JP2014528720A - スプリットインテインおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
インテインは、ラージおよびミニマル(ミニ)の2つの群に分類される(Liu XQ, Ann Rev Genet 34:61-76 (2000))。ラージインテインは、ミニインテインには存在しないホーミングエンドヌクレアーゼドメインを含む。スプライシング有効ミニインテインは、中央エンドヌクレアーゼドメインを削除することによりラージインテインから作製されたものであり、このことはエンドヌクレアーゼドメインがタンパク質スプライシングに関与しないことを示している(Chong S. and Xu M., J Biol Chem. 272:15587-15589 (1997); Derbyshire V. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 94:11466-11471 (1997);およびShingledecker K. et al. Gene. 207:187-195 (1998))。
インテインは、それらのスプライシング機構によって分類することができる。最もよく研究されているインテイン群であるクラス1インテインは、4つの保存されたスプライス接合部残基のうちの3つにより媒介される4つの求核攻撃の急速なプロセスを持つ。ステップ1において、このスプライシングプロセスは、N末端スプライシングドメインの第1の位置に位置するセリンまたはシステイン残基のアシルシフトで始まる。これにより、N−エクステイン/インテイン接合部に(チオ)エステル結合が形成される。ステップ2において、この(チオ)エステル結合は、C−エクステインの最初の残基(Cys、Ser、またはThr)のOH基またはSH基によって作用を受ける。これにより、N−エクステインをC−エクステインの最初の残基の側鎖に移動させるトランスエステル化に至る。ステップ3において、C末端スプライシングドメインの最後の位置に存在する保存されているAsnまたはGln残基が環化して、(チオ)エステル結合によりエクステインを連結する。最後に、ステップ4は、自発的なS−NまたはO−Nアシルシフトによる、(チオ)エステル結合のペプチド結合への再配列である。スプライシング反応に直接的または間接的に関与する重要なアミノ酸を図3Aに示す。
インテインは、2つの個別に転写および翻訳された遺伝子によりコードされる2つの断片として存在することもできる。これらのいわゆるスプリットインテインは自己会合し、タンパク質スプライシング活性をトランスで触媒する。
インテインは、広範なバイオテクノロジー適用において有益なツールである。インテインの天然スプライシング活性を用いたペプチドおよびタンパク質の連結は、インテイン媒介タンパク質連結(IPL)として知られ、またはタンパク質連結(EPL)と表現され、分子生物学およびバイオテクノロジーの方法において十分に確立されている(Evans T. et al., Biopolymers 51:333-342 (1999); Muir T. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95:6705-6710 (1998); and Severinov K. and Muir T., J Biol Chem. 273:16205-16209 (1998))。さらに、インテインは、インテイン標的タンパク質ボーダーにおいてのみ、部位特異的切断によるタンパク質精製に使用されてきた(Lu W. et al, J Chromatography A. 1218:2553-2560 (2011))。バイオセパレーションにおけるインテイン媒介法の使用は実験室規模では十分に確立され、大規模バイオテクノロジーへのますますの関心が寄せられている。大規模タンパク質生産のためのこれらのタンパク質精製技術の可能性は明らかであるが、工業的スケールアップ条件下でのインテイン媒介タンパク質精製系を開発しなければならない。他の適用としては、NMR分析のためのタンパク質のセグメント標識、タンパク質の環化、毒性タンパク質の発現制御、タンパク質への量子ドットのコンジュゲーションおよび非カノニカルアミノ酸の組み込みがある(Arnold U., Biotechnol Lett. 31:1129-1139 (2009); Charalambous A. et al., J Nanobiotechnology 7:9 (2009); Oeemig J. et al., FEBS Letters 583:1451-1456 (2009); Seyedsayamdost M. et al., Nat Protoc. 2:1225-1235 (2007); Zuger S. and Iwai H., Nat Biotechnol. 23:736-740 (2005);およびEvans T. et al., Annu Rev Plant Biol. 56:375-392 (2005))。基礎研究では、インテインは、in vivoタンパク質−タンパク質相互作用、具体的には、タンパク質の細胞オルガネラへの移行、外因性ポリペプチドの、生細胞上の膜タンパク質への連結またはタンパク質活性の光制御をモニタリングするために使用されてきた(Chong S. and Xu M., Homing endonucleases and inteins. Vol 16. Springer, Berlin Heidelberg, New York, 273-292 (2005); Ozawa T. and Umezawa Y., Homing endonucleases and inteins. Vol 16. Springer, Berlin Heidelberg, New York, 307-323 (2005); Ozawa T. et al., Nat Biotechnol. 21:287-293 (2003); Dhar T. and Mootz H., Chem Commun. 47:3063-3065 (2011);およびBinschik J. et al., Angewandte Chemie International Ed. 50(14):3249-3252 (2011))。バイオテクノロジーにおいて使用されるインテインのほとんどは原核生物に由来するか、またはS.セレビシエ(S. cerevisiae)VMA1−インテインの操作型変異体である(Elleuche & Poggeler 2010 Appl. Microbiol Biotechnol 78:479-489)。
本発明は、ロバストなスプリットインテインおよびその使用方法を提供する。本スプリットインテインは、大きな温度範囲、広いpH範囲、およびカオトロピック塩の存在下で活性である。本スプリットインテインはまた、融合した異種ポリペプチドの配列変異性に対して高い耐用性を示す。これらの特徴は、本スプリットインテインをタンパク質精製・工学技術に特に有用なものとする。
