩＲＲＫＳＬＧＭＨＥＶＦＤＩＧＬＥＫＤＨＮＦＶＬＳＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２７０）

ＣＬＳＹＮＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＤＥＱＩＨＣＲＶＹＳＶＤＥＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＹＱＥＩＦＡＹＥＬＡＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＥＤＧＱＭＦＰＩＤＥＩＷＥＫＧＬＤＬＫＫＬＰＴＶＱＤ（配列番号２７１）

ＶＫＩＶＲＲＱＳＬＧＶＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＳＧＥＩＡＳＮ（配列番号２７２）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＲＭＶＥＥＳＬＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＳＩＱＱＷＨＳＲＧＱＱＥＩＦＥＹＣＦＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＡＥＧＫＭＳＳＩＨＤＩＦＥＱＧＬＥＬＫＫＩＩＰＷＳＧ（配列番号２７３）

ＡＫＩＩＳＣＫＳＬＧＫＱＳＶＹＤＩＧＶＶＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＶＶＡＳＮ（配列番号２７４）

ＣＬＧＹＤＴＰＶＬＴＶＥＹＧＦＭＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＱＣＨＶＹＳＶＤＱＮＧＬＶＦＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＷＥＹＮＬＤＮＧＤＩＶＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＮＱＩＦＥＱＧＬＥＬＫＶＩＡ（配列番号２７５）

ＶＫＩＶＳＣＫＰＬＲＶＱＴＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＩＬＤＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２７６）

ＣＬＳＹＤＴＫＶＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＶＶＱＥＮＩＲＣＲＶＹＴＴＮＤＱＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＩＦＥＹＨＬＤＤＫＴＩＩＲＡＴＫＥＨＱＦＭＴＶＤＨＶＭＭＰＩＤＥＩＦＥＱ（配列番号２７７）

ＫＩＩＲＲＫＳＬＧＭＨＥＶＦＤＩＧＬＥＫＤＨＮＦＶＬＳＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２７８）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＳＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２７９）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＶＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２８０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＭＰＩＧＫＩＶＫＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＱＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２８１）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＬＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２８２）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＳＫＩＶＥＥＫＩＥＣＴＶＹＴＶＮＮＱＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＥＬＤＬ（配列番号２８３）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＱＥＤＨＮＦＶＬＮＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２８４）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＥＥＮＩＤＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＮＩＡＱＷＨＬＲＧＱＱＥＶＦＥＹＹＬＤＤＧＳＩＬＲＡＴＫＤＨＱＦＭＴＬＥＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＩＫＩ（配列番号２８５）

ＶＫＩＶＳＹＲＳＬＧＫＱＦＶＹＤＩＧＶＡＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号２８６）

ＣＬＳＹＤＴＡＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＬＦＥＹＳＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＫＬＥＬＭＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号２８７）

ＶＫＩＩＡＫＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号２８８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＰＮＧＦＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＹＲＧＥＱＥＩＦＥＹＹＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＱＬ（配列番号２８９）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＶＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＥＨＮＦＬＬＨＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２９０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＩＴＶＥＹＧＰＩＡＩＧＥＩＶＥＫＧＩＰＣＴＶＹＳＶＤＳＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＧＧＬＥＬＫＱＬ（配列番号２９１）

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＫＤＤＨＮＦＩＬＡＮＧＭＶＡＳＮ（配列番号２９２）

＞ＣｓｐＥＳＦＣ／１－１３７

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＶＰＩＧＫＬＶＥＥＫＬＮＣＳＶＹＴＶＤＰＮＧＹＩＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＩＱＥＶＦＥＹＱＬＥＤＮＴＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＥＤＨＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＫＫＣＰＱＰＱＱ（配列番号２９３）

ＶＫＩＩＲＲＲＳＬＧＦＱＰＶＹＤＩＧＬＥＱＤＨＮＦＬＬＮＱＧＡＩＡＳＮ（配列番号２９４）

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＶＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＮＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬ（配列番号２９５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号２９６）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＰＬＡＩＧＴＩＶＳＥＲＬＡＣＴＶＹＴＶＤＲＳＧＦＬＹＡＱＡＩＳＱＷＨＥＲＧＲＱＤＶＦＥＹＡＬＤＮＧＭＴＩＲＡＴＫＤＨＫＬＭＴＡＤＧＱＭＶＡＩＤＤＩＦＴＱＧＬＴＬＫＡＩＤＴＡＡＦ（配列番号２９７）

ＭＫＩＶＳＲＫＳＬＧＶＱＨＶＹＤＩＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＳＮ（配列番号２９８）

ＣＬＳＹＤＴＡＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＬＦＥＹＳＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＫＬＥＬＭＱＶＫＧＬＰ（配列番号２９９）

ＶＫＩＩＡＫＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３００）

ＣＬＳＹＤＴＱＩＬＴＶＥＨＧＰＭＳＩＧＥＩＶＥＫＣＬＥＣＨＶＹＴＶＮＫＮＧＮＩＣＩＱＴＩＴＱＷＨＦＲＧＥＱＥＩＦＥＹＥＬＥＤＧＳＦＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＴＧＥＭＬＰＩＨＥＩＦＴＮＧＬＥＩＬＱＬＳＫＳＬＬ（配列番号３０１）

ＶＫＩＬＡＲＫＳＬＧＴＱＫＶＹＤＩＧＶＮＤＤＨＮＦＡＬＳＮＳＦＩＡＳＮ（配列番号３０２）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＦＧＡＩＰＭＧＫＩＶＥＥＲＬＮＣＱＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＴＱＮＩＡＱＷＨＤＲＧＶＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＲＩＩＫＡＴＫＤＨＫＭＭＩＥＮＣＥＭＶＥＩＤＲＩＦＥＥＧＬＥＬＦＥＶＮ（配列番号３０３）

ＶＫＩＬＫＲＲＳＩＳＳＱＱＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３０４）

ＣＬＳＹＤＴＫＩＩＴＶＥＹＧＡＩＡＩＧＴＩＶＥＱＧＬＨＣＨＶＹＳＶＤＰＮＧＦＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＱＲＧＥＱＥＶＦＡＹＴＬＥＮＧＳＩＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＱＱＧＫＭＬＰＩＤＴＩＦＥＱＧＬＤＬＬＱＶ（配列番号３０５）

ＫＩＩＫＲＴＳＬＧＶＲＰＶＹＤＩＧＶＩＱＤＨＮＦＬＬＥＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３０６）

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＩＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＩＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号３０７）

ＶＫＩＩＳＲＱＦＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３０８）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＬＫＹＧＡＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＮＣＨＶＹＴＲＡＥＳＧＦＦＹＩＱＳＩＥＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＡＴＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬ（配列番号３０９）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＫＱＰＶＹＤＬＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＴＶＡＳＮ（配列番号３１０）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＡＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＡＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＤＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＱＱＥＶＦＥＹＳＬＤＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＧＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＭＲＩＤＳＬＰ（配列番号３１１）

ＶＫＩＬＴＲＫＳＩＧＫＱＴＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３１２）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＴＮＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＡＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＶＫＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰ（配列番号３１３）

ＶＫＩＩＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３１４）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＧＩＥＣＴＶＹＴＶＤＮＮＧＮＶＹＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＫＮＬＰ（配列番号３１５）

ＶＫＩＶＴＲＲＰＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＳＤＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３１６）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＳＩＥＣＳＶＹＴＶＤＳＮＧＮＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＨＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＭＫＩＱＧＬＰＥ（配列番号３１７）

ＡＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＶＴＲＤＧＦＩＡＳＮ（配列番号３１８）

ＣＬＳＹＮＳＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＫＧＩＥＣＳＶＹＳＶＤＳＹＧＫＩＹＴＱＶＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＴＩＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＭＱＶＱＧＬＰＤ（配列番号３１９）

ＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＳＳＤＨＮＦＶＭＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３２０）

ＣＬＳＳＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＬＩＰＩＧＥＩＩＥＫＲＩＤＣＳＶＦＳＶＤＫＮＧＮＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＤＲＧＩＱＥＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＡＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＫＶＨＮＬＰＱ（配列番号３２１）

ＶＫＩＩＴＲＮＹＶＧＫＥＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＩＫＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３２２）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＨＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＥＬＤＬＬＱＶＴＧＬＶＮ（配列番号３２３）

ＶＫＩＶＴＲＲＬＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３２４）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＦＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＬＥＣＴＶＬＴＶＤＮＨＧＮＩＹＳＱＰＩＡＱＷＨＨＲＧＱＱＱＩＹＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＬＱＶＴＮＬＤＮ（配列番号３２５）

ＶＫＶＩＴＲＫＬＡＤＴＥＮＶＹＤＩＧＶＥＮＨＨＮＦＬＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３２６）

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＴＶＤＮＮＧＹＶＣＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＲＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＴＧＬＰ（配列番号３２７）

ＶＫＩＩＴＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３２８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＳＩＧＥＩＶＥＫＥＩＥＣＴＶＹＴＶＤＳＮＧＹＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＥＱＧＥＱＥＩＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＥＧＥＭＬＰＩＤＱＩＦＡＲＱＬＤＬＭＱＩＴＧＬＰＱ（配列番号３２９）

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ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＴＮＧＹＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＮＲＤＥＱＥＶＦＥＹＡＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＫＧＬＤＬＬＱＶＱＧＬＰ（配列番号３３１）

ＶＫＩＶＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３３２）

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＴＶＤＮＮＧＹＶＣＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＲＱＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＧＬＤＬＬＱＶＫＧＬＰＥ（配列番号３３３）

ＶＫＩＩＴＲＱＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３３４）

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＥＫＴＩＥＣＮＶＦＴＶＤＳＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＹＱＥＶＦＥＹＧＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＡＲＥＬＤＬＬＱＶＴＧＬＩＮ（配列番号３３５）

