JP2003534768A - 環状ペプチド - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 環状ペプチドの製造方法及びループ状ペプチド中間体のスプライシング方法を提供する。
【解決手段】 スプリットインテインのトランス−スプライシング能力を利用して、そのスプリットインテインの２つの部分間に介在するターゲットペプチドを有する前駆体ペプチドからペプチドの環化を触媒する。そのスプリットインテインの２つの部分の相互作用により触媒作用的にアクティヴなインテインを生成すると共に強制的にターゲットペプチドをループ状に形成する。
Description
【０００１】
環状ペプチド
関連発明の説明
本願は、1998年12月18日出願の米国仮出願第60／112,723号と、「環状ペプチド
と生体蛋白質の生成」と称する1999年10月7日出願の米国仮出願に基づき仮出願
の利益を主張し、その両方の出願に本願の中で言及することにより、内容を組入
れている。
と生体蛋白質の生成」と称する1999年10月7日出願の米国仮出願に基づき仮出願
の利益を主張し、その両方の出願に本願の中で言及することにより、内容を組入
れている。
【０００２】
連邦政府
本発明は、米国厚生省により認定されたＧＭ13306号及びＧＭ19891号の下で連
邦政府の支援を受けて完成されたものである。本発明に対し、連邦政府が何らか
の権利を有する可能性がある。
邦政府の支援を受けて完成されたものである。本発明に対し、連邦政府が何らか
の権利を有する可能性がある。
【０００３】
発明の分野
本発明は、生化学の分野に係わり、特に、環状ペプチド、環状ペプチドの製造
方法、及び環状ペプチドを特定の特徴のために選別（screening）する方法に係
わる。
方法、及び環状ペプチドを特定の特徴のために選別（screening）する方法に係
わる。
【０００４】
発明の背景
直鎖状の(linear)小ペプチドは、生理学上の（physiological）種々の現象を調
べるのに有用である。なぜなら、それらは、広範囲の生物学的活動を示現し、固
相法（solid phase synthesis）と組合せ化学（combinational chemistry）にお
ける従来の技術を利用してほとんど無限に変更可能な配列で合成できるからであ
る。又、これらの特質のため、新薬を識別し開発するために直鎖状の小ペプチド
が特に役立つことになる。例えば、無数の異なった直鎖状小ペプチドの大きなラ
イブラリー（library）を人工的に用意し、種々の生物学的検定法(biological a
ssays)で特定の特徴のために選別可能である。例えば、Scotty, J.K. 及びG.P.
Smithによる1990年サイエンス誌249:386、同じく、Delvin, J.J.他の1990年サイ
エンス誌、24:404, Furka, A.他による1991年Int. J. Pept. Protein Res.37:48
7、及びLam.K.S. 他による1991年ネィチャー誌354:82参照。特定の特徴を発現す
る前記ライブラリー内のペプチドは、将来の研究対象の候補として分離できる。
ミクロシーケンシング（microsequencing）又はその他の化学分析を使用して選
別されたペプチド、例えばアミノ酸配列などを特徴付けることができる。これら
の利点にもかかわらず、従来、ごくひと握りの直鎖状小ペプチドしか用途の広い
医薬品に開発されてこなかった。その1つの理由は、直鎖状小ペプチドは、通常
人体からあまりに早く排出されてしまい治療効果を発揮できなかったことがある
。
べるのに有用である。なぜなら、それらは、広範囲の生物学的活動を示現し、固
相法（solid phase synthesis）と組合せ化学（combinational chemistry）にお
ける従来の技術を利用してほとんど無限に変更可能な配列で合成できるからであ
る。又、これらの特質のため、新薬を識別し開発するために直鎖状の小ペプチド
が特に役立つことになる。例えば、無数の異なった直鎖状小ペプチドの大きなラ
イブラリー（library）を人工的に用意し、種々の生物学的検定法(biological a
ssays)で特定の特徴のために選別可能である。例えば、Scotty, J.K. 及びG.P.
Smithによる1990年サイエンス誌249:386、同じく、Delvin, J.J.他の1990年サイ
エンス誌、24:404, Furka, A.他による1991年Int. J. Pept. Protein Res.37:48
7、及びLam.K.S. 他による1991年ネィチャー誌354:82参照。特定の特徴を発現す
る前記ライブラリー内のペプチドは、将来の研究対象の候補として分離できる。
ミクロシーケンシング（microsequencing）又はその他の化学分析を使用して選
別されたペプチド、例えばアミノ酸配列などを特徴付けることができる。これら
の利点にもかかわらず、従来、ごくひと握りの直鎖状小ペプチドしか用途の広い
医薬品に開発されてこなかった。その1つの理由は、直鎖状小ペプチドは、通常
人体からあまりに早く排出されてしまい治療効果を発揮できなかったことがある
。
【０００５】
環状に閉じること、即ち、環化はペプチドが生体内で劣化する速度を減少し、
薬効協働力学的 （pharmocokinetic）特性を劇的に改善する。既知の医療価値の
ある環状ペプチドの大多数は、天然資源（たとえば、カルシトニン、オキシトシ
ン、バソプレシンなど）から分離して同定されてきた。不幸にも、特定の生物学
的活動の為に選別可能な天然に存在する環状ペプチドの集合（pool）は本来的に
限定されている。その上、天然資源から環状ペプチドを分離し純化するために必
要な工程は煩雑で、そのような選別を割高で非実用的なものにする。従って、無
限に変形可能なアミノ酸配列の多数の異種ペプチドを生成する合成方法は、新薬
の候補として特定の環状ペプチドをつきとめることに多いに役立つことになる。
薬効協働力学的 （pharmocokinetic）特性を劇的に改善する。既知の医療価値の
ある環状ペプチドの大多数は、天然資源（たとえば、カルシトニン、オキシトシ
ン、バソプレシンなど）から分離して同定されてきた。不幸にも、特定の生物学
的活動の為に選別可能な天然に存在する環状ペプチドの集合（pool）は本来的に
限定されている。その上、天然資源から環状ペプチドを分離し純化するために必
要な工程は煩雑で、そのような選別を割高で非実用的なものにする。従って、無
限に変形可能なアミノ酸配列の多数の異種ペプチドを生成する合成方法は、新薬
の候補として特定の環状ペプチドをつきとめることに多いに役立つことになる。
【０００６】
従来、環状ペプチドを生成する種々の方法が記述されてきた。たとえば、米国
特許第4,033,940号や4,102,877号に記述されているような化学反応プロトコール
が、環化ペプチドを生成するために考案されてきた。別の技術では、生物学的方
法と化学的方法が組み合わされ、環状ペプチドを製造する。その後者の方法では
、細胞内（例えばバクテリア）の環状ペプチドの直鎖状前駆体（precursor）を
先ず表現して環状ペプチドの直鎖状前駆体を生成し、次いで外因性の（exogenou
s）作用因子、例えばプロテアーゼや求核試薬を添加し、これらの直鎖状前駆体
を化学的に環状ペプチドに変える。Camerero, J.A. 及びMuir, T.W.による1999
年 J.Am.Chem.Societyの121:5597及び Wu,H. 他による1998年 Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 95:9226 参照。
特許第4,033,940号や4,102,877号に記述されているような化学反応プロトコール
が、環化ペプチドを生成するために考案されてきた。別の技術では、生物学的方
法と化学的方法が組み合わされ、環状ペプチドを製造する。その後者の方法では
、細胞内（例えばバクテリア）の環状ペプチドの直鎖状前駆体（precursor）を
先ず表現して環状ペプチドの直鎖状前駆体を生成し、次いで外因性の（exogenou
s）作用因子、例えばプロテアーゼや求核試薬を添加し、これらの直鎖状前駆体
を化学的に環状ペプチドに変える。Camerero, J.A. 及びMuir, T.W.による1999
年 J.Am.Chem.Societyの121:5597及び Wu,H. 他による1998年 Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 95:9226 参照。
【０００７】
一旦生成されると、環状ペプチドは、薬理的な活動のために選別可能になる。
例えば、多数の異なった環状ペプチドを包含するライブラリーを用意し、特別の
特徴、例えば特定のターゲットリガンド（目標配位子）を結合する能力など、の
ために選別可能である。そのライブラリーはターゲットリガンドと混合し、その
ターゲットリガンドと結合するライブラリーの構成要素が分離されアミノ酸配列
により同定可能である。同様に、環状ペプチドのライブラリーは特定の生物学的
活動の検定法に付加できる。そして、その生物学的活動を調整する環状ペプチド
は、分離・配列化により同定できる。
例えば、多数の異なった環状ペプチドを包含するライブラリーを用意し、特別の
特徴、例えば特定のターゲットリガンド（目標配位子）を結合する能力など、の
ために選別可能である。そのライブラリーはターゲットリガンドと混合し、その
ターゲットリガンドと結合するライブラリーの構成要素が分離されアミノ酸配列
により同定可能である。同様に、環状ペプチドのライブラリーは特定の生物学的
活動の検定法に付加できる。そして、その生物学的活動を調整する環状ペプチド
は、分離・配列化により同定できる。
【０００８】
不幸にも、アクティヴなペプチドを同定する工程は困難なため、それらの選別
検定法は労力と時間がかかる。例えば、選別検定法は通常は逆方向のマッピング
工程を必要とする。なぜなら、ターゲットリガンドと結合したり又は生物学的活
動を調整（modulate）する環状ペプチドの実際の量は、通常はそのまま直接的に
シーケンシングできないほど微量であるからである。この問題を避けるため、ラ
イブラリーを備える種々の環状ペプチドの物理的位置を示すマップを作成しても
よい。
検定法は労力と時間がかかる。例えば、選別検定法は通常は逆方向のマッピング
工程を必要とする。なぜなら、ターゲットリガンドと結合したり又は生物学的活
動を調整（modulate）する環状ペプチドの実際の量は、通常はそのまま直接的に
シーケンシングできないほど微量であるからである。この問題を避けるため、ラ
イブラリーを備える種々の環状ペプチドの物理的位置を示すマップを作成しても
よい。
【０００９】
異なった位置からの環状ペプチドの選別物（aliquots）は、次に選別検定法内
で対応した位置に移される。そして、ある活動に対応して選別されたもの(例え
ば生物学的活動の結合や調整を発現する検定法内の領域が前記ライブラリー内の
その対応位置にマップ化される。そのライブラリーの領域の環状ペプチドは、次
に分離し配列化できる。標本取扱による空間的解決の必要性とそれにより課せら
れる制限から生じる困難により、所定時間内で選別可能な候補ペプチドの数が限
定される。
で対応した位置に移される。そして、ある活動に対応して選別されたもの(例え
ば生物学的活動の結合や調整を発現する検定法内の領域が前記ライブラリー内の
その対応位置にマップ化される。そのライブラリーの領域の環状ペプチドは、次
に分離し配列化できる。標本取扱による空間的解決の必要性とそれにより課せら
れる制限から生じる困難により、所定時間内で選別可能な候補ペプチドの数が限
定される。
【００１０】
検定法で選別可能なペプチドの数は、ペプチドを発現する細胞を使用すること
で劇的に増加できる。例えば、直鎖状ペプチドのライブラリーを発現するように
設計されたバクテリアを選別検定法に添加し、特定の特徴に対応して選別された
ものを発現するバクテリアを、その検定法から直接拾うことができる。その拾わ
れたバクテリアは、次に多数複製可能で選別された直鎖状ペプチドを大量に生成
し（例えばシーケンシングにより）その同定化と生産を促進できる。 しかし、生体内の直鎖状小ペプチドの生成・選別は、結果的に厄介であることが
判明した。なぜなら、直鎖状小ペプチドは通常の細胞代謝（metabolic）過程で
急速により劣化するからである。ペプチドの環化は、ペプチドを細胞内で安定化
することによりこの問題を回避できる。
で劇的に増加できる。例えば、直鎖状ペプチドのライブラリーを発現するように
設計されたバクテリアを選別検定法に添加し、特定の特徴に対応して選別された
ものを発現するバクテリアを、その検定法から直接拾うことができる。その拾わ
れたバクテリアは、次に多数複製可能で選別された直鎖状ペプチドを大量に生成
し（例えばシーケンシングにより）その同定化と生産を促進できる。 しかし、生体内の直鎖状小ペプチドの生成・選別は、結果的に厄介であることが
判明した。なぜなら、直鎖状小ペプチドは通常の細胞代謝（metabolic）過程で
急速により劣化するからである。ペプチドの環化は、ペプチドを細胞内で安定化
することによりこの問題を回避できる。
【００１１】
それにも係わらず、従来は環状ペプチドの大ライブラリーの細胞内の生成は実
行可能ではなかった。なぜなら、一般的で容易に実行可能な生体内ペプチド環状
化方法は利用できなかったからである。例えば、生体内で環状ペプチドを生成す
る周知の方法は非リボソームペプチドシンテターゼ（NRPS）コンプレックスを利
用する（Cane他、1998年サイエンス誌 282:63）。しかし、そのようなNRPSコン
プレックスは作用し易いわけでもなく一度に単一環以上の環状ペプチドを製造す
るのに有用なわけでもない。その上、単量体（アミノ酸）の直鎖状配列がそれを
エンコードする核酸分子でベース（bases）直鎖状配列により書取られるリボソ
ームペプチド合成と異なり、前記NRPS法により生成される単量体の直鎖状配列は
前記NRPSコンプレックスのサブユニット組織により書き取られる。そのNRPS法に
より生成される環状ペプチドの配列の変更は、所望の単量体を組入れるサブユニ
ットをクローニングし、そのサブユニットをその他の全てのサブユニットを既に
取込んでいるホストセルに導入することを伴う。この技術を使用してライブラリ
ーを制作するには、NPRSサブユニットの組合せ（組成と順序の両方）をホストセ
ルに導入し、そのサブユニットが確実に正確な超分子構造に組立てられる方法を
工夫することが求められる。
行可能ではなかった。なぜなら、一般的で容易に実行可能な生体内ペプチド環状
化方法は利用できなかったからである。例えば、生体内で環状ペプチドを生成す
る周知の方法は非リボソームペプチドシンテターゼ（NRPS）コンプレックスを利
用する（Cane他、1998年サイエンス誌 282:63）。しかし、そのようなNRPSコン
プレックスは作用し易いわけでもなく一度に単一環以上の環状ペプチドを製造す
るのに有用なわけでもない。その上、単量体（アミノ酸）の直鎖状配列がそれを
エンコードする核酸分子でベース（bases）直鎖状配列により書取られるリボソ
ームペプチド合成と異なり、前記NRPS法により生成される単量体の直鎖状配列は
前記NRPSコンプレックスのサブユニット組織により書き取られる。そのNRPS法に
より生成される環状ペプチドの配列の変更は、所望の単量体を組入れるサブユニ
ットをクローニングし、そのサブユニットをその他の全てのサブユニットを既に
取込んでいるホストセルに導入することを伴う。この技術を使用してライブラリ
ーを制作するには、NPRSサブユニットの組合せ（組成と順序の両方）をホストセ
ルに導入し、そのサブユニットが確実に正確な超分子構造に組立てられる方法を
工夫することが求められる。
【００１２】
本発明の要約
環状ペプチド・ライブラリの生体内生産と選別の一般的方法が発見されている
。この方法に於いて、ペプチドの環状化を暗号化するヌクレオチド配列は、分裂
（または遊離）インテイン（Ｃ−インテインまたはIｃ）のカルボキシ基末端部
分を暗号化するヌクレオチド配列に一端を接し、他端においては分裂（または遊
離）インテイン（Ｎ−インテインまたはＩN）アミノ基末端部分を暗号化するヌ
クレオチド配列と接するように、アミノ酸分子は構成される。バクテリア或いは
真核細胞のようなホストシステム内の構造を発現すると融合蛋白質が生産される
。次に融合蛋白質の二つの分裂インテイン成分（例えばＩＣとＩＮ）は集合して
活性酵素を形成し、アミノ基末端とカルボキシ基末端を共に分裂させて環状ペプ
チドの基幹を生成する。この化学反応は下記に述べられている。
。この方法に於いて、ペプチドの環状化を暗号化するヌクレオチド配列は、分裂
（または遊離）インテイン（Ｃ−インテインまたはIｃ）のカルボキシ基末端部
分を暗号化するヌクレオチド配列に一端を接し、他端においては分裂（または遊
離）インテイン（Ｎ−インテインまたはＩN）アミノ基末端部分を暗号化するヌ
クレオチド配列と接するように、アミノ酸分子は構成される。バクテリア或いは
真核細胞のようなホストシステム内の構造を発現すると融合蛋白質が生産される
。次に融合蛋白質の二つの分裂インテイン成分（例えばＩＣとＩＮ）は集合して
活性酵素を形成し、アミノ基末端とカルボキシ基末端を共に分裂させて環状ペプ
チドの基幹を生成する。この化学反応は下記に述べられている。
【００１３】
インテインに媒介される環状化作用
【００１４】
【化１】
アミノ基末端とカルボキシ基末端の断片から活性インテインを形成することに
より、Ｎ−インテインと環状化されるペプチド（上図ＢにおいてのＸ＝Ｓ又は０
）の間の結合点におけるアミノ酸のエステル異性体を安定化される。Ｒ＝ＸＨの
時、Ｃ−インテインから生ずるヘテロ原子は保持されて、エステルに作用し環状
エステル中間体（Ｃ）を生成する。インテインにより触媒作用されてアミノスシ
ニマイドが形成されると環状ペプチド（ラクトン形で）を遊離し、環状ペプチド
は転位して、熱力学的に基幹（ラクタム形）環状ペプチド生成物を形成する（Ｅ
）。この方法は、予定された特性を持つ環状ペプチドの選択或いは選別を容易に
する。
より、Ｎ−インテインと環状化されるペプチド（上図ＢにおいてのＸ＝Ｓ又は０
）の間の結合点におけるアミノ酸のエステル異性体を安定化される。Ｒ＝ＸＨの
時、Ｃ−インテインから生ずるヘテロ原子は保持されて、エステルに作用し環状
エステル中間体（Ｃ）を生成する。インテインにより触媒作用されてアミノスシ
ニマイドが形成されると環状ペプチド（ラクトン形で）を遊離し、環状ペプチド
は転位して、熱力学的に基幹（ラクタム形）環状ペプチド生成物を形成する（Ｅ
）。この方法は、予定された特性を持つ環状ペプチドの選択或いは選別を容易に
する。
【００１５】
従って、分裂したインテインの1番目の部分、２番目の部分そして、1番目と２
番目の部分の中間に存在するターゲットインテインを有するポリペプチドを暗号
化する核酸分子を人工的に発生させる特徴を、本発明は有する。ホストシステム
における核酸分子の発現はポリペプチドを生成し、ポリペプチドはホストシステ
ムにおいて自然に分裂しターゲットペプチドの環化形を発生させるか、又は活性
インテイン中間体、チオエステル中間体又はラリアット中間体のような環化形タ
ーゲットペプチドのスプライシング中間体を発生させる。
番目の部分の中間に存在するターゲットインテインを有するポリペプチドを暗号
化する核酸分子を人工的に発生させる特徴を、本発明は有する。ホストシステム
における核酸分子の発現はポリペプチドを生成し、ポリペプチドはホストシステ
ムにおいて自然に分裂しターゲットペプチドの環化形を発生させるか、又は活性
インテイン中間体、チオエステル中間体又はラリアット中間体のような環化形タ
ーゲットペプチドのスプライシング中間体を発生させる。
【００１６】
分裂したインテインの1番目の部分、２番目の部分の両方とも、ＳＳｐ Ｄna
Ｅのような自然分裂したインテインから誘導される。別の変化では、分裂インテ
イン部分の一方又は両方がＲecＡ，ＤnaＢ，ＰspＰol-I，そしてＰlfインテイン
から誘導されるような人工的発生の分裂インテインから誘導され得る。
Ｅのような自然分裂したインテインから誘導される。別の変化では、分裂インテ
イン部分の一方又は両方がＲecＡ，ＤnaＢ，ＰspＰol-I，そしてＰlfインテイン
から誘導されるような人工的発生の分裂インテインから誘導され得る。
【００１７】
もう一つの局面に於いては、本発明は、分裂したインテインの1番目の部分、
２番目の部分、３番目の部分そして４番目の部分を有するポリペプチドを暗号化
する人工的核酸分子を特徴とする。この分子は、分裂したインテインの1番目の
部分と２番目の部分の間に置かれている1番目のターゲットペプチド及び分裂し
たインテインの３番目の部分と４番目の部分の間に置かれている２番目のターゲ
ットペプチドを持つことができる。分裂したインテインの1番目の部分は、分裂
したインテインの３番目の部分に対して相補的であり得るが２番目の部分に対し
ては相補的であり得ない。そして分裂したインテインの２番目の部分は、分裂し
たインテインの４番目の部分に対して相補的であり得るが３番目の部分に対して
は相補的であり得ない。
２番目の部分、３番目の部分そして４番目の部分を有するポリペプチドを暗号化
する人工的核酸分子を特徴とする。この分子は、分裂したインテインの1番目の
部分と２番目の部分の間に置かれている1番目のターゲットペプチド及び分裂し
たインテインの３番目の部分と４番目の部分の間に置かれている２番目のターゲ
ットペプチドを持つことができる。分裂したインテインの1番目の部分は、分裂
したインテインの３番目の部分に対して相補的であり得るが２番目の部分に対し
ては相補的であり得ない。そして分裂したインテインの２番目の部分は、分裂し
たインテインの４番目の部分に対して相補的であり得るが３番目の部分に対して
は相補的であり得ない。
【００１８】
また本発明に於いて、本発明の核酸分子を構成する表現ベクターも含まれる。
ホストシステムに於ける表現ベクターは、ホストシステム中で自然に分裂して環
状ペプチド又はスプライシング中間物を生じさせるポリペプチドを生成する。本
発明の表現ベクターは又、ホストシステム中でポリペプチドの発現を容易にする
規定配列を持つことができる。ベクターの核酸分子は、特別の特性を持った環化
形ターゲットペプチドの選別を容易にするペプチドを暗号化するヌクレオチド配
列、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドの精製を容易にするペプチド
を暗号化するヌクレオチド配列、の双方又は一方を有する。
ホストシステムに於ける表現ベクターは、ホストシステム中で自然に分裂して環
状ペプチド又はスプライシング中間物を生じさせるポリペプチドを生成する。本
発明の表現ベクターは又、ホストシステム中でポリペプチドの発現を容易にする
規定配列を持つことができる。ベクターの核酸分子は、特別の特性を持った環化
形ターゲットペプチドの選別を容易にするペプチドを暗号化するヌクレオチド配
列、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドの精製を容易にするペプチド
を暗号化するヌクレオチド配列、の双方又は一方を有する。
【００１９】
もう一方の局面では、本発明は、分裂したインテインの1番目の部分に対して
融合した1番目の端部と、分裂したインテインの２番目の部分に対して融合した
２番目の端部を有するターゲットペプチドを持つポリペプチドを暗号化する表現
ベクトルを特徴とする。本発明の表現ベクターは、プラスミド、バクテリアファ
ージ、ヴィールス、線状核酸分子又は他の型のベクターであり得る。
融合した1番目の端部と、分裂したインテインの２番目の部分に対して融合した
２番目の端部を有するターゲットペプチドを持つポリペプチドを暗号化する表現
ベクトルを特徴とする。本発明の表現ベクターは、プラスミド、バクテリアファ
ージ、ヴィールス、線状核酸分子又は他の型のベクターであり得る。
【００２０】
更に本発明は、分裂したインテインの1番目の部分、２番目の部分と分裂した
インテインの1番目の部分と２番目の部分の間に存在するターゲットペプチドを
有する本質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、ホスト
システム中で自然に分裂することができ環化形ターゲットペプチドを生ずるか、
或いはスプライシング中間物を生じることができる。
インテインの1番目の部分と２番目の部分の間に存在するターゲットペプチドを
有する本質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、ホスト
システム中で自然に分裂することができ環化形ターゲットペプチドを生ずるか、
或いはスプライシング中間物を生じることができる。
【００２１】
又、本発明中のホストシステムは、本発明の核酸分子を内在する。このホスト
システムは、バクテリア、原始バクテリアの様な原核細胞であり、イースト菌又
は哺乳類の細胞、植物細胞、生体外での転写／翻訳システム、細胞溶解物の様な
真核細胞であり得る。
システムは、バクテリア、原始バクテリアの様な原核細胞であり、イースト菌又
は哺乳類の細胞、植物細胞、生体外での転写／翻訳システム、細胞溶解物の様な
真核細胞であり得る。
【００２２】
他の面では、本発明はペプチド分子の製作方法を特徴とする。この方法は次の
手段を有する。本発明による分離した核酸分子を用意する、ホストシステムを用
意する、分離した核酸分子をホストシステムに誘導する、そして分離した核酸分
子を発現する。一つの変形方法として、分離した核酸分子を発現する手段でポリ
ペプチドが生成され、ホストシステム中で自然に分裂して環化形ターゲットペプ
チドを生じる。この方法は、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドを精
製する手段を特徴とする。
手段を有する。本発明による分離した核酸分子を用意する、ホストシステムを用
意する、分離した核酸分子をホストシステムに誘導する、そして分離した核酸分
子を発現する。一つの変形方法として、分離した核酸分子を発現する手段でポリ
ペプチドが生成され、ホストシステム中で自然に分裂して環化形ターゲットペプ
チドを生じる。この方法は、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドを精
製する手段を特徴とする。
【００２３】
この方法のもう一つの変形では、分離した核酸分子を発現する手段により、環
化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物が生成される。この方法は又、
ホストシステムから環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物を精製す
る手段を特徴とする。またこの方法のもう一つの変形は、スプライシング中間物
から環状ペプチドを形成する手段を有する。またこの方法のもう一つの局面では
、プロテーゼ又はチオールの様な外来附加物無しに、ホストシステムに於いて、
環化形としてターゲットペプチドが生産される。
化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物が生成される。この方法は又、
ホストシステムから環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物を精製す
る手段を特徴とする。またこの方法のもう一つの変形は、スプライシング中間物
から環状ペプチドを形成する手段を有する。またこの方法のもう一つの局面では
、プロテーゼ又はチオールの様な外来附加物無しに、ホストシステムに於いて、
環化形としてターゲットペプチドが生産される。
【００２４】
本発明のもう一つの局面は、ポリペプチドのライブラリを用意する方法である
。この方法は、異なるアミノ酸配列を持つ複数のターゲットペプチドを暗号化す
る複数の核酸分子を供給する手段である。複数の核酸分子の各々を表現ベクター
に組み込み複数の表現ベクターを形成し、ホストシステムに於いて表現ベクター
を発現させる。
。この方法は、異なるアミノ酸配列を持つ複数のターゲットペプチドを暗号化す
る複数の核酸分子を供給する手段である。複数の核酸分子の各々を表現ベクター
に組み込み複数の表現ベクターを形成し、ホストシステムに於いて表現ベクター
を発現させる。
【００２５】
ホストシステムに於いて自然に分裂して環化形ターゲットペプチドを生じさせ
るポリペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物の様な
複数のペプチド分子がホストシステムに於ける表現ベクターの発現により生成さ
れる様に、各々の発現ベクターを形成した状態で、複数の核酸分子は、分裂した
インテインの1番目の部分を暗号化する核酸分子と２番目の部分を暗号化する核
酸分子の間に位置している。
るポリペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物の様な
複数のペプチド分子がホストシステムに於ける表現ベクターの発現により生成さ
れる様に、各々の発現ベクターを形成した状態で、複数の核酸分子は、分裂した
インテインの1番目の部分を暗号化する核酸分子と２番目の部分を暗号化する核
酸分子の間に位置している。
【００２６】
そしてもう一つの局面では、本発明は、予定された特性をもつペプチド分子を
選別する方法を有する。この方法は、次の様な手段を有する。分裂したインテイ
ンの1番目の部分、２番目の部分と、分裂したインテインの1番目の部分と２番目
の部分の間に在るターゲットペプチドで構成されるポリペプチドを暗号化する核
酸分子を用意する、ホストシステムを用意する、分離した核酸分子をホストシス
テムに誘導する、ペプチド分子が生産される条件下にホストシステムを置く、そ
のペプチド分子が予定の特性であるかをテストする。ホストシステムに於ける核
酸分子の発現は、ホストシステムに於けるポリペプチドの自然分裂から発生する
環化形ターゲットペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中
間物を生成する。
選別する方法を有する。この方法は、次の様な手段を有する。分裂したインテイ
ンの1番目の部分、２番目の部分と、分裂したインテインの1番目の部分と２番目
の部分の間に在るターゲットペプチドで構成されるポリペプチドを暗号化する核
酸分子を用意する、ホストシステムを用意する、分離した核酸分子をホストシス
テムに誘導する、ペプチド分子が生産される条件下にホストシステムを置く、そ
のペプチド分子が予定の特性であるかをテストする。ホストシステムに於ける核
酸分子の発現は、ホストシステムに於けるポリペプチドの自然分裂から発生する
