DE60033551T2 - Sonde zum analysieren von protein-protein-wechselwirkungen und entsprechendes verfahren dafür - Google Patents

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    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung dieser Anmeldung betrifft eine Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung und ein Verfahren zur Verwendung einer solchen Sonde für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Konkreter betrifft die Erfindung eine Sonde für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung und ein Verfahren zu deren Verwendung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, welches eine genaue und einfache Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in allen lebenden Zellen ermöglicht.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist wohlbekannt, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen Schlüsselrollen bei der strukturellen und funktionellen Organisation lebender Zellen spielen.
  • Viele ungelöste Probleme, die derzeit in der Molekularbiologie und Biochemie untersucht werden, wie z.B. Gentranskriptionsmechanismen und intrazelluläre Informationsübertragung, stehen in Bezug zu Protein-Protein-Wechselwirkungen.
  • Einige der Probleme auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biochemie wurden allmählich gelöst durch die Entwicklung von Proteinbank-Screeningtechniken, wie z.B. eine Zwei-Hybrid-Strategie, bei der eine Bank von "Target"-Proteinen hinsichtlich der Wechselwirkung mit "Köder"-Proteinen gescreent wird (Chien, C. T., Bartel, P. L., Sternglanz, R., Fields, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 9578-9582; Fields, S., Song, O., Nature 1989, 340, 245-246). Das Zwei-Hybrid-Verfahren erleichtert die Identifizierung von potentiellen Protein-Protein-Wechselwirkungen und wurde als effektives Verfahren zur Generierung von Protein-Wechselwirkungskarten vorgeschlagen (Flores, A., Briand, J. F., Gadal, O., Andrau, J. C., Rubbi, L., Mullem, V., Boschiero, C., Goussout, M., Marck, C., Carles, C., Thuriaus, P., Sentenac, A., Werner, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 7815-7820; Ito, T., Tashiro, K., Muta, S., Ozawa, R., Chiba, T., Nishizawa, M., Yamamoto, K., Kuhara, S., Sakaki, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 97, 1143-1147; Walhout, A. J. M., Sordella, R., Lu, X., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A., Thierry-Mieg, H., Vidal, M., Science 2000, 287, 116-122). Das Zwei-Hybrid-Verfahren ist jedoch insofern problematisch, als es nur auf die nachweisbaren Protein-Wechselwirkungen anwendbar ist, die um das Reportergen in Zellkernen stattfinden, jedoch nicht auf irgendwelche anderen gewöhnlichen Protein-Protein-Wechselwirkungen.
  • Ein weiteres Problem bei dem Zwei-Hybrid-Verfahren besteht darin, dass dessen Zuverlässigkeit gering ist. Deshalb muss jedem Assay nach diesem Verfahren ein zusätzlicher Bestätigungstest unter Verwendung von Proteinen von Modellzellen oder Lebewesen, deren funktionelle Daten bekannt sind, folgen (Walhout, A. J. M., et al., Science 1999, 287, 116-122).
  • In Anbetracht dieser Situation wurden andere Strategien zur Unersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkung entwickelt. Eine ist ein Ubiquitin-Spaltprotein-Sensor (USPS)-Verfahren, welches die Rekonstruktion von N- und C-terminalen Ubiquitinen durch Protein-Protein-Wechselwirkung, gefolgt von der Aktivierung des im Kern lokalisierten Reporters durch Transkriptionsfaktor-Spaltung, umfasst (Dunnwald, M., Varshavsky, A., Johnsson, N., Mol. Biol. Cell 1999, 10, 329-344; Johnsson, N., Varshavsky, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 5187-5192; Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N., Heesen, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 5187-5192); eine weitere ist ein SOS-Rekrutierungssystem, bei dem eine Katalysatordomäne in die Nähe einer vorgesehenen Membranlokalisierungsdomäne durch Protein-Protein-Wechselwirkung gebracht wird, wodurch ein Guaninaustauschfaktor ("guanine exchange factor"; GEF) oder Ras rekonstruiert wird, welcher dann eine Hefe temperaturempfindlich machende Mutation in Hefe-GEF komplementiert (Aronheim, A., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3373-3374; Aronheim, A., Zandi, E., Hennemann, H., Elledge, S. J., Karin, M., Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 3094-3102; Broder, Y. C., Katz, S., Aronheim, A., Curr. Biol. 1998, 8, 1121-1124).
  • Als allgemeinerer Ansatz wurde über eine Spaltenzym-Technik berichtet (Rossi, F., Charlton, C. A., und Blau, H. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 8405-8410; Remy, I., Michnick, S. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 5394-5399; Pelletier, J. N., Arndt, K. M., Pluckthun, A., Michnick, S. W., NatureBiotech. 1999, 17, 683-690). Es wird angegeben, dass gemäß diesem Verfahren ein gespaltenes Enzym durch Protein-Protein-Wechselwirkung rekonstruiert und dessen enzymatische Aktivität wieder hergestellt wird. Ferner wird angegeben, dass die Aktivität des so rekonstruierten Enzyms durch seinen zellulären Phänotyp oder durch seine fluoreszierenden Substrat-Analoga identifiziert werden kann.
  • Diese verschiedenen Verfahren liefern bis zu einem gewissen Grad genaue Assay-Daten und sind gut geeignet für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen intrazellulären Proteinen und membran-proximalen Proteinen, sie beinhalten jedoch immer noch Probleme insofern, als sie nur auf entsprechend manipulierte Zellen anwendbar sind. Ein weiteres derartiges Problem besteht darin, dass deren Genauigkeit immer noch unbefriedigend ist und deren Sensitivität nicht ausreicht. Ein noch weiteres Problem besteht darin, dass solche Verfahren verschiedene Substrate erfordern und deshalb aufwendig sind.
  • Derzeit ist ein allgemeines Verfahren, das auf jedes Protein anwendbar ist und eine genaue und einfache Analyse verschiedener Protein-Protein-Wechselwirkungen erlaubt, oder eine Allzwecksonde für ein solches Verfahren nicht bekannt.
  • Die Erfindung der vorliegenden Anmeldung wurde vor dem Hintergrund der oben beschriebenen Situationen gemacht und ihre Aufgabe ist die Lösung der Probleme des Standes der Technik und die Bereitstellung einer Allzwecksonde, die für die Analyse verschiedener Protein-Protein-Wechselwirkungen einsetzbar ist, und eines Verfahrens der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung unter Verwendung einer solchen Sonde, welches eine genaue und einfache Untersuchung der Wechselwirkung von Proteinen ermöglicht.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Zur Lösung der obengenannten Probleme stellt die Erfindung dieser Anmeldung zunächst eine Sonde zur Analyse der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen bereit, wobei die Sonde aus zwei Sonden besteht, bei denen es sich um Sonde a, welche das N-terminale Polypeptid eines Inteins und das N-terminale Polypeptid eines markierten Proteins umfasst, und Sonde b, welche das C-terminale Polypeptid des Inteins und das C-terminale Polypeptid des markierten Proteins umfasst, handelt.
