CN110520729B - 用于产生和筛选隔离的肽文库的方法 - Google Patents

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Abstract

共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：a)形成包含编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室，b)从所述多核苷酸表达多肽，以及c)使所述多肽环化。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库。用于筛选共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库的方法。向这样的文库中掺入非经典的核酸。

Description

用于产生和筛选隔离的肽文库的方法
技术领域
本发明涉及环状肽及其编码多核苷酸的共同隔离。特别地，本发明涉及这样的隔离的环状肽的文库，以及从这样的文库筛选、选择和分选隔离的环状肽的方法。
发明背景
在分散于油相中的水滴中隔离单个样品是一种用于化学和生物学中的高通量测定的强有力的方法。这里，液滴相当于试管。液滴包含评估和解码文库成员的特定实验或特性所需的一切东西。利用大多数乳化技术生产的液滴的尺寸不均匀，并且在需要定量读数的实验中出现错杂性。微流体装置允许产生高度单分散的水滴，其频率高达每秒几(10)千。它们的直径通常为10-200微米，对应于0.5pL-4nL的体积。除了液滴形成之外，微流体形式还允许许多其他单元操作，如液滴分裂、融合、孵育、分析和分选。
液滴微流体涉及纳升至飞升大小的水包油液滴的形成，其提供了特别适合隔离单个基因、生物体和细胞的明确界定且离散的环境。特别地，小型化提供了许多优势，包括减少样品消耗、提高分析性能、快速内容物混合和层流(流线型)流动。
水滴将基因型与表型关联起来，因为它们提供的隔离模仿了自然细胞的隔离。在每个人造隔室中，单个基因通过无细胞方式转录和翻译，以产生其编码的蛋白质的多个拷贝。这种体外隔离(IVC)产生了“单克隆单元”，其非常适合高通量文库选择和新型肽基生物制剂的鉴定。由于基因型和表型之间的联系并非化学关联，而是共同隔离的，因此可以选择多种功能(酶促、调节、抑制、结合和结构)。这优于现有的展示选择策略(例如，细菌、病毒、酵母和噬菌体展示)，其中选择仅基于结合相互作用。由于结合与抑制或催化无关，因此使用这样的策略可能无意中导致选择出与酶表面紧密结合但在其活性位点之外的较差的抑制剂。
涉及乳化的油包水(w/o)液滴中的体外蛋白质表达的研究通常使用绿色荧光蛋白(GFP)作为概念验证。Dittrich等人首次证明了用于无细胞蛋白质合成隔离和GFP表达的微结构化装置的实现。Courtois等人随后描述了用于含有可测量量的体外表达的GFP的液滴的存储和在线检测的集成芯片系统的实用性。然而，在一些情况下，仅分离单一模板不会产生足够的蛋白质以达到检测阈值。与单一lacZ基因一样，尽管β-半乳糖苷酶具有高的酶促活性(kcat＝187s-1，KM＝150μM)，但仍无法检测到表达。这一问题可以通过DNA与等温扩增系统的共同封装来克服。利用Φ29DNA聚合酶进行芯片上等温扩增是产生μg量的双链DNA的一种简单的方法。该预扩增步骤包括含有液滴的IVTT与封闭扩增DNA的那些的协同融合，然而在许多情况下，DNA扩增、IVTT和任何后续酶促测定所需的最佳条件是不同的；例如，成功扩增DNA所需的组分可能会抑制IVTT。同样，可能需要在不同的pH值下或在不同的缓冲组合物中运行每个过程。
当使用油包水液滴时，不同生化反应彼此的相容性是一个问题。大多数生化方案是多步骤的过程：添加溶液，离心样品，除去上清液，洗涤团块等。将这样的方案转移到液滴是困难的。尽管可以利用专门的微流体装置来进行用于添加和/或稀释组分的液滴-液滴融合，但是当涉及较大的液滴数量并且需要额外的步骤(例如洗涤、缓冲液交换、添加或除去试剂)时，其实际上是具有挑战性的。此外，尽管液滴融合对液滴隔室的受控凝聚和化学及生物反应的启动至关重要，但该过程本身具有挑战性，因为例如液滴必须实现时间和空间同步以使融合发生，必须克服所利用的表面活性剂的稳定作用，并且对于活性融合需要使用专门的设备如电极，其中将液滴呈递至电场诱导它们的凝聚(电融合)。这使得液滴融合难以或不可能在连续的工作流中实施。
在体外进行多步骤的隔离反应的一种可选技术是使用于微流体液滴中的胶珠。这些技术对于生化过程特别有用，如高通量筛选、定向演化和基因分型方法。
例如，第PCT/GB2012/051106号PCT申请描述了以下用于筛选多种多肽将报告底物转化成可检测的报告子的活性的方法：
1).将包含多核苷酸、报告底物和凝胶形成剂的组群的水性报告子溶液乳化成微液滴，其中每个多核苷酸编码这样的产物，其在所述微液滴中将报告底物转化为可检测的报告子；
2).使微液滴内的凝胶形成剂凝固以产生胶珠，其包含多核苷酸和由产物产生的可检测的报告子；
3).将水性微液滴脱乳化，并将珠粒重悬于水性检测溶液中；以及
4).检测、测定或测量一个或多个珠粒中所述组群中的可检测的报告子。
可以鉴定和/或分离来自水溶液的一个或多个珠粒，其包含可检测的报告子或缺少可检测的报告子。可以鉴定、扩增、克隆、测序或以其他方式研究来自一个或多个鉴定的珠粒的多核苷酸。可以，例如在质粒、病毒或PCR产物中分离多核苷酸或核酸，或者多核苷酸或核酸可以包含在细胞或病毒颗粒中。多核苷酸保留在胶珠内。
与简单的油包水液滴相比，水包油包水(w/o/w)双乳剂提供了内部水性隔室，用于分离生物组分以及用于流式细胞术分析的水性载液。Tawfick和Griffiths先前利用w/o/w双乳剂作为微型化微反应器，用于创建定向蛋白质演化中的基因型-表型关联，以用于基于产物荧光的出现鉴定潜在的催化剂“命中”，其中随后通过流式细胞术选择显示所需活性的文库成员。然而，尽管已经开发了许多微流体系统来制造和分选液滴，但是所需的操作技能使得它们无法容易地在非专业环境中实现。因此，我们采用了如Zinchenko等人描述的两步骤单分散双乳剂液滴方法，其利用具有不同表面特征的两种独立的微流体装置，以用于单一(疏水装置表面涂层)和双乳剂液滴形成(亲水装置表面涂层)。所得的双乳剂液滴现在适用于经荧光活化细胞分选(FACS)的定量分析和分选。
国际专利申请WO 2000/036093 A2公开了产生环状肽和以环状构象剪接肽中间体的方法。该方法利用断裂内含肽(split intein)的反式剪接能力来催化来自前体肽的肽的环化，该前体肽具有插入在断裂内含肽的两个部分之间的靶肽。断裂内含肽的两个部分的相互作用产生具有催化活性的内含肽，并且还迫使靶肽形成环状构型，其稳定一个内内含肽部分和靶肽之间的连接处的氨基酸的酯异构体。然后来自另一个内含肽部分的杂原子与酯反应以形成环酯中间体。活性内含肽催化氨基琥珀酰亚胺的形成，其释放出环化形式的靶肽，该靶肽自发重排以形成热力学上有利的骨架环状肽产物。
国际专利申请WO 2012/156744 A2公开了使用微流体液滴中的胶珠来在体外进行多步骤的隔离反应。方法可包括将包含多核苷酸、报告底物和凝胶形成剂的水性报告子溶液乳化成微液滴。每种多核苷酸编码这样的产物，其在微液滴中将报告底物转化为可检测的报告子。然后凝胶形成剂在微液滴中凝固，而产生包含多核苷酸和由产物产生的可检测的报告子的胶珠。然后将水性微液滴脱乳化并重悬于水性检测溶液中，并检测于一个或多个珠粒组群中的报告子。
Cui,Weitz,Chong,等人(Scientific Reports 6，文章编号：22575)将体外双杂交系统(IVT2H)引入至微流体液滴，并开发出了简化的混合读取液滴IVT2H(mix-and-readdrop-IVT2H)方法来筛选随机DNA文库。液滴IVT2H是基于两种相互作用蛋白结构域的结合亲和力和荧光报告子的转录激活之间的关联。用IVT2H封装编码潜在的肽结合剂的DNA文库，使得在单个液滴中分布单个DNA分子。
Brouzes等人(PNAS 2009,106:34,pp.14195–14200)提出了能够高通量筛选单个哺乳动物细胞的基于液滴的微流体技术，并开发出了能够在测定读数期间鉴定液滴组成的光编码的液滴文库。使用综合的液滴技术，针对对抗U937细胞的细胞毒性作用筛选药物文库。
Thiele等人(芯片实验室，2014，第2651-2652页)报道了透明质酸水凝胶珠粒用于无膜体外转录/翻译。然而，不熔化的透明质酸水凝胶可能降低蛋白质产量。
小的线性肽可用于研究各种生理现象，因为它们表现出广泛的生物活性，并且可以利用固相合成和组合化学中的常规技术以具有几乎无限可变性的序列容易地合成。这些品质也使得小的线性肽特别适用于鉴定和开发新药。例如，可以合成制备无数不同小的线性肽的大文库，然后在各种生物测定中针对特定的特征进行筛选。例如，Scott,J.K.和G.P.Smith,Science 249:386,1990；Devlin,J.J.,等人,Science 24:404,1990；Furka,A.等人,Int.J.Pept.Protein Res.37:487,1991；Lam,K.S.,等人,Nature 354:82,1991。然后可以分离表现出特定特征的文库中的那些肽作为进一步研究的候选物。然后可以使用测序通过例如相关的多核苷酸来表征所选择的肽。
尽管有这些优势，但只有少数小的线性肽被开发成广泛使用的药物。其中一个原因是小的线性肽通常从体内清除得太快而变得没有治疗价值。
环闭合或环化可降低肽在体内降解的速率，因此显著改善其药代动力学性质。用于产生大量具有无限可变性的氨基酸序列的不同肽的合成方法极大地促进了特定环状肽作为新药候选物环状肽的鉴定。
已经描述了用于产生环状肽的各种方法。例如，已经设计了化学反应方案如第4,033,940号和第4,102,877号美国专利中所述的那些，以产生环化的肽。在其他技术中，将生物和化学方法组合以产生环状肽。后者的这些方法涉及首先表达环状肽的线性前体，然后添加外源试剂如蛋白酶或亲核试剂，以将这些线性前体化学转化为环状肽。参见例如Camerero,J.A.和Muir,T.W.,J.Am.Chem.Society.121:5597(1999)；Wu,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:9226(1998)。
一旦产生，即可以筛选环状肽的药理学活性。例如，可以制备含有大量不同环状肽的文库，然后筛选特定的特征，如结合特定靶配体的能力。将文库与靶配体混合，并且可以分离文库中与靶配体结合的那些成员并通过对相关的多核苷酸进行测序来鉴定。类似地，可以将环状肽的文库添加到针对特定生物活性的测定中。然后可以分离调节生物活性的那些环状肽并通过测序来鉴定。
环状肽文库被越来越多地用于高通量筛选，以鉴定各种具有挑战性的靶标的抑制剂。用于生成这样的文库的方法可分为两种——遗传编码的方法–如噬菌体展示或SICLOPPS(肽和蛋白质的断裂内含肽环状连接)–或需要利用反卷积代码(deconvolutioncode)标记的化学合成的文库–通常，使用独特的核酸(例如，RNA或DNA)代码来鉴定文库的每个成员。
分子生物学的最新进展允许根据一些分子的特性和编码它们的核酸共选择该分子。随后可以对选择的核酸进行克隆以用于进一步分析或使用，或者进行另外几轮的突变和选择。
这些方法的共同点是建立大型核酸文库。可以通过选择编码的多肽的所需活性如所需的生化或生物活性，例如结合活性的选择方案分离具有所需特征(活性)的分子。
噬菌体展示技术在提供这样的媒介物方面非常成功，其允许通过提供核酸和编码的多肽的活性之间的必要联系来选择展示的蛋白(Smith,1985；Bass等人,1990；McCafferty等人,1990；对于综述参见Clackson和Wells,1994)。丝状噬菌体颗粒用作遗传展示包，其中蛋白质在外部，且编码它们的多核苷酸在内部。核酸和编码的多肽的活性之间的紧密关联是噬菌体在细菌内组装的结果。由于单个细菌很少被多重感染，因此在大多数情况下，从单个细菌产生的所有噬菌体将携带相同的多核苷酸并展示相同的蛋白质。
然而，噬菌体展示依赖于在细菌中体内产生核酸文库。因此，噬菌体展示技术所允许的文库大小的实际限制是107-1011的量级，即使利用具有可切除的丝状噬菌体复制子的λ噬菌体载体亦如此。该技术主要应用于具有结合活性的分子的选择。使用该技术也分离出了少量具有催化活性的蛋白质，然而，选择并非直接针对所需的催化活性，而是针对与过渡态类似物的结合(Widersten和Mannervik，1995)或与自杀性抑制剂的反应(Soumillion等人,1994；Janda等人,1997)。最近出现了通过产物形成使用噬菌体展示而选择的酶的一些实例(Atwell&Wells,1999；Demartis等人,1999；Jestin等人,1999；Pederson,等人,1998)，但是在所有这些情况中，选择都不是为了多次周转。
虽然通过mRNA展示可以产生较大的文库，但是这些文库也限于基于亲和力的筛选，并且具有与噬菌体展示相同的缺点。
mRNA展示是这样的一种技术，其通过使用无细胞翻译系统(体外转录/翻译系统)将作为基因型的mRNA和作为表型的肽分子共价偶联来关联基因型和表型，并经由嘌呤霉素(其为酪氨酰-tRNA的3'端的类似物)，通过将合成的肽分子和编码其的mRNA偶联来应用。
在mRNA展示中(参见Szostak,J.W.和Roberts,R.W.，第6,258,558号美国专利，其内容通过引用整体并入本文中)，文库中的每个mRNA分子通过在其3'端共价添加嘌呤霉素样部分来修饰。嘌呤霉素样部分是发挥肽基受体的作用的氨酰tRNA受体茎类似物，并且可以通过翻译mRNA的核糖体的肽基转移酶活性添加到生长的多肽链中。在体外翻译期间，mRNA和编码的多肽通过嘌呤霉素样部分成为共价连接的，产生RNA-多肽融合。在通过将其多肽组分与靶标结合来选择融合分子后(即通过筛选)，可以使用PCR扩增所选择的融合分子的RNA组分，然后进行表征。已经开发了几种其他的方法来产生多肽和其编码核酸之间的物理关联，以促进选择和扩增(参见Yanagawa,H.,Nemoto,N.,Miyamoto,E.和Husimi,Y.，第6,361,943号美国专利；Nemoto,H.,Miyamoto-Sato,E.,Husimi,H.和Yanagawa,H.(1997).FEBS Lett.414:405-408；Gold,L.,Tuerk,C.,Pribnow,D.和Smith,J.D.,第5,843,701号和第6,194,550号美国专利；Williams,R.B.,第6,962,781号美国专利；Baskerville,S.和Bartel,D.P.(2002).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:9154-9159；Baskerville,D.S.和Bartel,D.P.,第6,716,973号美国专利；Sergeeva,A.等人(2006).Adv.DrugDeliv.Rev.58:1622-1654；以上中的每项的内容均通过引用整体并入本文中)。
mRNA展示是用于产生较大的肽文库的特别有用的方法。
在mRNA展示中，将含有经由合适的连接子预先连接到mRNA 3'端的嘌呤霉素的该mRNA引入无细胞翻译系统，以从mRNA合成肽，使得嘌呤霉素与生长肽链的C端融合，作为核糖体上肽基转移反应的底物。翻译的肽分子经由嘌呤霉素部分与mRNA融合。嘌呤霉素的特征在于，其与新生肽形成酰胺键，而不是酯键，这与氨酰tRNA的3'端不同。因此，嘌呤霉素和肽在核糖体上彼此融合的缀合物耐受水解且是稳定的。
在mRNA展示中，必须将嘌呤霉素连接到mRNA的3'端。这种连接可以通过以下方式来进行，即首先制备具有由线性聚合物组成的间隔子的嘌呤霉素缀合的连接子，然后将连接子与mRNA的3'端融合。也可以通过以下方式来进行连接，即首先将间隔子与mRNA的3'端缀合，然后将嘌呤霉素与缀合物融合。在任一方法中，线性聚合物间隔子通常在末端含有磷酸基或核苷酸，并且mRNA的3'端和连接子的5'端之间的连接是经由磷酸基的共价键。通过使用RNA连接酶或DNA连接酶的反应或标准有机化学反应而形成该共价键。
EP 2492344 A1公开了一种称为“RAPID”的修饰的mRNA展示方法。本发明的RAPID展示方法中的连接子通过在一端与mRNA的3'端结合，且在另一端以与已知的mRNA展示方法相同的方式与新生肽的C端结合来连接mRNA和从其翻译的肽。
然而，RAPID展示方法中的连接子的两端结构与已知的mRNA展示方法中使用的那些不同。在RAPID展示方法中使用的连接子在本文中有时被称为“RAPID连接子”。
连接子的一端的与肽的C端结合的区域在本文中有时被称为“肽基受体”或简称为“受体”。因此，术语“肽基受体”是指具有能够结合通过核糖体上的肽基转移反应(肽基-tRNA)生长的肽的结构的分子或部分。肽基受体可以指位于连接子末端的区域，或者可以指包括连接子在内的整个结构。例如，已知的mRNA展示方法中的肽基受体是位于连接子的一端的嘌呤霉素，或作为包括连接子在内的整个结构的嘌呤霉素缀合的连接子。
RAPID连接子的特征在于肽基受体的结构和制备过程。
在RAPID展示方法中，在3’端合成了具有由4-残基核糖核苷酸ACCA组成的序列的连接子，然后在3’端将氨基酸连接至腺苷酸上，从而在连接子上赋予作为肽基受体的结构。在核糖体上的肽延长反应期间，与连接子的末端连接的氨基酸接受肽基-tRNA的肽的C端，并与肽结合。其中氨基酸经由酯键与RNA序列ACCA连接的结构在本文中被称为“肽基受体区域”。
