DE60215820T2

DE60215820T2 - Protein-arrays, verfahren zu ihrer herstellung sowie verfahren zum nachweis intermolekularer wechselwirkungen

Info

Publication number: DE60215820T2
Application number: DE60215820T
Authority: DE
Inventors: Vehary Sakanyan; Marina Snapyan; Anahit Ghochikyan; Francoise-Michèle LECOCQ; Laetitia Guevel; Pierre Weigel; Frederique Braun
Original assignee: Universite de Nantes
Current assignee: Universite de Nantes
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: EP1412758B1; WO2003012451A3; ATE344457T1; EP1412758A2; AU2002333684A1; WO2003012451A2; EP1279963A1; DE60215820D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für den Nachweis von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Sonde(n) und Proteinzielen, wobei die Proteinziele wenigstens ein Protein oder Polypeptid einschließen, welches bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet. Insbesondere resultiert die Erfindung aus der Kombination der Herstellung von Proteinarrays mit zellfreien synthetisierten Proteinen und der Detektion von spezifischen Wechselwirkungen unter Anwendung von Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffen. Die Erfindung betrifft des Weiteren Proteinarrays und Verfahren für ihre Herstellung.
Die systematische Sequenzierung von Genomen hat den Biologen seit kurzem eine hohe Anzahl von Sequenzen von vermeintlichen Proteinen mit unbekannten Funktionen zur Verfügung gestellt. Durch Anwendung von funktionellen Genomforschungstechnologien ermöglichte das systematische Screening hinsichtlich abnormaler Expression von Sequenzen, welche mit einer spezifischen Pathologie korreliert ist, parallel dazu die Identifizierung potenzieller Ziele für neue Arzneimittel, welche aus Proteinen bestehen, die zum Teil unbekannte Funktionen besitzen.
Um die potenziellen Arzneistoffe zu entwickeln und/oder zu screenen, welche auf diese Proteine abzielen könnten, deren abnormale Expression mit spezifischen Pathologien korreliert ist, besteht ein Bedarf in Hochdurchsatzverfahren für den Nachweis von Molekülen, wie Nukleinsäuren, Proteinen, kleinen Liganden und anderen Verbindungen, welche an diese Proteinziele binden.
Es sind bereits mehrere Verfahren vorgeschlagen worden, um Protein-DNA- oder Protein-Protein-Wechselwirkungen sowohl in vivo als auch in vitro zu identifizieren. Diese Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die parallele Analyse einer hohen Zahl von Wechselwirkungen zulassen. Im Speziellen werden verbesserte Versionen eines Zwei-Hybrid-Systems, ursprünglich basierend auf einer selektiven Aktivierung von Reportergenen, welche von RNA-Polymerase II transkribiert werden, weithin bei Proteom-Forschern eingesetzt (Vidal & Legrain, 1999, Joung et al., 2000;). Des Weiteren ist die Phagen-Display-Technologie, welche das Screening von kurzen Peptiden, die mit anderen Molekülen wechselwirken, ermöglicht, in breitem Umfang zum Untersuchen von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen angewandt worden.
Noch kürzlicher ist die Proteinarray-Technologie ein wirkungsvolles Vorgehen für die Identifizierung von Hochdurchsatz-Intermolekular-Wechselwirkungen geworden (Büssow et al., 1998, Silzal et al., 1998, MacBeath & Schreiber, 2000; Holt et al., 2000; Mahlknecht et al., 2001). Mehrere Verfahren zur Herstellung von Proteinarrays sind beschrieben worden. Zum Beispiel basiert ein Verfahren auf der Bindung von Proteinen auf einer Nitrozellulosemembran an definierten Positionen und der Inkubation der Membran mit ³²P-markierter Sonde zum Identifizieren von Protein-Nukleinsäure-, Protein-Protein- und Protein-Kleinligand-Wechselwirkungen (Ge, 2000, WO 0054046). Nach mehreren Waschschritten werden spezifische Wechselwirkungen zwischen Sonden und Zielen durch Autoradiografie oder mittels des PhosphorImager detektiert.
In den oben erwähnten Verfahren werden die Proteine, welche als Proteinarrays in Form von Spots aufgetragen bzw. aufgetropft werden, im Allgemeinen unter Anwendung von zellulärer Expression in vivo synthetisiert.
Allerdings erfordert die intrazelluläre Synthese von Proteinen in vivo mehrere Schritte, einschließlich Insertion der entsprechenden DNA in ein Vektormolekül, dessen Einführung in einen gegebenen Wirt, seine Expression und die weitere Aufreinigung des Expressionsproduktes. Darüber hinaus können manche Gene für Wirtszellen toxisch sein, oder ihr Expressionsprodukt kann nicht ohne weiteres gereinigt werden, zum Beispiel aufgrund ihrer hydrophoben Struktur, oder sie falten sich nicht korrekt auf eine solche Weise, dass sie nach der in vivo-Synthese und Reinigung keine natürliche Konformation mehr wiedererlangen. Dies führt zur Frage der Bereitstellung von Verfahren für die Herstellung von Proteinarrays, welche ein Protein umfassen, das in vivo, nämlich durch intrazelluläre Expression, nicht synthetisiert werden kann. Eine Lösung wird durch chemische Synthese in vitro bereitgestellt. Allerdings ist die chemische Synthese kostspielig und ist nicht geeignet für die Synthese von langen Polypeptiden oder Proteinen. Dieses Vorgehen ist daher auf die Synthese von kleinen Peptiden, im Allgemeinen bis zu 50 Aminosäuren, beschränkt. Daneben stellt dieses Verfahren nicht eine mögliche Reifung von Proteinen bereit, die normalerweise in Zellen stattfindet.
Im Gegensatz zu in vivo-Protein-Produktion gestatten zellfreie Systeme, für Zellwirte schädliche Proteine zu synthetisieren (Zubay, 1973;). Die zellfreie Synthese ist als eine essenzielle Komponente für das Translations-basierende Screening bei Polysomen-Display, Trunkierungs-Test (Van Essen et al., 1997), Scanning-Sättigungs-Mutagenese, ortsspezifischer Einbindung von unnatürlichen Aminosäuren in Proteine und der Markierung von Proteinen mit stabilen Isotopen eingesetzt worden. Außerdem sind zellfreie Systeme zur Identifikation von modifizierten Proteinen durch Analyse ihrer elektrophoretischen Wanderung (King et al., 1997) oder für die Identifizierung von DNA-bindenden Proteinen durch Mobilitäts-Verschiebungs-Assay (mobility shift assay) (Lustig et al., 1997) verwendet worden. Sowohl zirkuläre als auch lineare exogene DNAs können als Matrizen für Proteinsynthese verwendet werden, und eine gute Proteinausbeute kann von starken Phagen-Promotoren in einem bakteriellen zellfreien System erreicht werden. Allerdings beeinflussen viele Faktoren die Ausbeute und die Homogenität von synthetisierten Volllängenproteinen in einem zellfreien System, und deshalb ist dessen weitere Anwendung eingeschränkt. In Anbetracht der geringeren Ausbeute von Proteinsynthese unter Anwendung eines zellfreien Proteinsyntheseverfahrens, werden daher zelluläre in vivo-Systeme im Allgemeinen bevorzugt.
Es wird nämlich die Abscheidung einer hohen Menge an stabilen Proteinen als wesentlich für die Herstellung eines Proteinarrays angesehen, welcher zum Detektieren spezifischer Sonde-Protein-Wechselwirkungen bei einer guten Empfindlichkeit unter Anwendung der allgemein verwendeten Markierungsmethodiken geeignet ist.
Bis heute ist kein Proteinarray beschrieben worden, der auf zellfrei synthetisierten Proteinen basiert, welche seriell hergestellte Proteine umfassen, die entweder aufgrund einer Toxizität für ihre Wirtszellen oder wegen der Schwierigkeit, ein gereinigtes oder korrekt gefaltetes Produkt zu erhalten, nicht in vivo produzierbar sind.
Somit besteht noch eine Notwendigkeit, neue methodische Vorgehen zu entwickeln, welche fähig sind, eine serielle, schnelle und empfindliche Detektion von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Sonde(n) und Proteinzielen durchzuführen, wobei die Ziele mindestens ein Protein oder Polypeptid einschließen, welches nicht in vivo in Wirtszellen produzierbar ist, und welches für die Wirtszellen toxisch ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet.
Die Verwendung des Begriffes "serielle Detektion" bedeutet, dass mehrere getrennte Ziele parallel hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit mindestens einer spezifischen Sonde getestet werden.
Vorzugsweise werden mehr als zehn Ziele gleichzeitig getestet.
Fluoreszenzmethodik, als eine Alternative zu radioaktiven und Chemolumineszenz-Methoden, kommt in weitem Umfang für den direkten Nachweis von markierten Makromolekülen und zum Screenen von Makromolekülen, welche durch farbstoffmarkierte Sonden angezielt werden, zur Anwendung. Kürzlich ist ein Nachweisverfahren für Nukleinsäuren und Proteine durch Infrarotfluoreszenz-Bildgebung von LI-COR, Inc., entwickelt worden. Reagierende Makromoleküle, markiert mit Nah-Infrarot(IR)-Fluoreszenzfarbstoffen mit einer Emission bei ungefähr 700 nm und 800 nm können mittels des LI-COR Odyssey IR-Imagers, ausgestattet mit Lasern, welche bei 680 und 780 nm anregen, detektiert werden. Die Infrarotregion besitzt einen geringeren Hintergrund im Vergleich zu den Farbstoffen mit niedrigerer Wellenlänge, verwendet in anderen Fluoreszenz-Nachweisverfahren, wodurch ein höheres Signal-zu-Rauschen-Verhältnis vorgesehen wird und gestattet wird, Zielmoleküle mit einer höheren Empfindlichkeit nachzuweisen. Die Aussagekraft der Technologie ist für den Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen, welche an Membranen gebunden sind, sowie für den Nachweis von Proteinzielen mit IRD-markierten Antikörpern gezeigt worden (Esser et al., 2000; Schutz et al., 2000).
Die Erfindung resultiert aus der Feststellung, dass in vitro synthetisierte Proteine für die Herstellung eines Proteinarrays verwendet werden können. Die Erfinder haben nämlich gezeigt, dass die Verwendung von Arrays, basierend auf in vitro synthetisierten Proteinen, in Kombination mit den IR-Farbstoffen, ein hochempfindliches und schnelles Verfahren zur Detektion von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden und Proteinzielen bereitstellt.
Im Speziellen sieht die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Proteinarrays vor, umfassend Proteinziele, welche vorzugsweise ein Protein oder Polypeptid, das in vivo nicht herstellbar ist, welches bei Expression in vivo in Wirtszellen für die Wirtszellen toxisch ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet einschließen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