  • Unter Verwendung einer solchen Sonde wird durch Protein-Protein-Wechselwirkung eine Proteinspleissung induziert, wodurch ein physiochemisch oder biochemisch nachweisbares Protein regeneriert wird.
  • Zweitens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei der C-Terminus von Sonde a und der N-Terminus von Sonde b jeweils eine Linker-Sequenz enthalten.
  • Drittens stellt die vorliegende Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechseiwirkung bereit, wobei das Intein eine von Hefe-VMA abgeleitete Endonuklease ist; und viertens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei das Intein DnaE, erhalten aus Cyanobacterium, ist.
  • Fünftens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei das markierte Protein ein fluoreszierendes Protein ist; und sechstens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei das fluoreszierende Protein ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist.
  • Siebtens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei das markierte Protein ein emissions-katalysierendes Enzym ist; und achtens stellt die Erfindung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei das emissions-katalysierende Enzym eine Luciferase ist.
  • Neuntens stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, umfassend: Veranlassung eines Proteins, das mit einer Sonde a wie in den Ansprüchen 1 bis 9 beschrieben verknüpft ist, und eines Proteins, das mit Sonde b wie in den Ansprüchen 1 bis 9 beschrieben verknüpft ist, zur Koexistenz in einem System; und Nachweis des Signals, das von dem markierten Protein emittiert wird.
  • Zehntens stellt die Erfindung das Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, wobei ein Polynukleotid, welches die Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 exprimiert, in eine eukaryotische Zelle eingeführt wird, wodurch das mit der Sonde a verknüpfte Protein und das mit der Sonde b verknüpfte Protein zur Koexistenz in der Zelle veranlasst wird.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Beispiel der Struktur und des Funktionsprinzips der Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung. Hier zeigt (I) zwei koexistierende Sonden; (II) zeigt Protein-Protein-Wechselwirkung; (III) zeigt Protein-Spleissung; und (IV) zeigt die Verknüpfung von markiertem Protein. (1a) zeigt eine Sonde a zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung an; (1b) zeigt eine Sonde b zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung an; (2a) zeigt das N-terminale Polypeptid eines Inteins an; (2b) zeigt das C-terminale Polypeptid des Intein an; und (3) zeigt ein markiertes Protein an. Ferner zeigt (3a) das N-terminale Polypeptid des markierten Proteins an; und (3b) zeigt das C-terminale Polypeptid des markierten Proteins an. (4a) zeigt ein Protein (oder eine Proteinstelle) A an und (4b) zeigt ein Protein (oder eine Proteinstelle) B an.
  • 2 zeigt die N-terminale Polypeptidstruktur von EGFP in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung, bei dem die Aminosäurereste I124 bis I129 ersetzt wurden.
  • 3 zeigt die Daten der SDS-PAGE-Analyse von Proteinen, die in mit pGEX-NVC transformierten E. coli exprimiert wurden. Hier stellen die Spuren (a) bis (c) eine mit Coomassieblau angefärbte SDS-PAGE dar; Spur (a) zeigt den Proteinmolekülmassenstandard (Novagen) mit seinen Molekülmassen (kD) an; Spur (b) zeigt den Rohextrakt vor Reinigung mittels einer GST-Affinitätssäule an; und Spur (c) zeigt die mittels einer GST-Affinitätssäule gereinigte Probe an. Die Spuren (d) und (e) zeigen eine Westernblot-Analyse von rohem Lysat unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für VDE (d) und GFP (e).
  • 4 zeigt die Struktur eines Plasmids (Sonde <1> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung), konstruiert in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung. Hier sind die Restriktionsendonuklease-Spaltstellen über jedem Balken gezeigt; die gestrichelten Linien zeigen die Endonukleasedomäne in dem Intein VDE an; die offenen Balken zeigen das Intein VDE ohne Endonuklease an; die schwarzen Balken zeigen die GST-Markierung an; und die schattierten Balken zeigen die His-Markierung an. Die Gittermuster zeigen einen Linker an; "Stop" zeigt ein Translationsterminationscodon an, und "Start" zeigt ein Translationsinitiationscodon an.
  • 5 zeigt die Daten eines durch Wechselwirkung von Protein CaM und Protein M13 induzierten Spleissvorgangs in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung. Hier zeigt (a) pET-NVCΔSD (C/M) (SDS-PAGE) an; (b) zeigt pET-NVCΔSD (M/C) an; (c) zeigt das pET-NVCΔSD (/)-Gen 1 an; (d) zeigt pET-NVCΔSD-Linker (C/M) an; (e) zeigt pET-NVCΔSD-Linker (M/C) an und (f) zeigt pET-NVCΔSD-Linker (/) an. (A) zeigt die Daten eines Westernblots bei Markierung mit Anti-His; und (b) zeigt die Daten eines Westernblots bei Markierung mit Anti-GFP.
  • 6 zeigt die Fluoreszenzspektren von rohen Produkten von E. coli, das irgendeines der Plasmide (Sonde <1> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung) trägt, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden. Die Anregung geschieht bei 470 nm, die Anregungsbandbreite beträgt 5,0 nm und die Emissionsbandbreite beträgt 5,0 nm. (a) zeigt NVCΔSD-Linker (/) an; (b) zeigt NVCΔSD (C/M) an; und (c) zeigt NVCΔSD-Linker (C/M) an.
  • 7 zeigt die Struktur eines im Beispiel der vorliegenden Erfindung verwendeten Plasmids. Hier zeigen die gestrichelten Linien eine intrazelluläre Ribosom-Extein-Stelle (IRES) an; die cDNAs von pLucA11, pLucN und pLucC werden in pcDNA3.1 (+) inseriert; "Stop" und "Start" zeigen Translationsterminations- bzw. Translationsinitiationscodons an.
  • 8 zeigt die Emissionsintensität von LucN alleine, LucC alleine und LucA11 in dem Beispiel dieser Erfindung.
  • 9 zeigt die insulinabhängige Protein-Spleissungszunahme im Beispiel dieser Erfindung.
  • 10 zeigt den Einfluss einer Aminosäuremutation auf die Protein-Spleissung im Beispiel dieser Erfindung.
  • 11 zeigt die Insulin-Konzentrationsabhängigkeit der Lum-F-Emissionsintensität im Beispiel dieser Erfindung.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung basiert auf dem Prinzip, dass die Wechselwirkung von zwei Proteinen, die jeweils mit den Sonden verknüpft sind, eine Spleissung induziert, wodurch das markierte Protein, das gespalten und mit den beiden Sonden verknüpft ist, regeneriert wird, um ein Signal zu emittieren.