已知的mRNA展示方法中的肽基受体是嘌呤霉素，其具有氨基核苷结构，其中腺苷酸样部分中的核糖和氨基酸经由酰胺键连接。然而，在RAPID展示方法中，氨基酸经由酯键与核糖的3'-O连接。换言之，RAPID展示中的肽基受体具有与天然的氨酰tRNA类似的核苷结构。通过采用更接近天然受体的结构的结构，肽基受体显示出与嘌呤霉素相当或更高的掺入效率。
肽基受体和肽的C端之间的键形成似乎是通过以与核糖体中的正常肽基转移反应相同的方式使掺入到A位点中的肽基受体的氨基与P位点中的肽基-tRNA的连接肽的C端的酯键接近而发生的。因此，与肽链的C端形成的共价键通常是以与mRNA展示中相同的方式形成的酰胺键。应该注意的是，通过将人工RNA催化剂(flexizyme)用于合成连接子，也可以将具有不自然的(非经典的/非天然的/非蛋白原性的)氨基酸如D-氨基酸或β(beta)-氨基酸的连接子用于本发明的RAPID展示中。
在RAPID展示方法中，连接子的5'端和mRNA分子的3'端通过基于碱基配对的杂交形成复合物。RAPID连接子中的该区域在本文中被称为“单链结构区域”。在侧链中具有核酸碱基的单链结构的具体实例包括单链DNA、单链RNA、单链PNA(肽核酸)等。所得复合物必须在从mRNA文库中选择肽期间保持稳定。随着连接子的单链结构区域的核苷酸序列和mRNA分子的3'端的序列之间的互补性增加，双链形成的效率增加并且稳定性也增加。稳定性还取决于GC含量、反应溶液的盐浓度和反应温度。特别地，该区域理想地具有高GC含量，特别是80％或更多，优选85％或更多的GC含量。
除了两端之外的连接子的其余部分被设计成具有柔性、亲水性和简单的线性结构，具有较少的侧链，整体上类似于已知的mRNA展示方法中使用的连接子的结构。因此，可以适当地选择和使用线性聚合物，包括例如，寡核苷酸，如单链或双链DNA或RNA；聚烯烃如聚乙烯；聚亚烷基二醇如聚乙二醇；聚苯乙烯；多糖；或以上的组合。连接子优选具有的长度为100埃或更大，更优选约100-1000埃。
RAPID系统的优势是可以利用IVTT系统原位发生肽基受体区域和文库mRNA之间的关联，即不需要例如，嘌呤霉素与连接子之间或连接子与mRNA之间的初步连接步骤。
此外，可以将非天然(非经典的)氨基酸掺入到相同的翻译系统中。例如，可以通过人工RNA催化剂(核酶)，例如flexizyme来介导用于使tRNA荷载非蛋白原氨基酸或羟基酸(其为不寻常肽的组成单元)的酰化反应。
通过使用与lac阻遏物LacI的C端连接的肽的大型文库的亲和力选择，而选择了与受体结合的特异性肽配体(Cull等人,1992)。当在大肠杆菌(E.coli)中表达时，阻遏蛋白通过与质粒上的lac操纵子序列结合而将配体与编码质粒物理连接。
还报道了完全体外的多核糖体展示系统(Mattheakis等人,1994；Hanes和Pluckthun,1997)，其中新生肽经由核糖体与编码它们的RNA物理连接。还描述了通过制备RNA-肽融合物而将基因型与表型关联的可选的完全体外的系统(Roberts和Szostak,1997；Nemoto等人,1997)。
然而，上述系统的范围不允许直接选择除结合之外的活性，例如催化或调控活性。这些方法中的大多数仅与基于亲和力的测定相容。然而，大多数药物测定是功能性的，并且在任何情况下，功能测定都是优选的；仅仅因为化合物与靶蛋白结合并不意味着其具有任何生物学功能。
一个例外是SICLOPPS方法，其可以与基于亲和力的测定及功能测定相配合。然而，到目前为止，SICLOPPS仅在基于细胞的体内系统中获得证实。
在SICLOPPS系统中，可以构建核酸分子，使得编码待环化的肽的核苷酸序列的两侧分别是：其一端是编码断裂(或反式)内含肽(C-内含肽或IC)的羧基端部分的核苷酸序列，并且其另一端是编码断裂内含肽(N-内含肽或IN)的氨基端部分的核苷酸序列。构建体的表达导致产生融合蛋白。然后，融合蛋白的两个断裂内含肽组分(即IC和IN)组装形成活性酶，其将间插序列的氨基和羧基端剪接在一起以产生主链环状肽。化学反应描述在图14中。该方法可以适用于促进具有预定特征的环状肽的选择或筛选。
因此，本发明可以以编码多肽的非天然存在的核酸分子为特征，所述多肽具有第一部分的断裂内含肽、第二部分的断裂内含肽，以及插入第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽之间的靶肽。核酸分子的表达产生多肽，其自发剪接以产生环化形式的靶肽，或环化形式的靶肽的剪接中间体，如活性内含肽中间体、硫酯中间体或套索中间体。
第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽都可以来源于天然存在的断裂内含肽如Ssp DnaE。在其他变体中，断裂内含肽部分之一或二者可以来源于非天然存在的断裂内含肽，如来源于RecA、DnaB、PspPol-1和Pfu内含肽的那些。
在Tawfik和Griffiths(1998)以及国际专利申请PCT/GB98/01889中，描述了用于体外演化的系统，其通过使用微胶囊中的隔离来在分子水平上关联基因型和表型而克服了上述许多限制。
在Tawfik和Griffiths(1998)以及国际专利申请PCT/GB98/01889的几个实施方案中，多肽所需的活性导致编码其的多核苷酸(并且存在于相同的微胶囊中)的修饰。然后可在随后的步骤中选择修饰的多核苷酸。然而，这些方法没有考虑环状多肽。
因此，需要用于产生和标记环状肽文库的与任何药物测定相容的方法。本发明通过以与药物测定和肽文库生成相容的形式提供与其编码多核苷酸共隔室的环状多肽而解决了该需求。
发明概述
本发明有利地提供呈这样形式的环状多肽：其可与任何药物测定，特别是与功能测定配合，且允许容易且独特地鉴定每种多肽。
在第一个方面，公开了用于产生与编码环状多肽的多核苷酸共隔室的环状多肽的方法，包括以下步骤：
a)形成含有编码环状多肽的多核苷酸的隔室；
b)从所述多核苷酸表达多肽；以及
c)使所述多肽环化。
在实施方案中，使所述多肽环化是被动过程。换言之，所述多肽可以自环化或自动环化。该被动过程可以是“自动催化的”过程。例如，多肽可以是SICLOPPS多肽。在这样的情况下，“(c)使所述多肽环化”的步骤仅涉及允许所述多肽环化，例如通过允许反应进行合适的时间长度。在实施方案中，环化的合适时间长度可以是约几秒钟。在其他实施方案中，环化的合适时间长度可以是约几分钟、几小时或几天。对于任何给定的多肽，环化所需的时间可显著变化。然而，确定允许所需程度的环化的合适时间长度在本领域技术人员的能力范围内。
可选地，可以通过本领域已知的其他方法环化多肽，如化学方法或酶促方法。在这些环化的“非被动”方法中，允许环化所需的组分与多肽接触，并使反应经受合适时间长度的必要条件以产生所需程度的环化。在实施方案中，环化的合适时间长度可以是约几秒钟。在其他实施方案中，环化的合适时间长度可以是约几分钟、几小时或几天。对于任何给定的多肽，环化所需的时间可以显著变化。然而，确定允许所需程度的环化的合适时间长度在本领域技术人员的能力范围内。
由于环状多肽的表达发生在隔室内，所以编码环状肽的多核苷酸包含在同一隔室中。这使得可通过分离和测序其共隔室的多核苷酸而独特地鉴定环状多肽。隔室还形成微反应器，其包含表达系统的所有组分，和/或任何其他的反应组分。
多核苷酸可以与其编码的产物非共价结合，例如可将多核苷酸和编码的产物包含在相同的珠粒、隔室、细胞或病毒颗粒内。可以通过非共价连接直接或间接地连接多核苷酸及其编码的产物。
可选地或另外地，多核苷酸可与其编码的产物共价结合，例如通过mRNA展示系统中的嘌呤霉素部分。
在第二个方面，公开了用于分选环状多肽的方法，包括以下步骤：
a)形成含有编码环状多肽的多核苷酸的隔室；
b)从所述多核苷酸表达多肽；
c)使所述多肽环化；
d)针对活性筛选所述环状多肽；以及
e)选择表现出所需活性的环状多肽。
例如，可将环状多肽用于诱导或抑制荧光。然后可以相应地选择和/或分选表现出或未表现出荧光的珠粒和/或隔室，如通过荧光活化液滴分选(FADS)。稍后可以通过对相关的多核苷酸进行测序来鉴定表现出所需特征的环状肽。
在实施方案中，方法还包括鉴定选择的环状多肽的步骤。例如，通过对与借助本发明的多肽相关的多核苷酸测序。
在一些实施方案中，隔室可以是通过微流体操作包含多核苷酸的溶液获得的油包水(w/o)液滴或水包油包水(w/o/w)乳剂。
在其他的实施方案中，隔室可以是通过生物电喷雾或喷射聚电解质中的合适的多核苷酸溶液获得的微胶囊，如藻酸盐隔室。
在其他的实施方案中，隔室可以是囊泡，如脂质囊泡。
方法还可包括扩增多核苷酸的步骤。增加的多核苷酸拷贝数最终可导致更高的环状多肽的表达。这促进了任何后续测定中环状多肽的检测，从而提高了其灵敏度。
隔室还可包含凝胶形成剂，其中在扩增多核苷酸后，凝胶形成剂凝固(或形成)为胶珠。扩增的多核苷酸被捕获(或固定)在凝胶基质中，从而将相同的多核苷酸拷贝保持在单个珠粒中。如果隔室稍后被破坏，这防止扩增的多核苷酸拷贝从珠粒丢失，从而维持了独特地鉴定珠粒的能力。可通过例如冷却至形成凝胶的温度来使凝胶形成剂形成凝胶。
在扩增反应期间，可以施加外部热源。这可通过向其中进行扩增的反应器皿或容器，例如，在玻璃注射器中施加热量来实现。这可刺激扩增反应。可选地或另外地，在采用凝胶形成剂的实施方案中，施加热量来使凝胶维持液相。
优选地，在恒定温度下均匀且连续地向容器施加热量。“均匀地”施加，其意指容器的基本上所有表面都经受相同程度的加热，即容器表面上的任何给定点接收与容器表面上的任何其他给定点相同量的热能。在实施方案中，“基本上所有”的容器包括容器的在侧面包围或环绕容器的仅一个表面，或者一起在侧面包围或环绕容器的多个表面。例如，容器可以是这样的注射器，其具有圆形横截面，因此具有总体上圆柱形的形状和围绕由两个圆形表面(顶部和底部表面)覆盖的注射器的单个侧面弯曲表面(侧表面)。在该实例中，如果弯曲(侧)表面上的任何给定点接收与该弯曲(侧)表面上的任何其他给定点相同量的热能，则热量均匀地施加到容器的表面上，而不管由封盖(顶部和底部)表面之一接收的热能的量是多少。
外部热源可包含柔性加热元件或细丝。热源可以是电动的。在实施方案中，热源是可商购获得的电子加热垫。在其他的实施方案中，热源可以是填充有流体的夹套，加热的流体例如水被连续地从加热的流体源泵入其中。在实施方案中，外部热源可以与容器一体形成。
在形成胶珠之后，隔室可能会破坏。这允许珠粒所暴露的条件发生改变。例如，可以通过缓冲液交换程序改变缓冲溶液。新的缓冲溶液可以渗入胶珠中，并与保持在珠粒内的多核苷酸拷贝或任何其他组分发生相互作用。这可以导致新的过程如基因表达的活化。
每个胶珠也代表机械稳定的单元，并且可以被认为是具有相同序列的多核苷酸的储库。可以单独地操作每个珠粒。例如，可以将珠粒送入微流体装置进行乳化。
在一些实施方案中，可将胶珠暴露于用于表达环状多肽的条件。例如，可将胶珠暴露于体外转录和翻译(IVTT)系统。
在暴露于用于表达环状多肽的条件之后和/或期间，可围绕胶珠形成隔室。换言之，珠粒被重新隔离，意味着未隔离的珠粒具有在其周围形成的新的隔室。该第二隔离步骤可以遵循与上述第一隔离相同的程序。可选地，第二隔离步骤可以遵循不同的程序。例如，第一隔离可以是通过微流体形成含有胶珠的乳剂的液滴，且第二隔离可以是通过用聚电解质的喷射程序形成包含胶珠的隔室。在可选的实例中，第一和第二隔离程序均是通过微流体形成含有珠粒的乳剂的液滴。
翻译后，可对珠粒进行测定。例如，可以通过光学测定如比色或荧光测定评估环状肽抑制靶酶的潜能。如果酶催化产生有色或荧光产物的反应，则与含有非抑制剂的其他珠粒相比，含有抑制性多肽的珠粒将具有降低的颜色或荧光强度。可以以高通量方式例如通过荧光活化细胞分选(FACS)或荧光活化液滴分选(FADS)来分选珠粒。在实施方案中，珠粒为乳剂的液滴。为了与FACS/FADS相容，乳剂的连续相应是水性的。
多核苷酸可包含编码N端内含肽片段的序列，接着是编码环状多肽的序列，接着是编码C端内含肽片段的序列。当表达为多肽时，N端内含肽片段与C端内含肽片段结合。这导致包含所需环状多肽的间插多肽形成多肽环。然后内含肽-环结构自发进行剪接反应，其产生游离的内含肽和所需的环状多肽。可以通过常规的分子克隆技术获得所需的多核苷酸。
在任何方面或实施方案中，隔室可以是水包油包水(w/o/w)乳剂的液滴、囊泡或隔间。
在第三个方面，公开了包含以下的隔室：
a)编码N端内含肽片段的多核苷酸，接着是编码环状肽的序列，接着是编码C端内含肽片段的序列；和
b)环状多肽。
多核苷酸的表达产生包含N端内含肽片段、间插环状多肽序列和C端内含肽片段的线性多肽。线性肽可在内含肽片段和环状多肽序列之间的连接处进行自发剪接反应，从而产生环状多肽和游离的内含肽部分。这是一种可使隔室含有环状多肽及其编码多核苷酸的方式。可以测定这样的隔离的环状多肽。特别地，隔离的环状多肽与药物测定，包括功能测定相容。这允许例如在药物发掘中高通量筛选和选择有前景的环状多肽候选化合物。如果使用根据本发明的文库，则尤其如此。
因此，本发明可以以编码多肽的非天然存在的核酸分子为特征，所述多肽具有第一部分的断裂内含肽、第二部分的断裂内含肽，以及插入第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽之间的靶肽。核酸分子的表达产生多肽，其自发剪接以产生环化形式的靶肽，或环化形式的靶肽的剪接中间体，如活性内含肽中间体、硫酯中间体或套索中间体。
通过使用重新指定的密码子组结合含有荷载有非天然氨基酸的特定tRNA的定制的IVTT混合物，本发明可用于编码含有一种或多种非天然氨基酸的环状多肽；可使用先前报道的方法容易地产生荷载有非天然氨基酸的tRNA。例如，可以通过人工RNA催化剂(核酶)，例如，flexizyme介导用于使tRNA荷载有非蛋白原氨基酸或羟基酸(其为不寻常肽的组成单元)的酰化反应。
第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽均可来源于天然存在的断裂内含肽，如Npu或Ssp DnaE。在其他变型中，断裂内含肽部分之一或二者可来源于天然的、改造的或非天然存在的断裂内含肽，如来源于RecA、DnaB、Psp Pol-l和Pfu内含肽的那些。
在第四个方面，提供了与其编码多核苷酸共隔室的环状多肽的文库。文库包括多个这样的隔室，其中至少一个隔室中的多核苷酸包含这样的序列，其不同于(即不相同)至少一个其他的隔室(即不同的隔室)中的多核苷酸的序列。可以例如通过对文库进行荧光或比色测定来对其进行筛选，并且例如通过FADS选择那些表现出所需信号的隔室。
在另一个方面，提供了试剂盒，包含：
a)微流体装置；
b)编码N端内含肽片段的多核苷酸；和
c)编码C端内含肽片段的多核苷酸。
在实施方案中，试剂盒包含胶囊形成材料。所述胶囊形成材料可以是油、脂质或聚电解质。
在一些实施方案中，试剂盒还包含凝胶形成剂。
编码内含肽片段的多核苷酸可用于产生编码环状多肽序列的多核苷酸，所述环状多肽序列的两侧分别是在一端的N端内含肽片段和在另一端的C端内含肽片段。这可通过常规的分子克隆技术，例如通过将内含肽编码序列与编码环状多肽的核苷酸连接而实现。
附图的简要说明
图1.用于产生和操作飞升尺寸的液滴的微流体装置。(左)用于飞升液滴的受控生成的与载玻片结合的PDMS装置；(右)装置运行的图片-液滴形成发生在微流体芯片的喷嘴(10μm宽x 5μm深)处，而新生成的液滴通过流道(100μm宽x 25μm深)迁移。提供了4个入口用于注入，因而将流体引入装置内：两个外部端口用于油，而中间的两个端口用于水溶液。比例尺＝50μm。
图2.单个油包水乳剂液滴尺寸的分析。通过维持10μL/h的恒定的水流速，而将油/表面活性剂流速从10μL/h增加至60μL/h(分别是A-F)，来测定精细地控制产生的液滴直径的能力。每个直径分布直方图上方的明场图片表示在每种条件下收集期间所得的液滴生成流。对于每个实验，分析三个独立的图像并绘制所得的液滴直径以获得直径直方图；在每种情况下，将y轴(液滴计数)标准化，并将结果表示为分数。在每种情况下以约束幅度为1拟合高斯正态分布。每张图片的变化系数(C.V.)与每组一起呈现。堆栈尺寸(bin size)＝0.5μm。
图3.单乳剂液滴直径、体积和产生率的分析。(左)对于单乳剂液滴产生的液滴直径相对于油流速。(右)针对10-60μl/h油流速绘制的液滴产生率(kHz)和平均体积；液滴体积的增加对应于其所得的产生率的减少。值绘制为平均值及SD，从中分析三个独立样品的三张独立的图片。
图4.用于产生双乳剂液滴的基于双芯片的微流体设置。用于再乳化的单乳剂液滴以正浮位置包含在玻璃注射器内。一旦沉降，乳剂即被驱动通过具有较大通道尺寸的第二微流体装置(放大的裁切)以允许双乳剂液滴形成。
图5.微流体装置连接处双乳剂产生的图示；液滴从左向右移动。(A)芯片上单乳剂和双乳剂形成的图示；(B)装置孔口处的双乳剂液滴形成的明场图像。
图6.以可控且灵活的方式产生高度单分散的双乳剂(w/o/w)液滴。水包油包水(w/o/w)双乳剂液滴含有于FC-40油壳和1％tris/吐温80外相中的100μM荧光素内核。使用以下流速产生液滴：乳剂-4μl/h，FC-40隔离油-15μl/h和1％tris/吐温-60μl/h。10倍放大的图片中突出的球状结构代表矿物油液滴。箭头突出了双倍占据的双乳剂液滴。(左上方)插图显示单个双乳剂液滴的放大图像；显示了内部水性核心的直径和总的双乳剂直径(ID&OD)。
