JP3772193B2 - 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを利用した蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法 - Google Patents

Description

この出願の発明は、蛋白質−蛋白質相互作用を解析するためのプローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、あらゆる生細胞中の蛋白質−蛋白質間の相互作用を精度高く、簡便に解析できる蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法に関するものである。

生細胞の構築や機能においては、蛋白質−蛋白質相互作用が重要な役割を果たしていることが知られている。

また、遺伝子の転写機構や細胞内情報伝達などに代表される分子生物学や生物化学の様々な課題の多くは、蛋白質−蛋白質相互作用が関連するものである。

分子生物学や生物化学の分野におけるこれらの研究課題の一部は、これまでに、蛋白質ライブラリー中の「獲物」蛋白質と「おとり」蛋白質との相互作用によってスクリーニングされるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９１，８８，９５７８−９５８２；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｏ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４０，２４５−２４６）などの発展によって解明されてきた。このｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法は、蛋白質−蛋白質相互作用の候補分子の同定を簡便にし、更に新たな蛋白質−蛋白質相互作用マップを作成する有効な手段として提唱されたものである（Ｆｌｏｒｅｓ，Ａ．，Ｂｒｉａｎｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｇａｄａｌ，Ｏ．，Ａｎｄｒａｕ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｕｂｂｉ，Ｌ．，Ｍｕｌｌｅｍ，Ｖ．，Ｂｏｓｃｈｉｅｒｏ，Ｃ．，Ｇｏｕｓｓｏｔ，Ｍ．，Ｍａｒｃｋ，Ｃ．，Ｃａｒｌｅｓ，Ｃ．，Ｔｈｕｒｉａｕｓ，Ｐ．，Ｓｅｎｔｅｎａｃ，Ａ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９９，９６，７８１５−７８２０；Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，Ｍｕｔａ，Ｓ．，Ｏｚａｗａ，Ｒ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｋｕｈａｒａ，Ｓ．，Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９９，９７，１１４３−１１４７；Ｗａｌｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｒｄｅｌｌａ，Ｒ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｅｍｐｌｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｂｒａｓｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｔｈｉｅｒｒｙ−Ｍｉｅｇ，Ｎ．，Ｖｉｄａｌ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０００，２８７，１１６−１２２）。しかし、このｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法では、細胞核中、レポーター遺伝子の付近で起こる解析可能な蛋白質相互作用に限って適用できるものであり、一般性に欠けるという問題があった。

また、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法は、信頼性においても問題があり、分析の度にモデル細胞あるいは動物を用いて、機能が既知となっている蛋白質による確認試験を行う必要があった（Ｗａｌｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８７，１１６−１２２）。

そこで、新たな蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法として、蛋白質との反応によりＮ−およびＣ−末端のユビキチンが再構成され、転写因子の開裂により細胞核付近にあるレポーターが活性化されるスプリットユビキチン蛋白センサー（ＵＳＰＳ）法（Ｄｕｎｎｗａｌｄ，Ｍ．，Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｎ．， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １９９９，１０，３２９−３４４；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｎ．，Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８，９５，５１８７−５１９２；Ｓｔａｇｌｊａｒ，Ｉ．，Ｋｏｒｏｓｔｅｎｓｋｙ，Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｎ．，Ｈｅｅｓｅｎ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８，９５，５１８７−５１９２）や、蛋白質間の相互作用により、触媒ドメインと膜局在化ドメインが近づき、グアニン交換因子（ＧＥＦ）またはＲａｓが再構成され、これがさらに温度敏感変異酵母ＧＥＦを有する酵母を補完するというＳＯＳ−リクルートシステムが提案された（Ａｏｎｈｅｉｍ，Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，３３７３−３３７４；Ａｒｏｎｈｅｉｍ，Ａ．，Ｚａｎｄｉ，Ｅ．，Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ，Ｈ．，Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｋａｒｉｎ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，１７，３０９４−３１０２；Ｂｒｏｄｅｒ，Ｙ．Ｃ．，Ｋａｔｚ，Ｓ．，Ａｒｏｎｈｅｉｍ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９８，８，１１２１−１１２４）。

さらに、より一般性の高いアプローチとして、スプリット酵素法が報告された（Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．，Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４，８４０５−８４１０；Ｒｅｍｙ，Ｉ．，Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９９，９６，５３９４−５３９９；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７，６８３−６９０）。この方法では、分割された酵素が蛋白質−蛋白質相互作用により再構築され、酵素活性が復旧される。このとき再構築された酵素の活性は、菌または細胞の表現型、あるいは蛍光性酵素基質によって測定できる。

これらの様々な方法は、比較的精度が高く、いずれも細胞内蛋白質や膜蛋白質の相互作用を検定する目的には適するが、適切に設計された細胞にのみ適用できる、十分な精度や感度が得られない等の問題があった。また、これらの方法は、いずれも、解析を行うために種々の基質を用いる必要があり、手間がかかるという問題もあった。

したがって、これまで、あらゆる蛋白質について、精度高く、かつ簡便に蛋白質−蛋白質相互作用を解析できる汎用性のある方法やプローブは全く知られていなかったのが実情である。

そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、あらゆる蛋白質について、高い精度で簡便に蛋白質−蛋白質相互作用を解析できる蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法を提供することを課題としている。

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのＮ−末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のＮ−末端側のポリぺプチドを含むプローブａと、inteinのＣ−末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のＣ−末端側のポリぺプチドを含むプローブｂの二つのプローブからなり、蛋白質−蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な蛍光蛋白を再生させることを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを、第２には、この出願の発明は、蛍光蛋白が、緑色蛍光蛋白である蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。