  • Protein-Spleissung ist ein Prozess, bei dem das innere Proteinsegment (Intein) aus einem translatierten Protein ausgeschnitten wird. Bei diesem Prozess wird der Ausschnitt von Inteinen von der Ligierung flankierender Sequenzen (Exteinen) begleitet (Gimble, F. S., Sci. Biol. 1998, 5, R251-256).
  • Die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt, indem der Selbstausschnitt von Inteinen in geschickter Weise auf die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung angewandt wird.
  • Mit anderen Worten, die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung besteht aus zwei Sonden a und b, die jeweils separat mit zwei verschiedenen Proteinen verknüpft sind. 1 ist eine schematische Darstellung des Prinzips der Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung.
  • Von den beiden Sonden a (1a) und b (1b) enthält die Sonde a (1a) das N-terminale Polypeptid eines Inteins (2a) und das N-terminale Polypeptid eines markierten Proteins (3a), und die Sonde b (1b) enthält das C-terminale Polypeptid des Inteins (2b) und das C-terminale Polypeptid des markierten Proteins (3b).
  • Die beiden Sonden a (1a) und b (1b) sind separat mit den jeweiligen Proteinen A (4a) und B (4b), deren Wechselwirkung analysiert werden soll, verbunden, um die Protein-A-Protein B-Wechselwirkung nachzuweisen. Wenn somit Protein A (4a) und Protein B (4b), jeweils mit Sonde a (1a) bzw. Sonde b (1b) verbunden, koexistieren (I) und wenn die beiden Proteine (4a, 4b) miteinander wechselwirken (II), wird das Intein (2) durch Spleissung ausgeschnitten (III). Als Folge werden die markierten Proteinstellen (3a, 3b), die an das Intein (2) gebunden sind, ligiert (IV), wodurch die Bestätigung der Protein-Protein-Wechselwirkung durch Nachweis des Signals, das von dem markierten Protein (3) herrührt, ermöglicht wird.
  • Wenn in diesem Prozess das Protein A (4a) nicht mit dem Protein B (4b) wechselwirkt, findet die Spleissung des Inteins (III) nicht statt, deshalb wird das markierte Protein (3) nicht regeneriert (IV) und ist nicht nachweisbar.
  • Für die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechseiwirkung der vorliegenden Erfindung können die Sonden a und b (1a und 1b) jeweils aus dem Intein-Polypeptid und dem markierten Protein-Polypeptid bestehen, können jedoch andere Anteile, wie z.B. eine Linker-Sequenz, enthalten. Dementsprechend können in den Sonden a und b (1a und 1b) die Intein-Polypeptide (2a, 2b) und die markierten Protein-Polypeptide (3a, 3b) direkt aneinander gebunden sein oder können über irgendein anderes Polypeptid, wie z.B. eine Linker-Sequenz, verbunden sein.
  • Das Intein kann aus verschiedenen bekannten Organismen erhalten werden. Es schließt z.B. diejenigen ein, die aus Eukaryoten erhalten werden, wie z.B. Sce-VMA aus Saccharomyces cerevisiae (Hefe), Ctr-VMA aus Candida tropiallis (Candida fungi); diejenigen, welche aus Eubakterien erhalten werden, wie z.B. Mtu-recA aus Mycobacterium tuberculosis (Tuberkulosebacillus); und die aus Paläobakterien erhaltenen, wie z.B. Tac-VMA aus Thermoplasma acidophilum. Darüber hinaus kann DnaE aus Cyanobacterium synechocystis sp. (Cyanobacterium) ebenfalls als Intein zur Verwendung in der Erfindung dienen.
  • Wenn Protein A (4a) mit Protein B (4b) in Anwesenheit der Sonden (1a, 1b) zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung wechselwirkt, sind die Inteine vorzugsweise stellenspezifische Endonukleasen, um den automatischen Inteinausschnitt zu erleichtern.
  • Speziell sind das von Hefe-VMA abgeleitete Intein und das aus Cyanobacterium erhaltene Ssp-DnaE-Intein bevorzugt. Bei Hefe-VMA katalysiert das naszierende Translationsprodukt, 120-kD-VMA1, die Protein-Spleissung, um eine 70-kD-H*-ATPase-Untereinheit und eine stellenspezifische 50-kD-Endonuklease (VDE oder PI-Scel) zu ergeben. Dieses VDE wird vorzugsweise als die Inteinstellen (2a, 2b) in den Sonden zur Analyse von Protein-Proten-Wechselwirkung (1a, 1b) verwendet. Für das aus Cyanobacterium erhaltende Ssp-DnaE wurde die DNA-Sequenz des Stammes PCC6803 bestimmt (der N-Terminus besitzt 123 Aminosäurereste und der C-Terminus besitzt 36 Aminosäurereste); ferner ist Ssp-DnaE-Intein ein natürlich gespaltenes Intein und es ist bekannt, dass die Ligierung von N- und C-Extein stattfindet (Wu, H., Hu, Z., Liu, X.-Q., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 9226-9231). Deshalb ist Ssp-DnaE-Intein leicht zu handhaben und als Intein-Stellen (2a, 2b) in den vorliegenden Sonden (1a, 1b) zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bevorzugt.
  • Von den verschiedenen oben erwähnten Inteinen ist das aus Cyanobacterium erhaltene Ssp-DnaE-Intein am meisten bevorzugt, um einen hoch empfindlichen Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Säugerzellen zu ermöglichen. Es ist unnötig zu sagen, dass irgendwelche anderen bekannten oder neuen Inteine ebenfalls in der Erfindung eingesetzt werden können.
  • Für eine effektive Intein-Spleissung (III) mit den Sonden (1a, 1b) zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung müssen die Sonden 1a und 1b korrekt gefaltet sein, so dass die beiden Stellen, die an der Protein-Spleissung beteiligt sind, nebeneinander liegen und korrekt zugeordnet sind (Duan, X., Gimble, F. S., und Quiocho, F. A., Cell 1997, 89, 555-564). Dementsprechend können als Inteine die aus den Organismen erhaltenen direkt verwendet werden oder können geeignet modifiziert werden, um die beabsichtigte Intein-Spleissung zu erleichtern, beispielsweise durch partielle Substitution der Aminosäurereste des aus einem Organismus erhaltenen Inteins durch irgendeinen anderen Rest, partielle Deletion von Aminosäuren oder Einführung einer geeigneten Linker-Sequenz darin.
  • Beispielsweise ist für das obengenannte VDE bekannt, dass seine Mutante, welche speziell durch Deletion der Endonuklease-Domäne und Substitution durch einen faltbaren Dodeca peptid-Linker konstruiert wurde, eine erhöhte Spleissaktivität zeigt (Cooper, A. A., Chen, Y. J., Lindorfer, M. A., Stevens, T. H., EMBO J. 1993, 12, 2575-2583; Chong, S., Xu, M.-Q., J. Biol. Chem. 1997, 272, 15587-15590). Andererseits ist das aus Cyanobacterium erhaltene Ssp-DnaE ein natürliches gespaltenes Intein wie oben erwähnt und führt bekanntermaßen zu einer Spleissung mit korrekter Faltung. Deshalb kann eine Linker-Sequenz eingeführt werden oder auch nicht.