图7.含FITC的双乳剂液滴的流式细胞术分析。(A)双乳剂样品的侧向散射相对于前向散射对数图，(B)绿色荧光强度相对于前向散射对数图；还呈现了前向散射(上方)和绿色荧光强度(右)直方图，(C)在没有初始乳剂的情况下制备的水包油单乳剂样品，并使用与先前的样品相同的流速和条件来测定背景荧光水平，(D)水包油单乳剂液滴的荧光相对于前向散射。使用JUS装置进行单乳剂产生，而利用15x 16μm(h x w)装置形成双乳剂。用于水包油产生的流速和装置设计与基于FITC的w/o/w乳剂的那些相同，以允许进行比较。(A)和(C)中的插图显示了所需液滴组群的放大的设门区域。
图8.使用DNA填充的琼脂糖珠粒和三芯片微流体系统形成含有三乳剂IVTT的液滴的图示。(A)将氟化油、琼脂糖/DNA悬浮液和Phi29DNA聚合酶注入疏水性微流体流动聚焦装置中，并在形成稳定的单分散琼脂糖液滴流后从流动聚焦连接处进行收集。(B)将凝固的琼脂糖珠粒与IVTT混合物一起再注入第二疏水性微流体装置中。(C)将含有IVTT/DNA的液滴进行第三次也是最后一次再乳化，以产生现在可以进行流式细胞术分析的外部水相。
图9.用于单分散琼脂糖珠粒产生的微流体设置。将微流体装置安装在光倒置显微镜上。在激光切割PMMA支架的顶部将注射泵升高到装置顶部的水平。将管道用于提供玻璃注射器和微制造的微流体系统之间的连接。将微波加热的可商购的加热垫置于琼脂糖注射器的顶部，以防止装置运行期间琼脂糖凝固。随后使用USB连接的电加热垫来维持约40℃的恒定温度。
图10.包含Phi29DNA扩增的质粒DNA的琼脂糖珠粒的分析。(A)芯片上琼脂糖液滴形成的过程，插图表示包含扩增的DNA的凝固琼脂糖珠粒的图示。(B)一旦从乳剂脱离，四幅单独的琼脂糖珠粒图片的直径尺寸分布。(C)于1X TAE缓冲液中的未洗涤的琼脂糖珠粒的明场成像；用荧光双链DNA结合染料孵育的琼脂糖珠粒的荧光成像。
图11.包含Phi29DNA聚合酶扩增的质粒DNA的单分散的1％琼脂糖珠粒的流式细胞术分析。为了允许分析和可视化，在30C孵育后，利用荧光ds-DNA结合对分离的琼脂糖珠粒染色。在每种条件下，已根据泊松统计，对起始DNA溶液进行了统计学稀释以确保每个液滴平均(A)100个、(B)10个、(C)1个或(D)0.1个DNA拷贝(λ值)。
图12.在多分散的大量乳剂中的来自包含Phi29预扩增的SICLOPPS文库质粒DNA的琼脂糖珠粒的体外蛋白质表达。在DNA扩增后，经由在6,500rpm下离心3次来分离和洗涤琼脂糖珠粒。洗涤后，将珠粒重悬成包含PURExpress IVTT组分和QX200油/表面活性剂的溶液，并最后涡旋10-15s以产生多分散的大量乳剂。与利用微流体装置的单分散相反，多分散液滴的产生使得人们能够快速确定所需生化反应的合适条件。因此，在存在预扩增的情况下，GFP介导的来自SICLOPPS质粒(编码SICLOPPS内含肽和GFP)的荧光清晰可见；相比之下，在没有DNA扩增的情况下，没有观察到GFP荧光，因此突出了从单个拷贝扩增对于液滴中IVTT的重要性。在成像之前，将乳剂样品在37C下孵育2小时。
图13.来自于琼脂糖珠粒中的Phi29DNA聚合酶预扩增的SICLOPPS文库质粒DNA的GFP的IVTT。(A)将包含具有平均100个起始DNA拷贝的SICLOPPS质粒DNA和Phi29DNA扩增组分的微流体产生的琼脂糖珠粒在30C孵育16小时，并使用流式细胞术分析。一旦用DNA嵌入染料染色，观察到相比相应的阴性对照，绿色荧光强度信号的明显增加，证明成功的扩增。(B)在IVTT之前，经由在6,500rpm下离心除去扩增缓冲液来洗涤凝固DNA包封的琼脂糖珠粒，并与PURExpressIVTT组分一起注入15x16μm疏水性装置中。在37C下孵育2小时后，使用亲水性装置流式细胞术分析将IVTT液滴再乳化成三乳剂形式。在前向相对于侧向散点图上观察到两个不同的液滴组群，较高的对应于水滴包油包IVTT包琼脂糖。与不存在扩增的DNA和IVTT的对照相比，观察到明显且独特的GFP介导的绿色荧光，其大约是IVTT混合物的背景荧光的10倍。
图14.由SICLOPPS多肽中的断裂内含肽催化的自发多肽环化(A)。由氨基和羧基端内含肽片段形成的活性内含肽(B)使N-内含肽和待环化的肽之间的连接处的氨基酸的酯异构体稳定(C)。来自C-内含肽的杂原子准备攻击酯并产生环酯中间体(D)。内含肽催化的氨基琥珀酰亚胺形成释放环状肽(以内酯形式，未显示)，其自发重排以形成热力学上有利的主链(内酰胺形式)环状肽产物(E)。可以用苏氨酸取代所描述的半胱氨酸中的一个或多个，即可以用醇(OH)基取代巯基。其他杂原子也可以取代所描述的半胱氨酸残基的硫原子，条件是这不会阻止酯中间体的形成、亲核攻击或主链重排。
图15.用于环状肽文库生成的基于pETDuet-1的SICLOPPS载体的构建的图示。pDuetNpu-GFP表达载体的图示；MCS1编码具有Npu内含肽的SICLOPPS，而MCS2编码GFP。“文库”表示文库的可变多核苷酸序列的位置。该序列编码本发明中的环状多肽，包括在第一位置中的亲核氨基酸(例如半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸)。它位于两个内含肽片段之间，因此也可以称为“外显肽”序列，因为其编码在翻译后将从SICLOPPS多肽剪接出的外显肽。
图16.编码体外环化的多肽CLLFVY的pDuetNpu。载体CSpDuetNpuHisCLLFVY在批量形式的IVTT后和FACS分选后的质谱分析。(左)在载体CSpDuetNpuHisCLLFVY存在下组装的标准PURExpress IVTT反应。(右)琼脂糖珠粒中载体CSpDuetNpuHisCLLFVY的预扩增。将包含单克隆扩增的DNA的洗涤过的琼脂糖珠粒与IVTT一起再封装以允许CLLFVY表达，然后进行第三乳化步骤以产生双乳剂FACS相容的液滴。FACS分选的样品从乳剂中脱离，并进行质谱分析。在任何一种情况下，指示环CLLFVY的峰都是明显的。
图17.微流体液滴中与环TAFDR(Matis等人)融合的AB42-GFP的体外表达。载体CSpDuetNpuHisAB42-GFP用于将TAFDR克隆到MCS1中。此后，将质粒DNA与等温DNA扩增反应组分一起封装在琼脂糖液滴中，并孵育过夜。如先前所述准备琼脂糖珠粒，并与IVTT一起重新封装。进行最终的乳化步骤以产生FACS相容的双乳剂。在CA5存在下同样构建阴性对照载体以验证环TAFDR AB42-GFP聚集抑制。相对于仅缓冲液、仅IVTT和环CA5数据，观察到在环TAFDR表达后绿色荧光的正向偏移。
图18.双乳剂液滴中TX4SICLOPPS文库的体外隔离和FACS筛选。包含于MCS1中的NpuHis TX4和于MCS2中的AB42-GFP融合物的pETDuet-1载体的质粒构建。为了在IVTT之前允许单克隆DNA扩增，将质粒DNA与TempliPhi等温DNA扩增组分一起封装在琼脂糖飞升液滴中。将珠粒从乳剂脱离，提取和洗涤水相允许除去扩增缓冲液。接下来将珠粒与PURExpressIVTT系统一起封装在高度单分散的液滴中，然后在37℃下孵育2小时。在蛋白质表达后，将样品转化成双乳剂形式(水包油包IVTT包琼脂糖珠粒)，以允许FACS筛选。鉴定双乳剂组群，并设门以允许文库分类(B)。从乳剂组群中设门选出仅高于IVTT背景的荧光读数，并在FL1-H(GFP,A)上进行分选。仅针对TX4文库样品(橙色线)示出了百分比+ve(潜在的阳性候选肽)和-ve设门的颗粒。
优选实施方案的详述
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与诸如肽化学、微流体、核酸化学、分子遗传学和克隆以及生物化学领域的领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。标准技术用于分子生物学、遗传和生化方法中(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology(1999)4th ed.,John Wiley&Sons,Inc.)，将其通过引用并入本文中。
“线性多肽”是这样的肽，其不是环状形式，并且通常具有包含游离羧基端的羧基端氨基酸和包含游离氨基端的氨基端氨基酸。
如在本文中所使用的，词语“内含肽”意指嵌入在前体蛋白中的天然存在的或人工构建的多肽序列，其可以在蛋白质的翻译后加工期间催化剪接反应。一些已知内含肽的列表发布在http://www.inteins.com上。
“断裂内含肽”是这样的内含肽，其具有两个或更多个彼此不融合的独立组分。
如在本文中所使用的，词语“插入的”或“间插的”意指置于其间。因此，在具有插入第二序列和第三序列之间的第一序列(或具有间插的第一序列的第二序列和第三序列)的多肽中，构成第一序列的氨基酸链实际上位于构成第二序列的氨基酸链和构成第三序列的氨基酸链之间。
相比之下，“环状多肽”是已被“环化”的多肽。术语“环状的”意指具有形成环的构成原子。当提及肽时，术语“环化”意指使肽成为环状或“环化”形式。因此，例如，线性肽在其游离氨基端与其游离羧基端共价结合(即以头对尾形式)时被“环化”，使得肽中不存在游离的羧基端或氨基端。
如在本文中所使用的，词语“自发地”意指所描述的行为在没有添加外源物质的情况下发生。例如，当除了前体多肽或编码前体多肽的核酸分子外没有向宿主系统中添加任何东西时，前体多肽自发地剪接以产生环状肽。相比之下，如果需要与宿主系统无关的试剂来产生环状肽，则宿主系统内的前体多肽不在宿主系统中自发剪接。
如在本文中所使用的，短语“表达载体”意指在合适的体外或体内系统中促进核酸分子的转录和/或翻译的媒介物。当向含有表达载体的宿主系统中添加外源物质导致表达该载体(例如，导致载体内的核酸分子被转录成mRNA)时，表达载体是“可诱导的”。
如在本文中所使用的，短语“调控序列”意指调节核酸分子的表达(例如，转录)的核苷酸序列。例如，启动子和增强子是调控序列。
本发明带来了新的特征和伴随的优势，其可以结合通过与其编码多肽共同隔离而可鉴定标记的多肽(特别地，环状多肽)的产生更详细地解释。特别地，本发明提供对遗传文库进行功能测定的新的手段，这是通过已知遗传文库无法实现的。现有技术文库，如噬菌体展示文库，与基于亲和力的测定相容，但不能有效地与功能测定配合。大多数药物测定都是功能性的，部分原因是功能测定提供了比亲和力测定更准确的生物(或生理)活性指示。因此，存在对这样的技术的未满足的需求，即将遗传文库的多样性和高通量以及与功能测定配合的灵活性相组合的技术。
4.1隔室
在第一个方面，本发明涉及在隔室内表达环状多肽的方法，其包括形成含有多核苷酸的隔室的步骤，所述多核苷酸包含编码环状多肽的序列。
隔室由物理边界组成，其划定了与外部环境分开的内部容积。在实施方案中，隔室是基本上球形的。隔室可以是于溶液中的颗粒，例如悬浮在溶液中的颗粒，如乳液中的胶体或液滴。
隔室的内部容积必须足以容纳至少一个多核苷酸分子和一个环状多肽。
为了确保多核苷酸和多肽不会在隔室之间扩散，每个隔室的内容物优选与周围隔室的内容物隔开，使得在实验的时间范围内，隔室之间没有或很少有多核苷酸和多肽的交换。
隔室的物理边界可以由任何材料形成，所述材料能够防止封闭的多核苷酸和任何相关的多肽从隔室中排出。隔室可以是半渗透的，从而形成对一种组分如多核苷酸的移动的屏障，同时允许其他组分如缓冲组分或核苷磷酸盐(例如核苷三磷酸)的移动。因此，半渗透隔室的内部可以是热力学开放系统，允许物质和能量穿过其边界，尽管是以选择性的方式。可选地，隔室可以是不可渗透的，从而形成对所有组分、物质和部分(包括介质，如水溶液、水和油)的移动的屏障，尽管仍然能够与外部环境进行能量交换。
隔离是形成隔室的过程。当将实体描述为被隔离的时，这意味着该实体被包含在隔室内。
如在本文中所使用的，术语“隔离”与“封装”同义。因此，术语“隔室”与“胶囊”同义。
本发明的隔室需要适当的物理特性以允许本发明的运作。隔室的形成和组成有利地不会消除用于表达多核苷酸的机构的功能或多肽的活性。适当的系统可以根据本发明的每种应用中的要求的确切性质而变化，这对于技术人员是显而易见的。
合适的隔室和隔室形成材料包括乳剂的液滴、脂质囊泡和微胶囊。
4.1.1隔室尺寸
优选的隔室尺寸将依赖于根据本发明进行的任何单个选择过程的确切要求而变化。在所有情况下，在单个隔室中的基因文库大小、所需的富集和所需的组分浓度之间将存在最佳平衡，以实现多肽的有效表达和反应性。
表达过程发生在通过本发明提供的每个单独隔室内。体外转录和偶联的转录翻译在亚纳摩尔DNA浓度下变得不太有效。由于在每个隔室中仅需要有限数量的DNA分子存在，因此这对可能的隔室尺寸设定了实际的上限。优选地，隔室的平均体积小于5.2x 10-16m3(对应于直径小于10μm，更优选小于6.5x 10-17m3(5μm直径)，更优选约4.2x 10-18m3(2μm直径)，且理想的是约9x 10-18m3(2.6μm直径)的球形隔室。
可以通过本领域技术人员熟知的各种方法人工增加隔室中的有效的DNA或RNA浓度。这些包括例如，添加体积排除化学物质如聚乙二醇(PEG)和各种基因扩增技术，包括使用RNA聚合酶进行转录，所述聚合酶包括来自细菌如大肠杆菌(Roberts,1969；Blattner和Dahlberg,1972；Roberts等人,1975；；Rosenberg等人,1975)、真核生物例如(Weil等人,1979；Manley等人,1983)和噬菌体如T7、T3和SP6(Melton等人,1984)的那些；聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等人,1988)；Qb复制酶扩增(Miele等人,1983；Cahill等人,1991；；Chetverin和Spirin,1995；Katanaev等人,1995)；连接酶链式反应(LCR)(Landegren等人,1988；Barany,1991)；以及自我持续序列复制系统(Fahy等人,1991)和链置换扩增(Walker等人,1992)。如果乳剂和体外转录或偶联的转录-翻译系统是热稳定的(例如，可从热稳定的生物体如水生栖热菌(Thermus aquaticus)制得的偶联的转录-翻译系统)，则可使用需要热循环的基因扩增技术如PCR和LCR。
增加有效的局部核酸浓度使得能够有效地使用更大的隔室。这允许隔室体积的优选实际上限为约5.2x 10-16m3(对应于直径为10μm的球体)。
隔室尺寸优选足够大以容纳在隔室内发生所需的生化反应的所有所需组分。例如，体外转录反应和偶联的转录-翻译反应均需要总核苷三磷酸浓度为约2mM。
例如，为了将基因转录为500个碱基长度的单个短RNA分子，这将需要每个隔室最少500个核苷三磷酸分子(8.33x 10-22摩尔)。为了构成2mM溶液，将该数量的分子包含在体积为4.17x 10-19升(4.17x 10-22m3，如果是球体，则将具有93nm的直径)的隔室内。
此外，特别是在涉及翻译的反应的情况下，应注意发生翻译所必需的核糖体自身直径为约20nm。因此，隔室优选的下限是约0.1μm(100nm)的直径。
因此，隔室体积优选为约5.2x 10-22m3至5.2x 10-16m3，对应于直径为0.1μm-10μm的球体，更优选为约5.2x 10-19m3至6.5x 10-17m3(1μm-5μm)。约2.6μm的球体直径是最有利的。
并非巧合，优选的隔室尺寸(2.6μm平均直径的液滴)与细菌的那些非常相似，例如，埃希氏菌(Escherichia)为1.1-1.5x 2.0-6.0μm的杆菌，固氮菌(Azotobacter)是直径为1.5-2.0μm的卵圆形细胞。以其最简单的形式，达尔文进化论是基于“一种基因型一种表型”的机制。单个隔离基因或基因组的浓度从2μm直径隔室中的0.4nM下降到5μm直径隔室中的25pM。原核转录/翻译机构已经进化到在～1-2μm直径的隔室中操作，其中单个基因处于约纳摩尔浓度。在2.6μm直径的隔室中，单个基因的浓度为0.2nM。该基因浓度足够高以进行有效翻译。在这样的容积中的隔离也确保即使只形成单个分子的多肽，它也以约0.2nM存在。因此，考虑多核苷酸的转录和翻译的需要，选择隔室体积。
可以仅仅通过调整用于形成根据选择系统的要求的乳剂的乳剂条件来改变乳剂隔室的尺寸。隔室尺寸越大，隔离给定多核苷酸文库所需要的体积就越大，这是因为最终限制因素将是隔室的尺寸，因此是每单位体积可能的隔室数量。
选择隔室尺寸不仅考虑转录/翻译系统的要求，而且还考虑用于多核苷酸的选择系统的要求。因此，选择系统的组分如化学修饰系统，可能需要对于转录/翻译不是最佳的反应体积和/或试剂浓度。这样的要求可以通过二次重新封装步骤来提供。最佳隔室体积和试剂浓度的经验确定是优选的。
优选可以在微流体规模上获得隔室。例如，隔室的最大直径(例如图6左上插图的“外径(Od)”)可以不大于100μm。在实施方案中，隔室的最大直径可以是0.1μm至100μm，优选0.5μm至10μm，如0.5μm至5μm，或1.0μm至4μm的直径。在实施方案中，隔室的最大直径可以是0.8μm。在涉及多个隔室的情况下，这些测量值适用于隔室的最大直径的平均值。这可以通过以下方式测定：获得含有隔室的样品的显微照片，测量显微照片中每个隔室的最大直径乘以适当的比例因子，以及确定所采用的测量的平均值。
多种隔离程序是可用的(参见Benita,1996)，并且可用于创建根据本发明使用的隔室。实际上，文献中已确定了超过200种隔离方法(Finch,1993)。