また、この出願の発明は、第３には、二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのＮ−末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のＮ−末端側のポリぺプチドを含むプローブａと、inteinのＣ−末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のＣ−末端側のポリぺプチドを含むプローブｂの二つのプローブからなり、蛋白質−蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な発光触媒酵素を再生させることを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。

さらに、この出願の発明は、第４には、発光触媒酵素が、ルシフェラーゼである蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを、第５には、inteinが酵母ＶＭＡ由来のエンドヌクレアーゼである蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを提供し、第６には、この出願の発明は、inteinが藍藻由来のＤｎａＥである蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。

そして、この出願の発明は、第７には前記第１ないし第６のいずれかのプローブａを連結した蛋白質と前記第１ないし第６いずれかのプローブｂを連結した蛋白質を共存させ、標識蛋白のシグナルを検出することを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法を提供し、第８には、前記第１ないし第７のいずれかの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを発現するポリヌクレオチドを真核細胞内に導入することによりプローブａを連結した蛋白質とプローブｂを連結した蛋白質を共存させる蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法を提供する。

図１は、この発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブの構成および作用原理を例示した概略摸式図である。（Ｉ）は共存、（ＩＩ）は蛋白質−蛋白質相互作用、（ＩＩＩ）は蛋白質スプライシング、（ＩＶ）は標識蛋白連結を示す。さらに、（１ａ）は蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブａ、（１ｂ）は蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブｂ、（２ａ）はｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド、（２ｂ）はｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド、（３）は標識蛋白を示し、とくに（３ａ）は標識蛋白のＮ−末端側のポリペプチドを、（３ｂ）は標識蛋白のＣ−末端側のポリペプチドを示す。（４ａ）は蛋白質（または蛋白質部位）Ａ、（４ｂ）は蛋白質（または蛋白質部位）Ｂを示す。

図２は、この発明の実施例において、ＥＧＦＰのＮ−末端側のポリペプチドの構造について、 Ｉ１２４〜Ｉ１２９の間で置換したアミノ酸残基を示した図である。

図３は、この発明の実施例において、大腸菌中で発現され、ｐＧＥＸ＿ＮＶＣで変換された蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示した図である。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（ａ）は蛋白質分子量標準（Ｎｏｖａｇｅｎ）と分子量（ｋＤａ）、（ｂ）はＧＳＴ−アフィニティーカラム前の粗生成物、（ｃ）はＧＳＴ−アフィニティーカラムによる精製後を示す。また、（ｄ）〜（ｅ）は溶解産物の粗生成物のウェスタンブロッティングを示し、（ｄ）はＶＤＥ特異的抗体による分析結果、（ｅ）はＧＦＰ特異的抗体による分析結果を示す。

図４は、この発明の実施例において作成されたプラスミド（蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞）の構成を示した概略摸式図である。帯上は制限酵素切断領域であり、破線はＶＤＥｉｎｔｅｉｎのエンドヌクレアーゼドメイン、白帯はエンドヌクレアーゼを有さないＶＤＥｉｎｔｅｉｎ、黒帯はＧＳＴ標識、斜線はＨｉｓ標識を示す。また、格子模様はリンカーを、ｓｔｏｐは翻訳停止コドンを示し、ｓｔａｒｔは翻訳開始コドンを意味する。

図５は、この発明の実施例において、蛋白質ＣａＭと蛋白質Ｍ１３の相互作用によるスプライシング結果を示した図である。（ａ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（Ｃ／Ｍ）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、（ｂ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（Ｍ／Ｃ）、（ｃ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（／）ｇｅｎｅ１、（ｄ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）、（ｅ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｍ／Ｃ）、（ｆ）はｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）を示し、（Ａ）はａｎｔｉ−Ｈｉｓ標識によるウェスタンブロッティング、（Ｂ）はａｎｔｉ−ＧＦＰによるウェスタンブロッティングの結果を示す。

図６は、この発明の実施例において作成された各プラスミド（蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞）を有する大腸菌からの粗生成物の蛍光スペクトルを示した図である（励起：４７０ｎｍ、５．０ｎｍバンド幅、発光：５．０ｎｍバンド幅）。（ａ）はＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）、（ｂ）はＮＶＣΔＳＤ（Ｃ／Ｍ）、（ｃ）はＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）を示す。

図７は、この出願の発明の実施例において用いられるプラスミドの構成を示した図である。点線は細胞内リボソーム結合サイト（ＩＲＥＳ）を示す。また、ｐＬｕｃＡｌｌ、ｐＬｕｃＮ、およびｐＬｕｃＣのｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入されている。ｓｔｏｐおよびｓｔａｒｔは翻訳の停止および開始コドンを表す。

図８は、この出願の発明の実施例において、ＬｕｃＮのみ、ＬｕｃＣのみ、およびＬｕｃＡｌｌの発光強度を示す図である。

図９は、この出願の発明の実施例におけるインシュリン添加による蛋白質スプライシングの増加を示した図である。

図１０は、この出願の発明の実施例におけるアミノ酸変異の影響を示す図である。

図１１は、この出願の発明の実施例におけるＬｕｍ＿Ｆ発光強度のインシュリン濃度依存性を示す図である。

この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブは、各プローブを連結させた二つの蛋白質が相互作用することによってスプライシングが起こり、プローブ中に含まれる分割された標識蛋白部位が連結して標識蛋白を再生し、シグナルを発するという原理に基づくものである。