a.第1のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.第1のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.第1のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.第1のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一である。
a.第1のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.第1のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.第1のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.第1のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であり、第2のインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;または
e.第1のインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であれば、第2のインテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である。
いくつかのタンパク質工学適用において有用なスプリットインテインの説明を以下に提供する。スプリットインテインは、異種タンパク質と融合したGp41.1、Gp41.8、NrdA2、NrdJ1またはIMPDH1配列を含有し、例えば、タンパク質合成、切断、精製、連結、環化、および調節ならびに/またはタンパク質活性のモニタリングに使用することができる。
そうではないことが明確に定義されない限り、本明細書で使用される用語は、当技術分野における通常の意味に従って理解される。単数で使用されるまたは「1つ("a" or "an")」として言及される用語は、そうではないことが明示されているか文脈により示されない限り、複数形を含み、逆もまたそうである。標準技術および手順は一般に、当技術分野における常法および本明細書を通して示される種々の一般参照文献(引用することにより本明細書の一部とされるSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照)に従って実施される。
Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムを組み込んだGCGソフトウエアパッケージのGAPプログラムを用いて、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる(例えば、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、およびギャップウェイト16、14、12、10、8、6または4、およびレングスウェイト1、2、3、4、5を使用)。あるいは、特定の態様では、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)を使用し、残基表、ギャップレングスペナルティー12およびギャップペナルティー4とともにPAM120を用いて決定することができる。特定のアラインメントソフトウエアによる最大アラインメントのために適当なパラメーターは当業者により決定可能である。特定の態様では、アラインメントソフトウエアのデフォルトパラメーターを使用する。特定の態様では、第1のアミノ酸配列の第2のアミノ酸配列に対する同一性パーセンテージ「X」は、100×(Y/Z)として計算され、式中、Yは、第1の配列と第2の配列のアラインメントにおいて(目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインされた場合に)同一一致としてスコアが入れられたアミノ酸残基の数であり、Zは、第2の配列の残基の総数である。第2の配列が第1の配列よりも長ければ、同一性パーセントは、前記の第1の配列と第2の配列の間の重複領域でのみ決定されてよい。この場合、第1の配列と第2の配列が重複する領域の長さをZ値として使用すること以外は上記と同じ式を使用することができ、前記の領域は第1の配列の長さと実質的に同じ長さを有する。
インテインは、宿主タンパク質から自己切除し、ペプチド結合によるフランキング配列の連結を触媒することができるタンパク質エレメントである。スプリットインテインは、インテインのN末端ドメインとインテインのC末端ドメインがペプチド結合により直接連結されない任意のインテインである。天然スプリットインテインはシアノバクテリアおよび古細菌で確認されているが、スプリットインテインは、インテインの配列を2つに分離することにより人工的に作出することもできる。本明細書に記載のスプリットインテインは、大きな温度範囲および塩の存在下で機能するという点で既知のスプリットインテインを超える利点を提供する。スプリットインテインまた、他の既知のスプリットインテインよりも速い反応でスプライスする。さらに、本明細書に記載のスプリットインテインは、インテイン内とエクステイン内の両方の配列変異および/または異種ポリペプチド配列に耐用性を示す。本明細書に記載のスプリットインテインは、C−エクステインの最初のアミノ酸に依存せずにC末端自己切断を遂行できるという点で既知のスプリットインテインを超える利点を提供する。
スプリットインテインを含んでなる融合タンパク質もまた本明細書に記載される。インテインN末端ドメインおよび/またはインテインC末端ドメインは、直接的(すなわちペプチド結合を介して)または間接的(すなわちリンカーアミノ酸配列を介して)のいずれかで異種ポリペプチドと融合させることができる。
インテイン融合物をコードするポリヌクレオチドも本明細書に記載される。ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAの形態であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み、二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖である場合、コード鎖であっても非コード(アンチセンス)鎖であってもよい。特定の態様では、ポリヌクレオチドは単離される。特定の態様では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋される。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含有する組成物およびパーツキットに関する。本発明において用語「組成物」とは1以上の成分の組合せを意味し、これらの成分は、
(i)別個の処方物として提供し(すなわち、互いに独立)、次に、互いに併用するために一緒にすることができ;または