ＶＫＩＶＴＲＫＦＬＧＩＱＮＶＹＤＩＧＶＥＱＮＨＮＦＶＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３３６）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＶＶＤＥＫＩＥＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＬＩＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＫＱＥＶＦＥＹＳＬＥＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＭＤＮＱＭＬＰＩＤＥＩＬＥＫＧＬＥＬＫＱＶＮＡＤＳＶ（配列番号３３７）

ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＤＳＱＴＶＹＤＩＧＶＥＴＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号３３８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＬＰＩＧＫＩＶＥＮＱＭＩＣＳＶＹＳＩＤＮＮＧＹＩＹＩＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＱＱＥＶＦＥＹＩＬＥＤＧＳＩＩＲＳＴＫＤＨＫＦＭＴＫＧＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＥＬＡＱＶＴＲＬＥＱ（配列番号３３９）

ＶＫＩＩＳＲＲＳＶＧＶＱＳＶＹＤＩＧＶＫＱＤＨＮＦＦＬＲＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３４０）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＡＭＹＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＴＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＩＦＥＹＤＬＥＤＧＳＫＩＫＡＴＫＤＨＫＦＭＴＩＤＧＥＭＬＰＩＤＥＩＦＥＫＮＬＤＬＫＱＶＶＳＨＰＤ（配列番号３４１）

ＶＫＩＩＧＣＲＳＬＧＴＱＫＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＳＩＡＳＮ（配列番号３４２）

＞ＣｃｈＰＣＣ７４２０：／１－１３５ＣｏｌｅｏｆａｓｃｉｃｕｌｕｓｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓＰＣＣ７４２０

ＣＬＳＹＤＴＱＩＬＴＶＥＹＧＡＶＡＩＧＥＩＶＥＫＱＩＥＣＴＶＹＳＶＤＥＮＧＹＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＬＬＥＤＧＡＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＤＥＤＱＭＬＰＩＤＱＩＦＥＱＧＬＥＬＫＱＶＥＶＬ（配列番号３４３）

ＶＫＩＩＧＲＫＰＬＧＴＱＰＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＦＮＧＳＶＡＳＮ（配列番号３４４）

＞ＣｓｐＰＣＣ６７１２／１－１３３

ＣＬＳＹＤＴＥＶＬＴＶＥＹＧＡＩＰＩＧＫＩＶＥＥＫＩＡＣＮＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＹＨＤＲＧＩＱＥＶＦＥＹＲＬＥＮＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＫＭＭＴＡＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＫＱＮＬＤＬＫＱＬＮ（配列番号３４５）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＫＱＳＶＦＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３４６）

ＣＬＳＹＥＴＥＶＬＴＬＥＹＧＦＬＰＩＧＥＩＶＤＫＱＭＶＣＴＶＦＳＶＮＤＳＧＮＶＹＴＱＰＩＧＱＷＨＤＲＧＶＱＥＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＱＧＥＭＶＰＩＤＥＩＦＨＱＧＷＥＬＶＱＶＳＧＴＭＮ（配列番号３４７）

ＶＫＩＶＳＲＲＹＬＧＫＡＤＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＩＩＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３４８）

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＭＰＩＧＫＩＶＥＥＮＩＮＣＳＶＹＴＶＮＫＮＧＦＶＹＴＱＳＩＡＱＷＨＨＲＧＥＱＥＶＦＥＹＹＬＥＤＧＥＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＥＧＫＭＬＰＩＤＥＩＦＥＮＮＬＤＬＫＫＬＴＶ（配列番号３４９）

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ＶＫＩＶＳＲＫＳＬＧＴＱＴＶＹＤＬＧＶＡＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＴＶＡＳＮ（配列番号３５２）

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ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＫＱＳＶＹＤＩＧＶＡＫＤＨＮＦＬＬＡＮＧＭＶＡＳＮ（配列番号３５４）

ＣＬＳＹＥＴＥＶＬＴＬＥＹＧＦＶＰＩＧＥＩＶＮＫＱＭＶＣＴＶＦＳＬＮＤＳＧＮＶＹＴＱＰＩＧＱＷＨＤＲＧＶＱＤＬＹＥＹＣＬＤＤＧＳＴＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＱＧＥＭＶＰＩＤＥＩＦＨＱＧＷＥＬＶＱＶＳＧＩＳＫ（配列番号３５５）

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ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＶＮＣＴＶＹＳＶＤＫＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＮＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号３５７）

ＶＫＩＩＳＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３５８）

ＣＬＧＧＥＴＬＩＬＴＥＥＹＧＬＬＰＩＡＫＩＶＳＥＥＩＮＣＴＶＹＴＶＤＱＮＧＦＶＹＳＱＰＩＳＱＷＨＥＲＧＬＱＥＶＦＥＹＴＬＥＮＧＱＴＩＱＡＴＫＤＨＫＦＭＴＳＤＧＥＭＬＡＩＤＴＩＦＥＲＧＬＤＬＫＳＳＤＦＳ（配列番号３５９）

ＶＫＩＩＧＲＱＳＬＧＲＫＰＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＧＮＧＬＩＡＳＮ（配列番号３６０）

図１は、本発明の一つの実施形態によるＣｆａスプリットインテインの設計のアライメントおよびコンピュータ生成モデルを示す。パネルＡは、ＮｐｕＤｎａＥおよびＣｆａＤｎａＥの配列アライメントを示す。これらの配列は、一次配列を介して均等に分布した差異（下線部、シアン）と８２％の同一性を共有する。触媒残基と第２のシェルの「アクセラレータ」残基とは、それぞれカレット（オレンジ色）とアスタリスク（緑色）とで示されている。パネルＢは、Ｎｐｕ構造（ｐｄｂ＝４ｋ１５）にマッピングされたものと同じ残基（パネルａにおいて強調されている）を示す。

ＣｆａインテインはＮｐｕ（８２％）と高い配列類似性を有し、非同一残基はタンパク質の３Ｄ構造全体に広がっている。

モデルエクステインに融合したＣｆａインテイン断片を生成し、それらのＰＴＳ活性を前述のインビトロアッセイを用いて測定した（図２）。これによりＣｆａインテインがＮｐｕよりも３０℃で２．５倍速くスプライスすることが明らかになった（ｔ_１／２２０秒対５０秒）。つまり、後者は最も速い特徴付けられたＤｎａＥスプリットインテインであるため、活性増強が顕著である（図２Ａ）。この加速された速度は、分岐形成（３倍増加）および分岐分解（２倍増加）の両方で現れる。親ＤｎａＥインテインと一致して、ＣｆａはＣ－エクステインの＋２位で嵩高い疎水性残基の選択を保持する。驚くべきことに、Ｃｆａは温度の関数として増加したスプライシング速度を示し、Ｎｐｕよりも一貫して速い（図２Ａ）。スプライス産物の収量は低下するものの、Ｃｆａインテインは８０℃でも活性を維持するのに対して、Ｎｐｕはこの温度では不活性である。これらの結果は、コンセンサスエンジニアリングが広範囲の温度にわたって高度に活性であるインテインを産生するのに有効であることを示している。

ＰＴＳの適用は、典型的には、標的タンパク質の分裂および得られた断片の適切なスプリットインテインセグメントへの融合を必要とする^１。その結果、これらの融合タンパク質の溶解性が低いことも時々起こりうる。これらの難溶性断片を溶解状態に保つために、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）および尿素などのタンパク質変性剤が頻繁に使用されるので、これらのカオトロピック剤の存在下でＣｆａのスプライシング能を試験した。Ｃｆａインテインは４ＭＧｕＨＣｌの存在下でスプライシングすることが見出されたが（３Ｍまで活性の低下はほとんどない）、３Ｍ以上のＧｕＨＣｌのＮｐｕについて活性は観察されなかった（図２Ｂ）。注目すべきことに、Ｃｆａのスプライシングは尿素が８Ｍまでだとほとんど影響されないが、Ｎｐｕのスプライシングは尿素が４Ｍを上回ると大幅に低下する（図２Ｃ）。

図２は、本発明の一つの実施形態によるＣｆａインテインの特徴を示すグラフを示す。パネルＡには、温度の関数としてのＣｆａおよびＮｐｕのスプライシング速度が示されている。Ｎｐｕは８０℃で不活性である（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））。パネルＢおよびＣには、添加されたカオトトピックの関数としてのＣｆａおよびＮｐｕのスプライシング速度が示されている。Ｎｐｕは、３ＭＧｕＨＣｌまたは８Ｍ尿素において不活性である。注：Ｃｆａは４ＭＧｕＨＣｌ（ｋ＝７×１０^－５）（誤差＝ＳＤ（ｎ＝３））において残留活性を有する。

高濃度のＧｕＨＣｌおよび尿素に対するＣｆａの前例がなく予期しない耐性は、インテインが細菌封入体からの不溶性タンパク質のカオトロピック抽出の直後に活性を保持することを示唆しており、それによってＰＴＳベースの研究が早く進むようになる。したがって、モデル融合タンパク質であるＨｉｓ_６－Ｓｕｍｏ－Ｃｆａ^Ｎを大腸菌細胞において過剰発現させ、６Ｍ尿素により封入体からタンパク質を抽出した。タンパク質はこの抽出物からニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、次いで、変性条件下でＰＴＳにより直接的かつ効率的に修飾した。すなわち、介在するリフォールディングステップを必要としなかった。一般に、カオトロピック剤の存在下でのＣｆａの強い活性により、天然条件下での溶解度が低いことを示すタンパク質断片を用いて作業する場合に有用であることが立証されるだろう。

対象のタンパク質をスプリットインテインに融合すると、タンパク質単独と比較して細胞発現レベルが著しく低下する可能性がある^６。この状況は、Ｃ－インテインよりもＮ－インテインへの融合の場合により頻繁に起こり、これは前者のサイズの方が大きく、それらが部分的にフォールディンされた状態である可能性が高いためである^１８。したがって、Ｃｆａの熱安定性およびカオトロピック安定性の改善がＣｆａ^Ｎ融合体の発現レベルの増加につながるかどうかを検討した。実際、大腸菌におけるモデル研究により、対応するＮｐｕ^Ｎ融合と比較して、Ｃｆａ^Ｎ融合に対する可溶性タンパク質発現の有意な（３０倍）増加が明らかになった（図８）。この結果を考慮に入れて、Ｃｆａ^Ｎ融合体が哺乳類細胞においてもタンパク質発現レベルの増加を示すかどうかを調べた。特に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖（ＨＣ）へのインテイン融合は、合成カーゴの部位特異的コンジュゲーションのための強力なツールとして持ち上がっている^{１９－２１}。ｍＡｂ（αＤｅｃ２０５）のＨＥＫ２９３細胞におけるそのＨＣに融合したＮ－インテインの機能としての発現レベルを調べた。細菌の発現結果と一致して、ＨＣ－Ｃｆａ^Ｎ融合体の産生は、検査した他のインテインと比較して有意に高かった。例えば、ｍＡｂ－Ｃｆａ構築物の分泌レベルは、対応するＮｐｕ融合物よりも～１０倍高かった（図３Ａおよび３Ｂ）。重要なことに、ｍＡｂ－ＣｆａはＰＴＳ活性を保持し、３７℃で４日間発現させた後に増殖培地中で直接スプライシングすることにより合成ペプチドを用いて部位特異的に修飾することができた。