这些包括膜包被的水性囊泡如脂质囊泡(脂质体)(New,1990)和非离子表面活性剂囊泡(van Hal等人,1996)。这些是非共价组装的分子的单个或多个双层的闭膜胶囊，其中每个双层通过水性隔室与其相邻层分开。在脂质体的情况下，膜由脂质分子组成；这些通常是磷脂质，但甾醇类如胆固醇也可以掺入膜中(New,1990)。可以在脂质体内进行多种酶催化的生化反应，包括RNA和DNA聚合(Chakrabarti等人,1994；Oberholzer等人,1995a；Oberholzer等人,1995b；Walde等人,1994；Wick&Luisi,1996)。
对于膜包被的囊泡系统，大部分水相位于囊泡之外，因此是非隔离的。除去这种连续的水相或抑制或破坏其中的生物系统(例如，通过用DNA酶或RNA酶消化核酸)，以使反应限于隔室(Luisi等人,1987)。
也在通过各种其他方法产生的隔室中证明了酶催化的生化反应。许多酶在逆微胞溶液中是有活性的(Bru&Walde,1991；Bru&Walde,1993；Creagh等人,1993；Haber等人,1993；Kumar等人,1989；Luisi&B.,1987；Mao&Walde,1991；Mao等人,1992；Perez等人,1992；Walde等人,1994；Walde等人,1993；Walde等人,1988)，如AOT-异辛烷-水系统(Menger&Yamada,1979)。
也可以通过界面聚合和界面络合产生隔室(Whateley,1996)。这种隔室可以具有刚性的、不可渗透的膜或半渗透膜。以硝酸纤维素膜、聚酰胺膜和脂质-聚酰胺膜为边界的半渗透隔室均可支持生化反应，包括多酶系统(Chang,1987；Chang,1992；Lim,1984)。可以在非常温和的条件下形成的藻酸盐/聚赖氨酸隔室(Lim&Sun,1980)，也被证明是完全生物相容的，这提供了例如封装活细胞和组织的有效方法(Chang,1992；Sun等人,1992)。
4.1.2乳剂
也可以使用基于胶体系统如乳剂中水性环境的相分配的无膜隔离系统。
优选地，本发明的隔室由乳剂形成；两种不混溶液相的异相系统，其中一相以微观或胶体尺寸的液滴分散在另一相中(Becher,1957；Sherman,1968；Lissant,1974；Lissant,1984)。
可由不混溶液体的任何合适组合产生乳剂。优选地，本发明的乳剂具有作为以细分散液滴形式存在的相的水(含有生化组分)(分散的、内部的或不连续的相)，和作为其中悬浮有这些液滴的基质的疏水性的、不混溶的液体(油)(非分散的、连续的或外部的相)。这样的乳剂被称为“油包水”(W/O)。这具有以下优势：含有生化组分的整个水相被隔离在离散的液滴(内相)中。外相，即疏水性油，通常不含生化组分，因此是惰性的。
可以通过添加一种或多种表面活性试剂(表面活性剂)来稳定乳剂。这些表面活性剂被称为乳化剂，并在水/油界面起作用以防止(或至少延迟)相分离。许多油和许多乳化剂可用于生成油包水乳剂；最近的汇编列出了16,000多种表面活性剂，其中许多用作可乳化剂(Ash和Ash,1993)。合适的油包括浅白色矿物油和非离子表面活性剂(Schick,1966)，如脱水山梨糖醇单油酸酯(SpanTM80；ICI)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温TM80；ICI)。
阴离子表面活性剂的使用也可能是有益的。合适的表面活性剂包括胆酸钠和牛磺胆酸钠。特别优选的是脱氧胆酸钠，优选浓度为0.5％w/v或更低。在一些情况下，包含这样的表面活性剂可以增加多核苷酸的表达和/或多肽的活性。向非乳化的反应混合物中添加一些阴离子表面活性剂完全取消了翻译。然而，在乳化过程中，表面活性剂从水相转移到界面中并恢复活性。向待乳化的混合物中添加阴离子表面活性剂确保反应仅在隔离后进行。
乳剂的产生通常需要施加机械能以迫使各相在一起。有多种方法来如此做，其利用多种机械装置，包括搅拌器(如磁力搅拌棒、螺旋桨和涡轮搅拌器、桨叶装置和搅拌器)、均质器(包括转子-定子均质器、高压阀门均质器和喷射均质器)、胶体磨、超声波和‘膜乳化’装置(Becher,1957；Dickinson,1994)。在优选的实施方案中，乳剂由微流体过程产生。最优选地，微流体乳剂基于逐个液滴而获得，一次产生一个液滴。
在油包水乳剂中形成的水性隔室通常是稳定的，隔室之间即使有也只有很少的多核苷酸或多肽的交换。另外，生化反应在乳剂隔室中进行。此外，复杂的生化过程，特别是基因转录和翻译在乳剂隔室中也很活跃。该技术的目的是产生乳液，其体积一直达到数千升的工业规模(Becher,1957；Sherman,1968；Lissant,1974；Lissant,1984)。
在实施方案中，隔室是乳剂的液滴，如初始乳剂的液滴(例如油包水(w/o))。在涉及乳剂的实施方案中，分散(或不连续)相的最外层和连续相之间的界面构成了隔室边界的表面。在实施方案中，液滴是微流体液滴。可以使用微流体装置，如芯片上的微流体装置获得微流体液滴。可以在微流体装置，优选疏水性微流体装置上获得油包水乳剂的微流体液滴。这可以通过使用水相作为第一相(也称为“分散相”或“内相”)和非水相(例如亲脂性的)作为第二相(也称为“连续相”或“外相”)来实现。
也可以在微流体装置上获得“双”乳剂的液滴。例如，可以在微流体装置，优选亲水性微流体装置上获得水包油包水(w/o/w)乳剂的液滴。这可通过使用油包水乳剂作为不连续相和水相流体作为连续相来实现。
因此，双乳剂可分两个阶段生产。首先，获得单乳剂(如油包水)，其次，将单乳剂自乳化以获得双乳剂。第一和第二阶段可以串联进行，例如通过将来自第一微流体装置的输出连接到第二微流体装置的输入。该实例是特别有利的，因为微流体装置可商购获得，因此该方法不需要任何专业设备。可选地，可以收集单乳剂，并且任选地，在第一步骤之后储存，并稍后进行第二步骤。可以使用以所述方式串联操作的三个、四个或更多个微流体装置来获得任意数量的乳剂层。
4.2多核苷酸
在本发明中，在多核苷酸周围形成隔室，或在其形成后将多核苷酸插入隔室中是可取的。本发明的方法需要每个隔室仅有有限数量的多核苷酸。这确保了将单个多核苷酸的多肽与其他多肽分开。因此，多核苷酸和多肽之间的偶联是高度特异性的。富集因子最大，每个隔室平均有一个或更少的多核苷酸，核酸和编码的多肽的活性之间的联系尽可能紧密，因为单个多核苷酸的多肽将与所有其他多核苷酸的产物分开。然而，即使不使用平均每个隔室单个多核苷酸或更少的理论上的最佳情况，每个隔室5、10、50、100个或1000个或更多个多核苷酸的比例也可以在分选大型文库中证明其优势。随后几轮的分选，包括利用不同的多核苷酸分布重新封装，将允许更严格的多核苷酸分选。优选地，每个隔室存在单个多核苷酸或更少。
隔室可含有单个多核苷酸(即单个多核苷酸分子)。可选地，隔室可含有多个多核苷酸(即多于一个多核苷酸分子，例如两个多核苷酸分子)。优选地，当隔室包含多个多核苷酸时，所有那些多核苷酸具有相同的或基本上相同的多核苷酸序列。当隔室中的多个多核苷酸具有基本上相同的序列时，这意指隔室中的一个多核苷酸的序列与同一隔室中的另一个多核苷酸的序列的差异不超过由用于合成多核苷酸的方法的累积误差率所决定的差异。
可以通过在隔离步骤之前适当稀释含有多核苷酸的大量培养基，对隔室中的多核苷酸的数量进行统计学控制。
当隔室是乳剂的液滴时，多核苷酸在乳化之前被包含在不连续相流体中。通过适当稀释不连续相流体来对隔室中的多核苷酸的数量进行统计学控制。例如，可以稀释不连续相流体，使得单个液滴中的多核苷酸的平均数量不大于1。在乳化之后，如此稀释的不连续相将形成乳剂液滴的内部容积，并且因而产生的每个液滴将含有0个或1个多核苷酸。
本发明的多核苷酸编码环状多肽。在表达时，可从多核苷酸产生线性多肽。然后线性多肽可进行环化过程以获得所需的环状多肽。多肽的环化可自发发生，即多肽自环化。最终的环状多肽中的氨基酸序列可能与获得其的线性肽的氨基酸序列不同。例如，环化过程可从线性肽截断一个或多个N端残基。可选地，环化过程可从线性多肽截断一个或多个C端残基。在一些实施方案中，环化过程可从线性多肽的N端和C端截断一个或多个残基。线性多肽也可称为“前环”多肽。环状多肽的序列可以指构成环状多肽的氨基酸序列，或在环化后将被包含在环状多肽中的线性多肽中包含的氨基酸的序列。环状多肽的序列以这样的氨基酸残基起始，其为线性多肽中包含的环状多肽序列的N端残基。在一些实施方案中，环状多肽的序列与线性多肽的序列相同。
编码环状多肽的序列是指编码在环化后将包含在环状多肽中的线性多肽部分的多核苷酸中的核苷酸序列。
多核苷酸是选自以下的分子或构建体：DNA分子、RNA分子、仅由合成的碱基或天然存在的碱基和合成的碱基的混合物组成的部分或完全人工的核酸分子、与多肽连接的以上中的任一种，以及与任何其他分子基团或构建体连接的以上中的任一种。有利地，其他分子基团或构建体可以选自核酸、聚合物质，特别是珠粒，例如聚苯乙烯珠粒，以及磁性或顺磁性物质，如磁性或顺磁性珠粒。多核苷酸在本文中也可以称为“核酸”或“核酸分子”。
多核苷酸的核酸部分可以包含合适的调控序列，如有效表达多肽所需要的那些调控序列，例如启动子、增强子、翻译起始序列、多腺苷酸化序列、剪接位点等。
本发明中的核酸分子包括编码这样的多肽的那些核酸分子，所述多肽具有第一部分的断裂内含肽、第二部分的断裂内含肽和位于第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽之间的靶肽。在本发明的一个实施方案中，核酸分子的表达导致自发剪接以产生环状形式的靶肽的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，核酸分子的表达产生这样的多肽，其是环化形式的靶肽的剪接中间体。
可根据本领域通常已知的制备和操作核酸分子的方法(参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,New York:John Wiley&Sons,1997；Sambrook等人,Molecular Cloning:A laboratory Manual(第2版),Cold Spring Harbor Press,1989)，来制备本发明的核酸。例如，可通过单独制备编码第一部分的断裂内含肽的多核苷酸、编码第二部分的断裂内含肽的多核苷酸和编码靶肽的多核苷酸，来制备本发明中的核酸分子。可将三种多核苷酸连接在一起以形成核酸分子，其编码具有插入在第一部分的断裂内含肽和第二部分的断裂内含肽之间的靶肽的多肽。
可以使用已知的技术人工断裂呈其天然状态的未断裂的内含肽(即作为一个连续的氨基酸链存在的那些内含肽)。例如，可以制备编码这样的内含肽的不同部分的两种或更多种核酸分子，使得其表达产生两种或更多种人工断裂内含肽组分。参见例如，Evans等人,J.Biol.Chem.274:18359,1999；Mills等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3543,1998。可将编码这样的非天然存在的内含肽组分(部分)的核酸用于本发明。编码与相同的前体多肽有效相互作用以产生环状肽或剪接中间体的非天然存在的断裂内含肽部分的那些核酸分子是优选的。
可以衍生出这样的核酸分子的非天然存在的断裂内含肽的实例包括Psp Pol-l(Southworth,M.W.,等人,The EMBO J.17:918,1998)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)RecA内含肽(Lew,B.M.,等人,J.Biol.Chem.273:15887,1998；Shingledecker,K.,等人,Gene 207:187,1998；Mills,K.V.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3543,1998)、Ssp DnaB/Mxe GyrA(Evans,T.C.等人,J.Biol.Chem.274:18359,1999)和Pfu(Otomo等人,Biochemistry 38:16040,1999；Yamazaki等人,J.Am.Chem.Soc.l20:5591,1998)。
在实施方案中，可以通过诸如共价键或非共价键的键将多核苷酸与多核苷酸编码的多肽结合。非共价键的实例包括离子键、氢键和诱导的偶极相互作用(也称为范德华力)。在优选的实施方案中，键是共价的。这可通过上述的mRNA展示方法实现。在该实施方案中，多核苷酸包含3’肽基受体区域，如嘌呤霉素部分或氨基酸部分。当这样的多核苷酸被翻译时，末端的氨酰基转移酶反应产生新生多肽和3’肽基受体区域之间的共价键。在优选的实施方案中，提供了包含与多核苷酸的3’端特异性杂交的5’端和包含肽基受体区域(或部分)的3’端的连接子。
本发明的多核苷酸也可以被修饰或改造以将特定密码子置于其自身的多核苷酸上或在多核苷酸编码的mRNA中的所需的位置。这在这样的实施方案中可能是有用的，其中一些tRNA(具有相应反密码子的那些)已经负载有非天然的，例如非蛋白原性的残基，如下文中更详细描述的(“重新指定的密码子组”)。然而，本发明的多核苷酸中的密码子的操作对于采用这样的非经典的酰基-tRNA的实施方案的功能发挥不是必需的。
4.3表达载体
可以通过将编码靶肽的多核苷酸插入可以促进多核苷酸的表达的任何合适的表达载体中来制备本发明的表达载体。这样的合适的载体包括质粒、噬菌体和病毒载体。大量这些是本领域已知的，并且许多可商购获得或可从科学界获得。本领域技术人员可以基于例如选择的系统类型(例如，体外系统、原核细胞如细菌和真核细胞如酵母或哺乳动物细胞)和选择的表达条件，来选择合适的载体用于特定应用。
本发明中的表达载体可以包括编码靶多肽的一段核苷酸和作为调控或控制载体中的核苷酸序列的表达(例如，转录)的调控域而运行的一段核苷酸。例如，调控域可以是启动子或增强子。
本发明中的表达载体可以包括编码这样的肽的核苷酸序列，所述肽促进针对特定特征筛选环化形式的靶肽或剪接中间体(例如，DNA结合域、亲和标签如几丁质-结合域或生物素标签；有色或发光标签；放射性标签等)，或纯化环化形式的靶肽或剪接中间体(例如，亲和标签如几丁质结合域、生物素标签、有色或发光标签；放射性标签)。
在优选的实施方案中，产生了本发明中的表达载体，其在编码断裂内含肽部分的核酸序列之间及其内具有限制位点，以使得能够克隆大量的环化靶标或剪接中间体。在一些实施方案中，本发明的表达载体可以是可诱导的表达载体，如阿拉伯糖可诱导的载体。诱导物可能够渗透本发明的隔室材料。
4.4多肽
本领域已知几种多肽环化方法。可以在两个侧链之间、在侧链和末端基团(即N端或C端)之间，或在两个末端基团(即“头对尾”或“主链”环化)之间进行多肽环化。可以酶促进行一种这样的侧链对侧链环化的方法。有许多环化肽序列的酶。例如，转谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺侧链和赖氨酸侧链之间的氨基转移酶反应，从而两个侧链之间产生共价异肽键。如果谷氨酰胺和赖氨酸在同一多肽上，则该多肽通过该反应而环化。可以类似地通过酶促，例如通过用枯草杆菌蛋白酶处理进行主链环化。其他非限制性实例是ProcM和PatG。通常，这些方法依赖于多肽中的氨基酸的“前导”序列的存在。前导序列通过与酶特异性相互作用来募集和指导其同源酶的作用。对于特定的前导序列，每种酶可以是特异性的。可以通过操作其编码多核苷酸，例如通过在本领域技术人员的能力范围内的常规分子克隆技术，将特定酶的前导序列添加到本发明的多肽中。
Bashiruddin和Suga,Curr.Op.in Chem.Bio.,vol.24,pp.131–138，特别地，在mRNA展示的上下文中详细论述了大环化的方法，虽然本领域技术人员将熟悉这些方法在mRNA展示技术之外的应用。为了使用翻译机构合成大环肽，最基本的方法是通过半胱氨酸残基之间的二硫键。然而，它们对细胞内环境中还原的敏感性使得它们对于一些应用是不可取的。因此，已经设计了通过简单的化学翻译后修饰而形成用于环化的抗还原的共价键的方法。使用二琥珀酰亚胺基戊二酸酯或使用二溴二甲苯将两个半胱氨酸残基的巯基桥接在N端和赖氨酸侧链之间的两个伯胺的方法已被用于成功产生大环肽。还报道了通过三个半胱氨酸残基的硫醚交联产生二环肽的类似方法(Heinis&Winter,Nat Chem Biol,5(2009),pp.502–507)。这些方法的一个优点是它们适用于标准蛋白原性氨基酸。然而，当在这些文库的随机区域中出现多于两个反应性残基时，交联模式可能变得混乱，从而可能导致难以基于这样的环化方法对选择结果进行去卷积。
技术要求比上述要求更高，但对于大环肽的构建来说更加可靠的方法是基于操纵遗传密码的概念，其被称为遗传密码重编程，其中指定的密码子被空置，然后被重新分配给非蛋白原性氨基酸。迄今已报道了两种主要的方法，它们都使用定制的重构翻译系统。
一种方法在过量的非蛋白原性氨基酸存在下利用氨酰tRNA合成酶的错载特性，产生相应的氨酰tRNA。Szostak等人报道了产生在肽链中含有4-硒酸赖氨酸(4-selenalysine)的肽的方法，接着是硒基的选择性氧化和伴随清除，以产生脱氢丙氨酸残基。然后脱氢丙氨酸通过迈克尔加成与半胱氨酸的巯基反应而形成硫醚键，产生羊毛硫氨酸样大环肽。