蛋白質スプライシングとは、翻訳後の蛋白質から内部蛋白セグメント（ｉｎｔｅｉｎ）が切り出されるプロセスである。このとき、ｉｎｔｅｉｎの切り出しと同時にフランキング配列（ｅｘｔｅｉｎ）の連結も生じる（Ｇｉｍｂｌｅ，Ｆ．Ｓ．，Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．１９９８，５，Ｒ２５１−２５６）。

この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブは、このようなｉｎｔｅｉｎの自己切り出しを巧妙に応用することにより、蛋白質間の相互作用を解析するものである。

つまり、この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブは、２つの蛋白質に各々連結される２つのプローブａ、ｂからなるものである。図１にこの出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブの原理を表す概略摸式図を示した。

２つのプローブａ（１ａ）およびプローブｂ（１ｂ）において、プローブａ（１ａ）は、ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド（２ａ）と標識蛋白のＮ−末端側のポリペプチド（３ａ）を含むものであり、プローブｂ（１ｂ）は、ｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド（２ｂ）と標識蛋白のＣ−末端側のポリペプチド（３ｂ）を含むものである。

これらのプローブａ（１ａ）およびｂ（１ｂ）を、各々相互作用を解析したい蛋白質Ａ（４ａ）およびＢ（４ｂ）に連結することにより、蛋白質Ａ−Ｂ間の相互作用が解析される。すなわち、プローブａ（１ａ）およびプローブｂ（１ｂ）を連結した蛋白質Ａ（４ａ）と蛋白質Ｂ（４ｂ）が共存（Ｉ）するとき、これらの蛋白質（４ａ、４ｂ）が相互作用（ＩＩ）すれば、ｉｎｔｅｉｎ（２）がスプライシング（ＩＩＩ）によって切り出される。これによりｉｎｔｅｉｎ（２）に結合されている標識蛋白部位（３ａ、ｂ）が連結される（ＩＶ）ので、得られた標識蛋白（３）を解析すれば、蛋白質−蛋白質相互作用を確認することができるのである。

このとき、蛋白質Ａ（４ａ）と蛋白質Ｂ（４ｂ）が相互作用（ＩＩ）しなければ、ｉｎｔｅｉｎのスプライシング（ＩＩＩ）が起こらないため、標識蛋白（３）は再生（ＩＶ）されず、検出することができない。

この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブでは、各プローブａ、ｂ（１ａ、１ｂ）は、ｉｎｔｅｉｎのポリペプチドと標識蛋白のポリペプチドのみからなるものであってもよいが、これら以外に、リンカー配列等を含んでいてもよい。したがって、プローブａ、ｂ（１ａ、１ｂ）においてｉｎｔｅｉｎのポリペプチド（２ａ、２ｂ）と標識蛋白のポリペプチド（３ａ、３ｂ）は、直接結合されていてもよいし、リンカー配列などのポリペプチドを介して結合されていてもよいのである。

また、このようなｉｎｔｅｉｎとしては、種々の生物由来の公知のものが適用できる。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）Ｓｃｅ ＶＭＡ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉａｌｌｉｓ（ガンジタ菌）ＣｔｒＶＭＡなどに代表される真核生物由来のもの、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）Ｍｔｕ ｒｅｃＡなどの真正細菌由来のもの、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｓｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（サーモプラスマアシドフィラム）Ｔａｃ ＶＭＡなどの古細菌由来のもの等が挙げられる。また、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（藍藻）由来のＤｎａＥもｉｎｔｅｉｎとして例示される。

この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）において、蛋白質Ａ（４ａ）と蛋白質Ｂ（４ｂ）の間に相互作用があるとき、ｉｎｔｅｉｎが自動的に切り出されるためには、ｉｎｔｅｉｎは、部位特異的エンドヌクレアーゼであることが好ましい。

具体的には、酵母ＶＭＡ由来のｉｎｔｅｉｎや藍藻由来のＳｓｐ Ｄｎａ Ｅｉｎｔｅｉｎが好ましく例示される。酵母ＶＭＡでは、新生翻訳生成物である１２０ｋＤａ ＶＭＡ１が蛋白質スプライシングを触媒し、７０ｋＤａのＨ^＋−ＡＴＰａｓｅサブユニットと、５０ｋＤａの部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＶＤＥ、またはＰＩ−Ｓｃｅｌ）を与える。このＶＤＥは、上記蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）におけるｉｎｔｅｉｎ部位（２ａ、２ｂ）として好ましく用いられる。また、藍藻由来のＳｓｐ ＤｎａＥでは、ｓｔｒａｉｎ ＰＣＣ６８０３が、そのＤＮＡ配列が明らかになっている（Ｎ−末端側に１２３アミノ酸残基、Ｃ−末端側に３６アミノ酸残基を有する）上、天然の分割ｉｎｔｅｉｎであり、Ｎ−およびＣ−ｅｘｔｅｉｎの結合を起こすことが知られている（Ｗｕ，Ｈ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｘ．−Ｑ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８，９５，９２２６−９２３１）ため、扱い易く、上記蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）におけるｉｎｔｅｉｎ部位（２ａ、２ｂ）として好ましく用いられる。

以上に例示される種々のｉｎｔｅｉｎの中でも藍藻由来のＳｓｐ ＤｎａＥｉｎｔｅｉｎが、哺乳動物細胞における蛋白質−蛋白質間の相互作用をも感度高く検出でき、好ましい。もちろん、これ以外の、公知あるいは新規のｉｎｔｅｉｎを用いてもよい。