環化形ターゲットペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中
間物を生成する。
【００２７】
この方法の一つの変形は、予定された特性はターゲット分子を特に拘束する能
力を有し、予定の特性であるかどうかのテスト手段は、（ａ）ペプチド分子をタ
ーゲット分子に接触させ、（ｂ）ペプチド分子がターゲット分子に結合するかど
うかを決定する手段を有する。もう一つの変形では、予定された特性とは生化学
反応を調節する能力のことである。そのペプチド分子が予定の特性であるかをテ
ストする手段は、（ａ）ペプチド分子を生化学反応を有するシステムに接触させ
（ｂ）ペプチド分子が生化学反応を調節するかどうかを決定する手段で構成され
る。ペプチド分子がターゲット分子に結合するか或いは生化学反応を調節するか
どうかを決定する手段は、細胞周期或いは有機物の生成の分析により、色彩の変
化、蛍光信号を観測することにより測定できる。
力を有し、予定の特性であるかどうかのテスト手段は、（ａ）ペプチド分子をタ
ーゲット分子に接触させ、（ｂ）ペプチド分子がターゲット分子に結合するかど
うかを決定する手段を有する。もう一つの変形では、予定された特性とは生化学
反応を調節する能力のことである。そのペプチド分子が予定の特性であるかをテ
ストする手段は、（ａ）ペプチド分子を生化学反応を有するシステムに接触させ
（ｂ）ペプチド分子が生化学反応を調節するかどうかを決定する手段で構成され
る。ペプチド分子がターゲット分子に結合するか或いは生化学反応を調節するか
どうかを決定する手段は、細胞周期或いは有機物の生成の分析により、色彩の変
化、蛍光信号を観測することにより測定できる。
【００２８】
これ等の方法に於けるターゲット分子は、薄膜連合分子或いは細胞内分子（例
えば、ミトコンドリア、リソソーム、内質網状組織、緑葉体、ゴルジそして原形
質膜の様な細胞核分子或いは一つ又はそれ以上の細胞小器官）の様な細胞連合分
子であり得る。又、細胞外分子でもあり得る。生化学反応は、細胞内の代謝現象
、薄膜連合現象、細胞核現象の様な細胞連合過程である。
えば、ミトコンドリア、リソソーム、内質網状組織、緑葉体、ゴルジそして原形
質膜の様な細胞核分子或いは一つ又はそれ以上の細胞小器官）の様な細胞連合分
子であり得る。又、細胞外分子でもあり得る。生化学反応は、細胞内の代謝現象
、薄膜連合現象、細胞核現象の様な細胞連合過程である。
【００２９】
これ等の方法に於いて、ペプチド分子が予定された特性を持つかどうかののテ
ストの手段は、ハイブリッドシステムと固相支持体の上にペプチド分子を固定す
る手段の双方か一方を使って行われる。
ストの手段は、ハイブリッドシステムと固相支持体の上にペプチド分子を固定す
る手段の双方か一方を使って行われる。
【００３０】
本発明は又、混合物から環状ペプチドを精製する方法をも特徴とする。この方
法は、次の手段を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体
を含む混合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体
と、アフィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、そ
の支持体が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄
して支持体から特別でない結合をしている物質を除去する、スプライシング中間
体から環状ペプチドを作る試剤を支持体に付加する、そして環状ペプチドを支持
体から溶離する。
法は、次の手段を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体
を含む混合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体
と、アフィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、そ
の支持体が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄
して支持体から特別でない結合をしている物質を除去する、スプライシング中間
体から環状ペプチドを作る試剤を支持体に付加する、そして環状ペプチドを支持
体から溶離する。
【００３１】
前述の変形として本発明は、混合物から環状ペプチドを精製する次の手段を持
つ方法を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体を含む混
合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体と、アフ
ィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、その支持体
が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄して支持
体から特別な結合はしていない物質を除去する、そしてスプライシング中間体を
支持体から溶離する、そしてスプライシング中間体から環状ペプチドを作る溶離
されたスプライシング中間体に試剤を加える。
つ方法を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体を含む混
合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体と、アフ
ィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、その支持体
が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄して支持
体から特別な結合はしていない物質を除去する、そしてスプライシング中間体を
支持体から溶離する、そしてスプライシング中間体から環状ペプチドを作る溶離
されたスプライシング中間体に試剤を加える。
【００３２】
加えるに、本発明は、スプライシング中間体を結び付けているターゲット分子
を混合物から精製する方法を有する。この方法は、次の手段から成っている。上
部に特に結合しているスプライシング中間体を有する固相支持体を用意する、支
持体を混合物中のターゲット分子に接触させる、支持体を洗浄して支持体から特
別な結合はしていない物質を除去する、ターゲット分子を支持体から溶離する。
を混合物から精製する方法を有する。この方法は、次の手段から成っている。上
部に特に結合しているスプライシング中間体を有する固相支持体を用意する、支
持体を混合物中のターゲット分子に接触させる、支持体を洗浄して支持体から特
別な結合はしていない物質を除去する、ターゲット分子を支持体から溶離する。
【００３３】
ここで使用されている「非自然的発生」という句は、直接又は間接的に人体の
活動を介して行われることを意味する。従って「非自然的発生」の核酸は、人間
による操作を介して生成されるもので、自然な進化プロセスを介して生成される
ものではない。
活動を介して行われることを意味する。従って「非自然的発生」の核酸は、人間
による操作を介して生成されるもので、自然な進化プロセスを介して生成される
ものではない。
【００３４】
「核酸分子」という句は、順次に結合した2つ以上のヌクレオチドの鎖を意味
する。例えば、核酸分子はＤＮＡやＲＮＡであり得る。
する。例えば、核酸分子はＤＮＡやＲＮＡであり得る。
【００３５】
ここで使用されている「ペプチド」とは、順次に結合した2つ以上のアミノ酸
の鎖を意味し、ポリペプチドとプロテインを包含する。「ポリペプチド」とは、
長さや翻訳後（post-translational）の変性に係わらず、2つ以上のペプチドか
らなるポリマーを意味する。「プロテイン」とは、アミノ酸の鎖を意味し、ペプ
チド、ポリペプチド、プロテイン、及び糖蛋白（glycoprotein），リポ蛋白（li
poprotein），燐蛋白（phosphoprotein），金属蛋白質 （metalloprotein）等の
変性プロテインを包含する。
の鎖を意味し、ポリペプチドとプロテインを包含する。「ポリペプチド」とは、
長さや翻訳後（post-translational）の変性に係わらず、2つ以上のペプチドか
らなるポリマーを意味する。「プロテイン」とは、アミノ酸の鎖を意味し、ペプ
チド、ポリペプチド、プロテイン、及び糖蛋白（glycoprotein），リポ蛋白（li
poprotein），燐蛋白（phosphoprotein），金属蛋白質 （metalloprotein）等の
変性プロテインを包含する。
【００３６】
直鎖状ペプチドとは、一般的に環状でなく、カルボキシル基の遊離端を備えた
カルボキシル基アミノ酸とアミノ基の遊離端を有するアミノ基アミノ酸の双方を
有する。
カルボキシル基アミノ酸とアミノ基の遊離端を有するアミノ基アミノ酸の双方を
有する。
【００３７】
これと比較して、「環状ペプチド」とは環状化されたペプチドを指す。ここで
「環状」とは環(リング)を形成する構成原子を有することを意味する。ペプチド
に言及する場合、「環化」という意味は、そのペプチドを環状すなわち環状化さ
せることを意味する。したがって、例えば，直鎖状のペプチドが環化されるのは
、その遊離アミノ基がその遊離カルボキシル基と共有結合して遊離基がペプチド
に残っていない時である。
「環状」とは環(リング)を形成する構成原子を有することを意味する。ペプチド
に言及する場合、「環化」という意味は、そのペプチドを環状すなわち環状化さ
せることを意味する。したがって、例えば，直鎖状のペプチドが環化されるのは
、その遊離アミノ基がその遊離カルボキシル基と共有結合して遊離基がペプチド
に残っていない時である。
【００３８】
ここで使用する「スプライシング中間体」とは、開放された環状ペプチド生成
物が形成される前に前述したインテインにより媒介される環状化反応の間に発生
するポリペプチドである。スプライシング中間体は「アクティヴ‐インテイン中
間体」（すなわち、前述の例でＡラベルのポリペプチドと類似した化学構造のも
の）、「チオエステル中間体」（すなわち、前述の例でＢラベルのポリペプチド
と類似した化学構造のもの）、及び「輪縄形（lariat）形中間体」（すなわち、
前述の例でＣラベルのポリペプチドと類似した化学構造のもの）、を包含する。
物が形成される前に前述したインテインにより媒介される環状化反応の間に発生
するポリペプチドである。スプライシング中間体は「アクティヴ‐インテイン中
間体」（すなわち、前述の例でＡラベルのポリペプチドと類似した化学構造のも
の）、「チオエステル中間体」（すなわち、前述の例でＢラベルのポリペプチド
と類似した化学構造のもの）、及び「輪縄形（lariat）形中間体」（すなわち、
前述の例でＣラベルのポリペプチドと類似した化学構造のもの）、を包含する。
【００３９】
「ターゲットペプチド」とは、スプライシング中間体で環状化又は表示される
べき対象としてのペプチドを意味する。例えば，前駆体プロテインにおいてスプ
リットインテインのカルボキシル基部分とアミノ基部分の中間に介在させたペプ
チドは、そのペプチドがその前駆体プロテインのスプライシングにより環化され
るか又はその前駆体プロテインの処理（例えば折り畳み‐folding）によりスプ
ライシング中間体の一部となるならば、ターゲットペプチドになるであろう。
べき対象としてのペプチドを意味する。例えば，前駆体プロテインにおいてスプ
リットインテインのカルボキシル基部分とアミノ基部分の中間に介在させたペプ
チドは、そのペプチドがその前駆体プロテインのスプライシングにより環化され
るか又はその前駆体プロテインの処理（例えば折り畳み‐folding）によりスプ
ライシング中間体の一部となるならば、ターゲットペプチドになるであろう。
【００４０】
ここで使用する「インテイン」という言葉は、プロテインの翻訳後処理の間に
スプライシング反応に触媒作用可能な前駆体プロテイン内に埋込まれた自然発生
又は人工的に構成されるポリペプチド配列を意味する。周知のインテインのリス
トは、http：//www.neb.com/inteins.htmlで公開されている。「スプリットイン
テイン」とは、互いに融合していない２つ以上の分離成分を有するインテインで
ある。
スプライシング反応に触媒作用可能な前駆体プロテイン内に埋込まれた自然発生
又は人工的に構成されるポリペプチド配列を意味する。周知のインテインのリス
トは、http：//www.neb.com/inteins.htmlで公開されている。「スプリットイン
テイン」とは、互いに融合していない２つ以上の分離成分を有するインテインで
ある。
【００４１】
ここで使用する「介在させる」という言葉の意味は、“間に置く”ことである
。従って、第２と第３のペプチドの間に介在させた第１のペプチドを有するポリ
ペプチドにおいて、その第１のペプチドを構成するアミノ酸の鎖は，物理的に、
第２のペプチドを構成するアミノ酸鎖と第３のペプチドを構成するアミノ酸鎖の
間に位置することになる。
。従って、第２と第３のペプチドの間に介在させた第１のペプチドを有するポリ
ペプチドにおいて、その第１のペプチドを構成するアミノ酸の鎖は，物理的に、
第２のペプチドを構成するアミノ酸鎖と第３のペプチドを構成するアミノ酸鎖の
間に位置することになる。
【００４２】
「異質のアミノ酸配列」を有する複数のペプチドとは、その複数のペプチドが
、少なくとも２つ以上で通常は多数の，本質的に全く異なるアミノ酸配列の異な
るペプチドから成ることを意味する。
、少なくとも２つ以上で通常は多数の，本質的に全く異なるアミノ酸配列の異な
るペプチドから成ることを意味する。
【００４３】
ここで使用する「ホストシステム」という句は、核酸分子が転写、複製及び／
又は翻訳される媒体又は媒介物、及び／又はポリペプチドが継合わされる（スプ
ライスされる）か翻訳後処理される媒体又は媒介物を指す。
又は翻訳される媒体又は媒介物、及び／又はポリペプチドが継合わされる（スプ
ライスされる）か翻訳後処理される媒体又は媒介物を指す。
【００４４】
ここで使用する「自発的」という言葉は、記述された作用が外因性物質の添加
なしで発生することを意味する。例えば、ホストシステム内の前駆体ポリペプチ
ドは、その前駆体ポリペプチドか又はその前駆体ポリペプチドをエンコードする
核酸分子以外には何もそのホストシステムに添加されない際に自発的にスプライ
スして環状ペプチドを生成する。対照的に、ホストシステムへの外因性作用因子
(agent)が環状ペプチドを生成するために必要だと、ホストシステム内の前駆体
ポリペプチドは自発的にはスプライスしなくなる。
なしで発生することを意味する。例えば、ホストシステム内の前駆体ポリペプチ
ドは、その前駆体ポリペプチドか又はその前駆体ポリペプチドをエンコードする
核酸分子以外には何もそのホストシステムに添加されない際に自発的にスプライ
スして環状ペプチドを生成する。対照的に、ホストシステムへの外因性作用因子
(agent)が環状ペプチドを生成するために必要だと、ホストシステム内の前駆体
ポリペプチドは自発的にはスプライスしなくなる。
【００４５】
ここで使用する「スプライス」という言葉は、ポリペプチドの中央部を切り取
って2つ以上の小ポリペプチド分子を形成することを意味する。スプライシング
は、時として、2つ以上の小ポリペプチドを融合して新しいポリペプチドを形成
する工程を含むことがある。
って2つ以上の小ポリペプチド分子を形成することを意味する。スプライシング
は、時として、2つ以上の小ポリペプチドを融合して新しいポリペプチドを形成
する工程を含むことがある。
【００４６】
ここで使用する「由来する」という言葉は、あるものから取得、分離、純化、
発生することを意味する。
発生することを意味する。
【００４７】
ここで使用する発現ベクター（expression vector）という句は、ホストシス
テムでの核酸の転写及び／又は翻訳を助長する媒介物を意味する。発現ベクター
は，その発現ベクターを包含するホストシステムに外因性物質を添加することで
その発現ベクターが発現化する際（例えば、ベクター内の核酸分子がｍＲＮＡに
転写される際）には不可誘導的である。
テムでの核酸の転写及び／又は翻訳を助長する媒介物を意味する。発現ベクター
は，その発現ベクターを包含するホストシステムに外因性物質を添加することで
その発現ベクターが発現化する際（例えば、ベクター内の核酸分子がｍＲＮＡに
転写される際）には不可誘導的である。
【００４８】
核酸の「発現」という句は、その核酸がポリペプチドに転写及び／又は翻訳、
及び／又は、複製されることを意味する。
及び／又は、複製されることを意味する。
【００４９】
ここで使用する調節塩基配列（regulatory sequence）という句は、核酸分子
の発現を転調(例：転写)するヌクレオチド配列を意味する。たとえば，プロモー
ターやエンハンサーは調節塩基配列である。
の発現を転調(例：転写)するヌクレオチド配列を意味する。たとえば，プロモー
ターやエンハンサーは調節塩基配列である。
【００５０】
「融合」という言葉は、共有結合されることを意味する。例えば、2つのペプ
チドが違いに共有結合する（例えばペプチド結合）際に第1のペプチドと第2のペ
プチドが融合される。
チドが違いに共有結合する（例えばペプチド結合）際に第1のペプチドと第2のペ
プチドが融合される。
【００５１】
ここで使用する「分離」又は「実質的に純粋な物質」という句は、自然状態の
ある物質に包含されるその物質以外の成分からその物質を分離したものを意味す
る。通常、ポリペプチドは、それが付帯する他のプロテインや自然発生有機分子
を少なくとも５０重量％（例えば、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０
重量％、９５重量％及び９９重量％）分離すると実質的に純粋であると言える。
ある物質に包含されるその物質以外の成分からその物質を分離したものを意味す
る。通常、ポリペプチドは、それが付帯する他のプロテインや自然発生有機分子
を少なくとも５０重量％（例えば、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０
重量％、９５重量％及び９９重量％）分離すると実質的に純粋であると言える。
【００５２】
前駆ＤＮＡ（progenitorDNA）は突然変異体を作成又はその作成時の母体とす
る特別のデオキシリボ核酸である。
る特別のデオキシリボ核酸である。
【００５３】
「ターゲット分子」という句は、別の分子の結合又は機能的特徴を決定するた
めに使用される分子を意味する。
めに使用される分子を意味する。
【００５４】
ここで「結合」とは、標本内で、ある分子が別の分子を識別しそれに結合する
一方、それ以外の分子は識別や結合をしないことを意味する。ある分子は、もし
それが別の分子との結合親和力が約１０5から１０6リッター／モルより大きい場
合は、その別の分子と特定的に結合する。
一方、それ以外の分子は識別や結合をしないことを意味する。ある分子は、もし
それが別の分子との結合親和力が約１０5から１０6リッター／モルより大きい場
合は、その別の分子と特定的に結合する。
【００５５】
「細胞関連プロセス」（cell-associated process）とは、細胞内又は細胞の
近傍で発生するプロセスである。
近傍で発生するプロセスである。
【００５６】
「細胞膜関連事象」とは、細胞の原形質膜（plasma membrane）に
起きる細胞関連プロセスである。
【００５７】
「核事象」とは、細胞の核に起きる細胞関連プロセスである。
【００５８】
細胞関連事象と比較して、細胞外反応は細胞内で発生しない反応である。
【００５９】
「ハイブリッドシステム」とは、二重ハイブリッドシステム、逆二重ハイブリ
ッドシステム、１ハイブリッドシステム、スプリットハイブリッド、及びその他
の類似したシステムであってペプチドと他の分子（例えばプロテインや核酸分子
）間の相互作用を同定するものを意味する。ハイブリッドシステムの例として、
VidalとLegrainによる、1999年「核酸研究」27:919参照。
ッドシステム、１ハイブリッドシステム、スプリットハイブリッド、及びその他
の類似したシステムであってペプチドと他の分子（例えばプロテインや核酸分子
）間の相互作用を同定するものを意味する。ハイブリッドシステムの例として、
VidalとLegrainによる、1999年「核酸研究」27:919参照。
【００６０】
他に別に定義されていない限り、此処に使用した全ての技術的用語は、本発明
の属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同様の意味を有する。此
処に記述したものと類似又は均等な方法と材料は本発明の試験や実習で使用して
もよいが、以下では適当な方法と材料を記述するものである。全ての出版物、特
許出願、特許、及びその他の参考文献は此処に言及することでその全体が組入れ
られる。利害の抵触があった場合、定義を包含する本明細書が基準となる。更に
、以下に述べる特別の実施例は例示にとどまり、限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記述及び特許請求の範囲から明らかと
なる。
の属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同様の意味を有する。此
処に記述したものと類似又は均等な方法と材料は本発明の試験や実習で使用して
もよいが、以下では適当な方法と材料を記述するものである。全ての出版物、特
許出願、特許、及びその他の参考文献は此処に言及することでその全体が組入れ
られる。利害の抵触があった場合、定義を包含する本明細書が基準となる。更に
、以下に述べる特別の実施例は例示にとどまり、限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記述及び特許請求の範囲から明らかと
なる。
【００６１】
発明の詳細な説明
分離インテインのトランス−スプライシング能力は、環状ペプチドの製造及び
環状配列においてペプチドを表示する中間生成物のスプライシングの一般的方法
の発展に活用されている。この方法において、ターゲットペプチドは、前駆ポリ
ペプチド中の分離インテインの間に配置される。適当なホストシステムにおいて
、分離インテインの二つ部分は環状配置にターゲットペプチドを強制する配列中
で活性インテインを形成するために組み合わされる。この配列において、インテ
イン部分の一部（例えばＩN）とターゲットペプチドとの間の接合におけるアミ
ノ酸のエステル異性体は、他のインテインの部分（例えばＩC）からのヘテロ原
子が環状エステル中間体を形成するためのエステルと反応することを安定化させ
る。そのとき、この活性インテインは、ターゲットペプチドの環化形（すなわち
ラクトン形）を遊離させるアミノサクシニミドの構成に触媒作用を及ぼし、そし
てそのとき、環状ペプチド生成物骨格（すなわちラクタム形）を熱力学的に好ま
しい形に自発的に転位する。環状ペプチドの遊離前に反応を拘束することにより
、環状配列におけるターゲットペプチドを運ぶスプライシング中間体を生成する
ことができる。２つのインテイン部分間に配置されるターゲットペプチド配列を
有するポリぺプチドをコード化する核酸分子は、このようなペプチドを生成する
ために構成される。発現ベクターにおけるこれらの構造の誘導は、ホストシステ
ムにおけるポリぺプチドを製造する方法を提供する。そして、そのポリぺプチド
は、環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体にスプライシングされる。この
方法を用いることは、いくつかの異なる環状ぺプチドあるいはスプライシング中
間体が、特有の性質のためにスクリーンされる環状あるいは部分環状ぺプチドの
ライブラリーを生じさせうる。
環状配列においてペプチドを表示する中間生成物のスプライシングの一般的方法
の発展に活用されている。この方法において、ターゲットペプチドは、前駆ポリ
ペプチド中の分離インテインの間に配置される。適当なホストシステムにおいて
、分離インテインの二つ部分は環状配置にターゲットペプチドを強制する配列中
で活性インテインを形成するために組み合わされる。この配列において、インテ
イン部分の一部（例えばＩN）とターゲットペプチドとの間の接合におけるアミ
ノ酸のエステル異性体は、他のインテインの部分（例えばＩC）からのヘテロ原
子が環状エステル中間体を形成するためのエステルと反応することを安定化させ
る。そのとき、この活性インテインは、ターゲットペプチドの環化形（すなわち
ラクトン形）を遊離させるアミノサクシニミドの構成に触媒作用を及ぼし、そし
てそのとき、環状ペプチド生成物骨格（すなわちラクタム形）を熱力学的に好ま
しい形に自発的に転位する。環状ペプチドの遊離前に反応を拘束することにより
、環状配列におけるターゲットペプチドを運ぶスプライシング中間体を生成する
ことができる。２つのインテイン部分間に配置されるターゲットペプチド配列を
有するポリぺプチドをコード化する核酸分子は、このようなペプチドを生成する
ために構成される。発現ベクターにおけるこれらの構造の誘導は、ホストシステ
ムにおけるポリぺプチドを製造する方法を提供する。そして、そのポリぺプチド
は、環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体にスプライシングされる。この
方法を用いることは、いくつかの異なる環状ぺプチドあるいはスプライシング中
間体が、特有の性質のためにスクリーンされる環状あるいは部分環状ぺプチドの
ライブラリーを生じさせうる。
【００６２】
図１を参照するに、本発明の実施態様の概要は、核酸分子から環状ぺプチドを
製造する方法を含んでいる。この方法において、核酸分子は、そのヌクレオチド
配列が分離インテインの第１の部分（例えばＩC）と環状化されたぺプチド（す
なわちターゲットぺプチド）と分離インテインの第２の部分（ＩN）とが連続す
るポリぺプチドをコード化するために用意される。その核酸分子はホストシステ
ムにおいてその発現を容易にするために発現ベクター中で混合され、このホスト
システムでは、２つの分離インテイン部分間に配置される環状ぺプチドを有する
前駆ポリぺプチドを複写して翻訳することができる。前述したステップにより、
分離インテインの２つの部分は組み合わされ、最終的に環状ペプチドを生じる化
学反応を発生させる配座に前駆ポリぺプチドを配置する（図２参照）。
製造する方法を含んでいる。この方法において、核酸分子は、そのヌクレオチド
配列が分離インテインの第１の部分（例えばＩC）と環状化されたぺプチド（す
なわちターゲットぺプチド）と分離インテインの第２の部分（ＩN）とが連続す
るポリぺプチドをコード化するために用意される。その核酸分子はホストシステ
ムにおいてその発現を容易にするために発現ベクター中で混合され、このホスト
システムでは、２つの分離インテイン部分間に配置される環状ぺプチドを有する
前駆ポリぺプチドを複写して翻訳することができる。前述したステップにより、
分離インテインの２つの部分は組み合わされ、最終的に環状ペプチドを生じる化
学反応を発生させる配座に前駆ポリぺプチドを配置する（図２参照）。
【００６３】
核酸分子
本発明における核酸分子は、分離インテインの第１の部分、第２の部分及びこ
れら第１の部分と第２の部分との間に位置したターゲットペプチドとを有するポ
リぺプチドをコード化するものを含む。本発明の一実施態様において、ホストシ
ステムにおける核酸の発現は、ターゲットペプチドの環化形を生じるためにホス
トシステム中で自発的にスプライシングするポリぺプチドに帰着する。本発明の
他の実施態様では、ホストシステムにおける核酸分子の発現は、ターゲットペプ
チドの環化形のスプライシング中間体であるポリぺプチドに帰着する。本発明の
核酸分子は、前述した方法により用意され、そして公知技術である核酸分子を生
成し扱う方法とともにここで供給されるガイダンスを用いてもたらされる（例え
ば、オースベルら版 「分子生物学における現在のプロトコロル」ニューヨーク
：ジョンウィリー社，１９９７年、サンプルックら「分子クローン 演習マニュ
アル」（第２版） コールドスプリングハーバー出版社，１９８９年参照）。例
えば、本発明の核酸分子は、分離インテインの第１の部分をコード化するポリヌ
クレオチド、分離インテインの第２の部分をコード化するポリヌクレオチド、及
びターゲットペプチドをコード化するポリヌクレオチドを別々に用意することに
より得られる。この３つのポリヌクレオチドは、分離インテインの第１の部分と
第２の部分との間に挿入したターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード
化する核酸分子を形成するために一緒に接合される。
れら第１の部分と第２の部分との間に位置したターゲットペプチドとを有するポ
リぺプチドをコード化するものを含む。本発明の一実施態様において、ホストシ
ステムにおける核酸の発現は、ターゲットペプチドの環化形を生じるためにホス
トシステム中で自発的にスプライシングするポリぺプチドに帰着する。本発明の
他の実施態様では、ホストシステムにおける核酸分子の発現は、ターゲットペプ
チドの環化形のスプライシング中間体であるポリぺプチドに帰着する。本発明の
核酸分子は、前述した方法により用意され、そして公知技術である核酸分子を生
成し扱う方法とともにここで供給されるガイダンスを用いてもたらされる（例え
ば、オースベルら版 「分子生物学における現在のプロトコロル」ニューヨーク
：ジョンウィリー社，１９９７年、サンプルックら「分子クローン 演習マニュ
アル」（第２版） コールドスプリングハーバー出版社，１９８９年参照）。例
えば、本発明の核酸分子は、分離インテインの第１の部分をコード化するポリヌ
クレオチド、分離インテインの第２の部分をコード化するポリヌクレオチド、及
びターゲットペプチドをコード化するポリヌクレオチドを別々に用意することに
より得られる。この３つのポリヌクレオチドは、分離インテインの第１の部分と
第２の部分との間に挿入したターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード
化する核酸分子を形成するために一緒に接合される。
【００６４】
インテインコード化核酸
本発明の核酸分子の分離インテインの第１の部分と第２の部分をコード化する
ヌクレオチドの配列は、公知のインテインから得られる。そのようなインテイン
を正確に記述したリストがニューイングランド バイオ研究所により「ｈｔｔｐ
／／ｗｗｗ．ｎｅｂ.ｃｏｍ／ｉｎｔｅｉｎｓ／ｉｎｔ ｒｅｇ．ｈｔｍｌ.」で
公表されている。これら公知のインテインの多くは、本発明に合致する限り使用
することができる。
ヌクレオチドの配列は、公知のインテインから得られる。そのようなインテイン
を正確に記述したリストがニューイングランド バイオ研究所により「ｈｔｔｐ
／／ｗｗｗ．ｎｅｂ.ｃｏｍ／ｉｎｔｅｉｎｓ／ｉｎｔ ｒｅｇ．ｈｔｍｌ.」で