  • Wie hier oben beschrieben, wird das Intein in das N-terminale Polypeptid (2a) und das C-terminale Polypeptid (2b) gespalten. In den Sonden (1a, 1b) zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung sind die Spaltpolypeptide (2a, 2b) an das N-terminale Polypeptid (3a) eines markierten Proteins bzw. an das C-terminale Polypeptid (3b) davon gebunden, um eine Sonde zu konstruieren.
  • Andererseits erfahren bei den Sonden (1a, 1b) zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung die zu verwendenden markierten Proteinstellen eine direkte Peptidbindung und Verknüpfung miteinander (IV) durch die Wechselwirkung der Proteine A und B (II), gefolgt von der Intein-Spleissung von den Sonden a und b (1a, 1b) (III). Das markierte Protein (3) kann jedes Protein sein, das nach Proteinverknüpfung (IV) nachgewiesen werden kann. Beispielsweise sind ein fluoreszierendes Protein und ein emissionskatalysierendes Enzym bevorzugt. Als fluoreszierendes Protein ist ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), welches nach Proteinverknüpfung Licht emittiert und einen visuellen Nachweis erlaubt, bevorzugt. Für das emissions-katalysierende Enzym ist Luciferase bevorzugt, welche nach Proteinverknüpfung ein Aktivitätszentrum bildet und Licht emittiert, das leicht nachgewiesen wird. Damit die gespaltenen N- und C-Termini der Luciferase keine Fluoreszenz ergeben, wenn sie separiert sind, und deren Emissionsaktivität wieder hergestellt wird, nachdem ihre beiden Enden rekombiniert wurden, muss die Luciferase so gespalten werden, dass deren Aktivitätszentrum zweigeteilt ist. Es ist bekannt, dass das Enzym Luciferase in zwei Domänen gefaltet ist, welche eine breite Region, die das Aktivitätszentrum enthält, dazwischen als "Sandwich" umfassen; eine ist eine große N-terminale Domäne, die eine β-Tonne und zwei β-Faltblätter umfasst, und die andere ist eine C-terminale Stelle (Waud, J. P., Sala-Newby, G. B., Matthews, S. B., Campbell, A. K., Biochim. Biophys. Acta 1996, 1292, 89-98; Conti, E., Franks, N. P., Brick, P., Structure 1996, 4, 287-298). Dementsprechend ist es wünschenswert, dass das Enzym Luciferase an der flexiblen Stelle, an der die beiden Domänen miteinander verknüpft sind, in zwei Hälften 3a und 3b geteilt wird. Für das Enzym Luciferase ist ferner bekannt, dass dessen N-terminales Polypeptid (3a), an welches das N-terminale Polypeptid des Inteins (2a) gebunden werden soll, einen Cystein (Cys)-Rest aufweist und ferner einen Tyrosin (Tyr)-Rest-1 stromaufwärts davon und Alanin (Ala)- bzw. Phenylalanin (Phe)-Reste-3 und -4 stromaufwärts davon aufweist; deshalb ermöglicht das Enzym Luciferase eine effizientere Protein-Spleissung. Somit wird für die Verwendung des Enzyms Luciferase in der vorliegenden Erfindung empfohlen, dass das Enzym zu den Mutanten R437, wobei das Arginin 437 durch Cystein ersetzt ist, D436Y, wobei der Asparaginsäurerest 436 durch Tyrosin ersetzt ist, und I434A, wobei der Isoleucinrest 434 durch Alanin ersetzt ist, mutiert ist, um eine effizientere Protein-Spleissung zu ermöglichen.
  • Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung dieser Anwendung die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit. Konkret wird eine Sonde (z.B. Sonde a) mit dem Zielprotein (Protein A) verknüpft, dessen Vermögen zur Wechselwirkung mit einem anderen Protein (Protein B) bestätigt werden soll, während eine andere Sonde (Sonde b) mit dem anderen Protein (Protein B) verknüpft wird, und die beiden Sonden dazu veranlasst werden, in einem System zu koexistieren, um dadurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B durch das obige Prinzip und den obigen Mechanismus zu bestätigen.
  • Die Proteine (4a, 4b) können mit den Sonden (1a, 1b) nach irgendeinem Verfahren verknüpft werden, so lange die Eigenschaften der Proteine und der Sonden nicht beeinflusst werden. Beispielsweise sind beliebige übliche chemische, biochemische oder genetische Manipulationsstrategien anwendbar.
  • Das Verfahren zur Verwendung der Sonde für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der Erfindung zum Nachweis und zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (z.B. durch Luminometrie) ist nicht beschränkt und kann auf irgendwelche üblichen Weisen erfolgen. Experimentelle Verfahren und Detektoren, die allgemein auf dem Gebiet der Chemie und Biochemie verwendet werden, können eingesetzt werden. Beispielsweise ist ein Luminometer bevorzugt, welcher einen einfachen Nachweis und eine einfache Analyse ermöglicht.
  • Ausführungsformen der Erfindung sind detaillierter in den folgenden Beispielen unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es ist unnötig zu sagen, dass die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist und verschiedene Änderungen und Modifikationen ohne Beschränkung vorgenommen werden können.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Konstruktion der Sonde <1> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung
  • Als Intein-Stelle der Sonde <1> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung wurde ein von Hefe-VMA1 abgeleitetes Intein (VDE) verwendet.
  • Von den 454 Aminosäuren, die VDE ausmachen, ist Cys1 der erste Aminosäurerest und Asn454 ist der letzte Aminosäurerest. Bei VDE beginnt das C-Extein an Cys455 und der Exteinrest neben Cys1 ist als -1 nummeriert. Die anschließenden Exteinreste sind nacheinander als -2, -3, ... bis zum N-Extein nummeriert.
  • Für die markierte Stelle wurde ein "Enhanced Green Fluorescent Protein", erhalten aus Aequoea victoria (EGFP, beispielsweise in Current Biology 1996, 6 (2), 178-182, beschrieben), verwendet.
  • In der Sonde <1> erfordert die N-terminale Hälfte von EGFP als Spleissstelle einen Cys-Rest, einen weiteren Gly-Rest stromaufwärts der Position -1 und drei hydrophobe Aminosäurereste an ihren Positionen -5, -4 und -3.
  • Dementsprechend wurden die Aminosäurereste I124 bis I129, welche in der N-terminalen Polypeptidstruktur von EGFP relativ stabil sind, wie folgt substituiert (2).
    • (1) Die Mutation I129C und E125I in EGFP zeigte Fluoreszenz und es wurden Anregungs- und Emissionspeaks äquivalent denjenigen von EGFP bei 488 nm und 510 nm beobachtet.
