CN1354788A - 环肽 - Google Patents

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Abstract

本文公开了制备环肽和环形构象的肽的剪接中间体的方法。该方法利用了断裂内含肽催化含有插入在断裂内含肽两部分之间的靶肽的前体肽,形成环化肽的反式剪接能力。断裂内含肽两部分之间的相互反应产生了催化活性的内含肽,并迫使靶肽呈环形构象,这稳定了内含肽一个部分和靶肽之间连接处的氨基酸的酯异构体。随后内含肽另一部分中的杂原子与该酯反应形成环状酯中间体。该活性内含肽催化形成氨基琥珀酰亚胺,其释放产生环状形式的靶肽,该靶肽自发地重排形成热动力学性能优良的主链环肽产物。本文还公开了核酸分子、多肽、制备环肽的方法、制备文库的方法和筛选肽的方法。

Description

环肽
与相关申请的相互参照
本发明申明享有于1998年12月18日申请的美国临时专利申请No.60/112,723和于1999年10月7日申请的名为“环肽和蛋白质的体内生产”的美国临时专利申请No.××的权益，本文将这两者全部纳入作为参考。
联邦资助研究的声明
本发明的完成得到了政府资助使用了国立卫生研究院的GM13306和GM19891资金。因此联邦政府享有本发明的一定权利。
发明领域
本发明涉及生物化学领域。更具体说，本发明涉及环肽、环肽的制备方法和筛选具有特定性能的环肽的方法。
发明背景
小的线性肽在研究各种生理现象中非常有用，因为它们表现出的生物活性范围很大，而且用固相合成和组合化学的常规方法以几乎无穷变化的序列极易合成。这些特性也使小的线性肽在鉴定和开发新药中特别有用。例如，可以合成制备成千上万的小线性肽的大文库，然后以各种生物试验筛选某一特性。E.g.Scott，J.K.和G.P.Smith，Science249：386，1990；Devlin，J.J.，等人，Science 24：404，1990；Furka，A.等人，J.Pept.Protein Res.37：487，1991；Lam，K.S.，等人，Nature 354：82，1991。然后分离出文库中表现出该特性的那些肽作为候选物进行进一步的研究。微测序或其他化学分析可用于分析所选出的肽的特性，如氨基酸序列。虽然有这些优点，但是仅有一小部分小线性肽被开发成广泛使用的药物。造成这种情况的一个原因是小线性肽在体内通常被迅速清除，而无治疗价值。
环状闭合或环化可降低体内肽的降解速率，从而大大改善它们的药物动力学性能。从天然来源(如降钙素、催产素和加压素)分离后，已鉴定了大部分具有已知治疗价值的环肽。不幸的是，可以筛选出的具有特定生物活性的天然环肽数量有限。且需要从天然来源分离和纯化环肽的繁重步骤使这种筛选既昂贵又不实用。所以建立能产生大量含有无穷变化氨基酸序列的不同肽的合成方法，将大大便利作为新药候选物的特定环肽的鉴定。
已有人描述了产生环肽的各种方法。如设计了化学反应方案(如美国专利No.4,033,940和No.4,102,877中所述的)来产生环化的肽。在其他技术中联合采用生物学和化学方法来产生环肽，这些方法包括首先在细胞(如细菌)中表达环肽的线性前体，以产生环肽的线性前体，然后加入外源试剂(如蛋白酶或亲核试剂)，从而将这些线性前体肽化学转变成环肽。见如Camerero，J.A.，和Muir，T.W.，J.Am.Chem.Society.121：5597(1991)；Wu，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：9226(1998)。
一旦产生，将可以筛选环肽的药学活性。例如，可制备包含大量不同环肽的文库，然后筛选某一特性，如结合特异性靶配体的能力。将文库与靶配体混合，可以分离出文库中那些与靶配体结合的成员，并通过氨基酸测序来鉴定。类似地，可加入环肽文库来测试特定的生物活性。然后分离出那些能调节生物活性的环肽，并通过测序来鉴定。
不幸的是，由于鉴定活性肽的步骤可能很难，这些筛选试验通常需要消耗大量劳力和时间。例如，筛选试验通常需要反向作图步骤，因为结合于靶配体或调节生物活性的环肽的实际数量通常非常小，难以直接测序。为了避免这个问题，可以制图表明含有各种环肽的文库的实际位置。将不同位置的等份环肽转移到筛选试验中的相应位置；然后将试验中表现出所筛选特性(如结合或调节生物活性)的那些区域再作图返回文库中的其相应位置。然后分离出文库中该区域的环肽并测序。需要空间分辨所产生的困难以及样品处理所具有的限制性，限制了在任何给定的时间内可筛选的候选肽的数量。
采用能表达肽的细胞可大大增加试验中可筛选的肽的数量。例如，可在筛选试验中加入经工程改造能表达线性肽文库的细菌，直接从试验中挑选出表达所筛选特性的那些细菌。然后可大量再生挑出的细菌，从而大量产生选定的线性肽以便于它们的鉴定(如通过测序)和生产。然而体内小线性肽文库的产生和筛选证明也是费力的，因为小的线性肽被正常细胞代谢过程所迅速降解。通过让肽在细胞内稳定可以解决肽的环化问题。
除此以外，至今环肽大文库的细胞内生产还是不可行的，因为还没有易于操作的体内环化肽的方法。例如，一已知的体内产生环肽的方法采用了非核糖体肽合成酶(NRPS)复合物(Cane等人，Science 282：63，1998)。但这种NRSP复合物既不易起作用通常又不能用于同时产生一种以上的单一环肽。另外，与核糖体肽的合成(单体的线性序列(氨基酸)由编码它的核酸分子中碱基的线性序列支配)不同，由NRPS方法产生的肽的单体线性序列是由NRPS复合物的该亚基组织支配的。改变NRPS产生的环肽序列，使该亚基克隆，此亚基中渗入了所需的单体，并将该亚基引入宿主细胞，所述的宿主细胞已含有所有其他必须的亚基。用这种技术产生的文库需要将NRPS诸亚基的组合(组成和序列)引入宿主细胞，并设计一方法以确保将这些亚基装配入正确的超分子结构中。
发明概述
已发现了体内产生和筛选环肽文库的通用方法。在这种方法中，构建一核酸分子，使编码待环化肽的核苷酸序列于一端侧接编码断裂(或反式)内含肽(intein)(C-内含肽或Ic)的羧基末端部分的核苷酸序列，在另一端侧接编码断裂内含肽(N一内含肽或IN)的氨基末端的核苷酸序列。在宿主系统(如细菌或真核细胞)中此构建物的表达能产生一种融合蛋白。然后将这种融合蛋白的两个断裂内含肽组分(即Ic和IN)装配形成活性酶，此酶将氨基和羧基端一起断裂形成主链环肽。以下图示说明了此化学反应。
内含肽介导的环化的机理
Figure A9981581400151
由氨基和羧基端片段形成活性内含肽稳定了N-内含肽和待环化肽之间连接处氨基酸的酯异构体(在上图B中，X＝S或0)。当R＝XH时，C-内含肽的杂原子易攻击该酯并产生一种环状酯中间体(C)。内含肽催化形成了氨基琥珀酰亚胺(D)释放出该环肽(以内酯形式)，其自发地重排形成热动力学性能优良的主链(内酰胺形式)环肽产物(E)。可采纳这种方法以便于选择或筛选具有预订特性的环肽。
本发明的特征是编码多肽的非天然形成的核酸分子，此多肽含有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分，还位于断裂内含肽的第一部分和第二部分之间的靶肽。宿主系统中该核酸分子的表达产生了多肽，其在宿主系统中能自发地断裂产生环化形式的靶肽或环化形式的该靶肽的剪接中间体，如活性内含肽中间体、硫酯中间体或套索中间体。
可从天然形成的断裂内含肽(如Ssp DnaE)衍生得到断裂内含肽的第一部分和第二部分。在其他变化中，一个或两个断裂内含肽部分可以从非天然形成的断裂内含肽(如那些从RecA、DnaB、Psp、Pol-1和Pfu内含肽)衍生得到。
另一方面，本发明的特征是编码一多肽的非天然形成的核酸分子，所编码的多肽含有断裂内含肽的第一、第二、第三和第四部分。该分子可以含有插入在断裂内含肽第一和第二部分之间的第一靶肽，和插入在断裂内含肽第三和第四部分之间的第二靶肽。断裂内含肽的第一部分可互补于断裂内含肽的第三部分，但与断裂内含肽的第二部分不互补，断裂内含肽的第二部分可互补于断裂内含肽的第四部分但与断裂内含肽的第三部分不互补。
本发明的中还有包含本发明核酸分子的表达载体。该载体在宿主系统中的表达产生多肽，该多肽在宿主系统中能自发地断裂，产生环肽或断裂(splicting)中间体。本发明的表达载体还包含调节序列，有利于多肽在宿主系统中的表达。高载体的核酸分子可包含核苷酸序列(其编码的肽有利于具有某种特性的环状形式靶肽的筛选)，和/或核苷酸序列(其编码的肽有利于从宿主系统纯化环状形式的靶肽)。此表达载体也可以是可诱导型的。
在另一方面，本发明的特征是编码含有靶肽的多肽的表达载体，所述的靶肽具有融合于断裂内含肽的第一部分的第一个末端，和融合于断裂内含肽的第二部分的第二个末端。本发明的表达载体可以是质粒、噬菌体、病毒、线性核酸分子或其他类型的载体。
本发明的其他特征是基本纯的多肽，其具有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分和位于断裂内含肽第一部分和第二部分之间的靶肽。此多肽可以是能在宿主系统中自发断裂的多肽，以产生环化形式的靶肽，或也可以是断裂中间体。
本发明还包括包含本发明核酸分子的宿主系统。此宿主系统可以是原核细胞如细菌、古细菌(archaebacterium)，真核细胞如酵母或哺乳动物细胞、植物细胞、体外转录/翻译系统，或细胞裂解液。
另一方面，本发明还提供产生肽分子的方法。该方法包括如下步骤：提供本发明的分离的核酸分子；提供宿主系统；将分离的核酸分子引入宿主系统；表达分离的核酸分子。在一变化中，分离的核酸分子的表达步骤导致产生多肽，该多肽在宿主系统中能自发地断裂产生环化形式的靶肽。这种方法还可包括以下步骤：从宿主系统纯化环化形式的靶肽。
此方法的另一种变化是，分离的核酸分子的表达步骤导致产生环状形式靶肽的断裂中间体。该方法还包括以下步骤：自宿主系统纯化环状形式靶肽的剪接中间体。该方法的另一变化包括由剪接中间体形成环肽的步骤。
该方法的另一方面，在缺乏外源添加剂(如蛋白酶和巯基)时，在宿主系统中产生环化形式的靶肽。
本发明另一方面提供了一种制备肽分子文库的方法。该方法包括如下步骤：提供多种核酸分子，其编码多种具有异源氨基酸序列的靶肽；将这些核酸分子分别整合入表达载体，形成许多表达载体；和在宿主系统中表达这些表达载体。将多个核酸分子在各个形成的表达载体中插入在编码断裂内含肽第一部分的核酸分子和编码断裂内含肽第二部分的核酸分子之间，从而在宿主系统中这些表达载体的表达导致产生许多肽分子，这些多肽能在宿主系统中自发地断裂，产生环化形式的靶肽、或环化形式靶肽的剪接中间体。
本发明的另一方面包括一种筛选具有某预定特性的肽的方法。该方法包括如下步骤：提供编码多肽的核酸分子，该多肽包含断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分，和插入在断裂内含肽第一部分和第二部分之间的靶肽；提供宿主系统；将分离的核酸分子引入宿主系统；将宿主系统置于生成肽分子的条件下；测试肽分子的预定特性。核酸分子在宿主系统中的表达产生环化形式的靶肽(因该多肽在宿主系统中自发性断裂而产生的)或环化形式靶肽的剪接中间体。
该方法的另一种变化是，预定的特性包括特异性结合靶分子的能力，检测肽分子预定特性的步骤包括步骤(a)使肽分子与靶分子接触，和(b)测定肽分子是否结合于靶分子。在另一种变化中，预定的特征是调节生物化学反应的能力，测定肽预定特征的步骤包括(a)使肽分子与含生物化学反应的系统接触，和(b)测试肽分子是否调节该生物化学反应。可通过观察颜色的变化、荧光信号、通过分析细胞周期或组织的再生，来衡量肽分子是否结合于靶分子或是否调节生物化学反应的测定步骤。
在这些方法中靶分子可以是细胞相关(cell-associated)的分子如膜结合分子或细胞内分子(如核分子或一种或多种细胞器如线粒体、溶酶体、内质网、叶绿体、高尔基体和周质)。也可以是细胞外分子。
生物化学反应可以是细胞相关的过程，如细胞内代谢活动、与膜相关的活动、细胞核活动。也可以是细胞外的反应。
在这些方法中，可用杂交系统和/或将肽分子固定在固相载体上的步骤，进行肽分子预定特性的测试。
