JP6041154B2 - 並列反応方法およびスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
例えば、非特許文献1には目的のタンパク質を発現する細胞をクローニングする際に、限界希釈法により1つの容器に1つの細胞が入る濃度から細胞を培養し、目的のタンパク質を発現するクローンを取得する方法が提案されている。
例えば、目的の細胞を含む細胞懸濁液を96穴ウェルプレートに分注し、抗体などを含む分析用試薬類を順次添加して細胞表面に発現した物質若しくは細胞から分泌される物質の量を定量したり、多様なアミノ酸置換を含む酵素を発現するライブラリーの中から活性の高い酵素を発現するクローンを選択する際に、96穴ウェルプレート等の反応器の中で酵素を発現させ、酵素の反応基質等を添加することにより酵素の活性を測定している。
つまり96穴ウェルプレート等を用いる場合には、多数の反応器(穴)に順次複数の試薬を分注する必要があり、分析対象となる酵素や細胞の数の増加に伴い必要となる反応器数が増大し、それに伴う溶液・試薬の分注操作が煩雑となる。
また非特許文献8には、ゲル粒子内でタンパク質合成反応を行わせるために、ゲル粒子表面の高分子皮膜を通してゲル粒子内に基質を供給する内容が開示されている。更に非特許文献9にはゲル粒子を反応容器として用いてPCRを行う方法が開示されている。
更に非特許文献9にはアガロースを分散相とし油相を連続相としたエマルションの当該アガロース滴中にプライマーDNAを含ませ、アガロース滴中でPCRを行うことが開示されているが、タンパク質の合成と合成したタンパク質を固定することについての開示がない。また、多段階の生化学反応に応用する方法は開示されていない。また、マイクロ流体デバイスを用いてDNAを含ませる方法が用いられているが、マイクロ流体デバイスの加工は非常に複雑で高価である。
尚、実際には限界希釈しても1つのゲル粒子中に複数のDNA分子が包含されたり、1つのゲル粒子中に包含されるDNA分子がない場合も想定される。本発明における限界希釈の意味は、平均的に1つのゲル粒子に1つのDNAが包含される濃度である。
ゲル粒子となる水溶液中に核酸増幅反応およびタンパク質を合成するのに必要な物質を導入し、次いで、水と混じり合わない液体にゲル粒子を懸濁させることで、複雑で高価なマイクロ流体デバイスを用いずとも、個々のゲル粒子中でコンパートメント化された核酸増幅反応およびタンパク合成反応を実施することが可能となる。
工程1
前記DNAプライマーと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変異が入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と、核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液と、ゲル粒子の懸濁液とを混合して、ゲル粒子内にDNAを平均1分子以下で導入・固定するとともにゲル粒子内に核酸増幅反応に必要な物質を導入する工程。
工程3
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁させる工程。
工程4
核酸増幅反応によって前記ゲル粒子中のDNAを増幅させる工程
工程5
ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁させる工程。
工程6
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液とゲル粒子の懸濁液とを混合する工程。
工程7
工程6でタンパク質を合成するのに必要な物質が導入されたゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁させる工程。
工程8
前記ゲル粒子内でタンパク質合成反応によってタンパク質を合成する工程。
工程9
内部でタンパク質が合成されたゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁させる工程。
工程10
ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程11
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程。
工程12
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読して、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。
工程1
前記ゲル粒子に固定化されたDNAと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈された溶液を用いてゲル粒子を作製することで、ゲル粒子内にDNAが平均1分子以下の濃度で固定されたゲル粒子を作製する工程。
工程3
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液を混合する工程。
工程4
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再懸濁する工程。
工程5
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程6
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程7
前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬と混合する工程。
工程8
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程9
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。
工程1
前記ゲル粒子に固定化したDNAと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と、ゲル粒子の懸濁液とを混合して、ゲル粒子内にDNAを平均1分子以下で導入・固定する工程。
工程3
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液を混合する工程。
工程4