公表されている。これら公知のインテインの多くは、本発明に合致する限り使用
することができる。
【００６５】
自然発生あるいは人工生成分離インテインのいずれをもコード化するヌクレオ
チドの配列は、本発明の核酸のインテイン部分を生成するのに使用される。自然
発生分離インテインは、一つの活性スプライシング物を形成するために互いに結
合した２つの分離成分として自然に発現する。これらの自然発生成分をコード化
する核酸分子は、このようにして本発明において使用される。使用可能な自然発
生分離インテインの一例としては、Ｓｓｐ ＤｎａＥ（ウら 「会報ナショナル
アカデミー サイエンス」 米国９５：９２２６，１９９８年）が挙げられる。
チドの配列は、本発明の核酸のインテイン部分を生成するのに使用される。自然
発生分離インテインは、一つの活性スプライシング物を形成するために互いに結
合した２つの分離成分として自然に発現する。これらの自然発生成分をコード化
する核酸分子は、このようにして本発明において使用される。使用可能な自然発
生分離インテインの一例としては、Ｓｓｐ ＤｎａＥ（ウら 「会報ナショナル
アカデミー サイエンス」 米国９５：９２２６，１９９８年）が挙げられる。
【００６６】
自然状態において分離していないインテイン（すなわち、アミノ酸の一連鎖と
して存在するもの）は、公知の技術により人工的に分離される。例えば、そのよ
うなインテインの相違する部分をコード化する２あるいはそれ以上の核酸分子は
、それらの発現が２あるいはそれ以上の人工分離インテイン構成物を生成するた
めに製造される。エバンスら、「生化学ジャーナル」２７４：１８３５９，１９
９９、ミルズら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」 ＵＳＡ９５：
３５４３，１９９８を参照されたい。そのような非自然発生インテイン構成物（
部分）をコード化した核酸は本発明に用いることができる。環状ペプチドあるい
はスプライシング中間体を生成するための同じ前駆ポリぺプチドに効率よく相互
作用する非自然発生分離インテイン部分をコード化する核酸分子を用意する。そ
のような核酸分子を形成する非自然発生分離インテインの一例は、Ｐｓｐ Ｐｏ
ｌ−１（サウスワース，エム．ダブリューら 「ザ イーエムビーオー ジャー
ナル」 １７：９１８，１９９８）、マイコバクテリウム ツベルクロシス Ｒ
ｅｃＡインテイン（リュー，ビー．エムら 「生化学ジャーナル」２７３：１５
８８７，１９９８、シングレデッカー，ケイら 「遺伝子」２０７：１８７，１
９９８、ミルズ，ケイ．ブイ ら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス
」 米国９５：３５４３）、Ｓｓｐ ＤＤｎａＢ／ＭｘｅＧｙｒＡ（エバンス，
ティー．シー.ら 「生化学ジャーナル」２７４：１８３５９，１９９９）及び
Ｐｆｕ（オートモら 「生化学」３８：１６０４０，１９９９、ヤマザキ ら
「アメリカ化学学会ジャーナル」１２０：５５９１，１９９８）を含んで誘導さ
れる。
して存在するもの）は、公知の技術により人工的に分離される。例えば、そのよ
うなインテインの相違する部分をコード化する２あるいはそれ以上の核酸分子は
、それらの発現が２あるいはそれ以上の人工分離インテイン構成物を生成するた
めに製造される。エバンスら、「生化学ジャーナル」２７４：１８３５９，１９
９９、ミルズら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」 ＵＳＡ９５：
３５４３，１９９８を参照されたい。そのような非自然発生インテイン構成物（
部分）をコード化した核酸は本発明に用いることができる。環状ペプチドあるい
はスプライシング中間体を生成するための同じ前駆ポリぺプチドに効率よく相互
作用する非自然発生分離インテイン部分をコード化する核酸分子を用意する。そ
のような核酸分子を形成する非自然発生分離インテインの一例は、Ｐｓｐ Ｐｏ
ｌ−１（サウスワース，エム．ダブリューら 「ザ イーエムビーオー ジャー
ナル」 １７：９１８，１９９８）、マイコバクテリウム ツベルクロシス Ｒ
ｅｃＡインテイン（リュー，ビー．エムら 「生化学ジャーナル」２７３：１５
８８７，１９９８、シングレデッカー，ケイら 「遺伝子」２０７：１８７，１
９９８、ミルズ，ケイ．ブイ ら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス
」 米国９５：３５４３）、Ｓｓｐ ＤＤｎａＢ／ＭｘｅＧｙｒＡ（エバンス，
ティー．シー.ら 「生化学ジャーナル」２７４：１８３５９，１９９９）及び
Ｐｆｕ（オートモら 「生化学」３８：１６０４０，１９９９、ヤマザキ ら
「アメリカ化学学会ジャーナル」１２０：５５９１，１９９８）を含んで誘導さ
れる。
【００６７】
ターゲットペプチドをコード化する核酸あるいはスプライシング中間体におい て表示されるぺプチド
公知あるいはランダムに配列したぺプチドをコード化する核酸を製造する多く
の方法が知られている。例えば、予め決まったあるいはランダムな配列を有する
ポリヌクレオチドは、商業的に入手可能な機材及び試薬を用いて固相法により化
学的に合成される。ポリメラーゼ鎖反応も公知あるいはランダムに配列したポリ
ヌクレオチドを用いることができる。例えば、オースベルらの「スープラ」を参
照されたい。他の例としては、制限酵素エンドヌクレアーゼはより大きな核酸分
子、あるいは本発明の核酸分子を合成するために使用可能なより小さいポリヌク
レオチド断片の大多数中の全部の染色体ＤＮＡでさえも酵素分解するのに用いる
ことができる。
の方法が知られている。例えば、予め決まったあるいはランダムな配列を有する
ポリヌクレオチドは、商業的に入手可能な機材及び試薬を用いて固相法により化
学的に合成される。ポリメラーゼ鎖反応も公知あるいはランダムに配列したポリ
ヌクレオチドを用いることができる。例えば、オースベルらの「スープラ」を参
照されたい。他の例としては、制限酵素エンドヌクレアーゼはより大きな核酸分
子、あるいは本発明の核酸分子を合成するために使用可能なより小さいポリヌク
レオチド断片の大多数中の全部の染色体ＤＮＡでさえも酵素分解するのに用いる
ことができる。
【００６８】
環状化されたぺプチド配列をコード化するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオ
チドの一端が環化反応を促進するために、アスパラギン、セリン、システイン、
あるいはトレオニン残基をコード化するために好ましくは用意される。同じ理由
によりスプライシング中間体の生成物に適したペプチド配列をコード化するポリ
ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一端が、環化反応を抑制するためにアスパ
ラギン、セリン、システイン、あるいはトレオニン残基をコード化するため好ま
しくは用意される。
チドの一端が環化反応を促進するために、アスパラギン、セリン、システイン、
あるいはトレオニン残基をコード化するために好ましくは用意される。同じ理由
によりスプライシング中間体の生成物に適したペプチド配列をコード化するポリ
ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一端が、環化反応を抑制するためにアスパ
ラギン、セリン、システイン、あるいはトレオニン残基をコード化するため好ま
しくは用意される。
【００６９】
インテイン部分をコード化するポリヌクレオチドぺプチドの連結及びターゲッ トペプチドあるいはスプライシング中間体において表示されるぺプチド
一度反応すると、第１のインテイン部分−ターゲットペプチド−第２のインテ
イン部分の順番を有するポリぺプチドをコード化するより大きな核酸分子を形成
するために、ターゲットペプチド（あるいはスプライシング中間体中のぺプチド
）をコード化する核酸にインテイン部分をコード化する核酸を連結するための伝
統的な方法を用いることができる。例えばオースベルらの「スープラ」を参照さ
れたい。
イン部分の順番を有するポリぺプチドをコード化するより大きな核酸分子を形成
するために、ターゲットペプチド（あるいはスプライシング中間体中のぺプチド
）をコード化する核酸にインテイン部分をコード化する核酸を連結するための伝
統的な方法を用いることができる。例えばオースベルらの「スープラ」を参照さ
れたい。
【００７０】
多数の分離インテイン及び多数のぺプチドをコード化する核酸分子
これら前述したのと同様の技術を用いれば、熟練した技術もまたペプチドとと
もに挿入した分離インテインの２つの部分のうちの少なくとも１セットをコード
化する核酸構造を生成することができる。例えば、本発明は、Ｎポリぺプチド（
Ｎは１又はそれ以上の整数）からなり、いかなるターゲットペプチドｉ（ｉは１
以上の整数で、前駆ポリぺプチドにおけるターゲットペプチドの位置を意味する
。）もインテイン部分２ｉ−１と２ｉとの間（例えば、ターゲットペプチド１は
、インテイン部分１及び２間であり、ターゲットペプチド２はインテイン部分３
及び４間であるなど）に存在するのと同様に２Ｎインテイン部分間に置かれてい
るＮターゲットペプチドを有する前駆ポリペプチド分子をコード化する核酸分子
を含んでいる。同じ長さのインテイン部分２ｉ−１と２ｉとは相補的でなく（す
なわち、スプライシング現象に触媒作用を及ぼすための自然の相互作用を起こし
）、ターゲットペプチドｉは環化できない。しかしながら、もしインテイン部分
２ｉがインテイン部分２ｉ＋１と相補的であり、インテイン部分２Ｎがインテイ
ン部分１と相補的であれば、Ｎポリぺプチドの完全な集合は、１−Ｎターゲット
ペプチドが環状ぺプチド／たんぱく質において互いに電子対を共有して結合する
ところを生成することを増加させるためにＮ−１トランススプライス（２ポリぺ
プチド間）と１シススプライス（両端を接合する）を実行する（すなわち、イン
テイン部分２及び３はターゲットペプチド１及び２をトランス−スプライスし、
インテイン部分４及び５はターゲットペプチド２及び３をトタンス−スプライス
し、インテイン部分２Ｎ−２及び２Ｎ−１はターゲットペプチドＮ−１及びＮを
トタンス−スプライスし、並びにインテイン部分Ｎ及び１はＮターゲット配列を
含む環状生成物を閉鎖するためにシス−スプライスする）。そのトランス／シス
スプライシング事象の順序は不適当である。最も遅いスプライシング種類はシス
−スプラスの不遂行によりなされるだろう（相補的なインテイン部分２Ｎ及び１
、２及び３あるいは８０及び８１のいずれにせよ）。
もに挿入した分離インテインの２つの部分のうちの少なくとも１セットをコード
化する核酸構造を生成することができる。例えば、本発明は、Ｎポリぺプチド（
Ｎは１又はそれ以上の整数）からなり、いかなるターゲットペプチドｉ（ｉは１
以上の整数で、前駆ポリぺプチドにおけるターゲットペプチドの位置を意味する
。）もインテイン部分２ｉ−１と２ｉとの間（例えば、ターゲットペプチド１は
、インテイン部分１及び２間であり、ターゲットペプチド２はインテイン部分３
及び４間であるなど）に存在するのと同様に２Ｎインテイン部分間に置かれてい
るＮターゲットペプチドを有する前駆ポリペプチド分子をコード化する核酸分子
を含んでいる。同じ長さのインテイン部分２ｉ−１と２ｉとは相補的でなく（す
なわち、スプライシング現象に触媒作用を及ぼすための自然の相互作用を起こし
）、ターゲットペプチドｉは環化できない。しかしながら、もしインテイン部分
２ｉがインテイン部分２ｉ＋１と相補的であり、インテイン部分２Ｎがインテイ
ン部分１と相補的であれば、Ｎポリぺプチドの完全な集合は、１−Ｎターゲット
ペプチドが環状ぺプチド／たんぱく質において互いに電子対を共有して結合する
ところを生成することを増加させるためにＮ−１トランススプライス（２ポリぺ
プチド間）と１シススプライス（両端を接合する）を実行する（すなわち、イン
テイン部分２及び３はターゲットペプチド１及び２をトランス−スプライスし、
インテイン部分４及び５はターゲットペプチド２及び３をトタンス−スプライス
し、インテイン部分２Ｎ−２及び２Ｎ−１はターゲットペプチドＮ−１及びＮを
トタンス−スプライスし、並びにインテイン部分Ｎ及び１はＮターゲット配列を
含む環状生成物を閉鎖するためにシス−スプライスする）。そのトランス／シス
スプライシング事象の順序は不適当である。最も遅いスプライシング種類はシス
−スプラスの不遂行によりなされるだろう（相補的なインテイン部分２Ｎ及び１
、２及び３あるいは８０及び８１のいずれにせよ）。
【００７１】
したがって核酸構造物は、分離インテインの２つの部分間に配置されるインテ
イン成分が相補的でないターゲットペプチドにより互いに構成される２あるいは
それ以上のポリぺプチドを発現することにより得られる（すなわち、同じインテ
インあるいはいかなる環化反応を引き起こす別の協働を由来としない）。このよ
うな構造においては、適当な相補的インテイン構成物を有する第２のポリぺプチ
ドの存在による発現がなければ環化しない。本発明におけるこのような核酸の構
成は、構造ごとにただ１つのポリぺプチドを、あるいは構造ごとに１より多くの
ポリぺプチドをコード化することができる（例えば、二機能を有するプラスミド
）。
イン成分が相補的でないターゲットペプチドにより互いに構成される２あるいは
それ以上のポリぺプチドを発現することにより得られる（すなわち、同じインテ
インあるいはいかなる環化反応を引き起こす別の協働を由来としない）。このよ
うな構造においては、適当な相補的インテイン構成物を有する第２のポリぺプチ
ドの存在による発現がなければ環化しない。本発明におけるこのような核酸の構
成は、構造ごとにただ１つのポリぺプチドを、あるいは構造ごとに１より多くの
ポリぺプチドをコード化することができる（例えば、二機能を有するプラスミド
）。
【００７２】
発現ベクター
本発明の発現ベクターは、ホストシステム中におけるポリヌクレオチドの発現
を促進可能ないくつかの好ましい発現ベクターの中にターゲットペプチドをコー
ド化するポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。このような好ましい
ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ及びウィルス性のベクターが含ま
れる。これらの多くは公知であり、ほとんどは商業的に入手可能か科学団体から
手に入れることができる。これらの技術は特定の適用に基づいて用いるために好
適なベクターを選択することができ、例えば、選択されたホストシステム（すな
わち、生体外システムにおけるバクテリアのような原核細胞、及び酵母菌あるい
は哺乳類細胞のような真核細胞）及び選択された発現状態である。
を促進可能ないくつかの好ましい発現ベクターの中にターゲットペプチドをコー
ド化するポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。このような好ましい
ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ及びウィルス性のベクターが含ま
れる。これらの多くは公知であり、ほとんどは商業的に入手可能か科学団体から
手に入れることができる。これらの技術は特定の適用に基づいて用いるために好
適なベクターを選択することができ、例えば、選択されたホストシステム（すな
わち、生体外システムにおけるバクテリアのような原核細胞、及び酵母菌あるい
は哺乳類細胞のような真核細胞）及び選択された発現状態である。
【００７３】
本発明における発現ベクターは、ターゲットペプチドをコード化するヌクレオ
チドの範囲及びそのベクターにおけるヌクレオチド配列の発現（例えば転写）を
調整あるいはコントロールする調整ドメインとして機能するヌクレオチドの範囲
を包含する。
チドの範囲及びそのベクターにおけるヌクレオチド配列の発現（例えば転写）を
調整あるいはコントロールする調整ドメインとして機能するヌクレオチドの範囲
を包含する。
【００７４】
本発明における発現ベクターは、特有の性質（例えば、キチン質接合ドメイン
あるいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標
識など）のためにターゲットペプチドあるいはスプライシング中間体の環化形の
スクリーニングを促進し、もしくはホストシステムからターゲットペプチドある
いはスプライシング中間体の環化形の精製（すなわち、キチン質接合ドメインあ
るいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標識
など）するぺプチドをコード化するヌクレオチド配列を包含する。
あるいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標
識など）のためにターゲットペプチドあるいはスプライシング中間体の環化形の
スクリーニングを促進し、もしくはホストシステムからターゲットペプチドある
いはスプライシング中間体の環化形の精製（すなわち、キチン質接合ドメインあ
るいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標識
など）するぺプチドをコード化するヌクレオチド配列を包含する。
【００７５】
好ましい実施態様としては、本発明における発現ベクターは、制限サイトと、
環状ターゲットあるいはスプライシング中間体の多様性のクローンを可能にする
ための分離インテイン部分をコード化する核酸との間で生成される。他の態様と
して、本発明における発現ベクターは、誘導発現ベクターであり、それはアラビ
ノース誘導ベクターである。このようなベクターはホストシステムにおける環化
前駆体あるいはスプライシング中間体の発現をコントロールするために利用する
ことができる。他のベクターは、公知のバクテリアの発現系統及び混成システム
との適合性に基づいて本発明に使用するために選択される。例えば、チャンら
「カー バイオロジー」９：４１７ １９９９年、ペルティエら「ナショナル
バイオテクノロジー」１７：６８３ １９９９年、カリモバら 「会報ナショナ
ル アカデミー サイエンス」米国９５：５７５２、１９９８年、ドミトローバ
ら 「分子 ゼネラル、ジェネット」２５７：２０５ １９９８年、クら「会報
ナショナル アカデミー サイエンス」米国９６：１５１ １９９９年、ロッシ
ら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」米国９４：８４０５ １９９
７年を参照されたい。
環状ターゲットあるいはスプライシング中間体の多様性のクローンを可能にする
ための分離インテイン部分をコード化する核酸との間で生成される。他の態様と
して、本発明における発現ベクターは、誘導発現ベクターであり、それはアラビ
ノース誘導ベクターである。このようなベクターはホストシステムにおける環化
前駆体あるいはスプライシング中間体の発現をコントロールするために利用する
ことができる。他のベクターは、公知のバクテリアの発現系統及び混成システム
との適合性に基づいて本発明に使用するために選択される。例えば、チャンら
「カー バイオロジー」９：４１７ １９９９年、ペルティエら「ナショナル
バイオテクノロジー」１７：６８３ １９９９年、カリモバら 「会報ナショナ
ル アカデミー サイエンス」米国９５：５７５２、１９９８年、ドミトローバ
ら 「分子 ゼネラル、ジェネット」２５７：２０５ １９９８年、クら「会報
ナショナル アカデミー サイエンス」米国９６：１５１ １９９９年、ロッシ
ら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」米国９４：８４０５ １９９
７年を参照されたい。
【００７６】
ポリぺプチド
本発明におけるポリぺプチドは、本発明の核酸の発現により製造されるどのよ
うなものも含む。例えば、分離インテインの第１の部分と分離インテインの第２
の部分間に配置されるターゲットペプチドを有するほぼ純粋な前駆ポリぺプチド
（あるいはスプライシング中間体により表示されるぺプチド）が本発明において
は含まれる。前駆ポリぺプチドのいくつかの例においては、ターゲットペプチド
は、第１及び第２のインテイン部分から直接融合される。その前駆ポリぺプチド
はターゲットペプチドの環化を形成するためにホストシステムにおいて自発的に
スプライスする。
うなものも含む。例えば、分離インテインの第１の部分と分離インテインの第２
の部分間に配置されるターゲットペプチドを有するほぼ純粋な前駆ポリぺプチド
（あるいはスプライシング中間体により表示されるぺプチド）が本発明において
は含まれる。前駆ポリぺプチドのいくつかの例においては、ターゲットペプチド
は、第１及び第２のインテイン部分から直接融合される。その前駆ポリぺプチド
はターゲットペプチドの環化を形成するためにホストシステムにおいて自発的に
スプライスする。
【００７７】
ターゲットペプチドの環化形及びぺプチドを表示するスプライシング中間体も
また本発明に含まれる。好ましくは、これらは本発明の前駆ポリぺプチドのスプ
ライシングにより製造される。このターゲットペプチドの環化形は、本発明の方
法により環化されるアミノ酸配列のいくつかであることがある。このスプライシ
ング中間体は、活性インテイン、チオエステル中間体あるいはラリアット中間体
であり、そしてそれは反応しないアミノ酸配列のぺプチドを表示する。
また本発明に含まれる。好ましくは、これらは本発明の前駆ポリぺプチドのスプ
ライシングにより製造される。このターゲットペプチドの環化形は、本発明の方
法により環化されるアミノ酸配列のいくつかであることがある。このスプライシ
ング中間体は、活性インテイン、チオエステル中間体あるいはラリアット中間体
であり、そしてそれは反応しないアミノ酸配列のぺプチドを表示する。
【００７８】
ホストシステム
本発明において使用されるホストシステムは、転写、翻訳及び／又は本発明の
核酸の複製をサポートし、あるいはポリぺプチドの改変（例えばスプライシング
）又は本発明のタンパク質の翻訳をサポートする。そのような多数のホストシス
テムが知られている。例えば、本発明においては特に人為構造やホストシステム
の活動により引き起こされる干渉を避けたい時には、生体外での転写／翻訳シス
テムの形を受け入れる。このようなシステムは公知の技術により実験室で構築す
ることができ、あるいは商業的に購入することができる。例えば、ＳＴＰ２−Ｔ
７（カタログ番号６９９５０−３）及びＳＴＰ−ＳＰ−６（カタログ番号６９９
９７−３）はノバゲン（ウイスコンシン州 マディソン）から入手できる。プロ
メガ（ウイスコンシン州 マディソン）もまたそのようなシステムを売っており
（例えば、カタログ番号Ｌ１１７０、Ｌ２０８０、Ｌ４６００、Ｌ４６１０、Ｌ
４１３０、Ｌ４１４０、Ｌ１１３０、Ｌ１０２０及びＬ１０３０）、同様にスト
ラタジェン（カリフォルニア州 ラジョーラ）はイン ビトロ エクスプレス（
カタログ番号２００３６０）の商標のシステムを売っている。本発明で使用する
ための不生ホストシステムは生微生物を由来として得られる。例えば網状赤血球
可溶化液としての細胞可溶化液は、幾つかの応用例に用いることができる。
核酸の複製をサポートし、あるいはポリぺプチドの改変（例えばスプライシング
）又は本発明のタンパク質の翻訳をサポートする。そのような多数のホストシス
テムが知られている。例えば、本発明においては特に人為構造やホストシステム
の活動により引き起こされる干渉を避けたい時には、生体外での転写／翻訳シス
テムの形を受け入れる。このようなシステムは公知の技術により実験室で構築す
ることができ、あるいは商業的に購入することができる。例えば、ＳＴＰ２−Ｔ
７（カタログ番号６９９５０−３）及びＳＴＰ−ＳＰ−６（カタログ番号６９９
９７−３）はノバゲン（ウイスコンシン州 マディソン）から入手できる。プロ
メガ（ウイスコンシン州 マディソン）もまたそのようなシステムを売っており
（例えば、カタログ番号Ｌ１１７０、Ｌ２０８０、Ｌ４６００、Ｌ４６１０、Ｌ
４１３０、Ｌ４１４０、Ｌ１１３０、Ｌ１０２０及びＬ１０３０）、同様にスト
ラタジェン（カリフォルニア州 ラジョーラ）はイン ビトロ エクスプレス（
カタログ番号２００３６０）の商標のシステムを売っている。本発明で使用する
ための不生ホストシステムは生微生物を由来として得られる。例えば網状赤血球
可溶化液としての細胞可溶化液は、幾つかの応用例に用いることができる。
【００７９】
ホストシステムはまた生微生物からも得られる。生微生物は、一般に連続的で
発展が容易でかつ取り扱い容易な選択された核酸分子源による大量の複写物にお
いて通常再生産できるのでホストシステムのために好適である。本発明において
ホストシステムとして使用可能な生微生物は、バクテリアのような原核生物（例
えば、大腸菌）並びに酵母菌及び哺乳類（例えば、人、マウス、牛、ひつじ、ブ
タなど）の細胞を含む。古細菌、植物細胞、及び本発明の方法に使用するに好適
な幾つかの他の微生物もまたホストシステムとして機能することができる。
発展が容易でかつ取り扱い容易な選択された核酸分子源による大量の複写物にお
いて通常再生産できるのでホストシステムのために好適である。本発明において
ホストシステムとして使用可能な生微生物は、バクテリアのような原核生物（例
えば、大腸菌）並びに酵母菌及び哺乳類（例えば、人、マウス、牛、ひつじ、ブ
タなど）の細胞を含む。古細菌、植物細胞、及び本発明の方法に使用するに好適
な幾つかの他の微生物もまたホストシステムとして機能することができる。
【００８０】
特別の用途のために最も好適なホストシステムは、多くの異なる要素に依存し
て変化するであろう。しかしながら、その技術は、異なるホストシステムの公知
の適用例に基づく特有の応用のために好適なホストシステムを選択すべきである
。例えば、環状ぺプチドの大量な生成物を必要とするときには、バクテリアホス
トあるいは昆虫のホスとが好適である。他の例としては、人細胞構成要素の相互
作用を分析することを希望するときには、バクテリアシステムを用いるよりもホ
ストシステムとしての人細胞がおそらく好適である。
て変化するであろう。しかしながら、その技術は、異なるホストシステムの公知
の適用例に基づく特有の応用のために好適なホストシステムを選択すべきである
。例えば、環状ぺプチドの大量な生成物を必要とするときには、バクテリアホス
トあるいは昆虫のホスとが好適である。他の例としては、人細胞構成要素の相互
作用を分析することを希望するときには、バクテリアシステムを用いるよりもホ
ストシステムとしての人細胞がおそらく好適である。
【００８１】
ポリぺプチド、環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体の製造方法
本発明のポリぺプチドは、公知のアミノ酸配列のポリぺプチドを製造する常法
により得られる。例えば、本発明におけるポリぺプチドは、商業的に入手可能な
設備及び試薬を用いる固相法により製造することができる。環状ぺプチドを製造
するに使用可能な生体外での製法は公知である。しかしながら、多くの場合にお
いて、本発明のポリぺプチドはホストシステムにおいてそれらをコード化する核
酸を発現することにより好ましくは製造される。例えば、本発明の核酸は、発現
ベクトル中に合成され、そしてホストシステム中にもたらされる。その後、その
ホストシステムは、発現されるベクターと、前駆ぺプチドの形態の生成及び続い
てターゲットペプチドの環化形又はぺプチドを表示するスプライシング中間体と
をもたらす条件下に置かれる。
により得られる。例えば、本発明におけるポリぺプチドは、商業的に入手可能な
設備及び試薬を用いる固相法により製造することができる。環状ぺプチドを製造
するに使用可能な生体外での製法は公知である。しかしながら、多くの場合にお
いて、本発明のポリぺプチドはホストシステムにおいてそれらをコード化する核
酸を発現することにより好ましくは製造される。例えば、本発明の核酸は、発現
ベクトル中に合成され、そしてホストシステム中にもたらされる。その後、その
ホストシステムは、発現されるベクターと、前駆ぺプチドの形態の生成及び続い
てターゲットペプチドの環化形又はぺプチドを表示するスプライシング中間体と
をもたらす条件下に置かれる。
【００８２】
環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体を製造するための好ましい方法は
、（ａ）分離インテインの第１の部分と分離インテインの第２の部分との間に配
置されたターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化する単離された核
酸分子を供給し、（ｂ）ホストシステムを供給し、（ｃ）ホストシステム中に単
離された核酸分子をもたらし、（ｄ）単離された核酸分子を発現させる、ステッ
プを含む。ホストシステム中における核酸分子の発現は、ターゲットペプチドの
環化形のスプライシング中間体の形状におけるぺプチド分子、あるいはターゲッ
トペプチドの環化計をもたらすための自発的にスプライシングするポリぺプチド
を製造する。
、（ａ）分離インテインの第１の部分と分離インテインの第２の部分との間に配
置されたターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化する単離された核
酸分子を供給し、（ｂ）ホストシステムを供給し、（ｃ）ホストシステム中に単
離された核酸分子をもたらし、（ｄ）単離された核酸分子を発現させる、ステッ
プを含む。ホストシステム中における核酸分子の発現は、ターゲットペプチドの
環化形のスプライシング中間体の形状におけるぺプチド分子、あるいはターゲッ
トペプチドの環化計をもたらすための自発的にスプライシングするポリぺプチド
を製造する。
【００８３】
この方法の好ましい態様としては、ぺプチドの環化を触媒作用する外因的に添
加される作用剤（例えば、プロテアーゼやチオール）がないときは、ポリぺプチ
ドの生成物、環状ぺプチド、あるいはスプライシング中間体は、生体内（例えば
、生ホストシステムとともに）に置かれる。
加される作用剤（例えば、プロテアーゼやチオール）がないときは、ポリぺプチ
ドの生成物、環状ぺプチド、あるいはスプライシング中間体は、生体内（例えば
、生ホストシステムとともに）に置かれる。
【００８４】
ポリぺプチドの生成物、環状ぺプチド、あるいはスプライシング中間体は、特
定のタンパク質の一般的技術を用いることで絶えず監視される。例えば、サンブ
ルックらの「スープラ」を参照されたい。使用可能な代表的な技術としては、常
法によるクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ及びこれと同種のもの、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）、２
次元電気泳動のような電気泳動、電磁放射スペクトグラフィー、生成物消化酵素