さらに、この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）では、ｉｎｔｅｉｎのスプライシング（ＩＩＩ）が有効に起こるためには、蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ１ａと１ｂにおいて、蛋白質のスプライシングに関与する二つの部位が隣接するように、正しく折り畳まれ、かつ、各部位が正確に並べられなければならない（Ｄｕａｎ，Ｘ．，Ｇｉｍｂｌｅ，Ｆ．Ｓ．ａｎｄ Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．，Ｃｅｌｌ １９９７，８９，５５５−５６４）。したがって、ｉｎｔｅｉｎとしては、生物由来のものをそのまま用いてもよいが、一部のアミノ酸残基を変換したり、削除したり、適当なリンカー配列を導入したりして、スプライシングが起こりやすいように設計してもよい。

例えば前記のＶＤＥでは、エンドヌクレアーゼドメインを削除し、屈曲性のドデカペプチドリンカーで置き換えた変異体において、高いスプライシング活性を示すことが知られている（Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｔ，Ｈ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９３，１２，２５７５−２５８３；Ｃｈｏｎｇ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｍ．−Ｑ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７ ２７２，１５５８７−１５５９０）。一方、藍藻Ｓｓｐ ＤｎａＥでは、前記のとおり、天然の開裂ｉｎｔｅｉｎであり、正しく折りたたまれてスプライシングが起こることが知られているが、とくにリンカー配列を導入してもしなくてもよい。

以上のとおりのｉｎｔｅｉｎは、Ｎ−末端側のポリペプチド（２ａ）とＣ−末端側のポリペプチド（２ｂ）に分割される。この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）では、分割されたポリペプチド（２ａ、２ｂ）は、標識蛋白のＮ−末端側のポリペプチド（３ａ）、およびＣ−末端側のポリペプチド（３ｂ）に各々結合されてプローブとなる。

一方、この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａ、１ｂ）において、用いられる標識蛋白部位は、蛋白質ＡおよびＢの相互作用（ＩＩ）により、各プローブａ、ｂ（１ａ、１ｂ）からｉｎｔｅｉｎがスプライシング（ＩＩＩ）したとき、直接ペプチド結合し、連結（ＩＶ）されるものである。このような標識蛋白（３）は、連結（ＩＶ）により再び解析可能となるものであれば、どのようなものであってもよい。例えば、蛍光蛋白や発光触媒酵素が好ましく適用される。緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）などの蛍光蛋白は、連結されたとき発光し、可視的に解析でき、好ましい。また、ルシフェラーゼ等の発光触媒酵素も連結されて活性中心を形成し、ルミノメーターで容易に検出可能な光を発するため、好ましい。このとき、分割されたルシフェラーゼのＮ−およびＣ−末端が、夫々個々では蛍光を示さず、結合して再び活性を取り戻すようにするためには、活性中心を２つに分割するような分け方をする必要がある。ルシフェラーゼ酵素は、活性中心を含む広い間隔を挟んで、一つのβ−バレルと二つのβ−シートからなる大きなＮ−末端ドメインとＣ−末端部位の二つのドメインに折り畳まれていることが知られている（Ｗａｕｄ，Ｊ．Ｐ．，Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙ，Ｇ．Ｂ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｓ．Ｂ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１９９６，１２９２，８９−９８；Ｃｏｎｔｉ，Ｅ．，Ｆｒａｎｋｓ，Ｎ．Ｐ．，Ｂｒｉｃｋ，Ｐ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９６，４，２８７−２９８）。したがって、これらの二つのドメインが連結している柔軟な部位で分割して、３ａおよび３ｂとするとよい。さらに、ルシフェラーゼ酵素では、Ｎ−末端側のポリペプチド（３ａ）に、ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド（２ａ）との結合部位に、システイン（Ｃｙｓ）残基、その−１上流側にチロシン（Ｔｙｒ）残基、または−３、−４位に各々アラニン（Ａｌａ）とフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を有することにより、さらに効率的なスプライシングが起こり易くなることが知られていることから、４３７番目のアルギニン残基をシステインに変換した変異体（Ｒ４３７Ｃ）、４３６番目のアスパラギン酸残基をチロシンに変換した変異体（Ｄ４３６Ｙ）、４３４番目のイソロイシン残基をアラニンに変換した変異体（Ｉ４３４Ａ）等の変異体を作成し、効率的なスプライシングが起こるようにしてもよい。

この出願の発明では、以上のとおりの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブが提供される。そして、一方のプローブ（例えばプローブａ）を相互作用を確かめたい一方の蛋白質（蛋白質Ａ）に連結させ、もう一方のプローブ（プローブｂ）を相互作用を確認したいもう一方の蛋白質（蛋白質Ｂ）に連結して両者を共存させることにより、以上のとおりの原理、機構に基づき、蛋白質Ａ−Ｂ間の相互作用が解析できるのである。

各蛋白質（４ａ、４ｂ）とプローブ（１ａ、１ｂ）の連結方法は、蛋白質やプローブに影響を及ぼさなければ、どのような方法であってもよい。例えば、通常用いられる化学的、生物化学的、あるいは、遺伝子工学的手法等が適用できる。また、以上のとおりの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを用いて蛋白質−蛋白質間の相互作用（発光）を検出、解析する方法は、どのようなものであってもよい。一般的に化学、生物化学等の分野で用いられる実験的手法や検出器を適用すればよく、例えばルミノメーター等を用いて簡便に検出、解析できる。