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程5
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程6
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程7
前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程8
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程9
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。
工程1
核酸増幅反応プライマーと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液とを混合し、この希釈・混合された複数種のDNAが含まれる溶液を用いてゲル粒子を作製することで、ゲル粒子内にDNAが平均1分子以下の濃度で固定されたゲル粒子を作製する工程。
工程3
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程4
核酸増幅反応によって前記ゲル粒子中のDNAを増幅させる工程。
工程5
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程6
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液とを混合する工程。
工程7
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程8
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程9
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程10
前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程11
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程12
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。
また、ゲル粒子からのDNAやタンパク質の溶出を防止し、ゲル粒子内での反応が効率よく行われ、且つ反応生成物であるタンパク質の回収も効率よく行われる。
DNAが固定化されたアガロースゲル粒子の懸濁液を用いて、核酸増幅反応を行うには、図3(a)の状態、即ち低融点アガロースの網目構造部分に核酸増幅反応プライマーが固定されている状態から、ゲル粒子をテンプレートDNAおよび増幅反応に必要な物質を含んだ水溶液中に懸濁させ、これらの分子を拡散によりゲル粒子内に供給する(図3b)。引き続き、ゲル粒子を油相中に懸濁させることで、ゲル粒子間の相互物質移動を遮蔽し(図3c)、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって核酸増幅反応を行う。増幅されたDNAはゲル粒子に固定化されているプライマーDNAによって補足され、ゲル粒子に固定化される(図3dおよび図4)。
次いで、55〜60℃でアニーリングすることで、一本鎖DNAを既にゲル粒子の網目構造部分に固定されているプライマーに結合させ、更にDNAポリメラーゼによる酵素反応によってプライマーを伸長させ二本鎖DNAとする。
以上の操作を繰り返すことによって、図3(d)に示すように、1つのゲル粒子内に同一の塩基配列を有するDNAが高濃度に存在することになる。
NTAが固定化されたアガロースゲル粒子の懸濁液を用いて、無細胞タンパク質合成反応を行うには、図9(a)の状態、ゲル粒子をアミノ酸配列をコードしたDNAおよび無細胞タンパク合成反応に必要な物質(アミノ酸、酵素、ATPなど)を含んだ水溶液中に懸濁させ、これらの分子を拡散によりゲル粒子内に供給する(図9b)。引き続き、ゲル粒子を油相中に懸濁させることで、ゲル粒子間の相互物質移動を遮蔽し(図9c)、37℃でインキュベーションすることでタンパク質合成反応を行う。合成されたタンパク質はゲル粒子に固定化されているNTAによって補足され、ゲル粒子に固定化される(図9dおよび図10)。
DNAおよびNTAが固定化されたアガロースゲル粒子の懸濁液を用いて、DNA増幅反応に引き続き、無細胞タンパク質合成反応を行うには、図1の状態、即ち低融点アガロースの網目構造部分に核酸増幅反応プライマーとNTAが固定されている状態からゲル粒子をテンプレートDNAおよび増幅反応に必要な物質を含んだ水溶液中に懸濁させ、これらの分子を拡散によりゲル粒子内に供給する(図12a)。引き続き、ゲル粒子を油相中に懸濁させ、適切なサーマルサイクルを行うことで、独立したコンパートメント内でPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって核酸増幅反応を行う。増幅されたDNAはゲル粒子に固定化されているプライマーDNAによって補足され、ゲル粒子に固定化される(図12bおよび図13)。その結果、1つのゲル粒子内に同一の塩基配列を有するDNAが高濃度に存在することになる。
先ずDNAライブラリーを限界希釈し、ゲル粒子を作製する。希釈濃度およびゲル粒子の大きさは、ゲル粒子1つにDNAが1分子のみ入るようにする。現実にはゲル粒子の数は極めて多いため、すべてのゲル粒子にDNAが正確に1分子含まれる分けではなく、中にはDNAが入っていないものや複数入っているゲル粒子も存在するが、並列反応を行うには問題とならない。
(1.1)野性型ERPコード直鎖DNAの作成
野性型ERPをコードしたDNAとして、pUT/phoA Vector (Biuomedal) のAlkaline Phospataseコード領域を利用する。RTS 100 E.coli lin tempGenSet, His-tag kit (5prime)を用いて、pUT/phoA Vector (Biuomedal) のAlkaline Phospataseコード領域を直鎖DNAとして増幅する。この直鎖DNA作製はキットのプロトコルに従い、二回のPCRによって行われる。この2回のPCRの反応条件は下記の通りである。