本发明还提供从混合物纯化环肽的方法。该方法包括如下步骤：提供含有与亲和标记物偶联的剪接中间体的混合物；将偶联的剪接中间体与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合亲和标记物，从而使载体能特异性结合剪接中间体；洗涤载体除去载体上非特异性结合物质；在载体中加入试剂，使剪接中间体形成环肽；从载体上洗脱下环肽。
上述的改变是，本发明还包括从混合物纯化环肽的方法，该方法包括如下步骤：提供含有偶联于亲和标记物的剪接中间体的混合物；将偶联的剪接中间体与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合亲和标记物，从而使载体能特异性结合剪接中间体；洗涤载体除去载体上非特异性结合的物质；从载体上洗脱下剪接中间体；将试剂加到洗脱的剪接中间体中，使剪接中间体生成环肽。
另外，本发明还包括从混合物中纯化能结合剪接中间体的靶分子。该方法包括如下步骤：提供固相载体，其上带有特异性结合的剪接中间体；使该载体与混合物中的靶分子接触；洗涤载体除去载体上非特异性结合物质；从载体上洗脱靶分子。
如本文所用术语“非天然形成的”指通过人为作用直接或间接制造或产生的。所以，非天然形成的核酸分子是通过人操作而不是天然演化过程产生的核酸分子。
术语“核酸分子”指序列中结合的两个或多个核苷酸链形成的。例如核酸分子可以是DNA或RNA。
如本文所用术语“肽”指序列中结合的两个或多个氨基酸形成的链，包括多肽和蛋白质。“多肽”指由两个或多个肽构成的聚合物，无论长度或翻译后的修饰。“蛋白质”指氨基酸形成的任何链，包括肽、多肽、蛋白质和修饰的蛋白质如糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白等。
“线性肽”指非环状的肽，通常具有带游离羧基末端的羧基端氨基酸和带游离氨基末端的氨基端氨基酸。
与其相比，“环肽”指“环化的”肽。术语“环状”指组成的原子构成一个环。当指肽时，术语“环状”指将肽构成环或“环化的”形式。所以如当某肽的游离氨基末端与其游离的羧基末端共价结合时(即头接尾形式，从而在肽中不存在游离的羧基或氨基末端)，该线性肽被“环化”。
如本文所用，“剪接中间体”指在形成释放的环肽产物之前，在内含肽介导的上述环化反应中产生的多肽。剪接中间体包括“活性内含肽中间体”(即那些与上图中标记有“A”的多肽化学结构类似的)、“硫酯中间体”(即那些与上图中标记有“B”的多肽化学结构类似的)和“套索中间体”(即那些与上图中标记有“C”的多肽化学结构类似的)。
术语“靶肽”指待环化的或展示在剪接中间体中的肽。例如，前体蛋白质中断裂内含肽羧基端部分和氨基端部分之间插入的肽可以是靶肽，如果在剪接前体蛋白质后肽环化，或在加工(如折叠)前体蛋白质后肽成为剪接中间体的一部分。
如本文所用术语“内含肽”指天然形成的或人工构建的包埋在前体蛋白质中的多肽序列，在蛋白质翻译后加工工程中该蛋白质能催化剪接反应。http：∥www.neb.com/ineins.html公开了一张已知内含肽的表格。“断裂的内含肽”指具有两个或多个互相不融合的分开成分的内含肽。
如本文所用术语“插入”指置于二者之间。所以在具有插入在第二个和第三个肽之间的第一个肽的多肽中，构成第一个肽的氨基酸链实际位于构成第二个肽的氨基酸链和构成第三个肽的氨基酸链之间。
具有“异源氨基酸序列”的多个肽指由至少两种但通常是大量不同的肽(具有完全不同的氨基酸序列)构成的多个肽。
如本文所用术语“宿主系统”指在其中核酸分子能转录、复制和翻译的任何介质或载体，和/或在其中多肽能被断裂或进行其他翻译后加工的任何介质或载体。
如本文所用术语“自发地”指未添加外源物质就发生的反应。例如，除前体多肽或编码前体多肽的核酸分子外，未在宿主系统中添加其他任何物质，在宿主系统中该前体多肽自发地发生剪接，产生环肽。与此相反，如果宿主系统需要添加外源物质来产生环肽，则该前体多肽在宿主系统的剪接就不是自发的。
如本文所用术语“剪接”指切割多肽的中心部分形成两个或多个较小的多肽分子。在一些情况中，剪接还包括将两个或多个较小多肽融合起来形成新多肽的步骤。
如本文所用术语“衍生的”指直接或间接得到的形式、分离形式、纯化形式、下降(descended)的形式或其他上升(arising)形式。
如本文所用术语“表达载体”指有利于核酸分子在宿主系统中转录和/或翻译的运载体。当将外源物质加到含有表达载体的宿主系统中引起载体表达时(如使载体中的核酸分子转录成mRNA)，该表达载体是“可诱导性的”。
术语核酸的“表达”指核酸被转录和/或翻译成多肽和/或被复制。
如本文所用术语“调节序列”指调节核酸分子表达(如转录)的核苷酸序列。例如，启动子和增强子就是调节序列。
术语“融合”指共价结合。例如，当两个肽彼此共价结合时(如通过肽键)，第一个肽就与第二个肽融合了。
如本文所用术语“分离的”或“基本纯的”物质是与其天然伴随成分相分开的物质。通常，当至少50重量％(如60％、70％、80％、90％、95％和99％)无其他蛋白质和天然形成的有机分子(天然相伴的)时，多肽是基本纯的。
“祖代DNA”特指从其产生突变体或以其为基础的特定脱氧核糖核酸。
术语“靶分子”指用于测定其他分子结合或功能性特性的分子。
如本文所用术语“结合”指一种分子识别和附着于样品中的另一种分子，但基本不识别或结合于样品中的其他分子。如果一种分子对另一种分子的结合亲和力大于105到106升/mol时，则该种分子“特异性结合于”另一种分子。
“细胞相关的加工”指细胞中或细胞附近发生的加工。
“膜相关的加工”指在细胞的质膜上发生的细胞相关的加工。
“核加工”指在细胞核中发生的细胞相关的加工。
与细胞相关加工相反，“细胞外反应”指不在细胞内发生的反应。
术语“杂交系统”指双杂交系统、反双杂交系统、单杂交系统、断裂杂交系统、小分子杂交系统和所有用于鉴定肽和其他分子(如蛋白质和核酸分子)之间相互反应的系统。杂交系统的综述可见Vidal和Legrain，Nucleic Acids Res.27：919，1999。
除以上定义外，本文所用的所有技术术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下叙述了合适的方法和材料，虽然其他与本文所述相似的方法和材料也可用于本发明的实际应用和测试中。本文所引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都全部纳入作为参考。若有冲突，则以本发明的说明书(包括定义)为准。另外，以下所述的具体实施例仅起说明作用无任何限制作用。
本发明的其他特征和优点在以下的详细描述和权利要求中显而易见。
附图简述
本发明将在附带的权利要求书中具体指明。本发明的上述及其他优点可参考以下描述并结合附图更好地了解：
图1是说明本发明通用环化反应的流程图。
图2是说明本发明的肽环化方法中发生的一系列化学反应步骤的流程图。
图3是(a)质粒pARCP、(b)质粒pARCP-DHFR、(c)质粒pARCPAH-DHFR、(d)含有克隆到Mfel位置而产生的半胱氨酸(TGY)或丝氨酸(TCN)密码子的修饰载体(N表示任何核碱基，S表示C或G，Y代表嘧啶)、(e)质粒pARCP-p和(f)质粒pARCBD-p的基因图。
图4是在10-20％梯度Tris/谷氨酸预制胶(Bioard)上分析二氢叶酸还原酶(DHFR)环化的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5是显示65℃预温育后野生型DHFR活性(三角形)和环状DHFR活性(菱形)的图。
图6是预计内切蛋白酶Lys-c消化线性和环状DHFR的模式图。
图7是体内试验中用于测定假星素(pseudostellarin)F对酪氨酸酶抑制的FeCuY平板图。
图8是本发明纯化环肽的说明性示意图。
图9是本发明另一种纯化环肽方法的说明性示意图。
图10是一种用于鉴定/纯化特异性结合断裂中间体的分子的基于固相载体/亲和层析方法的说明性示意图。
图11是另一种用于鉴定/纯化特异性结合断裂中间体的分子的基于固相载体/亲和层析方法的说明性示意图。
图12是另一种用于鉴定/纯化特异性结合断裂中间体的分子的基于固相载体/亲和层析方法的说明性示意图。
图13是另一种用于鉴定/纯化特异性结合断裂中间体的分子的基于固相载体/亲和层析方法的说明性示意图。
图14是本发明适体支架(aptamer scaffold)使用的说明性示意图。
图15是制备本发明适体支架的两种反应的说明性示意图。
图16是本发明筛选方法的说明性示意图。
图17是本发明另一种筛选方法的说明性示意图。
图18是本发明另一种筛选方法的说明性示意图。
图19是本发明另一种筛选方法的说明性示意图。
发明详述
已研究了断裂内含肽的反剪接能力，来开发产生环肽和展示环状构型肽的剪接中间体的通用方法。在该方法中，在前体多肽的断裂内含肽的两个部分之间插入靶肽。在合适的宿主系统中，断裂内含肽的两个部分物理上相结合现成活性内含肽，其构型迫使靶肽呈环状构型。在该构型中，在内含肽的一个部分(如IN)和靶肽之间结合处的氨基酸酯异构体得以稳定，从而内含肽的另一部分(如IC)中的杂原子可与该酯反应现成环状酯中间体。然后活性内含肽催化氨基琥珀酰亚胺的形成，从而释放环状靶肽(即内酯形式)，其自发地重排形成热动力学性能优良的主链环肽产物(即内酰胺形式)。通过在释放环肽前的给定(反应)点停止反应，能产生含有环状构型靶肽的剪接中间体。为了产生这样的肽，可构建一种核酸分子，其编码的多肽在两个内含肽部分之间插入了靶肽序列。将这些构建物引入表达载体，提供了在宿主系统中产生该多肽的方法，其中可将该多肽剪接入环肽或剪接中间体。用这种方法可制备多种不同的环肽或剪接中间体，以产生可用于筛选特定性状的环化的或部分环化的肽的文库。
如图1所示，本发明一实施例的概述包括从核酸分子制备环肽的方法。在该方法中，制备核酸分子使核苷酸序列编码的肽具有以下相连序列：断裂内含肽的第一部分(如IC)、待环化的肽(即靶肽)、和断裂内含肽的第二部分(如IN)。可将该核酸分子整合入表达载体，以便于它在宿主系统中的表达，宿主系统可将该核酸转录和翻译成前体多肽，其在两个断裂内含肽部分之间插有待环化的肽。通过上述步骤，断裂内含肽的两部分结合起来，替代构型中的前体肽引发化学反应，最终得到环肽(如图2所示)。
核酸分子
本发明的核酸分子包括那些所编码的多肽具有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽第二部分和位于断裂内含肽第一部分和第二部分之间的靶肽。在本发明的一个实施例中，该核酸分子在宿主系统中的表达产生了多肽，该多肽在宿主系统中能自发地断裂产生一环形靶肽。在另一实施例中该核酸分子在宿主系统中的表达产生多肽，该多肽是环化形式靶肽的剪接中间体。可按本文所述的方法制备本发明的核酸，也可用本文所提供的指导结合本领域通常所知道的制备和操作核酸分子的方法进行制备(见如Ausubel等人编辑，分子生物学最新规程，New York；John Wiley & Sons，1997；Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(第二版)，ColdSpring Harbor Press，1989)。例如，可分别制备编码断裂内含肽第一部分的多核苷酸、编码断裂内含肽第二部分的多核苷酸和编码靶肽的多核苷酸，来制备本发明的核酸分子。将这三种多核苷酸连接起来形成核酸分子，其编码的多肽含有整合在断裂内含肽第一部分和第二部分之间靶肽。
编码内含肽的核酸
可用已知的内含肽衍生出编码本发明核酸分子的断裂内含肽第一部分和第二部分的核苷酸序列。New England Biolabs在http∥www.neb.com/inteins/int_reg.html上公开了这些内含肽的相当完整的描述列表。只要适合本发明可使用任何已知的那些内含肽。