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。

実施例１ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞の作成
蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞のｉｎｔｅｉｎ部位としては、酵母ＶＭＡ１由来のｉｎｔｅｉｎ（ＶＤＥ）を用いた。

以下、ＶＤＥの４５４のアミノ酸のうち、Ｃｙｓ１を最初のアミノ酸残基、Ａｓｎ４５４を最後のアミノ酸残基とする。また、Ｃ＿ｅｘｔｅｉｎは、Ｃｙｓ４５５から開始し、Ｃｙｓ１に隣接した ｅｘｔｅｉｎ残基を−１とナンバリングする。以下Ｎ−ｅｘｔｅｉｎ方向に−２、−３・・・と数字が大きくなる。

標識部位としては、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光蛋白（ＥＧＦＰ：例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９６，６（２）；１７８−１８２）を用いた。

蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞では、スプライシング結合部としては、ＥＧＦＰのＮ−末端側のポリペプチドに１つのＣｙｓ残基、−１位の上流にあるＧｌｙ残基、−５、−４、−３の３つの疎水性アミノ酸残基が存在することが必要である。

したがって、ＥＧＦＰのＮ−末端側のポリペプチドの構造が比較的安定なＩ１２４〜Ｉ１２９の間でアミノ酸残基を以下のように置換した（図２）。

（１）ＥＧＦＰのＩ１２９ＣおよびＥ１２５Ｉの変異を行なった。これらは蛍光を呈し、ＥＧＦＰのそれと同等の４８８ｎｍおよび５１０ｎｍに励起および発光ピークを示した。

（２）さらにｍ１２５にＬ１２６Ｙの変異を行なった場合には、発現レベルが同じであるにもかかわらず、蛍光が見られなくなった。

以上より、Ｌ１２６Ｙの変異によりｍ１２９ＥＧＦＰ変異体が不正に折り畳まれるようになったこと、および／または、蛍光蛋白部位が連結できないことが示された。

そこで、Ｉ１２９ＣおよびＥ１２５Ｉの変異を行ったｍ１２５ＥＧＦＰ変異体を蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブの標識蛋白部位として用いた。以下、この標識蛋白部位をＥＧＦＰ変異体と呼ぶ。
実施例２ 単一ポリペプチドにおけるスプライシングの確認
ＶＤＥがＥＧＦＰ変異体のＮ−末端側ポリペプチドおよびＣ−末端側ポリペプチドに挟まれた単一のポリペプチドにおいて、蛋白質スプライシングが生じるかを確認するために、大腸菌中でｐＧＥＸ＿ＮＶＣの発現を２５℃で行なった。

（１）大腸菌のＤＨ５α株を用いてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白を発現した。ＶＤＥ領域とＥＧＦＰ変異体のＮ−およびＣ−末端側ポリペプチドを覆うプラスミドをｔａｃプロモーターの制御下で、このＧＳＴ遺伝子に融合した。これより、ＧＳＴ（２６−ｋＤａ）、ＥＧＦＰ変異体のＮ−末端側ポリペプチドから１２５残基（１３−ｋＤａ）、ＶＤＥ（５０−ｋＤａ）、および変異体のＣ−末端側ポリペプチド（１４−ｋＤａ）からなるキメラ蛋白質が得られた。

（２）得られた蛋白質を大腸菌から抽出、精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。１２〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、標識蛋白と１０〜２２５−ｋＤａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加し、電気泳動を行なった。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色し、可視化した。

ウェスタンブロッティングは、ａｎｔｉ−ＶＤＥポリクローナル抗体、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ標識ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはａｎｔｉ−ＧＦＰモノクローナル抗体（ＢｉｏＲａｄ）をプローブとして行なった。

クローニングに必要な酵素は、すべてＴａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから入手し、製造元のマニュアルに従って用いた。

ＰＣＲ断片は、ＡＢＩ３１０ジェネティックアナライザーによってシーケンスされた。

粗生成物の主成分は、〜５０−ｋＤａの蛋白質であった（図３ｂ）。これは、ＶＤＥ（５０−ｋＤａ）およびＧＳＴと連結したｅｘｔｅｉｎの大きさと一致した。つまり、ＧＳＴとＥＧＦＰ変異体のＮ−末端側ポリペプチド（２６−ｋＤａ＋１３−ｋＤａ）の融合蛋白質であると考えられる。

これより、融合蛋白質の１０３−ｋＤａ前駆体が５０−ｋＤａのＶＤＥと５３−ｋＤａのＧＳＴ−ＥＧＦＰ変異融合蛋白質に分割されたことが分かった。

さらに、ＶＤＥとＧＳＴ−ＥＧＦＰ変異融合蛋白質の分子量を、ウェスタンブロッティングより評価した。

Ａｎｔｉ−ＶＤＥおよびａｎｔｉ−ＧＦＰ抗体は、それぞれ、切り出された５０−ｋＤａ ｉｎｔｅｉｎ（図３ｄ）および５３−ｋＤａ ＧＳＴ−ＥＧＦＰ変異融合蛋白（図３ｅ）と特異的に反応した。また、スプライシングされない前駆体の１００−ｋＤａ付近に見られる成分は、いずれの抗体によっても解析された。