図８は、Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－Ｎｐｕ^ＮおよびＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ－Ｃｆａ^Ｎの試験発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。大腸菌培養液１Ｌの可溶性画分の４ｍＬカラム容量（ＣＶ）Ｎｉ－ＮＴＡ精製からのクマシーブリリアントブルー染色ゲル。各レーンは、（Ｐ）封入体ペレット、（ＦＴ）バッチ結合Ｎｉ－ＮＴＡ溶液のフロースルー、（Ｗ１）５ｍＭイミダゾールを用いた５ＣＶ洗浄、（Ｗ２）２５ｍＭイミダゾールの５ＣＶ洗浄、（Ｅ１－Ｅ４）および２５０ｍＭイミダゾールの４回の１．５ＣＶ溶出に対応する。

最後に、ＰＴＳ系を用いて合成カーゴの多コピーをｍＡｂの重鎖に結合させることができるかどうかを、抗体コンジュゲーションとの関わりにおけるＣｆａインテインの有用性をさらに調べるために検討した。したがって、半合成を用いて、Ｃｆａ（Ｃｆａ^Ｃ）のＣ－末端半分が、カーゴ、この場合はフルオレセインの多量体結合を可能にするデンドリマー骨格を含むＣ－エクステインに融合された構築物を調製した（図３Ｃ）。この樹枝状カーゴは、Ｃｆａ媒介ＰＴＳを介してαＤｅｃ２０５抗体に首尾よく連結され、再び細胞増殖培地中で直接インサイチューにおいて行った（図３Ｄおよび３Ｅ）。これは、ＰＴＳが分岐エクステイン構築物を標的タンパク質に結合させるために初めて使用されたことを表し、抗体薬物コンジュゲートのペイロード量を操作するためのシステムの可能性が際立つことになる^２２。

図３は、本発明の一つの実施形態によるＣｆａインテインを用いたマウスモノクローナル抗体の発現および修飾を示す。パネルＡは、マウスαＤｅｃ２０５モノクローナル抗体の重鎖のＣ－末端に融合した種々のＩｎｔ^Ｎホモログ（Ｎｐｕ、Ｍｃｈｔ、ＡｖａおよびＣｆａ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における試験発現を示す。上部：９６時間の発現後の培地中に存在する抗体レベルのウェスタンブロット分析（αＭｏｕｓｅＩｇＧ）。下部：ローディングコントロールとしての細胞溶解物のα－アクチンウェスタンブロット。パネルＢは、パネルＡにおけるαＤＥＣ２０５ＨＣ－Ｉｎｔ^Ｎシグナルのデンシトメトリーによる正規化発現収量の定量化を示す（誤差＝ＳＤ（ｎ＝４））。パネルＣは、αＤＥＣ２０５ＨＣ－Ｉｎｔ^Ｎ融合体とのＰＴＳ反応に使用されるＣｆａ^Ｃ－デンドリマー構築物の構造を示す。単純化のために、Ｃｆａ^Ｃペプチド配列は、記号を使って緑色で描写している（左に三角形の切り抜きを有する長方形として）。パネルＤは、多価カーゴを有するｍＡｂのＨＣを修飾するために使用されるインサイチューＰＴＳアプローチの概略図である。パネルＥは、ＰＴＳ反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。レーン１：野生型マウスαＤＥＣ２０５ｍＡＢ。レーン２：マウスαＤＥＣ２０５－Ｃｆａ^ＮｍＡＢ融合体。レーン３：αＤＥＣ２０５－Ｃｆａ^ＮｍＡＢを含む培地へのＣｆａ^Ｃ－デンドリマーの添加。スプライシング反応を、蛍光発光（下部）およびウェスタンブロット（上部、αＭｏｕｓｅＩｇＧ）により分析した。

高速スプリットインテインの発見は、タンパク質トランススプライシングの応用に革命を起こした。この研究で説明されているＣｆａインテインの顕著な堅牢性は、ＰＴＳをより広い範囲の反応条件で実施することを可能にすることにより、これらの技術の多くの有用性を拡大するはずである。さらに、Ｎ－インテイン融合体の発現収量を増加させるＣｆａの能力は、タンパク質半合成のためのスプリットインテインの更なる使用を促すはずである。このインテインをエンジニアリングするために使用する活性誘導アプローチは、他のインテインファミリーに適用することができるか、またはコンセンサスエンジニアリングに使用される多配列アライメントの精製のための一般的な戦略として行われる。

材料および方法
材料
オリゴヌクレオチドおよび合成遺伝子は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＸＬＩＩ部位特異的突然変異誘発キットおよびＰｆｕＵｌｔｒａＩＩＨｏｔｓａｒｔ融合ポリメラーゼは、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。全ての制限酵素および２ｘＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。クローニングおよびタンパク質発現に使用した「インハウス」の高コンピテンシー細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入したＯｎｅＳｈｏｔＢｌ２１（ＤＥ３）ケミカリーコンピテント大腸菌およびサブクローニング効率ＤＨ５αコンピテント細胞から生成した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、リポフェクタミン２０００、および低ＩｇＧウシ胎児血清は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからも購入した。ＤＮＡ精製キットはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から購入した。全てのプラスミドは、ＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により配列決定した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、および全ての緩衝塩は、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クマシーブリリアントブルー、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ＤＬ－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）、および５（６）－カルボキシフルオレセインは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入し、さらに精製することなく使用した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）およびイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、ＧｏｌｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。使用したプロテアーゼインヒビターは、ＲｏｃｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）であった。ニッケル－ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）樹脂は、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＢａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）から購入した。（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）およびＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂は、Ｂｉｏｔａｇｅ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ（ＮｏｒｔｈＡｕｇｕｓｔａ、ＳＣ）から購入した。イムノブロットＰＶＤＦ膜（０．２μｍ）およびＣｒｉｔｅｒｉｏｎＸＴビス－トリスゲル（１２％ポリアクリルアミド）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファーは、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）から購入した。抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｃｏｒマウス８００）およびマウスαＡｃｔｉｎ一次抗体は、Ｌｉ－ＣＯＲｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から購入した。

装置
分析用ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｃ_１８Ｖｙｄａｃカラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ１１００および１２００シリーズ装置で流速１ｍＬ／分で行った。分取ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ２５４５ＢｉｎａｒｙＧｒａｄｉｅｎｔＭｏｄｕｌｅおよびＷａｔｅｒｓ２４８９ＵＶ検出器からなるＷａｔｅｒｓｐｒｅｐＬＣシステムで行った。精製は、１８ｍＬ／分の流速でＣ_１８Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ１０２２カラム（１０μＭ；２２×２５０ｍｍ）で行った。全ての分析は、水（溶媒Ａ）中０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）および０．１％ＴＦＡを含む水（溶媒Ｂ）中９０％アセトニトリルを使用した。特に明記しない限り、ペプチドおよびタンパク質は、以下のグラジエントを使用して分析した：２分間で０％Ｂ（アイソクラティック）、続けて３０分間にわたり０～７３％Ｂ。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）は、ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＭｉｃｒｏＴＯＦ－ＱＩＩ質量分析計で行った。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ７５１６／６０（ＣＶ＝１２５ｍＬ）カラムを使用して、ＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。クーマシー染色されたゲルおよびウェスタンブロットをＬＩ－ＣＯＲオデッセイ赤外線画像装置を用いて画像化した。蛍光ゲルは、ＧＥＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００Ｉｍａｇｅｒを用いて画像化した。スプライシング依存性大腸菌増殖アッセイは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓからのＶｅｒｓａＭａｘチューナブルマイクロプレートリーダーで行った。細胞溶解は、Ｓ－４５０ＤＢｒａｎｓｏｎＤｉｇｉｔａｌＳｏｎｉｆｉｅｒを用いて行った。

ＤＮＡプラスミドのクローニング
大腸菌発現のための全てのＮ－インテイン構築物を、予め使用したｐＥＴおよびｐＴＸＢ１ベクターにクローニングした^１。ＷＴｐｅｔ３０－Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ^Ｎ、ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｎｐｕ^Ｎ、ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡＨｉｓ_６、およびｐＴＸＢ１－Ｎｐｕ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ_６プラスミドをコードするプラスミドを、前述のようにクローニングし、以下のタンパク質配列をコードする。ＳＵＭＯ切断（Ｎ－インテイン）またはチオール開裂（Ｃ－インテイン）後のタンパク質産物は、全てのプラスミドについて太字で示す。

プラスミド１：
ＷＴＳｓｐ ^Ｎ：ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６１）

プラスミド２：
ＷＴＮｐｕ ^Ｎ：ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｎｐ ^ｕＮ
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＡＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号３６２）

プラスミド３：
ＷＴＳｓｐ ^Ｃ：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６
ＭＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３６３）

プラスミド４：
ＷＴＮｐｕ ^Ｃ：ｐＴＸＢ１－Ｎｐｕ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３６４）

全てのＳｓｐ^Ｎバッチ変異体を、プラスミド１をテンプレートとして用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを用いてクローニングし、以下に示すタンパク質配列をコードする。Ｎ－インテイン配列は太字で示しており、バッチ突然変異に対応する残基には下線を引いている。

プラスミド５：
バッチ１：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｒ７３Ｋ，Ｌ７５Ｍ，Ｙ７９Ｇ，Ｌ８１Ｍ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６５）

プラスミド６：
Ｓｓｐ ^ＮＲ７３Ｋ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｒ７３Ｋ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＫＦＬＴＴＤＹＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６６）

プラスミド７：
Ｓｓｐ ^ＮＲ７３ＫＹ７９Ｇ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｒ７３Ｋ、Ｙ７９Ｇ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＫＦＬＴＴＤＧＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６７）

