JP5816412B2 - 分割レポータータンパク質による標的タンパク質の検出方法 - Google Patents
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Description
(1)ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとN末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
(2)さらに、発光基質を添加することを含む(1)記載の方法。
(3)発光タンパク質がルシフェラーゼであり、発光基質がルシフェリンである(2)記載の方法。
(4)ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである(3)記載の方法。
(5)ホタルルシフェラーゼが北米産ホタル天然ルシフェラーゼである(4)記載の方法。
(6)北米産ホタル天然ルシフェラーゼが配列番号1のアミノ酸配列からなる(5)記載の方法。
(7)北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びN末端フラグメントが、それぞれ、配列番号1のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びN末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記N末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである(6)記載の方法。
(8)北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである(7)記載の方法。
(9)北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目若しくは1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜2番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目若しくは1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜3番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端からら1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目若しくは1〜14番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜4番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目若しくは1〜13番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜5番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目若しくは1〜12番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜6番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目若しくは1〜11番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜7番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目若しくは1〜10番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜8番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目若しくは1〜9番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜9番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目若しくは1〜8番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜10番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目若しくは1〜7番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜11番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目若しくは1〜6番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜12番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目若しくは1〜5番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜13番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目若しくは1〜4番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜14番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目若しくは1〜3番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目又は1〜2番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のN末端から1番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のC末端から1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチドである(8)記載の方法。
(10)ホタルルシフェラーゼが配列番号7のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである(4)記載の方法。
(11)変異型ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びN末端フラグメントが、それぞれ、配列番号7のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びN末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記N末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである(10)記載の方法。
(12)ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである(11)記載の方法。
(13)ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目若しくは1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜2番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目若しくは1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜3番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目若しくは1〜14番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜4番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目若しくは1〜13番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜5番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目若しくは1〜12番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜6番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目若しくは1〜11番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜7番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目若しくは1〜10番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜8番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目若しくは1〜9番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜9番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目若しくは1〜8番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜10番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目若しくは1〜7番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜11番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目若しくは1〜6番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜12番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目若しくは1〜5番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜13番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目若しくは1〜4番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜14番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目若しくは1〜3番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目若しくは1〜2番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のN末端から1番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のC末端から1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチドである(12)記載の方法。
(14)ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記N末端フラグメントとC末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
(15)発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記N末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
(16)さらに、発光基質を含む、(15)記載の試薬。
(17)さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムA及び還元剤からなる群より選択される少なくとも1つを含む、(15)又は(16)記載の試薬。
(18)(15)〜(17)のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
(19)さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、(18)記載のキット。