ＧＳＴ−アフィニティーカラムによってさらにＧＳＴ−ＥＧＦＰ変異融合蛋白の同定を行なった。粗生成物をアフィニティーカラムに通し、樹脂に結合した蛋白質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（図３ｃ）ところ、２５−ｋＤａにバンドが見られた。これは、ＥＧＦＰ変異体の分子量とほぼ一致した。

（３）次にアフィニティーカラムによって精製された蛋白質の蛍光スペクトルを測定したところ、励起および発光の最大波長は、それぞれ４８８ｎｍおよび５１０ｎｍとなり、ＥＧＦＰの値とよく一致した。

以上の結果より、スプライシングによって単一ポリペプチドの中央にあったＶＤＥが切り出され、ＥＧＦＰ変異体のＮ−およびＣ−末端のポリペプチドがペプチド結合によって連結し、得られたＥＧＦＰ変異体が正しく折りたたまれて蛍光体となることが示された。
実施例３ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞の有効性
（１）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を用いてＮ−末端にＨｉｓ標識を結合した組換え融合蛋白質を得た。

蛋白質−蛋白質相互作用を試験するために、ｐＧＥＸ＿ＮＶＣのＧＳＴをｐＥＴ１６−ｂベクターのＨｉｓ標識で置換し、スプライシングの機能部位を分割してｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（／）を得た。

この分割は、１８５〜３８９アミノ酸領域に存在する機能的に不要なエンドヌクレアーゼモチーフを〈（翻訳停止コドン）−（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）−（翻訳開始コドン）〉からなるカセットで置換することにより実現した。

得られたプラスミドｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（／）は、主にＥＧＦＰとＶＤＥのＮ−末端側のポリペプチド（Ｎ＿ＥＧＦＰ−ＶＤＥ）をコードするｇｅｎｅ１と、ＶＤＥとＥＧＦＰのＣ−末端側のポリペプチド（Ｃ＿ＶＤＥ−ＥＧＦＰ）をコードするｇｅｎｅ２からなる２遺伝子オペロンであった。

蛋白質−蛋白質相互作用の際に、ＶＤＥのＮ−およびＣ−末端側のポリペプチドが空間的に近位にあるようにするために、図４に示されるように、翻訳停止コドンと翻訳開始コドンの間にＧｌｙ−Ａｓｎ繰り返し配列を有する屈曲性のペプチドリンカーを導入した（ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／））。

大腸菌内においてＥＧＦＰを与えるスプライシング現象を容易に起こすような特別な蛋白質−蛋白質相互作用が存在するかを確認するために、カルモジュリン（ＣａＭ）とそのターゲットペプチドであるＭ１３をモデル蛋白質として選択した。

ＣａＭおよびＭ１３の構造は、ＮＭＲにより明らかになっている（Ｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９２，２５６，６３２−６３８）ため、ＣａＭ中の任意のアミノ酸からＭ１３中の任意のアミノ酸までの距離が分かり、好ましい。

（２）組換えプラスミドｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（Ｃ／Ｍ）、ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）、およびｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）を大腸菌細胞内に導入し、対応する融合蛋白質を得た。

菌内でスプライシングを起こすために、蛋白発現を２５℃にて１２時間行い、その後４℃で１〜２日間保存した。

ｇｅｎｅ１の発現蛋白は、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ標識抗体によって確認された（図５Ａ）。また、抗体によって解析された主成分は、５５−ｋＤａ蛋白（図５Ａａ、ｄ）であり、これらはＮ＿ＥＧＦＰ−ＶＤＥ（３６−ｋＤａ）のスプライシングされない前駆体とＣａＭ（１７−ｋＤａ）、または、その連結リンカー（１−ｋＤａ）の大きさと同程度であった。

コントロールとして、ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）プラスミドを有する大腸菌の溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、Ｎ＿ＥＧＦＰ−ＶＤＥの単一バンドが得られた（図５Ａｆ）。

これら３種のプラスミドから得られたスプライシングされない前駆体蛋白質の発現レベルはほぼ同一であった。

一方、ｇｅｎｅ２の蛋白質生成物は、ａｎｔｉ−ＧＦＰモノクローナル抗体によって識別され、ＥＧＦＰのＣ−末端側のポリペプチドであることが分かった。

さらに、ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（Ｃ／Ｍ）およびｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）を発現した細胞において、遺伝子オペロンから得られた発現蛋白の大きさは、Ｎ＿ＶＤＥ−ＥＧＦＰ（２０−ｋＤａ）とＭ１３（３−ｋＤａ）（図５Ｂａ）または含リンカ−Ｍ１３（４−ｋＤａ）（図５Ｂｄ）の前駆体蛋白質のそれとよく一致した。同様に、コントロールプラスミドは、予想された蛋白質を発現した（図５Ｂｆ）。オペロンＩＩから得られた３つの蛋白質は、いずれも同じ発現レベルであった。

図６に各プラスミドを保有する大腸菌溶解産物の蛍光スペクトルを示した。ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）を含む大腸菌では、スペクトル変化は見られなかった。ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤ（Ｃ／Ｍ）を有する大腸菌中で、ＣａＭとＭ１３を共発現したところ、５１０ｎｍにおける蛍光発光に若干の変化が見られた。一方、Ｎ＿ＥＧＦＰ−ＶＤＥおよびＣ＿ＶＤＥ−ＥＧＦＰに屈曲性のペプチドリンカーを結合したＣａＭおよびＭ１３の共発現では、５１０ｎｍの蛍光が大きく変化した。ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）を有する大腸菌からの粗生成物の蛍光強度は、コントロールプラスミドｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（／）または屈曲性リンカーｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）をコードしないプラスミドを有する細胞を識別するのに十分であった。