    • (2) Die Fluoreszenz verschwand mit der L126Y-Mutation bei m125, obwohl sich das Expressionsniveau der Variante nicht änderte.
  • Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die L126Y-Mutation die korrekte Faltung in der m129EGFP-Mutante verhindert und/oder die Ligierung der Fluoreszenzproteinstellen nicht stattfinden konnte.
  • Dementsprechend wurde die m125EGFP-Mutante, bei der die Mutation I129C und E125I durchgeführt wurde, als markierte Proteinstelle der Sonde verwendet. Diese markierte Proteinstelle wird hier im folgenden als EGFP-Mutante bezeichnet.
  • Beispiel 2: Bestätigung der Spleissung in einem einzigen Polypeptid
  • Zur Bestätigung, dass eine Protein-Spleissung in einem einzigen Polypeptid stattfindet, bei dem sich VDE zwischen den N-terminalen und C-terminalen Hälften der EGFP-Mutante als "Sandwich" befindet, wurde pGEX-NVC bei 25°C in E. coli exprimiert.
    • (1) Zellen von E. coli DH5α wurden inkubiert, um ein Glutathion S-Transferase-Fusionsprotein (GST) zu exprimieren. Ein Plasmid, welches die VDE-Region und die N- und C-terminalen Polypeptide der EGFP-Mutante umfasst, wurde mit dem GST-Gen unter der Kontrolle eines tac-Promoters fusioniert. Dies ergab ein chimäres Protein, bestehend aus GST (26 kD), 125 Resten vom N-Terminus der EGFP-Mutante (13 kD), VDE (50 kD) und dem C-terminalen Polypeptid der Mutante (14 kD).
    • (2) Das resultierende Protein wurde aus den E. coli-Zellen extrahiert, gereinigt und mittels SDS-PAGE identifiziert. Das markierte Protein und 10 bis 225 kD (Novagen) wurden auf einem 12- bis 15%igen SDS-PAGE-Gel elektrophoresiert. Das Gel wurde durch Anfärbung mit Coomassiebrilliantblau sichtbar gemacht.
  • Für Westernblots wurde polyklonaler Anti-VDE-Antikörper, polyklonaler Anti-His-markierter Antikörper (Santa Crus Biotechnology) oder monoklonaler Anti-GFP-Antikörper (BioRad) als Sonde verwendet.
  • Die für die Klonierung erforderlichen Enzyme wurden alle von Takara Biomedical erhalten und nach den Instruktionen des Herstellers behandelt.
  • Die PCR-Fragmente wurden unter Verwendung eines Genanalysators, ABI310, sequenziert.
  • Die Hauptkomponente des Rohprodukts war ein Protein von etwa 50 kD (3b). Dieses Ergebnis entspricht der Größe des Exteins, das mit VDE (50 kD) und GST verknüpft ist. Mit anderen Worten, es wurde festgestellt, dass diese Komponente ein Fusionsprotein von GST und dem N-terminalen Polypeptid der EGFP-Mutante (26 kD + 13 kD) war.
  • Anhand dieses Ergebnisses wurde festgestellt, dass der 103-kD-Vorläufer des Fusionsproteins in das 50-kD-VDE und das 53-kD-GST-EGFP-Mutante-Fusionsprotein gespalten wurde.
  • Darüber hinaus wurde das Molekulargewicht von VDE und das des GST-EGFP-Mutante-Fusionsproteins durch Westernblots gemessen.
  • Die Anti-VDE- und Anti-GFP-Antikörper reagierten spezifisch mit dem ausgeschnittenen 50-kD-Intein (3d) bzw. dem 53-kD-GST-EGFP-Mutante-Fusionsprotein (3e). Alle Komponenten von etwa 100 kD des ungespleissten Vorläufers wurden mit Hilfe dieser Antikörper analysiert.
  • Das GST-EGFP-Mutante-Fusionsprotein wurde ferner durch GST-Aftinitätschromatographie identifiziert. Der Rohextrakt wurde durch eine Aftinitätssäule geleitet und die an das Harz gebundenen Proteine wurden unter Verwendung von PreScission-Protease extrahiert und dann einer SDS-PAGE unterworfen (3c). Dies ergab eine 25-kD-Bande, welche fast mit dem Molekulargewicht der EGFP-Mutante übereinstimmte.
    • (3) Als nächstes wurde das mit der Affinitätssäule gereinigte Protein einer Fluoreszenzspektrometrie unterworfen, für welche die Anregungs- und die Emissionspeaks bei 488 nm bzw. 510 nm auftraten. Die Daten korrespondierten gut mit denjenigen von EGFP.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen an, dass das VDE im Zentrum des einzigen Polypeptids durch Spleissung ausgeschnitten wurde, was eine Ligierung der N- und C-terminalen Polypeptide der EGFP-Mutante durch Peptidbindung veranlasste und zur korrekten Faltung der EGFP-Mutante unter Bildung eines Fluorophors führte.
  • Beispiel 3: Wirkung der Sonde <1> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung
    • (1) Zellen von E. coli-BL21(DE3)pLysS wurden inkubiert, um ein rekombinantes Fusionsprotein, das an seinem N-Terminus mit His markiert war, herzustellen.
  • Zum Testen von Protein-Protein-Wechselwirkung wurde GST von pGEX-NVC mit der His-Markierung eines pET16-b-Vektors substituiert und dessen funktionelle Spleissstelle wurde gespalten, um pET-NVCΔSD (/) zu erhalten.
  • Die Spaltung wurde durchgeführt mittels Ersatz des nichtfunktionellen Endonuklease-Motivs, welches im Bereich der 185. bis 389. Aminosäure der Mutante vorliegt, durch eine Kassette von ((Translationsterminationscodon) – (Shine-Dalgarno-Sequenz) – (Translationsinitationscodon)).
  • Das resultierende Plasmid pET-NVCΔSD (/) war ein Zwei-Gen-Operon, im wesentlichen aufgebaut aus Gen 1, welches für das N-terminale Polypeptid von EGFP und VDE (N-EGFP-VDE) codiert, und Gen 2, welches für das C-terminale Polypeptid von VDE und EGFP codiert (C-VDE-EGFP).
  • Damit die N- und C-terminalen Polypeptide von VDE einander räumlich während der Protein-Protein-Wechselwirkung nahe sein konnten, wurde ein faltungsfähiger Peptid-Linker mit repetitiven Gly-Asn-Sequenzen zwischen dem Translationsterminationscodon und dem Translationsinitiationscodon eingeführt (pET-NVCΔSD-Linker (/)).
  • Zur Bestätigung, dass eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung, welche das Spleissen zur Bildung von EGFP in E. coli erleichtert, stattfindet, wurden Calmodulin (CaM) und dessen Zielpeptid M13 als Modellproteine ausgewählt.