a) paralleles Synthetisieren von Proteinzielen unter Anwendung eines zellfreien Proteinsynthese-Verfahrens mit einem Überschuss der α-Untereinheit von RNA-Polymerase entsprechend den anderen Untereinheiten derselben;
b) Gewinnen der synthetisierten Proteine oder Polypeptide; und
c) Herstellen eines Proteinarrays durch Binden von synthetisierten Proteinen oder Polypeptiden an einen Träger an definierten Positionen.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Proteinarray" auf einen Träger, umfassend einen Satz von Proteinen oder Polypeptiden, gebunden an definierten Positionen, wobei jede Position einer spezifischen Sequenz von Polypeptid oder Protein entspricht. Eine oder mehrere Positionen können derselben Sequenz von Polypeptid oder Protein entsprechen. Ein Proteinarray kann bis zu Tausende unterschiedliche Polypeptide oder Proteine umfassen.
Gemäß der Erfindung beziehen sich die Proteinziele, austauschbar, auf die Proteine oder Polypeptide, welche an den Träger gebunden sind.
Der Fachmann auf dem Gebiet kann jedwedes Protein oder Polypeptid wählen, für welches eine intermolekulare Wechselwirkung mit spezifischen Sonde(n) in Frage gestellt wird. Diese Ziele können beispielsweise alle die Proteine sein, welche von dem Genom eines Organismus codiert werden. Diese Ziele können auch eine spezifische Familie von Proteinen sein, und zwar nach ihrer Funktion in der Zelle, wie Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen. Diese Ziele können auch Proteine sein, welche an Erkrankungen beteiligt sind und speziell Proteine aus pathogenen Organismen oder Proteine mit einer abnormen Expression bei Krebs, kardiovaskulärer, neurodegenerativer oder genetischer Pathologie. Diese Ziele können auch Proteine sein, welche verschiedene katalytische Aktivitäten aufzeigen und/oder die Bindung von kleinen Liganden oder Cofaktoren oder kurzen Peptiden ermöglichen.
Vorzugsweise schließen die Proteinziele Proteine oder Polypeptide ein, welche unter Verwendung eines zellulären in vivo-Expressionssystems nicht erhältlich sind und welche mindestens eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche länger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise länger als 50 Aminosäuren ist.
Die Proteinziele umfassen mindestens ein Proteinziel, welches bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "kann nicht gereinigt werden", dass herkömmliche Reinigungsvorgehen kein gereinigtes Protein bereitstellen können, welches weniger als 10 % Verunreinigungen enthält, oder selbiges nicht gereinigt werden kann, ohne seine korrekte Faltung zu beeinträchtigen, wie bei Membranproteinen.
Gemäß der Erfindung ist ein Protein, das sich nicht korrekt faltet, ein rekombinantes Protein, welches nicht im Wesentlichen die gleichen Bindungseigenschaften wie ein entsprechendes natives Protein aufweist, welches aus einem homologen Wirtsorganismus gereinigt wird.
Genauer gesagt, umfassen Proteine oder Polypeptide, welche toxisch sind oder nicht gereinigt werden können oder sich nicht korrekt falten, fehlgefaltete oligomere oder monomere Wildtyp- oder Mutantenproteine, die, aufgrund ihrer Expression in vivo, den regulatorischen, membranverknüpften, sekretorischen oder anderen Proteinen angehören, insbesondere in einer heterologen zytoplasmatischen Umgebung. Insbesondere kann die in vivo-Multiplikation eines gegebenen Gens unter selektivem Druck, wobei das gegebene Gen ein für die Wirtszelle schädliches Protein codiert, Mutationen in dem Gen und das entsprechende mutierte Protein erzeugen, welche die realen Bindungseigenschaften des Wildtyp-Proteins nicht widerspiegeln.
Gemäß des Verfahrens der Erfindung werden die Zielproteine daher in vitro unter Anwendung eines zellfreien Proteinsyntheseverfahrens synthetisiert, welches die rasche parallele Synthese einer Anzahl von Proteinen gestattet, einschließlich derer, welche, wenn sie in vivo in Wirtszellen exprimiert werden, für die Wirtszellen toxisch sind oder nicht gereinigt werden können oder sich nicht korrekt falten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein zellfreies Proteinsyntheseverfahren auf jedwedes Verfahren für die zellfreie Synthese eines gewünschten Proteins von einer Ribonukleinsäure(RNA)-Matrize oder einer Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Matrize aus. Somit kann es sich entweder auf in vitro Transkriptions-Translations- oder in vitro Translations-Verfahren beziehen. Diese Verfahren werden in vivo-Proteinsyntheseverfahren unter Beteiligung der Kultur rekombinanter Zellen, welche die gewünschten Proteine exprimieren, und chemischen Syntheseverfahren gegenübergestellt. Beispiele für eukaryotische in vitro-Translationsverfahren sind die Verfahren, welche die Kaninchen-Reticulocyten (Pelham und Jackson, 1976) oder Weizenkeim-Lysat (Roberts und Paterson, 1973) beteiligen. Das E.coli-S30- Extrakt-Verfahren, welches von Zubay (1973) beschrieben wurde, ist ein Beispiel eines weithin verwendeten prokaryotischen in vitro-Transkriptions-Translations-Verfahrens.
Lesley et al. (1991) optimierte den E.coli-Extrakt von Zubay (1973) zur Verwendung mit PCR-Fragmenten und anderen linearen DNA-Matrizen durch Herstellung eines Bakterienextraktes aus einem Nuklease-defizienten Stamm von E.coli. Des Weiteren ist eine Verbesserung des Verfahrens von Kigawa et al. (1999) beschrieben worden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das zellfreie Proteinsynthese-Verfahren die Verwendung eines zellfreien Extraktes, vorzugsweise eines bakteriellen zellfreien Extraktes, weiter bevorzugt eines zellfreien E.coli-Extraktes. Der Begriff zellfreien Extrakt, wie hierin verwendet, definiert jedwede Präparation, umfassend die Komponenten der Proteinsynthese-Maschinerie, wobei derartige Komponenten ausreichend sind, um die Translation einer Botschafter-Ribonukleinsäure zu ermöglichen, welche ein gewünschtes Protein codiert. Gegebenenfalls umfasst der zellfreie Extrakt Komponenten, welche fernerhin die Transkription der DNA erlauben, welche das gewünschte Protein codiert.
Wenn die Matrize eine DNA ist, umfasst sie wenigstens die Sequenz eines offenen Leserahmens (ORF), codierend das gewünschte Protein, und die Sequenzen, welche für Transkriptions- und Translationsinitiation angemessen sind. Gegebenenfalls kann die DNA-Matrize kurze Sequenzen umfassen, welche Tags zum Erleichtern einer weiteren Aufreinigung des synthetisierten Proteins codieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die DNA-Matrize ebenfalls einen starken bakteriellen Promotor mit mindestens einem UP-Element, vorzugsweise den Promotor des argCo-Gens von Bacillus stearothermophilus.
Die lineare DNA-Matrize kann auch eine durch PCR erzeugte DNA-Matrize sein, welche den ORF, codierend das Protein oder Polypeptid, und eine zusätzliche Sequenz umfasst, die in einer bevorzugten Ausführungsform mindestens 3 bp, vorzugsweise länger als 100 bp und weiter bevorzugt länger als 200 bp ist. Diese Verlängerung der durch PCR erzeugten DNA-Matrize verbessert gezeigtermaßen die Ausbeute und die Homogenität einer in vitro Proteinsynthese unter Verwendung eines zellfreien bakteriellen Extraktes.
Jedes Proteinziel kann somit parallel synthetisiert werden, zuerst durch Amplifizieren des Gens, welches das gewünschte Protein oder Polypeptid codiert, und zum Zweiten durch Ausführen einer zellfreien Proteinsynthese unter Verwendung des Amplifizierungsproduktes als DNA-Matrize.
Auf dem Fachgebiet ist es bekannt, dass das Zusetzen von gereinigtem RNA-Polymerase-Holoenzym die Ausbeute einer Proteinsynthese verbessern kann. Zum Beispiel kann der Reaktionsmischung gereinigte T7-RNA-Polymerase zugegeben werden, wenn eine zellfreie Proteinsynthese unter Verwendung eines T7-Phagen-Promotors durchgeführt wird. Es ist jedoch ebenfalls gezeigt worden, dass das Zugeben von gereinigter thermostabiler RNA-Polymerase, vorzugsweise T.thermophilus, eine ähnliche Ausbeute ermöglicht, wenn entsprechende Promotorsequenzen verwendet werden.
Somit wird, in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, bei welchem ein bakterieller zellfreier Extrakt verwendet wird, eine gereinigte thermostabile RNA-Polymerase, vorzugsweise aus T.thermophilus, in den bakteriellen zellfreien Extrakt zugesetzt.
Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass spezifisch die Zugabe von gereinigter α-Untereinheit von RNA-Polymerase in den zellfreien Extrakt im Überschuss zu dem Wirts-RNA-Polymerase-Holoenzym desselben überraschenderweise eine bessere Ausbeute der Proteinsynthese vorsieht, als mit T7-RNA-Polymerase-Holoenzym, wenn entsprechende Promotorsequenzen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, in welcher ein bakterieller zellfreier Extrakt verwendet wird, ist das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass gereinigte α-Untereinheit von RNA-Polymerase in den zellfreien Extrakt im Überschuss zu anderen Untereinheiten derselben zugesetzt wird.
Alternativ dazu ist in einer anderen Ausführungsform, worin ein bakterieller zellfreier Extrakt verwendet wird, das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der zellfreie Extrakt aus Wirtszellen hergestellt wird, welche ein Gen überexprimieren, das die α-Untereinheit von RNA-Polymerase codiert.
Die Proteinziele werden dann nach der zellfreien Synthese gewonnen. Sie können vor der Ablagerung auf dem Träger gereinigt werden oder sie können teilweise gereinigt werden oder direkt, ohne irgendeine Reinigung, abgelagert werden. Insbesondere können sie unter Verwendung von Säulen-Affinitäts-Chromatographie-Verfahren gereinigt werden.
Um einen Proteinarray zu bilden, werden die Proteinziele an einen Träger an definierten Positionen gebunden. Abhängig von dem Typ des Trägers könnte das Ziel entweder fest an den Träger gebunden werden oder muss chemisch an den Träger verknüpft werden. Ein Beispiel eines Trägers, der keine chemische Verknüpfung erfordert, ist eine organische Membran, vorzugsweise eine Nitrozellulosemembran. In anderen Beispielen muss ein Verknüpfungs- oder Bindungsverfahren ausgeführt werden, um die Bindung der Polypeptide zu gewährleisten. Beispiele von Verknüpfungsverfahren sind im Stand der Technik beschrieben, ebenso wie die Natur von Trägern, welche für die Bindung der Proteinziele geeignet sind.
Als ein Beispiel für die Herstellung eines Protein-Makroarrays können Proteinziele im Bereich von 0,1 pMol bis 400 pMol auf Nitrozellulosemembran mittels Vakuum ohne Verwenden irgendeines spezifischen Linkers abgelagert werden. Der Protein-Mikroarray kann ebenfalls unter Verwendung eines "Spotters" bzw Auftragungsgeräts hergestellt werden, wie dem "Arrayer" Affymetrix GMS417.
Ein Vorteil des Vakuumblotting von zellfrei synthetisierten Proteinen im Vergleich zu "Spotting"-Vorgehen besteht darin, dass sowohl die Zugabe als auch die Bindung von Proteinen an den Träger auf einer relativ großen Oberfläche durchgeführt werden kann, sogar für verdünnte Proben leicht gesteuert werden kann, wobei die Bindung von äquimolaren Mengen an zellfrei synthetisierten Proteinen an den Träger zugelassen wird.
Ein Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht darin, dass Proteinziele direkt nach ihrer Synthese ohne Reinigung, als Rohextrakte, welche aus in vitro-Expressionssystemen erhalten werden, abgelagert werden können.
Folglich wird ein Proteinarray bereitgestellt, das mindestens ein nicht-gereinigtes Protein oder Polypeptid umfasst, welches durch ein in vivo-Synthese-Verfahren nicht erhältlich ist, aber mit einem zellfreien Proteinsynthese-Verfahren erhältlich ist.
Es kann ein Proteinarray erhalten werden, bei welchem das Protein oder Polypeptid, das an den Träger gebunden ist, falls es in vivo in Wirtszellen exprimiert wird, toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet.
In einer spezifischen Ausführungsform enthält das Proteinarray ein Protein oder Polypeptid, welches nicht unter Verwendung eines zellulären in vivo-Expressionssystems erhältlich ist, und eine Aminosäuresequenz länger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise länger als 50 Aminosäuren aufweist.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist ein Proteinarray erhältlich durch das Verfahren zur Herstellung eines Proteinarrays, wie obenstehend definiert.
Tatsächlich betrifft die vorliegende Erfindung ein einfaches, schnelles und empfindliches Verfahren für die serielle Detektion von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Protein- oder Polypeptid-Zielen und Sonden.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Sonde(n) und Proteinzielen, wobei die Proteinziele vorzugsweise mindestens ein in vivo nicht-herstellbares Protein oder Polypeptid, das bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet, einschließen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte kombiniert:

a) Vorsehen von Proteinzielen durch serielles in vitro-Synthetisieren dieser unter Verwendung eines zellfreien Proteinsyntheseverfahrens mit einem Überschuss der α-Untereinheit von RNA-Polymerase im Vergleich zu anderen Untereinheiten derselben;
b) Binden der Proteinziele an einen Träger an definierten Positionen, um einen Protein-Array herzustellen,
c) Vorsehen von Sonde(n), die mit einem Nah-Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind,
d) Kontaktieren des Protein-Arrays mit den markierten Sonde(n) in einem Medium, das zum Ermöglichen einer spezifischen Bindung geeignet ist,
e) Nachweisen, auf dem Protein-Array, der Proteinziel(e), an welche(n) die markierten Sonde(n) spezifisch bindet bzw. binden, wobei eine Infrarot-Bilderzeugungsvorrichtung angewandt wird.

Somit gestattet das Verfahren, jedwede intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Proteinzielen und der Sonde zu detektieren. Wie hierin verwendet, beziehen sich "intermolekulare Wechselwirkungen" oder "spezifische Bindung" zwischen einer Sonde und einem Proteinziel auf eine physikalische Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, welche unter Anwendung üblicher Waschbedingungen, umfassend Inkubation in einem Puffer von niedriger Stringenz, zum Beispiel dem Puffer A100, wie beschrieben in Ge, 2000, während mindestens einer Stunde bei Raumtemperatur, nicht dissoziiert werden kann.
Gemäß des Verfahrens der Erfindung werden die Proteinziele unter Verwendung von zellfreien Proteinsynthese-Systemen synthetisiert, einschließlich speziell bakteriellem zellfreiem Extrakt, vorzugsweise zellfreiem E.coli-Extrakt, wie oben beschrieben. In ähnlicher Weise wird die Herstellung des Protein-Arrays in Schritt (b) durchgeführt, wie oben stehend beschrieben.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf ein Molekül, welches mit einem oder mehreren Polypeptiden oder Proteinen des Arrays binden könnte, um die Detektion von gebundenen oder reagierenden Komplexen zu gestatten. Diese Sonde kann jedweder Typ von Molekül sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Sondenmolekül eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder ein Protein, welches direkt oder indirekt an einem Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist. Vorzugsweise wird ein Sondenmolekül direkt oder indirekt mit Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffen mit einer Emission bei ungefähr 700 nm und 800 nm gebunden. Diese Farbstoffe können beispielsweise mittels der Li-COR-Odyssey-Infrarot-Bilderzeugungsvorrichtung detektiert werden, die mit Diodenlasern ausgestattet ist, welche bei 680 und 780 nm anregen. Gegebenenfalls können verschiedene Sonden, welche mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, gleichzeitig vereinigt werden, um intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den Zielen und den unterschiedlichen Sonden zu detektieren.
Vorzugsweise besitzen Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffe eine Wellenlänge, welche höher als 680 nm ist, vorzugsweise im Bereich zwischen 680 nm und 800 nm.
Das Protein-Array wird in einem Inkubationspuffer inkubiert, welcher die Sonde(n) umfasst, wobei der Inkubationspuffer aus einem Medium besteht, welches geeignet ist, um eine spezifische Bindung zuzulassen. Nach einer Zeitdauer für die Inkubation, welche abhängig von den Mengen der Ziele und Sonden variieren kann, wird das Protein-Array gewaschen, um nichtspezifische Wechselwirkungen und sehr schwache Wechselwirkungen zu vermeiden.
Gemäß der Erfindung wird die Bindung als spezifisch betrachtet, wenn die Bindung in einem Inkubationspuffer beobachtet wird, welcher einen nicht-spezifischen Kompetitor enthält, d. h. ein Molekül, welches schwach an jedes Protein oder Polypeptid bindet. Ein Beispiel eines Inkubationspuffers für die Detektion von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist folgendes: 20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 0,1 mM DTT, 0,005 % Surfactant P20 (Biacore) und 25 μg/ml einer schallbehandelten Lachs-DNA, welche als Kompetitor-DNA verwendet wird. Ein Beispiel eines Inkubationspuffers für die Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist PBS, enthaltend 1 % BSA und 0,1 % Tween 20 (LI-COR, INC.), oder der A 100-Puffer, wie beschrieben von Ge (2000), welcher 1 % fettfreie Milch enthält.
Die mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen markierten Sonden bleiben an die Proteine gebunden, mit welchen sie spezifisch wechselwirken, und erzeugen auf dem Protein-Array ein Signal, welches unter Anwendung eines Gerätes detektiert werden kann, das Infrarot-Detektion ermöglicht. Als ein Beispiel, handelt es sich bei einem Gerät, welches Infrarot-Detektion erlaubt, um den IRD-Imager, welcher von LI-COR^® entwickelt wurde.
Die zellfreie Proteinsynthese ermöglicht es, normierte Mengen an Proteinziel vor dem Binden an den Träger bereitzustellen.
Somit ist in einer anderen spezifischen Ausführungsform das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es ferner die Schritte zur Normierung der Menge an synthetisiertem Protein vor dem Binden an einen Träger umfasst, wobei die Normierungsschritte aus folgendem bestehen:

a) Markieren jedes synthetisierten Proteins, vorzugsweise durch Zuführen einer radioaktiven Aminosäure in das zellfreie System,
b) Quantifizieren jedes markierten Proteins,
c) Vorsehen einer äquivalenten Menge jedes synthetisierten Proteins vor dem Binden an einen Träger zur Normierung.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht darin, dass mehrere Sonden gleichzeitig verwendet werden können, wobei die Sonden mit verschiedenen spezifischen IR-Farbstoffen bzw. IRDyes mit unterschiedlichen Wellenlängen markiert sind. Folglich werden, in einer spezifischen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, mindestens zwei verschiedene Sonden verwendet, wobei die Sonden mit IR-Farbstoffen von unterschiedlichen Wellenlängen markiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von in vitro synthetisierten Proteinen oder Polypeptiden für die Herstellung von Protein-Arrays, wobei mindestens eines des Proteins oder Polypeptids, falls es in vivo in Wirtszellen exprimiert wird, für die Wirtszellen toxisch ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet.
Die Proteine werden in vitro, wie oben stehend definiert, für ihre Verwendung in der Herstellung von Protein-Arrays synthetisiert.
Speziell werden Proteine oder Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von Protein-Arrays, wie oben erwähnt, von einer PCR-erzeugten DNA-Matrize synthetisiert, wobei die PCR-erzeugte DNA-Matrize einen ORF, welcher das Protein oder Polypeptid codiert, und eine zusätzliche Sequenz umfasst, welche mindestens 3 bp lang, vorzugsweise länger als 100 bp und weiter bevorzugt länger als 200 bp ist, welche unmittelbar stromabwärts des Stop-Codons des Gens lokalisiert ist, welches das Protein oder Polypeptid codiert.
Eine gereinigte α-Untereinheit von RNA-Polymerase wird in den zellfreien Extrakt im Überschuss zum RNA-Polymerase-Holoenzym für die Herstellung der Proteine oder Polypeptide zur Verwendung in den Protein-Arrays zugegeben.
Das Verfahren kann angewandt werden, um nach DNA-Fragmenten zu screenen, welche an die α-Untereinheit von bakterieller RNA-Polymerase binden. Die α-Untereinheit von bakterieller RNA-Polymerase wird in vivo in Wirtszell-Expressionssystemen oder in vitro in einem gekoppelten Transkriptions-Translations-System synthetisiert und wird mit oder ohne Reinigung auf einem Träger immobilisiert, um ein Protein-Array bereitzustellen, das nützlich zum Screenen von starken Promotoren ist, wobei die starken Promotoren dadurch gekennzeichnet sind, dass sie spezifisch mit der α-Untereinheit binden, wobei die α-Untereinheit nicht mit anderen Untereinheiten der RNA-Polymerase zusammengefügt ist.
Das Screening nach DNA-Fragmenten, welche die α-Untereinheit binden, ist im genaueren nützlich, um UP-Elemente oder Konsensus-Promotor-Stellen -10 und -35-Stellen und die ATreichen Sequenzen, welche stromaufwärts der -35-Stelle von starken Promotoren lokalisiert sind, zu identifizieren.
Das Verfahren kann für die Detektion von DNA-Fragmenten verwendet werden, welche das cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) binden. CRP wird in vivo in Wirtszell-Expressionssystemen oder in vitro in einem gekoppelten Transkriptions-Translations-System synthetisiert und wird mit oder ohne Reinigung auf einem Träger immobilisiert, um ein Protein-Array bereit zustellen, das nützlich für das Screening von starken Promotoren ist, wobei die starken Promotoren dadurch gekennzeichnet sind, dass sie spezifisch mit CRP binden.
Die untenstehenden Beispiele veranschaulichen einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken. Speziell die in den Beispielen präsentierten Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der Erfindung besonders empfindlich ist und schwache intermolekulare Wechselwirkungen, zum Beispiel mit einer K_D von weniger als 10^–7 M für DNA-Protein-Wechselwirkungen und Protein-Protein-Wechselwirkungen, nachweisen kann.
LEGENDEN DER FIGUREN
1: Eine Zeichnung, welche die transkriptionellen und translationalen Signale zeigt, die für das B.stearothermophilus-argC-Gen identifiziert wurden.
Ein UP-DNA-Element ist in Kursivdruck gezeigt. -35- und -10-Promotor-Stellen sowie eine Shine-Dalgarno-Stelle sind unterstrichen. Die Position der Oligonukleotid-Primer, welche verwendet wurden für die PCR-Amplifikation der 89-bp-, 59-bp- und 39-bp-Promotoren, sind durch einen Pfeil gezeigt. Die argCo-Operatorsequenz wird mittels einer dicken Linie gezeigt.
2: Ein Bild eines Protein-Arrays, welcher hergestellt wurde mit zellfrei synthetisierten ³⁵S-markierten Proteinen, die auf einer Nitrozellulosemembran immobilisiert wurden.
Die zellfrei synthetisierten, His-getaggten Proteine T.maritima-GntRTm0439 (Reihen 1–6) und T.maritima-LacITm1856 (7–12) wurden durch Affinitäts-Chromatografie gereinigt, aufeinanderfolgend 2-fach (von A zu H) verdünnt, mittels Vakuum auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und in Streifen ausgeschnitten. Die Streifen wurden direkt für Autoradiografie (Reihen 1 und 7) verwendet oder aufeinanderfolgend in Bindungspuffer gespült (Reihen 2 und 8) und einmal oder zweimal mit A 100 (Reihen 3 und 9 oder 4 und 10), A500 (Reihen 5 und 11) und A1000 (Reihen 6 und 12) gewaschen. Die Autoradiografie wurde mit BioMax MS-Film während 30 Minuten durchgeführt.
3: Ein Bild eines immobilisierten Proteins, welches ArgR-Protein-Wechselwirkung mit einer biotinmarkierten T.neapolitana-argRo-Operator-DNA zeigt.
His-getaggte ArgR-Proteine von B.stearothermophilus (Reihen 1 und 6) oder T.neapolitana (Reihen 3 und 8) wurden aus rekombinanten E.coli-BL21(DE3)-Zellen gereinigt. Ein Hisgetaggtes ArgR von T.neapolitana wurde zellfrei synthetisiert und mittels Affinitätschromatografie (Auftragungskerben bzw. Slots 5A und 10A) gereinigt. Die Slots 5B und 10B sind gereinigte S30-Extrakte ohne synthetisiertes ArgR, und die Slots 5C und 10C sind nichtgereinigte S30-Extrakte ohne zellfrei synthetisiertes ArgR. Die Slots 1A, 3A, 6A und 8A enthalten 100 pMol Protein; Slots 1B, 3B, 6B und 8B enthalten 20 pMol Protein; Slots 1C, 3C, 6C und 8C enthalten 2 pMol Protein. Eine biotinmarkierte T.neapolitana-argRo-Operator-DNA (Endkonzentration 10 ng/ml) wurde mit Membranen bei 4 °C (Reihen 1–5) oder 60 °C (Reihen 6–10) über Nacht inkubiert.
4: Bild eines Protein-Arrays, welches DNA-Protein-Wechselwirkungen mit IRD-800-markierter 59-bp-DNA (a) oder einer 39-bp-DNA (b) von B. stearothermophilus-argCo zeigt.
1 – ArgR von T.neapolitana; 2 – ArgR von B.stearothermophilus; 3 – ein chimäres ArgR-EbE; 4 – GroES von T.neapolitana; 5 – α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase; 6 – CRP von E.coli. Die seriell 2-fach verdünnten Proteinproben wurden auf der Nitrozellulosemembran geblottet, die Membran wurde in zwei Hälften geteilt und in Bezug auf eine der zwei IRD-markierten Sonden sondiert.
5: Sensogramme, welche die Bindung von Wildtyp-ArgR-Proteinen von T.neapolitana, B.stearothermophilus, E.coli und von einem chimären ArgR-EbE in Bezug auf die B.stearothermophilus-argCo-Operator-DNA zeigen.
Gereinigte, His-getaggte Proteine wurden bei 10 mM, 25 mM, 50 mM und 100 mM in Gegenwart von 5 mM L-Arginin injiziert.
6: Sensogramm, welches E.coli-CRP-Wechselwirkung hinsichtlich der B.stearothermophilus-argCo-Operator-DNA zeigt.
Gereinigtes His-getaggtes CRP wurde in Abwesenheit oder Gegenwart von 5 mM cAMP injiziert.
7: Ein Bild eines Protein-Arrays, welches aufeinanderfolgend Protein-Protein- und DNA-Protein-Wechselwirkungen zeigt.
Proteine wurden seriell verdünnt und auf die Nitrozellulosemembran geblottet: 1 – ArgR von T.neapolitana; 2 – ArgR von B.stearothermophilus; 3 – ArgR von E.coli; 4 – GroES von T.neapolitana; 5 – α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase; 6 – CRP von E.coli. Die Membran wurde zuerst verwendet, um mit Cy5.5-markierter α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase zu sondieren (a), dann gewaschen und erneut sondiert mit einer IRD-800-markierten 39-bp-DNA, welche einen verkürzten argCo-Operator trug (b). 5 μg der abgelagerten His-getaggten Proteine in den Slots A entsprachen 290 pMol ArgR-Proteinen, 500 pMol GroES, 140 pMol der α-Untereinheit oder 208 pMol CRP.
8: Ein Bild eines zellfrei synthetisierten Protein-Arrays, welches DNA-Protein-Wechselwirkungen zeigt.
Äquimolare Mengen (für Monomer) von zellfrei synthetisierten vermeintlichen T.maritima-Proteinen, angehörend der Gnt- (a), Lac- (b) und (c) Xyl-Famlie von Regulatoren, wurden 2-fach seriell verdünnt und auf einer Nitrozellulose-Membran geblottet. Die Inkubation wurde in Bezug auf IRD-800-markierte Operator-DNA-Sonden von E.coli-gntKo, laclo bzw. xylFo bei 60 °C über Nacht durchgeführt.
9: Nicht-denaturierendes Agarosegel, welches die Wechselwirkung von zellfrei synthetisierten Proteinen in Bezug auf Operator-DNAs zeigt.
His-getaggte gereinigte Proteine wurden in einem zellfreien System synthetisiert und in Bezug auf Dig-markierte Operator-DNA-Sonden in DNA-Bindungs-Puffer bei 37°C während 30 Minuten sondiert. Die ArgR-Bindung wurde in Gegenwart von 10 mM L-Arginin in Bindungs- und Laufpuffern durchgeführt.
10: Ein Bild eines zellfrei synthetisierten Protein-Arrays, welches Protein-Protein-Wechselwirkungen zeigt.
Äquimolare Mengen an zellfrei synthetisierten vermeintlichen T.maritima-Proteinen, angehörend den Regulatorfamilien Gnt (a), Lac (b) und Xyl (c), wurden seriell verdünnt und auf einer Nitrozellulosemembran geblottet. Die Inkubation wurde mit der Cy5.5-markierten α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt. Nicht-verdünnte Proben von CRP und α-Untereinheit von E.coli-RNA [-Polymerase], gereinigt aus Zellen, enthalten 200 pMol Proteine.
11: Ein Bild eines Protein-Arrays, welches Ligand-Protein-Wechselwirkungen in Rattenzell-Membranhomogenaten unter Verwendung von IRD-800-markierten Ratten-Sekundär-Antikörpern zeigt.
Die immobilisierten Homogenate wurden zuerst an HNK-1-Kohlenhydrat (a) oder an 8-Aminosäure-Nachahmer-Protein (c) gebunden, dann wurden diese Membranen mit entsprechenden Anti-HNK-1- oder Anti-Nachahmer-Primär-Ratten-Antikörpern inkubiert und danach mit IRD-800-markierten Sekundär-Antikörpern sondiert. Die Membran (b) wurde mit Anti-GABAR-Primär-Antikörpern inkubiert und dann mit IRD-800-markierten Sekundär-Antikörpern sondiert.

1, 5 und 8 – Homogenate mit gleichzeitig exprimierten GABA_BR1a- und GABA_BR2a-Rezeptoren;
2, 7 und 9 – Homogenate mit gleichzeitig exprimierten GABA_BR1b- und GABA_BR2a-Rezeptoren;
3 und 10 – Laminin (die anfängliche Menge beträgt 100 μg);
4, 6 und 11 – Homogenate ohne exprimierte GABA-Rezeptoren.