(ii)互いに併用するために、「合剤パック」の別個の成分として一緒に包装および提供することができる。
(i)(i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチド(前記異種ポリペプチドは前記インテインドメインのC末端にある)とを含んでなる融合タンパク質である第1の成分、ならびに
(ii)(i)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチド(前記異種ポリペプチドは前記インテインドメインのN末端にある)とを含んでなる融合タンパク質、およびN末端インテインドメイン(前記インテインドメインの最初のアミノ酸がセリンまたはシステイン以外のアミノ酸である)からなる群から選択される第2の成分
を含んでなり、ここで、
a.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号7と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号16と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号24と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号38と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;あるいは
e.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号65と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である。
(i)(i)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチド(この異種ポリペプチドは前記インテインドメインのN末端にある)とを含んでなる融合タンパク質である第1の成分、ならびに
(ii)(i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチド(前記異種ポリペプチドは前記インテインドメインのC末端にある)とを含んでなる融合タンパク質、およびC末端インテインドメイン(前記インテインドメインの最後のアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミン以外のアミノ酸であり、前記異種ポリペプチドまたは前記リンカーの最初のアミノ酸がセリン、システイン、またはトレオニン以外のアミノ酸である)からなる群から選択される第2の成分
を含んでなり、ここで、
a.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインは配列番号7と少なくとも75%同一であり;
b.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインは配列番号16と少なくとも75%同一であり;
c.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインは配列番号24と少なくとも75%同一であり;
d.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインは配列番号38と少なくとも75%同一であり;あるいは
e.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号64 と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインは配列番号65と少なくとも75%同一である。
(i)(i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)第2の異種ポリペプチド(前記異種ポリペプチドは前記インテインドメインのC末端にある)とを含んでなる融合タンパク質、ならびに
(ii)(i)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)第1の異種ポリペプチド(前記異種ポリペプチドは前記インテインドメインのN末端にある)とを含んでなる融合タンパク質
を含んでなり、ここで、
a.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号7と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号16と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号24と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号38と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;あるいは
e.第1の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号65と少なくとも75%同一であり、かつ、第2の成分を形成する融合タンパク質に由来するインテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である。
本明細書に記載のスプリットインテインおよびスプリットインテインを含んでなる融合タンパク質は、例えば、ポリペプチド配列を切断、連結(スプライシング)および/または環化するために使用することができる。インテイン配列はこれらの反応を触媒し、これらの反応は、他の酵素、化学添加剤、または処理の不在下で起こり得る。
本発明はまた、インテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、インテインドメインと異種ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の発現をもたらす位置に異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入を可能とする1以上のクローニング部位とを含んでなるインテイン融合タンパク質の生成に好適なベクターも提供する。
(i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第1のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、
(ii)前記ポリヌクレオチドの下流に、第1のインテインドメインをコードする第1のクローニング部位と、
(iii)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第2のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、
(iv)前記ポリヌクレオチドの上流に、第2のインテインドメインをコードする第2のクローニング部位と
を含んでなり、