可用编码天然形成的或人工产生的断裂内含肽的核苷酸序列来产生本发明核酸分子的内含肽部分。天然形成的断裂内含肽在自然中以两种分开的成分表达，这两种成分彼此结合形成一种活性断裂剂。然后编码这些天然形成成分的核酸分子就可用于本发明。一种可使用的天然形成的断裂内含肽例子是Ssp DnaE(Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9226，1998)。
可用已知的方法将天然状态下未被断裂的内含肽(即那些以氨基酸的连续链存在的内含肽)进行人工断裂。例如，可制备编码这些内含肽不同部分的两种或多种核酸分子，它们的表达可产生两种或多种人工断裂的内含肽成分。见如Evans等人J.Biol.Chem.274：18359，1999；Mells等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：3543，1998。编码这种非天然形成的内含肽成分(部分)的核酸可用于本发明。优选的是那些编码与相同的前体多肽能有效反应的非天然形成的断裂内含肽部分的核酸分子。可衍生得到这种核酸分子的非天然形成的断裂内含肽的例子包括Psp Pol-1(Southworth，M.W.等人，The EMBO J.17：918，1998)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)RecA内含肽(Lew，B.M.，等人，J.Biol.Chem.273：15887，1998；Shingledecker，K.，等人，Gene 207：187，1998；Mills，K.V.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：3543，1998)、Ssp DnaB/Mxe GyrA(Evans，T.C.等人，J.Biol.Chem.274：18359，1999)和Pfu(Otomo等人，Biochemistry 38：16040，1999；Yamazaki等人，J.Am.Chem.Soc.120：5591，1998)。
编码靶肽或展示在剪接中间体中的肽的核酸
各种制备编码肽(已知或随机序列)的核酸的方法是本领域已知的。例如，用可购得的装置和试剂，通过固相合成可以化学制备含有预定或随机序列的多核苷酸。也可用聚合酶链式反应来制备已知或随机序列的多核苷酸。见如Ausubel等人，同上。另一例子是可用限制性内切酶来酶促消化大核酸分子或甚至整个染色体DNA成为许多较小的多核苷酸片段，来用于制备本发明的核酸分子。
优选地制备编码待环化肽序列的多核苷酸，使该多核苷酸的一端编码天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸残基以便于环化反应。出于相同的原因，优选地制备编码产生剪接中间体的肽序列的多核苷酸，使其末端编码除天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、或苏氨酸残基以外的氨基酸，以便于防止环化反应。
编码内含肽部分和靶肽或展示在剪接中间体的肽的多核苷酸的连接
一旦生成，可用常规的方法将编码内含肽部分的核酸分子与编码靶肽(或剪接中间体中的肽)的核酸分子连接起来，形成较大的编码含有第一内含肽部分一靶肽一第二内含肽部分顺序的核酸分子。见如Ausubel等人，同上。
编码多个断裂内含肽和多个肽的核酸分子
用与上述类似的技术，本领域技术人员还可制备编码一套以上的插有肽的断裂内含肽两部分的核酸构建物。例如，本发明包括编码前体多肽分子(由N多肽(N＝大于或等于1的整数)组成)的核酸分子，该前肽分子在2N内含肽部分之间插入了N靶肽，即任何靶肽i(i＝大于1的整数，表示在该前体多肽中靶肽的位置)被插入在内含肽2i-1和2i之间的(如靶肽1位于内含肽部分1和2之间，靶肽2位于内含肽部分3和4之间)。只要内含肽部分2i-1和2i不互补(即能够物理上相互反应催化剪接活动)，靶肽i不能环化。然而如果内含肽部分2i与内含肽部分2i+1互补，且内含肽2N与内含肽部分1互补，则完整装配的N多肽可进行N-1反式剪接(在2个多肽之间)和1顺式剪接(将两个端点连接在一起)，从而产生产物，此产物中1-N靶肽共价附着于环状肽/蛋白质中的另一个(如，内含肽部分2和3反式剪接靶肽1和2；内含肽部分4和5反式剪接靶肽2和3；内含肽部分2N-2和2N-1反式剪接靶肽N-1和N；和内含肽部分N和1顺式剪接以闭合含有N靶序列的环状产物)。反式/顺式剪接的顺序是不相关的。违反进行顺式剪接将得到最慢的剪接品种(无论其是否是互补性内含肽部分2N和1、2和3、或80和81)。
所以，可制备如下核酸构建物，其表达两种或多种多肽，各由插入在两部分断裂内含肽之间的靶肽构成，其中内含肽组分不互补(即不是从相同的内含肽衍生的或能合作催化环化反应)。在这种构建物中，没有一种多肽能环化，除非存在第二种含有适当互补内含肽组分的多肽时其被表达。本发明的这种核酸构建物每个仅能编码一种多肽或每个构建物能编码一种以上的多肽(如双功能质粒)。
表达载体
通过将编码靶肽的多核苷酸插入适合的表达载体(能使多核苷酸在宿主系统中表达)来制备本发明的表达载体。适合的载体包括质粒、噬菌体和病毒载体。这些大部分都是本领域已知的，且是可购得的或可以从科学社团获得。本领域技术人员可选择合适的载体用于具体应用，根据例如所选的宿主系统类型(如体外系统、原核细胞如细菌，和真核细胞如酵母或哺乳动物细胞)和所选的表达条件。
本发明的表达载体可包含一段编码靶多肽的核苷酸和一段起调控结构域作用的核苷酸(其调节或控制载体中核苷酸的表达(如转录))。例如，该调控结构域可以是启动子或增强子。
本发明的表达载体可包括的核苷酸序列编码一种肽，该肽有利于具有某特性(如亲和标记物，如壳多糖结合结构域或生物素标记物；颜色或发光标记物；放射性标记物等)的环化形式靶肽或剪接中间体的筛选，或有利于从宿主系统纯化环化形式的靶肽或剪接中间体(如亲和标记物，如壳多糖结合结构域或生物素标记物；颜色或发光标记物；放射性标记物等)。
在优选实施例中，在编码断裂内含肽诸部分的核酸序列之间和之中的限制性位点产生本发明的表达载体，从而能克隆各种各样环化靶肽或剪接中间体。在一些实施例中，本发明的表达载体可以是可诱导性表达载体，如阿拉伯糖可诱导载体。可用这些载体控制宿主系统中环化前体或剪接中间体的表达。可根据载体与已知细菌表达菌株和杂交系统的相容性来选择用于本发明的其他载体。如见Zhang等人，Curr.Biol.9：417，1999；Pellitier等人，Nat.Biotechnol.17：683，1999；Karimova等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA95：5752，1998；Dmitrova等人，Mol.Gen.Genet，257：205，1998；Xu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：151，1999；Rossi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8405，1997。
多肽
本发明的多肽包括经本发明核酸表达可产生的多肽。例如，本发明包括一基本纯的前体多肽，其在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间插有一靶肽(或在剪接中间体所展示的肽)。在一些前体多肽实施例中，可将靶肽直接融合于内含肽的第一和第二部分。该前体多肽在宿主系统中能自发地剪接产生环化形式的靶肽(或展示肽的剪接中间体)。
环化形式的靶肽和展示肽的剪接中间体也属于本发明的范围中。宜通过剪接本发明的前体多肽产生它们。环化形式的靶肽可以是任何可用本发明方法环化的氨基酸序列。剪接中间体可以是活性内含肽中间体、硫酯中间体或套索中间体，且能够展示具有任何相容氨基酸序列的肽。
宿主系统
本发明所用的宿主系统包括任何支持本发明核酸分子转录、翻译和/或复制的系统；或支持本发明多肽或蛋白质翻译后修饰(如剪接)的系统。许多这种宿主系统是已知的。如在本发明中，尤其当需要避免活宿主系统造成的干扰或人工产物时，该宿主系统可采取体外转录/翻译系统形式。这些系统可以是按已公开的方法在实验室制造的或是可购得的。例如，可从Novagen(Madison，WI)购得的STP2-T7(cat.No.69950-3)和STP-SP6(cat.No.69997-3)。Promega(Madison，WI)也出售这种系统(如Cat.Nos.L1170、L2080、L4600、L4610、L4130、L4140、L1130、L1020和L1030)，以及Stratagene(LaJolla，CA)所出售的商标为IN VITRO EXPRESS(Cat.No.200360)的系统。也可从活生物中衍生得到用于本发明的无生命的宿主系统。例如，在一些应用中可使用细胞裂解物如网织红细胞裂解物。
还可从活生物取得宿主系统。活生物对宿主系统而言是优选的，因为它们通常能以大量的拷贝数再生，从而提供连续、易扩展和易操作来源的所选择的核酸分子。可用于本发明宿主系统的活生物包括原核生物如细菌(如大肠杆菌)和真核生物如酵母和哺乳动物(如人、鼠、牛、羊、猪等)细胞。古细菌、植物细胞和任何其他适用于本发明方法的生物都可作为宿主系统。
最适合某具体应用的具体宿主系统取决于许多不同因素而定。本领域技术人员可根据不同宿主系统的已知用途能选出适合某具体应用的宿主系统。例如，若需要大规模生产环肽，细菌宿主或昆虫宿主是合适的。另一个例子是，若需要分析人细胞组分之间的相互反应，则使用人细胞作为宿主系统比用细菌系统可能更合适。
制造多肽、环肽或剪接中间体的方法
可用常规产生已知氨基酸序列的多肽的方法来制备本发明的多肽。例如，用可购得的装置和试剂，通过固相合成来制备本发明的多肽。也可用已知的体外产生环肽的方法来制备环肽。但在许多情况中，本发明的环肽宜通过在宿主系统中表达编码它们的核酸分子来产生。例如，可将本发明的核酸分子整合入表达载体，然后引入宿主系统。再将该宿主系统置于可引起该载体表达的条件下，导致形成前体肽，随后形成环化形式的靶肽或展示该肽的剪接中间体。
一优选的制备环肽或剪接中间体的方法包括如下步骤：(a)提供分离的核酸分子，其编码的多肽含有插入在断裂内含肽第一和第二部分之间的靶肽；(b)提供宿主系统；(c)将分离的核酸分子引入宿主系统；和(d)表达该分离的核酸分子。该核酸分子在宿主系统中的表达产生了以环化形式靶肽剪接中间体形式的肽分子，或能自发剪接产生环化形式靶肽的多肽。
在该方法的优选实例中，在体内(如活宿主系统中)且无任何加入的外源性试剂如催化肽环化的试剂(如蛋白酶或硫醇)时，产生该多肽、环肽或剪接中间体。
可用对蛋白质定性标准的技术来监测多肽、环肽或剪接中间体的产生。见如Sambrook等人，同上。所用方法实例包括常规的层析、HPLC、FPLC等；电泳如十二烷基苯磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)、2维凝胶电泳、电磁辐射光谱、质谱、酶促消化产物分析、热稳定性试验等。
本发明多肽、环肽或剪接中间体的纯化
常规纯化蛋白质的方法适用于本发明多肽、环肽和剪接中间体的纯化。本发明还包括一种从混合物纯化环肽的优选方法。在该方法中，将亲和标记物附着于环肽以辅助其纯化。该方法包括如下步骤：(a)提供含有偶联于亲和标记物的环肽的混合物；(b)将偶联的环肽与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合亲和标记物，从而使载体能特异性结合该环肽；(c)洗涤载体除去载体上非特异性结合物质；和(d)从载体上洗脱下环肽。
在该方法中，亲和标记物可以是任何能结合固相载体上某配体的分子。例如，当配体是壳多糖(见下述实施例部分)时，亲和标记物可以是壳多糖结合结构域，当配体是链霉亲和素时，亲和标记物可以是生物素标记物。其他许多亲和标记物-配体对是已知的且可用于本发明。由于亲和标记物特异性结合固相载体上的配体，环肽(附带亲和标记物)特异性结合于该载体。然后可用缓冲液(如高盐、酸或碱缓冲液)洗涤载体除去混合物中非特异性结合于载体的物质。然后可用含有能使标记物与配体分开的物质(如竞争性抑制剂，如过量非偶联亲和标记物、或变性剂)的缓冲液或从亲和标记物上切割环肽的酶或化学试剂，从固相载体上洗脱下亲和标记的环肽。