12: Bild eines Protein-Arrays, welches die Detektion von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung von Extrakten von E.coli BL21 (DE3)-Zellen zeigt.
Die Konzentration an gesamten oder gereinigten Proteinen, welche in A-Slots zugesetzt worden waren, belief sich auf 63 μg, mit der Ausnahme von A2, bei welchem 41 μg Gesamtprotein zugegeben wurden, aufgrund eines langsameren Wachstums von E.coli (pET-ArgR_Bs-His). Die Inkubation wurde mit einer IRD-800-markierten 39-bp-DNA von B.stearothermophilus-argCo bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt.
Die vertikalen Reihen 1, 2 bzw. 3 stehen für 1 h IPTG-induzierte Proben von E.coli (pET-ArgR_Ec-HIS), E.coli (pET-ArgR_Bs-His) und E.coli (pET-ArgR_T _n-His);
4, 5, 6 bzw. 7 sind 5 h IPTG-induzierte Proben von E.coli, E.coli (pET-ArgR_Ec-HIS), E.coli (pET-ArgR_Bs-His) und E.coli (pET-ArgR_Tn-His);
8, 9 bzw. 10 – reines His-getaggtes ArgR von E.coli, B.stearothermophilus und T.neapolitana;
11 – reines His-getaggtes E.coli-CRP.
13: Bild eines Glasobjektträger-Mikroarrays, welches Nahinfrarot-Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen zeigt.
Die Spots bzw. Auftragungsorte 1, 2, 3, 4, 5 bzw. 6 entsprechen jeweils T.neapolitana-ArgR, synthetisiert in einem zellfreien System, oder B.stearothermophilus-ArgR, E.coli-ArgR, T.neapolitana-GroES, E.coli-α-Untereinheit von RNA-Polymerase und CRP, synthetisiert in E.coli-Zellen. Die Menge an abgelagerten Proteinen, welche in vivo synthetisiert wurden, ist in pg gezeigt. Proben wurden 4-fach verdünnt, und eine Bindung wurde mit Cy5.5-markiertem T.neapolitana-GroEL bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt.
14: SDS-PAGE-Analyse und Fluoreszenzdetektion von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen auf Arrays mit aufgetropften ArgR-Repressoren.
80 μg Gesamtprotein (Rohextrakte) von nicht-induzierten und 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten lang IPTG-induzierten Proben des E.coli BL21 (DE3)-Stammes, welcher das argR-Gen von E.coli (a), B.stearothermophilus (b) oder T.neapolitana (c) trug, wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen; die letzte Spur enthält 5 μg eines gereinigten His-getaggten Proteins; molekulare Massen-Referenzen sind in kDA angegeben. Protein-Chips wurden mit denselben Rohextrakten durch eine serielle 2-fache Verdünnung oder mit reinen Proteinen durch eine serielle 4-fache Verdünnung hergestellt. Das Gesamtprotein in aufgetropften Zellextrakten ist in pg gezeigt, die Menge an aufgetropften reinen Proteinen ist in fMol und aMol gezeigt. Bindungsreaktionen wurden mit einer IRD-800-markierten 59-bp-DNA, welche die gesamte B.stearothermophilus-PargCo-Region trug (d, e und f), oder mit einer IRD-800-markierten 39-bp-DNA, welche eine verkürzte PargCo-Region trug (g, h und i), oder einer Cy5.5-markierten E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit (j, k und l) in Gegenwart von 10 mM Arginin ausgeführt.
15: SDS-PAGE-Analyse und Fluoreszenzdetektion von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen auf Arrays mit aufgetropfter E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit und CRP.
Bindungsreaktionen wurden mit einer IRD-800-markierten 59-bp-DNA, welche die gesamte B.stearothermophilus-PargCo-Promotor-Operator-Region trug (c und d), oder mit einer Cy5.5-markierten E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit (e und f) ausgeführt. Die Bindung von CRP-Chips wurde in Gegenwart von 5 mM cAMP ausgeführt. Andere Beschreibungen sind wie in 14.
BEISPIELE
A. Materialien und Methoden
A.1 Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen.
Bakterienstämme und Plasmide werden in der Tabelle 1 beschrieben.
E.coli-Zellen wurden durch Schütteln (180 U/min.) bei 28 °C oder 37 °C auf LB-Medien (Miller, 1992) wachsen gelassen, welche mit geeigneten Antibiotika ergänzt worden waren: Ampicillin 100 μg/ml, Chloramphenicol 25 μg/ml und Kanamycin 25 μg/ml. Für die Herstellung von zellfreien Extrakten wurden E.coli-Zellen bei 37 °C in einem Medium mit 5,6 g/l KH₂PO₄, 28,9 g/l K₂HPO₄, 10 g/l Hefeextrakt (Difco), 1 mM Mg-Acetat, 10 g/l Glucose, 15 μg/ml Thiamin, beschrieben von Zubay (Zubay, 1973), wachsen gelassen. B.stearothermophilus-Zellen wurden in LB-Nährmedium (pH 7,3) bei 56 °C bei heftigem Schütteln wachsen gelassen. Für die in vivo-Expression von His-getaggten Proteinen wurden rekombinante E.coli-BL21-Stämme in LB mit 100 μg/ml Ampicillin bei 28 °C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,8–1,0 herangezogen, und nach einer Induktion mittels IPTG (1 mM) wurde die Inkubation 5 Stunden lang fortgesetzt.
A.2 DNA-Isolation
Die Bakterienbiomasse von Thermotoga maritima MSB8 oder Bacillus stearothermophilus NCIB8224 wurde geerntet, mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, gewaschen und gründlich in derselben Lösung resuspendiert, welche 2 mg/ml Lysozym enthielt. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37°C wurde ein Lysis-Puffer (0,1 M Tris pH 8,0, 1 % SDS) durch vorsichtiges Vermischen zugesetzt, und die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 60°C fortgesetzt. Die Lyse wurde durch Zugeben von Proteinase K (0,6 mg/ml) und Inkubieren der Reaktionsmischung während 30 Minuten bei 60°C vervollständigt. Nach vier aufeinanderfolgenden Extraktionen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1, v/v) wurde DNA mit 0,6 Volumen Isopropanol durch Zentrifugation bei 15000 U/min. während 30 Minuten bei 4°C gefällt, mit 70 % Ethanol gespült und dann in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA verdünnt.
Chromosomale und Plasmid-DNA aus E.coli-Stämmen wurde gemäß Ausubel et al. (1993) isoliert.
A.3 PCR-Amplifikation und Konstruktion von rekombinanten DNAs
Der B.stearothermophilus-PargC-Promotor des argCJBD-Operons (Sakanyan et al., 1990; Savchenko et al., 1998; 1) wurde als ein starker Promotor zum Antreiben der Proteinsynthese in einem zellfreien System verwendet.
Zwei Oligonukleotid-Primer wurden für die Amplifikation der PargCo-Promotor-Operator-Region und entsprechend den Stromaufwärts- und Stromabwärts-Extremitäten der Promotor- Operator-Region (5'-CATAGACTTAGGGAGGGGC und 5'-ATGATGATGATGATGATGCATATGTTCCCCCTCACCCGTATG) verwendet; wobei das Letztgenannte 6 Histidin-Codons enthält, um ein N-terminales Tag zu erzeugen.
Zwei andere Oligonukleotide, 5'-CCTCGAAAATTATTAAATATAC und 5'-ACATTTGATTTTATTTTTATAC, wurden ebenfalls verwendet, um stromaufwärts verkürzte Fragmente der Promotorsequenz, d. h. ein 59-bp- und ein 39-bp-Fragment der PargC-Promotor-Operator-DNA zu erzeugen (siehe auch die 1).
Eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein von Interesse codiert, wurde durch PCR amplifiziert und an den B.stearothermophilus-PargC-Promotor durch das Überlappungsverlängerungs-Verfahren (Ho et al., 1989) fusioniert. Grundsätzlich umfasst das Überlappungsverlängerungs-Verfahren die folgenden Schritte:
Beim ersten Schritt wurden zwei separate DNA-Fragmente, entsprechend den N-terminalen und C-terminalen Teilen eines gegebenen Proteins, aus chromosomalen DNA-Matrizen aus Bacillus stearothermophilus NCIB 8224, Escherichia coli K12 XA4, Thermotoga maritima MSB8 oder Thermotoga neapolitana DSM 5068 mit spezifischen Primern amplifiziert, welche in einer solchen Art ausgelegt waren, dass die amplifizierten Produkte überlappende Sequenzen mit der Sequenz stromabwärts der PargC-Promotorregion aufweisen.
Beim zweiten Schritt wurden die erhaltenen PCR-Produkte dann zu einem nachfolgenden Fusions-PCR-Produkt vereinigt, wobei nur zwei flankierende Primer durch Annealing der überlappenden Enden zum Bereitstellen der rekombinanten Volllängen-DNA-Matrize verwendet wurden.
Alle vermeintlichen Gene wurden an eine his-Tag-Sequenz im Leseraster zur N-terminalen Extremität des offenen Leserahmens fusioniert, um eine weitere Reinigung des Proteins durch Ni-Affinitäts-Chromatografie zu ermöglichen, wie hierin nachstehend unter A6 beschrieben wird.
Die für die Amplifikation von vermeintlichen ORFs aus dem T.maritima-Genom verwendeten Oligonukleotid-Primer sind in den nachstehenden Tabellen 2A und 2B beschrieben.
Für die Amplifikation von Operator-Sequenzen verwendete Oligonukleotid-Primer werden in der Tabelle 3 beschrieben. Tabelle 3. IRD-markierte Oligonukleotid-Primer, welche für die Amplifikation von Operator-DNA-Regionen verwendet wurden
Falls notwendig, wurden PCR-erzeugte Matrizen aus Agarosegel extrahiert, mit Phenol-Chloroform-Isoamyl (25 : 24 : 1, v/v) behandelt, mit Ethanol gefällt und resuspendiert. Ihre DNA-Konzentration wurde durch Spektrophotometrie bestimmt und durch Vergleichen der Bandenintensität mit einer "Smart Ladder"-Referenz-DNA (Eurogentec) nach SDS-PAGE oder Agarose-Elektrophorese bestätigt.
Ansonsten wurden die quantifizierten PCR-erzeugten DNA-Matrizen direkt zu einem zellfreien Extrakt gegeben, um Proteinsynthese anzutreiben.
Das XA4rpoA-Gen von E.coli, das für die α-Untereinheit von RNA-Polymerase codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer 5'-GACACCATGGAGGGTTCTGTGACAGAG (die NcoI-Stelle ist unterstrichen) und 5'-CCGCTCGAGCTCGTCAGCGATGCTTGC (die XhoI-Stelle ist unterstrichen) amplifiziert und in pET21d(+) kloniert.
Das E.coli-XA4-crp-Gen, welches für CRP codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer 5'-CATGCCATGGTGCTTGGCAAACC und 5'-CCGCTCGAGACGAGTGCCGTAAACGAC amplifiziert.
Die T.neapolitana groES-groEL-Gene, welche Chaperonine codieren, wurden mittels PCR unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotid-Primern 5'-GGAGGG-ATGGATGATGAARGTNA und 5'-GAYTTYATHGAYCARCAYCCNGA amplifiziert, worin R = A + G, Y = C + T, H = A + C + T, H = alle Basen. Das erhaltene 2,4 kb große DNA-Fragment wurde in pCR4-TOPO (Invitrogen) kloniert. Den groES- und groEL-Sequenzen von T.neapolitana wurde die EMBL-Zugangsnummer AF275319 zugewiesen.
Ein chimäres ArgR-EbE-Protein wurde durch Fusionieren von Sequenzen konstruiert, entsprechend DNA-Bindungs- und Oligomerisierungs-Domänen von E.coli-ArgR-Repressor, an einen Linker aus B.stearothermophilus-ArgR. Diese chimäre Sequenz zeigt eine bessere Affinität mit dem heterologen B.stearothermophilus-argCo-Operator als mit einem Wildtyp-E.coli-ArgR.
Die amplifizierten rpoA-, crp- und Wildtyp- oder Chimären-argR-Gene wurden in den Vektor pET21d(+) (Novagen) kloniert, welcher eine Expression im Leseraster an eine his-Tag-Sequenz an der 5'-Extremität von entsprechenden Proteinen gestattete. Amplifizierte groES- und groEL-Gene von T.neapolitana wurden separat in pETl9b-Vektor (Novagen) im Leseraster an einen His-tag an der N-Extremität von Chaperonin-Proteinen kloniert.
Nicht-markierte und biotinmarkierte Oligonukleotid-Primer wurden von Life Technologies erworben. Dig-markierte und IRD-markierte Oligonukleotid-Primer wurden von MWG-Biotech erworben.
A.4 Herstellung von zellfreien Extrakten
E.coli-Stämme wurden für die Herstellung von zellfreien Extrakten durch das Verfahren von Zubay (1973) mit Modifikationen, wie folgt, eingesetzt:
Die Zellen wurden bei 37 °C herangezogen, in der mittellogarithmischen Phase durch Zentrifugation geerntet und zweimal gründlich in eiskaltem Puffer gewaschen, der 10 mM Tris-Acetat pH 8,2, 14 mM Mg-Acetat, 60 mM KCl, 6 mM β-Mercaptoethanol enthielt. Dann wurden die Zellen in einem Puffer resuspendiert, welcher 10 mM Tris-Acetat pH 8,2, 14 mM Mg-Acetat, 60 mM KCl, 1 mM Dithiotreitol enthielt, und durch eine Frenchpresse (Caver, ICN) bei 9 Tonnen (≈ 20 000 psi) aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 30 000 g bei 4°C 30 Minuten lang zentrifugiert, das Pellet wurde verworfen, und der Überstand wurde erneut zentrifugiert. Das klare Lysat wurde in einem Verhältnis von 1 : 0,3 zu der Präinkubationsmischung zugesetzt, welche 300 mM Tris-Acetat bei pH 8,2, 9,2 mM Mg-Acetat, 26 mM ATP, 3,2 mM Dithiotreitol, 3,2 mM L-Aminosäuren, 3 U/ml Pyruvatkinase (Sigma) enthielt, und bei 37°C während 80 Minuten inkubiert. Die gemischte Extraktlösung wurde bei 6 000 g bei 4°C während 10 Minuten zentrifugiert, gegen einen Puffer, welcher 10 mM Tris-Acetat pH 8,2, 14 mM Mg-Acetat, 60 mM K-Acetat, 1 mM Dithiotreitol enthielt, bei 4°C während 45 Minuten mit 2 Pufferwechseln dialysiert, 2- bis 4-fach konzentriert mittels Dialyse gegen den gleichen Puffer mit 50 % PEG-20.000, gefolgt von zusätzlicher Dialyse ohne PEG während 1 Stunde. Der erhaltende zellfreie Extrakt wurde aliquotiert und bei –80°C aufbewahrt.