使用したプライマーの配列を次に示す。 プライマーの設計にはprimer3を用いた。(left primer及びright primerについては図5参照)
left primer; CTTTAAGAAGGAGATATACCATGACACCAGAAATGCCTGTTCTG, right primer; TGATGATGAGAACCCCCCCCTTTCAGCCCCAGAGCG
PCRを行うにあたり、PCR溶液の各成分を最終濃度 として、300nM left primer, 300nM right primer, 2.5mM MgCl2, 250μM 各dNTP, 3U Expand High Fidelity Enzyme mix (Roche),1ng pUT/phoA Vectorとなるように添加し、PCR grade waterで総量を50uLにして調製した。PCRにおけるサーマルサイクルの条件は、 94℃で4分、その後 (94℃で 1分, 60℃で30秒, 72℃で1分)を25サイクル、さらに72℃で7分加熱することで行った。サーマルサイクルにはTakara Thermal cycler Dice Real Time PCR Systemを用いた。
プライマーはTS 100 E.coli lin tempGenSet, His-tag kitに含まれるT7プロモータープライマーおよびT7ターミネータープライマーを用いた。これらのプライマーを用いてPCRを行うことで、Alkaline Phospataseコード領域N末端にT7プロモーター領域、C末端にT7ターミネーター及びHis-tagコード領域を付加した形で直鎖DNAを作製することができる。
Overlap extension PCR法 (Steffan N. Ho, Site-directed mutagenesis by overlap extension using polymerase chain reaction, 1989.) を用いて、前述の野性型ERPコード直鎖DNAの活性部位周辺のアミノ酸三か所 [100番目のスレオニン(T), 101番目のアルギン酸(D), 102番目のセリン(S)]に網羅的な変異を導入した。実際の操作プロトコルを以下に示す。
First PCR 1
left primer; CGGCGTAGAGGATCGAGA,
right primer ; TGATGCAGCNNNNNNNNNGACGTAGTCC,
First PCR 2
left primer; GGACTACGTCNNNNNNNNNGCTGCATCA
right primer ; ACCCCTCAAGACCCGTTTAG
この二種類の異なるPCRによって生成された二種類のDNAは、変異導入箇所及び周辺に共通の配列を持つことになる。
left primer; CGGCGTAGAGGATCGAGA,
right primer; ACCCCTCAAGACCCGTTTAG,
ゲル粒子として臭化シアン化セファロース (CNBr - activated Sepharose 4B Fast Flow、GE Heath care)を用い(図2参照)、乾燥重量180mgのセファロースを2mLの0.1mM HCl水溶液で洗浄し、900uLまで膨潤させ、1mLだけ上澄みを除去した。(900uL分のゲル粒子はおおよそ106個と考えられ、全てのゲル粒子内で独立的な反応が進んだ場合、アミノ酸三箇所の全変異13824通りを網羅できると考えられる。)
(NH2-TTTTTTTTACCCCTCAAGACCCGTTTAG) 1.08 nmolおよびAB-NTA (Dojindo) 9.9 nmolを0.1 M炭酸水素ナトリウム水溶液 1mL中に添加し、同セファロースと混合し、4℃で一晩撹拌した。その後、余剰のCNBr活性部位を十分量の1.0Mグリシン溶液と反応させ不活性化した。最後に同ゲル粒子を十倍量の2.5mM MgCl2 in 0.1M NaHCO3 aqで6回洗浄した。
作製した粒子900uLに限界希釈濃度2.0 [copy/bead]となるようにERP変異体ライブラリー水溶液を添加し、同時にPCR系900uLを添加した。この時のPCR系の各成分の濃度として、300nMフォワードプライマー(CGGCGTAGAGGATCGAGA, 500uM 各 dNTP, 100U Expand High Fidelity Enzyme mixとなるように添加し、PCR grade waterで総量を900uLにして調製した。PCR系とゲル粒子を撹拌することで、分子を拡散によりゲル粒子内に供給した。
PCR後のゲル粒子900uLをRTS 100 E. coli HY Kit (Roche) 100uLと粒子を混合し、タンパク質合成系を粒子内に4℃で供給後、油相に再分散させ30℃で6時間、4℃で24時間静置し各ゲル粒子内でHis-tag-mutation ERPの合成を行った。油相にはspan80 1 wt%, PGCR (Taiyou Kagaku) 4 wt%を溶解したミネラルオイルを用いた。反応後はゲルビースを2mLのヘキサンで二回洗浄後、2mLのph 10 bufferで二回洗浄した。
ERPと反応して蛍光(Excitation/Emission= 345/530) 沈殿を形成するELFR 97 Phosphatase Substrate (Invitrogen) 100(in ph 10 buffer )倍希釈液1mLと無細胞タンパク質合成後のゲル粒子900uLを混合させ室温で1h反応させる。その後pH 8.0 buffer で洗浄し蛍光顕微鏡下で観察する。ゲル粒子の懸濁液を直径10cmのディッシュに展開し、ピペットマンにより粒子近傍の液体ごとゲル粒子を採取することで、蛍光を有するゲル粒子を分取した。
蛍光を有する個々のゲル粒子を1個ずつ個別にPCR試薬中に添加し、PCRを行った。このPCR試薬に含まれるプライマーの配列を次に示す。
left primer; CGGCGTAGAGGATCGAGA,
right primer ACCCCTCAAGACCCGTTTAG,