另一种方法涉及由Suga等人开发的‘灵活的’tRNA酰化核酶(被称为flexizyme)，其促进了具有几乎无限选择的多种非蛋白原性氨酰tRNA的制备。定制的体外翻译系统与flexizyme的组合(被称为FIT(灵活体外翻译)系统)允许使用能够与其他蛋白原性或非蛋白原性残基交联的非蛋白原性氨基酸进行大环肽的核糖体合成。FIT系统允许多种环化方法，例如，可以通过乙烯基甘氨酸的掺入来合成甲基羊毛硫氨酸样大环肽，所述乙烯基甘氨酸被热异构化成脱氢酪氨酸(dehydrobutyrine)，所述脱氢酪氨酸随后可以与半胱氨酸残基形成硫醚键(Y.Goto,K.Iwasaki,K.Torikai,H.Murakami,H.Suga；Chem Commun(Camb),23(2009),pp.3419–3421)。含有由N端起始氨基酸和下游5-羟色氨酸指定的苄胺基团的肽的翻译是温和氧化大环化形成荧光吲哚连键的独特方法(Y.Yamagishi,H.Ashigai,Y.Goto,H.Murakami,H.Suga；ChemBioChem,10(2009),pp.1469–1472)。此外，也可以通过C端Cys-Pro-HOG(乙醇酸)序列或含有C端Cys-Pro序列的程序化肽基tRNA脱落产生头尾连接的肽的核糖体合成(T.Kawakami,Nat Chem Biol,5(2009),pp.888–890；Y.Ohshiro,ChemBioChem,12(2011),pp.1183–1187；T.J.Kang,Angew Chem Int Ed Engl,50(2011),pp.2159–2161)。在这两种情况下，C端酯键加速N→S迁移的自重排以形成C端二酮哌啶-硫酯，最终产生主链环化的单环或二硫键桥接的二环肽。
最方便和可靠的环化方法是通过利用可与下游半胱氨酸反应的N-氯乙酰基-氨基酸起始子翻译肽(Y.Goto,A.Ohta,Y.Sako,Y.Yamagishi,H.Murakami,H.Suga；ACS ChemBiol,3(2008),pp.120–129)。该方法的优点是在最接近的半胱氨酸残基的N端氯乙酰基和巯基之间形成自发的和选择性的硫醚键。唯一的例外是由于环约束，与N-氯乙酰基-氨基酸相邻的半胱氨酸残基不能与氯乙酰基反应，因此在该位置留下游离的巯基。然而，这种选择性是翻译融合的二环肽的便利方式，所述二环肽在N端和第二个半胱氨酸之间具有硫醚(硫化物)键，以及在第一个和第三个半胱氨酸残基之间具有二硫键。重要的是，已经证明FIT系统促进含有D-氨基酸、N-甲基-氨基酸、N-烷基甘氨酸和具有非经典侧链的肽的翻译。
在其他的方法中，可以通过多肽内的分子内相互作用自发实现多肽环化。这可以例如通过将来源于“内含肽”的序列与所需的环状多肽的融合来实现。
许多制备已知或随机序列的核酸编码肽的方法在本领域中是已知的。例如，可以通过固相合成，使用可商购的设备和试剂以化学方法制备具有预定或随机序列的多核苷酸。聚合酶链式反应也可用于制备已知或随机序列的多核苷酸。参见例如，Ausubel等人，同上。作为另一个实例，限制性内切核酸酶可用于将较大的核酸分子或甚至整个染色体DNA酶促消化成多个较小的多核苷酸片段，其可用于制备本发明的核酸分子。
优选制备编码待环化的肽序列的多核苷酸，使得多核苷酸的一端编码天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸残基，以促进环化反应。出于同样的原因，优选制备编码用于产生剪接中间体的肽序列的多核苷酸，使得末端编码除天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸残基之外的氨基酸，以便防止环化反应。
一旦生成，可使用常规的方法来将编码内含肽部分的核酸分子与编码靶肽(或剪接中间体内的肽)的核酸分子连接，以形成编码具有第一内含肽部分-靶肽-第二内含肽部分顺序的多肽的较大的核酸分子。参见例如，Ausubel等人，同上。
4.4.1 SICLOPPS
已利用断裂内含肽的反式剪接能力，以开发产生环状肽和展示环形构象的肽的剪接中间体的一般方法(PCT/US1999/030162)。在该方法中，将靶肽插入前体多肽中的断裂内含肽的两个部分之间。断裂内含肽的两个部分物理结合在一起，以形成这样的活性内含肽，其构象也迫使靶肽成为环形构型。在这种构型中，一个内含肽部分(例如，IN)和靶肽之间的连接处的氨基酸的酯异构体是稳定的，使得来自内含肽的另一部分(例如，IC)的杂原子然后可以与酯反应以形成环酯中间体。然后活性内含肽催化氨基琥珀酰亚胺的形成，其释放出环化形式的靶肽(即内酯形式)，所述靶肽然后自发重排以形成热力学上有利的主链环状肽产物(即内酰胺形式)。
通过在释放环状肽之前在给定点处阻止反应，可以产生带有环形构型的靶肽的剪接中间体。为了产生这样的肽，可以构建编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽具有插入在两个内含肽部分之间的靶肽序列。将这些构建体引入表达载体中提供了在适当的表达系统中产生多肽的方法，其中多肽可以被剪接成环状肽或剪接中间体。使用该方法，可以制备几种不同的环状肽或剪接中间体，以产生可以针对特定的特征进行筛选的环化的或部分环化的肽的文库。
内含肽是一段这样的蛋白质，其能够自身切除并且在称为“蛋白质剪接”的过程中利用肽键连接剩余的部分(外显肽)。内含肽介导的蛋白质剪接在含内含肽的mRNA翻译成蛋白质后发生。该前体蛋白包含三个区段：N-外显肽，接着是内含肽，接着是C-外显肽。剪接发生后，所得蛋白质包含与C-外显肽连接的N-外显肽。有时，前体蛋白的内含肽来自两个基因。在这种情况下，内含肽被称为断裂内含肽。由一个基因编码的内含肽部分(或片段)与由另一个基因编码的内含肽片段相互作用，以产生具有催化活性的内含肽，其进行自身切除并将来自两个基因的外显子剪接在一起。
如果两个断裂内含肽片段反而被置于间插多肽序列的对端上，则剪接和切除的过程产生具有原始间插多肽的序列的环状多肽。这可通过常规的分子遗传技术，例如通过将编码两个互补断裂内含肽片段的序列克隆到具有编码所需环状多肽的序列的载体中来实现。三条多核苷酸序列被排列在载体中，使得在表达后，获得具有N端内含肽片段，接着是环状多肽序列，接着是C端内含肽片段的多肽，所述N端和C端内含肽片段能够结合形成功能内含肽，其随后催化产生环状多肽的剪接反应。换言之，多核苷酸包含编码N端内含肽片段的序列，接着是编码环状多肽序列的序列，接着是编码C端内含肽片段的序列。该过程被称为肽和蛋白质的断裂-内含肽环化连接(SICLOPPS)。
来自多核苷酸的表达可以是来自多核苷酸的多肽的表达。来自多核苷酸的表达也可以是来自第一多核苷酸的第二多核苷酸的表达。例如，可以通过合适的RNA聚合酶经转录过程从DNA多核苷酸表达RNA多核苷酸。可以通过合适的核糖体经翻译过程从RNA多核苷酸表达多肽。在一些用途中，来自多核苷酸的表达是指从其编码遗传物质最终表达多肽，即转录为RNA和翻译为多肽。从上下文中预期用途将变得清晰。
一种合适的断裂内含肽是来自dnaE的Npu断裂内含肽。根据本发明的包含Npu断裂内含肽的多肽的实例可以具有以下序列：
HHHHHHGENLYFKLQAMGMIKIATRKYLGKQNVYDIGVERYHNFALKNGFIASNX～～～～～CLSYDTEILTVEYGILPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGCLIRATKDHKFMTVDGQMMPIDEIFERELDLMRVDNLPNGTAANDENYALAA
其中X～～～～～是产生的环状肽；X是C、S、T或任何其他的氨基酸，且“～”表示环状肽序列的氨基酸。对本领域技术人员显而易见的是，可以在上述序列中的“X”后插入任何序列。序列的长度可以是一个或多个氨基酸，在实施方案中，长度为至少3个或更多个氨基酸长度，优选长度为至少6个氨基酸。
上述序列包含以下组成部分：
1：
HHHHHH
任选的六组氨酸标签以帮助纯化，例如在镍-NTA柱上。设想了其他的纯化系统，如“FLAG-TAG”，在这种情况下六组氨酸被适当的标签序列取代。
2：
GENLYFKLQAMGMIKIATRKYLGKQNVYDIGVERYHNFALKNGFIASN
含有C端内含肽片段。
3：
X～～～～～
环状多肽序列。
4：
CLSYDTEILTVEYGILPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGCLIRATKDHKFMTVDGQMMPIDEIFERELDLMRVDNLPNGTAANDENYALAA
含有N端内含肽片段。
4.5修饰隔室内容物
4.5.1体外转录和翻译
为了将环状多肽与其编码多核苷酸共同隔离，也可将从多核苷酸表达多肽的手段包封在隔室内。这样的手段可包括体外转录和翻译(IVTT)系统。IVTT系统可包括例如RNA聚合酶、核糖体、核苷酸磷酸盐(酯)、负载氨基酸的tRNA和翻译因子，如起始和延长因子。合适的体外转录/翻译试剂是本领域熟知的(例如Isalan,M等人(2005)PLoS Biol.3e64)。因此，隔室中多核苷酸的表达将多肽和多核苷酸共定位。当隔室为乳剂液滴时，这可通过在乳化前将IVTT组分包括在不连续的(或分散的或内部的)相流体中来实现。
此外，可以将预先荷载有所需的非蛋白原性氨基酸(或羟基酸)(即，具有连接于其上的活化氨基酸)的酰化的tRNA，添加到仅包含有限天然氨基酸的重构无细胞翻译(IVTT)系统中。通过将排除的天然氨基酸的密码子与用非蛋白原性氨基酸(或羟基酸)酰化的tRNA的反密码子相关联，可以基于本发明的多核苷酸所编码的或构成本发明的多核苷酸的mRNA的遗传信息，通过核糖体上的翻译来合成含有非蛋白原性氨基酸(或羟基酸)的肽。可选地，也可以通过向不含天然氨基酸的重构无细胞翻译系统添加荷载有非蛋白原性氨基酸(或羟基酸)的仅酰化的tRNA，来翻译合成不含天然氨基酸的肽。
可以通过使用能够催化氨酰tRNA合成的人工RNA催化剂“flexizyme”，制备荷载有非蛋白原性氨基酸(或羟基酸)的酰化的tRNA。如上所述，这些人工RNA催化剂能够荷载具有任何侧链的氨基酸，并且还具有仅识别tRNA的3’端的共有序列5'-RCC-3'(R＝A或G)以酰化tRNA的3’端的功能，因此，它们可以作用于具有不同反密码子的任何tRNA。此外，flexizyme不仅可以使tRNA荷载L-氨基酸，而且还可以使其荷载羟基酸(在α位具有羟基)、N-甲基氨基酸(在α位具有N-甲基氨基酸)、N-酰基氨基酸(在α位具有N-酰氨基)、D-氨基酸等。详细的描述可见于Y.Goto,H.Suga(2009)“Translation initiation with initiator tRNAcharged with exotic peptidess”Journal of the American Chemical Society,Vol.131,No.14,5040-5041；WO2008/059823，标题为“在N-端具有非天然结构的多肽的翻译和合成及其应用(TRANSLATION AND SYNTHESIS OFPOLYPEPTIDE HAVING NONNATIVESTRUCTURE AT N-TERMINUS AND APPLICATION THEREOF)”；Goto等人,ACS Chem.Biol.,2008,3,120-129；WO2008/117833，标题为“合成环状肽化合物的过程(PROCESS FORSYNTHESIZING CYCLIC PEPTIDE COMPOUND)”等，以上的全部内容通过引用并入本文中。
可以通过flexizyme连接到tRNA的其他非天然氨基酸包括具有各种侧链的氨基酸、β(beta)-氨基酸、γ(gamma)-氨基酸和δ(delta)-氨基酸、D-氨基酸，以及具有其中氨基酸主链上的氨基或羧基被取代的结构的衍生物。此外，通过掺入非天然氨基酸获得的不寻常肽可具有除正常酰胺键之外的主链结构。例如，不寻常肽还包括由氨基酸和羟基酸组成的缩酚肽、通过羟基酸的连续缩合产生的聚酯、通过引入N-甲基氨基酸在酰胺键的氮原子处甲基化的肽，和N端具有各种酰基(乙酰基、焦谷氨酸、脂肪酸等)的肽。此外，也可以合成通过环化非环状肽获得的环状肽(或者如果使用N-甲基肽，则可以获得环状N-甲基肽)，所述非环状肽由在对端携带一对能够在其间形成键的功能基团的氨基酸序列组成。可以在具有一对一些功能基团的无细胞翻译(IVTT)系统的条件下发生环化，如通过经硫醚键环化的环状肽所例示的，所述环状肽通过在对端携带氯乙酰基和半胱氨酸基团的肽序列的翻译/合成而获得。
4.5.2多核苷酸扩增
从单个多核苷酸产生足够的多肽以在随后的测定中获得可检测的信号可能是困难的。在实施方案中，在隔室内产生了多核苷酸的多个拷贝。这可以通过扩增过程如通过聚合酶链式反应(PCR)，或通过使用Phi29聚合酶实现。如果扩增过程的组分与多核苷酸一起包含在隔室内，则可以通过使隔室经受必要的扩增条件，如在加热下进行热循环或孵育来进行扩增。因此隔室成为独立的微反应器，其方式类似于上面关于多核苷酸的转录和翻译所述的方式。由于隔室形成了多核苷酸移动的屏障，所以扩增的多核苷酸的所有拷贝都包含在该隔室中并被隔离。因此，隔室成为单克隆单元，即多核苷酸的相同或基本相同的拷贝的共定位单元。
当隔室是乳剂的液滴时，这是通过在乳化之前将扩增反应的组分包含在不连续相流体中来实现的。然后可以使乳剂经受扩增至所需拷贝数所必需的条件。
可以选择或设计PCR引物以扩增完整的所需多核苷酸序列(“扩增子”)。例如，可以将一条引物设计为与模板链上的所需序列的起始部分退火，并且可以将第二条引物设计为与编码链上的所需序列的起始部分退火。
当多核苷酸编码SICLOPPS自剪接多肽时，例如，第一引物可以与编码模板(或反义)链上的N端内含肽片段的序列退火，并且第二引物可以与编码编码(或有义)链上的C端内含肽片段的序列退火。
可选地，可以选择或设计载体以含有用于与引物退火的特定序列。例如，可以在载体的模板链上的所需序列之后(即在模板链上的所需序列的3’端之后)插入与第一引物互补的序列，并且可以在载体的编码链上的所需序列之后(即在编码链上的所需序列的3’端之后)插入与第二引物互补的序列。当待扩增的所需序列未知时，如当将随机化的多核苷酸插入载体中以构建遗传文库时，此选择特别合适。在这种情况下，可以在翻译扩增的具有特定性质的多核苷酸后，选择或设计引物以产生多肽序列。例如，可以设计一条引物以编码N端谷氨酰胺供体序列Ala-Leu-Gln，并且可以设计第二引物以编码C端区域赖氨酸作为转谷氨酰胺酶的底物。
优选地，扩增试剂是等温扩增试剂。琼脂糖凝胶中的等温扩增的技术是本领域公知的，并且包括利用Phi29DNA聚合酶多重引发的RCA，其产生含有扩增的多核苷酸拷贝的高分子量(>40kb)和超支化产物。(Michikawa,Y等人(2008).Anal.Biochem.,383,151-158)。扩增的DNA，尤其是超支化扩增的DNA，不能从珠粒基质扩散出来。
当多核苷酸和编码的产物保持共定位而没有隔离时，珠粒可以与水性表达溶液接触而不会乳化。多核苷酸和编码的产物保持共定位的能力取决于编码的产物的浓度和生物物理性质(例如尺寸)。
在实施方案中，通过Phi29DNA聚合酶扩增多核苷酸。在这些实施方案中，引物可以是随机引物，如具有6个核苷酸的随机序列的多核苷酸六聚体。可选地，可以以与上述PCR所述类似的方式设计或选择引物。通过Phi29系统扩增的一个优势是不需要热循环；可以通过简单地孵育反应混合物经Phi29进行扩增。
在实施方案中，通过将隔室孵育1小时或更长来进行Phi29扩增。优选地，扩增进行8小时或更长。最优选的，扩增进行16小时或更长。Phi29扩增反应的孵育也可以进行1天、2天或3天或更多天。
在实施方案中，可以在环境条件下进行Phi29扩增的孵育。可选地，可以在20C-50C加热下，最优选在30C-40C，例如在37C下孵育Phi29扩增。
然而，进行扩增反应所需的条件可能与IVTT不相容。因此，为了在隔室内对扩增的多核苷酸进行IVTT，有时需要操纵隔室以在扩增完成后改变内部环境。本领域中的方法，如Brouzes等人(PNAS,2009,106:34,pp.14195-14200)，通过液滴合并的过程改变微流体液滴中的条件。然而，液滴合并是一项技术上具有挑战性的过程，需要专业的设备和知识来以任何程度的可靠性进行。
4.5.3凝胶转移
在实施方案中，本发明以WO 2012/156744 A2的方式通过在隔室内采用凝胶形成材料来避免与液滴合并相关的缺点。可以使凝胶形成材料经历从液相到固相或凝胶相的可逆转变，以固定扩增的多核苷酸。当凝胶在隔室中固化时，它可以形成含有固定的多核苷酸的珠粒。然后可以破坏隔室而不影响捕获在凝胶中的扩增的多核苷酸的单克隆完整性。
破坏隔室的过程将根据所使用的隔室材料而不同。在一些实施方案中，可以将脱乳化剂(例如弱的表面活性剂)添加到乳剂中以分离各相并移出含有珠粒的水相。脱乳化剂与表面活性剂在油/水界面处竞争并造成其崩解；这也被称为“破乳”。合适的弱表面活性剂包括全氟辛醇(PFO)和其他具有小亲水基团的含氟化合物(如果使用氟化油)，或含有SDS和Triton的缓冲液和其他的在一侧具有碳链且在另一侧具有小亲水基团的化合物(如果使用矿物油)。可以将脱乳化剂添加到乳剂中，并搅拌混合物，例如用移液器。
在其他的实施方案中，可以对乳剂离心以分离各相，并移出含有珠粒的水相。用于胶珠的再乳化的合适技术是本领域已知的(Abate,A.R.等人(2009)Lab Chip,9,2628-2631)。
在脱乳化之后，可以分离和/或洗涤珠粒以除去缓冲液和其他试剂。可以使用标准技术通过离心或过滤来分离和/或洗涤珠粒。
洗涤后，可以立即对珠粒进行本文中描述的方法中的其他步骤，或者可以将珠粒储存，例如在室温下或通过冷藏或冷冻(优选在甘油存在下)对珠粒进行储存。在珠粒含有活细胞的实施方案中，可以根据已知技术，在冷冻前用防腐剂如甘油处理珠粒。
去隔离的(decompartmentalised)胶珠是多孔的，并且可以通过将其悬浮在不同的介质中而改变凝胶的内部条件。因此，可以从进行PCR的条件移出珠粒，并转移到适于进行IVTT而不损失单克隆性的条件。然后，珠粒内的环境将适合于多核苷酸的IVTT。