A.5 Gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktion
Das Expressionssystem basierte auf der Verwendung von transkriptionellen und translationalen Signalen des B.stearothermophilus-argC-Gens (siehe 1). Das argC-Gen wird von einem starken PargC-Promotor aus transkribiert, welcher mit einem 42 bp großen argCo-Operator überlappt (Savchenko et al., 1996), der von dem ArgR-Repressor von B.stearothermophilus erkannt wird (Dion et al., 1997). Allerdings besitzt der E.coli-ArgR-Repressor einen sehr schwachen Repressionseffekt in Hinsicht auf diesen Operator. Deshalb können heterologe Gene vom B.stearothermophilus-PargC-Promotor in E.coli-Zellen überexprimiert werden (Savchenko, et al., 1998).
T7-Promotor-basierende zellfreie Synthese wurde von pET-Vektoren ausgeführt, welche entsprechende Gene trugen. T7-RNA-Polymerase wurde von Promega bezogen.
Unter Verwendung des E.coli-S30-Extrakt-Systems wurde die transkriptions-translationsgekoppelte Reaktion, wie beschrieben von Zubay (1973), mit einigen Modifikationen durchgeführt. Die standardmäßige Vormischung enthielt 50 mM Tris-Acetat pH 8,2, 46,2 mM K-Acetat, 0,8 mM Dithiotreitol, 33,7 mM NH₄-Acetat, 12,5 mM Mg-Acetat, 125 μg/ml tRNA aus E.coli (Sigma), 6 mM-Mischung von CTP, GTP und TTP, 5,5 mM ATP, 26,2 mM Phosphoenolpyruvat, 8,7 mM CaCl₂, 1,9 % PEG-8000, 0,32 mM L-Aminosäuren, 5,4 μg/ml Folsäure, 5,4 μg/ml FAD, 10,8 μg/ml NADP, 5,4 μg/ml Pyridoxin und 5,4 μg/ml para-Aminobenzoesäure. In den Experimenten, worin Pyruvat als die Energie-regenerierende Verbindung verwendet wird (Kim und Swartz, 1999), wird Phosphoenolpyruvat in der Standardreaktionsmischung durch 32 mM Pyruvat ersetzt und 6,7 mM K-Phosphat, pH 7,5, 3,3 mM Thiamin-Pyrophosphat, 0,3 mM FAD und 6 U/ml Pyruvatoxidase (Sigma) werden zugegeben. Typischerweise wurden zu 25 μl Vormischung, welche alle Aminosäuren ausser Methionin enthielt, 10 μCi [α³⁵-S]-L-Methionin (spezifische Aktivität 1000 Ci/mMol, 37 TBq/mMol, Amersham-Pharmacia Biotech) und die E.coli-S30-Extrakte, 100–750 ng zirkuläre Plasmid-DNA oder lineare PCR-erzeugte DNA zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C während 90–120 Minuten inkubiert.
Falls notwendig, wurden die Proteinproben bei 80 °C während 10 Minuten behandelt und dann rasch zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Aceton gefällt und für Proteintrennung auf SDS-PAGE verwendet. Nach Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (Sigma) wurden Gele mit einer Verstärker-Lösung (Amersham-Pharmacia Biotech) behandelt, auf ein 3 MM-Papier durch Vakuumtrockung fixiert, und die radioaktiven Banden wurden durch Autoradiographie unter Verwendung von BioMax-MR-Film (Kodak) visualisiert. Die Molekulargewichte von vermeintlichen Proteinen wurden aus ORFs des T.maritima-Genoms (Nelson et al., 1999) abgeleitet und ferner durch das Wanderungsverhalten der entsprechenden Proteine auf der SDS-PAGE bestätigt. Die Quantifizierung von zellfrei synthetisierten Proteinen (als Monomer-Äquivalent) wurde entweder (i) durch Vergleichen nicht-radioaktiv markierter Proteinbanden mit bekannten Referenzproteinen nach Färbung mit EZBlue-Gel-Färbungsreagens (Sigma), oder (ii) durch Zählen der Radioaktivität von ³⁵S-markierten Proteinbanden mit Hilfe des PhosphorImager durchgeführt.
A.6 Reinigung von His-getaggten Proteinen
Rekombinante Bakterien wurden in einem Puffer (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) suspendiert, durch Schallbehandlung aufgebrochen, und His-getaggte Proteine wurden durch Affinitätschromatographie auf einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit 10 × Bett-Volumen des erwähnten Puffers gewaschen, und Proteine wurden mittels 6 × Bett-Volumen Elutionspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 50 oder 300 mM NaCl, 200 oder 400 mM Imidazol, 5 % (vol/vol) Glycerol)] eluiert, und dann wurde gegen Puffer dialysiert, welcher 20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, 5 % (vol/vol) Glycerol enthielt. Die Proteinkonzentration wurde mittels der Bradford-Methode (Bradford, 1976) gemessen.
Durch zellfreie Synthese synthetisierte Proteine wurden unter Verwendung von magnetischen Ni-NTA-Agarose-Kügelchen (Quiagen) gereinigt.
A.7 DNA-Markierung mit IR-Farbstoffen
Es wurden zwei Vorgehensweisen verwendet, um IR-Farbstoffe in DNAs einzubringen. Eine DNA-Sonde wurde durch PCR unter Verwendung eines Paares von Primern amplifiziert, bei welchem ein oder beide Primer mittels IRD-700 oder IRD-800 markiert waren (siehe Tabelle 3 oben). Alternativ dazu wurde eine DNA-Sonde einem statischen Einbau von IRD-700 oder IRD-800 unter Verwendung eines entsprechenden Kits (LI-COR, Inc.), das von ScienceTec erworben worden war, unterzogen.
A.8 Proteinmarkierung mit IR-Farbstoffen
Die gereinigte His-getaggte α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase und GroEL von T.neapolitana wurden mittels des FluoroLink-Mab-Cy5.5-Markierungskits unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech) markiert. Typischerweise wurden 5 μl eines Kopplungspuffers zu 100 μl 0,1 mg/ml Proteinlösung zugegeben und im Dunklen 30 Minuten lang inkubiert, wobei alle 10 Minuten geschüttelt wurde. Der konjugierte Farbstoff-Protein-Komplex wurde von freiem Farbstoff durch Hindurchlaufen durch eine PD 10-Säule getrennt und mit PBS-Puffer, pH 7,2, eluiert. Fraktionen, welche ein letztendliches molares Farbstoff(A₆₇₈)/Protein(A₂₈ ₀)-Verhältnis vonμngefähr 2 ergaben, wurden zum Detektieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet.
A.9 Protein-Array-Herstellung
Sowohl in vivo als auch in vitro synthetisierte Proteine wurden für die Herstellung von Protein-Arrays verwendet. Um eine ausreichende Menge an Proteinen für eine Kleinmaßstabs-Analyse von vermutlichen ORFs von T.maritima herzustellen, wurde eine zellfreie Synthese in einer Reaktionsmischung von 200 oder 400 μl während 2 Stunden durchgeführt.
Verschiedene Mengen an gereinigten Proteinen (Verdünnungen von 200 pMol bis 0,1 pMol) in einem A100-Puffer (100 mM KCl, 10 % Glycerol, 20 mM HEPES-Na, pH 7,9, 0,2 mM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,5 mM PMSF), welcher von Ge (2000) beschrieben wurde, wurden auf einer 12 × 8 cm großen Nitrozellulosemembran unter Verwendung einer 96-Vertiefungs-Dot-Blot-Vorrichtung (Bio-Rad) unter Vakuum abgeschieden und zweimal in A100-Puffer gespült. Radioaktive Signale auf Nitrozellulosemembranen wurden mittels Autoradiographie unter Verwendung von BioMax-MS-Film (Kodak) oder eines PhosphorImager 445 SI (Molecular Dynamics) nachgewiesen.
A.10 Detektion von intermolekularen Wechselwirkungen mit fluoreszierenden Sonden
Für Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden die Membranen in einem DNA-Bindungs-Puffer (DBB): 20 mM Tris HCl, pH 7,9, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 0,1 mM DTT, 0,005 % Surfactant P20 (Biacore), und 25 μg/ml einer Kompetitor-DNA (schallbehandelte Lachs-DNA) oder einer Mischung von 12,5 μg/ml Poly-dGdC und 12,5 μg/ml Poly-dAdT (Sigma) bei Raumtemperatur während 30 Minuten inkubiert. Dann wurde eine IRD-markierte DNA-Sonde (10 ng/ml) zu der Vorbindungs-Lösung zugegeben und 12 Stunden lang unter langsamem Rotieren bei unterschiedlichen Temperaturen (4°C, 18°C oder 60°C) inkubiert. Falls notwendig, wurden L-Arginin (10 mM) oder cAMP (5 mM) in die Reaktionsmischung eingeschlossen. Die Membranen wurden aufeinanderfolgend mit A100 und A500 gewaschen und dann für die Detektion von Fluoreszenz-Signalen verwendet.
Für Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden die Membranen in A100-Puffer mit 1 % fettfreier Milch bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, wie beschrieben (Ge, 2000). Dann wurde eine Cy5.5-markierte Proteinsonde (5 ng/ml) zu der Vorbindungs-Lösung zugesetzt und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Alternativ dazu wurden die Proteinproben gegen PBS-Puffer (4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4, mit 20 % Glycerol) dialysiert und danach auf der Nitrozellulosemembran unter Vakuum abgeschieden. Nach Inkubation in der PBS-Lösung mit 1 % BSA während 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit entsprechenden Sonden in der selben Lösung mit 0,1 % Tween 20 bei Raumtemperatur während 1 Stunde für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen inkubiert.
Die Protein-Makroarrays wurden nach aufeinanderfolgendem Waschen mit Puffer A, enthaltend 1 M (NH₄)₂SO₄, 1 M Harnstoff (Ge, 2000), und dann aufeinanderfolgend mit PBS, enthaltend 0,1 % Tween 20, und PBS bei Raumtemperatur wieder verwendet.
Um ein Protein-Mikroarray herzustellen, wurde das von MacBeath und Schreiber (MacBeath und Schreiber, 2000) beschriebene Verfahren mit Abwandlungen wie folgend angewandt: Die Proteinproben wurden gegen PBS-Puffer mit 20 % Glycerol dialysiert, und dann wurden 600 pl mit einem Hochpräzisions-Kontaktdruckungs-Roboter SDDC-20 (Virtek) auf Glasobjektträger zugeführt, welche mit Superaldehyd (Telechem International) bedeckt wurden, wodurch man Spots von 150 μm Durchmesser erhielt. Die aufgetropften Proben wurden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur während 3 Stunden inkubiert, um die nicht-umgesetzten Aldehyde auf dem Objektträger abzulöschen. Nach Spülen in der PBS- Lösung mit 1 % BSA wurden die Objektträger mit Cy5.5-markierter Sonde (Endkonzentration 1 μg/ml) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Protein-Mikro-Arrays wurden ebenfalls mit einem Arrayer GMS417 (Affymetrix) durch Auftropfen von Proben auf eine Oberfläche einer BA83-Nitrozellulosemembran (Schleich & Schuell) hergestellt.
Nahinfrarot-Fluoreszenzsignale auf Membranen wurden mittels des IR-Bilderzeugers Odyssey (LI-COR, Inc.) detektiert.
A.11 Chemolumineszenz-Detektion
Verdünnte Proben von Proteinen in A100-Puffer (von 100 pMol bis 0,2 pMol) wurden, wie oben beschrieben, auf Nitrozellulosemembran geblottet. Eine Inkubation wurde in Bezug auf eine biotinmarkierte DNA-Sonde (10 ng/ml) durchgeführt, und die Detektion von gebundenen DNA-Protein-Komplexen wurde mit Streptavidin durchgeführt (Nachweiskit Phototope-star, BioLabs). In diesem Verfahren wird ein mäßig stabiles Intermediat gebildet, welches unter Emission von Licht bei 461 nm spontan zerfällt. Die Emission wurde durch Exponieren der Membran an BioMax MS-Röntgenfilm (Kodak) detektiert.
A.12 Mobilitäts-Verschiebungs-Assay (MSA, mobility-shift assay)
Die DNA-Bindungsaktivität von Proteinen wurde auch durch Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Dig-markierten Operator-DNAs von B.stearothermophilus, E.coli, T.maritima oder T.neapolitana getestet. Eine DNA-Bindung wurde in DNA-Bindungs-Puffer in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses von unmarkierter schallbehandelter Heringssperma-DNA und 3 ng Dig-markierter Operator-DNA bei 37 °C oder 70 °C während 30 Minuten durchgeführt. Falls notwendig, wurde L-Arginin (10 mM) in die Reaktionsmischung eingeschlossen. Proben wurden auf ein 2%iges Agarose-Gel aufgetragen, welches hergestellt wurde in TAE-Puffer (40 mM Tris-Base, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 8,0), und wanderten mittels Elektrophorese bei Raumtemperatur bei 12 Vcm^–1 während 1 Stunde. Die DNA-Protein-Komplexe wurden auf Nylon-Membranen (Schleicher und Schuell) durch das Kapillarverfahren (Ausubel et al., 1993) übertragen. Eine immunologische Detektion wurde mit CSPD-vermittelter Lumineszenz (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die Quantifizierung von freier und retardierter DNA in Gelen erfolgte durch Scanning-Densitometrie von Chemoluminogrammen (Molecular Analyst, Bio-Rad).
A.13 Oberflächenplasmonresonanz (SPR)