  • Die Struktur von CaM und die von M13 wurden mittels NMR aufgeklärt (Ikura, M., et al., Science 1992, 256, 632-638); deshalb sind CaM und M13 geeignet, da die Distanz zwischen jeder Aminosäure in CaM und jeder Aminosäure in M13 bekannt ist.
    • (2) Die rekombinanten Plasmide pET-NVCΔSD (C/M), pET-NVCΔSD-Linker (C/M) und pET-NVCΔSD-Linker (/) wurden in die Zellen von E. coli eingeführt, um das entsprechende Fusionsprotein zu erhalten.
  • Für die intrazelluläre Spleissung wurde die Proteinexpression 12 h lang bei 25°C bewirkt; die Zellen wurden ein oder zwei Tage lang bei 4°C gelagert.
  • Die Gen 1-Proteinexpression wurde durch einen Anti-His-markierten Antikörper bestätigt (5A). Die von dem Antikörper analysierten Hauptkomponenten waren Proteine von 55 kD (5A a, d) und deren Größe ist von derselben Größenordung wie diejenige des ungespleissten N-EGFP-VDE-Vorläufers (36 kD) mit CAM (17 kD) oder dessen Linker (1 kD).
  • Als Kontrolle wurde ein Lysat von E. coli mit einem pET-NVCΔSD-Linker (/)-Plasmid einer SDS-PAGE unterworfen, welches eine einzelne Bande für N-EGFP-VDE ergab (5A, f).
  • Das Expressionsniveau der ungespleissten Vorläuferproteine, das von diesen drei Plasmiden erhalten wurde, war fast gleich.
  • Andererseits wurde das Gen 2-Proteinprodukt mit einem monoklonalen Anti-GFP-Antikörper identifiziert und als C-terminales Polypeptid von EGFP befunden.
  • Darüber hinaus korrespondierte in der Zelle, welche pET-NVCΔSD (C/M) und pET-NVCΔSD-Linker (C/M) exprimierte, die Größe des Expressionsproteins, welches von dem Gen-Operon erhalten wurde, gut mit derjenigen des Vorläuferproteins von N-VDE-EGFP (20 kD) mit M13 (3 kD) (5B, a) oder dem linker-enthaltenden M13 (4 kD) (5B, d). Gleichermaßen exprimierte das Kontrollplasmid das erwartete Protein (5B, f). Die Expressionsniveaus aller drei Proteine, die von Operon II erhalten wurden, waren gleich.
  • 6 zeigt die Fluoreszenzspektren von Lysaten von E. coli-Zellen, die jeweils eines der vorgenannten Plasmide trugen. Für die Zellen von E. coli, die pET-NVCΔSD-Linker (/) trugen, wurde keine spektrale Veränderung beobachtet. Von den Zellen von E. coli, die pET-NVCΔSD (C/M) trugen und CaM und M13 koexprimierten, wurde eine leichte Veränderung der Fluoreszenzemission bei 510 nm beobachtet. Andererseits wurde von den E. coli-Zellen, die N-EGFP-VDE und C-VDE-EGFP mit einem Peptid-Linker dazwischen trugen und CaM und M13 koexprimierten, eine signifikante Veränderung der Fluoreszenzemission bei 510 nm beobachtet. Die Fluroeszenzintensität des Rohprodukts aus den Zellen von E. coli, welche pET-NVCΔSD-Linker (C/M) trugen, war ausreichend, um diese Zellen von denjenigen zu unterscheiden, welche das Kontrollplasmid, pET-NVCΔSD-Linker (/), trugen oder das Plasmid, welches nicht für den faltbaren Linker codiert, pET-NVCΔSD-Linker (CIM).
  • Diese Ergebnisse zeigen an, dass die CaM-M13-Wechselwirkung zu einer in-trans-Spleissung führte, wodurch die Ligierung der beiden externen Bereiche der N- und C-terminalen Polypeptide der EGFP-Mutante zur Bildung des EGFP-Fluorophors induziert wurde.
  • Beispiel 4: Wirkung des Linkers in der Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung <1>
  • Für die Protein-Spleissung ist es erforderlich, dass die N- und C-Termini von VDE korrekt gefaltet werden. Korrekte Faltung wird nur erhalten, wenn das C-terminale N-VDE sich in der Nähe des N-terminalen C-VDE befindet.
  • Bezüglich CaM und M13 beträgt die Distanz zwischen dem N-Terminus von CaM und dem C-Terminus von M13 50 Å (nach Brookhaven Proteindatenbank). Diese Distanz ist für N-VDE zu groß, um nahe bei C-VDE zu sein, und es wurde erwartet, dass die große Distanz die korrekte Faltung der N- und C-Termini von VDE in E. coli, welche das Plasmid pET-NVCΔSD-Linker (C/M) trugen, störte.
  • Jedoch erhöhte der Plasmid pET-NVCΔSD-Linker (C/M) tatsächlich die Fluoreszenzintensität bei 510 nm signifikant. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die 10- und 9-Aminosäurelinker, die jeweils mit den N- und C-VDEs verknüpft waren, die erforderliche Faltbarkeit von VDE gewährten und eine gute Konformation für eine effektive VDE-Spleissung ermöglichten.
  • Beispiel 5: Konstruktion einer Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung <2>
  • Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Konstruktion eines Plasmids in einem Wirt, E. coli-DH5α, zu demonstrieren.
  • Als Intein-Stelle für eine Sonde <2> wurde DnaE, erhalten aus einem Cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC6803, gewählt. Als markiertes Protein für die Sonde wurde eine aus Wildglühwürmchen erhaltene Luciferase (Lum-F) (pLucA11) zwischen der 437. Aminosäure und der 438. Aminosäure in N-terminale (pLucN)- und C-terminale (pLucC)-Segmente gespalten.
  • 7 zeigt die Struktur der Luciferase und Luciferase-Segmente.
  • (1) Spaltung von Luciferase:
  • Zuerst wurde die Abwesenheit von enzymatischer Aktivität in pLucN und pLucC bestätigt, indem die beiden Luciferase-Segmente in Human-Insulinrezeptor überexprimierenden Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-HIR) vorübergehend exprimiert wurden.
  • Konkret wurden die CHO-HIR-Zellen mit 1 μg eines jeden Plasmids (pLucA11, pLucN und pLucC) oder mit 0,01 μg eines Kontrollplasmids (pRL-TK) transfiziert und in einer 12-Mulden-Platte 45 h lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Emission der Zellen in jeder Mulde mit Hilfe eines Luminometers gemessen.
  • Als Blindkontrolle wurden die CHO-HIR-Zellen ohne Plasmid unter denselben Bedingungen inkubiert.
  • Der Fehler bei der Transfektionseffizienz in jeder Mulde der Platte wurde durch einen doppelten Luciferase-Assay unter Verwendung einer aus Renilla erhaltenen Luciferase (lum-R) korrigiert.
  • 8 zeigt die relative Emissionsintensität (RLU) einer jeden Luciferase (oder eines jeden Luciferase-Segments).