以模拟的形式，可纯化剪接中间体而不是环肽。也可用剪接中间体从混合物中纯化环肽。例如，从混合物纯化环肽的方法包括如下步骤：(a)提供含有与亲和标记物偶联的剪接中间体的混合物；(b)将偶联的剪接中间体与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合此亲和标记物，从而使载体能特异性结合该剪接中间体；(c)洗涤载体除去非特异性结合的物质；(d)在载体中加入试剂，从剪接中间体产生环肽；和(e)从载体上洗脱下环肽。在上述方法的变化中，可颠倒步骤(d)和(e)，从而步骤(d)是从载体上洗脱剪接中间体，步骤(e)是在洗脱的剪接中间体中加入试剂，从剪接中间体产生环肽。从剪接中间体产生环肽而加入的试剂包括硫醇、蛋白酶和其他能催化剪接中间体环化的物质。
如一实例所述，通过将IC融合于亲和标记物并除去必须天冬酰胺残基(如图3所示)，可将环酯固定在亲和柱上。如此得到的环肽柱可由于亲和纯化环肽本身。许多蛋白水解方法可用于从亲和标记物和IC上释放出环酯(取决于环肽产物的序列)。
如图8所示，显示了一种纯化环肽的方法。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)从而用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IN下游引入亲和标记物(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(步骤C)。然后使此分子通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物的配体，从而留住并纯化IN/IC非共价复合物(品种3)。然后中断IN/IC反应产生套索中间体(品种4)，可从亲和柱上洗脱下该中间体。在氨基酸Y处进行了蛋白水解或化学切割(步骤F)释放出内酯中间体(品种5)。酰基-到-N重排(步骤G)产生热动力学性能优良的酰胺环状产物(品种6)。
图9显示了对上述纯化环肽方法的一种变化。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)从而用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IC上游引入亲和标记物(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(步骤C)。然后使此分子通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物/IC中间体(品种3)的配体。从配体分离出亲和标记物(步骤E)(如用竞争性抑制标记物-配体反应的分子，用高盐缓冲液或变性剂，或用化学试剂或蛋白酶来切割该标记物)，来回收套索中间体(品种4)。在氨基酸Y处进行蛋白水解或化学切割(步骤F)释放出内酯中间体(品种5)。酰基-到-N重排(步骤G)产生热动力学性能优良的酰胺环状产物(品种6)。
制备环肽和剪接中间体文库的方法
本领域已知多种制造线性肽文库的方法。可用这些改进的已知方法以及本文所述的产生环肽和剪接中间体的方法，来产生环肽和剪接中间体的文库。通常，制备环肽和/或剪接中间体的方法包括如下步骤：(a)提供多种核酸分子，其编码多种具有异源氨基酸序列的靶肽；(b)将这些核酸分子分别渗入表达载体，形成多个表达载体，在形成的各个表达载体中这些核酸分子的每一个被插入到编码断裂内含肽第一部分的核酸分子和一个编码断裂内含肽第二部分的核酸分子之间，这样在宿主系统中这些表达载体的表达导致产生多种环化形式靶肽的剪接中间体或在宿主系统中能自发性剪接产生环化形式靶肽的多肽；和(c)在宿主系统中表达这些表达载体。
更具体的例子，如Childs等人，在“转录和翻译中序列的特异性”(AlanR.Liss，Inc.，1985)所述的方法和Schuacher等人Science 271：1854，1996中所述的双链连接方法以用于本发明。已知以PCR为基础的方法也可用于产生编码带有随机序列肽的多核苷酸，这些肽在本发明中可以环化或作为剪接中间体表达。见如Caldwell和Joyce，PCR Methods Appl.2：22，1992；Ostermeier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3562，1999；Nested Deletion Protocol and Reagents from Promega；和Stemmer，W.P.Nature 370：389，1994(DNA移动)。可将多个编码异源序列肽的多核苷酸作为靶肽(或展示在剪接中间体中的肽)整合入核酸分子和上述本发明的表达载体中的，然后在宿主系统中表达以产生环肽或剪接中间体文库。
筛选具有预定特性的环肽的方法
有许多种技术可用于筛选具有特定性质的小分子。见如Femades，P.，CurrentOpin.Chem.Biol.2：597，1998；science 286：1759，1999；美国专利No.5,585,277和5,989,814。更具体说，还已知确定在组合肽文库中哪个肽能特异性结合于靶蛋白质的方法。如美国专利No.5,834,318。这些方法许多都适用于筛选用本发明方法所制备的具有特定性质的环肽和/或剪接中间体。
筛选具有预定特性的肽分子的通用方法包括如下步骤：(a)提供编码多肽的核酸分子，该多肽包含插入在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间的靶肽，从而在宿主系统中该核酸分子的表达将产生此肽分子，或是此靶肽的环化形式(在宿主系统中该多肽自发性剪接的结果)或是此靶肽环化形式的剪接中间体；(b)提供宿主系统；(c)将分离的核酸分子引入宿主系统；(d)将宿主系统置于引起肽分子产生的条件下；(e)测试此肽分子的预定特性。
可如下进行步骤(a)，例如用分子生物技术(见Ausubel等人和Sambrook等人，同上)来产生编码靶肽、内含肽第一部分和内含肽第二部分的多核苷酸。然后将得到的三种多核苷酸融合(如连接)在一起形成核酸分子。提供的宿主系统可以是上述的可表达该核酸分子的那些宿主系统(如细菌、酵母、哺乳动物细胞等)。可用已知的方法将核酸引入宿主系统，这取决于所用的核酸分子和宿主系统。例如，可用以下方法将核酸分子引入细胞：电穿孔法、脂转染、用氯化钙介导的转化、用基因“枪”、用噬菌体载体(当宿主系统是细菌时)、用质粒构建物、用病毒载体等。
将宿主系统置于产生此肽分子的条件下，按所用的核酸分子的具体形式和宿主系统调节此条件。对人细胞宿主系统而言，这可能意味着将细胞置于合适的富营养培养基中，在37℃、湿润的、5-10％CO2培养箱中培养细胞。对可诱导性表达载体而言，这可能意味着将能诱导载体中该核酸分子表达的物质加到宿主系统中。例如，采用阿拉伯糖可诱导表达载体时，该步骤可包括在宿主系统中加入阿拉伯糖。
可用许多不同的方法进行肽分子的预定特性的测试，如测定肽分子与已知配体的结合和分析肽分子调节(即增加或降低生化反应速度)生化反应的能力。可用于测试肽的预定特性的各种方法的描述见Femades，P.，同上。
可用于筛选具有特定性质的环肽或剪接中间体的具体例子包括：用固相载体和亲和层析降低特异性结合环肽或剪接中间体的分子；用噬菌体展示方法；和用适体肽融合构建物和/或杂交系统，来鉴定内调节特异性生化反应或细胞内反应的环肽或剪接中间体。
用于鉴定与环肽和/或剪接中间体反应的分子的固相载体/亲和层析
可将环肽或剪接中间体固定在固相载体上以便于鉴定和/或纯化能特异性结合某给定环肽或剪接中间体的分子。用于纯化的肽亲和柱的综述见G.A.和D.J.Hammond，Biopharm.，5：24，1992。以下是本发明如何进行的实例。
参考图10显示了鉴定/纯化能特异性结合某给定剪接中间体的分子的方法。在该方法中，诱变活性内含肽(品种1)，用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IC上游引入亲和标记物(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(步骤C)。然后使此分子通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物/IC中间体(品种3)的配体。然后将含有靶分子(即能结合剪接中间体的候选物)的溶液通过此柱(步骤E)。特异性结合剪接中间体的靶分子被选择性地保留在柱中。从柱中取出这些靶分子，并作生化分析(如测序)。
参考图11显示了另一种鉴定/纯化能特异性结合某给定剪接中间体的分子的方法。在该方法中，诱变活性内含肽(品种1)用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IN下游引入亲和标记物(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(步骤C)。然后使此分子通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物的配体，从而得以回收和纯化IN/IC非共价复合物(品种3)。切断亲和标记物(步骤E)回收套索中间体(品种4)。然后将含有靶分子(即能结合剪接中间体的候选物)的溶液通过此柱(步骤E)。特异性结合剪接中间体的靶分子被选择性地保留在柱中。
参考图12显示了另一种鉴定/纯化能特异性结合某给定剪接中间体的分子的方法。在该方法中，诱变活性内含肽(品种1)用非催化性氨基酸(Z)替代IN亲核体(步骤A)，并在IN下游引入亲和标记物(步骤B)产生IC-肽-IN-标记物融合蛋白(品种2)。进行内含肽介导的催化反应产生融合蛋白(步骤C)。然后使此蛋白通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物的配体，从而得以保留并纯化该蛋白质复合物(品种3)。然后将含有靶分子(即能结合剪接中间体的候选物)的溶液通过此柱(步骤E)。能特异性结合剪接中间体的靶分子被选择性地保留在柱中。
参考图13显示了另一种鉴定/纯化特异性能结合于某给定剪接中间体的分子的方法。在该方法中，诱变活性内含肽(品种1)用非催化性氨基酸(Z)替代IN亲核体(步骤A)，并在IC上游引入亲和标记物(步骤B)产生标记物-IC-肽-IN融合蛋白(品种2)。进行内含肽介导的催化反应产生融合蛋白(步骤C)。然后使此蛋白通过带有固相载体的亲和柱(步骤D)，该固相载体上附着有能特异性结合亲和标记物的配体，从而得以保留并纯化该蛋白质复合物(品种3)。然后将含有靶分子(即能结合剪接中间体的候选物)的溶液通过此柱(步骤E)。能特异性结合剪接中间体的靶分子被选择性地保留在柱中。
噬菌体展示
本发明还使用了噬菌体展示来筛选分子。可用噬菌体展示本发明环肽和/或剪接中间体来改进常规的用噬菌体展示的方法。例如，当图1中Z是噬菌体外被蛋白和图2中为XH＝H时，剪接反应将不超过第一种酯中间体，从而产生呈环的靶肽。在该方式中，可制备包含展示环状靶肽的噬菌体颗粒的文库，并用于淘选(pan)能结合所展示环肽的分子。例如，可将靶分子固定在固相载体上。然后将展示不同环肽的噬菌体文库与载体混合。那些展示能结合靶分子的环肽的噬菌体将被选择性地保留在载体中。从载体洗脱后(如通过用高浓度的强亲核体切割噬菌体展示环肽的酯键)，可用标准分子生物方法测定环肽的氨基酸序列。
适体(Aptamers)
肽适体是含有支架所展示的各种序列的构象受约束的靶肽区域的多肽。由于环肽或剪接中间体可作为适体起作用，可改进已知的分析适体的方法以辅助环肽或剪接中间体的具体特性的鉴定。见如Geyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8567，1999；Caponigro等人，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 95：7508，1998；Mikhail等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14266，1998；Norman等人，Science 285：591，1999。