これらの結果より、ＣａＭとＭ１３の相互作用により、ｉｎ ｔｒａｎｓでスプライシングが起こり、ＥＧＦＰ変異体のＮ−およびＣ−末端の二つの外部領域が連結してＥＧＥＰ蛍光体を形成することが示された。
実施例４ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜１＞におけるリンカーの効果
スプライシングが起こるためには、ＶＤＥにおけるＮ−およびＣ−末端が正しく折り畳まれなくてはならない。このような折り畳みは、Ｃ−末端のＮ＿ＶＤＥがＮ−末端のＣ＿ＶＤＥと近位にあるとき生じる。

ＣａＭとＭ１３の場合、ＣａＭのＮ−末端およびＭ１３のＣ−末端の間の距離は、５０Åであった（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋより）。この距離は、Ｎ＿ＶＤＥおよびＣ＿ＶＤＥが隣接するには大きすぎる可能性があり、したがって、ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）プラスミドを有する大腸菌での正しい折り畳みを阻害しているものと考えられた。

しかし、実際には、ｐＥＴ＿ＮＶＣΔＳＤｌｉｎｋｅｒ（Ｃ／Ｍ）プラスミドでの５１０ｎｍで蛍光強度の明らかな増大が見られ、Ｎ＿およびＣ＿ＶＤＥにそれぞれ結合した１０−および９−アミノ酸リンカーがＶＤＥの折り畳みに必要な屈曲性を持たせ、ＶＤＥが効率よくスプライシングするコンホメーションがとられていることが示された。
実施例５ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞の作成
以下、プラスミドの作成は、大腸菌のｓｔｒａｉｎＤＨ５α株を宿主として行った。

蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞のｉｎｔｅｉｎ部位としては、藍藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＥを、標識蛋白としては、野生ホタル由来のルシフェラーゼ（Ｌｕｍ＿Ｆ）（ｐＬｕｃＡｌｌ）を４３７アミノ酸と４３８アミノ酸の間で分割し、Ｎ−末端側（ｐＬｕｃＮ）およびＣ−末端側（ｐＬｕｃＣ）として用いた。

図７にこれらのルシフェラーゼおよびルシフェラーゼ片の構成を示した。

（１）ルシフェラーゼの分割
まず、ｐＬｕｃＮおよびｐＬｕｃＣが酵素活性を失っていることを確認するために、ヒトインシュリンリセプターを過剰発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＨＩＲ）に各ルシフェラーゼ片を過渡的に発現させた。

１μｇのプラスミド（ｐＬｕｃＡｌｌ、ｐＬｕｃＮ、およびｐＬｕｃＣ）と０．０１μｇのコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともにＣＨＯ−ＨＩＲにトランスフェクションし、１２ウェルプレート中で４５時間培養した。培養後、発光をルミノメーターで測定した。

また、コントロールとして、プラスミドを含まないＣＨＯ−ＨＩＲを同条件で培養した。

プレート中のウェル毎のトランスフェクション効率の誤差を補正するために、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）由来のルシフェラーゼ（Ｌｕｍ＿Ｒ）を用いたｄｕａｌ−ルシフェラーゼ アッセイを行い、ウェル毎のトランスフェクション効率を補正した。

図８に各ルシフェラーゼ（またはルシフェラーゼ片）の相対発光強度（ＲＬＵ）を示した。

野生ホタルルシフェラーゼ（ＬｕｃＡｌｌ）を発現したＣＨＯ−ＨＩＲでは、ＲＬＵは、１１．４であった（図８ａ）が、ＬｕｃＮおよびＬｕｃＣのみを発現したＣＨＯ−ＨＩＲでは、ＲＬＵは、それぞれ２．２×１０^−４および４．５×１０^−５であった（図８ｂ）。また、Ｌｕｍ＿Ｒそのものを形質移入したＣＨＯ−ＨＩＲのＲＬＵ（バックグランド）は、２．２×１０^−４であったことから、ＬｕｃＮおよびＬｕｏＣのみでは発光活性を有さないことが示された。

（２）ＤｎａＥの分割
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＥは、前記のとおり、Ｎ−末端側の１２３アミノ酸残基とＣ−末端側の３６アミノ酸残基を用いた。

（３）蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞
上記（２）のＤｎａＥのＮ−末端側と（１）のＬｕｃＮを、また、上記（２）のＤｎａＥのＣ−末端側と（１）のＬｕｃＣを、各々連結し、バイシストロン性発現ベクターであるｐＩＲＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入し、ｐＩＲＥＳ−ＤＳＬを得た。得られたプラスミド（ｐＩＲＥＳ−ＤＳＬ）は、Ｎ−末端ＤｎａＥの３’−末端側とＣ−末端側ＤｎａＥの５’−末端に二つのＭＣＳ（各々、ＭＣＳ−ＡおよびＭＣＳ−Ｂ）を有し、これらのＭＣＳには、相互作用する、または相互作用を調べたい蛋白質や蛋白質ドメインを導入することができる。

図７にｐＩＲＥＳ−ＤＳＬの構成を示した。
実施例６ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞の有効性１
（１）実施例５で作成した蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞が有効に作用し、ルシフェラーゼのスプライシングを起こすことを確認するために、生理学的にインシュリン情報伝達に関与することで知られるＩＲＳ−１の９４１番目のチロシン残基を含むオリゴペプチド（Ｙ９４１）およびそのターゲット蛋白であるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ由来のＳＨ２Ｎドメイン（Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ１９９７，４０，Ｓ２−Ｓ１７）を用いた。