プラスミド８：
Ｓｓｐ ^ＮＲ７３ＫＹ７９ＧＬ８１Ｍ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｒ７３Ｋ、Ｙ７９Ｇ、Ｌ８１Ｍ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＫＦＬＴＴＤＧＱＭＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６８）

プラスミド９：
バッチ２：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｌ５６Ｆ、Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ、Ｅ８５Ｄ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＰＩＤＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３６９）

プラスミド１０：
Ｓｓｐ ^ＮＡ８３Ｐ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ａ８３Ｐ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＰＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３７０）

プラスミド１１：
Ｓｓｐ ^ＮＳ７０ＫＡ８３Ｐ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＰＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３７１）

プラスミド１２：
Ｓｓｐ ^ＮＬ５６，Ｓ７０Ｋ，Ａ８３Ｐ：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｌ５６Ｆ、Ｓ７０Ｋ、Ａ８３Ｐ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＫＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＰＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３７２）

プラスミド１３：
バッチ３：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｓ２３Ｅ、Ｅ２４Ｋ、Ｅ２５Ｒ、Ｎ２７Ｅ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＳＶＹＳＶＤＰＥＧＲＶＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３７３）

プラスミド１４：
バッチ４：Ｐｅｔ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｓｓｐ ^Ｎ（Ｐ３５Ｎ、Ｅ３６Ｎ、Ｒ３８Ｎ、Ｖ３９Ｉ）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＦＧＴＥＩＬＴＶＥＹＧＰＬＰＩＧＫＩＶＳＥＥＩＮＣＳＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＡＩＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＬＥＹＥＬＥＤＧＳＶＩＲＡＴＳＤＨＲＦＬＴＴＤＹＱＬＬＡＩＥＥＩＦＡＲＱＬＤＬＬＴＬＥＮＩＫＱＴＥＥＡＬＤＮＨＲＬＰＦＰＬＬＤＡＧＴＩＫ（配列番号３７４）

Ｓｓｐ^Ｃインテイン上の４つのバッチ変異体（バッチ５～８）およびＡ１３６Ｓ点変異体を、プラスミド３をテンプレートとしたＰｆｕＵｌｔｒａＩＩＨＳポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた逆ＰＣＲによってクローニングし、以下に示すタンパク質配列をコードした：

プラスミド１５：
バッチ５：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６（Ｖ１０３Ｉ、Ｖ１０５Ｉ、Ｉ１０６Ａ、Ｇ１０７Ｔ）
ＭＩＫＩＡＴＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７５）

プラスミド１６：
バッチ６：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６（Ｒ１１５Ｎ、Ｉ１１６Ｖ、Ｆ１１７Ｙ）
ＭＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＮＶＹＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７６）

プラスミド１７：
バッチ７：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６（Ｌ１２１Ｖ、Ｐ１２２Ｅ、Ｑ１２３Ｒ）
ＭＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＡＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７７）

プラスミド１８：
バッチ８：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６（Ｌ１２８Ａ、Ａ１３０Ｋ、Ａ１３３Ｆ）
ＭＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＡＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７８）

プラスミド１９：
Ｓｓｐ ^ＣＡ１３６Ｓ：ｐＴＸＢ１－Ｓｓｐ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈｉｓ _６（Ａ１３６Ｓ）
ＭＶＫＶＩＧＲＲＳＬＧＶＱＲＩＦＤＩＧＬＰＱＤＨＮＦＬＬＡＮＧＡＩＡＳＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７９）

融合コンセンサスＤｎａＥ配列の遺伝子は、ＩＤＴＤＮＡによる大腸菌発現のためにコドン最適化し、ｇＢｌｏｃｋとして取得した。ＤＮＡｇＢｌｏｃｋ配列を以下に示す：

ＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＧＡＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＡＣＧＧＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＧＴＧＣＡＡＣＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＣＣＧＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＧＧＧＧＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＡＧＴＣＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＣＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＣＴＡＡＣ（配列番号３８０）

Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてプラスミド１にＣｆａ^Ｎの発現プラスミドをクローニングし、以下に示す以下のタンパク質をコードするベクターを得た：

プラスミド２０：
Ｃｆａ ^Ｎ：ｐＥＴ３０－Ｈｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｃｆａ ^Ｎ
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧＡＥＹＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号３８１）

Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてプラスミド３にコンセンサスＣ－インテインの発現プラスミドをクローニングし、以下に示す以下の遺伝子をコードするベクターを得た：

プラスミド２１：
Ｃｆａ ^Ｃ：ｐＴＸＢ１－Ｃｆａ ^Ｃ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈ６
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８２）

大腸菌増殖スクリーニングに使用されるＣｆａ構築物
Ｃ－エクステインの＋２位でのスプライシングの依存性をスクリーニングするために使用されるＣｆａプラスミドは、スプリットアミノグリコシドホスホトランスェラーゼ（Ｋａｎ^Ｒ）遺伝子の二重発現系を含む予め生成されたプラスミド２中への制限クローニングを用いて生成した。Ｃｆａ二重発現構築物を以下に示す：

プラスミド２２～２５
［ＫａｎＲプロモーター］－［ＲＢＳ］－［ＫａｎＲ ^Ｎ］－［Ｃｆａ ^Ｎ］－［ｉＲＢＳ］－［Ｃｆａ ^Ｃ－［ＣＸＮ－ＫａｎＲ ^Ｃ］
プロモーター配列に続いて、このベクター（ＲＢＳおよびｉＲＢＳ）には２つの別個の大腸菌リボソーム結合部位が存在する。各ＲＢＳには、分割されたＫａｎＲ－インテイン構築物の半分が続き、そのタンパク質配列を以下に示す（Ｃｆａインテインは太字で強調している）。

ＫａｎＲ ^Ｎ－Ｃｆａ ^Ｎ：
ＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＳＨＩＱＲＥＴＳＣＳＲＰＲＬＮＳＮＭＤＡＤＬＹＧＹＫＷＡＲＤＮＶＧＱＳＧＡＴＩＹＲＬＹＧＫＰＤＡＰＥＬＦＬＫＨＧＫＧＳＶＡＮＤＶＴＤＥＭＶＲＬＮＷＬＴＥＦＭＰＬＰＴＩＫＨＦＩＲＴＰＤＤＡＷＬＬＴＴＡＩＰＧＫＴＡＦＱＶＬＥＥＹＰＤＳＧＥＮＩＶＤＡＬＡＶＦＬＲＲＬＨＳＩＰＶＣＮＣＰＦＮＳＤＲＶＦＲＬＡＱＡＱＳＲＭＮＮＧＬＶＤＡＳＤＦＤＤＥＲＮＧＷＰＶＥＱＶＷＫＥＭＨＫＬＬＰＦＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号３８４）

Ｃｆａ ^Ｃ－ＫａｎＲ ^Ｃ
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮＣＸＮＳＶＶＴＨＧＤＦＳＬＤＮＬＩＦＤＥＧＫＬＩＧＣＩＤＶＧＲＶＧＩＡＤＲＹＱＤＬＡＩＬＷＮＣＬＧＥＦＳＰＳＬＱＫＲＬＦＱＫＹＧＩＤＮＰＤＭＮＫＬＱＦＨＬＭＬＤＥＦＦ（配列番号３８５）

Ｃ－エクステインの＋２位には下線を引いており、フェニルアラニン、グリシン、アルギニンまたはグルタミン酸塩のいずれかである。

αＤＥＣ２０５－ＨＣ－Ｃｆａ ^Ｎ
αＤＥＣ２０５抗体軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）、およびＨＣ－インテイン融合体（ＨＣ－Ｎｐｕ^Ｎ、ＨＣ－Ｍｃｈｔ^Ｎ、ＨＣ－Ａｖａ^Ｎ）を含むｐＣＭＶプラスミドを前述のようにして得た^３。哺乳動物細胞発現のためのコドン最適化ＣｆａＤｎａＥ配列を、ＪＣＡＴ^４を用いて生成し、ＩＤＴＤＮＡによるｇＢｌｏｃｋとして取得した。配列を以下に示す：

ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号３８６）

次いで、哺乳動物コドン最適化Ｃｆａ^Ｎ配列を、制限クローニングを用いてｐＣＭＶＨＣ－Ｎｐｕ^Ｎプラスミド中にクローニングすることで以下のタンパク質をコードする配列を得た：

プラスミド２６：
ＨＣ－Ｃｆａ ^Ｎ：ｐＣＭＶ－ＨＣ－Ｃｆａ ^Ｎ
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＡＴＴＫＧＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫＡＳＧＧＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰＧＨＨＨＨＨＨＧ（配列番号３８７）

デンドリマーのライゲーションのためのＣｆａ ^Ｃインテイン：
Ｃ－エクステインリンカーを有するＣｆａＣ－インテインを含むプラスミドを、逆ＰＣＲによりプラスミド２１中にクローニングし、以下に示すタンパク質配列をコードする：

プラスミド２７：
Ｃｆａ ^Ｃ－ｌｉｎｋ：ｐＴＸＢ１－Ｈ６－Ｃｆａ ^Ｃ－ＣＦＮＳＧＧ－ＭｘｅＧｙｒＡ－Ｈ６
ＭＧＨＨＨＨＨＨＳＧＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮＣＦＮＳＧＧＣＩＴＧＤＡＬＶＡＬＰＥＧＥＳＶＲＩＡＤＩＶＰＧＡＲＰＮＳＤＮＡＩＤＬＫＶＬＤＲＨＧＮＰＶＬＡＤＲＬＦＨＳＧＥＨＰＶＹＴＶＲＴＶＥＧＬＲＶＴＧＴＡＮＨＰＬＬＣＬＶＤＶＡＧＶＰＴＬＬＷＫＬＩＤＥＩＫＰＧＤＹＡＶＩＱＲＳＡＦＳＶＤＣＡＧＦＡＲＧＫＰＥＦＡＰＴＴＹＴＶＧＶＰＧＬＶＲＦＬＥＡＨＨＲＤＰＤＡＱＡＩＡＤＥＬＴＤＧＲＦＹＹＡＫＶＡＳＶＴＤＡＧＶＱＰＶＹＳＬＲＶＤＴＡＤＨＡＦＩＴＮＧＦＶＳＨＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８８）

全てのＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｉｎｔ^Ｎ（プラスミド１、２、５～１４、２０）およびＩｎｔ^Ｃ－ＧｙｒＡ－Ｈｉｓ_６（プラスミド３、４、１５～１９、２１～２７）構築物の発現および精製プロトコルは、前述の方法から適合した^１。

全てのＨｉｓ _６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｉｎｔ ^Ｎ構築物の発現
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をＮ－インテインプラスミドにより形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１ＬのＬＢに３７℃で増殖させた。培養液がＯＤ_６００＝０．６に達したら、０．５ｍＭＩＰＴＧを添加して発現を誘導した（最終濃度０．５ｍＭ、３７℃で３時間）。細胞を遠心分離（１０，５００ｒｃｆ、３０分）によりペレット化し、－８０℃で保存した。

全てのＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＡＥＹ－Ｉｎｔ^Ｎ構築物の精製
バッチ突然変異誘発のためのＮ－インテイン構築物の精製
ＲｏｃｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する３０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に細胞ペレット（プラスミド１、２、５～１４の発現由来）を再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞を氷上で超音波処理（３５％振幅、８×２０秒のパルスオン時間／３０秒のオフ時間）して溶解させた。Ｎ－インテインを含む不溶性封入体を遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）により回収した。上清を捨て、ペレットを３０ｍＬのトリトン洗浄バッファー（０．１％トリトンＸ－１００を含む溶解バッファー）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、トリトン洗浄剤を３５，０００ｒｃｆで３０分間遠心分離した。上清を捨て、６Ｍ尿素を含む３０ｍＬの溶解バッファー中に封入体ペレットを再懸濁し、懸濁液を４℃で一晩インキュベートし、タンパク質を抽出および再可溶化した。次いで、この混合物を３５，０００ｒｃｆで３０分間遠心分離した。

次いで、上清を４ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｈｉｓ_６タグを用いたアフィニティー精製用）と混合し、４℃で３０分間インキュベートしてタンパク質をバッチ結合させた。この混合物をフリット処理済みカラムに充填し、フロースルーを回収し、６Ｍ尿素を有する５カラム容量（ＣＶ）の溶解バッファーならびに２５ｍＭイミダゾールおよび６Ｍ尿素を含む５ＣＶの溶解バッファーでカラムを洗浄した。次いで、２５０ｍＭイミダゾールおよび６Ｍ尿素を含む４つの１．５ＣＶ画分の溶解バッファーにタンパク質を溶出させた。最初の２つの溶出画分は、一般的にＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ビス－トリスゲル、１７０Ｖで５０分間運転）により発現されたタンパク質を含むことが見出され、リフォールディングのために組み合わせた。

Ｎ－インテインは、４℃で０．５ｍＭのＤＴＴを含む溶解バッファーに段階的透析によってリフォールディングした。次いで、このリフォールディングされたタンパク質を１０ｍＭＴＣＥＰおよびＵｌｐ１プロテアーゼ（一晩、ＲＴ）で処理してＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ発現タグを切断した。次いで、溶液を４ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。スラリーをフリット処理済みカラムに適用し、溶解バッファーを含む３ＣＶ洗浄液と共にフロースルーを回収した。次いで、タンパク質を１０ｍＭＴＣＥＰで処理し、１０ｍＬに濃縮し、脱気したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を移動相として用いるＳ７５１６／６０ゲル濾過カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳによって分析した。純粋なタンパク質を、グリセロール（２０％ｖ／ｖ）の添加後、液体窒素中で急速凍結することによって保存した。注：リフォールディング工程中、バッチ３について有意なタンパク質沈殿が観察され、これは凝集する傾向があることを示唆するものである。

Ｃｆａ^Ｎの精製：
ＲｏｃｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する３０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に細胞ペレット（プラスミド２０の発現由来）を最初に再懸濁した。次いで、細胞を超音波処理（３５％振幅、８×２０秒のパルスオン時間／３０秒のオフ時間）により溶解し、溶解物を遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分間）によりペレット化した。
上清を４ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂と共に４℃で３０分間インキュベートして、可溶性Ｃｆａ^Ｎタンパク質を濃縮した。次いで、スラリーをフリット処理済みカラムに充填し、カラムを２０ｍＬの洗浄バッファー１（溶解バッファー）、続けて２０ｍＬの洗浄バッファー２（２５ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）により洗浄した。最後に、タンパク質を４×１．５ＣＶの溶出バッファー（溶解バッファー＋２５０ｍＭイミダゾール）によりカラムから溶出した。

次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１７０Ｖで５０分間、ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファーに１２％のビス－トリスゲルを泳動）により測定した溶出画分１および２に存在する所望のタンパク質を溶解バッファーに４℃で４時間透析した。透析後、タンパク質を１０ｍＭＴＣＥＰおよびＵｌｐ１プロテアーゼにより室温で一晩処理してＨｉｓ_６－ＳＵＭＯ発現タグを切断した。次いで、溶液を４ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂と共に４℃で３０分間インキュベートした。スラリーをフリット処理済みカラムに適用し、溶解バッファーを含む３ＣＶ洗浄液と共にフロースルーを回収した。次いで、タンパク質を１０ｍＭＴＣＥＰで処理し、１０ｍＬまで濃縮し、脱気したスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を移動相として用いるＳ７５１６／６０ゲル濾過カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１７０Ｖで６０分間、ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファーに１２％のビス－トリスゲルを泳動）、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳによって分析した。純粋なタンパク質を、グリセロール（２０％ｖ／ｖ）に保存し、液体窒素中で急速凍結した。

Ｉｎｔ^Ｃ－ＣＦＮ構築物の半合成
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を適切なｐＴＸＢ１－Ｉｎｔ^Ｃ－ＧｙｒＡ－Ｈ_６プラスミド（プラスミド３、４、１５～１９、２１）により形質転換し、３７℃でアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する２ＬのＬＢ培地に３７℃で増殖させた。培養液がＯＤ_６００＝０．６に達したら、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ、３時間、３７℃）を添加して発現を誘導した。遠心分離（１０，５００ｒｃｆ、３０分）により細胞ペレットを採取し、溶解バッファーに再懸濁し、氷上で（３５％振幅、１０×２０秒のパルスオン時間／３０秒のオフ時間）して溶解させた。可溶性画分中のタンパク質を遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）により単離し、次いでＮｉ－ＮＴＡ精製（ビーズ４ｍＬ、Ｎ－インテイン構築物について記載したとおり行った）により濃縮した。２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファーに溶出した後、イミダゾールを透析により新しい溶解バッファーに除去した。次いで、１０ｍＭＴＣＥＰ、ＲｏｃｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターカクテル、１００ｍＭＭＥＳＮａ、５ｍＭＥＤＴＡ、および５ｍＭＣＦＮ－ＮＨ_２（ｐＨ７．０）を添加して、室温で一晩ライゲーションを行った。ライゲーションされたＩｎｔ^Ｃ－ＣＦＮペプチドを０．５％ＴＦＡにより酸性化し、Ｃ_１８分取カラム：グラジエント＝１０分間（アイソクラティック）で１０％Ｂ、続けて６０分間にわたり２０～６０％ＢでＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。各タンパク質の純度を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより決定し、その同一性をＥＳＩ－ＭＳにより確認した。

Ｃｆａ^Ｃ－ｌｉｎｋ－ＭＥＳＮａの単離
インテイン－デンドリマー融合体の半合成に使用されるＣｆａ^Ｃ－ｌｉｎｋ－ＭＥＳＮａペプチドは、Ｉｎｔ^Ｃ－ＣＦＮ構築物（プラスミド２７からの発現）について上記で記載したとおり正確に発現および精製した。しかしながら、最終的なライゲーションステップの間にトリペプチドは添加せず、代わりにインテインのチオール開裂およびα－チオエステルの形成が生じた。次いで、このＣｆａ^Ｃ－ＭＥＳＮａα－チオエステルを分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。画分をＥＳＩ－ＭＳにより分析し、合一し、凍結乾燥した。

バッチ変異体についてのＲＰ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳによるタンパク質トランススプライシングの分析
スプライシング反応は、上述のプロトコルから適合させて行った^１。簡潔に述べると、Ｎ－およびＣ－インテイン（１５μＭＩｎｔ^Ｎ、１０μＭＩｎｔ^Ｃ）を個々にスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に２ｍＭＴＣＥＰと共に１５分間プレインキュベートした。他に指示がない限り、全てのスプライシング反応は３０℃で行った。指示された濃度の尿素または塩酸グアニジンを用いて、カオトロピック剤に対するＮｐｕおよびＣｆａの耐性を比較するスプライシング反応を行った。等しい容量のＮ－およびＣ－インテインを、指示された時間に取り出したアリコートと混合し、８Ｍグアニジン塩酸塩、４％ＴＦＡ（３：１ｖ／ｖ）の添加によりクエンチすることにより、スプライシングを開始した。Ｎｐｕ^Ｃ－ＣＦＮまたはＣｆａ^Ｃ－ＣＦＮのいずれかを含む全てのスプライシング反応について、反応の進行をＲＰ－ＨＰＬＣによりモニターした。Ｓｓｐ^Ｃ－ＣＦＮを含む全てのスプライシング反応では、予め見られた各状態のクロマトグラフィー分離度が低いため、ＥＳＩ－ＭＳ（注入前にＺｉｐＴｉｐにより脱塩したサンプル）により反応の進行をモニターした^１。８０℃でのバッチ３およびＣｆａ（１５分間のプレインキュベーション）のスプライシングは両方とも非効率的であり、約５０％の完了に達することが観察された。これはＮ－インテインの凝集（および不活性化）に起因する可能性が高い。注：８０℃でのＣｆａのプレインキュベーションが短くなると、スプライシングがより効率的になる。

バッチ変異体のトランススプライシング反応の動態分析：
動態分析は、上述のとおり行った^１。簡潔に述べると、５つの種（１～５）をＲＰ－ＨＰＬＣにより分離し、ピーク面積を決定する。ＥＳＩ－ＭＳの場合、ピーク面積は１～４の種について計算する。個々のピークは、全ての合わせたピークの合計面積に対して正規化し、反応進行曲線をプロットした（ｎ＝３）。次いで、データは、スリーステート動態スプライシングモデルのための結合された微分速度方程式に対する解析解にＰｒｏＦｉｔに適合させた。このアッセイを用いて出発物質を線状チオエステルから分離することはできないので、スリーステート動態モデルは結合ステップおよびスプライシング反応の最初の２つのステップを１つの平衡に崩壊させる。各スプライシング反応は、各複製を別々に分析して三重反復で行った。全ての値（ｎ＝３）の平均および標準偏差を報告する。