Die SPR-Technik (für einen Übersichtsartikel siehe Malmqvist, 1993) wurde eingesetzt, um eine Echtzeit-Wechselwirkung von Wildtyp- und Chimären-ArgR-Proteinen mit Operator-DNAs zu untersuchen. End-biotinylierte DNA-Fragmente, entsprechend verschiedenen Operatoren, wurden mittels PCR unter Anwendung der oben erwähnten Primer für MSA hergestellt, außer dass Digoxigenin durch Biotin ersetzt wurde. Die markierten DNA-Fragmente wurden von einem Überschuss von Primern und dNTPs durch Passage durch eine Zentrifugenpatrone gereinigt, welche eine Siliciuindioxid-basierende Membran enthielt (Life Technologies Gibco BRL). Die Immobilisierung von biotinylierter DNA wurde auf Streptavidin-eingefangenen Biosensor-Chips SA (Biacore AB) durchgeführt. Biotinylierte Operator-DNA (5 mg/ml) in DNA-Bindungspuffer wurde über den Sensor-Chip bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/Minute bei 25°C injiziert, und ihre Immobilisierung wurde manuell durch Erreichen von beinahe 150 RU gesteuert, einer relativ geringen Menge an DNA, gekoppelt an den Biosensor, um Massentransporteffekte bei einem Minimum zu halten. Bindungs-Assays wurden im selben DNA-Bindungspuffer durch Injektion von 10–100 nM eines Proteins (Monomer-Äquivalent) bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl/Minute bei 25°C durchgeführt. Falls nötig, wurden L-Arginin (5 mM) oder cAMP (5 mM) in die Reaktionsmischung eingeschlossen. SPR-Messungen wurden in parallelen Kanälen unter Anwendung eines Biocore 3000 (Biacore AB) ausgeführt. Der Sensor-Chip wurde durch Waschen mit 1 % NaCl bei einer Strömung von ungefähr 10 μl/Minute regeneriert. Der Kanal mit keiner immobilisierten DNA wurde als ein Referenzsignal für jeden Zyklus verwendet. Die Daten für Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden aus Sensorgrammen unter Anwendung des 1:1-Bindungsmodells ausgewertet (BIAevaluation Software-Handbuch, 1999). Das SPR-Signal ist direkt proportional zu den Massenänderungen an der Sensor-Chip-Oberfläche und wird in Resonanzeinheiten ausgedrückt; 1000 RU entsprechen einer Oberflächenkonzentration von ungefähr 1 ng/mm^–2.
B.Experimentelle Ergebnisse
B.1 Beispiel 1: Herstellung eines Protein-Arrays, welche die Bindung von zellfrei synthetisierten Proteinen an Nitrozellulosemembran umfasst
Um einen Array mit chemisch nicht-modifizierten Proteinen herzustellen, wurde das Verfahren unter Verwendung von Nitrozellulosemembranen, wie beschrieben von Ge (Ge, 2000), angewandt. Da der Autor jedoch keine Daten über ein mögliches Abwaschen von Membranangehefteten Proteinen vorgelegt hat, ist die Effizienz der Bindung von Proteinen an Nitrozellulosemembran nach Inkubation in Bindungs- und Waschlösungen getestet worden.
Zwei thermostabile His-getaggte Proteine von unterschiedlicher Größe, nämlich ein 25 kDa großes GntRTm0439 und ein 37 kDa großes LacITm1856, entsprechend vermuteten Proteinen von T.maritima (Nelson, et al., 1999), wurden zellfrei synthetisiert, wobei PCR-erzeugte DNA-Matrizen und zellfreie E.coli BL21Z-Extrakte in 150 μl Reaktionsmischung während 2 Stunden verwendet wurden. Die Proben wurden bei 80°C 10 Minuten lang behandelt, und 10 Minuten lang bei 15000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden verworfen, und die Proteine wurden aus Überstandsfraktionen mittels Affinitäts-Chromatographie mit magnetischen Ni-NTA-Agarosekügelchen gereinigt. Das eingebaute radioaktive Methionin ließ es zu, die durch SDS-PAGE getrennten Banden von zellfrei synthetisierten Proteinen mit Hilfe des PhosphorImagers zu quantifizieren. Die Daten wurden durch Färbung von Gelen mit EZBlue bestätigt.
Dann wurden beide gereinigten Proteine, GntR Tm0439 und LacITm1856, seriell verdünnt und langsam auf eine Nitrozellulosemembran unter Vakuum während 5 Minuten geblottet. Membranstreifen, welche jeder Reihe entsprachen, wurden herausgeschnitten, in verschiedenen Lösungen inkubiert und dann einer Autoradiographie unterzogen. Es wurde praktisch keine Verminderung der Radioaktivität in entsprechenden Slots nach aufeinanderfolgenden gründlichen Waschungen mit A100-, A500- und A1000-Puffern (wie definiert in Ge et al., 2000) detektiert (2; vgl. Proben in horizontalen Reihen für jedes Protein). Mehr als 98 % der zwei getesteten Proteine, GntR Tm0439 von T.maritima und LacI TM1856 von T.maritima, blieben nach den Waschschritten auf den Membranen gebunden. Sobald ein Protein auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert und in einem Bindungspuffer gespült wird, bleibt es daher perfekt an den Träger gebunden.
Die Bindung von zellfrei synthetisierten Proteinen auf einer festen Phase (hier Nitrozellulosemembran), welche keine kovalente chemische Verknüpfung beinhaltet, scheint gleichmäßig zu sein. Darüber hinaus ist das Vakuumblotten von zellfrei synthetisierten Proteinen im Vergleich zu "Spotting"-Vorgehensweisen vorteilhaft, weil sowohl Zugeben als auch Binden von Proteinen auf einer relativ großen Oberfläche erfolgen können, sogar für verdünnte Proben leicht gesteuert werden können, und dadurch die Quantitäten von Proteinmustern in verschiedenen Vertiefungen präzise normiert werden können.
B.2 Beispiel 2: Versagen von üblichen Chemolumineszenz-Verfahren für die Detektion von ArgR-Protein-DNA-Wechselwirkungen
Ein 17 kDa großer ArgR-Repressor beherrscht die Arginin-Biosynthese in E.coli-Zellen (für Übersichtsartikel siehe Maas, 1994; Glansdorff, 1996). ArgR-Proteine von thermophilen Bakterien B.stearothermophilus (Dion et al., 1997, Ni et al., 1999; Karaivanova et al., 1999) und T.neapolitana (Dimova et al., 2000) wurden früher untersucht. Der ArgR-Repressor besteht aus zwei strukturellen Domänen, welche durch ein kurzes Linker-Peptid verbunden sind. Die N-terminale Domäne enthält ein geflügeltes Helix-turn-Helix-Modul, welches argspezifische Operatoren erkennt und bindet (Sunnerhagen et al., 1997; Ni et al., 1999). Die Cterminale Domäne ist an der Bildung von Trimeren beteiligt, welche zu hexameren Molekülen in Gegenwart von L-Arginin dimerisieren. Arginin wird als ein allosterischer Co-Repressor zur Verbesserung der DNA-Bindung von zugehörigen arg-Operatoren verwendet. Sequenz- und Strukturähnlichkeit zwischen ArgR-Proteinen aus verschiedenen Bakterien legen einen gemeinsamen DNA-Erkennungsmechanismus nahe. Nichtsdestoweniger existieren größere Unterschiede zwischen den verschiedenen ArgR-Repressoren. Insbesondere zeigt E.coli-ArgR eine geringe DNA-Bindungsaffinität für den argCo-Operator aus B.stearothermophilus (Savchenko et al., 1996), wohingegen sowohl die B.stearothermophilus- als auch T.neapolitana-Repressoren effizient E.coli-Operatoren binden (Wang, 1998; Karaivanova et al., 1999; Dimova, 2000).
Unter Berücksichtigung dieser wertvollen Information wurden Wechselwirkungen von ArgR-Proteinen, welche in vivo oder in vitro synthetisiert und danach an Nitrozellulosemembran gebunden worden waren, zuerst unter Verwendung eines Chemolumineszenz-Nachweisverfahrens getestet. Rekombinante His-getaggte ArgR-Proteine von B.stearothermophilus und T.neapolitana wurden in E.coli BL21 (DE3)-Zellen synthetisiert, durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt und auf eine Membran bei unterschiedlichen Konzentrationen geblottet. Daneben wurde das T.neapolitana-ArgR-Protein in vitro synthetisiert, mit magnetischen Ni-NTA-Agarose-Kügelchen gereinigt und auf der gleichen Membran geblottet. Kontrollproben von S30-Extrakten wurden ebenfalls auf der Membran geblottet. Biotin- oder Digoxigenin-markierte Operator-DNAs von B.stearothermophilus-argCo oder T.neapolitana-argRo wurden als Sonden verwendet, und eine DNA-Bindung wurde bei 4°C oder 60°C in DNA-Bindungspufferlösung über Nacht durchgeführt. Vorwaschen, Vorbinden und Binden wurden in Gegenwart von 10 mM L-Arginin durchgeführt.
Es ist festgestellt worden, dass eine Digoxygenin-markierte Sonde ein ziemlich schwaches Signal in Bezug auf die getesteten Proteine auf Nitrozellulose-Membran ergab, wohingegen Biotin-markierte Sonden ein starkes Signal ergaben. Allerdings war die Intensität des Signals für beide zellfreien Extrakt-Proben nahezu gleich, ungeachtet dessen, ob T.neapolitana-ArgR synthetisiert wurde oder nicht (3). Darüber hinaus war ein Signal immer noch stark, wenn die Bindung bei 60 °C ausgeführt worden war.
Obwohl es möglich war, ein stärkeres positives Signal zwischen Proben mit in vitro synthetisiertem und in vivo synthetisiertem ArgR-Repressor durch Verlängerung der Radioautographie-Exposition zu unterscheiden, war die Interpretation der Ergebnisse stets zweideutig. Es stellte sich heraus, dass Spurenmengen von (einem) E.coli-Biotinbindungsprotein(en), wie zum Beispiel natürlich biotinylierter Pyruvatcarboxylase, in Proben nach der Reinigung vorhanden waren, und diese Proteinspuren zeigten eine hohe Affinität gegenüber Streptavidin, die ein positives Signal nachahmte.
Deshalb weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass das Chemolumineszenz-Verfahren nicht empfindlich genug zum Testen von Protein-DNA-Wechselwirkungen unter Verwendung der Protein-Arrays ist, welche zellfrei synthetisierte Proteine umfassen.
B.3 Beispiel 3: Detektion von ArgR-Protein-arg-Operator-DNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von Nahinfrarot-Fluoreszenz-Farbstoffen
Bei der Suche nach anderen Farbstoffen, die ein höheres Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis und dadurch einen geringen Hintergrund auf Nitrozellulosemembran ermöglichen könnten, sind Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffe von längerer Wellenlänge getestet worden. Eine Sonde, welche aus der 59-bp großen argCo-Operator-DNA von B.stearothermophilus bestand (siehe 1) wurde mittels IRD-800 markiert. Diese Sonde ist in Bindungsexperimenten mit ArgR-Repressoren, welche auf Nitrozellulosemembran geblottet worden waren, verwendet worden. Seriell zweifach verdünnte (von 100 pMol zu 0,8 pMol) Wildtyp-ArgR-Proteine von T.neapolitana, B.stearothermophilus sowie ein chimäres ArgR-EbE wurden verwendet, um ein Protein-Array mit einem 48-Vertiefungs-Format herzustellen. Die Bindungsreaktion wurde bei 4 °C, 18 °C oder 60 °C in Gegenwart von 10 mM L-Arginin über Nacht ausgeführt.
Wie man in der 4a ersehen kann, wurde ein schwaches Signal von einem chimären ArgR-EbE mit jeder der IRD-Sonden nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde ein starkes Signal für gebundene T.neapolitana- oder B.stearothermophilus-ArgR-DNA-Komplexe detektiert. Das Signal wurde als eine Funktion der gebundenen Proteinkonzentration graduell verringert, und die Membran zeigte einen sehr geringen Hintergrund. Ein positives Signal wurde bis zu 0,8 pMol bzw. 3,12 pMol für T.neapolitana- bzw. B.stearothermophilus-ArgR beobachtet. Ein derartig niedrige Protein-Nachweishöhe zeigt, dass das Verfahren hochempfindlich ist.
Ähnliche Ergebnisse wurden erfasst, als die Bindung bei drei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurde, und als Operator-DNA mittels IRD-700 markiert wurde. Es stellte sich heraus, dass die gebildeten Komplexe zwischen synthetisierten Proteinen und IRD-markierten Sonden ziemlich stabil waren, und dass der äquilibrierte Zustand von ArgR-argCo-Wechselwirkungen durch die Temperatur nicht beeinflusst wurde.
Als Nächstes wurde eine 39 bp große argCo-Operator-DNA, der eine stromaufwärts gelegene Operator-Sequenz fehlte (siehe 1), als eine Sonde verwendet, um Wechselwirkungen mit den ArgR-Proteinen, welche auf der Membran geblottet waren, nachzuweisen. Wie in der 4b gezeigt wird, wurde eine Bindung für höhere Konzentrationen von thermostabilen ArgR-Proteinen, 6,25 pMol bzw. 25 pMol für T.neapolitana- bzw. B.stearothermophilus-Repressoren, detektiert.
Die Affinität von ArgR für arg-spezifische Operator-DNA hängt von der Anzahl von Arg-Boxen im Operator ab (Chen et al., 1997), und deshalb schien der Unterschied in den erfassten Signalen die DNA-Bindungsfähigkeit von thermostabilen Repressoren an die vollständigen und verkürzten argCo-Operator-Sequenzen widerzuspiegeln.
Mit den Protein-Arrays erhaltene Daten wurden durch SPR-Analyse bestätigt. Tatsächlich, wie gezeigt in 5, zeigten Wildtyp-ArgR-Proteine aus T.neapolitana und B.stearothermophilus eine hohe Bindungskapazität gegenüber dem B.stearothermophilusargCo-Operator. Im Gegensatz dazu zeigten die ArgR-EbE-Chimäre und speziell der Wildtyp-E.coli-ArgR-Repressor eine sehr geringe Bindung an diese Operator-DNA. Es ist bemerkenswert, dass alle Proteine eine hohe DNA-Bindungsaktivität in Bezug auf den E.colicarAB-Operator aufzeigten.
Deshalb demonstrieren die in den Beispielen 2 und 3 präsentierten Daten deutlich, dass die Protein-Arrays der Erfindung in Kombination mit IRD-Technologie eingesetzt werden können