サーマルサイクルの条件は94℃で4分、その後 (94℃で 1分, 60℃で1分, 72℃で1分)を25サイクル、さらに72℃で7分加熱することで行った。生成物を精製後、定量および電気泳動による分子量確認を行った(1,643塩基)。次にABI 3500x1 genetic analyzer (Applied Biosystems)を用いて各DNA配列を解析した。野生型ERPと異なる配列を持ったDNAのみをRTS 100 E. coli HY Kit (Roche)を用いてマイクロプレート上で発現した。その後ELFR 97 Phosphatase Substrate (Invitrogen) 100倍希釈液1mL (in pH 8.0)を各ウェルに添加し、プレートリーダーで蛍光強度を経時的に読み取ることで、kcat及びKm値を算出した。
Claims (14)
- アガロースからなるゲル粒子中に固定するDNAを核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが15〜50塩基の範囲に含まれる1本鎖DNAとし、複数種のDNAが含まれる溶液を1つのゲル粒子中にDNAが平均1分子以下となる濃度でゲル粒子の懸濁液と混合することで1つのゲル粒子中に1種類のDNAを固定し、この操作と同時もしくは次いで、核酸増幅反応を行うのに必要な物質が含まれる溶液にゲル粒子を懸濁することで、核酸増幅反応に必要な物質をゲル粒子中に導入し、次いで、個々のゲル粒子中で個別の核酸増幅反応を同時に並行して行うことを特徴とする並列反応方法。
- アガロースからなるゲル粒子中にDNAを固定し、タグ配列を持つタンパク質を認識する物質をニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかとし、ゲル粒子中に固定されたDNAと相補的な配列を有する複数種のDNAが含まれる溶液を限界希釈し、この限界希釈した溶液がゲル粒子となる懸濁液を作製し、1つのゲル粒子中に1種類のDNAを固定し、次いで、タンパク質合成反応を行うのに必要な物質が含まれる溶液にゲル粒子を懸濁することで、タンパク質を合成するのに必要な物質をゲル粒子中に導入し、次いで、個々のゲル粒子中で個別のタンパク質合成反応を同時に並行して行うことを特徴とする並列反応方法。
- アガロースからなるゲル粒子中にDNAを固定し、タグ配列を持つタンパク質を認識する物質をニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかとし、ゲル粒子中に固定されたDNAと相補的な配列を有する複数種のDNAが含まれる溶液を、1つのゲル粒子中にDNAが平均1分子以下となる濃度でゲル粒子の懸濁液と混合することで1つのゲル粒子中に1種類のDNAを固定し、この操作と同時もしくは次いで、タンパク質を合成するのに必要な物質をゲル粒子中に導入し、次いで、個々のゲル粒子中で個別のタンパク合成反応を同時に並行して行うことを特徴とする並列反応方法。
- アガロースからなるゲル粒子中に固定するDNAを核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが15〜50塩基の範囲に含まれる1本鎖DNAとし、複数種のDNAが含まれる溶液を限界希釈し、この限界希釈した溶液がゲル粒子となる懸濁液を作製し、1つのゲル粒子中に1種類のDNAを固定するとともに、核酸増幅反応に必要な物質を導入し、個々のゲル粒子中で個別の核酸増幅反応を同時に並行して行った後にタンパク質を合成するのに必要な物質をゲル粒子中に導入し、次いで、個々のゲル粒子中で個別のタンパク合成反応を同時に平行して行うことをすることを特徴とする並列反応方法。
- 請求項1に記載の並列反応方法において、核酸増幅反応によってゲル粒子中のDNAを増幅させた後に、ゲル粒子中にタンパク質を合成するのに必要な物質を導入し、次いで、個々のゲル粒子中で個別のタンパク合成反応を同時に平行して行うことをすることを特徴とする並列反応方法。
- 請求項1乃至請求項5の何れか1項に記載の並列反応方法において、ゲル粒子中に核酸増幅反応およびタンパク合成反応に必要な物質を導入した後に、ゲル粒子を水と混じり合わない液体に懸濁させ、次いで前記核酸増幅反応およびタンパク合成反応を行うことを特徴とする並列反応方法。
- 請求項2乃至請求項6の何れか1項に記載の並列反応方法において、前記タンパク質を合成するのに必要な物質はアミノ酸と酵素であることを特徴とする並列反応方法。
- 請求項1に記載の並列反応方法に続いて、個々のゲル粒子に固定されているDNAの量を評価することで、元のテンプレートDNA中の特定の配列を検査する検査方法。
- 請求項2乃至請求項7の何れか1項に記載した並列反応方法に続いて、個々のゲル粒子内に固定されているタンパク質の特性を検査し、目的のタンパク質をコードするDNAを選別することを特徴とするスクリーニング方法。
- 請求項9に記載のスクリーニング方法において、前記DNAの選別は蛍光を発するゲル粒子を分取することを特徴とするスクリーニング方法。
- 核酸増幅反応プライマーとして機能することのできる15〜50塩基のDNAと、特定のタグ配列を有するタンパク質を認識する物質としてニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかを固定したゲル粒子を用いたスクリーニング方法であって、以下の工程からなることを特徴とするスクリーニング方法。
工程1
前記DNAプライマーと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変異が入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と、核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液と、アガロースからなるゲル粒子の懸濁液とを混合して、ゲル粒子内にDNAを平均1分子以下で導入・固定するとともにゲル粒子内に核酸増幅反応に必要な物質を導入する工程。
工程3
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁させる工程。
工程4
核酸増幅反応によって前記ゲル粒子中のDNAを増幅させる工程
工程5
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁させる工程。
工程6
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液とを混合する工程。
工程7
工程6でタンパク質を合成するのに必要な物質が導入されたゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁させる工程。
工程8