の分析、熱安定性の評価などが含まれる。
定のタンパク質の一般的技術を用いることで絶えず監視される。例えば、サンブ
ルックらの「スープラ」を参照されたい。使用可能な代表的な技術としては、常
法によるクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ及びこれと同種のもの、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）、２
次元電気泳動のような電気泳動、電磁放射スペクトグラフィー、生成物消化酵素
の分析、熱安定性の評価などが含まれる。
【００８５】
ポリぺプチド、環状ぺプチド、あるいは本発明のスプライシング中間体の精製
通常用いられるタンパク質の精製法は、ポリぺプチド、環状ぺプチド、あるい
は本発明のスプライシング中間体の精製に適用可能である。本発明はまた混合物
から環状ぺプチドを精製するための好ましい方法をも含む。この方法は、（ａ）
アフィニティ標識を伴って接合した環状ぺプチドを含む混合物を供給し、（ｂ）
支持体が環状ぺプチドと明らかな結合を形成するためにリガンドを有するととも
にアフィニティ標識を明らかに結合した固相支持体と接合された環状ぺプチドと
を混合し、（ｃ）結合が明白でない部分を取り去るために支持体を洗浄し、そし
て（ｄ）支持体から環状ぺプチドを溶離するステップを含む。
は本発明のスプライシング中間体の精製に適用可能である。本発明はまた混合物
から環状ぺプチドを精製するための好ましい方法をも含む。この方法は、（ａ）
アフィニティ標識を伴って接合した環状ぺプチドを含む混合物を供給し、（ｂ）
支持体が環状ぺプチドと明らかな結合を形成するためにリガンドを有するととも
にアフィニティ標識を明らかに結合した固相支持体と接合された環状ぺプチドと
を混合し、（ｃ）結合が明白でない部分を取り去るために支持体を洗浄し、そし
て（ｄ）支持体から環状ぺプチドを溶離するステップを含む。
【００８６】
この方法においては、アフィニティ標識は、固相支持体上のリガンドを結合可
能な幾つかの分子を含んでいる。例えば、アフィニティ標識は、リガンドがキチ
ン質である場合にキチン質結合ドメインであり、また、それはリガンドがストレ
プトアビジンである場合にはビオチンである。その他の多くのアフィニティ標識
とリガンドとの組は公知であり、本発明に用いることができる。固相支持体上で
アフィニティ標識はリガンドと確実に結合するので、環状ぺプチド（アフィニテ
ィ標識を取り付けたもの）は、支持体と確実に結合するであろう。そして、混合
物中で支持体と確実な結合を形成していない部分を除去する緩衝剤（例えば、高
塩類、酸あるいはアルカリ緩衝剤）で洗浄される。それから、そのアフィニティ
標識を有する環状ぺプチドは、リガンドからアフィニティ標識を分離する物質（
例えば、過剰量の非接合アフィニティ標識のような拮抗的反応抑制剤、あるいは
変性剤）、あるいは酵素又はアフィニティ標識から環状ぺプチドを分離する化学
反応物質を含有する緩衝剤を用いて固相支持体から溶離される。
能な幾つかの分子を含んでいる。例えば、アフィニティ標識は、リガンドがキチ
ン質である場合にキチン質結合ドメインであり、また、それはリガンドがストレ
プトアビジンである場合にはビオチンである。その他の多くのアフィニティ標識
とリガンドとの組は公知であり、本発明に用いることができる。固相支持体上で
アフィニティ標識はリガンドと確実に結合するので、環状ぺプチド（アフィニテ
ィ標識を取り付けたもの）は、支持体と確実に結合するであろう。そして、混合
物中で支持体と確実な結合を形成していない部分を除去する緩衝剤（例えば、高
塩類、酸あるいはアルカリ緩衝剤）で洗浄される。それから、そのアフィニティ
標識を有する環状ぺプチドは、リガンドからアフィニティ標識を分離する物質（
例えば、過剰量の非接合アフィニティ標識のような拮抗的反応抑制剤、あるいは
変性剤）、あるいは酵素又はアフィニティ標識から環状ぺプチドを分離する化学
反応物質を含有する緩衝剤を用いて固相支持体から溶離される。
【００８７】
類似する方法においては、スプライシング中間体は環状ぺプチドよりむしろ精
製することができる。環状ぺプチドは、またスプライシング中間体を用いる混合
物からも精製することができる。例えば、混合物から環状ぺプチドを精製するた
めの方法は、（ａ）アフィニティ標識とともに接合したスプライシング中間体を
含む混合物を供給し、（ｂ）支持体がスプライシング中間体と明確な結合を形成
するようなアフィニティ標識を結合したリガンドを有する固相支持体と接合され
たスプライシング中間体とを混合し、（ｃ）確実でない結合部分を除去するため
に支持体を洗浄し、（ｄ）スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造する試
薬を支持体に添加し、そして（ｅ）支持体から環状ぺプチドを溶離する、ステッ
プを含む。上述のバリエーションにおいては、ステップ（ｄ）は支持体からスプ
ライシング中間体を溶離し、ステップ（ｅ）はスプライシング中間体から環状ぺ
プチドを製造する試薬をスプライシング中間体を溶離するためには、ステップ（
ｂ）及び（ｅ）は反対である。スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造す
るために加えられる試薬は、チオール、プロテアーゼ及びスプライシング中間体
の環化に作用する他の物質を含む。
製することができる。環状ぺプチドは、またスプライシング中間体を用いる混合
物からも精製することができる。例えば、混合物から環状ぺプチドを精製するた
めの方法は、（ａ）アフィニティ標識とともに接合したスプライシング中間体を
含む混合物を供給し、（ｂ）支持体がスプライシング中間体と明確な結合を形成
するようなアフィニティ標識を結合したリガンドを有する固相支持体と接合され
たスプライシング中間体とを混合し、（ｃ）確実でない結合部分を除去するため
に支持体を洗浄し、（ｄ）スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造する試
薬を支持体に添加し、そして（ｅ）支持体から環状ぺプチドを溶離する、ステッ
プを含む。上述のバリエーションにおいては、ステップ（ｄ）は支持体からスプ
ライシング中間体を溶離し、ステップ（ｅ）はスプライシング中間体から環状ぺ
プチドを製造する試薬をスプライシング中間体を溶離するためには、ステップ（
ｂ）及び（ｅ）は反対である。スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造す
るために加えられる試薬は、チオール、プロテアーゼ及びスプライシング中間体
の環化に作用する他の物質を含む。
【００８８】
具体的な例として、ＩCをアフィニティ標識に融合することにより、必須のア
スパラギン残留物が除去され（ＦＩＧ３のｄ参照）、環状エステルがアフィニテ
ィカラム上に固定される。環状ぺプチドカラムでの結果は、環状ぺプチド自身の
アフィニティ精製のために使用することができる。タンパク質分解方法の広い範
囲は、アフィニティ標識及び環状ぺプチド生成物の配列に依存するＩCから環状
エステルを遊離するのに使用される。
スパラギン残留物が除去され（ＦＩＧ３のｄ参照）、環状エステルがアフィニテ
ィカラム上に固定される。環状ぺプチドカラムでの結果は、環状ぺプチド自身の
アフィニティ精製のために使用することができる。タンパク質分解方法の広い範
囲は、アフィニティ標識及び環状ぺプチド生成物の配列に依存するＩCから環状
エステルを遊離するのに使用される。
【００８９】
ＦＩＧ８には、環状ぺプチドを精製する方法が示されている。この方法におい
て、活性インテイン中間体（スピーシ１）は、触媒作用を及ぼすアスパラギン（
ステップＡ）と非作用性のアミノ酸（Ｙ）が入れ替わり、スピーシ２を生成する
ためにＩNの下流にアフィニティ標識をもたらす変異（ステップＢ）を起こす。
このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する
（ステップＣ）。そして、この分子は、アフィニティ標識と確実に結合するリガ
ンドを含む固相支持体を有するアフィニティカラムを通過し（ステップＤ）、こ
のとき保持されＩN／ＩC非共有合成物（スピーシ３）が精製される。それから、
このＩN／ＩC反応は、ラリアット中間体の合成を中断させ（スピーシ４）、そし
てそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あるいはアミノ酸
Ｙでの化学開裂（ステップＦ）はラクトン中間体を遊離させる（スピーシ５）。
アシル基とＮとの再編成（ステップＧ）は熱力学的に好ましいアミド循環生成物
をもたらす（スピーシ６）。
て、活性インテイン中間体（スピーシ１）は、触媒作用を及ぼすアスパラギン（
ステップＡ）と非作用性のアミノ酸（Ｙ）が入れ替わり、スピーシ２を生成する
ためにＩNの下流にアフィニティ標識をもたらす変異（ステップＢ）を起こす。
このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する
（ステップＣ）。そして、この分子は、アフィニティ標識と確実に結合するリガ
ンドを含む固相支持体を有するアフィニティカラムを通過し（ステップＤ）、こ
のとき保持されＩN／ＩC非共有合成物（スピーシ３）が精製される。それから、
このＩN／ＩC反応は、ラリアット中間体の合成を中断させ（スピーシ４）、そし
てそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あるいはアミノ酸
Ｙでの化学開裂（ステップＦ）はラクトン中間体を遊離させる（スピーシ５）。
アシル基とＮとの再編成（ステップＧ）は熱力学的に好ましいアミド循環生成物
をもたらす（スピーシ６）。
【００９０】
ＦＩＧ９には、前述したのとは異なる環状ぺプチドを精製する方法が示されて
いる。この方法において、活性インテイン中間体（スピーシ１）は、触媒作用を
及ぼすアスパラギン（ステップＡ）と非作用性のアミノ酸（Ｙ）が入れ替わり、
スピーシ２を生成するためにＩＣの上流にアフィニティ標識をもたらす変異（ス
テップＢ）を起こす。このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形
成されるまで進行する（ステップＣ）。そして、この分子は、アフィニティ標識
／ＩC中間体と明確に結合するリガンドを含む固相支持体を有するアフィニティ
カラムを通過する（ステップＤ）。リガンドからのアフィニティ標識の分離（ス
テップＥ）（例えば、標識とリガンド間の相互作用を拮抗的に抑制する分子を用
いること、高塩緩衝剤又は変性物質を用いること、あるいは化学試薬又は標識を
開裂するプロテアーゼを用いること）ラリアット中間体の回収を許容する（スピ
ーシ４）。そしてそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あ
るいはアミノ酸Ｙでの化学開裂（ステップＦ）はラクトン中間体を遊離させる（
スピーシ５）。アシル基とＮとの再編成（ステップＧ）は熱力学的に好ましいア
ミド循環生成物をもたらす（スピーシ６）。
いる。この方法において、活性インテイン中間体（スピーシ１）は、触媒作用を
及ぼすアスパラギン（ステップＡ）と非作用性のアミノ酸（Ｙ）が入れ替わり、
スピーシ２を生成するためにＩＣの上流にアフィニティ標識をもたらす変異（ス
テップＢ）を起こす。このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形
成されるまで進行する（ステップＣ）。そして、この分子は、アフィニティ標識
／ＩC中間体と明確に結合するリガンドを含む固相支持体を有するアフィニティ
カラムを通過する（ステップＤ）。リガンドからのアフィニティ標識の分離（ス
テップＥ）（例えば、標識とリガンド間の相互作用を拮抗的に抑制する分子を用
いること、高塩緩衝剤又は変性物質を用いること、あるいは化学試薬又は標識を
開裂するプロテアーゼを用いること）ラリアット中間体の回収を許容する（スピ
ーシ４）。そしてそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あ
るいはアミノ酸Ｙでの化学開裂（ステップＦ）はラクトン中間体を遊離させる（
スピーシ５）。アシル基とＮとの再編成（ステップＧ）は熱力学的に好ましいア
ミド循環生成物をもたらす（スピーシ６）。
【００９１】
環状ぺプチドのライブラリー及びスプライシング中間体の製造方法
直鎖状ぺプチドライブラリを作る多くの方法が公知である。そのような公知の
方法の変更は、環状ぺプチド及びスプライシング中間体を製造する方法に有用で
あり、ここで環状ぺプチド及びスプライシング中間体のライブラリを生じるため
の方法の変更を示す。一般に、環状ぺプチド及び／又はスプライシング中間体の
ライブラリを製造する方法は、（ａ）雑多なアミノ酸配列を有するターゲットペ
プチドの大半をコード化する核酸の大半を供給し、（ｂ）発現ベクターの大半を
形成するための発現ベクター中に核酸の大半のおのおのを混合し、それにより核
酸の大半のおのおのは、分離インテインの第１の部分をコード化する核酸と核酸
の大半のおのおのを形成された発現ベクターのおのおのに分離インテインの第２
の部分をコード化する核酸との間に配置され、そして、それはターゲットペプチ
ドの環化形のスプライシング中間体又はターゲットペプチドの環化形を生じるホ
ストシステムにおいて自然発生的にスプライシングするポリぺプチドの大半の生
成物を結果として生じるホストシステムにおいて発現ベクターの発現ということ
であり、（ｃ）ホストシステムにおける発現ベクターを発現する、ステップを含
む。
方法の変更は、環状ぺプチド及びスプライシング中間体を製造する方法に有用で
あり、ここで環状ぺプチド及びスプライシング中間体のライブラリを生じるため
の方法の変更を示す。一般に、環状ぺプチド及び／又はスプライシング中間体の
ライブラリを製造する方法は、（ａ）雑多なアミノ酸配列を有するターゲットペ
プチドの大半をコード化する核酸の大半を供給し、（ｂ）発現ベクターの大半を
形成するための発現ベクター中に核酸の大半のおのおのを混合し、それにより核
酸の大半のおのおのは、分離インテインの第１の部分をコード化する核酸と核酸
の大半のおのおのを形成された発現ベクターのおのおのに分離インテインの第２
の部分をコード化する核酸との間に配置され、そして、それはターゲットペプチ
ドの環化形のスプライシング中間体又はターゲットペプチドの環化形を生じるホ
ストシステムにおいて自然発生的にスプライシングするポリぺプチドの大半の生
成物を結果として生じるホストシステムにおいて発現ベクターの発現ということ
であり、（ｃ）ホストシステムにおける発現ベクターを発現する、ステップを含
む。
【００９２】
より具体的な例としては、Chllds他により「Sequeunce Specificity in Trans
cription and Translation」（alan R.Liss.Inc，1985年）で述べられている方
法、Schumacher他 「Science」（271:1854,1996）で述べられている２倍連結法
は、この発明に使用するために変更することができる。ＰＣＲをベースとした公
知の方法もまた環化可能なランダム配列あるいは本発明のスプライシング中間体
としての発現を伴うぺプチドをコード化するポリぺプチドを生じるために使用す
ることができる。例えば、Caidwell and Joyce,「PCR Methods APPL」2:22,1999
年、Ostermeiier他「Proc.natl.Acad.Sci.米国96：3562，1999年」、「the Nest
ed Delection Protocol and Reagent from Promega」及びStemmer,W.P.naturee3
70:389,1994年(DNA shuffling)を参照されたい。雑多の配列を有するぺプチドを
コード化するポリヌクレオチドの大半は、核酸分子におけるターゲットペプチド
（又はスプライシング中間体において表示されるぺプチド）と、前述した本発明
の発現ベクターと混合され、そして、環状化ぺプチドあるいはスプライシング中
間体のライブラリーを生成するためのホストシステムにおいて発現する。
cription and Translation」（alan R.Liss.Inc，1985年）で述べられている方
法、Schumacher他 「Science」（271:1854,1996）で述べられている２倍連結法
は、この発明に使用するために変更することができる。ＰＣＲをベースとした公
知の方法もまた環化可能なランダム配列あるいは本発明のスプライシング中間体
としての発現を伴うぺプチドをコード化するポリぺプチドを生じるために使用す
ることができる。例えば、Caidwell and Joyce,「PCR Methods APPL」2:22,1999
年、Ostermeiier他「Proc.natl.Acad.Sci.米国96：3562，1999年」、「the Nest
ed Delection Protocol and Reagent from Promega」及びStemmer,W.P.naturee3
70:389,1994年(DNA shuffling)を参照されたい。雑多の配列を有するぺプチドを
コード化するポリヌクレオチドの大半は、核酸分子におけるターゲットペプチド
（又はスプライシング中間体において表示されるぺプチド）と、前述した本発明
の発現ベクターと混合され、そして、環状化ぺプチドあるいはスプライシング中
間体のライブラリーを生成するためのホストシステムにおいて発現する。
【００９３】
あらかじめ決定された性質の環状化ぺプチドをスクリーニングする方法
特有の性質の小さい分子をスクリーニングする多くの技術が存在している。例
えば、Fernades,P,Current Opin.Chem.Biol.2:597,1998年、Science286:1759,19
99年、米国特許番号5,585,277号及び5,989,814号参照。より具体的には、結合の
ぺプチドライブラリーにおけるターゲットタンパク質に明確に結合するぺプチド
を決定する方法もまた知られている。例えば、米国特許5,834,318号。これらの
方法の多くは特有の性質のための本発明の方法で得られる環状ぺプチド及び／又
はスプライシング中間体をスクリーンするために適用可能である。
えば、Fernades,P,Current Opin.Chem.Biol.2:597,1998年、Science286:1759,19
99年、米国特許番号5,585,277号及び5,989,814号参照。より具体的には、結合の
ぺプチドライブラリーにおけるターゲットタンパク質に明確に結合するぺプチド
を決定する方法もまた知られている。例えば、米国特許5,834,318号。これらの
方法の多くは特有の性質のための本発明の方法で得られる環状ぺプチド及び／又
はスプライシング中間体をスクリーンするために適用可能である。
【００９４】
あらかじめ決定された性質のためのぺプチド分子をスクリーニングする一般的
な方法は、（ａ）分離インテインの第１の部分と第２の部分との間に配置され、
ターゲットペプチドの環化形（ホストシステムにおけるポリヌクレオチドの自発
的スプライシングの結果としての）、あるいはターゲットペプチドの環化形のス
プライシング中間体のどちらかのぺプチド分子を生成するホストシステムにおけ
る核酸分子の発現と同様のターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化
する核酸分子を供給し、（ｂ）ホストシステムを供給し、（ｃ）単離した核酸を
ホストシステムに誘導し、（ｄ）生成されるぺプチド分子をもたらす条件下にホ
ストシステムを置き、そして（ｅ）あらかじめ決定された性質のぺプチド分子を
テストするステップを含む。
な方法は、（ａ）分離インテインの第１の部分と第２の部分との間に配置され、
ターゲットペプチドの環化形（ホストシステムにおけるポリヌクレオチドの自発
的スプライシングの結果としての）、あるいはターゲットペプチドの環化形のス
プライシング中間体のどちらかのぺプチド分子を生成するホストシステムにおけ
る核酸分子の発現と同様のターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化
する核酸分子を供給し、（ｂ）ホストシステムを供給し、（ｃ）単離した核酸を
ホストシステムに誘導し、（ｄ）生成されるぺプチド分子をもたらす条件下にホ
ストシステムを置き、そして（ｅ）あらかじめ決定された性質のぺプチド分子を
テストするステップを含む。
【００９５】
ステップ（ａ）は、例えば、ターゲットペプチド、インテインの第１の部分及
びインテインの第２の部分をコード化するポリヌクレオチドを製造するための分
子生物学的技術（Ausubel他及びSambrook他「supra」参照）を用いることが、こ
こでのいずれかで述べられている。そして、三つのポリヌクレオチドは結果とし
て、核酸分子を形成するために共に融合（例えば、縛りつけ）される。供給され
たホストシステムについては、核酸分子の発現（例えばバクテリア、酵母菌、哺
乳類細胞など）の中で述べられている。この核酸は、核酸分子の形状と使用され
るホストシステムに依存する公知の方法によりホストシステムに導かれる。例え
ば、核酸分子は、エレクトロポイレーション、リポフェクション、塩化カルシウ
ム媒介トランスフォーメーションの使用、遺伝子ガンの使用、バクテリオファー
ジベクター（ホストシステムがバクテリアの場合）の使用、プラスミド構造の使
用、ウィルスベクターの使用などにより細胞に導かれる。
びインテインの第２の部分をコード化するポリヌクレオチドを製造するための分
子生物学的技術（Ausubel他及びSambrook他「supra」参照）を用いることが、こ
こでのいずれかで述べられている。そして、三つのポリヌクレオチドは結果とし
て、核酸分子を形成するために共に融合（例えば、縛りつけ）される。供給され
たホストシステムについては、核酸分子の発現（例えばバクテリア、酵母菌、哺
乳類細胞など）の中で述べられている。この核酸は、核酸分子の形状と使用され
るホストシステムに依存する公知の方法によりホストシステムに導かれる。例え
ば、核酸分子は、エレクトロポイレーション、リポフェクション、塩化カルシウ
ム媒介トランスフォーメーションの使用、遺伝子ガンの使用、バクテリオファー
ジベクター（ホストシステムがバクテリアの場合）の使用、プラスミド構造の使
用、ウィルスベクターの使用などにより細胞に導かれる。
【００９６】
ホストシステムは、核酸分子の特定の形状と使用されるホストシステムによる
条件を調節することにより製造されるぺプチド分子に起因する条件下に置かれる
。人細胞ホストシステムの場合には、これは、細胞を栄養に富んだ適当な培養液
に配置し、37℃で加湿した５〜１０％二酸化炭素培養器で培養することを意味す
る。誘導発現ベクターの場合には、ベクターにおいて核酸分子の発現を誘導する
物質をホストシステムに加えることを意味する。例えば、アラビノーゼ誘導発現
ベクターを用いるときには、このステップはホストシステムにアラビノーゼを加
えることを含む。
条件を調節することにより製造されるぺプチド分子に起因する条件下に置かれる
。人細胞ホストシステムの場合には、これは、細胞を栄養に富んだ適当な培養液
に配置し、37℃で加湿した５〜１０％二酸化炭素培養器で培養することを意味す
る。誘導発現ベクターの場合には、ベクターにおいて核酸分子の発現を誘導する
物質をホストシステムに加えることを意味する。例えば、アラビノーゼ誘導発現
ベクターを用いるときには、このステップはホストシステムにアラビノーゼを加
えることを含む。
【００９７】
あらかじめ決定された性質によるぺプチド分子をテストすることは、非常に多
くの異なる方法により行うことができ、例えば、公知のリガンドに対するぺプチ
ド分子の結合を測定し、生化学反応を調節（すなわち割合の減少あるいは増加）
するためのぺプチド分子の能力を分析することである。あらかじめ決定された特
性のぺプチドをテストするために用いられる多くの種々の方法記述としてFernan
des,P.「supra」を参照されたい。
くの異なる方法により行うことができ、例えば、公知のリガンドに対するぺプチ
ド分子の結合を測定し、生化学反応を調節（すなわち割合の減少あるいは増加）
するためのぺプチド分子の能力を分析することである。あらかじめ決定された特
性のぺプチドをテストするために用いられる多くの種々の方法記述としてFernan
des,P.「supra」を参照されたい。
【００９８】
より具体的で代表的な特定の性質の環状化ぺプチドあるいはスプライシング中
間体をスクリーンするために使用されうる方法は、固相支持体と環状化ぺプチド
あるいはスプライシング中間体を明確に結合する分子を見分けるためにアフィニ
ティクロマトグラフィーとを用いること、ファージディスプレイテクノロジーを
用いること、及び具体的な生化学反応あるいは細胞内の事象を調整可能な環状ぺ
プチドあるいはスプライシング中間体を見分けるためのアプタマーぺプチド融合
構造及び／又は混合システムを用いることを含む。
間体をスクリーンするために使用されうる方法は、固相支持体と環状化ぺプチド
あるいはスプライシング中間体を明確に結合する分子を見分けるためにアフィニ
ティクロマトグラフィーとを用いること、ファージディスプレイテクノロジーを
用いること、及び具体的な生化学反応あるいは細胞内の事象を調整可能な環状ぺ
プチドあるいはスプライシング中間体を見分けるためのアプタマーぺプチド融合
構造及び／又は混合システムを用いることを含む。
【００９９】
環状ペプチドおよび／またはスプライシング中間体と相互作用する分子を同定 するための固相支持／アフィニティークロマトグラフィー
環状ペプチドまたはスプライシング中間体は、与えられた環状ペプチドまたは
スプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および／または精製を容易
にするために、固相支持体に固定化可能である。精製のためのペプチドアフィニ
ティーカラムの一般的な概要については、Bumbach, G.A. and D.J. Hammond, Bi
opharm., 5:25, 1992を参照。下記は、本発明においてどのようにこれを行うこ
とができるか、という例である。
スプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および／または精製を容易
にするために、固相支持体に固定化可能である。精製のためのペプチドアフィニ
ティーカラムの一般的な概要については、Bumbach, G.A. and D.J. Hammond, Bi
opharm., 5:25, 1992を参照。下記は、本発明においてどのようにこれを行うこ
とができるか、という例である。
【０１００】
図１０を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分
子の同定および／または精製の方法が示されている。この方法において、活性イ
ンテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y）で
触媒作用のあるアスパラギンを置換し（ステップA）、ICの上流にアフィニティ
標識（アフィニティタグ）を導入し（ステップB）、化学種２を得る。インテイ
ン媒介環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する（ステップC）
。この分子は、つぎにアフィニティ標識／IC中間体（化学種３）と特異的に結合
する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通される（ステッ
プD）。ターゲット分子（すなわち、スプライシング中間体に結合する候補）を
含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステップE）。スプライシング中間
体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。これ
らターゲット分子は、カラムから取り除かれて生化学的に分析（例、塩基配列）
可能である。
子の同定および／または精製の方法が示されている。この方法において、活性イ
ンテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y）で
触媒作用のあるアスパラギンを置換し（ステップA）、ICの上流にアフィニティ
標識（アフィニティタグ）を導入し（ステップB）、化学種２を得る。インテイ
ン媒介環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する（ステップC）
。この分子は、つぎにアフィニティ標識／IC中間体（化学種３）と特異的に結合
する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通される（ステッ
プD）。ターゲット分子（すなわち、スプライシング中間体に結合する候補）を
含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステップE）。スプライシング中間
体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。これ
らターゲット分子は、カラムから取り除かれて生化学的に分析（例、塩基配列）
可能である。
【０１０１】
図１１を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分
子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法において、活
性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y
）で触媒作用のあるアスパラギンを置換し（ステップA）、INの下流にアフィニ
ティ（親和性）標識を導入し（ステップB）、化学種２を得る。インテイン媒介
環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する（ステップC）。この
分子は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体
を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、IN／IC非共有結合錯体（
化学種３）の保持および精製を可能にする。アフィニティ標識の切断は（ステッ
プE）は、ラリアット中間体（化学種４）の回収を可能にする。ターゲット分子
（すなわち、スプライシング中間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎに
カラムに通される（ステップE）。スプライシング中間体と特異的に結合するタ
ーゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。
子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法において、活
性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y
）で触媒作用のあるアスパラギンを置換し（ステップA）、INの下流にアフィニ
ティ（親和性）標識を導入し（ステップB）、化学種２を得る。インテイン媒介
環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する（ステップC）。この
分子は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体
を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、IN／IC非共有結合錯体（
化学種３）の保持および精製を可能にする。アフィニティ標識の切断は（ステッ
プE）は、ラリアット中間体（化学種４）の回収を可能にする。ターゲット分子
（すなわち、スプライシング中間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎに
カラムに通される（ステップE）。スプライシング中間体と特異的に結合するタ
ーゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。
【０１０２】
図１２を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分
子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法において、活
性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Z
）でIN求核分子を置換し（ステップA）、INの下流にアフィニティ（親和性）標
識を導入し（ステップB）、IC-ペプチド-IN-標識−融和蛋白質（化学種２）を得
る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する（ステップC）。この蛋
白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体
を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、蛋白質錯体（化学種３）
の保持および精製を可能にする。ターゲット分子（すなわち、スプライシング中
間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステップE
）。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選
択的に保持される。
子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法において、活
性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Z
）でIN求核分子を置換し（ステップA）、INの下流にアフィニティ（親和性）標
識を導入し（ステップB）、IC-ペプチド-IN-標識−融和蛋白質（化学種２）を得
る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する（ステップC）。この蛋
白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体
を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、蛋白質錯体（化学種３）
の保持および精製を可能にする。ターゲット分子（すなわち、スプライシング中
間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステップE
）。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選
択的に保持される。
【０１０３】
図１３を参照すると、さらに、与えられたスプライシング中間体と特異的に結
合する分子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法にお
いて、活性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミ
ノ酸（Z）でIN求核分子を置換し（ステップA）、ICの上流にアフィニティ（親和
性）標識を導入し（ステップB）、標識-IC-ペプチド-IN−融和蛋白質（化学種２
）を得る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する（ステップC）。
この蛋白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相
支持体を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、蛋白質錯体（化学
種３）の保持および精製を可能にする。ターゲット分子（すなわち、スプライシ
ング中間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステ
ップE）。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム
中に選択的に保持される。
合する分子の同定および／または精製の別の方法が示されている。この方法にお
いて、活性インテイン中間体（化学種１）は変異誘発され、触媒作用のないアミ
ノ酸（Z）でIN求核分子を置換し（ステップA）、ICの上流にアフィニティ（親和
性）標識を導入し（ステップB）、標識-IC-ペプチド-IN−融和蛋白質（化学種２
）を得る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する（ステップC）。
この蛋白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相
支持体を備えたアフィニティカラムに通され（ステップD）、蛋白質錯体（化学
種３）の保持および精製を可能にする。ターゲット分子（すなわち、スプライシ
ング中間体に結合する候補）を含有した溶液は、つぎにカラムに通される（ステ
ップE）。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム
中に選択的に保持される。
【０１０４】
ファージディスプレイ
ファージディスプレイを用いた分子をスクリーニングする方法もまた本発明の
範囲である。従来のファージディスプレイを用いた方法を、本発明の環状ペプチ
ドおよび／またはスプライシング中間体を示すファージを用いることによって変
更することができる。例えば、仮に図１のZがファージコート蛋白質であり、図
２においてXH=Hであるとすると、スプライシング反応は最初のエステル中間体を
超えて進行せず、したがって、ターゲットペプチドがループとして示される結果
となる。この方法で、ループターゲットペプチドを示すファージ粒子からなるラ
イブラリーは、示されたループに結合する分子をピックアップするために準備さ
れ使用されることが可能である。例えば、ターゲット分子を固相支持体に固定化
可能である。また、異なったループ状のペプチドを示すファージライブラリーは
、支持体に混合可能である。それらのターゲット分子に結合するファージディス
プレーを行うループ状のペプチドは、選択的に支持体に保持される。支持体から
溶離した後（例えば、高濃度の強力な求核分子と、ファージディスプレイされた
ループペプチドのエステル結合を開裂させることにより）、ループ状ペプチドの
アミノ酸塩基配列は、標準的な分子生物学の方法で決定可能である。
範囲である。従来のファージディスプレイを用いた方法を、本発明の環状ペプチ
ドおよび／またはスプライシング中間体を示すファージを用いることによって変
更することができる。例えば、仮に図１のZがファージコート蛋白質であり、図
２においてXH=Hであるとすると、スプライシング反応は最初のエステル中間体を
超えて進行せず、したがって、ターゲットペプチドがループとして示される結果
となる。この方法で、ループターゲットペプチドを示すファージ粒子からなるラ
イブラリーは、示されたループに結合する分子をピックアップするために準備さ
れ使用されることが可能である。例えば、ターゲット分子を固相支持体に固定化
可能である。また、異なったループ状のペプチドを示すファージライブラリーは
、支持体に混合可能である。それらのターゲット分子に結合するファージディス
プレーを行うループ状のペプチドは、選択的に支持体に保持される。支持体から
溶離した後（例えば、高濃度の強力な求核分子と、ファージディスプレイされた
ループペプチドのエステル結合を開裂させることにより）、ループ状ペプチドの
アミノ酸塩基配列は、標準的な分子生物学の方法で決定可能である。
【０１０５】
アプタマー
ペプチドアプタマーは、立体配置的に束縛されたターゲットペプチド領域を含
んだポリペプチドであり、そのターゲットペプチド領域は骨格から示される様々
な塩基配列になっている。環状ペプチドまたはスプライシング中間体はアプタマ
ーとして機能可能であるので、アプタマーを分析する既知の方法は、環状ペプチ
ドまたはスプライシング中間体の特定の特性の決定における補助のために変更可
能である。例えば、Geyer et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8567, 1999;
Caponigro et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:7508, 1998; Mikhail et a
l, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:14266, 1998; Norman et al, Science 285:
591, 1999を参照。
んだポリペプチドであり、そのターゲットペプチド領域は骨格から示される様々
な塩基配列になっている。環状ペプチドまたはスプライシング中間体はアプタマ
ーとして機能可能であるので、アプタマーを分析する既知の方法は、環状ペプチ
ドまたはスプライシング中間体の特定の特性の決定における補助のために変更可
能である。例えば、Geyer et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8567, 1999;
Caponigro et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:7508, 1998; Mikhail et a
l, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:14266, 1998; Norman et al, Science 285:
591, 1999を参照。
【０１０６】
例えば、図１４を参照すると、環状蛋白質は、ペプチドライブラリーのメンバ
ーを環状蛋白骨格のN-終端とC-終端との間の束縛されたループとして示すことが
できる技術において、アプタマー骨格として使用可能である。図１４に示される
ように、アプタマーライブラリーは、IC-骨格-IN−融合蛋白質（化学種１）とし
て表すことができる。生体内のインテイン媒介環化反応の進行（ステップA）に
より、IN、IC、および環状骨格蛋白質（化学種２）が得られる。アプタマーライ
ブラリーは、N-終端とC-終端との間のリンカー領域において示される。図１４に
おいて、Nはアミノ酸を表し、添字ｎおよびｍは０以上の総数であり、Xはセリン
、トレオニンまたはシステインを示す。
ーを環状蛋白骨格のN-終端とC-終端との間の束縛されたループとして示すことが
できる技術において、アプタマー骨格として使用可能である。図１４に示される
ように、アプタマーライブラリーは、IC-骨格-IN−融合蛋白質（化学種１）とし
て表すことができる。生体内のインテイン媒介環化反応の進行（ステップA）に
より、IN、IC、および環状骨格蛋白質（化学種２）が得られる。アプタマーライ
ブラリーは、N-終端とC-終端との間のリンカー領域において示される。図１４に
おいて、Nはアミノ酸を表し、添字ｎおよびｍは０以上の総数であり、Xはセリン
、トレオニンまたはシステインを示す。
【０１０７】
アプタマーを用いたその他の方法も本発明の範囲である。図１５を参照して、
２つのそのような方法を記述する。反応Iにおいて、活性インテイン中間体は変
異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Z）でINからの求核アミノ酸を置換する
（ステップA）。これらのプロセスは、スプライシング反応を不活性化し、化学
種２が得られる。ICとINの間の強い相互作用のために、この技術によって、ペプ
チドライブラリーのメンバーを２つのインテイン部分の間のリンカー領域（ター
ゲット）において束縛されたループとして示すことが可能となる。反応IIにおい
て、活性インテイン中間体は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y）で触
媒作用のあるアスパラギンを置換して化学種２を得る（ステップA）。生体内の
インテイン媒介環化反応の進行（ステップB）、およびラリアット中間体段階（
化学種３）の拘束により、ペプチドライブラリーのメンバーを束縛されたラクト
ンとして示すことが可能となる。
２つのそのような方法を記述する。反応Iにおいて、活性インテイン中間体は変
異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Z）でINからの求核アミノ酸を置換する
（ステップA）。これらのプロセスは、スプライシング反応を不活性化し、化学
種２が得られる。ICとINの間の強い相互作用のために、この技術によって、ペプ
チドライブラリーのメンバーを２つのインテイン部分の間のリンカー領域（ター
ゲット）において束縛されたループとして示すことが可能となる。反応IIにおい
て、活性インテイン中間体は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸（Y）で触
媒作用のあるアスパラギンを置換して化学種２を得る（ステップA）。生体内の
インテイン媒介環化反応の進行（ステップB）、およびラリアット中間体段階（
化学種３）の拘束により、ペプチドライブラリーのメンバーを束縛されたラクト
ンとして示すことが可能となる。
【０１０８】
ハイブリッドシステム
イースト二重ハイブリッドシステムは、生体内のプロテイン間の相互作用を分
析する方法として良く研究されている(Fields, Ｓ. 及びO. Song, 1989年ネーチ
ャー雑誌(ロンドン)、340:245参照)。そのシステム及びその変形としての、１ハ
イブリッドシステム、三重ハイブリッドシステム、逆二重ハイブリッドシステム
、スプリットハイブリッドシステム、選択的ｎ―ハイブリッドシステム、小分子
系ハイブリッドシステムなどが、周知の方法を適用して環状ペプチドやスプライ
シング中間体の特徴を分析するために使用可能である(Drees, B.L による.,199
9 年Current Opin.Chem.Biol., 3:64; Vidal, M., 及びP. Legrainによる 1999
年Nucleic Acids Research, 27:919; Ausubel, F.M. 他編集1996年 Wiley, New
York, 「Current Protocols in Molecular Biology」；Huang, J.及びS.L., Sch
reiberによる1997年アメリカProc. Natl Acad. Sci94:13396; Yang, M.他による
1995年Nucleic Acids Res. 23:1152; Colas, P. 他による1996年ネーチャー雑
誌(ロンドン), 380-548；Xu, C.W., 他による1997年アメリカProc. Natl. Acad.
Sci.94:12473、を夫々参照) たとえば、図16を参照すると、スプライシング中間体と相互作用するターゲッ
トプロテインを同定する方法は本発明の範囲に含まれる。この方法では、アクテ
ィヴインテイン中間体（種１）が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性ア
ミノ酸（Ｙ）と置換し（ステップＡ）、ＩNの下流でＤＮＡ結合ドメインを導入
（ステップＢ）して種2を得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート
中間体（種３）が形成される（ステップＣ）まで進行する。ＩN、ＩCは強い共有
結合コンプレックスを形成する。その帰結としてラリアート中間体はＤＮＡ結合
ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＤ）。ラ
リアート中間体のターゲットプロテイン（種4）との相互作用は、プロモータ領
域の活性化を引起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子（＊）を発現させる。こ
の方法により、ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この
方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ結合ド
メインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート
中間体を同定するように変形可能である。
析する方法として良く研究されている(Fields, Ｓ. 及びO. Song, 1989年ネーチ
ャー雑誌(ロンドン)、340:245参照)。そのシステム及びその変形としての、１ハ
イブリッドシステム、三重ハイブリッドシステム、逆二重ハイブリッドシステム
、スプリットハイブリッドシステム、選択的ｎ―ハイブリッドシステム、小分子
系ハイブリッドシステムなどが、周知の方法を適用して環状ペプチドやスプライ
シング中間体の特徴を分析するために使用可能である(Drees, B.L による.,199
9 年Current Opin.Chem.Biol., 3:64; Vidal, M., 及びP. Legrainによる 1999
年Nucleic Acids Research, 27:919; Ausubel, F.M. 他編集1996年 Wiley, New
York, 「Current Protocols in Molecular Biology」；Huang, J.及びS.L., Sch
reiberによる1997年アメリカProc. Natl Acad. Sci94:13396; Yang, M.他による
1995年Nucleic Acids Res. 23:1152; Colas, P. 他による1996年ネーチャー雑
誌(ロンドン), 380-548；Xu, C.W., 他による1997年アメリカProc. Natl. Acad.
Sci.94:12473、を夫々参照) たとえば、図16を参照すると、スプライシング中間体と相互作用するターゲッ
トプロテインを同定する方法は本発明の範囲に含まれる。この方法では、アクテ
ィヴインテイン中間体（種１）が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性ア
ミノ酸（Ｙ）と置換し（ステップＡ）、ＩNの下流でＤＮＡ結合ドメインを導入
（ステップＢ）して種2を得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート
中間体（種３）が形成される（ステップＣ）まで進行する。ＩN、ＩCは強い共有
結合コンプレックスを形成する。その帰結としてラリアート中間体はＤＮＡ結合
ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＤ）。ラ
リアート中間体のターゲットプロテイン（種4）との相互作用は、プロモータ領
域の活性化を引起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子（＊）を発現させる。こ
の方法により、ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この
方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ結合ド
メインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート
中間体を同定するように変形可能である。
【０１０９】
図17を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテイン
を同定する別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン中間体（
種１）が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性アミノ酸（Ｙ）と置換し（
ステップＡ）、ＩCの下流でＤＮＡ結合ドメインを導入（ステップＢ）して種2を
得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート中間体（種３）が形成され
る（ステップＣ）まで進行する。次に、この分子は、ＤＮＡ結合ドメインに付着
したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＤ）。ラリアート中間体
のターゲットプロテイン（種4）との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引
起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子（＊）を発現させる。この方法により、
ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、（未知
のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ結合ドメインに付着し
、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート中間体を同定す
るように変形可能である。
を同定する別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン中間体（
種１）が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性アミノ酸（Ｙ）と置換し（
ステップＡ）、ＩCの下流でＤＮＡ結合ドメインを導入（ステップＢ）して種2を
得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート中間体（種３）が形成され
る（ステップＣ）まで進行する。次に、この分子は、ＤＮＡ結合ドメインに付着
したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＤ）。ラリアート中間体
のターゲットプロテイン（種4）との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引
起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子（＊）を発現させる。この方法により、
ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、（未知
のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ結合ドメインに付着し
、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート中間体を同定す
るように変形可能である。
【０１１０】
図1８を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテイ
ンを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン
中間体（種１）が変異誘発されＩN求核試薬を非触媒性アミノ酸（Ｚ）と置換し
（ステップＡ）、ＩNの下流でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を導入する（ステ
ップＢ）。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、ＩC―ペプチ
ドーＩN―ＤＢＤ融合プロテイン（種２）を発生させる。次に、この分子は、ＤＮ
Ａ結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＣ
）。その融合プロテインのターゲットプロテイン（種３）との相互作用は、プロ
モータ領域の活性化を引起こし（ステップＤ）、レポータ遺伝子（＊）を発現さ
せる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット分子を同定する
。この方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ
結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示す融合
プロテインを同定するように変形可能である。
ンを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン
中間体（種１）が変異誘発されＩN求核試薬を非触媒性アミノ酸（Ｚ）と置換し
（ステップＡ）、ＩNの下流でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を導入する（ステ
ップＢ）。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、ＩC―ペプチ
ドーＩN―ＤＢＤ融合プロテイン（種２）を発生させる。次に、この分子は、ＤＮ
Ａ結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＣ
）。その融合プロテインのターゲットプロテイン（種３）との相互作用は、プロ
モータ領域の活性化を引起こし（ステップＤ）、レポータ遺伝子（＊）を発現さ
せる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット分子を同定する
。この方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知の分子をＤＮＡ
結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示す融合
プロテインを同定するように変形可能である。
【０１１１】
図1９を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテイ
ンを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン
中間体（種１）が変異誘発されＩN求核試薬を非触媒性アミノ酸（Ｚ）と置換し
（ステップＡ）、ＩCの下流でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を導入する（ステ
ップＢ）。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、ＤＢＤ−ＩC
―ペプチドーＩN融合プロテイン（種２）を発生させる。次に、この分子は、ＤＮ
Ａ結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＣ
）。ステップＤでの当該融合プロテインのターゲットプロテイン（種３）との相
互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子
（＊）を発現させる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット
分子を同定する。この方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知
の分子をＤＮＡ結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプ
チドを示す融合プロテインを同定するように変形可能である。
ンを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン
中間体（種１）が変異誘発されＩN求核試薬を非触媒性アミノ酸（Ｚ）と置換し
（ステップＡ）、ＩCの下流でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を導入する（ステ
ップＢ）。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、ＤＢＤ−ＩC
―ペプチドーＩN融合プロテイン（種２）を発生させる。次に、この分子は、ＤＮ
Ａ結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される（ステップＣ
）。ステップＤでの当該融合プロテインのターゲットプロテイン（種３）との相
互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし（ステップＥ）、レポータ遺伝子
（＊）を発現させる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット
分子を同定する。この方法は、（未知のターゲットプロテインの代わりに）既知
の分子をＤＮＡ結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプ
チドを示す融合プロテインを同定するように変形可能である。
【０１１２】
生体内での環状ペプチド及びスプライシング中間体のターゲティング
本発明の環状ペプチド及びスプライシング中間体は、従来周知のターゲティン
グ方法を変形することで特定の細胞内の位置や細胞外液の分泌をターゲット化で
きる（例えば、Willkinson他による1997年J. membrane Biol., 155:189; Komi
ya他による1998年The EMBO, 17:3886; Kouranov及びSchnellによる1996年J.Biol
.Chem.271:31009; Bhagwat 他による1999年J.Biol.Chem.274:24014; Adam, S.A.