  • Die RLU der CHO-HIR-Zellen mit der Expression von Wildglühwürmchen-Luciferase (LucA11) betrug 11,4 (8a); jedoch betrug die RLU der CHO-HIR-Zellen mit der Expression von nur LucN oder LucC 2,2 × 10-4 bzw. 4,5 × 10-5 (8b). Die RLU (Hintergrund) der CHO-HIR-Zellen, die mit Lum-R selbst transfiziert waren, betrug 2,2 × 10-4. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass LucN oder LucC alleine keine Emissionsaktivität zeigen.
  • (2) Spaltung von DnaE:
  • Wie oben erwähnt, wurde von Synechocystis sp. PCC6803 erhaltenes DnaE in ein N-terminales Segment von 123 Aminosäureresten und ein C-terminales Segment von 36 Aminosäureresten gespalten.
  • (3) Sonde <2>:
  • Das N-terminale Segment von DnaE in (2) wurde mit LucN in (1) ligiert, während das C-terminale Segment von DnaE in (2) mit LucC in (1) ligiert wurde. Diese Segmente wurden in einem bicistronischen Expressionsvektor, pIRES (Invitrogen), an der Mehrfachklonierungsstelle (MCS) inseriert, um pIRES-DSL zu konstruieren. Das resultierende Plasmid pIRES-DSL besaß zwei Mehrfachklonierungsstellen am 3'-Terminus des N-terminalen DnaE und am 5'-Terminus des C-terminalen DnaE (MCS-A bzw. MCS-B), worin Proteine oder Proteindomänen, die miteinander wechselwirken könnten oder welche hinsichtlich ihrer Wechselwirkung getestet werden sollen, eingeführt werden.
  • 7 zeigt die Struktur von pIRES-DSL.
  • Beispiel 6: Wirkung der Sonde <2> zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung 1
    • (1) Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass die in Beispiel 5 konstruierte Sonde <2> zur Luciferase-Spleissung effektiv ist, wobei ein Oligopeptid (Y941), das den Tyrosinrest 941 von IRS-1 (welches bekanntermaßen an der Insulin-Signaltransduktion beteiligt ist) und dessen Zielprotein, SH2N-Domäne von Phosphatidylinosit-3-Kinase, (White, M. F., Diabetologia 1997, 40, S2-S17) enthält, verwendet wurde.
  • Ein Plasmid pIRES-DSL (Y/S), bei dem Y941 in MCS-A und SH2N in MCS-B inseriert war, und ein pRL-TK-Vektor wurden vorübergehend in CHO-HIR-Zellen koexprimiert.
  • 7 zeigt die Struktur des pIRES-DSL (Y/S).
  • Zuerst wurden in einer 6-Mulden-Platte CHO-HIR-Zellen mit 2 μg des Plasmids pIRES-DSL (Y/S) oder 0,02 ng des Kontrollplasmids pRL-TK transfiziert. Die Zellen wurden 45 h lang inkubiert und dann wurde die Kultur durch eine FBS-freie Lösung von 1,0 × 10-7 M Human-Insulin ersetzt; die CHO-HIR-Zellen wurden durch Inkubation (bei 37°C) für 72 h, 3 h oder 5 Minuten angeregt. Die 5 Minuten lang inkubierten Zellen wurden weiter 172 Minuten lang in einer FCS-freien Kultur ohne Insulin inkubiert.
  • 9 zeigt die relative Emissionsintensität, RLU, der mit Insulin angeregten Zellen.
  • Die korrigierten Luciferase-Aktivitäten der CHO-HIR-Zellen, die 72 h, 3 h und 5 Minuten lang mit Insulin angeregt worden waren, betrugen 1,0, 0,73 bzw. 0,18. Die relative Emissionsintensität (gegen Hintergrund) der Zellen, die in der insulinfreien Kultur inkubiert worden waren, betrug 0,15 und dies ist nahezu die gleiche wie diejenige der Zellen, die 5 Minuten lang mit Insulin angeregt wurden.
  • Darüber hinaus versteht sich, dass die relative Emissionsintensität, RLU, der Zellen, die mit Insulin 3 h oder länger angeregt wurden, mehr als das Vierfache des Hintergrunds beträgt. Die Kinase-Aktivität der hier getesteten Zellen resultiert aus der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Peptid Y941 (dessen Aminosäure 941 Tyrosin ist), phosphoryliert mit einem Insulinrezeptor, und SH2N. Dies ermöglichte die effiziente in-trans-Faltung und Spleissung von DnaE in der Sonde <2>, wodurch die Ligierung von LucN und LucC zur Realisierung der Wiederherstellung der Luciferase-Emission veranlasst wurde.
  • Anschließend wurde eine Y941-Mutante (bei weicher der Tyrosinrest in Y941 durch einen Alaninrest ersetzt wurde, der nicht mit dem Insulinrezeptor phosphoryliert ist) konstruiert und auf die gleiche Weise wie oben beschrieben getestet.
  • Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
  • Die korrigierte Luciferase-Emission der CHO-HIR-Zellen, welche die Y941-Mutante exprimierten, lag auf demselben Niveau wie diejenige der Hintergrunddaten. Dies bestätigt, dass die Tyrosin-Phosphorylierung in Y941 zu der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Y941 und SH2N führte.
  • Beispiel 7: Wirkung der Sonde <2> 2
  • Die in Beispiel 5 konstruierte Sonde <2> wurde hinsichtlich quantitativer Analyse der insulininduzierten Protein-Protein-Wechselwirkung in CHO-HIR-Zellen getestet.
  • Zuerst wurde die Abhängigkeit der RLU von der Insulinkonzentration durch die folgende Prozedur bestätigt: pIRES-DSL (Y/S) und pRL-TK wurden in den CHO-HIR-Zellen auf dieselbe Weise wie oben koexprimiert und die Zellen wurden dann mit Insulin verschiedener Konzentrationen zwischen 1,0 × 10-3 und 1,0 × 10-7 M 3 h lang bei 37°C angeregt.
  • 11 zeigt die RLU der Zellen.
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass die Emissionsintensität der Zellen mit der Insulinkonzentration zunimmt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie hier detailliert oben beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung eine Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung bereit, welche eine genaue und einfache Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung der Sonde bereit.
  • Das vorliegende Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen erfordert keinerlei Reportergen oder -substrat wie in den herkömmlichen Verfahren und erlaubt eine einfache und genaue Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das Verfahren und die Sonde sind sogar auf Säugerzellen für eine hochempfindliche Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in den Zellen anwendbar.
  • Dementsprechend ermöglicht die Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung der vorliegenden Erfindung eine Analyse der Mechanismen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen Organismen, wie z.B. Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembranen und Rezeptoraktivierung durch Hormone in Zellen, in einer vereinfachten Art und Weise, welche wenig Zeit erfordert.