凝胶形成剂是这样的试剂，例如聚合物如多糖或多肽，其可以从液体凝固成凝胶，例如通过改变条件，如加热、冷却或改变pH。
合适的凝胶形成剂包括藻酸盐、明胶和琼脂糖以及具有足够流动性以移动通过微流体装置的通道的溶胶相的其它凝胶。优选采用琼脂糖，其是由二糖(D-半乳糖和3,6-酐-L-吡喃半乳糖)的重复单元组成的线性聚合物。可以通过任何方便的方法，例如通过改变条件，将凝胶形成剂凝固成珠粒。优选地，通过改变温度，例如通过冷却，将水凝胶形成剂凝固。透明质酸是另一种凝胶形成剂，其可以用在本发明中。
在优选的实施方案中，可以通过将凝胶冷却至低于其相变(或转变)温度，诱导该凝胶经历从其液体形式到其固体形式的相变。例如，当试剂是琼脂糖时，可以通过降低温度，例如低于25℃、低于20℃或低于15℃，来将其凝固。精确的胶凝温度取决于琼脂糖的类型及其浓度，并且可以由技术人员容易地确定。例如，0.5％-2％的超低熔点琼脂糖类型IX-A(Sigma)具有约17℃的胶凝点。
隔室内试剂的凝固将凝固的凝胶模塑成珠粒。凝固的珠粒的组群可以是单分散的。可以通过任何方便的方法将编码的产物保留在珠粒中。例如，可以通过包埋在凝胶基质内或通过与保留剂或凝胶基质自身的共价或非共价结合来将产物保留在珠粒中。
可凭借分子大小将诸如多肽和多核苷酸的分子保留在珠粒中。例如，大于阈值大小的分子可能不能通过凝胶中的孔扩散出珠粒，因此可以被捕获在珠粒的凝胶基质中。例如，可以将诸如质粒和扩增的多核苷酸拷贝的多核苷酸保留在珠粒中。在一些实施方案中，凝胶可以保留具有50nm或更大的直径的颗粒，尽管精确的阈值取决于多种因素，包括凝胶的类型及其浓度。
在一些实施方案中，其中胶珠在乳化后凝固的水溶液，例如包含水凝胶形成剂的溶液，如上述水性表达和/或扩增溶液，还可包含一种或多种保留剂，以减少或防止多核苷酸或编码的产物例如通过与多核苷酸或编码的产物结合而从珠粒扩散。
在其他的实施方案中，可以通过直接结合水凝胶支架来保留隔室组分如底物和编码的产物。例如，可将支架改造成含有结合液滴组分并将其保留在珠粒中的一个或多个结合位点。
在其他的实施方案中，可将多核苷酸和/或编码的产物足够地保留在珠粒中，而不需要结合保留剂或凝胶支架。
可以在破坏隔室前的任何阶段将凝胶形成剂掺入到隔室中。
4.6文库
可以产生隔室中的遗传标记的环状肽文库。可以将所需长度的随机化的多核苷酸克隆到载体中用于扩增和表达，然后以单拷贝隔离载体，例如通过上述方法。例如，图15中描绘的载体具有标记为“文库”的部分，这是该实施方案中随机化的多核苷酸的位置。
插入载体中的随机化多核苷酸的长度将取决于可由技术人员确定的各种因素。首要的考虑是表达的最终多肽的尺寸。在优选的实施方案中，多肽的长度是6个氨基酸。因此，合适的随机化多核苷酸的长度将是18个核酸。对于环状肽形成，必须考虑多肽的长度是否足以允许进行环化反应，即长度是否允许形成闭合的肽环。在实施方案中，通过任何长度的连接子来环化肽。因此，可以通过编码仅两个氨基酸来获得环状多肽，在这种情况下随机化多核苷酸的长度将是至少6个核酸。另一个考虑是载体和相应的复制系统所容纳的最大插入物大小。在实施方案中，随机化序列可以更长，例如，至少9、30、60、90、180、300、600、900、1,800、3,000个或更多个核酸的长度。在优选的实施方案中，随机化核苷酸序列的长度是6、9、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸。尽管随机化序列旨在编码多肽，但其长度可以不必是3的倍数。例如，其长度可以是7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28或29个核苷酸。随机化多核苷酸序列在本文中也可以称为可变序列。在实施方案中，可以实际上固定“随机”或“可变”序列的一个或多个位置。例如，在通过SICLOPPS方法实现环化的实施方案中，第一部分可被不变的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基占据，接着是可变或随机的氨基酸序列。
还应当理解，本发明的文库可以包含具有不同长度的随机化序列的成员。例如，一定比例的文库成员可以包括9个核苷酸长度的随机化序列，并且另一比例的相同文库的成员可以包括19个核苷酸长度的随机化序列。在相同文库中可以存在任何数量的不同长度。
然后，每个单独的隔室可以用作用于扩增的微反应器，例如通过在隔离之前在载体介质中包括用于Phi29扩增的组分。在利用凝胶的实施方案中，隔室经受导致凝胶凝固的条件，此时隔室可能被破坏并且对于IVTT，介质条件发生了改变。任选地再隔离胶珠，并且每个珠粒现在用作其固定的多核苷酸的IVTT的微反应器。因此获得了文库。在IVTT的同时或之后，可以将进行选择方案所需的一些或全部组分引入到珠粒和/或胶囊中。
可以通过采用以上在本发明的隔室和凝胶转移方案中描述的mRNA展示技术，进一步加强多肽和编码的多核苷酸之间的结合的完整性。在该实施方案中，对多核苷酸结构化，使得其通过翻译过程与产生的多肽关联。例如，多核苷酸的3’端可包含肽基受体区域，如嘌呤霉素部分或氨基酸部分。
应理解，本文中描述的展示技术(例如，mRNA展示、噬菌体展示、隔离的随机化多核苷酸)不一定是相互排斥的，并且可以在相同的实施方案中一起实施。例如，本发明的多核苷酸可编码SICLOPPS多肽，同时还包含肽基受体区域，其在多核苷酸翻译结束时与新生肽形成共价键。
此外，通过任何本文中描述的方法隔离mRNA文库允许对mRNA文库进行功能测定，从而克服mRNA展示技术的一个主要缺陷。
4.7选择
可以通过使本发明的文库经受测定的条件来筛选文库，每个珠粒或隔室因而具有测定的阳性或阴性结果的性质(视情况而定)。然后可基于该性质选择珠粒或隔室。例如，可以通过FACS/FADS选择荧光信号。
本文公开的所有的报告子、标记物和标签均可用于本文公开的任何实施方案中。
4.7.1亲和力选择
在对特定配体具有亲和力的多肽进行选择的情况下，可以经配体在微胶囊中将多核苷酸与多肽连接。例如，可以将配体与多核苷酸共价连接，如通过配体和多核苷酸的3’-OH或5’-磷酸之间的反应。如在本文中所使用的，“配体”可以指结合另一个实体或可以被另一个实体结合的任何实体。例如，配体可以是包含受体结合位点的另一多肽。以这种形式，基于本发明的肽与配体多肽相互作用的强度，理想地经所述受体结合位点，来选择本发明的肽。可选地，配体可以是小分子、其他的多核苷酸(例如适配子)，或宏观尺度的物理结构，如聚苯乙烯珠粒或磁珠。这些实例不旨在是限制性的。
只有对配体具有亲和力的多肽才会与多核苷酸结合，并且只有那些经配体与多肽结合的多核苷酸才能获得改变的光学性质，使其能够在选择步骤中被保留。在该实施方案中，多核苷酸因此包含编码与多肽的配体连接的多肽的核酸。
在多肽与配体结合后可以以多种方式诱导多核苷酸的光学性质的改变，包括：
(1)多肽自身可以具有独特的光学性质，例如，其为发荧光的(例如绿色荧光蛋白(Lorenz等人,1991))。
(2)多肽的光学性质可以在与配体结合时被修饰，例如，多肽的荧光在结合时被猝灭或增强(Guixe等人,1998；Qi和Grabowski,1998)
(3)配体的光学性质可以在与多肽结合时被修饰，例如，配体的荧光在结合时被猝灭或增强(Voss,1993；Masui和Kuramitsu,1998)。
(4)配体和多肽的光学性质均在结合时被修饰，例如，可能存在从配体至多肽(或反之亦然)的荧光共振能量转移(FRET)，导致在“供体”吸收波长处激发时，在“受体”发射波长处发射(Heim&Tsien,1996；Mahajan等人,1998；Miyawaki等人,1997)。
在该实施方案中，不需要经配体将多肽与多核苷酸结合以直接诱导光学性质的改变。所有要被选择的多肽都可以包含要选择的假定结合域，和共同特征-标签。每个微胶囊中的多核苷酸与配体物理连接。如果从多核苷酸产生的多肽对配体具有亲和力，则它将与其结合并与编码它的相同多核苷酸物理连接，导致多核苷酸被“标记”。
在反应结束时，可以组合所有微胶囊，并且在一个环境中将所有多核苷酸和多肽汇集在一起。可以通过添加试剂来选择编码表现出所需结合的多肽的多核苷酸，所述试剂与“标签”特异性结合或特异性反应，从而诱导多核苷酸的光学性质的改变，允许其分选。例如，可以使用荧光标记的抗“标签”抗体，或抗“标签”抗体，接着结合第一抗体的第二荧光标记的抗体。
在可选的实施方案中，可以基于以下事实来分选多核苷酸：结合配体的多肽仅仅使配体躲避例如另外的结合伴侣，否则其会改变多核苷酸的光学性质。在这种情况下，具有未修改的光学性质的多核苷酸将被选择。
在可选的实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中多肽与编码其的多核苷酸结合。然后，由于配体与具有所需结合活性的多肽的结合，而分选多肽以及连接的核苷酸。例如，所有多肽可以含有与多核苷酸共价或非共价结合的不变区域，和多样化的以产生所需结合活性的第二区域。
在可选的实施方案中，多肽的配体本身由多核苷酸编码，并且结合多核苷酸。换言之，多核苷酸编码两种(或实际上更多种)多肽，其中至少一种结合多核苷酸，并且可以潜在地彼此结合。只有当多肽在隔室中相互作用时，多核苷酸才会以最终导致其光学性质发生变化的方式进行修饰，从而使其能被分选。该实施方案例如用于在基因文库中搜索编码彼此结合的蛋白质对的基因对。也可以由单个多核苷酸编码单个多肽。
可以通过使用Tyramide信号放大(TSATM)进行放大来增强荧光，以使多核苷酸发荧光。这涉及过氧化物酶(与另一种蛋白质连接)，所述过氧化物酶与多核苷酸结合，并催化荧光素-酪胺转化为自由基形式，其然后与多核苷酸反应(局部)。进行TSA的方法是本领域已知的，并且可从NEN商购获得试剂盒。
TSA可以配置为使得其引起多核苷酸的荧光的直接增加，或使得配体与被第二荧光分子结合的多核苷酸或其中的一种或多种发荧光的分子的序列连接。
4.7.2催化作用选择
当选择催化作用时，每个微胶囊中的多核苷酸可包含反应底物。如果多核苷酸编码能够用作催化剂的多肽，则多肽将催化底物转化为产物。因此，在反应结束时，多核苷酸与催化反应的产物物理连接起。
在一些情况下，底物并不是多核苷酸的组分也可能是可取的。在这种情况下，底物会含有无活性的“标签”，其需要另外的步骤来活化它，如光活化(例如“笼蔽的”生物素类似物(Sundberg等人,1995；Pirrung和Huang,1996))。然后，待选择的催化剂将底物转化为产物。然后活化“标签”，并且“标记的”底物和/或被标签结合分子(例如亲和素或链霉亲和素)结合的产物与核酸络合。因此，底物与经“标签”与核酸连接的产物的比率将反映溶液中底物和产物的比例。
可以通过以下任一方法对连接了产物且编码具有所需催化活性的多肽的多核苷酸的光学性质进行修改：(1)在底物-多核苷酸复合物中未发现具有特征性光学性质的产物-多核苷酸复合物，这是由于例如：
(a)底物和产物具有不同的光学性质(许多荧光酶底物可商购获得(参见例如Haugland,1996)，包括糖苷酶、磷酸酯酶、肽酶和蛋白酶的底物(Craig等人,1995；Huang等人,1992；Brynes等人,1982；Jones等人,1997；Matayoshi等人,1990；Wang等人,1990))，或
(b)底物和产物具有相似的光学性质，但仅产物而非底物与多核苷酸结合或反应；
(2)添加与产物特异性结合或反应并因而诱导多核苷酸的光学性质改变的试剂，允许其分选(这些试剂可以在破坏隔室和汇集多核苷酸之前或之后添加)。所述试剂：
(a)与产物而非底物特异性结合或特异性反应，如果底物和产物均与多核苷酸连接，或者
(b)任选地结合底物和产物，如果仅产物而非底物与多核苷酸结合或反应。
然后可以通过选择具有修改的光学性质的多核苷酸，来富集编码催化分子的汇集的多核苷酸。
一种替代选择是将核酸与产物特异性抗体(或其他产物特异性分子)偶联。在这种模式下，在每个隔室中存在的底物(或底物中的一种)不与多核苷酸连接，但具有分子“标签”(例如生物素、DIG或DNP或荧光基团)。当待选择的催化剂将底物转化为产物时，产物保留“标签”，然后被产物特异性抗体捕获在微胶囊中。以这种方式，仅当多核苷酸编码或产生能够将底物转化为产物的酶时，该多核苷酸才与“标签”结合。当所有反应停止时，编码活性酶的多核苷酸将被“标记”，并可能已经具有改变的光学性质，例如，如果“标签”为荧光基团。可选地，可以通过添加结合“标签”的荧光标记的配体(例如荧光标记的亲和素/链霉亲和素——一种发荧光的抗“标记”抗体，或可通过第二荧光标记的抗体检测的非荧光的抗“标签”抗体)，来诱导“标记的”基因的光学性质的改变。
可选地，可以通过将第一反应与在同一隔室中发生的后续反应偶联来间接地进行选择。有两种通用的方式可进行这种选择。在第一实施方案中，第一反应的产物与不与第一反应的底物反应的分子反应或被其结合。第二偶联反应仅在第一反应的产物存在下进行。然后可以通过使用第二反应的产物的性质来纯化编码具有所需活性的多肽的多核苷酸，以诱导如上所述的多核苷酸的光学性质的改变。
可选地，选择的反应产物可以是第二酶催化的反应的底物或辅因子。催化第二反应的酶可以在微胶囊中原位翻译或在隔离之前掺入反应混合物中。只有当第一反应进行时，偶联的酶才会产生可用于诱导如上所述的多核苷酸的光学性质的改变的产物。
该偶联概念可被阐述为掺入多种酶，每种酶使用先前反应的产物作为底物。这允许选择不与固定的底物反应的酶。如果一个反应的产物是产生可选择的产物的第二反应或系列反应的催化剂或辅因子，则其也可以被设计成通过信号放大来给出增加的灵敏度(例如，参见Johannsson和Bates,1988；Johannsson,1991)。此外，酶级联系统可以基于酶的活化剂的产生或酶抑制剂的破坏(参见Mize等人,1989)。偶联还具有共同的选择系统可以用于产生相同产物的整组酶的优点，并且允许选择不能在单个步骤中进行的复杂化学转化。
因此，这样的偶联方法使得能够以逐步的方式演化新的体外“代谢途径”，首先选择和改进一个步骤然后进行下一步骤。选择策略基于途径的最终产物，使得所有较早的步骤可以独立地或顺序地演化，而不为反应的每个步骤建立新的选择系统。
以可选的方式表示，提供了分离一种或多种编码具有所需催化活性的多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：
(1)表达多核苷酸以产生其相应的多肽；
(2)允许多肽催化底物转化为产物，其根据所需的活性可以为或可以不为直接可选择的；
(3)任选地将第一反应与一个或多个随后的反应偶联，每个反应被先前的反应产物调节，并引起产生最终的可选择的产物；
(4)通过以下任一方式将催化作用的可选择的产物与多核苷酸连接：
a)以这样的方式将底物与多核苷酸偶联，其使得产物保持与多核苷酸结合，或
b)通过与保持在产物上的底物连接的合适的分子“标签”的方式，使可选择的产物与多核苷酸反应或结合，或
c)通过产物特异性的反应或与产物的相互作用的方式，使可选择的产物(但非底物)与多核苷酸偶联；以及
(5)通过其特征性光学性质的方式，或通过添加与产物特异性结合或特异性反应并从而诱导多核苷酸的光学性质的改变的试剂来选择催化作用的产物，以及其所结合的多核苷酸，其中步骤(1)-(4)每个多核苷酸和相应的多肽被包含在微胶囊中。
也可以利用多肽和反向的底物/抑制剂/产物/试剂的作用进行本文中描述的所有催化模式。例如，可以通过提供酶作为靶标来筛选本发明的文库多肽的底物或调控活性。以下还描述了通过调控活性进行的选择。
4.7.3底物特异性/选择性
可以通过进行与一种底物的反应的阳性选择和与另一种底物的反应的阴性选择，来特异性富集编码具有底物特异性或选择性的酶的多核苷酸。在分离区域选择性酶和立体选择性酶(例如，可以区分相同底物的两种对映体的酶)时，这样组合的阳性和阴性选择压力应该是非常重要的。例如，两种底物(例如，两种不同的对映体)各自用不同的标签(例如，两种不同的荧光团)标记，使得标签通过酶催化的反应与多核苷酸连接。如果两种标签赋予多核苷酸不同的光学性质，则可以从多核苷酸的光学性质和编码具有拒绝的错误(或没有)特异性的多肽的那些多核苷酸来确定酶的底物特异性。如果添加具有不同光学性质的标签特异性配体(例如，用不同荧光团标记的标签特异性抗体)，则也可以使用不赋予光学活性变化的标签。
4.7.4调控
类似的系统可用于选择环状多肽的调控性质。
在对作为生化过程的活化剂或抑制剂的调节剂分子进行选择的情况下，可以在每个隔室中原位翻译生化过程的组分，或者可以在隔离之前将组分掺入反应混合物中，除了可以在隔离后使能够透过隔室材料的组分与隔室接触。如果选择的多核苷酸将编码活化剂，则可以对调控反应的产物进行选择，如上文关于催化作用所述的。如果需要抑制剂，则可选择对调控反应的底物特异的化学性质，或者选择对调控反应的产物不存在特异的化学性质。
因此，提供了分选编码表现出所需调控活性的多肽的一种或多种多核苷酸的方法，包括以下步骤：
(1)表达多核苷酸以产生其相应的多肽；
(2)根据所需的活性，允许多肽活化或抑制生化反应，或偶联反应的顺序，以这样的方式允许可选择的分子的产生或存活；
(3)通过以下任一方式将可选择的分子与多核苷酸连接
a)使可选择的分子或其所来源的底物与多核苷酸连接，或
b)通过与保持在产物上的底物连接的合适分子“标签”的方式，使可选择的产物与多核苷酸反应或结合，或
c)通过产物特异性反应或与产物的相互作用的方式，将催化作用的产物(但非底物)与多核苷酸偶联；或