第1のクローニング部位が第1の対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とし、第2のクローニング部位が第2の対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とし、これにより、前記の順に、第2の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、第2のインテインドメインと、第1のインテインドメインと、第2の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが形成されるベクターであって、
a.前記第1のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.前記第1のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.前記第1のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一でれば、前記第2のインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.前記第1のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;または
e.前記第1のインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である、
ベクターに関する。
Gp41.1(G1)、Gp41.8(G8)、NrdJ1(N1)、およびIMPDH1(I1)スプリットインテイン配列を含む構築物を用いてin vitroトランススプライシング反応を行った。ロバストで高収率のインテインとして同定されているスプリットインテインNpu DnaE(DE)(Zettler J. et al, FEBS Letters 583:909-914 (2009))を対照として選択した。これらのインテインの番号、略号、配列および分子量を下表3に示す。図1Aに示されるように、各スプリットインテイン構築物のN末端断片は、(i)StreptagII(ST)精製タグ、(ii)タンパク質の溶解度を高めることができるファージタンパク質バクテリオファージλ頭部タンパク質D(gpD)、(iii)N−エクステインに属す5個の天然フランキングアミノ酸(EN)、(iv)N末端スプリットインテイン断片(IN)、および(v)ヘキサヒスチジン精製タグ(H6)からなった。各スプリットインテイン構築物のC末端断片も図1Aに示し、(i)C末端スプリットインテイン断片(IC)、(ii)C−エクステインに属す5個の天然フランキングアミノ酸(EC)、(iii)タンパク質の溶解度を高め、タンパク質フォールディングを助けることができるチオレドキシン、および(iv)ヘキサヒスチジン精製タグ(H6)からなった。
これらのスプリットインテインの多才性およびロバスト性を種々の温度で試験するため、Gp41.1をより詳細に分析した。インテイン活性は温度によって影響を受けることが示されている。これまでには4℃といった低温で天然Ssp DnaEおよび半合成Mtu RecAスプリットインテインにより媒介されるタンパク質スプライシング活性の証拠が報告されている(Martin, D. et al. 2001. Biochemistry, 40:1393-1402 and Lew, B. et al. 1999. Biopolymers (Peptide Science), 51:355-362)が、4℃未満での活性は本発明者らの知る限り従前の記載はない。従って、GP41.1の活性を様々な温度で試験した。Gp41.1の精製N末端断片およびC末端断片をスプライシングバッファー中、5μMの等モル濃度で混合し、0、12、25および37℃でインキュベートした。スプライシング産物の形成および速度定数を決定し、結果を表5に示す。
Ssp DnaE、およびMtu RecAインテインを含む多くのスプリットインテインが高pHまたは変性剤の存在下で収率の低下、および加水分解副産物形成の増加を呈することが示されている(Zettler et al., 2009. FEBS letters 583: 909-914)。しかしながら、G1スプライシングの効率は6〜9の間のpHにほぼ依存しなかった(表6)。4および10といった極端なpH値でのみ活性の低下が見られた。これに対して、Mtu RecAは、pH6〜7.5の間というはるかに狭い最適スプライシング範囲を有している(Lew B. et al. Biopolymers. 51:355-362 (1999))。Ssp DnaEインテインは、pH7.0で最大のトランススプライシング活性を示すが、それより高いpHでは低下する(Martin D. et al. 2001. Biochemistry. 40:1393-1402)。
N−インテインドメインに隣接するN−エクステイン(EN)アミノ酸はトランススプライシング反応に直接関与しないが、反応効率に影響を及ぼし得る。この可能性を調べるために、G1由来のENの5個のアミノ酸(TRSGY)を欠失させ、作出された新たなN末端断片(G1N(Δext))を、実施例1に記載したものと同じ条件で、対応するC末端断片(G1C)とともにインキュベートした。興味深いことに、ENの不在下でトランススプライシング活性が見られ(速度値1.8E−3s−1および収率45%)、このことはG1スプリットインテイン由来のENが必須ではないことを示す。
いくつかのインテインはN末端またはC末端において非依存的自己切断活性を示し、独特なアミノ酸残基を必要とする。INにおけるCys1からAlaへの突然変異(C1A)はN末端における切断を不能とするが、C末端における切断は不能とせず(これまでにC末端自己切断と呼ばれていたもの)、一方、ICのC末端におけるAsn154からAlaへの突然変異はC末端における切断を不能とするが、N末端における切断は不能としない(Mathys, S. et al. Gene 231:1-13 (1999) and Lu et al. J. Chromatography A. 1218:2553-2560 (2011))。この興味深い特性のために、いくつかの突然変異インテインは、融合タンパク質からの対象タンパク質の制御された遊離を可能とする自己切断可能なペプチドとして使用することができる。よって、このような突然変異インテインは、高価な市販のプロテアーゼの代わりに使用できる。