(20)発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記C末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
(21)さらに、発光基質を含む、(20)記載の試薬。
(22)さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムA及び還元剤からなる群より選択される少なくとも1つを含む、(20)又は(21)記載の試薬。
(23)(20)〜(22)のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
(24)さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、(23)記載のキット。
(25)発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号3又は9のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号3又は9のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
(26)(25)記載のペプチドをコードするDNA。
(27)(26)記載のDNAを含有するベクター。
(28)(26)記載のDNAの上流又は下流に制限酵素部位を含有する(27)記載のベクター。
(29)(27)又は(28)記載のベクターで形質転換した細胞。
(30)(25)記載のペプチドをコードするDNAで形質転換した宿主を培養し、培養物から(25)記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
(31)発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号5又は11のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号5又は11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
(32)(31)記載のペプチドをコードするDNA。
(33)(32)記載のDNAを含有するベクター。
(34)(32)記載のDNAの上流又は下流に制限酵素部位を含有する(32)記載のベクター。
(35)(33)又は(34)記載のベクターで形質転換した細胞。
(36)(31)記載のペプチドをコードするDNAで形質転換した宿主を培養し、培養物から(31)記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
(37)発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記N末端フラグメントとC末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
(38)発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとN末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
(39)ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記C末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
(40)(39)記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
(41)ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記N末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
(42)(41)記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
pBluescriptII KS、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T、pET-11a等がある。ターゲットタンパク質をコードするDNAは、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAの上流又は下流のいずれに組み込んでもよい。また、ターゲットタンパク質をコードするDNAと発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとの間には、1〜50個のヌクレオチドからなるリンカー配列を挿入してもよい。
A(BFA)を細胞懸濁液に添加したサンプル(処理区)、無添加のサンプル(無処理区)を設定する。それぞれの実験区に発光または蛍光タンパク質のN末端を含む試薬を添加して一定時間インキュベートして蛍光・発光強度を測定する。処理区・無処理区の強度を比較することにより細胞内輸送阻害の有無を判定する。
I.実験方法
1.ベクターの作製
検体細胞にトランスフェクションするためのベクターとしては、シグマ・アルドリッジ社製の市販品p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10に検出したいタンパク質と融合される小断片を組み込んだもの(C末端側ベクター:p3xFLAG-CMV-9-CLuc(細胞外に分泌する)、p3xFLAG-CMV-10-CLuc(非分泌)を作製した(図3)。CLucは天然ルシフェラーゼの399〜550番目のアミノ酸を含んでいる(図4−1)。CLucのDNA断片はPCRにより増幅することにより得た。すなわち、天然ルシフェラーゼの399〜407番目のアミノ酸配列に対応したDNA配列を持ち、かつ制限酵素によるクローニングを容易にするため5'末端側にHindIIIの認識配列を持つプライマー(センスプライマー)、及び天然ルシフェラーゼの543〜550番目のアミノ酸配列に対応したDNA塩基配列と3'末端側にXbaIの認識配列を持つプライマー(アンチセンスプライマー)を合成した。これらのプライマーを使用し、天然ルシフェラーゼのDNA配列を持つ市販のベクター(PGV-C2 東洋インキ社製)を鋳型としてPCRを行った。増幅したDNA断片をアガロースゲルに電気泳動を行い、目的の断片を切り出して、p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10のHind III-XbaIサイトにライゲーションにより挿入した。
Maxi Kit(キアゲン社製)を用い、製品取扱説明書の手順に従いプラスミドDNAの抽出・精製を行った。
pTri6-NLucをタンパク質発現用大腸菌(BL21(DE3);メルク社製)に導入し、Overnight Express Instant LB
Medium(メルク社製)で16時間、NLucタンパク質の発現を誘導しつつ培養した。菌体を溶解してタンパク質を抽出してHis-tagカラムを用いてNLucを回収した。
p3xFLAG-CMV-9-CLuc、p3xFLAG-CMV-10-CLucそれぞれを遺伝子導入試薬(Lipofectamine 2000試薬;インビトロジェン社製)を用いてHEK293細胞にトランスフェクションして24時間培養した。
トランスフェクションした細胞を培養しているウェルから培地 100 mlを抜き取り、そこにHis-tag精製したNLuc 50mlを添加した。室温に30分静置した後、ピッカジーン(東洋ビーネット)100 mlを添加して5秒間の発光量を測定した。
1.発光量測定結果
実験方法4での測定結果を下表に示す。
分泌型ベクターを使用した場合、培地中にCLucが含まれているため、NLucを添加することによりN-C複合体が形成されて発光反応が生じると考えられる。非分泌型ベクターの結果より、細胞中にCLucは存在するが培地中には存在しないこと、およびCLucの漏出は発生していないことが示唆される。さらに、非分泌ベクター導入細胞の培地と細胞ライセートの発光量の比較から、NLucは細胞内には浸入していないと考えられる。
検出されるタンパク質(ターゲットタンパク質)にGaussiaルシフェラーゼを使用した。Gaussiaルシフェラーゼは、Gaussia princeps(カイアシ)よりクローン化された公知のルシフェラーゼである(Ballou et al. 11th Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Asilomar, Carifornia(2000), Verhaegent et al. Anal. Chem. 74 4378-85(2002), Tannous, et al. Mol Ther, 11:435-43, Siouxsie Wiles, et al. Appl. Envir. Microbiol. 71:3427-3432(2005), Svetlana J. Biol. (2004)279:3212-3217)。本ルシフェラーゼは185アミノ酸から構成され、分子サイズが19.9kDaである。また、ウミシイタケルシフェラーゼと同様にセレンテラジンを酸化する能力を有する。そのため、480 nmをピークとする光を放射する。さらに、Gaussiaルシフェラーゼは細胞外に容易に分泌されるタンパク質であることが判明している。Gaussiaルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列をDNA(図5)、NLuc、CLuc共に耐熱性を持たせるため変異を入れ(CLuc530、NLuc-TS)(図4−2)、C末端側ベクター((1) pTri-CLuc(ネガティブコントロール・非耐熱)、(2) pTri-GL-CLuc(分泌・非耐熱)、(3) pTri-CLuc530(ネガティブコントロール・耐熱)、(4) pTri-GL-Cluc530(分泌・耐熱))とN末端側ベクター(pTri6-NLucTS)を作製し、実施例1と同様の実験を行なった。但し、ベクターとしては、実施例1のシグマ・アルドリッジ社製の市販品p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10の代わりに、pTriEX-3(メルク社製)を用いた。
1.発光量測定結果
結果を図6に示す。
(1)〜(4)のベクターを導入した細胞(HEK293)の培地の発光量を測定した。分泌ターゲットタンパク質であるGaussiaルシフェラーゼを融合させたベクターを導入した場合に発光が確認された。また、耐熱性ルシフェラーゼを使用した場合は非耐熱性ルシフェラーゼより約3.8倍の発光が得られた。
配列番号1は、天然ホタルルシフェラーゼ(非耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、天然ホタルルシフェラーゼ(非耐熱)の塩基配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、CLuc(非耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、CLuc(非耐熱)の塩基配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、NLuc(非耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、NLuc(非耐熱)の塩基配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、変異型ホタルルシフェラーゼ(耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、変異型ホタルルシフェラーゼ(耐熱)の塩基配列を示す。
<配列番号9>
配列番号9は、CLuc530(耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号10>
配列番号10は、CLuc530(耐熱)の塩基配列を示す。
<配列番号11>
配列番号11は、NLuc-TS(耐熱)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号12>
配列番号12は、NLuc-TS(耐熱)の塩基配列を示す。
Claims (16)
- ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとN末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
- さらに、発光基質を添加することを含む請求項1記載の方法。
- 発光タンパク質がルシフェラーゼであり、発光基質がルシフェリンである請求項2記載の方法。
- ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである請求項3記載の方法。
- ホタルルシフェラーゼが北米産ホタル天然ルシフェラーゼである請求項4記載の方法。
- 北米産ホタル天然ルシフェラーゼが配列番号1のアミノ酸配列からなる請求項5記載の方法。
- 北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びN末端フラグメントが、それぞれ、配列番号1のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びN末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記N末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである請求項6記載の方法。
- 北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである請求項7記載の方法。
- 北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目若しくは1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜2番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目若しくは1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜3番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端からら1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目若しくは1〜14番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜4番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目若しくは1〜13番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜5番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目若しくは1〜12番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜6番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目若しくは1〜11番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜7番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目若しくは1〜10番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜8番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目若しくは1〜9番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜9番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目若しくは1〜8番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜10番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目若しくは1〜7番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜11番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目若しくは1〜6番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜12番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目若しくは1〜5番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜13番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目若しくは1〜4番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜14番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目若しくは1〜3番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目又は1〜2番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号5のアミノ酸配列のC末端から1番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列のN末端から1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項8記載の方法。 - ホタルルシフェラーゼが配列番号7のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである請求項4記載の方法。
- 変異型ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びN末端フラグメントが、それぞれ、配列番号7のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びN末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記N末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである請求項10記載の方法。
- ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである請求項11記載の方法。
- ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目、1〜16番目若しくは1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目、1〜15番目若しくは1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜2番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目、1〜14番目若しくは1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜3番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目、1〜13番目若しくは1〜14番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜4番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目、1〜12番目若しくは1〜13番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜5番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目、1〜11番目若しくは1〜12番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜6番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目、1〜10番目若しくは1〜11番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜7番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目、1〜9番目若しくは1〜10番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜8番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目、1〜8番目若しくは1〜9番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜9番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目、1〜7番目若しくは1〜8番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜10番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目、1〜6番目若しくは1〜7番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜11番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目、1〜5番目若しくは1〜6番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜12番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目、1〜4番目若しくは1〜5番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜13番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目、1〜3番目若しくは1〜4番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜14番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目、1〜2番目若しくは1〜3番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜15番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目若しくは1〜2番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜16番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号11のアミノ酸配列のC末端から1番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列のN末端から1〜17番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項12記載の方法。 - ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記N末端フラグメントとC末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
- 発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記N末端フラグメントとC末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
- 発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとN末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
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