,による1999年Current Opin.Cell Biol.11402-406; Gorlich, D.による1997 年C
urrent Opin.Cell Biol.9:412; Pemberton 他による1998年Current Opin.Cell
Biol.10:292; Sakaguchi M.による1997年Current Opin.Cell Biol.8:595;Folsc
h他による1998年The EMBO, J.17:6508を夫々参照)。たとえば、本発明の環状ペ
プチドやスプライシング中間体に種々のシグナルペプチドを付着し、それらを所
定の細胞区画に局部集中させたり翻訳後外部空間に分泌させることが可能である
。このようにして、本発明の環状ペプチドやスプライシング中間体は、ミトコン
ドリア、リソソーム、小胞体、葉緑体、ゴルジ体、ぺリプラズム、核、原形質膜
等の細胞局部をターゲット化（標的化）できる。このターゲット方法は、ペプチ
ドライブラリーを発生させる方法及び所定の細胞局部で相互作用又は活発化する
分子を同定することを所望する場合にそのようなライブラリーを選別する方法に
使用可能である。
グ方法を変形することで特定の細胞内の位置や細胞外液の分泌をターゲット化で
きる（例えば、Willkinson他による1997年J. membrane Biol., 155:189; Komi
ya他による1998年The EMBO, 17:3886; Kouranov及びSchnellによる1996年J.Biol
.Chem.271:31009; Bhagwat 他による1999年J.Biol.Chem.274:24014; Adam, S.A.
,による1999年Current Opin.Cell Biol.11402-406; Gorlich, D.による1997 年C
urrent Opin.Cell Biol.9:412; Pemberton 他による1998年Current Opin.Cell
Biol.10:292; Sakaguchi M.による1997年Current Opin.Cell Biol.8:595;Folsc
h他による1998年The EMBO, J.17:6508を夫々参照)。たとえば、本発明の環状ペ
プチドやスプライシング中間体に種々のシグナルペプチドを付着し、それらを所
定の細胞区画に局部集中させたり翻訳後外部空間に分泌させることが可能である
。このようにして、本発明の環状ペプチドやスプライシング中間体は、ミトコン
ドリア、リソソーム、小胞体、葉緑体、ゴルジ体、ぺリプラズム、核、原形質膜
等の細胞局部をターゲット化（標的化）できる。このターゲット方法は、ペプチ
ドライブラリーを発生させる方法及び所定の細胞局部で相互作用又は活発化する
分子を同定することを所望する場合にそのようなライブラリーを選別する方法に
使用可能である。
【０１１３】
環状ジヒドロ葉酸（ＤＨＦＲ）と環状擬似ステラリンＦの合成
材料および方法
ベクターの作成
Ｓｓｐ ＤｎａＥ Ｎ−インテイン（ＩN）の遺伝子は、Ｔａｑポリメラーゼ
と、５’−Ｂｇｌ１１とＮｓｉ１と３’−ＰｓｔＩ制限部位を導入するプライマ
ーとを用いて、Ｓｓｐ ６８０３ゲノムＤＮＡから増幅された。Ｓｓｐ Ｄｎａ
Ｅ ＩC遺伝子は、同様に、５’−Ｎｃｏ１と３’−Ｎｄｅ１とＳａｃ１制限部
位を導入するプライマーを用いて増幅された。核外遺伝子ｐＤＩＭＣＰは、イン
テイン断片をｐＤＩＭＣ７［ＢａｍＨＩ制限部位のＢｇｌ１１への変換を除いて
ｐＤＩＭＣ６と同一（Ostermeier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:356
2,1999を参照）］へ個々にクローニングした結果として生じる。ＩC遺伝子（Ａ
３５Ｈ）におけるアラニンからヒスチジンへの変異は、ｐＤＩＭＣＰＡＨに起因
するクイック・チェンジ突然変異生成（遺伝子層）により影響される。Ｎｃｏ１
／Ｐｓｔ１消化としてのインテイン断片の除去と、ｐＡＲ４［複数のクローニン
グ部位における固有のＮｃｏ１を用いてｐＡＲ３（Perez-Perez, J. and J. Gut
ierrez, Gene, 158:141, 1995; American Type Culture Collection(ATCC)#8702
6）から誘導］への連結とによって、ｐＡＲＣＰ（図３のａ）とｐＡＲＣＰＡＨ
が生成した。大腸菌ＤＨＦＲは、（ＣＡＣ）6（６つのヒスチジン残余をコード
化する）と３’−ＰｓｔＩ部位に続く５’−Ｎｄｅ１部位を導入するプライマー
を用いてｐＥＴ２２ｂ−ＤＨＦＲ（Miller, G.P. and S.J. Benkivuc, Biochemi
stry 37:6327, 1998）から増幅され、ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩを用いて消化されて、
ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ消化されたｐＡＲＣＰまたはｐＡＲＣＰＡＨに連結され、ｐ
ＡＲＣＰ−ＤＨＦＲ（図３のｂ）およびｐＡＲＣＰＡＨ−ＤＨＦＲ（図３のｃ）
を生成した。ポリヒスチジンの塩基配列は、Ｎｄｅ１、Ｎｓｉ１およびＢｓｐＭ
１部位を用いて合成的に作成され、ｐＡＲＣＰＡＨへ結合されてシクロ−［ＣＨ
ＭＨＨＨＨＨＨＧＡＧＡＡ］をコード化する核外遺伝子ｐＡＲＣＰ２−６Ｈを作
成した。核外遺伝子ｐＡＲＣＰ−ｐは、ｐＤＩＭＣＰＡＨから３段階で作成され
た：（１）クイック・チェンジ突然変異生成は、ＩNへＡｆｌＩ１部位を導入し
、ｐＤＩＭＣＰＭＡが生成した；（２）擬似ステラリンＦ遺伝子は、合成的に作
成され、Ｍｆｅ１／ＡｆｌＩ１消化されたｐＤＩＭＣＰＭＡへ連結されてｐＤＩ
ＭＣＰ−ｐを生成した；（３）融合構造は、ＮｃｏＩ／Ｐｓｔ１断片としてのｐ
ＤＩＭＣＰ−ｐから除去され、Ｎｃｏ１／Ｐｓｔ１消化されたｐＡＲ４へ連結さ
れてｐＡＲＣＰ−ｐ（図３のｅ）が生成した。核外遺伝子ｐＡＲＣＢＤ−ｐを作
成するために、Ｋｐｎ１部位は、クイック・チェンジ突然変異生成によってｐＡ
ＲＣＰ−ｐのＩN遺伝子のカルボキシル終端へ導入され、ｐＡＲＣＰｐＫを生成
した。キチンが結合した領域をコード化する遺伝子は、５’Ｋｐｎ１と３Ｈｉｎ
ｄ１１１部位を導入するプライマーを用いて核外遺伝子ｐＣＹＢＩ（New Englan
d Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts）から増幅された。ＰＣＲ生成物と
ｐＡＲＣＰｐＫの両方は、ＫｐｎＩとＨｉｎｄ１１１を用いて消化され、一緒に
連結されてｐＡＲＣＢＤ−ｐ（図３のｆ）が生成した。全ての酵素は、別に付記
していなければ、PromegaまたはNew England Biolabsから入手した。
と、５’−Ｂｇｌ１１とＮｓｉ１と３’−ＰｓｔＩ制限部位を導入するプライマ
ーとを用いて、Ｓｓｐ ６８０３ゲノムＤＮＡから増幅された。Ｓｓｐ Ｄｎａ
Ｅ ＩC遺伝子は、同様に、５’−Ｎｃｏ１と３’−Ｎｄｅ１とＳａｃ１制限部
位を導入するプライマーを用いて増幅された。核外遺伝子ｐＤＩＭＣＰは、イン
テイン断片をｐＤＩＭＣ７［ＢａｍＨＩ制限部位のＢｇｌ１１への変換を除いて
ｐＤＩＭＣ６と同一（Ostermeier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:356
2,1999を参照）］へ個々にクローニングした結果として生じる。ＩC遺伝子（Ａ
３５Ｈ）におけるアラニンからヒスチジンへの変異は、ｐＤＩＭＣＰＡＨに起因
するクイック・チェンジ突然変異生成（遺伝子層）により影響される。Ｎｃｏ１
／Ｐｓｔ１消化としてのインテイン断片の除去と、ｐＡＲ４［複数のクローニン
グ部位における固有のＮｃｏ１を用いてｐＡＲ３（Perez-Perez, J. and J. Gut
ierrez, Gene, 158:141, 1995; American Type Culture Collection(ATCC)#8702
6）から誘導］への連結とによって、ｐＡＲＣＰ（図３のａ）とｐＡＲＣＰＡＨ
が生成した。大腸菌ＤＨＦＲは、（ＣＡＣ）6（６つのヒスチジン残余をコード
化する）と３’−ＰｓｔＩ部位に続く５’−Ｎｄｅ１部位を導入するプライマー
を用いてｐＥＴ２２ｂ−ＤＨＦＲ（Miller, G.P. and S.J. Benkivuc, Biochemi
stry 37:6327, 1998）から増幅され、ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩを用いて消化されて、
ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ消化されたｐＡＲＣＰまたはｐＡＲＣＰＡＨに連結され、ｐ
ＡＲＣＰ−ＤＨＦＲ（図３のｂ）およびｐＡＲＣＰＡＨ−ＤＨＦＲ（図３のｃ）
を生成した。ポリヒスチジンの塩基配列は、Ｎｄｅ１、Ｎｓｉ１およびＢｓｐＭ
１部位を用いて合成的に作成され、ｐＡＲＣＰＡＨへ結合されてシクロ−［ＣＨ
ＭＨＨＨＨＨＨＧＡＧＡＡ］をコード化する核外遺伝子ｐＡＲＣＰ２−６Ｈを作
成した。核外遺伝子ｐＡＲＣＰ−ｐは、ｐＤＩＭＣＰＡＨから３段階で作成され
た：（１）クイック・チェンジ突然変異生成は、ＩNへＡｆｌＩ１部位を導入し
、ｐＤＩＭＣＰＭＡが生成した；（２）擬似ステラリンＦ遺伝子は、合成的に作
成され、Ｍｆｅ１／ＡｆｌＩ１消化されたｐＤＩＭＣＰＭＡへ連結されてｐＤＩ
ＭＣＰ−ｐを生成した；（３）融合構造は、ＮｃｏＩ／Ｐｓｔ１断片としてのｐ
ＤＩＭＣＰ−ｐから除去され、Ｎｃｏ１／Ｐｓｔ１消化されたｐＡＲ４へ連結さ
れてｐＡＲＣＰ−ｐ（図３のｅ）が生成した。核外遺伝子ｐＡＲＣＢＤ−ｐを作
成するために、Ｋｐｎ１部位は、クイック・チェンジ突然変異生成によってｐＡ
ＲＣＰ−ｐのＩN遺伝子のカルボキシル終端へ導入され、ｐＡＲＣＰｐＫを生成
した。キチンが結合した領域をコード化する遺伝子は、５’Ｋｐｎ１と３Ｈｉｎ
ｄ１１１部位を導入するプライマーを用いて核外遺伝子ｐＣＹＢＩ（New Englan
d Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts）から増幅された。ＰＣＲ生成物と
ｐＡＲＣＰｐＫの両方は、ＫｐｎＩとＨｉｎｄ１１１を用いて消化され、一緒に
連結されてｐＡＲＣＢＤ−ｐ（図３のｆ）が生成した。全ての酵素は、別に付記
していなければ、PromegaまたはNew England Biolabsから入手した。
【０１１４】
ＤＨＦＲの精製
ｐＡＲＣＰ−ＤＨＦＲまたはｐＡＲＣＰＡＨ−ＤＨＦＲの一方を収容したＸＬ
Ｉ−ブルー細胞は、３７℃で５０μg/mlのクロラムフェニコールを加えたＬＢ培
地で培養物がＯＤ600Ｏｆ０．７に達するまで培養された。培養物は、Ｌ−（＋
）−アラビノースが最終濃度０．５％になるまで誘導され、２８℃で２４時間培
養された。細胞は、遠心分離（7,000 x g、１０分）によって収集され、液体窒
素中で冷凍された。細胞は溶解され、ＤＨＦＲ含有蛋白質は既述（Miller and B
enkovic, id）のとおり精製された。環状生成物は、３０分以上５０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ中の勾配０−１ＭのＮａＣｌに溶出されたモノ−Ｑカラム（Amersham
Pharmacia）を用いたＦＰＬＣによって、ほかのＤＨＦＲ含有中間体から分離さ
れた。ウエスタンブロット法は、抗ヒスチジン（Qiagen）とヤギ抗マウスアルカ
リホスファターゼ抱合抗体（Pierce）を用いて、製造者の説明書に従って行われ
た。
Ｉ−ブルー細胞は、３７℃で５０μg/mlのクロラムフェニコールを加えたＬＢ培
地で培養物がＯＤ600Ｏｆ０．７に達するまで培養された。培養物は、Ｌ−（＋
）−アラビノースが最終濃度０．５％になるまで誘導され、２８℃で２４時間培
養された。細胞は、遠心分離（7,000 x g、１０分）によって収集され、液体窒
素中で冷凍された。細胞は溶解され、ＤＨＦＲ含有蛋白質は既述（Miller and B
enkovic, id）のとおり精製された。環状生成物は、３０分以上５０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ中の勾配０−１ＭのＮａＣｌに溶出されたモノ−Ｑカラム（Amersham
Pharmacia）を用いたＦＰＬＣによって、ほかのＤＨＦＲ含有中間体から分離さ
れた。ウエスタンブロット法は、抗ヒスチジン（Qiagen）とヤギ抗マウスアルカ
リホスファターゼ抱合抗体（Pierce）を用いて、製造者の説明書に従って行われ
た。
【０１１５】
エンドプロテアーゼ・リジン−Ｃ消化
野生型または環状ＤＨＦＲ（５０μg）は、３７℃で０．１MのＮＨ4ＨＣＯ3中
の０．５μgのエンドプロテアーゼ・リジン−Ｃで処理された。サンプルは、６
および２４時間で採取され、ＳＤＳ／１６％ＰＡＧＥゲルで明視化され、マトリ
ックス支持レーザー脱離イオン化（MALDI）飛行時間マススペクトロメトリー（M
oore, W.T., Methods Enzymol., 289:520, 1997）に提出された。
の０．５μgのエンドプロテアーゼ・リジン−Ｃで処理された。サンプルは、６
および２４時間で採取され、ＳＤＳ／１６％ＰＡＧＥゲルで明視化され、マトリ
ックス支持レーザー脱離イオン化（MALDI）飛行時間マススペクトロメトリー（M
oore, W.T., Methods Enzymol., 289:520, 1997）に提出された。
【０１１６】
ＤＨＦＲの検定
熱安定性は、ＭＴＥＮ緩衝液［５０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンス
ルフォン酸（MES）、２５ｍMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリ
ス）、２５ｍMのエタノールアミンと１００ｍMのＮａＣｌ］中、２５℃または６
５℃のいずれかにおいて、１００ｎＭの野生型あるいは環状のＤＨＦＲの前保温
によって検定された。一定分量が、種々の時間に採取され、１００μＭの７，８
−ジヒドロ葉酸の存在下で５分間室温で平衡化された。活性の検定は、前述（Mi
ller and Benkovic, supra）のとおり還元されたニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NADPH）を用いて開始された。
ルフォン酸（MES）、２５ｍMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリ
ス）、２５ｍMのエタノールアミンと１００ｍMのＮａＣｌ］中、２５℃または６
５℃のいずれかにおいて、１００ｎＭの野生型あるいは環状のＤＨＦＲの前保温
によって検定された。一定分量が、種々の時間に採取され、１００μＭの７，８
−ジヒドロ葉酸の存在下で５分間室温で平衡化された。活性の検定は、前述（Mi
ller and Benkovic, supra）のとおり還元されたニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NADPH）を用いて開始された。
【０１１７】
シクロ−［Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu］の合成
３．５mg（４μmol）のNH2-Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu-CO2Hと、１．
８mg（１６μmol）のＮ−ヒドロキシスクシニミドの２０mlのジメチルホルムア
ミド溶液に、３．０mg（１６μmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（EDC）が加えられた。反応は、２５℃で１０時間攪
拌された。追加の３．０mgのEDCが次に加えられ、２５℃でさらに１０時間攪拌
が継続された。溶媒はロータリーエバポレーションによって除去され、残渣は２
mlの水で溶解され、３０分以上０．１％トリフルオロ酢酸／水中の直線勾配０−
５０％（vol/vol）のアセトニトリルに溶出されたWhatman Partisil 10 ODS-3 9
.4-mM X 50-cmカラムの逆相HPLCによって精製された。適正な画分は、凍結乾燥
され、２．８ｍｇ（８０％）の白色の固体が得られた［m/z 785(MH+)］。この合
成的に作成した物質の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されている単離さ
れた天然の生成物に関するスペクトルと一致した（Morita, H., et al, Tetrahe
dron 50:9975, 1994）。
８mg（１６μmol）のＮ−ヒドロキシスクシニミドの２０mlのジメチルホルムア
ミド溶液に、３．０mg（１６μmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（EDC）が加えられた。反応は、２５℃で１０時間攪
拌された。追加の３．０mgのEDCが次に加えられ、２５℃でさらに１０時間攪拌
が継続された。溶媒はロータリーエバポレーションによって除去され、残渣は２
mlの水で溶解され、３０分以上０．１％トリフルオロ酢酸／水中の直線勾配０−
５０％（vol/vol）のアセトニトリルに溶出されたWhatman Partisil 10 ODS-3 9
.4-mM X 50-cmカラムの逆相HPLCによって精製された。適正な画分は、凍結乾燥
され、２．８ｍｇ（８０％）の白色の固体が得られた［m/z 785(MH+)］。この合
成的に作成した物質の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されている単離さ
れた天然の生成物に関するスペクトルと一致した（Morita, H., et al, Tetrahe
dron 50:9975, 1994）。
【０１１８】
擬似ステラリンＦの精製
ｐＡＲＣＰ−ｐに収容された大腸菌株ＸＬ１−ブルー、ＤＨ５ａまたはＢＬ２
１−ＤＥ３は、培養され、既述のＤＨＦＲの精製と同様に収集された。培地（５
００ml）は、１−ブタノールで３回（３ｘ１００ml）抽出された。抽出物は、混
合されてエバポレートされ、固形の残さは２mlの０．１MのK2HPO4（ｐH8.0；溶
解緩衝液）で再懸濁された。細胞は、１０mlの溶解緩衝液で再懸濁され、超音波
処理され、遠心分離（20,000x g、２０分間）によって不純物が除去された。可
溶化液は抽出され（３ｘ５ml、ｎ−ブタノール）、抽出物は混合され、エバポレ
ートされて５００μlの溶解緩衝液で再懸濁された。組換え生成物は、上述のHPL
Cによって可溶化液と培地抽出物から精製された。可溶化液と培地抽出物からの
適正な画分の凍結乾燥から、油状の残分、m/z785.47(MH+), 807.43(MNa+), 823.
44(MK+)が得られた。凍結乾燥物の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されて
いる単離された天然の生成物に関するスペクトルと一致した（Morita rt al, su
pra）。キチン結合領域に融合した蛋白質は、上述したように不純物が除去され
た可溶化液を作成することから準備された。可溶化液は、キチンカラム（New En
gland Biolabs, Inc）に通され、溶解緩衝液と平衡化された。カラムは、定組成
溶離で溶離され、スプライシング中間体を含んだ画分は、貯蔵され、MALDIマス
スペクトル分析に提出された。
１−ＤＥ３は、培養され、既述のＤＨＦＲの精製と同様に収集された。培地（５
００ml）は、１−ブタノールで３回（３ｘ１００ml）抽出された。抽出物は、混
合されてエバポレートされ、固形の残さは２mlの０．１MのK2HPO4（ｐH8.0；溶
解緩衝液）で再懸濁された。細胞は、１０mlの溶解緩衝液で再懸濁され、超音波
処理され、遠心分離（20,000x g、２０分間）によって不純物が除去された。可
溶化液は抽出され（３ｘ５ml、ｎ−ブタノール）、抽出物は混合され、エバポレ
ートされて５００μlの溶解緩衝液で再懸濁された。組換え生成物は、上述のHPL
Cによって可溶化液と培地抽出物から精製された。可溶化液と培地抽出物からの
適正な画分の凍結乾燥から、油状の残分、m/z785.47(MH+), 807.43(MNa+), 823.