例如参考图14，环状蛋白质可用作适体支架用于一技术中，使肽文库的成员作为一种受约束的环展示在该环状蛋白质支架的N端和C端之间。如图14所示，适体文库可表达成IC-支架-IN融合蛋白(品种1)。体内内含肽介导的环化反应产生IN、IC和环形支架蛋白(品种2)。在N-端和C-端之间连接区域中展示该适体文库。在图14中N代表任何氨基酸，下标n和m是等于或大于0的整数，X表示丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸。
本发明还包括其他使用适体的例子。参考图15描述了两种该方法。在反应I中，诱变活性内含肽中间体用非催化性氨基酸(Z)替代IN的亲核氨基酸(步骤A)。这种加工使剪接反应灭活，产生品种2。由于IC和IN之间的强烈反应，该方法使肽文库的成员以受约束的环展示在两内含肽部分之间的连接区域中(靶)。在反应II中，诱变活性内含肽中间体用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)。内含肽介导的环化反应在体内进行(步骤B)，并停止在套索中间体状态，使得肽文库的成员以受约束的内酯被展示。
杂交系统
酵母双杂交系统是一种分析体内蛋白质-蛋白质相互反应的成熟研究方法。Fields，S.和O.Song，Nature(London)340：245，1989。该方法及其改进如单杂交系统、三杂交系统、反向双杂交系统、断裂杂交系统、替代性n-杂交系统、小分子杂交系统可用于分析环肽和/或剪接中间体的性状(通过采纳已知的方法)。见如Drees，B.L.，Current Opin.Chem.Biol.，3：64，1999；Vidal，M.，和P.Legrain，Nucleic AcidsResearch，27：919，1999；Current Protocols in Molecular Biology，编辑，Ausubel，F.M.，等人，Wiley，New York，1996；Huang，J.和S.L.Schreiber，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94：13396，1997；Yang，M.，等人Nucleic Acids Res.23：1152，1995；Colas，P.，等人，Nature(London)，380：548，1996；Xu，C.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94：12473，1997。
例如参考图16，本发明还包括鉴定能与剪接中间体反应的靶蛋白质的方法。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IN下游引入DNA结合结构域(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(品种3)(步骤C)。IN和IC形成一种强非共价复合物。然后将得到的套索中间体与附着于DNA结合结构域的靶蛋白共表达(步骤D)。套索中间体与靶蛋白质(品种4)的相互反应，将激活启动子区域(步骤E)，导致表达报道基因(*)。该方法可鉴定能与套索中间体结合的靶分子。可改进这种方法使已知的分子(代替未知的靶蛋白质)附着于DNA结合结构域，从而可鉴定展示能结合该已知分子的环肽的套索中间体。
参考图17，本发明还描述了另一种鉴定能与剪接中间体反应的靶蛋白质的方法。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)用非催化性氨基酸(Y)替代催化性天冬酰胺(步骤A)，并在IC上游引入DNA结合结构域(步骤B)产生品种2。进行内含肽介导的环化反应直至形成套索中间体(品种3)(步骤C)。然后该分子与附着于DNA结合结构域的靶蛋白共表达(步骤D)。套索中间体与靶蛋白质(品种4)的相互反应，激活启动子区域(步骤E)，导致表达报道基因(*)。该方法可鉴定能与套索中间体结合的靶分子。可改进这种方法使已知的分子(代替未知的靶蛋白质)附着于DNA结合结构域，从而可鉴定展示能结合该已知分子的环肽的套索中间体。
例如参考图18，本发明还包括另一种鉴定能与剪接中间体反应的靶蛋白质的方法。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)用非催化性氨基酸(Z)替代IN亲核体(步骤A)，并在IN下游引入DNA结合结构域(DBD)(步骤B)。这种加工将灭活剪接反应，产生IC-肽-IN-DBD融合蛋白(品种2)。然后将此分子与附着于DNA结合结构域的靶蛋白质共表达(步骤C)。此融合蛋白与靶蛋白质(品种3)的相互反应，将激活启动子区域(步骤D)，导致表达报道基因(*)。该方法可鉴定能与融合蛋白结合的靶分子。可改进这种方法使已知的分子(代替未知的靶蛋白质)附着于DNA结合结构域，从而可鉴定展示能结合该已知分子的环肽的套索中间体。
例如参考图19，本发明还包括另一种鉴定能与剪接中间体反应的靶蛋白质的方法。在该方法中，诱变活性内含肽中间体(品种1)用非催化性氨基酸(Z)替代IN亲核体(步骤A)，并在IC上游引入DNA结合结构域(步骤B)。这种加工将灭活剪接反应，产生DBD-IC-肽-IN融合蛋白(品种2)。然后将此分子与附着于DNA结合结构域的靶蛋白质共表达(步骤C)。步骤D中融合蛋白与靶蛋白质(品种3)的相互反应将激活启动子区域，导致表达报道基因(*)。该方法可鉴定能与融合蛋白结合的靶分子。可改进这种方法使已知的分子(代替未知的靶蛋白质)附着于DNA结合结构域，从而可鉴定展示能结合该已知分子的环肽的融合蛋白质。
体内靶向性环肽和剪接中间体
可特异性地将本发明的环肽和剪接中间体靶向特定的细胞区域或用改进的本领域已知的靶向方法进行胞外分泌。见如Wilkinson等人，J.MembraneBiol.155：189，1997；Komiya等人，The EMBO J.，17：3886，1998；Kouranov和Schnel，J.Biol.Chem.271：31009，1996；Bhagwat等人，J.Biol.Chem.，274，24014，1999；Adam，S.A.，Current Opin.Cell Biol.11：402-406，1999；Gorlich，D.，Current  Opin.CellBiol.9：412，1997；Pemberto等人，Current Opin.Cell Biol.10：292，1998；Sakaguchi，M.，Current Opin.Cell Biol.8：595，1997；Folsch等人，The EMBO J.17：6508，1998。例如，可将各种信号肽附着于本发明的环肽或剪接中间体，使它们位于预定的细胞区室，或翻译后被分泌到细胞外间隙。在该方法中，可将本发明的环肽或剪接中间体靶向细胞内区域如线粒体、溶酶体、内质网、叶绿体、高尔基体、周质、核、质膜。这种靶向方法也可用于产生肽文库的方法中，和筛选这种文库(当需要鉴定在预定细胞位置相互反应或表现出活性的分子时)的方法中。
实施例
制备环形二氢叶酸还原酶(DHFR)和环状假星素F
材料和方法
载体的构建
用Taq聚合酶以及引入5′-BglIl和NsiI和3′-PstI限制性位点的引物，从Ssp6803基因组DNA扩增了Ssp DnaE N-内含肽(IN)的基因。类似地用引入5′-Nocl和3′-NdeI和Sacl限制性位点的引物，扩增了Ssp DnaE IC基因。将分别克隆这些内含肽片断到pDIMC7中[与pDIMC6一致(见Ostermeier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3562，1999)，除将BamHI限制性内切位点转化入BglII以外]产生质粒pDMICP。用快速变化(Quick-Change)诱变法(Stratagene)引起IC基因(A35H)中的丙氨酸诱变成组氨酸，产生pDIMCPAH。以Ncol/Pstl消化切下内含肽片段，连接入pAR4[衍生自pAR3(Perez-Perez，J.和J.Gutierrez，Gene，158：141，1995；美国典型培养物保藏中心(ATCC)#87026)，在多个克隆位置上具有一个独特的Ncol]，产生pARCP(图3中的a)和pARCPAH。用引入5′-Ndel位点随后为(CAC)6(编码6个组氨酸残基)和3′-PstI位点的引物，从pET22b-DHFR(Miller，G.P.和S.J.benkovic，Biochemistry 37：6327，1998)扩增大肠杆菌DHFR，用NdeI/PstI消化，连接入NdeI/NsiI消化的pARCP或pARCPAH，产生pARCP-DHFR(图3中的b)和pARCPAH-DHFR(图3中的c)。用Ndel、Nsil和BspMl位点合成制备3-聚组氨酸序列，并连接到pARCPAH中产生质粒pARCP2-6H，其编码环-[CHMHHHHHHGA GAA]。分以下三步从pDIMCPAH产生了质粒pARCP-p：(1)快速变化诱变法将AflIl位点引入IN产生pDIMCPMA；(2)合成制备假星素F基因，并连接到Mfe1/AflIl消化的pDIMCPMA中产生pDIMCP-p；和(3)从pDIMCP-p切下此融合构建物作为NcoI/Pstl片段，并连接到用Ncol/Pstl消化的pAR4中产生pARCP-p(图3中的e)。为产生质粒pARCBD-p，用快速变化诱变法将Kpnl位点引入pARCP-p的IN基因的羧基端，产生pARCPpK。用引入5′Kpnl位点和3′HindIII位点的引物从质粒pCYBI(New England Biolabs，Inc.，Beverly，Massachusetts)扩增编码壳多糖结合结构域的基因。用KpnI和HindIII消化PCR产物和pARCPpK，连接起来产生pARCBD-p(图3中的f)。除非特别指出，所有酶都购自Promega或New England Biolabs。
DHFR纯化
37℃，在加有50μg/ml氯霉素的LB培养基中培养携带pARCP-DHFR或pARCPAH-DHFR的XL I-Blue细胞，直至培养物达到OD600 0.7。用L-(+)阿拉伯糖诱导培养物至最终浓度0.5％，在28℃生长24小时。离心(7,000×g，10分钟)收获细胞，在液氮中冷藏。裂解细胞，如(Meller和Benkovic，id)所述纯化含DHFR的蛋白质。用FPLC在Mono-Q柱(Amersham Pharmacia)，以50mM Tris-HCl配制的0-1M NaCl梯度洗脱30分钟将环化产物与其他含有DHFR的中间体分开。按照制造商说明，用抗His(Qiagen)和山羊抗鼠碱性磷酸酶偶联的抗体(Pierce)进行Western印迹。
内切蛋白酶Lys-C消化
37℃用0.5μg内切蛋白酶Lys-C(用0.1M NH4HCO3配制)处理野生型或环状DHFR(50μg)。在6和24小时取样，在SDS/16％ PAGE凝胶上观察，并进行矩阵辅助的激光解吸离子(MALDI)飞行时间质谱分析(Moore，W.T.，MethodsEnzymol.，289：520，1997)。
DHFR试验
25℃或65℃在MTEN缓冲液[50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(EMS)、25mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、25mM乙醇胺和100mM NaCl]中预培育100mM野生型或环化DHFR，来分析热稳定性。在各时间点采集等份样品，在100μM7，8-二氢叶酸存在下平衡至室温。如上所述(Meller和Benkovic，上述)用还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷(NADPH)进行活性试验。