d)将反应的组分和任何产物固定在凝胶中。在这种模式下，在过程开始时，一种或多种凝胶形成剂必须与封装的反应组分一起被包含。可以例如通过使反应冷却至凝胶的相变温度而形成凝胶；或
e)将反应组分和任何产物保留在微胶囊内；
(4)通过其特征性的光学性质的方式，或通过添加与产物特异性结合或特异性反应并从而诱导多核苷酸的光学性质的改变的试剂，来选择可选择的产物及其所结合的多核苷酸，其中对于步骤(1)-(3)，每个多核苷酸及相应的多肽被包含在隔室中。
在涉及步骤(3)中的选项(e)，和步骤(4)中的添加试剂的模式中，应当选择允许透过任何这样的试剂的半渗透的隔室材料。在实施方案中，隔室在分选之前未被破坏。
通常，当选择生化活性的调节剂或调控剂，例如酶的活化剂或抑制剂时，候选调节剂(在这种情况下，为环状多肽)与调控的靶标接触。还要使靶标和候选物与发生活性通常所必需的所有其他反应条件和组分(即，不存在可能干扰测定的任何调节剂)接触。在评估靶标的活性或其不存在之前，将混合物孵育一段时间。
可以将报告子包括在反应中以促进任何活性的检测。可检测的报告子是通过标准检测方法可检测到的分子、原子、离子或基团。例如，报告子可以能够产生响应刺激(如与发色底物接触或适当激发波长下的光)的可检测的信号。
可以通过检测或测量由报告子产生的信号确定可检测的报告子的存在或数量。合适的可检测标记物可包括荧光报告子，显色报告子，拉曼活性报告子，如巯基吡啶、苯硫酚(TP)、巯基苯甲酸(MBA)和二硫双琥珀酰亚胺基硝基苯甲酸酯(DNBA)，质谱分析报告子和可以通过图像分析经其形状鉴定的颗粒。
合适的荧光报告子包括荧光素和荧光素衍生物如O-甲基-荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白，铕，TruRed，别藻蓝蛋白(APC)，PerCP，丽丝胺，罗丹明，B X-罗丹明，TRITC，BODIPY-FL，FluorX，红613，R-藻红蛋白(PE)，NBD，荧光黄，瀑布蓝，甲氧基香豆素，氨基香豆素，德克萨斯红，羟基香豆素，Alexa Fluor～染料(Molecular Probes)，如AlexaFluor～350、Alexa Fluor～488、Alexa Fluor～546、Alexa Fluor～568、Alexa Fluor～633、Alexa Fluor～647、Alexa Fluor～660和Alexa Fluor～700，磺酸盐花青染料(APBiotech)，如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7，IRD41 IRD700(Li-Cor,Inc.)，NIR-1(Dejindom，Japan)，La Jolla蓝(Diatron)，DyLightTM405、488、549、633、649、680和800反应性染料(Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc)或LI-CORTM染料，如IRDyeTM(LI-CORTMBiosciences)。
报告子可以是生化过程的底物、产物或中间体。其可以是调控靶标的直接底物或产物。在其他的实施方案中，报告子可能不是调控靶标的直接底物或产物。例如，报告子可以在生化活性的较早步骤之后起作用或在生化活性的较早步骤中产生。可选地，报告子可以在生化活性的随后步骤之后起作用或在生化活性的随后步骤中产生。在简单的酶级联中，报告子的积累(相比缺少环状多肽的对照)指示报告子产生之前的任何步骤(“上游”步骤)的活化和/或报告子产生之后的任何步骤(“下游”步骤)的抑制。相反，不存在报告子指示报告子产生之前的任何步骤的抑制，和/或报告子产生之后的任何步骤的活化。可选地，报告子是已与涉及调控靶标的生化过程偶联的单独生化过程的底物或产物。
可以通过特定酶的作用转化为可检测的报告子的合适的报告底物是本领域熟知的。例如，可以通过芳基硫酸酯酶将报告底物荧光素二硫酸盐转化为可检测的报告子荧光素。类似地，磷酸荧光素和乙酸荧光素可分别与磷酸酶和乙酰化酶一起使用。
众多报告底物是可商购获得的(例如，Molecular Probes Inc)，或者可以通过标准程序合成。
优选地，可检测的报告子保留在珠粒中。
在其他的实施方案中，报告子可以是结合生化过程的组分的配体。然后，候选调节剂可以调节报告子的结合活性。在这种情况下，合适的报告子在结合时将经历可检测的物理化学变化。报告子可以与调控的靶标直接结合。在其他的实施方案中，报告子可以不直接与调控的靶标结合，而是与生化活性中的调控靶标上游或下游的另一组分结合。然而，在任何情况下，报告子的结合必须依赖于调控靶标的活性，无论是直接还是间接地。如果候选调节剂抑制报告子的结合，则与未结合的报告子相关的信号将是普遍的(即相对于阳性对照增加)。相反，如果候选调节剂促进结合，则与结合的报告子相关的信号将是普遍的(即相对于阴性对照增加)。
技术人员将容易考虑其他形式。例如，调控的靶标可以是催化这样的反应的酶，所述反应产生防止生化活性的另一组分与报告子结合的抑制剂。在任何情况下，技术人员都可以容易地确定存在的调控组分与其对报告子的影响之间的关系。
在实施方案中，报告子测定的组分与IVTT系统同时被掺入隔室中。报告子测定的一些组分可以通过胶囊中的IVTT系统从另外的多核苷酸转录，伴随着环状多肽的表达。
在一些实施方案中，可以使包含共固定的多核苷酸和环状肽的隔室去隔离的胶珠与包含报告子测定的组分的介质接触。
在一些实施方案中，报告子测定的一些组分和/或编码报告子测定的组分的多核苷酸与IVTT系统同时被掺入隔室中。在该实施方案中，报告子测定的剩余组分在随后的阶段与隔室或去隔离的胶珠接触。
在报告子测定组分与隔室接触的实施方案中，应当选择隔室材料，以便最初仅在隔室外部的环境中存在的报告子测定组分能够透过隔室边界进入隔室内部空间容积。
4.7.5蛋白质-蛋白质相互作用
可以通过可与文库一起封装，或随后使用液滴合并进行合并，或通过在测定介质中重构去隔离的胶珠掺入的测定(例如，FRET测定或HTRF测定)，来监测蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。
为了进行测定，可以使FRET供体部分与相互作用对的一种蛋白质连接，并且可以使FRET受体部分与相互作用对中的另一种蛋白质连接。当两种蛋白质相互作用时，定位供体/受体部分以确保足够接近共振能量转移在本领域技术人员的能力范围内。然后使FRET功能化的蛋白质与文库中的多肽接触。
根据本发明的抑制两种蛋白质之间的相互作用的多肽的存在不会FRET，而含有无活性分子的那些仍然会显示出FRET信号。可以利用FACS容易地分离这两种物质。
也可以在相反方向上进行测定，以鉴定产生或增强两种蛋白质之间相互作用的多肽，在这种情况下，FRET的存在或增加指示促进相互作用的多肽。
4.7.6多肽的光学性质
如果在隔室中，多肽结合回多核苷酸，例如通过结合作为多核苷酸的一部分的配体的多肽的共同元素，则选择多肽的固有光学性质是可能的。然后可以使用结合的多肽的光学性质来分选多核苷酸。该实施方案可用于例如，选择绿色荧光蛋白(GFP)的变体(Cormack等人,1996；Delagrave等人,1995；Ehrig等人,1995)，其具有改善的荧光和/或新的吸收和发射光谱。
4.7.7多核苷酸/多肽的流式分选
在本发明的优选实施方案中，将通过流式细胞术分选珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽。各种光学性质可用于引发分选，包括光散射(Kerker,1983)和荧光偏振(Rolland等人,1985)。在高度优选的实施方案中，珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽的光学性质的差异将会是荧光的差异，并且将使用荧光活化细胞分选仪(Norman,1980；Mackenzie和Pinder,1986)或类似的装置分选珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽。在特别优选的实施方案中，珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽包含直径最佳为0.6-1.0μm的非荧光非磁性的(例如，聚苯乙烯)或顺磁性微珠(参见Fornusek和Vetvicka,1986)，其连接有产生荧光信号所涉及的基因和基团：
(1)来自著名的制造商(例如，Becton-Dickinson,Coulter)的可商购获得的荧光活化细胞分选设备允许每小时分选多达108个珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽(事件)；
(2)来自每个珠粒的荧光信号紧密对应于与珠粒连接的荧光分子的数量。目前，每个颗粒仅仅可以定量检测数百个荧光分子；
(3)荧光检测器的宽动态范围(通常为4个对数单位)允许轻松设置分选程序的严格性，从而允许从起始池中回收最佳数量的珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽(取决于所进行的选择，门可以设置为分离具有较小荧光差异的珠粒，或者只分离出具有较大荧光差异的珠粒；
(4)可商购获得的荧光活化细胞分选设备可以在多达两种不同波长下进行同时激发，并在多达四种不同波长下检测荧光(Shapiro,1983)，允许通过监测具有两种(或更多种)不同荧光标志物的珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽的标记来同时进行阳性和阴性选择，例如，如果用不同的荧光标签标记酶的两种可选底物(例如，两种不同的对映体)，则可以根据所用的底物，用不同的荧光团标记珠粒、胶囊、多核苷酸和/或多肽，并且仅选择编码具有对映选择性的酶的基因。
(5)高度均一的衍生化的和非衍生化的非磁性的和顺磁性的微粒(珠粒)可从许多来源(例如，Sigma和Molecular Probes)商购获得(Fornusek和Vetvicka,1986)。
4.8多核苷酸的分离
可以分离、扩增、克隆、测序或以其他方式操纵来自一个或多个珠粒的多核苷酸。
本文中描述的方法还可包括从鉴定为含有候选环状多肽的一个或多个隔室或珠粒中鉴定和/或分离多核苷酸。
可以分离、扩增、测序克隆和/或以其他方式研究来自一个或多个珠粒的多核苷酸。例如，可以使用常规技术如凝胶提取柱或琼脂糖，和/或等温扩增(例如，多重引发的RCA)或通过PCR或二者连续地提取多核苷酸。
本文中描述的方法也可以类似地应用于其中隔室为例如囊泡或藻酸盐微胶囊的系统。也可以操作这些系统以提供用于PCR、琼脂糖胶凝化和IVTT，接着是测定和高通量分选的微反应器。
5实施例
5.1实施例前言：
在一个实施方案中，本发明通过向微流体液滴中导入SICLOPPS克服了本领域中的限制。我们不仅可以在每个液滴中表达单独的SICLOPPS文库成员，因为这是通过体外转录/翻译实现的，而且每个环状肽的DNA密码也包含在同一液滴中，使得经PCR扩增和DNA测序鉴定命中变得非常简单。该文库可以与任何具有荧光或比色输出(例如FRET、HTRF)的药物测定配合。该方法还允许产生数亿个环状肽的文库，并且可以包括非天然氨基酸。
为了克服液滴合并的限制，在体外蛋白质表达之前，我们利用基于油包琼脂糖液滴的方法进行高度平行和有效的单分子DNA扩增。该方法利用琼脂糖的热响应溶胶-凝胶转换性质，用于在Phi29DNA聚合酶扩增之前捕获单个DNA分子。在DNA扩增后，使琼脂糖液滴胶凝(或凝固)以形成琼脂糖珠粒，从而捕获每个微反应器中的所有扩增子以保持每个液滴的单克隆性。
使用的单分散油包琼脂糖微液滴先前已被用于监测凝胶化微珠中的生化反应。如所述的，从琼脂糖液滴到凝固的琼脂糖颗粒的转化提供了额外的稳定性并促进了操作。一旦凝固，我们证明仅在琼脂糖珠粒内分离等温扩增的DNA(即，预扩增的DNA不会扩散出来)。因此，可以通过破坏乳剂来回收所得颗粒，并洗涤以允许在IVTT相容缓冲液中再悬浮，以有效避开与液滴合并相关的限制。在IVTT相容缓冲液中再悬浮后，可以添加IVTT系统的其他组分，并且在实施方案中，可以将具有IVTT能力的琼脂糖珠粒再乳化以形成IVTT微反应器。
开发的方法使得能够高通量生成具有有效单分子DNA扩增的均匀液滴，从而为许多基于单拷贝遗传学的研究提供了一个很有前景的平台。
总之，我们描述了新的超高通量筛选平台，其可用于经飞升尺寸的水性隔室中的SICLOPPS来源的环状肽文库的体外隔离，使用FACS选择性地回收显示所需表型特征的液滴，来进行蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的快速选择。
我们证明了通过凝固和随后的乳剂破坏(经由添加PFO)以允许分离富含DNA的琼脂糖颗粒，而成功地在单分散琼脂糖液滴中进行单分子DNA扩增。通过用荧光dsDNA嵌入染料染色来检测扩增的DNA，其同时允许经流式细胞术检测。观察到侧向相对于前向散点图上的单个不同的琼脂糖颗粒组群，当与不包含Phi29DNA聚合酶的对照相比时，绿色荧光强度显著增加。
在将琼脂糖颗粒引入含有IVTT的液滴之前，洗涤琼脂糖珠粒以除去任何未结合的DNA，同时除去不相容的DNA扩增缓冲液；在没有洗涤的情况下，IVTT被抑制并且未观察到GFP表达。
对于油包IVTT包琼脂糖(双乳剂)形成，将琼脂糖颗粒连同IVTT的组分一起重新引入疏水性微流体装置中。在37C孵育后，通过将乳剂放在冰上来停止蛋白质表达。对于三乳剂形成(水包油包IVTT包琼脂糖)，将双乳剂液滴注入到第三且最后的亲水性微流体装置中，以再乳化成流式细胞术相容的构型。
最后，使用FACS成功地分选包含来自GFP编码质粒的体外表达的GFP的三乳剂。液滴以每秒超过1,000个事件的速率注射和分选，因此相当于每分钟60,000个事件或每小时320万个事件。
总之，我们证明了在微流体产生的液滴中琼脂糖颗粒在用于多肽的体外表达的IVTT中的成功实施。
实施例1：飞升尺度的单分散的单一油包水乳剂液滴的产生
图1中示出了使用芯片上的具有实现5–50fL体积的液滴的容量的10x 5μm(宽度x深度)流动聚焦微流体装置的水性飞升液滴的产生，借此两种不混溶液体经由四个平行的微通道进入装置，其中连续的基于HFE-7500的相从外部两个通道流入，且分散的水相从内部两个通道流入。在下游，水性微通道在进入孔口之前相遇。如Shim等人所报道的，在液滴形成期间最初在喷嘴孔口处观察到的固定的细长水流代表了具有破裂的滴落方案的液滴产生的“尖端流(tipstreaming)”作用机制，即具有释放较小液滴(直径小至0.5μm)的高尖尖端的锥形液滴形状的形成。1934年首次报道，表面活性剂介导的微尺度尖端流代表了一种流体动力学现象，其能够经由由于在流动聚焦几何形状内产生的拉伸流动而产生的界面表面活性剂浓度梯度而产生亚微米尺寸的液滴。
为了证明用于SICLOPPS文库封装的单分散油包水(w/o)飞升液滴的良好控制的产生，在预先与5％Krytox 157 FSL Jeffamine ED-600二盐表面活性剂(JUS，不可商购获得)混合的氢氟醚HFE-7500中形成了包含于1X TAE(pH～7.5，因为FITC荧光的发射强烈依赖于周围的pH)中的100μM荧光素(FITC染料)的液滴，以降低油-水界面处的界面张力。为了研究飞升液滴形成的频率并因此确定随时间可实现的封装的SICLOPPS文库变体的理论数量(假设单分子封装)，通过以逐步的方式(10-60μl/h)增加油相流速同时保持10μl/h的恒定水流来检查体积流速对液滴直径的影响(通过油/水流速比R1/R2示出)。液滴形成的频率(预计其随着液滴尺寸的减小而增加)理论上计算如下：f＝Qaq/Dv，其中f是产生的频率(Hz)，Qaq是水相的流速(μl/s)，且Vd是最终的液滴体积(μl)。
为了确定微流体产生的乳剂液滴的直径，将样品吸移到一次性快速读数计数载玻片中，并使用Olympus CKX41倒置显微镜或Zeiss Axio II成像；QIClick CCD相机适用于图像捕获，并使用开源显微镜软件(Micro-Manager)进行控制。对于分析，明场和荧光图片保存为16位文件，并利用ImageJ软件处理，以经由“分析颗粒”功能获得液滴直径和体积的统计数据。因此，测量了所有对象的大于指定的最小截止值(0.8)的用户定义的阈值以上的圆度，并制成表格用于数据处理。结果，在每个流速条件下的液滴直径分布呈现在图2中。
油/表面活性剂流速的增加之后是总体液滴直径的减小。同样地，液滴体积的减小与其产生频率的增加相匹配，如图3中所示。
实施例2：用于流式细胞术分析的水包油包水双乳剂液滴的产生
对于SICLOPPS包封的乳剂样品的流式细胞术分析，需要经两步骤再乳化产生的双乳剂水包油包水构型以确保相容性。因此，使用具有15x16μm的微通道尺寸测量值的第二亲水性流动聚焦芯片，将经10x 5μm微流体装置产生的初始含FITC的油包水乳剂转化为双乳剂液滴。为了允许再乳化，将初始乳剂直立储存在玻璃注射器中，用氟化油和矿物油溶液压片。在封装期间，添加第二个FC-40填充的注射器用于促进每双乳剂单个初始液滴的受控操作和封装。同时，将含有连续相的1％tris/吐温80表面活性剂用于界面稳定。芯片上两步骤乳化的过程如图4中所示。
另外，使用流动聚焦微流体几何学生成单乳剂和双乳剂液滴的工作流程如图5中所示。
得到的内部液滴直径平均为～6.69μm，而外部双乳剂直径为～14.98μm；因此，这些～1.76pL双乳剂产生～5.68x108个液滴/mL。虽然大多数(来自10张图像，平均为98.21％)被观察到包含单个水性核心，但发现一小部分(1.79％)被双重占据(箭头，图6)。在4℃下储存1个月后，液滴稳定性和结构完整性得到保持。