44(MK+)が得られた。凍結乾燥物の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されて
いる単離された天然の生成物に関するスペクトルと一致した（Morita rt al, su
pra）。キチン結合領域に融合した蛋白質は、上述したように不純物が除去され
た可溶化液を作成することから準備された。可溶化液は、キチンカラム（New En
gland Biolabs, Inc）に通され、溶解緩衝液と平衡化された。カラムは、定組成
溶離で溶離され、スプライシング中間体を含んだ画分は、貯蔵され、MALDIマス
スペクトル分析に提出された。
【０１１９】
チロシナーゼのクローニング
ストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Streptomyces antibioticus） (B
ernan et al, Gene 37:101, 1985)からのチロシナーゼ遺伝子（ORF 438を含む）
は、５’Ｎｄｅ１と３’ＥｃｏＲＩ制限部位を導入するプライマーを用いたpIJ7
02（ATCC no.35287）からのベント−ポリメラーゼを用いて増幅された。ＰＣＲ
生成物は、Ｎｄｅ１とＥｃｏＲＩを用いて消化され、同様に消化されたｐＤＩＭ
Ｎ２（Ostermeier et al, supra）へ結合され、ｐＤＮＭＮ−Ｙを生成する。形
質転換された連結混合物は、外界温度で５日間培養され、チロシナーゼを発現し
たコロニーは、ＦｅＣｕＹプレート［アンピシリン（２００μg/ml）、FeCl3・６
H2O（０．２mM）、CuSO4・５H2O（０．２mM）、L−チロシン（０．３mg/ml、Y）
、イソプロピル-B-D-ガラクトシド（０．３mg/ml、Y）を含んだＬＢ寒天板］（D
ella-Cioppa, G. et al., Biotechnology 8:634, 1990）上の色素形成によって
同定された。
ernan et al, Gene 37:101, 1985)からのチロシナーゼ遺伝子（ORF 438を含む）
は、５’Ｎｄｅ１と３’ＥｃｏＲＩ制限部位を導入するプライマーを用いたpIJ7
02（ATCC no.35287）からのベント−ポリメラーゼを用いて増幅された。ＰＣＲ
生成物は、Ｎｄｅ１とＥｃｏＲＩを用いて消化され、同様に消化されたｐＤＩＭ
Ｎ２（Ostermeier et al, supra）へ結合され、ｐＤＮＭＮ−Ｙを生成する。形
質転換された連結混合物は、外界温度で５日間培養され、チロシナーゼを発現し
たコロニーは、ＦｅＣｕＹプレート［アンピシリン（２００μg/ml）、FeCl3・６
H2O（０．２mM）、CuSO4・５H2O（０．２mM）、L−チロシン（０．３mg/ml、Y）
、イソプロピル-B-D-ガラクトシド（０．３mg/ml、Y）を含んだＬＢ寒天板］（D
ella-Cioppa, G. et al., Biotechnology 8:634, 1990）上の色素形成によって
同定された。
【０１２０】
結果
遺伝子作成の計画
Ssp ICとINをコード化する遺伝子は、標準的な分子生物学的方法（Sambrook,
et al., supra）によってSspゲノムDNAから増幅され、連続的にｐDIMC7へ結合さ
れる。生成した環化前駆体（CP）断片は、ｐDIMC7から切除され、隣接するpAR3
のAraBプロモーターにクローニングされ、pARCPベクターシリーズ（図３）を生
成する。これらのベクターは、アラビノースの存在下で環化前駆体の発現を活性
化する。大腸菌DHFR遺伝子は、pARCPのNde１およびNsi１部位の間でクローニン
グされ、各分割インテイン遺伝子（図３のｂとｃ）との枠内融合を作成した。DH
FRの増幅に用いられたPCRプライマーもまた、DHFR遺伝子の５’端の６ヒスチジ
ン標識をコード化する塩基配列が導入され、環化される領域の免疫検出を可能に
した。２つのDHFRの生成は、アスパラギン側鎖環化の酸／塩基触媒作用における
ICの最後から２番目の残基の役割を研究するために構築された。核外遺伝子pARC
P-DHFR（図３のｂ）は、野生型のICをコード化し、末端アスパラギンに隣接する
アラニン残基を有する。核外遺伝子pARCPAH-DHFR（図３のｃ）は、IC遺伝子の最
後から２番目の位置のアラニンからヒスチジンへの変異を組み入れる。擬似ステ
ラリンＦ（シクロ−［SGGYLPPL］）を生成させるために、ベクターはIN遺伝子の
５’端のAflI1部位を作成する沈黙突然変異によって修飾される（図３のｄ）。M
feI部位は、自然に、野生型のIC遺伝子の３’端に生じる。擬似ステラリンＦを
コード化する、合成的に作成された二重鎖の挿入断片が修飾されたベクターへ連
結することによって、核外遺伝子pARCP-pが生成する。Kpn1部位は、キチン結合
領域の遺伝子を擬似ステラリン生成構成体へ融合させるためにIN遺伝子の３’端
に導入された（図３のｆ）。
et al., supra）によってSspゲノムDNAから増幅され、連続的にｐDIMC7へ結合さ
れる。生成した環化前駆体（CP）断片は、ｐDIMC7から切除され、隣接するpAR3
のAraBプロモーターにクローニングされ、pARCPベクターシリーズ（図３）を生
成する。これらのベクターは、アラビノースの存在下で環化前駆体の発現を活性
化する。大腸菌DHFR遺伝子は、pARCPのNde１およびNsi１部位の間でクローニン
グされ、各分割インテイン遺伝子（図３のｂとｃ）との枠内融合を作成した。DH
FRの増幅に用いられたPCRプライマーもまた、DHFR遺伝子の５’端の６ヒスチジ
ン標識をコード化する塩基配列が導入され、環化される領域の免疫検出を可能に
した。２つのDHFRの生成は、アスパラギン側鎖環化の酸／塩基触媒作用における
ICの最後から２番目の残基の役割を研究するために構築された。核外遺伝子pARC
P-DHFR（図３のｂ）は、野生型のICをコード化し、末端アスパラギンに隣接する
アラニン残基を有する。核外遺伝子pARCPAH-DHFR（図３のｃ）は、IC遺伝子の最
後から２番目の位置のアラニンからヒスチジンへの変異を組み入れる。擬似ステ
ラリンＦ（シクロ−［SGGYLPPL］）を生成させるために、ベクターはIN遺伝子の
５’端のAflI1部位を作成する沈黙突然変異によって修飾される（図３のｄ）。M
feI部位は、自然に、野生型のIC遺伝子の３’端に生じる。擬似ステラリンＦを
コード化する、合成的に作成された二重鎖の挿入断片が修飾されたベクターへ連
結することによって、核外遺伝子pARCP-pが生成する。Kpn1部位は、キチン結合
領域の遺伝子を擬似ステラリン生成構成体へ融合させるためにIN遺伝子の３’端
に導入された（図３のｆ）。
【０１２１】
環状DHFRの生成とキャラクタリゼーション
DHFRの環化は、図４に示すとおり、pARCP-DHFRをアラビノース誘導したSDS-PA
GEによって直ちに明らかになった（F: IC-DHFR-IN 融合蛋白質。T: IC-DHFR-IN
融合チオエステル中間体。R: IC-DHFR ラリアット（輪縄形）中間体。L:直鎖状
DHFR。O:環状DHFR。IN:N-インテイン。IC:C-インテイン。１レーン：非誘導XL1-
ブルー/pARCP-DHFR。２レーン：アラビノース誘導されたXLI-ブルー/pARCP-DHFR
。３レーン：アラビノース誘導されたXLIブルー/pARCPAH-DHFR。４レーン：３レ
ーンのメトトレキセートアガロース後、未精製の可溶化液。５レーン：４レーン
のFPLC後の物質。６レーン：野生型DHFR）。
GEによって直ちに明らかになった（F: IC-DHFR-IN 融合蛋白質。T: IC-DHFR-IN
融合チオエステル中間体。R: IC-DHFR ラリアット（輪縄形）中間体。L:直鎖状
DHFR。O:環状DHFR。IN:N-インテイン。IC:C-インテイン。１レーン：非誘導XL1-
ブルー/pARCP-DHFR。２レーン：アラビノース誘導されたXLI-ブルー/pARCP-DHFR
。３レーン：アラビノース誘導されたXLIブルー/pARCPAH-DHFR。４レーン：３レ
ーンのメトトレキセートアガロース後、未精製の可溶化液。５レーン：４レーン
のFPLC後の物質。６レーン：野生型DHFR）。
【０１２２】
直鎖状（L,23kDa）および環状（O,21kDa）DHFR生成物、融合蛋白質（F,37kDa
）、IN（14kDa）およびIC（4kDa）に相当する明らかな分子量と一体となったバ
ンドがはっきりと現れ、チオエステル（T,36kDa）およびラリアット中間体（R,2
6kDa）として仮に割り当てられたバンドも同様である（図４、２レーン）。アラ
ニンからヒスチジンへのIC（A35）の最後から２番目の残基の変異（図３のｃ）
は、環状DHFRの収量を改善させた（図４、３レーン）。未精製の可溶化液のメト
トレキセートアガロース親和性クロマトグラフィー（図４、４レーン）は、誘導
されたバンドの大多数が正確に折り畳まれたDHFRを含有することを支持した。IN はDHFRに共有結合的に結合していないが、おそらくIC-DHFRラリアット中間体（R
）との非共有錯体構造のために、メトトレキセートカラムに保持された。メトト
レキセートアガロース溶離剤はFPLCによって分画され、培養液１リットルあたり
５mgの環状生成物の精製を可能にした。抗ヒスチジン抗体のウエスタンブロット
（図示せず）は、FPLCで精製された蛋白質のポリヒスチジンリンカー塩基配列（
図３のｄ）の存在を証明した。蛋白質は、SDS/PAGE分析において、付加的な形態
上の束縛を意味する余分な11-アミノ酸リンカー塩基配列（図３のｂ）にも関わ
らず、組換え型のDHFR（図４、６レーン）よりも早く移動する。さらに、FPLCで
精製された蛋白質をフェニルイソチオシアネート（Edman, P., Acta Chem）と反
応させたときに、何の反応も検出されなかったが、これはアミノ終端が有用でな
いことを示唆している。
）、IN（14kDa）およびIC（4kDa）に相当する明らかな分子量と一体となったバ
ンドがはっきりと現れ、チオエステル（T,36kDa）およびラリアット中間体（R,2
6kDa）として仮に割り当てられたバンドも同様である（図４、２レーン）。アラ
ニンからヒスチジンへのIC（A35）の最後から２番目の残基の変異（図３のｃ）
は、環状DHFRの収量を改善させた（図４、３レーン）。未精製の可溶化液のメト
トレキセートアガロース親和性クロマトグラフィー（図４、４レーン）は、誘導
されたバンドの大多数が正確に折り畳まれたDHFRを含有することを支持した。IN はDHFRに共有結合的に結合していないが、おそらくIC-DHFRラリアット中間体（R
）との非共有錯体構造のために、メトトレキセートカラムに保持された。メトト
レキセートアガロース溶離剤はFPLCによって分画され、培養液１リットルあたり
５mgの環状生成物の精製を可能にした。抗ヒスチジン抗体のウエスタンブロット
（図示せず）は、FPLCで精製された蛋白質のポリヒスチジンリンカー塩基配列（
図３のｄ）の存在を証明した。蛋白質は、SDS/PAGE分析において、付加的な形態
上の束縛を意味する余分な11-アミノ酸リンカー塩基配列（図３のｂ）にも関わ
らず、組換え型のDHFR（図４、６レーン）よりも早く移動する。さらに、FPLCで
精製された蛋白質をフェニルイソチオシアネート（Edman, P., Acta Chem）と反
応させたときに、何の反応も検出されなかったが、これはアミノ終端が有用でな
いことを示唆している。
【０１２３】
環状DHFRは、定常状態の動力学パラメータと基質、補助因子、２５℃における
野生型酵素から識別不能なメトトレキセート解離定数を有していた。野生型と環
状のDHFRの６５℃前保温後に行われた活性度の測定は、環化によって酵素の熱安
定性が改善されたことを示した（図５）。エンドプロテアーゼリジン-C消化は、
FPLCで精製された蛋白質が環状DHFRであることを明らかに示すために用いられた
。野生型の蛋白質の消化は、アミノ末端（4.4kDa）およびカルボキシ末端（6.3k
Da）の断片を生成する；環状の蛋白質では、これら２つの断片は結合し、10.7kD
aの消化生成物となる（図６）。FPLCで精製された物質は、野生型の酵素と比較
してタンパク分解に耐性があり、消化混合物のマススペクトル分析は、野生型蛋
白質には存在せず、環状蛋白質に由来する物質の10.7ｋDaのピークを確認した（
データは示さない）。
野生型酵素から識別不能なメトトレキセート解離定数を有していた。野生型と環
状のDHFRの６５℃前保温後に行われた活性度の測定は、環化によって酵素の熱安
定性が改善されたことを示した（図５）。エンドプロテアーゼリジン-C消化は、
FPLCで精製された蛋白質が環状DHFRであることを明らかに示すために用いられた
。野生型の蛋白質の消化は、アミノ末端（4.4kDa）およびカルボキシ末端（6.3k
Da）の断片を生成する；環状の蛋白質では、これら２つの断片は結合し、10.7kD
aの消化生成物となる（図６）。FPLCで精製された物質は、野生型の酵素と比較
してタンパク分解に耐性があり、消化混合物のマススペクトル分析は、野生型蛋
白質には存在せず、環状蛋白質に由来する物質の10.7ｋDaのピークを確認した（
データは示さない）。
【０１２４】
疑似ステラリンF (Pseudostellarin F)の生成と特徴
疑似ステラリンFは、組み換え型スレプトマイセス・アンチバイオチクス チ
ロシナーゼ （streptomyces antibioticus tyrosinase）(図７参照)の抑制を通
じて生体内で容易に検出された。図7の実験において、XLI-ブルー細胞は、ｐDIM
-NY及びpARC２−６H（a＆ｂ）又はpARCP-ｐ (c & d)で同時形質転換（co-transf
ormed）された。その細胞は、クロラムフェニコール（chloramphenicol）（５０
μg／ml）を備え、（a＆ｃ）なしか又は (ｂ& d)L-（＋）アラビノース（arabin
ose）（０．５％）を備えるFeCuYプレート培養皿に蒔かれた。
ロシナーゼ （streptomyces antibioticus tyrosinase）(図７参照)の抑制を通
じて生体内で容易に検出された。図7の実験において、XLI-ブルー細胞は、ｐDIM
-NY及びpARC２−６H（a＆ｂ）又はpARCP-ｐ (c & d)で同時形質転換（co-transf
ormed）された。その細胞は、クロラムフェニコール（chloramphenicol）（５０
μg／ml）を備え、（a＆ｃ）なしか又は (ｂ& d)L-（＋）アラビノース（arabin
ose）（０．５％）を備えるFeCuYプレート培養皿に蒔かれた。
【０１２５】
チロシナーゼを発現する細胞における疑似ステラリンFの同時発現は、色素フ
ォーメーション（図７のｄ参照）を劇的に減少した。pARC２−６Hからの関連性
の無い環状ペプチドの発現は、チロシナーゼ（図７のａとｂ）を阻害せず、阻害
には絶対的にアラビノース誘導を必要とした（図７のｃとｄを比較）。いくつか
の菌種（BL２１‐DE3，DH5a及びXLI−ブルー）のアラビノース誘導pARCP-ｐのSD
S/PAGE分析により、融合プロテイン（F）、チオエステル中間体（T）及びINに対
応したバンドが視覚化された。強い、低分子量バンドも視認されたが、解像度は
、ラリアット中間体(R)とIC（データ表示せず）を分離するには不十分であった
。疑似ステラリンFは小さすぎてSDS/PAGE分析では視覚化できなかったが、質量
分光分析では粗細胞溶菌液 （lysate）と媒体の両方で存在が示された。組換え
型環状ペプチドの約３０μｇが湿細胞質量のグラム当り細胞溶菌液から分離され
た。また、疑似ステラリンFは、１-ブタノール抽出後高速液体クロマトグラフィ
ー （HPLC）により、発現系次第で２ｍｇ/リットル（XLIブルー）と２０ｍｇ/リ
ットル（BL21−DE3）の間で変化する収率で媒体から分離された。その組換え型
材料のNMRスペクトルはその天然生成物に関し報告されている数値と合致し（森
田他、SUPRA参照）、そのバクテリア的に発現された環状ペプチドの滞留時間は
合成的に用意した標準と同一であった。前記組み換え型材料は、ニンヒドリン（
ninhydrin）と反応せず（Gordon, Ａ.J., 及びR.A.Ford ; The Chemist's Compa
nion誌、及び、１９７２年ニューヨーク Willey Interscience社の「実践デー
タ、技術及び参考文献ハンドブック」 参照）、ラクトン生成物というよりむしろ中堅（backbone）環状ペプチド（ラク
タム）を示した。HPLCと質量スペクトル分析のいずれも直鎖状の親ペプチドが生
成されたという証拠を与えなかった。
ォーメーション（図７のｄ参照）を劇的に減少した。pARC２−６Hからの関連性
の無い環状ペプチドの発現は、チロシナーゼ（図７のａとｂ）を阻害せず、阻害
には絶対的にアラビノース誘導を必要とした（図７のｃとｄを比較）。いくつか
の菌種（BL２１‐DE3，DH5a及びXLI−ブルー）のアラビノース誘導pARCP-ｐのSD
S/PAGE分析により、融合プロテイン（F）、チオエステル中間体（T）及びINに対
応したバンドが視覚化された。強い、低分子量バンドも視認されたが、解像度は
、ラリアット中間体(R)とIC（データ表示せず）を分離するには不十分であった
。疑似ステラリンFは小さすぎてSDS/PAGE分析では視覚化できなかったが、質量
分光分析では粗細胞溶菌液 （lysate）と媒体の両方で存在が示された。組換え
型環状ペプチドの約３０μｇが湿細胞質量のグラム当り細胞溶菌液から分離され
た。また、疑似ステラリンFは、１-ブタノール抽出後高速液体クロマトグラフィ
ー （HPLC）により、発現系次第で２ｍｇ/リットル（XLIブルー）と２０ｍｇ/リ
ットル（BL21−DE3）の間で変化する収率で媒体から分離された。その組換え型
材料のNMRスペクトルはその天然生成物に関し報告されている数値と合致し（森
田他、SUPRA参照）、そのバクテリア的に発現された環状ペプチドの滞留時間は
合成的に用意した標準と同一であった。前記組み換え型材料は、ニンヒドリン（
ninhydrin）と反応せず（Gordon, Ａ.J., 及びR.A.Ford ; The Chemist's Compa
nion誌、及び、１９７２年ニューヨーク Willey Interscience社の「実践デー
タ、技術及び参考文献ハンドブック」 参照）、ラクトン生成物というよりむしろ中堅（backbone）環状ペプチド（ラク
タム）を示した。HPLCと質量スペクトル分析のいずれも直鎖状の親ペプチドが生
成されたという証拠を与えなかった。
【０１２６】
キチン結合ドメインは、インテインが媒介するライゲーション(核酸連結)反応
中間体を親和・純化するINカルボキシル基に融合され、それらをMALDI質量分光
測定で特徴付ける（表１）。
中間体を親和・純化するINカルボキシル基に融合され、それらをMALDI質量分光
測定で特徴付ける（表１）。
【０１２７】
【表１】
ICを含むスプライシング反応の全ての中間体は、XLI−ブルー内のアラビノー
ス誘導形pARCＢD-ｐからの粗細胞溶菌液 がキチンアフィニティーカラム （affinity column）を通過する際に保持された。疑似ステラリンFは１−ブタノ
ール抽出により保持されない材料から回収された。融合プロテイン（F）、チオ
エステル中間体（T）及びIN に対する観察された分子質量は、遺伝子配列から予
測された値に極めて良く合致した。ICの質量は、製品リリースの提案されたメカ
ニズムから予測されたアスパラギン環化形状と合致した。ラリアート中間体（R
）の分子質量は、エステル転移反応 （transesterification）から予想された分
枝鎖ラクトン生成物とよりも直鎖状IC―疑似ステラリンF融合生成物とよく合致
した。
ス誘導形pARCＢD-ｐからの粗細胞溶菌液 がキチンアフィニティーカラム （affinity column）を通過する際に保持された。疑似ステラリンFは１−ブタノ
ール抽出により保持されない材料から回収された。融合プロテイン（F）、チオ
エステル中間体（T）及びIN に対する観察された分子質量は、遺伝子配列から予
測された値に極めて良く合致した。ICの質量は、製品リリースの提案されたメカ
ニズムから予測されたアスパラギン環化形状と合致した。ラリアート中間体（R
）の分子質量は、エステル転移反応 （transesterification）から予想された分
枝鎖ラクトン生成物とよりも直鎖状IC―疑似ステラリンF融合生成物とよく合致
した。
【０１２８】
その他の実施例
上述の明細書は多くの特定事項を含むが、それらは本発明を限定するものと解
釈されるべきではなく、好適な実施例の例示と解されるべきである。多くの他の
実施例が可能である。従って、本発明の範囲は上述の実施例ではなく、添付の特
許請求の範囲及びその法律的な均等物により制限されるべきである。
釈されるべきではなく、好適な実施例の例示と解されるべきである。多くの他の
実施例が可能である。従って、本発明の範囲は上述の実施例ではなく、添付の特
許請求の範囲及びその法律的な均等物により制限されるべきである。
【図１】
本発明における通常の環化反応の概要を示す概略図である。
【図２】
本発明のペプチド環化方法で起こる一連の化学反応ステップを示す概略図であ
る。
る。
【図３】
（ａ）核外遺伝子ｐＡＲＣＰ、（ｂ）核外遺伝子ｐＡＲＣＰ−ＤＨＦＲ、（ｃ
）核外遺伝子ｐＡＲＣＰＡＨ−ＤＨＦＲ、（ｄ）ＭｆｅＩサイトへのクローニン
グによって生成したシステイン（ＴＧＹ）またはセリン（ＴＣＮ）コドン（Ｎは
核酸塩基、ＳはＣ、ＧとＹはピリミジンを表す）、（ｅ）核外遺伝子ｐＡＲＣＰ
−ｐ、（ｆ）核外遺伝子ｐＡＲＣＢＤ−ｐの遺伝地図である。
）核外遺伝子ｐＡＲＣＰＡＨ−ＤＨＦＲ、（ｄ）ＭｆｅＩサイトへのクローニン
グによって生成したシステイン（ＴＧＹ）またはセリン（ＴＣＮ）コドン（Ｎは
核酸塩基、ＳはＣ、ＧとＹはピリミジンを表す）、（ｅ）核外遺伝子ｐＡＲＣＰ
−ｐ、（ｆ）核外遺伝子ｐＡＲＣＢＤ−ｐの遺伝地図である。
【図４】
10〜20％勾配のトリス／グリシン既製ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）でのジヒドロ葉酸
還元酵素（ＤＨＦＲ）環化の硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の写真である。
還元酵素（ＤＨＦＲ）環化の硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の写真である。
【図５】
65℃での前保温後の野生型（三角形）と環状ＤＨＦＲ（菱形）活性のＤＨＦＲ
活性のグラフである。
活性のグラフである。
【図６】
直鎖状および環状ＤＨＦＲの予想されるエンドプロテナーゼＬｙｓ−Ｃ消化パ
ターンを示す概略図である。
ターンを示す概略図である。
【図７】
擬似ステラリンＦによるチロシナーゼ抑制を検出するために生体内の検定で用
いたＦｅＣｕＹプレートの写真である。
いたＦｅＣｕＹプレートの写真である。
【図８】
本発明における環状ペプチドを精製する方法の概略図である。
【図９】
本発明における環状ペプチドを精製する別の方法の概略図である。
【図１０】
特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定／精製する固相支持体／
アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図１１】
特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定／精製する別の固相支持
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図１２】
特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定／精製する別の固相支持
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図１３】
特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定／精製する別の固相支持
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
体／アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図１４】
本発明におけるアプタマー骨格の使用を示す概略図である。
【図１５】
本発明におけるアプタマーを合成する２つの反応を示す概略図である。
【図１６】
本発明におけるスクリーニングの方法を示す概略図である。
【図１７】
本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
【図１８】
本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
【図１９】
本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５
1/21 7/00
5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ
7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 21/78 5/00 Ｂ
Ｃ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ
，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，
ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ
Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ
，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，
ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ
Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ベンコヴィック，ステファン，ジェイ．
米国，ペンシルヴァニア州 16801，ステ
ートカレッジ，ティーベリー レイン
771
(72)発明者 スコット，チャールズ，ピー．
米国，ペンシルヴァニア州 16801，ステ
ートカレッジ，ハイランドン コート
1614
(72)発明者 アベル−サントス，アーネスト，ヴィー．
米国，ペンシルヴァニア州 16801，ステ
ートカレッジ，ハイランドン コート
1635
Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AA06 AB10 EA03
4B024 AA01 BA80 CA02 DA01 DA02
DA06 DA12 EA03 GA11 HA11
4B063 QA01 QA08 QQ08 QQ09 QQ13
QQ43 QQ59 QR33 QR56 QR59
QR77 QS05 QS35 QX02
4B064 AG37 CA19 CC24 CE12 DA01
4B065 AA26 AA88 AA90 AB01 BA02
CA24 CA44
4H045 AA10 AA20 BA30 EA20 FA74
FA80 GA26
Claims (127)
- 【請求項１】 分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の部
分と、分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分との
間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する非自然
発生核酸分子において、ホストシステムにおける核酸分子の発現が、（ａ）前記
ターゲットペプチドの環化形を生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプ
ライシングしたポリペプチドと、（ｂ）前記ターゲットペプチドの環化形のスプ
ライシング中間体、とからなるグループから選ばれた形態のポリペプチドを生成
することを特徴とする非自然発生核酸分子。 - 【請求項２】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形を生
成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドであ
ることを特徴とする請求項１に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項３】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のス
プライシング中間体であることを特徴とする請求項１に記載の非自然発生核酸分
子。 - 【請求項４】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第
２の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請
求項１に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項５】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第
２の部分の両方は、Ｓｓｐ ＤｎａＥから誘導されたことを特徴とする請求項４
に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項６】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第
２の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたことを
特徴とする請求項１に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項７】 前記非自然発生分離インテインは、ＲｅｃＡ、ＤｎａＢ、Ｐ
ｓｐ Ｐｏｌ−Ｉ、Ｐｆｕインテインからなるグループから誘導されたことを特
徴とする請求項６に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項８】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第
２の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする
請求項１に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項９】 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体である
ことを特徴とする請求項８に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項１０】 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体である
ことを特徴とする請求項３に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項１１】 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であるこ
とを特徴とする請求項３に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項１２】 分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の
部分と、分離インテインの第３の部分と、分離インテインの第４の部分とからな
るポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子において、第１のターゲット
ペプチドが分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分
との間に挟まれ、第２のターゲットペプチドが分離インテインの前記第３の部分
と分離インテインの前記第４の部分との間に挟まれることを特徴とする非自然発
生核酸分子。 - 【請求項１３】 分離インテインの前記第１の部分は分離インテインの前記
第３の部分に相補的であるが分離インテインの前記第２の部分には相補的でなく
、分離インテインの前記第２の部分は分離インテインの前記第４の部分に相補的
であるが分離インテインの前記第３の部分には相補的でないことを特徴とする請
求項１２に記載の非自然発生核酸分子。 - 【請求項１４】 分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の
部分と、分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分と
の間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する発現
ベクターにおいて、ホストシステムにおける核酸分子の発現が、（ａ）前記ター
ゲットペプチドの環化形を生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライ
シングしたポリペプチドと、（ｂ）前記ターゲットペプチドの環化形のスプライ
シング中間体、とからなるグループから選ばれた形態のポリペプチドを生成する
ことを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項１５】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形を
生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドで
あることを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター - 【請求項１６】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形の
スプライシング中間体であることを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター
。 - 【請求項１７】 前記核酸分子は、さらに前記ホストシステムにおいてポリ
ペプチドの発現を容易にする調節塩基配列からなることを特徴とする請求項１５
に記載の発現ベクター。 - 【請求項１８】 前記核酸分子は、さらに個々の特性のための前記ターゲッ
トペプチドの前記環化形の選別を容易にするヌクレオチド配列からなることを特
徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項１９】 前記核酸分子は、さらに前記ホストシステムから前記ター
ゲットペプチドの前記環化形の精製を容易にするペプチドをコード化するヌクレ
オチド配列からなることを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項２０】 前記ターゲットペプチドは、分離インテインの前記第１の
部分へ融合する第１の端部と、分離インテインの前記第２の部分へ融合する第２
の端部とを有することを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項２１】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする
請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項２２】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、Ｓｓｐ ＤｎａＥから誘導されたことを特徴とする請求項
２１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２３】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたこと
を特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項２４】 前記非自然発生分離インテインは、ＲｅｃＡ、ＤｎａＢ、
Ｐｓｐ Ｐｏｌ−Ｉ、Ｐｆｕインテインからなるグループから誘導されたことを
特徴とする請求項２３に記載の発現ベクター。 - 【請求項２５】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とす
る請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項２６】 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であ
ることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。 - 【請求項２７】 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体である
ことを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。 - 【請求項２８】 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であるこ
とを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。 - 【請求項２９】 前記ホストシステムは、原核細胞からなることを特徴とす
る請求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３０】 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項２９
に記載の発現ベクター。 - 【請求項３１】 前記細菌は、大腸菌であることを特徴とする請求項３０記
載の発現ベクター。 - 【請求項３２】 前記ホストシステムは、真核細胞からなること特徴とする
請求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３３】 前記真核細胞は、酵母菌であることを特徴とする請求項３
２に記載の発現ベクター。 - 【請求項３４】 前記真核細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求
項３２に記載の発現ベクター。 - 【請求項３５】 前記ホストシステムは、始原細菌からなることを特徴とす
る請求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３６】 前記ホストシステムは、植物細胞からなることを特徴とす
る請求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３７】 前記ベクターは、核外遺伝子であることを特徴とする請求
項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３８】 前記ベクターは、細菌ウイルスであることを特徴とする請
求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項３９】 前記ベクターは、ウイルスであることを特徴とする請求項
１４記載の発現ベクター。 - 【請求項４０】 前記ベクターは、直鎖核酸分子であることを特徴とする請
求項１４記載の発現ベクター。 - 【請求項４１】 分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の
部分と、分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分と
の間に挟まれたターゲットペプチドとからなる十分に純粋なポリペプチドにおい
て、前記ポリペプチドが、（ａ）前記ターゲットペプチドの環化形を生成する前
記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドと、（ｂ）前
記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体、とからなるグループか
ら選ばれることを特徴とするポリペプチド。 - 【請求項４２】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形を
生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドで
あることを特徴とする請求項４１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４３】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形の
スプライシング中間体であることを特徴とする請求項４１に記載のポリペプチド
。 - 【請求項４４】 前記ターゲットペプチドは、分離インテインの前記第１の
部分へ融合する第１の端部と、分離インテインの前記第２の部分へ融合する第２
の端部とを有することを特徴とする請求項４１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４５】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする
請求項４１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４６】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、Ｓｓｐ ＤｎａＥから誘導されたことを特徴とする請求項
４５に記載のポリペプチド。 - 【請求項４７】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたこと
を特徴とする請求項４１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４８】 前記非自然発生分離インテインは、ＲｅｃＡ、ＤｎａＢ、
Ｐｓｐ Ｐｏｌ−Ｉ、Ｐｆｕインテインからなるグループから誘導されたことを
特徴とする請求項４７に記載のポリペプチド。 - 【請求項４９】 分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記
第２の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とす
る請求項４１に記載のポリペプチド。 - 【請求項５０】 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であ
ることを特徴とする請求項４３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５１】 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体である
ことを特徴とする請求項４３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５２】 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であるこ
とを特徴とする請求項４３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５３】 分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の
部分と、分離インテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分と
の間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する非自
然発生核酸分子からなるホストシステムにおいて、前記ポリペプチドが、（ａ）
前記ターゲットペプチドの環化形を生成する前記ホストシステムにおいて自然に
スプライシングしたポリペプチドと、（ｂ）前記ターゲットペプチドの環化形の
スプライシング中間体、とからなるグループから選ばれることを特徴とするホス
トシステム。 - 【請求項５４】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形を
生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドで
あることを特徴とする請求項５３に記載のホストシステム。 - 【請求項５５】 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形の
スプライシング中間体であることを特徴とする請求項５３に記載のホストシステ
ム。 - 【請求項５６】 前記ホストシステムは、原核細胞からなることを特徴とす
る請求項５３記載のホストシステム。 - 【請求項５７】 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項５６
に記載のホストシステム。 - 【請求項５８】 前記ホストシステムは、始原細菌からなることを特徴とす
る請求項５３記載のホストシステム。 - 【請求項５９】 前記ホストシステムは、真核生物からなること特徴とする
請求項５３記載のホストシステム。 - 【請求項６０】 前記真核生物は、酵母菌であることを特徴とする請求項５
９に記載のホストシステム。 - 【請求項６１】 前記真核生物は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求
項５９に記載のホストシステム。 - 【請求項６２】 前記ホストシステムは、植物細胞からなることを特徴とす
る請求項５３記載のホストシステム。 - 【請求項６３】 ペプチド分子を作成する方法であって、分離インテインの
第１の部分と、分離インテインの第２の部分と、分離インテインの前記第１の部
分と分離インテインの前記第２の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとか
らなるポリペプチドをコード化する単離核酸分子を準備するステップからなる方
法において、ホストシステムにおける前記核酸分子の発現が、（ａ）前記ホスト
システムにおいて前記ポリペプチドが自然にスプライシングしたことに由来する
前記ターゲットペプチドの環化形と、（ｂ）前記ターゲットペプチドの環化形の
スプライシング中間体、とからなるグループから選ばれた形態の前記ペプチド分
子を生成するステップと、前記ホストシステムを準備するステップと、前記ホス
トシステムに前記単離核酸分子を導入するステップと、前記単離核酸分子を発現
させるステップとからなることを特徴とする方法。 - 【請求項６４】 前記単離核酸分子を発現させるステップは、前記ターゲッ
トペプチドの環化形を生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシン
グしたポリペプチドを生成することを特徴とする請求項６３に記載の方法。 - 【請求項６５】 さらに前記ホストシステムから前記ターゲットペプチドの
環化形を精製するステップからなることを特徴とする請求項６４に記載の方法。 - 【請求項６６】 前記単離核酸分子を発現させるステップは、前記ターゲッ
トペプチドの環化形のスプライシング中間体を生成することを特徴とする請求項
６３に記載の方法。 - 【請求項６７】 さらに前記ホストシステムから前記ターゲットペプチドの
環化形を精製するステップからなることを特徴とする請求項６６に記載の方法。 - 【請求項６８】 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であ
ることを特徴とする請求項６６に記載の方法。 - 【請求項６９】 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体である
ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。 - 【請求項７０】 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であるこ
とを特徴とする請求項６６に記載の方法。 - 【請求項７１】 さらに前記スプライシング中間体から前記環化ペプチドを
生成するステップからなることを特徴とする請求項６６記載の方法。 - 【請求項７２】 前記単離核酸分子は、前記ホストシステムにおいて前記単
離核酸分子の発現を容易にする発現ベクターへ組込まれることを特徴とする請求
項６３記載の方法。 - 【請求項７３】 前記発現ベクターは、核外遺伝子であることを特徴とする
請求項７２に記載の方法。 - 【請求項７４】 前記発現ベクターは、細菌ウイルスであることを特徴とす
る請求項７２に記載の方法。 - 【請求項７５】 前記発現ベクターは、ウイルスであることを特徴とする請
求項７２に記載の方法。 - 【請求項７６】 前記ホストシステムは、原核細胞からなることを特徴とす
る請求項６３に記載の方法。 - 【請求項７７】 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項７６
に記載の方法。 - 【請求項７８】 前記細菌は、大腸菌であることを特徴とする請求項７７に
記載の方法。 - 【請求項７９】 前記ホストシステムは、始原細菌からなることを特徴とす
る請求項６３に記載の方法。 - 【請求項８０】 前記ホストシステムは、真核細胞からなることを特徴とす
る請求項６３に記載の方法。 - 【請求項８１】 前記真核細胞は、酵母菌であることを特徴とする請求項８
０に記載の方法。 - 【請求項８２】 前記真核細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求
項８０に記載の方法。 - 【請求項８３】 前記ホストシステムは、植物細胞からなることを特徴とす
る請求項６３に記載の方法。 - 【請求項８４】 前記ホストシステムは、生体外での転写／翻訳システムか
ら構成されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。 - 【請求項８５】 前記生体外での転写／翻訳システムは、細胞溶解物から構
成されることを特徴とする請求項８４に記載の方法 - 【請求項８６】 環化形の前記ターゲットペプチドの前記生成は、外因添加
試薬の非存在下で前記ホストシステムにて生じることを特徴とする請求項６４に
記載の方法。 - 【請求項８７】 前記外因添加試薬は、蛋白質分解酵素であることを特徴と
する請求項８６に記載の方法。 - 【請求項８８】 前記外因添加試薬は、チオールであることを特徴とする請
求項８６に記載の方法。 - 【請求項８９】 前記発現ベクターは、誘導できることを特徴とする請求項
７２に記載の方法。 - 【請求項９０】 ペプチド分子のライブラリーを作成する方法であって、異
種のアミノ酸塩基配列を有する多数のターゲットペプチドをコード化する多数の
核酸分子を準備するステップと、多数の発現ベクターを生成するためにそれぞれ
の多数の核酸分子を発現ベクターへ組込み、それによって、それぞれの多数の核
酸分子がそれぞれの生成した発現ベクターにおいて分離インテインの第１の部分
をコード化する核酸分子と分離インテインの第２の部分をコード化する核酸分子
との間に挿入されるステップとからなる方法において、ホストシステムにおける
前記発現ベクターの発現が、（ａ）前記ターゲットペプチドの環化形を生成する
前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプチドと、（ｂ）
前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体、とからなるグループ
から選ばれた形態の多数のペプチド分子を生成するステップと、前記ホストシス
テムにおいて発現ベクターを発現させるステップとからなることを特徴とする方
法。 - 【請求項９１】 前記多数のポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環
化形を生成する前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングしたポリペプ
チドであることを特徴とする請求項９０に記載の方法。 - 【請求項９２】 前記多数のポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環
化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項９０に記載の方法。 - 【請求項９３】 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸
分子は、固相法によって生成されたことを特徴とする請求項９０に記載の方法。 - 【請求項９４】 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸
分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成されたことを特徴とする請求項９０
に記載の方法。 - 【請求項９５】 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸
分子は、大きい核酸分子を酵素で消化することによって生成されたことを特徴と
する請求項９０に記載の方法。 - 【請求項９６】 前記大きい核酸分子は、生物体から誘導されることを特徴
とする請求項９５に記載の方法。 - 【請求項９７】 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸
分子は、原種核酸分子から生成され、この原種核酸分子は、前記原種核酸分子の
ヌクレオチド配列へ突然変異体を導入する条件下で増幅されたことを特徴とする
請求項９０に記載の方法。 - 【請求項９８】 予定された特性のためのペプチド分子を選別する方法であ
って、分離インテインの第１の部分と、分離インテインの第２の部分と、分離イ
ンテインの前記第１の部分と分離インテインの前記第２の部分との間に挟まれた
ターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する核酸分子を準備する
ステップからなる方法において、ホストシステムにおける前記発現ベクターの発
現が、（ａ）前記ホストシステムにおいて前記ポリペプチドが自然にスプライシ
ングしたことに由来する前記ターゲットペプチドの環化形と、（ｂ）前記ターゲ
ットペプチドの環化形のスプライシング中間体、とからなるグループから選ばれ
た形態のペプチド分子を生成するステップと、前記ホストシステムを準備するス
テップと、前記ホストシステムに単離核酸分子を導入するステップと、前記ペプ
チド分子を生成させる条件下に前記ホストシステムをおくステップと、前記予定
された特性のための前記ペプチド分子を試験するステップとからなることを特徴
とする方法。 - 【請求項９９】 前記ペプチド分子は、前記ターゲットペプチドの環化形で
あることを特徴とする請求項９８記載の方法。 - 【請求項１００】 前記ペプチド分子は、前記ターゲットペプチドの環化形
のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項９８記載の方法。 - 【請求項１０１】 前記予定された特性は、ターゲット分子に特異的に結合
する能力からなり、前記予定された特性のためのペプチド分子を試験するステッ
プは、（ａ）前記ペプチド分子を前記ターゲット分子に接触させるステップと、
（ｂ）前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合するかどうか測定するステ
ップとからなることを特徴とする請求項９８に記載の方法。 - 【請求項１０２】 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかど
うか測定する前記ステップは、色の変化の観察によって測定されることを特徴と
する請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０３】 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかど
うか測定する前記ステップは、蛍光シグナルの観察によって測定されることを特
徴とする請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０４】 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかど
うか測定する前記ステップは、生物体の細胞サイクルの分析によって測定される
ことを特徴とする請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０５】 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかど
うか測定する前記ステップは、生物体の再生の分析によって測定されることを特
徴とする請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０６】 前記ターゲット分子は、細胞結合分子であることを特徴
とする請求項１０１に記載の方法。 - 【請求項１０７】 前記細胞結合分子は、膜結合分子であることを特徴とす
る請求項１０６に記載の方法。 - 【請求項１０８】 前記細胞結合分子は、細胞内分子であることを特徴とす
る請求項１０６に記載の方法。 - 【請求項１０９】 前記細胞内分子は、核分子であることを特徴とする請求
項１０８に記載の方法。 - 【請求項１１０】 前記細胞内分子は、細胞小器官であることを特徴とする
請求項１０８に記載の方法。 - 【請求項１１１】 前記細胞小器官は、ミトコンドリア、リソソーム、小胞
体、葉緑体、ゴルジ体、ペリプラズムからなるグループから選ばれることを特徴
とする請求項１１０に記載の方法。 - 【請求項１１２】 前記ターゲット分子は、細胞外分子であることを特徴と
する請求項１０１に記載の方法。 - 【請求項１１３】 前記予定された特性は、生化学反応を調節する能力から
なり、前記予定された特性のためのペプチド分子を試験するステップは、（ａ）
前記ペプチド分子を前記生化学反応を包含した系へ接触させるステップと、（ｂ
）前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定するステップとか
らなることを特徴とする請求項９８に記載の方法。 - 【請求項１１４】 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか
測定する前記ステップは、色の変化の観察によって測定されることを特徴とする
請求項１１３記載の方法。 - 【請求項１１５】 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか
測定する前記ステップは、蛍光シグナルの観察によって測定されることを特徴と
する請求項１１３記載の方法。 - 【請求項１１６】 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか
測定する前記ステップは、生物体の細胞サイクルの分析によって測定されること
を特徴とする請求項１１３記載の方法。 - 【請求項１１７】 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか
測定する前記ステップは、生物体の再生の分析によって測定されることを特徴と
する請求項１１３記載の方法。 - 【請求項１１８】 前記生化学反応は、細胞結合プロセスであることを特徴
とする請求項１１３に記載の方法。 - 【請求項１１９】 前記生化学反応は、細胞内代謝で生じることを特徴とす
る請求項１１８に記載の方法。 - 【請求項１２０】 前記生化学反応は、膜結合で生じることを特徴とする請
求項１１８に記載の方法。 - 【請求項１２１】 前記生化学反応は、核で生じることを特徴とする請求項
１１８に記載の方法。 - 【請求項１２２】 前記生化学反応は、細胞外反応であることを特徴とする
請求項１１３に記載の方法。 - 【請求項１２３】 前記予定された特性のための前記ペプチド分子を試験す
る前記ステップは、ハイブリッドシステムを用いて行なわれることを特徴とする
請求項９８に記載の方法。 - 【請求項１２４】 さらに固相支持体で前記ペプチド分子を固定するステッ
プからなることを特徴とする請求項９８記載の方法。 - 【請求項１２５】 混合物から環状ペプチドを精製する方法であって、アフ
ィニティ標識と結合したスプライシング中間体を含む混合物を準備するステップ
と、前記結合したスプライシング中間体を特異的に前記アフィニティ標識と結合
する配位子を有する固相支持体と混合し、それによって前記支持体が前記スプラ
イシング中間体と特異的に結合するステップと、前記支持体から非特異的結合体
を除去するために前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体に前記スプライ
シング中間体から環状ペプチドを生成させる試薬を添加するステップと、前記支
持体から前記環状ペプチドを溶離するステップとからなる方法。 - 【請求項１２６】 混合物から環状ペプチドを精製する方法であって、アフ
ィニティ標識と結合したスプライシング中間体を含む混合物を準備するステップ
と、前記結合したスプライシング中間体を特異的に前記アフィニティ標識と結合
する配位子を有する固相支持体と混合し、それによって前記支持体が前記スプラ
イシング中間体と特異的に結合するステップと、前記支持体から非特異的結合体
を除去するために前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体から前記スプラ
イシング中間体を溶離するステップと、前記溶離スプライシング中間体に前記ス
プライシング中間体から環状ペプチドを生成させる試薬を添加するステップとか
らなる方法。 - 【請求項１２７】 混合物からスプライシング中間体に結合するターゲット
分子を精製する方法であって、特異的に結合するスプライシング中間体を有する
固相支持体を準備するステップと、前記支持体を前記混合物中の前記ターゲット
分子に接触させるステップと、前記支持体から非特異的結合体を除去するために
前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体から前記ターゲット分子を溶離す
るステップとからなる方法。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014528720A (ja) * | 2011-09-28 | 2014-10-30 | エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマＥｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓ．Ａ． | スプリットインテインおよびその使用 |
| JP2016538241A (ja) * | 2013-09-26 | 2016-12-08 | フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | アミロイドベータ結合性環状ペプチドおよびその使用 |
| KR102000490B1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-10-01 | 전남대학교산학협력단 | 가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도 |
| KR20190137078A (ko) * | 2017-02-23 | 2019-12-10 | 유니버시티 오브 사우스햄튼 | 구획화된 펩티드 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법 |
| JP2020517290A (ja) * | 2017-04-26 | 2020-06-18 | フーナン ゾンセン ペプリブ バイオテック カンパニー リミテッド | ペプチドライブラリーの構築方法 |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6781700A (en) * | 1999-08-17 | 2001-03-13 | Health Research Institute | Genetic system and self-cleaving inteins derived therefrom, bioseparations and protein purification employing same, and methods for determining critical, generalizable amino acid residues for varying intein activity |
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| US7252952B2 (en) * | 2000-03-06 | 2007-08-07 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein—protein interaction |
| US7378248B2 (en) | 2000-03-06 | 2008-05-27 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction |
| JP3772193B2 (ja) | 2000-07-26 | 2006-05-10 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを利用した蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法 |
| US7279304B2 (en) | 2000-12-18 | 2007-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for preparation of macrocyclic molecules and macrocyclic molecules prepared thereby |
| WO2002074930A2 (en) * | 2001-03-20 | 2002-09-26 | The Pennsylvania State Research Foundation | Trans inteins for protein domain shuffling and biopolymerization |
| EP2395083B1 (en) | 2002-01-08 | 2017-04-12 | Agrivida, Inc. | Transgenic plants expressing CIVPS or intein modified proteins and related method |
| US7250551B2 (en) | 2002-07-24 | 2007-07-31 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic mice expressing inducible human p25 |
| JP4287633B2 (ja) * | 2002-09-18 | 2009-07-01 | 独立行政法人科学技術振興機構 | オルガネラ局在タンパク質の解析方法と解析材料 |
| FI20021726A0 (fi) * | 2002-09-27 | 2002-09-27 | Ctt Cancer Targeting Tech Oy | Menetelmä peptidien tuottamiseksi |
| US20040198958A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-10-07 | Ming-Qun Xu | Carrier-ligand fusions and uses thereof |
| WO2005115433A2 (en) * | 2004-05-24 | 2005-12-08 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods for cyclizing synthetic polymers |
| US20100143972A1 (en) * | 2006-12-14 | 2010-06-10 | Horswill Alexander R | Method of Making Cyclic Polypeptides with Inteins |
| WO2008083493A1 (en) * | 2007-01-10 | 2008-07-17 | University Of Saskatchewan | Stabilization of cyclic peptide structures |
| CN101638642B (zh) * | 2008-08-01 | 2012-02-22 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化植酸酶 |
| WO2010135277A2 (en) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | Brown University | Cyclic-glur6 analogs, methods of treatment and use |
| US8420387B2 (en) | 2009-11-06 | 2013-04-16 | Agrivida, Inc. | Intein-modified enzymes, their production and industrial applications |
| US9464333B2 (en) | 2009-11-06 | 2016-10-11 | Agrivida, Inc. | Intein-modified enzymes, their production and industrial applications |
| US10407742B2 (en) | 2009-11-06 | 2019-09-10 | Agrivida, Inc. | Intein-modified enzymes, their production and industrial applications |
| US9598700B2 (en) | 2010-06-25 | 2017-03-21 | Agrivida, Inc. | Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch |
| US10443068B2 (en) | 2010-06-25 | 2019-10-15 | Agrivida, Inc. | Plants with engineered endogenous genes |
| JP6092104B2 (ja) | 2010-08-13 | 2017-03-08 | ミティ・バイオシステムズ・ゲーエムベーハー | 修飾ペプチドディスプレイ |
| EP2665744B1 (en) * | 2011-01-20 | 2015-04-08 | University Of Rochester | Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation |
| ES2610923T3 (es) | 2011-03-07 | 2017-05-04 | Agrivida, Inc. | Pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular |
| ES2930185T3 (es) | 2012-06-27 | 2022-12-07 | Univ Princeton | Inteínas divididas, conjugados y usos de las mismas |
| CN104822830B (zh) * | 2012-10-03 | 2021-07-09 | 谷万达公司 | 内含肽修饰的蛋白酶、其制备方法和工业用途 |
| WO2015043567A1 (de) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Amyloid-beta-bindende peptide und deren verwendung für die therapie und die diagnose der alzheimerschen demenz |
| US10544191B2 (en) | 2013-12-23 | 2020-01-28 | University Of Rochester | Methods and compositions for ribosomal synthesis of macrocyclic peptides |
| WO2016167291A1 (ja) | 2015-04-13 | 2016-10-20 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 環状化サイトカイン及びその製法 |
| CN106749497B (zh) * | 2017-02-06 | 2020-10-30 | 陈铭 | 套索多肽的化学全合成 |
| US11858974B2 (en) | 2017-05-22 | 2024-01-02 | Resq Biotech | Macrocyclic modulators of disease associated protein misfolding and aggregation |
| GB201909491D0 (en) * | 2019-07-01 | 2019-08-14 | Governing Council Of The Univ Of Toronto | Detection of protein to protein interactions |
| KR20210035752A (ko) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 성균관대학교산학협력단 | 항-바이러스 활성이 향상된 나노천공자 |
| CN115093470B (zh) * | 2022-06-30 | 2023-03-24 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 内含肽Mtu RecA突变体及其在生产谷胱甘肽GSH中的应用 |
| WO2024170051A1 (en) * | 2023-02-13 | 2024-08-22 | Kutzner Christoph | Fusion polypeptides for manufacturing of cyclic peptides |
| WO2024181807A1 (ko) * | 2023-02-28 | 2024-09-06 | 건국대학교 산학협력단 | 섬유아세포 성장인자 생산용 재조합 벡터 |
| WO2024181806A1 (ko) * | 2023-02-28 | 2024-09-06 | 건국대학교 산학협력단 | 단백질 환형화 시스템 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0770200A (ja) * | 1992-12-09 | 1995-03-14 | New England Biolabs Inc | 改質タンパク質及びその製造法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643758A (en) * | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
| WO1995001800A1 (en) * | 1993-07-09 | 1995-01-19 | Smithkline Beecham Corporation | Cyclic semi-random peptide libraries |
| US5498531A (en) | 1993-09-10 | 1996-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | Intron-mediated recombinant techniques and reagents |
| JP4476360B2 (ja) | 1995-06-28 | 2010-06-09 | ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド | 改質タンパク質及びその製造法 |
-
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2007
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0770200A (ja) * | 1992-12-09 | 1995-03-14 | New England Biolabs Inc | 改質タンパク質及びその製造法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6009049810, Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ｖｏｌ．９６， ｐ．１３６３８−１３６４３ （Ｎｏｖ．２３， １９９９） * |
| JPN6009049812, Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ｖｏｌ．９５， ｐ．９２２６−９２３１ （１９９８） * |
| JPN6009049814, Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ．６， ｐ．９５１−９５６ （１９９８） * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014528720A (ja) * | 2011-09-28 | 2014-10-30 | エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマＥｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓ．Ａ． | スプリットインテインおよびその使用 |
| US10100080B2 (en) | 2011-09-28 | 2018-10-16 | Era Biotech, S.A. | Split inteins and uses thereof |
| JP2016538241A (ja) * | 2013-09-26 | 2016-12-08 | フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | アミロイドベータ結合性環状ペプチドおよびその使用 |
| JP2020023510A (ja) * | 2013-09-26 | 2020-02-13 | フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | アミロイドベータ結合性環状ペプチドおよびその使用 |
| KR20190137078A (ko) * | 2017-02-23 | 2019-12-10 | 유니버시티 오브 사우스햄튼 | 구획화된 펩티드 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법 |
| JP2020511432A (ja) * | 2017-02-23 | 2020-04-16 | ユニバーシティ、オブ、サウサンプトンＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ | 区画化ペプチドライブラリを生成及びスクリーニングする方法 |
| KR102567657B1 (ko) * | 2017-02-23 | 2023-08-16 | 유니버시티 오브 사우스햄튼 | 구획화된 펩티드 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법 |
| JP2020517290A (ja) * | 2017-04-26 | 2020-06-18 | フーナン ゾンセン ペプリブ バイオテック カンパニー リミテッド | ペプチドライブラリーの構築方法 |
| JP7013039B2 (ja) | 2017-04-26 | 2022-01-31 | フーナン ゾンセン ペプリブ バイオテック カンパニー リミテッド | ペプチドライブラリーの構築方法 |
| KR102000490B1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-10-01 | 전남대학교산학협력단 | 가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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