环状-[Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu]的合成
在20ml二甲基甲酰胺配制的3.5mg(4μmol)NH2-Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu-CO2H和1.8mg(16μmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶液中加入3.0mg(16μmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。25℃搅拌反应物10小时。然后再加入3.0mg EDC，25℃再搅拌10小时。旋转蒸发除去溶剂，将残留物溶解在2ml水中，在Whatman Partisil 10 ODS-3 9.4-mM X 50-cm柱上用线性梯度0-50％(vol/vol)乙腈(用0.1％三氟乙酸/水配制)洗脱，进行反相HPLC 30分钟而纯化。冻干适当的组分得到2.8mg(80％)白色固体[m/z 785(MH+)]。该合成制备的物质的1H-NMR和UV-可见光谱与分离的天然产物所公布的光谱一致(Morital，H.，等人，Tetrahedron 50：9975，1994)。
假星素F纯化
如DHFR纯化所述，培养并收获携带pARCP-p的大肠杆菌菌株XL1-Blue、DH5a或BL21-DE3。用1-丁醇(3×100ml)提取培养液3次。合并提取物并蒸发，将固体残留物重悬浮在2ml 0.1M K2HPO4(pH8.0；裂解缓冲液)中。将细胞重悬在10ml裂解缓冲液中，超声处理，离心澄清(20,000×g，20分钟)。抽提(3×5ml n-丁醇)裂解液，将抽提物合并，蒸发，重悬浮在500μl裂解缓冲液中。从裂解液纯化重组产物，如上所述用HPLC纯化培养液抽提物。冻干裂解液和培养液抽提物中的适当组分得到油状残留物，m/z 785.47(MH+)，807.43(MNa+)和823.44(MK+)。此重组物质的1H-NMR和UV-可见光谱与分离的天然产物所公布的光谱一致(Morital等人，同上)。如上所述通过产生澄清的裂解液制备了融合于壳多糖结合结构域的蛋白质。将裂解液通过用裂解缓冲液平衡的壳多糖柱(New England Biolabs，Inc.)。等度洗脱该柱，合并含有剪接中间体的组分，并作MALDI质谱分析。
酪氨酸酶的克隆
用带有能引入5′Ndel和3′EcoRI限制性位点的pIJ702(ATCC No.35287)的Vent聚合酶，扩增产抗菌素链霉菌(Beman等人，Gene 37：101，1985)的酪氨酸酶基因(包括ORF 438)。用Ndel和EcoRl消化PCR产物，连接到经类似消化的pDIMN2(Ostermeier等人，同上)中，产生pDIMN-Y。在环境温度培养转化的连接混合物5天，在FeCuY板上[含有氨苄青霉素(200μg/ml)、FeCl3 6H2O(0.2mM)、CuSO4 5H2O(0.2mM)、L-酪氨酸(0.3mg/ml，Y)和异丙基-B-D-半乳糖苷(1mM)的LB琼脂平板]，通过色素形成鉴定了表达酪氨酸酶的菌落(Della-Cioppa，G.等人，Biotechnology 8：634，1990)。
结果
遗传构建物的设计
用标准分子生物方法(Sambrook，等人，同上)从Ssp基因组DNA扩增编码Ssp IC和IN的基因，并连续连接入pDIMC7。从pDIMC7切下产生的环化前体(CP)片段，克隆到pAR3的AraB启动子毗邻处产生pARCP载体系列(图3)。重组阿拉伯糖存在时这些载体激活环化前体的表达。在pARCP的Ndel和Nsil位点之间克隆大肠杆菌的DHFR基因，产生与各断裂内含肽基因的读框内融合(图3中的b和c)。还将用于扩增DHFR的PCR引物引入DHFR基因5’端编码六个组氨酸标记的系列中，从而得以免疫检测待环化的区域。装配了两个DHFR构建物以研究IC的倒数第二个残基在酸/碱催化天冬酰胺侧链环化中的作用。质粒pARCP-DHFR(图3中的b)编码野生型IC，其在临近终端天冬酰胺处有丙氨酸残基。在IC基因中的倒数第二位置，质粒pARCPAH-DHFR(图3中的c)整合了一个丙氨酸-向-组氨酸的突变。为产生假星素F(环化[SGGYLPPL])，通过沉默突变修饰该载体，在IN基因的5′端产生AflIl位点(图3中的d)。在野生型IC基因的3′端天然形成Mfel位点。将合成制备的编码假星素F的双链插入物连接入此修饰的载体，产生质粒pARCP-p(图3中的e)。将kpnl位点引入IN基因的3′端，从而将壳多糖结合结构域的基因融合于产生假星素的构建物(图3中的f)。
环状DHFR的产生和定性
如图4所示，用SDS-PAGE通过阿拉伯糖诱导pARCP-DHFR不难看出DHFR的环化(F：IC-DHFR-IN融合蛋白。T：IC-DHFR-IN融合硫酯中间体。R：IC-DHFR套索中间体。L：线性DHFR。0：环状DHFR。IN：N-内含肽。IC：C-内含肽。泳道1：未诱导的XL1-Blue/pARCP-DHFR。泳道2：阿拉伯糖诱导的CLI-Blue/pARCP-DHFR。泳道3：阿拉伯糖诱导的XLIBlue/pARCPAH-DHFR。泳道4：氨甲蝶呤琼脂糖后泳道3的粗制裂解液。泳道5：FPLC后泳道4的物质。泳道6：野生型DHFR)。
表观分子量相应于线性(L，23kDa)和环状(0，21kDa)DHFR产物，融合蛋白(F，37kDa)、IN(14kDa)和IC(4kDa)的条带清晰可见，如同推测性认定的硫酯(T，36kDa)和套索中间体(R，26kDa)条带(图4，泳道2)。IC倒数第二个残基从丙氨酸突变成组氨酸(图3中的c)改善了环状DHFR的产量(图4中的泳道3)。粗制裂解液的氨甲蝶呤-琼脂糖亲和层析证实大部分诱导的条带含有正确折叠的DHFR。虽然IN没有共价附着于DHFR，但可能由于与IC-DHFR套索中间体(R)形成的非共价复合物而保留在氨甲蝶呤柱上。用FPLC组分分离氨甲蝶呤-琼脂糖洗脱液，每升培养物可纯化得到5mg环状产物(图4泳道5)。用抗His抗体作的Western印迹(未显示)证明在FPLC纯化的蛋白质中存在聚组氨酸接头序列(图3中的d)。尽管11-氨基酸接头序列(图3中的b)暗示有附加的拓扑约束，在SDS/PAGE分析中该蛋白质比重组DHFR(图4泳道6)迁移得更快。另外，当FPLC-纯化的蛋白质与苯基异硫氰酸反应时没有检测到反应(Edman，P.，Acta Chem.Scand.，4：283，1950)，提示该氨基端是不能利用的。
25℃环状DHFR具有与野生型酶不同的稳态动力参数和底物、辅因子和氨甲蝶呤解离常数。65所℃预培养野生型和环状DHFR后进行的活性试验表明环化改善了此酶的热稳定性(图5)。用内切蛋白酶Lys-C消化明确地证明FPLC纯化的蛋白质是环状DHFR。野生型酶消化产生氨基端(4.4kDa)和羧基端(6.3kDa)片段，在环状蛋白质中这两种片段将连接起来形成10.7kDa消化产物(图6)。与野生型酶相比，FPLC纯化的物质耐蛋白酶解，质谱分析此消化混合物表明环状蛋白质的产物中有一个10.7kDa峰，而这在野生型酶中是没有的(没有显示数据)。
假星素F的产生和特性
通过抑制重组链霉菌抗生素酪氨酸酶不难探测到体内假星素F的产生(图7)。在图7显示的试验中，XLI-Blue细胞用pDIM-NY及pARCP2-6H(a和b)或pARCP-p(c和d)共转化。将该细胞接种于含氯霉素(50μg/ml)的FeCuY板(可以无(a和c)或有(b和d)L-(+)阿拉伯糖(0.5％)上。
假星素F在表达酪氨酸酶的细胞中的共表达明显减少了色素的形成(图7中的d)。pARCP2-6H的无关环状肽的表达不能抑制酪氨酸酶(图7中的a和b)，且抑制绝对需要阿拉伯糖诱导(与图7中的c和d相比)。在几种细菌菌株(BL21-DE3，DH5a和XLI-Blue)中对阿拉伯糖诱导的pARCP-p进行SDS/PAGE分析，可以观察到相应于融合蛋白(F)、硫酯中间体(T)和IN的条带。还可以看到浓的低分子量条带，但分辨率不足以分辨套索中间体(R)和IC(没有显示数据)。虽然假星素F太小不能用SDS/PAGE观察，但质谱分析表明它存在于粗制细胞裂解液和培养液中。每克湿重细胞的细胞裂解液可分离出约30μg重组环肽。还可通过1-丁醇抽提随后进行HPLC从培养液分离出假星素F，产量在2mg/升(XLI Blue)和20mg/升(BL21-DE3)之间变化，取决于表达菌株。该重组物质的NMR光谱与报道的天然产物(Morita等人，同上)的一致，细菌表达的环肽的保留时间与合成制备的标准物相同。重组物质不能与水合茚三酮反应(见，Gordon，A.J.，和R.A.Ford，“化学家的伙伴：实际数据、方法和参考文献手册”WileyInterscience，New York，1972)，表明是主链环肽(内酰胺)而不是内酯产物。HPLC或质谱分析都没有提供产生线性亲代肽的证据。
将壳多糖结合结构域与IN的羧基端融合，亲和纯化内含肽介导的连接反应的中间体，并用MALDI质谱对它们进行特性分析(表1)。
                                质谱(道尔顿)反应                           线性                        环状                        观察值组分
F，T  24,380.5  NA  24,380.4
IN  19,642.0  NA  19,642.3
R  4,756.5  4,738.5  4,756.2
IC  3,969.2  3,951.2  3,953.0
假星素F  802.4  784.4  784.4
表1：假星素F环化中间体的质谱特性
当CL1-Blue中阿拉伯糖诱导的pARCBD-p的粗制细胞裂解液通过壳多糖亲和柱时，保留了剪接反应的所有中间体包括IC。通过1-丁醇抽提从未保留的物质中回收了假星素F。融合蛋白(F)、硫酯中间体(T)和IN所观察到的分子量都与基因序列预计的值非常一致。IC的质量与所提出的产物释放机理预计的天冬酰胺环化形式一致。与转酯化反应所预计的分支的内酯产物相比，套索中间体(R)的分子量与线性IC-假星素F融合产物更一致。
其他实例
上述说明书包含许多具体内容，但它们并不构成对本发明的范围限制，而是本发明的优选实施例的一些例子。可能有许多其他变化。另外，本发明的范围不受所述实施例的限制，仅受附带的权利要求及其法律相等物的限制。

Claims (127)

1.一种非天然形成的核酸分子，其特征在于，该核酸分子编码的多肽包含断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分和插入在断裂内含肽第一部分和断裂内含肽第二部分之间的靶肽；
这种核酸分子在宿主系统中的表达产生选自以下形式的多肽：(a)在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体。
2.如权利要求1所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的多肽是在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
3.如权利要求1所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的多肽是环状形式靶肽的剪接中间体。
4.如权利要求1所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从天然形成的断裂内含肽衍生的。
5.如权利要求4所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从Ssp DnaE衍生的。
6.如权利要求1所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分中至少一个是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