数種のインテインおよびスプリットインテインについて、エクステインのすぐ上流のAsnの突然変異によりC末端切断を遮断しても、N−切断がなお起こり得ることが記載されている。エクステインのすぐ上流のAsnをAlaに置換することにより、この突然変異をGp41.1、Gp41.8、NrdJ1およびIMPDH1スプリットインテインのICドメインに導入した(それぞれG1C(N→A)、G8C(N→A)、N1C(N→A)およびI1C(N→A))。従前に記載されているように、これらの融合タンパク質を、大腸菌で生産し、精製し、その後、本質的に従前に記載されているように等量の対応物G1N、G8N、N1NおよびI1Nとともにインキュベートした。驚くことに、SDS−PAGEゲルに明らかに見られたのは2つの予想されたN末端自己切断産物のうちの一方(IN−H6)だけであったという所見により結論づけることができるように、N末端自己切断反応は極めて非効率的であった。ST−gpD−ENに相当するもう一方の予想産物も、極めて弱いバンドながら見られ、このことは、N末端自己切断反応が極めて非効率的であったことを示している。さらに、おそらくはST−gpD−ENと結合したC末端断片(G1C(N→A)、G8C(N→A)、N1C(N→A)またはI1C(N→A))に相当する中間産物も主要副産物として見られた。
Claims (29)
- (i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質であって、前記異種ポリペプチドが、前記インテインドメインのC末端にある、融合タンパク質。
- 前記異種ポリペプチドと前記インテインドメインとが、ペプチド結合により直接連結されているかまたはリンカーにより連結されている、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記異種ポリペプチドまたは前記リンカーの最初のアミノ酸が、セリン、システイン、またはトレオニンである、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、アスパラギンまたはグルタミン以外のアミノ酸であり、かつ、前記異種ポリペプチドまたは前記リンカーの最初のアミノ酸が、セリン、システイン、またはトレオニン以外のアミノ酸である、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- (i)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインと、(ii)異種ポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質であって、前記異種ポリペプチドが、前記インテインドメインのN末端にある、融合タンパク質。
- 前記異種ポリペプチドと前記インテインドメインとが、ペプチド結合により直接連結されているかまたはリンカーにより連結されている、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記インテインドメインの最初のアミノ酸が、セリンまたはシステインである、請求項6または7に記載の融合タンパク質。
- 前記インテインドメインの最初のアミノ酸が、セリンまたはシステイン以外のアミノ酸である、請求項6または7に記載の融合タンパク質。
- 第1のインテインドメインと第2のインテインドメインと異種ポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質であって、前記異種ポリペプチドが、前記第1のインテインドメインのN末端にあり、かつ、前記異種ポリペプチドが、前記第2のインテインドメインのC末端にあり、かつ、
(a)前記第1のインテインドメインが配列番号3と少なくとも75%同一であって、前記第2のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であるか;
(b)前記第1のインテインドメインが配列番号12と少なくとも75%同一であって、前記第2のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であるか;
(c)前記第1のインテインドメインが配列番号20と少なくとも75%同一であって、前記第2のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であるか;または
(d)前記第1のインテインドメインが配列番号34と少なくとも75%同一であって、前記第2のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であるか;または
(e)前記第1のインテインドメインが配列番号64と少なくとも75%同一であって、前記第2のインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一である、
融合タンパク質。 - 前記異種ポリペプチドと第2のインテインドメインとが、ペプチド結合またはリンカーにより連結されており、かつ、前記異種ポリペプチドの最初のアミノ酸または前記リンカーの最初のアミノ酸が、セリン、システイン、またはトレオニンである、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 第1の成分と第2の成分とを含んでなる、組成物またはパーツキットであって、
(i)前記第1の成分が請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、かつ、
(ii)前記第2の成分が請求項9に記載の融合タンパク質およびN末端インテインドメインからなる群から選択され、
a.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であって、請求項9に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインが配列番号3と少なくとも75%同一であるか;
b.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であって、請求項9に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインが配列番号12と少なくとも75%同一であるか;
c.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であって、請求項9に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインが配列番号20と少なくとも75%同一であるか;
d.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であって、請求項9に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインが配列番号34と少なくとも75%同一であるか;
e.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であって、請求項9に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはN末端インテインドメインが配列番号64と少なくとも75%同一である、
組成物またはパーツキット。 - 第1の成分と第2の成分とを含んでなる、組成物またはパーツキットであって、
(i)前記第1の成分が請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、かつ、