ＮｐｕおよびＣｆａに対する全体のトランススプライシング反応の動態解析
ＮｐｕおよびＣｆａを比較する全てのスプライシング反応はＲＰ－ＨＰＬＣにより分離し、ピーク面積はメーカーのソフトウェアを使用してもう一度計算した。これらの反応について、出発物質および分岐状中間体（種１および２）および産物（種３、４、５）のピーク面積を計算した。次に、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを一次速度式に適合させた。

［Ｐ］が正規化された積の強度である場合、［Ｐ］_ｍａｘはｔ＝∞（反応プラトー）でのこの値であり、ｋは速度定数（ｓ^－１）である。平均および標準偏差（ｎ＝３）を報告する。

ＤｎａＥインテイン多配列アライメントの生成および精製
ＮｐｕＤｎａＥのホモログは、ＮｐｕＤｎａＥタンパク質配列を用いたＮＣＢＩ^６（ヌクレオチドコレクション）およびＪＧＩ^７データベースのＢＬＡＳＴ^５検索により同定した。これにより、＞６０％の配列同一性を有する１０５のタンパク質を同定した。長いＣ－末端尾部を有するＮ－インテインについて、タンパク質はＮｐｕの長さである１０２の残基に切断した。ＪＧＩデータベースからのＮ－インテインについて、切断点はＢＬＡＳＴプログラムの結果により決定した（Ｂｌａｓｔ検索で同定された最後の残基を切断点として選択した）。次に、Ｊａｌｖｉｅｗ（図７Ａ）の全ての１０５のインテインの融合配列（すなわち、Ｃ－インテインに連結されたＮ－インテイン）の多配列アライメント（ＭＳＡ）を生成した^８。迅速にスプライシングされると予想されるインテインについてＭＳＡを精製するために、Ｋ７０、Ｍ７５、Ｍ８１、およびＳ１３６を含有しない全ての配列（「アクセラレータ」残基）をアライメントから除去し、高速スプライシング動態を有すると予想される７３のインテインを残した（図７Ｂ）。高速インテイン（Ｃｆａ）のこの精製されたアライメントのコンセンサス配列は、各位置で最も頻繁に現れるアミノ酸を決定することによりＪａｌｖｉｅｗで計算した。アライメントにおいて相同性の欠如ゆえにコンセンサス残基は位置９８および１０２で同定されなかったので、コンセンサス配列は１０１のアミノ酸に切断し、位置９８はＮｐｕＤｎａＥに見出される残基に固定した。次いで、このコンセンサス配列をＪａｌｖｉｅｗのＮｐｕＤｎａＥと整列させて、その同一性の割合を計算した。非同一残基は、ＮｐｕＤｎａＥ（ｐｄｂ＝４Ｋ１５）の結晶構造上にマッピングした（図１）。

図７Ａおよび７Ｂは、ＤｎａＥインテインファミリーのアライメントおよび精製を示す。図７Ａは、ＪＧＩおよびＮＣＢＩ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索から見出されたＤｎａＥインテインファミリーの１０５メンバーの多配列アライメント（ＭＳＡ）を示す。アライメントをフィルタリングするために使用される「アクセラレータ」残基の位置は、黒色の矢印で示している。図７Ｂは、全ての４つのアクセラレータ残基の存在に起因して高速スプライシング動態を示すと予測される７３のＤｎａＥインテインのＭＳＡを示す。

Ｃｆａエクステイン依存性のための大腸菌Ｋａｎ^Ｒスクリーニング
前述のとおり、タンパク質スプライシングカップリングカナマイシン耐性（Ｋａｎ^Ｒ）アッセイを行った^２．９。簡潔に述べると、Ｃ－エクステインの＋２位（プラスミド２２～２５）に存在するＦ、Ｇ、ＲまたはＥのいずれかを有するスプリットインテイン（Ｃｆａ）に融合した断片化アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするプラスミドを、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、スターター培養液において一晩培養した（ＬＢブロス、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１８時間）。次いで、これらの培養液を９６ウェルプレートに２０倍に希釈し、大腸菌の増殖を種々の濃度のカナマイシン（１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２．５、１０、２５、５０、１００、２５０、１０００μｇ／ｍＬのカナマイシン）で測定した。２４時間の終点で６５０ｎｍ（ＯＤ_６５０）における細胞の光学密度を、可変傾斜を有する用量反応曲線に適合させた。

ここでＯＤ_ｍｉｎは６５０ｎｍにおけるバックグラウンド吸光度に固定した。各アッセイを三重反復で行い、別々に適合させ、ＩＣ_５０値を、これら３つの別々の測定についてＩＣ_５０の平均および標準偏差として報告する。

抽出された封入体のタンパク質トランススプライシング
Ｈｉｓ_６－Ｓｕｍｏ－Ｃｆａ^Ｎ発現（プラスミド２０）を含む大腸菌封入体を再懸濁し、６Ｍ尿素を含む溶解バッファーに４℃で一晩抽出した。遠心分離（３５，０００ｒｃｆ、３０分）後、上清を除去し、タンパク質を変性条件下でＮｉ－ＮＴＡにより濃縮した（上記のとおり）。しかしながら、タンパク質をリフォールディングする代わりに、Ｃｆａ^Ｃ－ＣＦＮ（１０μＭＣｆａ^Ｃ、２ｍＭＴＣＥＰ、２ｍＭＥＤＴＡ、２時間、室温）の添加によりトランススプライシングを直接開始した。反応の進行をＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニターした。

αＤｅｃ２０５－ＨＣ－Ｉｎｔ^Ｎ試験発現およびスプライシング
ＨＣ－Ｎｐｕ^Ｎ、ＨＣ－Ｍｃｈｔ^Ｎ、ＨＣ－Ａｖａ^Ｎ、ＨＣ－Ｃｆａ^Ｎの試験発現
全てのｍＡｂ構築物の発現は、上述のとおり行った^３。簡潔に述べると、αＤｅｃ２０５－ＬＣおよびαＤｅｃ２０５－ＨＣ－Ｉｎｔ^ＮをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションし、９６時間（５％ＣＯ_２）インキュベートした。細胞をスピンダウン（５分、１，０００ｒｃｆ）し、各インテイン融合のための培地１５μＬを５μＬの４×ローディング色素と混合し、ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファー中の１２％ビス－トリスゲル上で泳動させた（５０分で１７０Ｖ）。次いで、タンパク質をウェスタンブロットにより分析した（ＰＶＤＦ膜に転写し、αＭｏｕｓｅＩｇＧに対してブロッティングした）。発現収量は、デンシトメトリーにより決定した培地中のＨＣ－Ｉｎｔ^Ｎの量として測定した。様々な細胞増殖および生存を説明するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のα－アクチンブロット（５秒の超音波、３５％振幅、１×ローディング色素中）を用いて収量を正規化し、ＨＣ－Ｃｆａ^Ｎの発現と比較して表した。この試験発現の４回の反復を行い、標準偏差として表される誤差を用いて平均値を計算した。

増殖培地におけるタンパク質トランススプライシング
上記のｍＡＢ－Ａｖａ^ＮおよびｍＡＢ－Ｃｆａ^Ｎ構築物の３７℃での９６時間の発現の後、培地をスピンダウンした（１，０００ｒｃｆ、５分間）。次いで、上清をＣｆａ^Ｃ－ＣＦＮペプチド（発現プラスミド２１の半合成）と混合し、室温（２μＭＣｆａ^Ｃ－ＣＦＮ、２ｍＭＴＣＥＰ、２ｍＭＥＤＴＡ）で２時間インキュベートした。スプライシング反応を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１７０Ｖで５０分間ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファー中での１２％ビス－トリスの泳動）により分析し、続けてウェスタンブロット（αＭｏｕｓｅＩｇＧ）により分析した。

ペプチドおよびデンドリマーの合成
Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（フルオレセイン）。このペプチドは、前で公開した手順に従ってＲｉｎｋＡｍｉｄｅ樹脂上に試薬を手動で添加することによって合成した^２。

補足スキーム１

化合物２（デンドリマーチオエステル）。この化合物は、４００ｍｇのＲｉｎｋＡｍｉｄｅ樹脂（置換：０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、１８８μｍｏｌ）のスケールで、補足スキーム１に概説した経路を用いて固相上で合成した。一般的な手順が最初に与えられ、続けてこのペプチドに対する任意の特定の方法が与えられる。ＤＭＦ中の３ｍＬの２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去し、２回実施した（３０秒間の脱保護１回、続けて１５分間の更なる脱保護）。それぞれの脱保護ステップの後、ならびにその後の全ての合成ステップの後、フロー洗浄を使用した（それぞれ約５ｍＬのＤＭＦで３×５秒）。４当量のモノマー、４当量のＨＢＴＵおよび８当量のＤＩＰＥＡのいずれかを用いて、特に明記しない限り、予備活性化なしでカップリングを実施した。完全にアシル化するように、全ての残基について二重カップリングを用いた。

トリチル保護基を、ＤＣＭ中の１％ＴＦＡ、５％ＴＩＳを用いて、合計３０ｍＬ（１０×３ｍＬ）の脱保護カクテルを用いて選択的に除去した。これらのサイクル中およびサイクル後の両方で、樹脂をＤＣＭで徹底的に洗浄することにより、遊離したトリチル種の除去を確実にした。樹脂をＤＭＦ中の５％ＤＩＰＥＡでも中和した後、次のカップリングを行った。Ａｌｌｏｃ基を０．１当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、２０当量のフェニルシランを用いてＤＣＭ中でそれぞれ３×４５分間脱保護した。これらのサイクル中およびサイクル後のＤＣＭによる樹脂の徹底的な洗浄、ならびに次のカップリング前のＤＭＦ洗浄における５％ＤＩＰＥＡを使用した。グルタル酸無水物モノマーは、チオエステルの形成を可能にする（すなわち、官能化する遊離樹脂結合カルボン酸を有するようにする）ために、予備活性化されたジカルボン酸として使用した。２０当量のグルタル酸無水物および１０当量のＤＩＰＥＡ（アシル化すべきアミンの数に対して）を樹脂に添加し、１時間反応させた。次いで、樹脂を洗浄し、カップリングを繰り返して樹脂に結合した第一級アミンの完全な反応を確実にした。樹脂に結合したチオエステルを形成するために、ＤＭＦ中の３０当量のチオグリコール酸メチル、５当量のＰｙＡＯＰおよび１０当量のＤＩＰＥＡ（カルボキシレートの数に対する）を樹脂に添加し、１時間反応させた。樹脂を過剰のＤＭＦで洗浄し、カップリング手順をさらに２回繰り返した。