(i) für das Screenen von äquilibrierten Protein-DNA-Wechselwirkungen; und
(ii) für die vorläufige Quantifizierung von DNA-Bindungs-Eigenschaften von Proteinen.

B.4 Beispiel 4: Detektion von Wechselwirkungen zwischen der α-Untereinheit von RNA-Polymerase und arg-Operator-DNA
Der Transkriptionsspiegel wird von der Stärke der Bindung der C-terminalen Domäne der α-Untereinheit von RNA-Polymerase an ein UP-Element in einigen E.coli-Promotoren gesteuert (Ross et al., 1993; Gourse et al., 2000). Die Daten mit einer verkürzten 39-bp-Sonde zeigten, dass eine 19 bp große AT-reiche Sequenz stromaufwärts einer -35-Stelle des PargC-Promotors Kontakte mit der α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase aufnehmen könnte. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde eine α-Untereinheit auf denselben Protein-Array geblottet und hinsichtlich Wechselwirkungen mit den IRD-markierten PargC-59-bp- und 39-bp-Promotor-DNAs getestet. Wiederum wurde, wie gezeigt in 4, ein Signal für bis zu 50 pMol gebundener α-Untereinheit in Bezug auf eine 59-bp-Operator-DNA-Sonde detektiert, wohingegen kein Bindungssignal mit einer 39-bp-Operator-DNA detektiert wurde. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass das Verfahren der Erfindung es ermöglicht, die Bindung von α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase an die Stromaufwärts-Sequenz des B.stearothermophilus-PargC-Promotors zu detektieren.
B.5 Beispiel 5: Detektion von cAMP-Rezeptor-Protein(CRP)-arg-Operator-DNA-Wechselwirkungen
CRP von E.coli ist an der transkriptionellen Aktivierung mancher Promotoren beteiligt (Bushy und Ebright, 1999). Seine Bindung an DNA erfordert eine allosterische Wechselwirkung mit cAMP (Valentin-Hansen et al., 1996). Die Sequenz stromaufwärts der -35-Stelle in B.stearothermophilus-PargCo-Promotor-Operator hat eine schwache Ähnlichkeit mit der CRP-Bindungs-Sequenz von E.coli-DNA gemeinsam. Deshalb wurde CRP von E.coli auf demselben Protein-Array geblottet und hinsichtlich Bindung mit PargCo-DNA-Sonden getestet. Wie man in der 4 ersehen kann, wurde ein positives Signal mit einer 59 bp großen, aber nicht mit einer 39 bp großen Operator-DNA in Gegenwart von 5 mM cAMP detektiert. Zusammengenommen mit den Beispielen 3 und 4 demonstrieren diese Ergebnisse daher, dass das Verfahren der Erfindung in der Lage ist, distinkte und spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen nachzuweisen.
Tatsächlich wurden diese Daten durch SPR-Analyse bestätigt. Wie in der 6 gezeigt wird, wies CRP eine Bindung an die B.stearothermophilus-PargCo-Promotor-Operator-Region in Gegenwart von cAMP auf, wohingegen keine Bindung in Abwesenheit des Liganden erfasst wurde.
Somit ist es durch Verwenden unterschiedlich langer IRD-markierter Sonden und unterschiedlicher DNA-Bindungsproteine gezeigt worden, dass die durch die Protein-Arrays der Erfindung nachgewiesenen Protein-DNA-Wechselwirkungen spezifisch sind. Das Verfahren der Erfindung gestattete es, Wechselwirkungen von relativ niedriger Affinität nachzuweisen. Dies unterstreicht das hohe Potenzial des Verfahrens zum Screenen von intermolekularen Wechselwirkungen in einem großen Maßstab.
B.6 Beispiel 6: Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf einem Protein-Array unter Verwendung einer mit Nahinfrarot-Farbstoffen markierten Sonde.
Die Transkriptionseffizienz von RNA-Polymerase-Holoenzym kann durch Wechselwirkung ihrer α-Untereinheit mit anderen Proteinen, wie CRP, moduliert werden (Gourse et al., 2000). Die oben stehend präsentierten Daten zeigten, dass B.stearothermophilus- oder T.neapolitana-ArgR-Proteine, sowie die α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase und CRP eine Affinität für dasselbe DNA-Ziel aufweisen, nämlich die PargCo-Promotor-Operator-Region von B.stearothermophilus. Es wurde deshalb vermutet, dass diese Proteine einander kontaktieren könnten. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde eine Cy5.5-markierte α-Untereinheit hinsichtlich ihrer Bindung an andere Proteine getestet, welche an Nitrozellulose in einem subtraktiven 48-Vertiefungs-Arrayformat gebunden worden waren.
Positive Signale wurden für T.neapolitana- und B.stearothermophilus-ArgR-Proteine, E.coli-CRP, aber nicht für E.coli-ArgR, α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase oder T.neapolitana-GroES und -GroEL nachgewiesen. Wie in der 7 gezeigt, waren Protein-Protein-Wechselwirkungen für die Abscheidung von 1,7 pMol (oder 0,04 μg) E.coli-CRP, 9,1 pMol (oder 0,16 μg) T.neapolitana- und B.stearothermophilus-ArgR-Proteinen nachweisbar. Die Abwesenheit eines Bindungssignals zwischen α-Untereinheiten selbst schien darauf hinzuweisen, dass dimere Moleküle des Proteins nicht miteinander Kontakt aufnehmen. Das negative Ergebnis in Bezug auf E.coli-ArgR legt nahe, dass dieser Repressor nicht signifikant an die homologe α-Untereinheit bindet.
Die Membran wurde mit einem harnstoffhaltigen Puffer A gewaschen (es wurde bemerkt, dass sogar ein gründliches Waschen in dieser Lösung die gebundenen Proteine nicht vollständig entfernt, wie aus der restlichen Fluoreszenz beurteilt wurde) und erneut in einer Bindungsreaktion mit einer 39 bp langen, mittels IRD-800 markierten PargC-DNA verwendet. Wie erwartet, wurde das spezifische IRD-800-Rotsignal (IRD-700 ergibt eine grüne Farbe) sowohl für T.neapolitana- als auch B.stearothermophilus-ArgR-Proteine (mit einer höheren Affinität für das Erstgenannte) erfasst, jedoch nicht für E.coli-ArgR (7b).
Die Spezifität von intermolekularen Wechselwirkungen war auch aus einem schwachen Signal bezüglich E.coli-CRP ersichtlich (vgl. 4 und 7), wohingegen dieses Protein stärkere Protein-Protein-Wechselwirkungen aufzeigte.
Ähnliche Daten für Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden erhalten, als die α-Untereinheit von RNA-Polymerase mittels IRD-800 markiert wurde.
Somit reflektiert die Bindung von geblottenen thermostabilen ArgRs oder E.coli-CRP an die IRD-markierte α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase in deutlicher Weise spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen. Darüber hinaus verhinderten diese Wechselwirkungen nicht die weitere Bindung an eine IRD-markierte 39-bp-DNA-Sonde. Es stellte sich heraus, dass die nachgewiesenen Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen von verschiedenen Regionen der geblotteten Proteine ermöglicht wurden.
Diese Daten zeigten, dass die Protein-Arrays der Erfindung mehrmalig mit unterschiedlichen Sonden verwendet werden können.
B.7 Beispiel 7: Screening von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Protein-Arrays, welches auf zellfrei synthetisierten Proteinen basiert
Die oben stehend präsentierten Daten zeigten, dass sowohl DNA-Protein- als auch Protein-Protein-Wechselwirkungen mit IRD-markierten Sonden von Interesse in Bezug auf ziemlich niedrige Mengen von Membran-geblotteten Proteinen, welche aus Bakterienzellen gereinigt worden waren, detektiert werden können. Folglich ist die Verwendung von IRD-markierten Sonden mit einem Protein-Array getestet worden, der mit zellfrei synthetisierten Proteinen hergestellt worden war.
Die Optimalbedingungen wurden zuerst für die unterschiedlichen Schritte der Herstellung des Arrays bestimmt. Diese Bedingungen wurden durch Sondieren von T.neapolitana-ArgR in Bezug auf IRD-markierte DNA- und Protein-Sonden bestimmt.
Ein ³⁵S-markierter T.neapolitana-ArgR ist in einem neuen PargC-vermittelten zellfreien System unter Verwendung der Extrakte des Stammes E.coli BL21 Star RecBCD (DE3) (pRIL) synthetisiert worden, und das His-getaggte Protein wurde durch Affinitäts-Chromatographie durch mehrere Verfahren gereinigt. Jeder Reinigungsschritt (Bindung an Ni⁺², Waschen und Elution mit Imidazol) wurde durch Zählen der Radioaktivität in Proteinbanden nach Auftrennen in SDS-PAGE kontrolliert. Zwei Reinigungsverfahren, basierend auf der Verwendung von Ni-beschichteten Platten (Pierce) und magnetischen Ni-NTA-Kügelchen (Quiagen) ergaben die besten Resultate. Da sich das zweite Verfahren als reproduzierbarer erwies und eine geringfügig höhere Ausbeute aufwies, wurde es in den weiteren Experimenten für die serielle Reinigung von in vitro synthetisierten His-getaggten Proteinen verwendet.
Das gereinigte ArgR (zellfreie Synthese wurde in einer 200-μl-Reaktionsmischung durchgeführt) wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Die Bindung wurde in Bezug auf IRD-800-markiertes argRo von T.neapolitana oder Cy5.5-markierte α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase jeweilig bei 60 °C bzw. 18 °C durchgeführt. In allen Fällen wurden Signale von bis zu 4-fach verdünnten Proteinproben erfasst, wohingegen kein Signal aus nicht-verdünnten Proben ohne synthetisiertes ArgR detektiert wurde. Daher kam man zur Folgerung, dass das thermostabile ArgR aus T.neapolitana in dem zellfreien System in einer ausreichenden Menge synthetisiert wird, und ein gefaltetes Protein spezifische DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen aufzeigt, wie sie bei einem aus Zellen gereinigten nativen rekombinanten Protein gefunden werden.
Unter Berücksichtigung dieser Daten wurde ein Protein-Makroarray mit zellfrei synthetisierten Proteinen zum Screening von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem kleinen Maßstab hergestellt. 14 ORFs von T.maritima, codierend vermeintliche Proteine, welche den Gnt-, Xyl- und Lac-Regulatorfamilien angehören (Nelson et al., 1999), wurden verwendet, um entsprechende Proteine in einem PargC-vermittelten zellfreien System zu synthetisieren. Die His-getaggten T.maritima-Proteine wurden durch Affinitäts-Chromatographie mit magnetischen Ni-NTA-Kügelchen gereinigt. Die Quantität der Proteine wurde in Bezug zueinander durch Zählen des Radioaktivitätsspiegels in jeweiligen Banden und Berücksichtigen der Anzahl von Methioninresten in den abgeleiteten Proteinsequenzen normiert. Es wurde nämlich die folgende Gleichung verwendet: N = R/m × V,worin