随后，使用BD Accuri C6流式细胞仪分析来自图6的双乳剂液滴。芯片上产生的双乳剂液滴的密度图在细胞计数前向和侧向散射上形成两个独特的簇(FSC和SSC，图7)。虽然FSC基于其尺寸(直径)区分液滴，但将SSC用于基于其内部复杂性(或粒度)来区分液滴。结果，包含内部水性核心的双乳剂液滴将表现出比空的水包油液滴更大的侧向散射，并因此将在SSC相对于FSC密度/散点图上表现出更高的定位。单分散液滴组群将表现出类似的前向散射。图7A中示出了单占据(包含内部荧光素核心的液滴)和未占据的液滴，即在芯片上再乳化期间未能封装初始油包水液滴的那些。如图6B中所示，相应的绿色荧光强度图谱进一步支持了这种区分，借此高荧光液滴组群代表单占据的含FITC的液滴，其具有的荧光信号比代表荧光的基线水平的第二较低定位的组群(未占据的液滴)的荧光信号大约3个数量级。
通过制备简单的水包油液滴确认了背景荧光水平，其中试剂和条件与先前使用的那些完全相同。分别从得到的荧光直方图和SSC相对于FSC图观察到单荧光峰和液滴组群，其直接对应于来自图7A&B的那些。
实施例3.在液滴中的320万个环状肽的文库的产生。
为了促进含有环状肽的液滴的鉴定，我们设计了编码SICLOIPPS内含肽和荧光蛋白(GFP)的表达系统。可以使用FACS基于其荧光容易地鉴定和分选/分离含有SICLOPPS质粒的液滴。构建了以SICLOPPS形式(IC-外显肽-IN)编码Npu断裂内含肽的基于pETDuet的质粒，以用于从载体pARNpuHisSsrA-CX5进行CX5SICLOPPS文库构建(Townend和Tavassoli,2016,ACS Chemical Biology,1624-1630)。使用分别编码Eco RI和Hind III限制酶的正向和反向引物PCR扩增进行编码C-内含肽和N-内含肽的区域以及编码肽的六聚体，其中反向引物被设计为删去SsrA降解标签。接着将该扩增的产物消化，随后克隆到载体pETDuet-1的第一个多克隆位点(MCS1)中。使用分别编码Nde I和Eco RV限制酶位点的正向和反向引物从编码基因块PCR扩增GFP；同样地将该构建体克隆到载体pETDuet-1的MCS2中，以产生编码SICLOPPS和GFP蛋白的载体。以下将所得质粒用作SICLOPPS环状肽文库构建中的模板。
如前所述(Tavassoli和Benkovic,2007,Nature Protocols,1126-1133)，构建包含五个可变氨基酸并因此包含3.2x 106个文库成员的六聚体文库(其中X＝任何氨基酸残基)。文库被设计为编码pETDuet-1的第一个多克隆位点(MCS)中的环状肽六聚体，其具有初始半胱氨酸残基，接着是5个随机化的残基，这是因为需要第一位置处的亲核体以用于内含肽加工的酯交换步骤(适于在第一位置处提供亲核体的其他残基包括丝氨酸(S)和苏氨酸(T))。构建了第二个MCS以表达GFP，并因此允许同时表达环状肽和荧光蛋白，以允许快速和系统地鉴定含有环状肽的液滴。
所得的质粒示出在图15中。
如先前所详述的(Tavassoli和Benkovic,2007,Nature Protocols,1126-1133)，使用了基于两步骤PCR的技术，其中文库的随机寡核苷酸被掺入结合IC的3’端和IN的5’端的区域之间的正向引物中。以NNS形式编码可变区段，其中N表示四种DNA碱基(A、C、G或T)中的任一种，且S表示C或G。NNS序列产生了32个密码子，且编码所有20种天然存在的氨基酸，同时从文库中清除赭石(UAA)和蛋白石(UGA)终止密码子。应该注意的是，对于靶肽内氨基酸的数量没有限制，允许产生各种尺寸的环状肽。
由于文库的序列复杂性，初始线性PCR产物的产生在随机化核苷酸区域中产生错配。因此，将使用对应于C-内含肽的3’端的“拉链”引物的第二次PCR用于确保所有DNA序列与其互补链的退火。使用标准分子生物学技术将得到的DNA文库掺入SICLOPPS质粒中，以在载体pDuetNpuHis-GFP中产生所需的CX5文库。
连接后，将SICLOPPS CX5肽文库转化至电感受态DH5α大肠杆菌细胞中，接种到LB琼脂培养基上，并在37℃下生长过夜。一旦生长，经由刮取菌落收获所得的菌落，并微量制备，以产生准备好在如上所详述的油包琼脂糖液滴中封装和Phi29介导的预扩增的质粒文库的。
实施例4：使用基于琼脂糖的液滴微流体将生化操作小型化
将上述质粒文库(实施例3中产生的)用于以下实验中。油包琼脂糖乳剂液滴应用于胶凝的琼脂糖珠粒中的扩增子捕获和DNA扩增已经物化为解决常规PCR和引物功能化的微珠方法的挑战的强有力方法。在这里，我们利用琼脂糖独特的热响应溶胶-凝胶转换性质来描述用于在直径范围为6-7μm的飞升尺寸的琼脂糖珠粒中的单DNA质粒分子扩增的高度平行的Phi29 DNA聚合酶介导的方案。我们利用具有共封装的等温扩增试剂以及作为捕获基质的琼脂糖的双水性入口乳剂液滴发生器。在达到储库/珠粒的稳健和惰性生化环境中，每种产物的单克隆性质最终得以保留。随后在没有液滴合并的情况下，将包封捕获的扩增子的凝固的珠粒共封装在体外转录翻译(IVTT)系统中，以研究在确定的反应体积中的蛋白质表达，如图8中所示。结果，我们证明了对无膜琼脂糖颗粒的基因转录和翻译的限制，从而证明了这种即将到来的技术在实现复杂生物系统的定量新研究方面的潜能。
图9示出了在用于包含1％琼脂糖溶液的高度均匀的且单分散的飞升乳剂液滴的受控产生的微制造的疏水装置内，使用Phi29DNA聚合酶的用于单个DNA质粒分子的封装和扩增的琼脂糖液滴微流体设置。将DNA模板分子与琼脂糖溶液一起以统计学稀释的浓度引入液滴中，使得单个液滴中的分子的平均数量不超过约1。将在37C下保持流体并且过渡胶凝点在8-17C之间的超低胶凝温度琼脂糖用于封装，以使得能够在装置运行期间易于产生琼脂糖液滴。在芯片外孵育和DNA扩增之后，通过将溶液冷却至临界胶凝点以下，允许将琼脂糖基质转换为固体凝胶相。一旦凝固，珠粒保持固态，除非出现温度升高。结果，扩增的DNA仍被捕获在凝固的琼脂糖基质内，因此即使在除去外部油相后仍保留液滴单克隆性。
对于液滴生成，根据泊松统计对所得的质粒文库进行统计学稀释，以确保在110fL油包琼脂糖液滴中，封装平均(λ)(i)0.1，表示单分子封装，或(ii)平均为100个文库拷贝(作为原理证明)。将所得的质粒文库连同Phi29DNA聚合酶介导的等温扩增试剂一起注入JUS装置中，并对于每个水相使用10μl/h的水流速，且对于油/表面活性剂混合物QX200(液滴产生油)使用30μl/h进行封装。为了产生均匀的琼脂糖乳剂液滴，将琼脂糖连同1X TAE缓冲液一起装入到具有QX200油/表面活性剂作为连续相的微流体装置中。为了确保维持液体状态的琼脂糖以用于产生液滴，在填充琼脂糖之前以及在装置运行期间，用商购的可微波加热包预热含琼脂糖的注射器(图9A)。可选地，购买可商购获得的5V DC电动的5x 10cm加热垫(图9B)，并将其手动连接到标准的5V USB电缆以产生能够在10分钟的运行期间产生约40C的温度的持续使用的加热元件。
收集后(图10A)，将现在包含DNA和Phi29DNA聚合酶扩增组分的琼脂糖液滴在30C下孵育过夜。进行经由冰上孵育的固化和使用PFO的珠粒提取，以分离所需的琼脂糖珠粒组群。结果，使用荧光双链DNA结合DNA对珠粒进行染色，以允许内部DNA的可视化(图10C)。
图13中呈现了在扩增之前包含平均100、10、1或0.1个起始DNA拷贝(λ值)的染色的琼脂糖珠粒的流式细胞术分析(图11)，其中0.1表示单分子封装。当相比4小时孵育时，孵育过夜16小时(对应于每个液滴约12,000个最终DNA拷贝)对于产生较大量的DNA是优选的。在所有情况下，当相比包含仅DNA或空的(无DNA)琼脂糖珠粒的阴性对照时，在每种实验条件下观察到独特的Phi29DNA聚合酶介导的DNA扩增。
由于已知用于DNA扩增的缓冲系统与基于液滴的IVTT不相容，因此使包含单克隆扩增的质粒DNA的琼脂糖珠粒凝固，并随后经由离心洗涤以允许它们在现在与IVTT相容的溶液中再悬浮。为了进一步研究使用PURExpress系统的IVTT与我们的含有质粒的琼脂糖珠粒的相容性，将洗涤过的琼脂糖珠粒再悬浮在具有QX200油/表面活性剂的IVTT溶液中，并涡旋以快速产生大量多分散液滴，其明场和荧光图片呈现在图12中。有趣的是，从包含于具有体外蛋白质表达组分的琼脂糖珠粒中的Phi29扩增的DNA的样品中观察到GFP介导的荧光，而在没有扩增的情况下未观察到荧光。因此，添加来自单拷贝DNA封装的预扩增步骤对蛋白质构建体的成功的体外介导的蛋白质表达是必要的。这证明了使用我们的双表达载体在这些液滴中产生了SICLOPPS文库和GFP。
为了证明使用PURExpress系统在微流体产生的单分散液滴中GFP的体外介导的蛋白质表达，使用Phi29DNA扩增对含有约100个起始质粒DNA拷贝的琼脂糖液滴预扩增(图13A)，并按先前所详述进行洗涤。随后将琼脂糖珠粒吸取到玻璃注射器中，并连同IVTT组分和1％tris/吐温80连续相一起注入疏水性的15x 16μm微流体装置中。收集后，将液滴在37C下孵育2小时，然后经由15x 25μm亲水性装置乳化成具有外部水相的三重乳液液滴，以用于流式细胞术分析。结果，在图13中，在高度单分散的微流体产生的液滴中呈现了体外GFP表达。观察到IVTT PURExpress系统本身显示高水平的背景荧光；尽管如此，观察到比背景水平大约10倍的独特的GFP介导的荧光，使得能够使用例如荧光活化细胞分选(FACS)容易地选择含有环状肽的液滴，以用于回收所需的表型性状。因此，呈现了在微流体液滴中在没有复杂的液滴合并程序的情况下，经由稳健的琼脂糖和IVTT平台进行的体外蛋白质表达。
实施例5：环状肽的形成和分选
我们已经通过质谱法证明了在乳剂内经由内含肽剪接而形成环状肽。在FACS分选乳剂液滴后，环状肽继续存在。
将实施例3的载体用于编码内含肽结合的六肽CLLFVY。按下述将该载体用于产生环状CLLFVY。
在载体CSpDuetNpuHisCLLFVY存在下组装标准的PURExpress IVTT反应。在质谱分析前2h将反应物在37℃下孵育。结果示出在图16，左图中。
在第二个实验中，在30℃下，将载体CSpDuetNpuHisCLLFVY经由TempliPhi扩增系统于高度单分散的～6μm 1％琼脂糖珠粒中，预扩增过夜。在酶热灭活后，将珠粒从乳剂中脱离，并经由在diH2O中在～6,000rpm下离心3x进行洗涤，以允许有效的扩增缓冲液除去(这将无意中干扰随后的IVTT操作)。然后将包含单克隆扩增的DNA的洗涤过的琼脂糖珠粒与IVTT一起再封装以允许CLLFVY表达，并在37℃下孵育2h，然后进行第三乳化步骤以产生双乳剂FACS相容的液滴。
选择表现出高于背景的增加的GFP荧光(MCS2克隆的GFP)的双乳剂组群以用于分选。将分选的样品从乳剂中脱离并进行质谱分析。参见图16，右手边的图。
在任何一种情况下指示环CLLFVY的峰均是明显的。
实施例6.AB42-GFP与环TAFDR的融合物在微流体液滴中的体外表达
环状肽TAFDR是一种已被证明可抑制与GFP融合的阿尔茨海默病蛋白Aβ42的聚集的环状肽。当GFP作为聚集的融合物产生时，其荧光丢失；然而，当聚集被TAFDR破坏时，GFP能够发荧光。参见Mathis等人,Nature Biomedical Engineering,第1卷，第838–852页(2017)。
我们已经使用了Aβ42聚集测定来评估本发明的系统的性能。该测定先前已与SICLOPPS筛选组合(Mathis等人)，因此环TAFDR是经验证的阳性环状肽对照。图17显示了该对照肽与AβGFP融合蛋白一起在液滴中的表达引起荧光的显著增加，这与Aβ聚集的破坏有关。
载体CSpDuetNpuHisAB42-GFP用于将TAFDR克隆到MCS1中。此后，将质粒DNA与等温DNA扩增反应组分一起封装在高度单分散的1％琼脂糖液滴中，并在30℃下孵育过夜。如前所述准备琼脂糖珠粒，并与IVTT一起重新封装，然后在37℃下孵育2小时。进行最终的乳化步骤以产生FACS相容的双乳剂。同样地在CA5存在下构建阴性对照载体以验证环TAFDRAB42-GFP聚集抑制。相对于仅缓冲液、仅IVTT和环CA5数据，观察到在环TAFDR表达后绿色荧光的正向偏移。
实施例7.双乳剂液滴中TX4 SICLOPPS文库的体外隔离和FACS筛选。
使用实施例6的方法，利用TX4文库进行了全筛选。图18显示了潜在活性化合物的清晰的库(区域标记为+ve 13.1％)。
与实施例6类似，包含于MCS1中的NpuHis TX4和于MCS2中的AB42-GFP融合物的pETDuet-1载体的质粒构建。为了在IVTT之前允许单克隆DNA扩增，将质粒DNA与TempliPhi等温DNA扩增组分一起封装在高度单分散的～6μm琼脂糖飞升液滴(1％琼脂糖)中。将样品孵育过夜(16h)以允许在30℃下的最大扩增。将Phi29DNA聚合酶在65℃下热灭活10min。将珠粒在冰上孵育以促进转化为凝胶相，并允许捕获等温扩增的DNA产物。将珠粒从乳剂脱离，提取水相并在diH2O中洗涤3x(6,000rpm)以允许除去扩增缓冲液。接下来将珠粒与PURExpress IVTT系统一起封装在高度单分散的液滴中，然后在37℃下孵育2小时。在蛋白质表达后，将样品转化成双乳剂形式(水包油包IVTT包琼脂糖珠粒)，以允许FACS筛选。鉴定双乳剂组群，并设门以允许文库分选(B)。从双乳剂组群设门仅高于IVTT背景的荧光读数，并在FL1-H(GFP,A)上进行分选。仅针对TX4文库样品(橙色线)示出了百分比+ve(潜在的阳性候选肽)和-ve设门的颗粒。
以上说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文中。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所述的方面和实施方案的各种修改和变型对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于这些特定的实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，所描述的用于实现本发明的模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。

Claims (12)

1.共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)形成含有编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室；
b)从所述多核苷酸表达多肽；以及
c)使所述多肽环化，
其中所述隔室选自：
(i)胶珠；
(ii)油包琼脂糖液滴；
(iii)水滴包油包体外转录和翻译系统包琼脂糖；
(iv)油包水液滴；
(v)水包油包水乳剂的液滴；
(vi)囊泡；
(vii)通过生物电喷雾或喷射获得的微胶囊；和/或
(viii)在溶液中的颗粒，并且
其中所述多核苷酸包含编码N端内含肽片段的序列，接着是编码所述环状多肽的序列，接着是编码C端内含肽片段的序列。
2.用于分选环状多肽的方法，包括权利要求1所述的步骤且还包括以下步骤：
c)针对活性筛选所述环状多肽；
d)选择表现出所需活性的环状多肽。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括扩增所述多核苷酸的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述隔室还包含凝胶形成剂，其中在扩增所述多核苷酸后，所述凝胶形成剂凝固成胶珠。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述隔室在所述凝胶形成剂凝固成胶珠后被破坏。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述胶珠被暴露至表达所述环状多肽的条件。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在所述胶珠周围形成新的隔室。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔室是水包油包水乳剂的液滴或囊泡。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述多核苷酸表达多肽包括以下步骤：使所述多核苷酸与包含荷载有非天然氨基酸的一种或多种tRNA的体外转录和翻译混合物接触。
10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其中在容器中进行扩增，其中在围绕所述容器的表面区域均匀地且连续地施加热量。
11.隔室，包含：
a)多核苷酸，其包含编码N端内含肽片段的序列，接着是编码环状多肽的序列，接着是编码C端内含肽片段的序列；和
b)所述环状多肽，
其中所述隔室为：
(i)胶珠；
(ii)油包琼脂糖液滴；
(iii)水滴包油包体外转录和翻译系统包琼脂糖；
(iv)油包水液滴；
(v)水包油包水乳剂的液滴；
(vi)囊泡；
(vii)通过生物电喷雾或喷射获得的微胶囊；和/或
(viii)在溶液中的颗粒。
12.隔室群，其包含多个权利要求11所述的隔室，其中至少一个隔室中的多核苷酸包含与在至少一个其他隔室中的多核苷酸的序列不同的序列。
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