(ii)前記第2の成分が請求項5に記載の融合タンパク質およびC末端インテインドメインからなる群から選択され、
a.請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号3と少なくとも75%同一であって、請求項5に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であるか;
b.請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号12と少なくとも75%同一であって、請求項5に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であるか;
c.請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号20と少なくとも75%同一であって、請求項5に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であるか;
d.請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号34と少なくとも75%同一であって、請求項5に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であるか;
e.請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号64と少なくとも75%同一であって、請求項5に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインまたはC末端インテインドメインが配列番号65少なくとも75%同一である、
組成物またはパーツキット。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質と請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを含んでなる、組成物またはパーツキットであって、
a.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であって、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質が配列番号3と少なくとも75%同一であるか;
b.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であって、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質が配列番号12と少なくとも75%同一であるか;
c.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であって、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号20と少なくとも75%同一であるか;
d.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であって、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号34と少なくとも75%同一であるか;または
e.請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であって、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質に由来するインテインドメインが配列番号64と少なくとも75%同一である、
組成物またはパーツキット。 - (i)インテインドメインのC末端に連結されている異種ポリペプチドをインテインドメインから切断するための方法であって、インテインを介したタンパク質切断を可能とする条件下で、請求項12に記載の組成物をインキュベートすること、または請求項12に記載のパーツキットの成分を会合させること、を含んでなる方法、
(ii)インテインドメインのN末端に連結されている異種ポリペプチドをインテインドメインから切断するための方法であって、インテインを介したタンパク質切断を可能とする条件下で、請求項13に記載の組成物をインキュベートすること、または請求項13に記載のパーツキットの成分を会合させること、を含んでなる方法、
(iii)第1のポリペプチドのN末端と第2のポリペプチドのC末端を共有結合させる方法であって、インテインスプライシングを可能とする条件下で、請求項14に記載の組成物をインキュベートすること、または請求項14に記載のパーツキットの成分を会合させることを含んでなり、前記第1のポリペプチドが、請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質の一部を形成する異種ポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドが、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質の一部を形成する異種ポリペプチドである、方法、
(iv)異種ポリペプチドを環化するための方法であって、請求項10または11に記載の融合タンパク質を、インテインスプライシングを可能とする条件下でインキュベートすることを含んでなり、前記異種ポリペプチドが、請求項10または11に記載の融合タンパク質の一部を形成する異種ポリペプチドである、方法
からなる群から選択される方法。 - 配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの下流に、対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とする少なくとも1つのクローニング部位とを含んでなり、これにより、前記インテインドメインと対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが形成される、ベクター。
- 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項16に記載のベクター。
- 前記インテインドメインの最後から2番目のアミノ酸が、ヒスチジンである、請求項17に記載のベクター。
- 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、アスパラギンまたはグルタミン以外のアミノ酸である、請求項16に記載のベクター。
- 前記インテインドメインと前記異種ペプチドによりコードされるポリペプチドとの間にリンカーペプチドを形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項16に記載のベクター。