7.如权利要求6所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的非天然形成的断裂内含肽是从以下内含肽衍生的：RecA、DnaB、Psp、Pol-l和Pfu内含肽。
8.如权利要求1所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
9.如权利要求3所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的剪接中间体是活性内含肽中间体。
10.如权利要求3所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的剪接中间体是硫酯中间体。
11.如权利要求3所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的剪接中间体是套索中间体。
12.一种非天然形成的核酸分子，编码的多肽包含断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的的第二部分、断裂内含肽的第三部分和断裂内含肽的的第四部分，其特征在于，第一靶肽插入在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间，第二靶肽插入在断裂内含肽的第三部分和第四部分之间。
13.如权利要求12所述的非天然形成的核酸分子，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分互补于断裂内含肽的第三部分但不互补于断裂内含肽的第二部分，断裂内含肽的第二部分互补于断裂内含肽的第四部分但不互补于断裂内含肽的第三部分。
14.一种表达载体，其特征在于，其包含的核酸分子编码的多肽含有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分和插入在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间的靶肽，这种核酸分子在宿主系统中的表达产生选自以下形式的多肽：(a)在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体。
15.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的多肽是在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
16.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的多肽是环状形式靶肽的剪接中间体。
17.如权利要求15所述的表达载体，其特征在于，所述的核酸分子还包含有利于该多肽在宿主系统中表达的调节序列。
18.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的核酸分子还包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码的肽有利于特定性质环状形式靶肽的筛选。
19.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的核酸分子还包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码的肽有利于从宿主系统纯化出环状形式的靶肽。
20.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的靶肽含有融合于断裂内含肽的第一部分的第一末端，和融合于断裂内含肽的第二部分的第二末端。
21.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从天然形成的断裂内含肽衍生的。
22.如权利要求21所述的表达载体，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从Ssp DnaE衍生的。
23.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分中至少一个是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
24.如权利要求23所述的表达载体，其特征在于，所述的非天然形成的断裂内含肽是从以下内含肽衍生的：RecA、DnaB、Psp、Pol-1和Pfu内含肽。
25.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
26.如权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述的剪接中间体是活性内含肽中间体。
27.如权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述的剪接中间体是硫酯中间体。
28.如权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述的剪接中间体是套索中间体。
29.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的宿主系统包括原核细胞。
30.如权利要求29所述的表达载体，其特征在于，所述的原核细胞是细菌。
31.如权利要求30所述的表达载体，其特征在于，所述的细菌是大肠杆菌。
32.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的宿主系统包括真核细胞。
33.如权利要求32所述的表达载体，其特征在于，所述的真核细胞是酵母菌。
34.如权利要求33所述的表达载体，其特征在于，所述的真核细胞是哺乳动物细胞。
35.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的宿主系统包括古细菌。
36.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的宿主系统包括植物细胞。
37.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的载体是质粒。
38.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的载体是噬菌体。
39.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的载体是病毒。
40.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的载体是线性核酸分子。
41.一种基本纯的多肽，其特征在于，其包含断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分、和插入在断裂内含肽第一部分和断裂内含肽第二部分之间的靶肽，所述的多肽选自以下形式的多肽：(a)在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体。
42.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的多肽是在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
43.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的多肽是环状形式靶肽的剪接中间体。
44.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的靶肽含有融合于断裂内含肽的第一部分的第一末端和融合于断裂内含肽的第二部分的第二末端。
45.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从天然形成的断裂内含肽衍生的。
46.如权利要求45所述的多肽，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从Ssp DnaE衍生的。
47.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分中至少一个是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
48.如权利要求47所述的多肽，其特征在于，所述的非天然形成的断裂内含肽是从以下内含肽衍生的：RecA、DnaB、Psp、Pol-1和Pfu内含肽。
49.如权利要求41所述的多肽，其特征在于，所述的断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分都是从非天然形成的断裂内含肽衍生的。
50.如权利要求43所述的多肽，其特征在于，所述的剪接中间体是活性内含肽中间体。
51.如权利要求43所述的多肽，其特征在于，所述的剪接中间体是硫酯中间体。
52.如权利要求43所述的多肽，其特征在于，所述的剪接中间体是套索中间体。
53.一种宿主系统，其特征在于，其包含非天然形成的核酸分子，所述的核酸分子所编码的多肽含有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分、和插入在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间的靶肽；
这种核酸分子在宿主系统中的表达产生选自以下形式的多肽：(a)在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体。
54.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的多肽是在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
55.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的多肽是环状形式靶肽的剪接中间体。
56.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的宿主系统包括原核细胞。
57.如权利要求56所述的宿主系统，其特征在于，所述的原核细胞是细菌。
58.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的宿主系统包括古细菌。
59.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的宿主系统包括真核细胞。
60.如权利要求59所述的宿主系统，其特征在于，所述的真核细胞是酵母菌。
61.如权利要求59所述的宿主系统，其特征在于，所述的真核细胞是哺乳动物细胞。
62.如权利要求53所述的宿主系统，其特征在于，所述的宿主系统包括植物细胞。
63.一种制备肽分子的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
提供分离的核酸分子，它编码的多肽含有断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分、和插入在断裂内含肽的第一部分和断裂内含肽的第二部分之间的靶肽，其中这种核酸分子在宿主系统中的表达产生选自以下形式的多肽：(a)在宿主系统中能自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体；
提供宿主系统；
将分离的所述核酸分子引入所述的宿主系统；和
表达分离的所述核酸分子。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括如下步骤：表达分离的核酸分子，产生能在宿主系统中自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括从宿主系统纯化环状形式靶肽的步骤。