切断は、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳおよび２．５％Ｈ_２Ｏにより室温で２時間実施した。次いでペプチドをジエチルエーテルにより沈殿させ、０．１％ＴＦＡを含む水に溶解し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。粗製物質をセミ分取スケールＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、所望の画分を分析し、プールし、凍結乾燥した。ＲＰ－ＨＰＬＣの特性：グラジエント０～７３％Ｂ、ｔ_ｒ＝１８．４分。予想される質量：２１９８．８６Ｄａ．実測値：２１９８．８２Ｄａ。

化合物３（デンドリマーフルオレセイン）
化合物３を天然のケミカルライゲーション（スキーム２）により合成した。化合物２をライゲーションバッファーに溶解し、５当量のＣｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（フルオレセイン）（１ｍＭ２、５ｍＭペプチド、４Ｍグアニジン、１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＭＰＡＡ、２０ｍＭＴＣＥＰ、ｐＨ７．０）で希釈し、室温で一晩反応させた。次いで、０．１Ｍメトキシアミン（最終濃度）の添加およびライゲーションバッファーのｐＨを４．０（一晩、室温）まで低下させることにより、チアゾリジンの脱保護を達成した。

ＲＰ－ＨＰＬＣにより化合物３を精製しようとした場合、それを酸性化して水で希釈すると難溶性であることを確認した。しかしながら、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（フルオレセイン）、ＭＰＡＡ、およびメトキシアミンは全て溶液中に残った。この観察から、０．１％ＴＦＡを用いて水中で１０倍希釈した後、選択的沈殿により３を精製した。沈殿した粉末を遠心分離（１７，０００ｒｃｆ、５分）により単離し、次いで残りの汚染物質をすべて洗い流すために再溶解した（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）。もう一度、酸性化によって溶液を沈殿させ、遠心分離（１７，０００ｒｃｆ、５分）により単離した。次いで、この単離された粉末を凍結乾燥した。予想される質量：４４１７．８Ｄａ．実測値：４４１７．５Ｄａ。

補足的スキーム２。ネイティブケミカルライゲーションを使用して、蛍光トリペプチドを有するテトラチオエステル含有化合物２を合成した。更なるライゲーションのために、メトキシルアミンを用いたその後の脱保護を使用してＮ－末端システインを曝すことで、四官能化デンドリマー、化合物３を得た。

化合物１：（Ｃｆａ^Ｃ－デンドリマー）
化合物１は発現されたタンパク質ライゲーションによって合成した。化合物３をライゲーションバッファーに溶解し、１．５当量のＣｆａ^Ｃ－ＭＥＳＮａチオエステル（１００μＭ３、１５０μＭＣｆａ^Ｃ－ＭＥＳＮａ、４Ｍグアニジン、１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴＣＥＰ、１００ｍＭＭＰＡＡ）と混合した。反応を室温で一晩進行させた。次いで、ライゲーションされた産物をセミ分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。所望の画分をプールし、凍結乾燥した。予想される質量：９８６０．８Ｄａ．実測値：９８６０．３Ｄａ。

αＤｅｃ２０５ｍＡｂを用いたデンドリマーのタンパク質トランススプライシング
そのＣ－末端に融合したＣｆａ^Ｎを有するαＤｅｃ２０５ｍＡｂを上記のとおり発現させた。９６時間の発現の後、培地をＡｍｉｃｏｎ３０Ｋ濃縮器（０．５ｍＬ）中で１０倍に濃縮した。化合物１をスプライシングバッファー（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に溶解し、次いで濃縮培地（２μＭ化合物１、２ｍＭＴＣＥＰ、１ｍＭＥＤＴＡ）と混合し、反応を室温で２時間進行させた。次いで、スプライシング混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１７０Ｖで５０分間、ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファーに１２％ビス－トリスを泳動）により分析し、蛍光画像装置で画像化した。これに続いて、ＰＶＤＦ膜への転写およびウェスタンブロット分析（αＭｏｕｓｅＩｇＧ）を行った。

本発明は、スプリットインテイン断片と化合物との間の種々の複合体の形成を可能にする。そのような複合体および化合物のいくつかを図１１の表に示す。Ｉｎｔ^Ｃは、スプリットインテイン断片、例えばスプリットインテインＣ断片である。例えば、デンドリマーは、化合物２、化合物３またはこれらの一部の形態をとり得る。例えば、カーゴは、色素（例えば、フルオレセイン）、別のマーカー分子、薬物（例えば、癌の治療に使用されるような細胞傷害性分子）、またはヌクレオチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、完全にまたは部分的に合成されたポリペプチドまたは天然に存在するポリペプチドまたはその一部であり得る。デンドリマーは、１つ以上の「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」分子がその上に「装填」され得る分岐状化学構造を有する分子であり得る。「カーゴ」分子は、天然に存在する分子の合成物であり得る。カーゴ分子は、遊離１，２－アミノチオールまたは１，２－アミノアルコールを有しないように構成することができる。インテインがアミノチオールまたはアミノアルコールを介してポリペプチドに結合される場合、図１１の表の３列目に示すように、形成された複合体は組換え融合タンパク質であると考えることができる。

実施例２：
スプライシングに基づく方法に対する主な注意点は、全ての特徴付けられたインテインがスプライス部位に隣接するエクステイン残基に配列優先を示すことである。＋１位に必須の触媒性Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ残基（すなわち、Ｃ－エクステイン内の第１残基）に加えて、ネイティブ挿入部位に見出される近位Ｎ－およびＣ－エクステイン配列に似ている残基の偏りがある。この好ましい配列の文脈からの逸脱は、スプライシング活性の著しい低下につながり、ＰＴＳに基づく方法の適用性を制限する^{２３，２４}。したがって、その活性が局所配列環境によって最小限に影響されるスプリットインテインが必要である。ＤｎａＥインテインについて、エクステイン配列の選択は、＋１位の触媒システインおよび＋２位で好ましい大きな疎水性残基に大きく限定されている^２５。

この実施例では、カナマイシン耐性アッセイにおいて、Ｃｆａ（Ｃｆａ_ＧＥＰ）の残基１２２～１２４への「ＥＫＤ」から「ＧＥＰ」のループ突然変異をエンジニアリングし、Ｃ－エクステインの＋２位置で乱雑さを増加させた（図９）。ＥＫＤ→ＧＥＰ突然変異は、広範囲のエクステインの状況下でＣｆａの活性を増加させる。さらに、これらの同じ（または類似の）突然変異が、ＤｎａＥインテインファミリー（Ｎｐｕおよび図７Ａおよび７Ｂに列挙されたものを含む）の他のメンバーとの乱雑さを増加させることが合理的に予測され得る。

以下の配列は、エンジニアリングされたインテインを表す：
本発明の一つの実施形態による、より「乱雑な」活性を付与する「ＧＥＰ」突然変異を有するＣｆａ^Ｃ－インテインは：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）である。

配列番号３８９の「ＧＥＰ」突然変異を有するＣｆａ－ＮインテインおよびＣｆａ－Ｃインテインの融合インテインの一例は：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３９０）である。

図９は、Ｃｆａ_ＧＥＰの増加した乱雑さを示す概略図および表を示す。パネルＡは、Ｃｆａスプリットインテインを有するＰＴＳ依存性大腸菌選択系を示す概略図を示す。カナマイシン耐性タンパク質ＫａｎＲは分裂し、Ｎ－およびＣ－インテイン断片（Ｃｆａ^ＮおよびＣｆａ^Ｃ）に融合する。＋２Ｃ－エクステイン残基（赤色Ｘ）は系内で変化する。パネルＢには、指示された＋２Ｃ－エクステイン残基を有するＣｆａ_ＥＫＤ（ＷＴ）およびＣｆａ_ＧＥＰ（ＧＥＰ）インテインのカナマイシン耐性のＩＣ_５０値を示している（誤差＝標準誤差（ｎ＝３））。

さらに、様々なエクステイン配列に対するこの同じ耐性も、大腸菌におけるｅＧＦＰの環化において観察された（図１０）。Ｃｆａ_ＧＥＰインテインは、試験した全ての好ましくない＋２Ｃ－エクステインの状況において、環化産物の収量の改善を示した（図１０パネルＡ、図１０パネルＢ）。さらに、Ｃｆａ_ＧＥＰは、－１および＋３エクステイン位置が変化しても、この改善された環化活性を維持する（図１０パネルＣ、図１０パネルＤ）。野生型天然スプリットＤｎａＥインテインにおいて同定されていないこのエンジニアリングされた「ＧＥＰ」ループ配列は、ＰＴＳに基づく技術にアクセス可能なタンパク質およびペプチドの幅を広げるべきである。

図１０は、Ｃｆａ_ＧＥＰスプリットインテインを用いたｅＧＦＰ環化を示す概略図およびグラフを示す。パネルＡは、＋２Ｃ－エクステイン位置（赤色Ｘ）で可変残基を有する大腸菌におけるｅＧＦＰの環化を示す概略図である。パネルＢには、指示された＋２Ｃ－エクステイン残基を有するＣｆａ_ＥＫＤ（ＷＴ）およびＣｆａ_ＧＥＰ（ＧＥＰ）について大腸菌において一晩発現後に形成された環化ｅＧＦＰの画分を示している（平均±標準偏差、ｎ＝３）。パネルＣは、＋３Ｃ－エクステイン位置（青色Ｘ）および－１Ｎ－エクステイン位置（赤色Ｘ）における可変残基を有する大腸菌におけるｅＧＦＰの環化を示す概略図である。パネルＤは、指示された＋３Ｃ－エクステインおよび－１Ｎ－エクステイン残基（平均±標準偏差、ｎ＝３）を有するＣｆａ_ＥＫＤ（ＷＴ）およびＣｆａ_ＧＥＰ（ＧＥＰ）についての大腸菌における一晩発現後に形成された環化ｅＧＦＰの画分を示す。

したがって、以下の特許請求の範囲は、上で具体的に図示し記載したもの、概念的に同等であるもの、明白に置換できるもの、本質的に本発明の本質的な考え方を組み込んだものも含むと理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、上述の好ましい実施形態の様々な適応および変更を構成できることを理解するであろう。例示された実施形態は、例示のためだけに記載されており、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は本明細書に具体的に記載された以外のものとして実施されてもよいことが理解されるべきである。