- 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、アスパラギンまたはグルタミン以外のアミノ酸であり、前記リンカーの最初のアミノ酸が、セリン、システインまたはトレオニン以外のアミノ酸である、請求項20に記載のベクター。
- 配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一であるインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに上流に、対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とする少なくとも1つのクローニング部位とを含んでなり、これにより、対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとインテインドメインとを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが形成される、ベクター。
- 前記インテインドメインの最初のアミノ酸が、セリンまたはシステインである、請求項22に記載のベクター。
- 前記インテインドメインの最初のアミノ酸が、セリンまたはシステイン以外のアミノ酸である、請求項22に記載のベクター。
- 配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第1のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの下流に、対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とする少なくとも1つのクローニング部位と、前記クローニング部位の下流に、配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第2のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドとを含んでなり、これにより、対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと第1および第2のインテインドメインとを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが形成されるベクターであって、
a.前記第1のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.前記第1のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.前記第1のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.前記第1のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;または
e.前記第1のインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である、ベクター。 - 前記インテインドメインの最後のアミノ酸が、グルタミンまたはアスパラギンであり、前記インテインドメインの最後から2番目のアミノ酸が、ヒスチジンであり、かつ/または前記第2のインテインドメインの最初のアミノ酸が、セリンまたはシステインである、請求項25に記載のベクター。
- (i)配列番号7、16、24、38および65からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第1のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、
(ii)第1のインテインドメインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に、第1のクローニング部位と、
(iii)配列番号3、12、20、34および64からなる群から選択される配列と少なくとも75%同一である第2のインテインドメインをコードするポリヌクレオチドと、
(iv)第2のインテインドメインをコードする前記ポリヌクレオチドの上流に、第2のクローニング部位と
を含んでなる、ベクターであって、
第1のクローニング部位が第1の対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とし、第2のクローニング部位が第2の対象ポリヌクレオチドのクローニングを可能とし、これにより、前記の順に、第2の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、第2のインテインドメインと、第1のインテインドメインと、第2の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが形成され、
a.前記第1のインテインドメインが配列番号7と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号3と少なくとも75%同一であり;
b.前記第1のインテインドメインが配列番号16と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号12と少なくとも75%同一であり;
c.前記第1のインテインドメインが配列番号24と少なくとも75%同一でれば、前記第2のインテインドメインは配列番号20と少なくとも75%同一であり;
d.前記第1のインテインドメインが配列番号38と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号34と少なくとも75%同一であり;または
e.前記第1のインテインドメインが配列番号65と少なくとも75%同一であれば、前記第2のインテインドメインは配列番号64と少なくとも75%同一である、ベクター。 - 前記第2のインテインドメインと前記第2の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとを連結する第1のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなり、かつ/または前記第1のインテインドメインと前記第1の対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとを連結する第2のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項27に記載のベクター。
- 前記第2のインテインドメインの最初のアミノ酸が、システインまたはセリンであり、前記第1のインテインドメイン最後のアミノ酸が、グルタミンまたはアスパラギンであり、前記第1のインテインドメインの最後から2番目のアミノ酸が、ヒスチジンであり、かつ/または第2の対象ポリペプチドのまたは前記第1のペプチドリンカーの最初のアミノ酸が、システイン、セリンまたはトレオニンである、請求項27に記載のベクター。
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