前記ゲル粒子内でタンパク質合成反応によってタンパク質を合成する工程。
工程9
内部でタンパク質が合成されたゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁させる工程。
工程10
ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程11
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程。
工程12
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読して、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。 - 相補的な配列を有するDNAを補足できる10塩基以上のDNAと、特定のタグ配列を有するタンパク質を認識する物質としてニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかを固定したアガロースからなるゲル粒子を用いるタンパク質のスクリーニング方法であって、以下の工程よりなるタンパク質のスクリーニング方法。
工程1
前記ゲル粒子に固定化されたDNAと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈された溶液を用いてゲル粒子を作製することで、ゲル粒子内にDNAが平均1分子以下の濃度で固定されたゲル粒子を作製する工程。
工程3
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液を混合する工程。
工程4
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再懸濁する工程。
工程5
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程6
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程7
前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬と混合する工程。
工程8
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程9
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。 - 相補的な配列を有するDNAを補足できる10塩基以上のDNAと、特定のタグ配列を有するタンパク質を認識する物質としてニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかを固定したアガロースからなるゲル粒子を用いるタンパク質のスクリーニング方法であって、以下の工程よりなるタンパク質のスクリーニング方法。
工程1
前記ゲル粒子に固定化したDNAと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と、ゲル粒子の懸濁液とを混合して、ゲル粒子内にDNAを平均1分子以下で導入・固定する工程。
工程3
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液を混合する工程。
工程4
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程5
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程6
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程7
前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程8
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程9
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。 - 核酸増幅反応プライマーとして機能することのできる15〜50塩基の1本鎖DNAと、特定のタグ配列を有するタンパク質を認識する物質としてニトリロ三酢酸(NTA)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかを固定したアガロースからなるゲル粒子を用いるタンパク質のスクリーニング方法であって、以下の工程よりなるタンパク質のスクリーニング方法。
工程1
核酸増幅反応プライマーと相補的な部位と、タンパク質をコードする遺伝子にランダムに変位の入った部位とを有する複数種のDNA(DNAライブラリー)が含まれる溶液を用意する工程。
工程2
工程1で得られた複数種のDNAが含まれる溶液を希釈し、この希釈した複数種のDNAが含まれる溶液と核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液とを混合し、この希釈・混合された複数種のDNAが含まれる溶液を用いてゲル粒子を作製することで、ゲル粒子内にDNAが平均1分子以下の濃度で固定されたゲル粒子を作製する工程。
工程3
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程4
核酸増幅反応によって前記ゲル粒子中のDNAを増幅させる工程。
工程5
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程6
タンパク質を合成するのに必要な物質を含む溶液と前記ゲル粒子の懸濁液とを混合する工程。
工程7
前記ゲル粒子を水と混じり合わない溶液に再び懸濁する工程。
工程8
タンパク質合成反応によって前記ゲル粒子中でタンパク質を合成する工程。
工程9
前記ゲル粒子を水系の溶液に再び懸濁する工程。
工程10 前記ゲル粒子とタンパク質の機能を評価する試薬とを混合する工程。
工程11
目的の機能を有するタンパク質を含むゲル粒子を分取する工程
工程12
分取したゲル粒子中に含まれるDNA配列を解読することで、目的の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を得る工程。
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