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（１０）Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．１９９４，３，２３４０．
（１１）Ｄｅａｒｄｅｎ，Ａ．Ｋ．；Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｂ．；Ｒｏｅｙ，Ｐ．Ｖ．；Ｌｉ，Ｚ．；Ｋｕｍａｒ，Ｕ．；Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｍ．；Ｎａｙａｋ，Ｓ．Ｋ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２０１３，２２，５５７．
（１２）Ｄｕ，Ｚ．；Ｓｈｅｍｅｌｌａ，Ｐ．Ｔ．；Ｌｉｕ，Ｙ．；ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｓ．Ａ．；Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｂ．；Ｎａｙａｋ，Ｓ．Ｋ．；Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｇ．；Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，１１５８１．
（１３）Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｍ．；Ｋｏｓｔｒｅｗａ，Ｄ．；Ｗｙｓｓ，Ｍ．；Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｒ．；Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．；Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓ，Ｌ．；ｖａｎＬｏｏｎ，Ａ．Ｐ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．２０００，１３，４９．
（１４）Ｓｔｅｉｐｅ，Ｂ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２００４，３８８，１７６．
（１５）Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．；Ｇｉｓｈ，Ｗ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．；Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３．
（１６）Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ，Ｉ．Ｖ．；Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ｈ．；Ｓｈａｂａｌｏｖ，Ｉ．；Ａｅｒｔｓ，Ａ．；Ｃａｎｔｏｒ，Ｍ．；Ｇｏｏｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．；Ｋｕｏ，Ａ．；Ｍｉｎｏｖｉｔｓｋｙ，Ｓ．；Ｎｉｋｉｔｉｎ，Ｒ．；Ｏｈｍ，Ｒ．Ａ．；Ｏｔｉｌｌａｒ，Ｒ．；Ｐｏｌｉａｋｏｖ，Ａ．；Ｒａｔｎｅｒｅ，Ｉ．；Ｒｉｌｅｙ，Ｒ．；Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｔ．；Ｒｏｋｈｓａｒ，Ｄ．；Ｄｕｂｃｈａｋ，Ｉ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１２，４０，Ｄ２６．
（１７）Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．；Ｃｉｕｆｏ，Ｓ．；Ｆｅｄｏｒｏｖ，Ｂ．；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｋ．；Ｔｏｌｓｔｏｙ，Ｉ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１４，４２，Ｄ５５３．
（１８）Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｈ．；Ｅｒｙｉｌｍａｚ，Ｅ．；Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｄ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，１８６７３．
（１９）Ｍｏｈｌｍａｎｎ，Ｓ．；Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ，Ｐ．；Ｇｒｅｖｅｎ，Ｓ．；Ｈａｒｒｅｎｇａ，Ａ．ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，１１，７６．
（２０）Ｂａｒｂｕｔｏ，Ｓ．；Ｉｄｏｙａｇａ，Ｊ．；Ｖｉｌａ－Ｐｅｒｅｌｌｏ，Ｍ．；Ｌｏｎｇｈｉ，Ｍ．Ｐ．；Ｂｒｅｔｏｎ，Ｇ．；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，９，２５０．
（２１）Ｖｉｌａ－Ｐｅｒｅｌｌｏ，Ｍ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｈ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｊ．Ａ．；Ｉｄｏｙａｇａ，Ｊ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，２８６．
（２２）Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｄ．；Ｐａｒｅｋｈ，Ｈ．Ｓ．；Ｓｔｅｐｔｏｅ，Ｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１４，３１，３１５０．
（２３）Ｉｗａｉ，Ｈ．；Ｚｕｇｅｒ，Ｓ．；Ｊｉｎ，Ｊ．；Ｔａｍ，Ｐ．Ｈ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２００６，５８０，１８５３．
（２４）Ａｍｉｔａｉ，Ｇ．；Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｂ．Ｐ．；Ｓｔａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｇ．；Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｍ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００９，１０６，１１００５．
（２５）Ｃｈｅｒｉｙａｎ，Ｍ．；Ｐｅｄａｍａｌｌｕ，Ｃ．Ｓ．；Ｔｏｒｉ，Ｋ．；Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２０１３，２８８，６２０２．

Claims

下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、１位のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ１）、７０位のＬｙｓ残基（Ｌｙｓ７０）、７２位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ７２）、７５位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ７５）および８１位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ８１）が保存されているアミノ酸配列を含んでなる、スプリットインテインＮ断片。
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号２）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、１位のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ１）、７０位のＬｙｓ残基（Ｌｙｓ７０）、７２位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ７２）、７５位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ７５）および８１位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ８１）が保存されているアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のスプリットインテインＮ断片。
請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ－断片と化合物とを含んでなる複合体であって、前記化合物がペプチドもしくはポリペプチドであるか、または、ペプチドもしくはポリペプチドを含むものである、複合体。
前記化合物が抗体鎖である、請求項３に記載の複合体。
前記化合物が抗体重鎖である、請求項３に記載の複合体。
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、１６位のＡｓｐ残基（Ａｓｐ１６）、２３位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ２３）、３４位のＳｅｒ残基（Ｓｅｒ３４）および３５位のＡｓｎ残基（Ａｓｎ３５）が保存されているアミノ酸配列を含んでなる、スプリットインテインＣ断片。
前記Ｃ断片の前記アミノ酸配列が、下記配列：
ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号４）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％配列同一性を有し、１７位のＡｓｐ残基（Ａｓｐ１７）、２４位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ２４）、３５位のＳｅｒ残基（Ｓｅｒ３５）および３６位のＡｓｎ残基（Ａｓｎ３６）が保存されているアミノ酸配列を含むものである、請求項６に記載のスプリットインテインＣ断片。
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３８９）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、１６位のＡｓｐ残基（Ａｓｐ１６）、２３位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ２３）、３４位のＳｅｒ残基（Ｓｅｒ３４）および３５位のＡｓｎ残基（Ａｓｎ３５）が保存されているアミノ酸配列を含んでなる、スプリットインテインＣ断片。
請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片と化合物とを含んでなる複合体であって、
・前記化合物が、下記構造：

［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素（Ｈ）およびカーゴ分子からなる群から選択されるものである］
を有するデンドリマーであるか、または
・前記化合物が、ペプチドであるか、または、ペプチドを含むものである、複合体。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、それぞれ色素分子である、請求項９に記載の複合体。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、それぞれ下記構造：

を有するフルオレセイン誘導体である、請求項９に記載の複合体。
前記化合物が、ペプチドに結合してなる１，２－アミノチオールである、請求項９に記載の複合体。
前記化合物が、ペプチドに結合してなる１，２－アミノアルコールである、請求項９に記載の複合体。
下記構造：

［式中、ＩｎｔＣは、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片であり、ｎは０～８である］
を有する複合体。
下記構造：

［式中、ＩｎｔＣは、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片であり、ｎは０～８である］
を有する複合体。
下記構造：

［式中、ＩｎｔＣは、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片であり、Ｘは、硫黄（Ｓ）または酸素（Ｏ）である］
を有する複合体。
請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片と、
請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片と
を含んでなる組成物。
請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミド。
請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドプラスミド。
２つの複合体をスプライシングするための方法であって、
第１の化合物と、請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片とを含む第１の複合体と、第２の化合物と、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片とを含む第２の複合体とを接触させ、当該接触が、前記スプリットインテインＮ断片と前記スプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成する条件下で実施されることを特徴とする工程と、
前記インテイン中間体を反応させて前記第１の化合物と前記第２の化合物とのコンジュゲートを形成する工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とし、
前記第１の化合物が、ペプチドであるか、または、ペプチドを含むものであり、
前記第２の化合物が、
・下記構造：

［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素（Ｈ）およびカーゴ分子からなる群から選択されるものである］
を有するデンドリマーであるか、または
・ペプチドであるか、または、ペプチドを含むものである、方法。
第１の化合物と、請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片とを含む第１の複合体と、第２の化合物と、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片とを含む第２の複合体とを接触させ、当該接触が、前記スプリットインテインＮ断片と前記スプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成する条件下で実施されることを特徴とする工程と、
前記インテイン中間体と求核剤とを反応させて前記第１の化合物と前記求核剤とのコンジュゲートを形成する工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とする方法であって、
前記第１の化合物が、ペプチドもしくはポリペプチドであるか、または、ペプチドもしくはポリペプチドを含むものであり、
前記第２の化合物が、
・下記構造：

［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素（Ｈ）およびカーゴ分子からなる群から選択されるものである］
を有するデンドリマーであるか、または
・ペプチドであるか、または、ペプチドを含むものである、方法。
前記第１の化合物が、ポリペプチドまたは抗体である、請求項２１に記載の方法。
前記第２の化合物が、デンドリマーまたはポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３９０）
に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、１位のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ１）、７０位のＬｙｓ残基（Ｌｙｓ７０）、７２位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ７２）、７５位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ７５）、８１位のＭｅｔ残基（Ｍｅｔ８１）、１１７位のＡｓｐ残基（Ａｓｐ１１７）、１２４位のＨｉｓ残基（Ｈｉｓ１２４）、１３５位のＳｅｒ残基（Ｓｅｒ１３５）および１３６位のＡｓｎ残基（Ａｓｎ１３６）が保存されているアミノ酸配列を含んでなるインテイン。
２つの複合体を一緒にスプライシングするためのキットであって、
請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片と、
請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片と、
前記スプリットインテインＮ断片と前記スプリットインテインＣ断片とを結合させてインテイン中間体を形成するための試薬と、
求核剤と
を含んでなる、キット。
請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列と、請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列とを融合させ、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列との融合物が隣接インテインをコードするようにする工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法。
請求項２６に記載の方法であって、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）
を含んでなるスプリットインテインＮ断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列と、
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）
を含んでなるスプリットインテインＣ断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と
を融合させ、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列との融合物が隣接インテインをコードするようにする工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
請求項６、７または８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチ配列と融合してなる、請求項１または２に記載のスプリットインテインＮ断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子融合物。
下記配列：
ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３）
を含んでなる、スプリットインテインＣ断片のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列と融合してなる、
下記配列：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号１）
を含んでなる、スプリットインテインＮ断片のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２８に記載の遺伝子融合物。
請求項１に記載のスプリットインテインＮ断片または請求項６～８のいずれか一項に記載のスプリットインテインＣ断片をコードするポリヌクレオチド。