Claims (14)

  1. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen, bestehend aus zwei Sonden, bei denen es sich um Sonde (a), welche das N-terminale Polypeptid eines Inteins und das N-terminale Polypeptid eines markierten Proteins umfasst, und Sonde (b), welche das C-terminale Polypeptid des Inteins und das C-terminale Polypeptid des markierten Proteins umfasst, handelt.
  2. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 1, wobei der C-Terminus der Sonde (a) und der N-Terminus der Sonde (b) jeweils eine Linkersequenz enthalten.
  3. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Intein eine Endonuklease ist, die von Hefe-VMA abgeleitet ist.
  4. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Intein DnaE, erhalten aus Cyanobacterium, Ctr-VMA, erhalten aus Candida fungi, Mtu-recA, erhalten aus Mycobakterium tuberculosis, oder Tac-VMA, erhalten aus Thermoplasma acidophilum, ist.
  5. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das markierte Protein ein fluoreszierendes Protein ist.
  6. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 5, wobei das fluoreszierende Protein ein grün fluoreszierendes Protein ist.
  7. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das markierte Protein ein lumineszierendes Enzym ist.
  8. Sonde zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 7, wobei das lumineszierende Enzym eine Luciferase ist.
  9. Sonde nach Anspruch 8, wobei die Luciferase die folgenden Mutationen R437C, D436Y und I434A aufweist.
  10. Polynukleotid, codierend für die Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9.
  11. Vektor, enthaltend das Polynukleotid nach Anspruch 10.
  12. Eukaryotische Zelle, enthaltend das Polynukleotid nach Anspruch 10 oder den Vektor nach Anspruch 11.
  13. Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung, umfassend: Veranlassung eines Proteins, das mit einer Sonde a wie in den Ansprüchen 1 bis 9 beschrieben verknüpft ist, und eines Proteins, das mit einer Sonde b wie in den Ansprüchen 1 bis 9 verknüpft ist, zur Koexistenz in einem System; und Nachweis des Signals, das von dem markierten Protein emittiert wird.
  14. Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung nach Anspruch 13, wobei ein Polynukleotid, welches die Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 exprimiert, in eine eukaryotische Zelle eingeführt wird, wodurch das mit der Sonde a verknüpfte Protein und das mit der Sonde b verknüpfte Protein zur Koexistenz in der Zelle veranlasst werden.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7855167B2 (en) * 1998-02-02 2010-12-21 Odyssey Thera, Inc. In vivo screening of protein-protein interactions with protein-fragment complementation assays
WO2003089464A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 Bioimage A/S Two green fluorescent protein fragments and their use in a method for detecting protein - protein interactions
JP4287633B2 (ja) * 2002-09-18 2009-07-01 独立行政法人科学技術振興機構 オルガネラ局在タンパク質の解析方法と解析材料
US20070022484A1 (en) * 2003-05-22 2007-01-25 Yoshio Umezawa Probes for analyzing interaction between proteins and method of analyzing interaction between proteins using the same
EP2308978B8 (de) 2003-10-10 2015-04-08 Promega Corporation Luciferase biosensor
US20090113563A1 (en) * 2004-02-12 2009-04-30 Yoshio Umezawa Probe for detecting nuclear receptor agonist or antagonist and method for screening agonist or antagonist to nuclear receptor with the use of the same
WO2005118790A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial marking of cells and cell structures with reconstituted fluorescent proteins
US20070026428A1 (en) * 2005-05-02 2007-02-01 Chelur Dattananda S Combinatorial expression of split caspase molecules
EP1811031A1 (de) 2006-01-18 2007-07-25 Millegen Methode zur Auswahl eines Peptids oder Polypeptids das an ein Zielmolekül bindet
EP2327768B1 (de) 2006-04-03 2015-09-09 Promega Corporation Permutierte und nichtpermutierte Luciferase-Biosensoren
JP4491516B2 (ja) 2007-05-09 2010-06-30 国立大学法人 東京大学 活性化プロテアーゼインジケーター
ATE542903T1 (de) 2008-05-19 2012-02-15 Promega Corp Luciferase-biosensoren für camp
JP5816412B2 (ja) * 2010-03-25 2015-11-18 東洋ビーネット株式会社 分割レポータータンパク質による標的タンパク質の検出方法
US9290794B2 (en) 2010-05-11 2016-03-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
EP2990479B1 (de) 2010-05-11 2019-03-27 Promega Corporation Mutante protease-biosensoren mit verbesserten erkennungseigenschaften
CN101975776B (zh) * 2010-10-22 2012-06-27 上海交通大学 用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用
KR102595753B1 (ko) * 2016-07-27 2023-10-30 얼라인 테크널러지, 인크. 치아 진단 기능이 있는 구강 내 스캐너

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834247A (en) * 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
EP0602899B1 (de) * 1992-12-09 2004-10-20 New England Biolabs, Inc. Kontrollierbare Zwischensequenzen enthaltende modifizierte Proteine und Verfahren zur deren Herstellung
US6770446B1 (en) * 1994-06-14 2004-08-03 Wyeth Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs
US5998136A (en) * 1996-08-19 1999-12-07 Arcaris, Inc. Selection systems and methods for identifying genes and gene products involved in cell proliferation
US5795731A (en) * 1996-08-26 1998-08-18 Health Research Incorporated Inteins as antimicrobial targets: genetic screens for intein function
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
WO2000018881A2 (en) 1998-09-30 2000-04-06 New England Biolabs, Inc. Intein mediated peptide ligation
FR2786788B1 (fr) * 1998-12-08 2002-04-19 Proteus Procede de criblage de substances capables de modifier l'activite d'une ou plusieurs proteines cibles ou d'un ensemble cible de proteines exprimees in vitro
ATE318894T1 (de) 1998-12-18 2006-03-15 Penn State Res Found Intein-vermittelte cyclisierung von peptiden
US6858775B1 (en) * 1999-05-24 2005-02-22 New England Biolabs, Inc. Method for generating split, non-transferable genes that are able to express an active protein product
AU7895700A (en) * 1999-10-15 2001-04-30 Dalhousie University Method and vector for producing and transferring trans-spliced peptides
WO2001057183A2 (en) * 2000-02-04 2001-08-09 New England Biolabs, Inc. Method for producing circular or multimeric protein species in vivo or in vitro and related methods
CA2419159A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US6828112B2 (en) * 2001-01-04 2004-12-07 Myriad Genetics, Inc. Method of detecting protein-protein interactions
US20020177691A1 (en) * 2001-03-20 2002-11-28 Scott Charles P. Trans inteins for protein domain shuffling and biopolymerization
US6841352B2 (en) * 2001-06-29 2005-01-11 Myriad Genetics, Inc. Mating-based method for detecting protein—protein interaction
US20030167533A1 (en) * 2002-02-04 2003-09-04 Yadav Narendra S. Intein-mediated protein splicing

Also Published As

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