前記ＭＣＳ−ＡにＹ９４１を、ＭＣＳ−ＢにＳＨ２Ｎを挿入したｐＩＲＥＳ−ＤＳＬ（Ｙ／Ｓ）とｐＲＬ−ＴＫベクターをＣＨＯ−ＨＩＲに過渡的に共発現させた。

図７にｐＩＲＥＳ−ＤＳＬ（Ｙ／Ｓ）の構成を示した。

まず、６ウェルプレート中で２μｇのプラスミド（ｐＩＲＥＳ−ＤＳＬ（Ｙ／Ｓ））および０．０２ｎｇのコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）をＣＨＯ−ＨＩＲ細胞にトランスフェクションした。４５時間の培養後、培養液をＦＢＳを含まない１．０×１０^−７Ｍのヒトインシュリン溶液で置換し、ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞を７２時間、３時間、および５分間培養（３７℃）して刺激した。５分間培養した細胞は、その後、インシュリン溶液をＦＣＳ−フリーでインシュリンを含まない培養液で１７５分間培養した。

インシュリン刺激後のＲＬＵによる発光強度を図９に示した。

ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞がインシュリンにより７２時間、３時間、および５分間刺激された際の補正後のルシフェラーゼ活性は、各々１．０、０．７３、０．１８であった。また、インシュリンを含まない培養液で培養した際の発光強度（バックグランド）は、０．１５であり、５分間インシュリン刺激を行った結果とほぼ同等であることが分かった。

さらに、３時間以上インシュリンによる刺激を行った際のＲＬＵによる発光強度は、バックグランド値の４倍以上であることが示された。ここで見られたキナーゼ活性は、インシュリンレセプターによってリン酸化されたＹ９４１ペプチド（９４１番目のアミノ酸＝チロシン）とＳＨ２Ｎの特異的な相互作用によるものであり、蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞においてＤｎａＥのｉｎ ｔｒａｎｓでの折り畳みとスプライシングが効率的に起こり、ＬｕｃＮとＬｕｃＣが連結してルシフェラーゼ発光が再現されたことが明らかとなった。

そこで、Ｙ９４１におけるチロシン残基をインシュリンリセプターによってリン酸化されないアラニン残基に変換したＹ９４１変異体を作成し、同様の試験を行った。

結果を図１０に示した。

Ｙ９４１変異体を発現させたＣＨＯ−ＨＩＲ細胞では、補正後のルシフェラーゼ発光はバックグランドと同程度であったことから、Ｙ９４１のチロシンのリン酸化によりＳＨ２Ｎと蛋白質間相互作用が起きたことが確認された。
実施例７ 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞の有効性２
実施例５で作成された蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ＜２＞を用いてＣＨＯ−ＨＩＲ細胞におけるインシュリン誘発蛋白質相互作用の定量的解析を行った。

まず、ＲＬＵ値のインシュリン濃度依存性を確認した。ＣＨＯ−ＨＩＲを前記のとおりにｐＩＲＥＳ−ＤＳＬ（Ｙ／Ｓ）とｐＲＬ−ＴＫで共発現した後、前記の方法で１．０×１０^−１３〜１．０×１０^−７Ｍの範囲の各濃度のインシュリンを用いて３７℃で３時間刺激した。

ＲＬＵによる発光強度を図１１に示した。

発光強度はインシュリン濃度に伴って増大することが確認された。

以上詳しく説明したとおり、この発明によって、蛋白質−蛋白質相互作用を精度高く、かつ簡便に解析するための蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブが提供される。また、この蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法が提供される。

この蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法では、従来の方法のようにレポーター遺伝子や基質を用いる必要がなく、簡便で精度高い解析が可能となる。また、哺乳動物細胞においても感度高く蛋白質−蛋白質相互作用を解析できる。

したがって、この発明の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを用いれば、細胞膜での蛋白質間の相互作用や細胞内におけるホルモンによるレセプターの活性化など、あらゆる生体内での蛋白質−蛋白質相互作用の機構を短時間で簡便に解析することが可能となる。

Claims (8)

1. 二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのＮ−末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のＮ−末端側のポリぺプチドを含むプローブａと、inteinのＣ−末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のＣ−末端側のポリぺプチドを含むプローブｂの二つのプローブからなり、蛋白質−蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な蛍光蛋白を再生させることを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
2. 蛍光蛋白が、緑色蛍光蛋白である請求項１の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
3. 二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのＮ−末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のＮ−末端側のポリぺプチドを含むプローブａと、inteinのＣ−末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のＣ−末端側のポリぺプチドを含むプローブｂの二つのプローブからなり、蛋白質−蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な発光触媒酵素を再生させることを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
4. 発光触媒酵素が、ルシフェラーゼである請求項３の蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
5. inteinが酵母ＶＭＡ由来のエンドヌクレアーゼである請求項１ないし４のいずれかの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
6. inteinが藍藻由来のＤｎａＥである請求項１ないし４のいずれかの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ。
7. 請求項１ないし６記載のいずれかのプローブａを連結した蛋白質と請求項１ないし６記載のいずれかのプローブｂを連結した蛋白質を共存させ、標識蛋白のシグナルを検出することを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法。
8. 請求項１ないし６記載のいずれかの蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブを発現するポリヌクレオチドを真核細胞内に導入することによりプローブａを連結した蛋白質とプローブｂを連結した蛋白質を共存させる請求項７の蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法。

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