66.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：表达分离的所述核酸分子，产生环状形式靶肽的剪接中间体的步骤。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括从宿主系统纯化环状形式靶肽剪接中间体的步骤。
68.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的剪接中间体是活性内含肽中间体。
69.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的剪接中间体是硫酯中间体。
70.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的剪接中间体是套索中间体。
71.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括自剪接中间体形成环肽的步骤。
72.如权利要求63所述的方法，其特征在于，将分离的所述核酸分子整合入表达载体，该表达载体有利于分离的核酸分子在宿主系统中的表达。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是质粒。
74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是噬菌体。
75.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是病毒。
76.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的宿主系统包括原核细胞。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述的原核细胞是细菌。
78.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述的细菌是大肠杆菌。
79.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的宿主系统包括古细菌。
80.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的宿主系统包括真核细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述的真核细胞是酵母菌。
82.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述的真核细胞是哺乳动物细胞。
83.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的宿主系统包括植物细胞。
84.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述的宿主系统包括体外转录/翻译系统。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述的体外转录/翻译系统包括细胞裂解液。
86.如权利要求64所述的方法，其特征在于，在缺乏外源添加剂的宿主系统中产生环化形式的靶肽。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述的外源添加剂是蛋白酶。
88.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述的外源添加剂是硫醇。
89.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是可诱导性的。
90.一种制备肽分子文库的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
提供多种核酸分子，其编码多种具有异源氨基酸序列的靶肽；
将这些核酸分子分别整合入表达载体，形成许多表达载体，其中在形成的各个表达载体中这些核酸分子各位于编码断裂内含肽第一部分的核酸分子和编码断裂内含肽第二部分的核酸分子之间，其中这些表达载体在宿主系统中的表达导致产生多种选自以下形式的肽分子：(a)在宿主系统中能自发地剪接以产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体；和
在宿主系统中表达这些表达载体。
91.如权利要求90所述的方法，其特征在于，所述的多种多肽是能在宿主系统中自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽。
92.如权利要求90所述的方法，其特征在于，所述的多种多肽是环状形式靶肽的剪接中间体。
93.如权利要求90所述的方法，其特征在于，采用固相合成法来制备所述的编码多种靶肽的多种核酸分子。
94.如权利要求90所述的方法，其特征在于，采用聚合酶链式反应来制备所述的编码多种靶肽的多种核酸分子。
95.如权利要求90所述的方法，其特征在于，通过酶促消化较大的核酸分子来制备所述的编码多种靶肽的多种核酸分子。
96.如权利要求95所述的方法，其特征在于，所述的较大的核酸分子是从生物体衍生的。
97.如权利要求90所述的方法，其特征在于，从祖代核酸分子产生所述的编码多种靶肽的多种核酸分子，该祖代核酸分子已在将突变引入祖代核酸分子核苷酸序列的条件下进行了扩增。
98.一种筛选具有预定特性的肽分子的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
提供编码多肽的核酸分子，该多肽包含断裂内含肽的第一部分、断裂内含肽的第二部分，和位于断裂内含肽第一部分和第二部分间的靶肽，其中这些表达载体在宿主系统中的表达产生了选自以下形式的肽分子：(a)在宿主系统中自发地剪接产生环状形式靶肽的多肽，和(b)环状形式靶肽的剪接中间体；
提供宿主系统；
将分离的核酸分子引入宿主系统；
将宿主系统置于能产生肽分子的条件下；和
测试肽分子的预定特性。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述的肽分子是靶肽的环状形式。
100.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述的肽分子是环状形式靶肽的剪接中间体。
101.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述的预定的特性包括特异性结合靶分子的能力，测试肽分子预定特性的步骤包括(a)使肽分子与靶分子接触，和(b)测定肽分子是否结合于靶分子。
102.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的测定肽分子是否结合于靶分子的步骤是观察颜色的变化。
103.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的测定肽分子是否结合于靶分子的步骤是观察荧光信号。
104.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的测定肽分子是否结合于靶分子的步骤是分析生物体的细胞周期。
105.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的测定肽分子是否结合于靶分子的步骤是分析生物体的再生。
106.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的靶分子是细胞相关分子。
107.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述的细胞相关分子是结合膜的分子。
108.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述的细胞相关分子是细胞内的分子。
109.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述的细胞内分子是核分子。
110.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述的细胞内分子是细胞器。
111.如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述的细胞器选自：线粒体、溶酶体、内质网、叶绿体、高尔基体和周质。
112.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述的靶分子是细胞外分子。
113.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述的预定的特性是调节生化反应的能力，测试肽分子预定特性的步骤包括(a)使肽分子与包含生化反应的系统接触，和(b)测定肽分子是否调节该生化反应。
114.如权利要求113所述的方法，其特征在于，测定肽分子是否调节生化反应的步骤是观察颜色的变化。
115.如权利要求113所述的方法，其特征在于，测定肽分子是否调节生化反应的步骤是观察荧光信号。
116.如权利要求113所述的方法，其特征在于，测定肽分子是否调节生化反应的步骤是分析生物体的细胞周期。
117.如权利要求113所述的方法，其特征在于，测定肽分子是否调节生化反应的步骤是分析生物体的再生。
118.如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述的生化反应是与细胞相关的活动。
119.如权利要求118所述的方法，其特征在于，所述的生化反应是细胞内的代谢反应。
120.如权利要求118所述的方法，其特征在于，所述的生化反应是与膜相关的反应。
121.如权利要求118所述的方法，其特征在于，所述的生化反应是核反应。
122.如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述的生化反应是细胞外的反应。
123.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述的测试肽分子预定特性的步骤是用杂交系统进行的。
124.如权利要求98所述的方法，其特征在于，该方法还包括将肽分子固定在固相载体上的步骤。
125.一种从混合物纯化环肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
提供含有偶联于亲和标记物的剪接中间体的混合物；
将偶联的剪接中间体与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合此亲和标记物，从而载体能特异性结合此剪接中间体；
洗涤载体除去载体上非特异性结合物质；
在载体中加入能从剪接中间体形成环肽的试剂；和
从载体上洗脱下环肽。
126.一种从混合物纯化环肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
提供含有偶联于亲和标记物的剪接中间体的混合物；
将偶联的剪接中间体与其上带有配体的固相载体混合，该配体能特异性结合此亲和标记物，从而载体能特异性结合此剪接中间体；
洗涤载体，除去载体上非特异性结合物质；
从载体上洗脱下剪接中间体；和
在洗脱的剪接中间体中加入能从剪接中间体形成环肽的试剂。
127.一种从混合物纯化能结合剪接中间体的靶分子的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
提供特异性结合有剪接中间体的固相载体；
使载体与混合物中的靶分子接触；
洗涤载体，除去载体上非特异性结合物质；和
从载体上洗脱下靶分子。
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