R: ein in einer Proteinbande mit dem PhosphorImager detektierter Radioaktivitäts spiegel ist,
m: eine Anzahl von Methioninresten in einem monomeren Protein ist,
V: ein Volumen einer Probe in μl ist,
N: eine willkürliche Quantität eines synthetisierten Proteins ist.

In praktischer Weise wurde die Probe mit dem geringsten Wert N als eine Referenz (das maximale Volumen) verwendet, und die anderen Proteinproben-Volumina wurden in Bezug auf die Referenz eingestellt (normiert) (Tabelle 4). Tabelle 4. Charakterisierung von vermuteten T.maritima-Proteinen.
Somit wurden äquimolare Mengen von Proteinen (Monomere) auf die Nitrozellulosemembran geblottet, um den Protein-Makroarray herzustellen.
Ein Protein-Makroarray, welcher, wie oben definiert, hergestellt wurde, wurde in drei Teile unterteilt und verwendet, um DNA-Protein-Wechselwirkungen in Hinsicht auf drei IRDmarkierte DNA-Sonden zu detektieren.
Ähnliche DNA-Bindungssequenzen sind kennzeichnend für die Ähnlichkeit zwischen regulatorischen Systemen (für Übersichtsartikel siehe Pabo & Sauer, 1992; Roy et al., 1998). Tatsächlich zeigten die oben stehend präsentierten Daten mit einem ArgR-regulatorischen System, dass Operator-Sequenzen in evolutionär weit entfernten Bakterien T.neapolitana und E.coli konserviert sein könnten. Deshalb wurden gut untersuchte Operator-Sequenzen aus dem E.coli-Genom als Sonden verwendet. Es wurden nämlich kurze DNA-Fragmente, welche die Operator-Sequenzen gntKo (Tong et al., 1996), xylFo (Song und Park, 1997) und laclo (Oehler et al., 1990) trugen, mittels IRD-800 markiert und in Bezug auf die 14 vermuteten regulatorischen Proteine von T.maritima (siehe Tabelle 4) bei Raumtemperatur sondiert.
Wie in der 8 gezeigt, wurden starke Signale aus bis zu 4-fach verdünnten Proben für die vermuteten Proteine GntTm0766 und GntTm0275 detektiert, wohingegen ein Signal für GntTm0439 ziemlich schwach war. Unter der Lac-Protein-Familie wurde ein starkes Signal für LacTm1200 detektiert, wohingegen das Signal für die anderen relativ schwach war. Schließlich wurden starke Signale für fünf von sechs XylTm-Proteinen detektiert, außer für XylTm0110.
Die Spezifität der detektierten Signale wurde durch ein Kreuz-Bindungs-Experiment bestätigt. Insbesondere konnten die GntR-Proteine nicht an die IRD-700-markierte xylFo-Operator-DNA binden. Außerdem wurden die Protein-Array-Daten mittels MSA bestätigt. Insbesondere zeigten zellfrei synthetisiertes GntTm0439, LacTm1856 und wahrscheinlich XylTm0808 eine Bindung an die Dig-markierten E.coli-Ziel-Operator-DNAs durch Bilden von Retardations-Banden in Agarosegel, wie es ebenfalls für zellfrei synthetisiertes T.neapolitana-ArgR beobachtet wurde (9).
Diese Ergebnisse zeigen, dass Protein-Arrays, welche mit zellfrei synthetisierten Proteinen gemäß der Erfindung hergestellt werden, für das rasche und parallele Screening und Charakterisieren von vermuteten DNA-bindenden Proteinen, speziell Transkriptions-Regulatoren, verwendet werden können.
B.8 Beispiel 8: Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Anwendung eines auf zellfrei synthetisierten Proteinen basierenden Arrays
Ein ähnlicher Protein-Makroarray, welcher zellfrei synthetisierte Proteine trug, wurde verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Cy5.5-markierten α-Untereinheit von E.coli-RNA-Polymerase als Sonde zu detektieren. Wie in der 10 gezeigt wird, wiesen alle GntTm-Proteine eine Bindung bezüglich der heterologen α-Untereinheit auf. Drei Lac-Familien-Proteine, Tm1856, Tm1218 und Tm0299, ergeben ebenfalls klare Signale aus nicht-verdünnten Proben. Es wurde ebenfalls ein Signal für drei Xyl-Familien-Proteine, Tm0393, Tm0808 und Tm0032, detektiert. Eine starke Antwort wurde von E.coli-CRP und T.neapolitana-ArgR detektiert, welche in vitro oder in vivo synthetisiert worden waren, jedoch nicht von E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit oder ArgR, welche allesamt als Kontrollen verwendet wurden. Diese Daten wurden mit IRD-800-markierter α-Untereinheit von RNA-Polymerase, welche als Sonde verwendet wurde, bestätigt.
Somit sind Protein-Arrays, welche mit zellfrei synthetisierten Proteinen hergestellt werden, zweckdienlich für die serielle Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie denjenigen, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind, unter Verwendung von IRDmarkierten Proteinsonden.
B.9 Beispiel 9: Detektion von Ligand-Protein-Wechselwirkungen mit nichtgereinigten Proteinen aus Zellhomogenaten, welche an Nitrozellulosemembran gebunden sind
Um die Empfindlichkeit des Verfahrens der Erfindung in Bezug auf nicht-gereinigte Proteine, welche an Nitrozellulosemembran gebunden sind, zu überprüfen, präsentiert das folgende Beispiel die Detektion von Ligand-Protein-Wechselwirkungen durch Anwenden von IRDmarkierten sekundären Antikörpern.
Der Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure (GABA) erkennt mehrere Rezeptoren, die auf der Zelloberfläche von Säugerzellen exprimiert werden (Bettler et al., 1998). Der GABA_B-Rezeptor ist aus zwei Untereinheiten, GABA_BR1 und GABA_BR2, aufgebaut. GABA_BR1 kann in zwei Splice-Varianten, GABA_BR1a und GABA_BR1b, existieren, welche sich durch ihren extrazellulären Teil unterscheiden. Es wurde postuliert, dass der GABA_B-Rezeptor an HNK-1-Kohlenhydrat von Adhäsionsmolekülen binden könnte.
Um diese Hypothese zu testen, wurde das Membran-Homogenat von Zellen verwendet, in welchen eine gleichzeitige Expression von Ratten-GABA_BR1a und -GABA_BR2a oder GABA_BR1b- und GABA_BR2a-Rezeptoren von klonierten cDNAs aus stattfand. Membran-Homogenate, welche aus Zellen erhalten wurden, in denen die Rezeptoren nicht exprimiert wurden (Novartis Pharma), wurden als eine Negativkontrolle verwendet. Laminin (Sigma), das Protein, welches an HNK-1-Kohlenhydrat bindet (Hall et al., 1995), wurde als eine Positivkontrolle verwendet. Außerdem wurde auch ein 8 Aminosäuren großes Peptid mit einer FLHTRLFV-Sequenz, welche das HNK-1-Kohlenhydrat-Epitop nachahmt (Strekalova et al., 2001) als eine Kontrolle verwendet.
Seriell 2-fach verdünnte Proben von Homogenaten wurden auf Nitrozellulosemembran unter Vakuum als Array angeordnet. Das Gesamtprotein belief sich in jedem Ausgangsmaterial auf 6,7 μg. Die Membranen wurden zweimal in A100-Puffer-Lösung gespült, mit Odyssey-Blocking-Puffer 30 Minuten lang bei 18 °C blockiert, und, nach Zugabe eines synthetischen HNK-1-Kohlenhydrats (Kornilov et al., 2000) bei einer Endkonzentration von 12,5 μg/ml oder von HNK-1-Nachahmungs-Peptid bei einer Endkonzentration von 85 μg/ml, wurde die Inkubation über Nacht fortgesetzt. Dann wurden die Membranen 5 Minuten lang in PBS-Puffer gespült, in Blocking-Puffer 1 Stunde lang reinkubiert, wobei die Inkubation 1 Stunde lang nach Zugabe von Ratten-Primär-Antikörpern gegen HNK-1-Kohlenhydrat (Verdünnung 1 : 2000) in einem Blocking-Puffer mit 0,1 % Tween 20 fortgesetzt wurde. Die Membranen wurden in PBS + 0,1 % Tween 20 während 5 Minuten ausgewaschen und mit IRD-800-markierten sekundären Anti-Ratte-Antikörpern (Verdünnung 1:2000 in Blocking-Puffer) während einer Stunde inkubiert. Die Membranen wurden aufeinanderfolgend mit PBS + 0,1 % Tween 20 während 5 Minuten und dann in PBS während weiterer 5 Minuten gewaschen.
In einem Kontrollexperiment wurden die Membranen mit immobilisierten Homogenaten von Zellen mit exprimiertem GABA_BR1a- und GABA_BR1b- und GABA_BR2a-Rezeptor-Untereinheiten direkt mit Ratten-GABA_B-Antikörpern (Verdünnung 1 : 2000) und dann mit IRD-800-markierten sekundären Antikörpern, wie oben stehend beschrieben, inkubiert.
Die 11 zeigt, dass ein starkes Signal bei bis zu 128-fach verdünnten Homogenat-Proben mit exprimierten GABA-Rezeptoren detektiert wurde, wohingegen ein nur schwaches Signal für das Kontroll-Homogenat aus nicht-verdünnten und 2-fach verdünnten Proben detektiert wurde. Somit stellt die IRD-Technologie eine ziemlich hohe Empfindlichkeit bereit, welche ausreichend ist, um geringe Mengen an Zielproteinen in Zellmembran-Homogenaten zu detektieren, und kann bei nicht-gereinigten Proteinproben angewandt werden.
B.10 Beispiel 10: Detektion von DNA-Protein-Wechselwirkungen in auf Nitrozellulosemembran geblotteten Zell-Rohextrakten
Es wurde ebenfalls ein anderes Experiment ausgeführt, um die Empfindlichkeit des IRD-Detektionsverfahrens für DNA-Protein-Wechselwirkungen in Zell-Rohextrakten auszuwerten. Die Auslegung dieses Experiments basierte auf der Beobachtung, dass eine verkürzte 39 bp lange PargCo-Operator-DNA von B.stearothermophilus eine spezifische Affinität in Hinsicht auf B.stearothermophilus- und T.neapolitana-ArgR-Proteine aufzeigte, wohingegen keine Bindung in Bezug auf homologe(s) E.coli-ArgR und -α-Untereinheit von RNA-Polymerase nachgewiesen werden konnte, oder eine schwache Bindung für CRP nachgewiesen wird (siehe Beispiel 3). Deshalb könnte eine solche kurze Operator-Sequenz als eine Sonde für das Screening eines Gesamt-Protein-Pools in E.coli-Extrakten verwendet werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen in Bezug auf B.stearothermophilus- oder T.neapolitana-ArgR-Repressoren, welche in E.coli-Zellen synthetisiert wurden, zu detektieren.
Die E.coli BL21 (DE3)-Zellen, welche ein pETd-ArgR-His-Plasmid mit dem entsprechenden E.coli-, B.stearothermophilus- oder T.neapolitana-argR-Gen trugen, wurden bis zu einer OD₆₀₀ von 0,8 kultiviert, dann wurde 1 mM IPTG zugesetzt und die Kultivierung wurde 5 Stunden lang fortgesetzt. Proben wurden vor und nach 1 und 5 h IPTG-Induktion entnommen, dreimal in A 100 gründlich gewaschen, schallbehandelt und zentrifugiert. Nach Verwerfen des Pellets wurde der Überstand 2-fach seriell in A 100 verdünnt und auf die Nitrozellulosemembran unter Vakuum geblottet. Die Membran wurde mit einer IRD-800-markierten 39 bp langen PargCo-DNA bei Raumtemperatur über Nacht sondiert. Wie es in der 12 gezeigt wird, wurde es festgestellt, dass beginnend von 1 h IPTG-Induktion Proben mit exprimiertem B.stearothermophilus- oder T.neapolitana-ArgR ein starkes Signal abgaben, jedoch nicht diejenigen mit E.coli-Repressor.
Die drei ArgR-Proteine wurden ebenfalls in einem zellfreien System synthetisiert. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Nitrozellulose-Membran geblottet und in Bezug auf eine IRD-800-markierte 39 bp lange PargCo-DNA-Sonde bei Raumtemperatur über Nacht sondiert. Signale wurden für Proben mit synthetisierten ArgR-Proteinen von B.stearothermophilus und T.neapolitana detektiert, wohingegen kein Signal für E.coli-ArgR-Repressor detektiert wurde.
Daher ist das Verfahren der Erfindung ebenfalls empfindlich für die Detektion von spezifischen DNA-Protein-Wechselwirkungen in Bezug auf nicht-gereinigte Proteine in Zellrohextrakten, speziell, wenn eine hohe Menge an Proteinzielen synthetisiert wird.
B.11 Beispiel 11: Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf einem Glasobjektträger unter Anwendung von Nahinfrarot-Fluoreszenzdetektion
Ähnliche Experimente wurden mit IRD-markierten Proteinen durchgeführt, welche chemisch an einen superaldehyd-bedeckten Glasobjektträger verknüpft waren.
Es ist festgestellt worden, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Proben von zellfrei synthetisierten Proteinen detektiert werden können, welche aufgetropft wurden auf Objektträger, trotz des relativ hohen Hintergrundes. Insbesondere wurden Signale von aufgetropften mehreren Proteinen erfasst, nämlich für T.neapolitana-ArgR, welches zellfrei synthetisiert worden war, und für B.stearothermophilus-ArgR, T.neapolitana-GroEs und E.coli-CRP, welche in vivo synthetisiert wurden, in Bezug auf das Cy5.5-markierte GroEL von T.neapolitana (13). Die höchste Empfindlichkeit wurde für CRP-Protein bis zu 2,3 pg Protein aus einer 256-fach verdünnten Probe detektiert. Signale wurden nicht für E.coli-ArgR und α-Untereinheit von RNA-Polymerase erfasst.
Somit zeigen diese vorläufigen Daten, dass superaldehyd-bedeckte Glasobjektträger (oder vorzugsweise Nitrozellulosemembran-Träger) ebenfalls als zweckdienliche Träger für die Herstellung von Protein-Mikroarrays aus zellfrei synthetisierten Proteinen und die folgende Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit IR-Farbstoffen gemäß der Erfindung verwendet werden können.
B.12 Beispiel 12: Detektion von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung von Zellrohextrakten, welche direkt als ein Mikro-Array abgelagert wurden
Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die Empfindlichkeit des Array-Verfahrens unter Verwendung von IR-Farbstoffen für die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung von Zellrohextrakten auszuwerten, welche direkt auf eine Nitrozellulosemembran durch einen Arrayer Affymetrix GMS417 aufgetropft wurden.
Zuerst wurde die Expression von arg-Genen von E.coli, B.stearothermophilus oder T.neapolitana oder rpoA- oder crp-Genen von E.coli unter Verwendung der Extrakte von nichtinduzierten oder IPTG-induzierten E.coli BL21 (DE3)-Zellen von einem T7-Phagen-Promotor aus durch SDS-PAGE analysiert (14; 15). Die drei überexprimierten E.coli-Proteine ArgR, RpoA und CRP begannen damit als klare Banden nach 30 Minuten Induktion sichtbar zu werden, wohingegen die thermophilen Proteine erst nach 120 Minuten Induktion erschienen.
Die Zell-Rohextrakte wurden 2-fach seriell verdünnt, in zweifacher Ausfertigung auf Nitrozellulosemembran aufgetropft und mit 59 bp oder 39 bp großen, mit IR-Dyes-800 markierten DNA-Fragmenten inkubiert. Dieselben Membranen enthielten aufgetropfte gereinigte Proteine (untere Reihen). Es wurde kein Signal in nicht-induzierten Bakterien detektiert, welche die klonierten argR- oder rpoA-Gene beinhalteten, als gegen eine 59-bp- DNA sondiert wurde. Das Fluoreszenzsignal wurde nicht aus IPTG-induzierten Zellextrakten detektiert, welche das überexprimierte E.coli-argR-Gen trugen. Jedoch wurde ein starkes Signal nach 30 Minuten Induktion von B.stearothermophilus- oder T.neapolitana-ArgR-Repressoren detektiert (14e und f), obwohl noch keine Proteinbanden in Extrakten mittels SDS-PAGE sichtbar waren. Die Fluoreszenz-Emission wurde ebenfalls für die Spots von überexprimierter E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit verfolgt, jedoch nur nach 60 Minuten Induktion (15c), welche von dem Erscheinen einer übermäßig reichlichen Bande des Proteins auf einem Polyacrylamidgel begleitet wurde. Überraschenderweise wurde ein Signal aus Extrakten von nicht-induzierten und 2-fach verdünnten Extrakten mit CRP (15d) detektiert, was die Gegenwart eines Pools von (einem) noch nicht identifizierten vermuteten Protein(en) in E.coli-Zellen anzeigt, das(die) eine gute Affinität für die PargCo-Promotor-Operator-Region in Gegenwart von cAMP besitzt. Allerdings erschien sogar in diesem Fall ein deutliches Signal in stärker verdünnten Proben nach 120 Minuten Induktion.
Als aufgetropfte Extrakte in Hinsicht auf eine kürzere 39-bp-DNA-Sonde getestet wurden, war die Fluoreszenzantwort für B.stearothermophilus- und speziell für T.neapolitana-ArgR-Repressoren noch stark (14h und i). Das Signal war um 2 Spots zu den niedriger verdünnten Proben des B.stearothermophilus-Repressors verschoben, wodurch die schlechtere Erkennung von einer einzelnen Arg-Box als von einer doppelten Box bestätigt wurde. Zwar schwächere aber eindeutige Signale wurden für dieselben Verdünnungen des aufgetropften T.neapolitana-ArgR-Proteins, im Vergleich zur Bindung einer 59-bp-DNA-Sonde, detektiert, wodurch dessen Fähigkeit zum Erkennen eines argCo-Operators, welcher eine einzelne und doppelte Arg-Box trug, mit fast gleichartiger Affinität bewiesen wurde.
Das Auftreten von Fluoreszenzsignalen aus aufgetropften Rohzellextrakten hing stark von der Menge an Zielproteinen und ihrer DNA-Bindungs-Affinität ab, wie beobachtet auf Arrays mit gereinigten Proteinen (untere Reihen in 14 und 15).
Diese Daten zeigen, dass die Verwendung von IR-Farbstoffen eine sehr empfindliche Detektion zulässt und das Vermeiden eines Reinungsschrittes gestattet, welcher im Allgemeinen für Protein-Array-Analysen als notwendig erachtet wird.
B.13 Beispiel 13: Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dem Array-Verfahren
Die Empfindlichkeit des Protein-Array-Verfahrens unter Verwendung von IR-Farbstoffen wird ebenfalls durch das nächste Beispiel für die Analyse von Protein-Protein- Wechselwirkungen in Rohzell-Extrakten bestätigt, welche auf einer Nitrozellulosemembran aufgetropft wurden.
Die E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit wurde mit Cy5.5 markiert und an die drei ArgR-Repressoren, CRP oder α-Untereinheit selbst sondiert, welche alle als Rohzellextrakte aufgetropft wurden. Dieselben Membranen enthielten ebenfalls gereinigte Proteine (untere Reihen).
Signale wurden aus allen Proben von nicht verdünnten und 2- und 4-fach verdünnten Rohextrakten, bis zu 60 pg Gesamtprotein-Spots, erfasst, was nahe legt, dass die E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit ziemlich stabile Kontakte mit vielen Proteinen aufzeigt, was eine Hintergrundfluoreszenz verursacht und die Detektion von spezifischen Wechselwirkungen vereitelt. Nichtsdestoweniger wurde ein schrittweises Anwachsen einer Signalintensität in Extrakten mit CRP als Funktion der Menge des übersynthetisierten Proteins nach IPTG-Induktion beobachtet (vgl. horizontale Reihen in 15f). Bei gereinigten E.coli-CRP-Spots entsprach das nachgewiesene Signal 600 aMol des aufgetropften Proteins (15f). Die Wechselwirkung zwischen E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit und CRP ist bereits aufgezeigt worden (Busby und Enright, 1994).
Klare Signale wurden aus gereinigtem B.stearothermophilus- und T.neapolitana-Repressor-Spots (bis zu 3,3 fMol bzw. 825 aMol) erfasst, wohingegen keine Bindung in Bezug auf E.coli-ArgR detektiert wurde (14j, k und i). Somit besitzt die E.coli-RNA-Polymerase-α-Untereinheit eine Fähigkeit, mit heterologen thermophilen Repressoren, aber nicht mit einem homologen ArgR zu interagieren, zumindest unter den angewandten Bedingungen.
Um die Array-Daten zu bestätigen, wurde die Fluoreszenz-Anisotropie von Protein-Wechselwirkungen durch Zugeben von CRP oder einem der drei ArgR-Repressoren zu der Bindungslösung mit der Cy3-markierten RNA-Polymerase- α-Untereinheit aus E.coli gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Form der Anisotropie ähnlich zu CRP-RNA-Polymerase-α-Untereinheit-Wechselwirkungen war, ungeachtet der Zugabe von cAMP in einen Puffer, und eine berechnete scheinbare Dissoziationskonstante Kd belief sich auf 300 nM, was 280 nM nahekommt, wie von Heyduck und Mitarbeitern bei ähnlichen Bedingungen bestimmt worden war (Heyduck et al., 1993). Sowohl B.stearothermophilus- als auch T.neapolitana-Repressoren, aber nicht E.coli-ArgR, zeigten des Weiteren eine typische gesättigte Anisotropie-Form, und die Kd-Werte wiesen auf eine ziemlich gute Affinität zwischen thermophilen ArgR's und einer mesophilen RNA-Polymerase-α-Untereinheit hin (Tabelle 5). Arginin beeinflusste diese Bindung nicht. Tabelle 5. Auswertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Fluoreszenz-Anisotrophie.

* Assays wurden in PBS mit 0,3 M NaCl in Abwesenheit oder in Gegenwart von 10 mM Arginin oder 0,5 mM cAMP durchgeführt.

Somit gestatten es die vorgesehenen Verfahren, mäßig starke Protein-Protein-Wechselwirkungen (von der Größenordnung von 10^–7 M) sowohl mit aufgetropften gereinigten Proben als auch Zell-Rohextrakten zu detektieren, was ihre extreme Empfindlichkeit unterstreicht, die für neue Anwendungen von Array-Technologien bedeutsam sein könnte.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Neuerungen ermöglichten es, mühselige Schritte der Genklonierung und Proteinexpression in lebenden Zellen auszuschließen, um Protein-Arrays für die Detektion von diversen intermolekularen Wechselwirkungen herzustellen, sowie ³²Pmarkierte radioaktive Sonden zu eliminieren. Ein weiterer Vorteil der Anwendung von zellfrei synthetisierten Proteinen für die Herstellung von Protein-Arrays ist die Möglichkeit, eine akkurate Normierung von Proben durchzuführen, welche auf einer festen Phase immobilisiert werden sollen. In dieser Untersuchung wurde eine äußerst hohe Empfindlichkeit der Detektion von DNA-Protein-, Protein-Protein- und Ligand-Protein-Wechselwirkungen durch Anwendung von IR-Farbstoffen erreicht. Das neu entworfene zellfreie Protein-Herstellungssystem, zusammen mit den eingesetzten IR-Farbstoffen, kann als ein universelles, empfindliches, weniger zeitaufwendiges und kostengünstiges Protein-Array-Verfahren zur Identifizierung von intermolekularen Wechselwirkungen eingesetzt werden.
LITERATUR-BEZUGSTELLEN

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. & Struhl, K. (1993). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N. Y.
Bettler, B., Kaupmann, K. & Bowery, N. (1998). GABA_B receptors: drugs meet clones. Cur. Opinion Neurobiol. 8, 345–350.
Bradford, M.M. (1976). A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.
Busby, S. & Ebright, R. E. (1999). Transcription activation by catabolite activator protein (CAP). J. Mol. Biol. 293, 199–213.
Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. & Walter, G. (1998). A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic. Acids Res. 26, 5007–5008.
Chen, S.-H., Merican, A. F. & Sherratt, D. J. (1997). DNA binding of Escherichia coli arginine repressor mutants altered in oligomeric state. Mol. Microbiol. 24, 1143–1156.
Dimova, D. (2000). La protéine régulatrice ArgR de bactéries hyperthermophiles du genre Thermotoga: clonage, thermostabilité et interaction avec I'ADN. Ph. Thesis, Nantes.
Dimova, D., Weigel, P., Takahashi, M., Marc, F., Van Duyne, G. & Sakanyan, V. (2000). Thermostability, oligomerization and DNA binding properties of the regulatory protein ArgR from the hyperthermophilic bacterium Thermotaga neapolitana. Mol. Gen. Genet. 263, 119–130.
Dion, M., Charlier, D., Wang, H., Gigot, D., Savchenko, A., Hallet, J.-N., Glansdorff, N. & Sakanyan, V. (1997). The highly thermostable arginine repressor of Bacillus stearothermophilus: gene cloning and repressoroperator interactions. Mol, Microbiol. 25, 385–398.
Ebright, R. E. & Busby, S. (1995). The Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit: structure and function. Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 197–203.
Esser, M. M., Urlacher, T. M., Draney, D. & Olive, D. M. (2000). Navel applications for infrared fluorescence imaging. On-line posters, www.licor.com
Ge, H. (2000). UPA, a universal protein assay system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions. Nucleic Acids Res. 28, e3
Glansdorff, N. (1996). Biosynthesis of arginine and polyamines. In: Neidhardt, F. C. (Ed. in chief) Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. American Society for Microbiology Press, Washington, DC, p. 408–433.
Gourse, R. L., Ross, W. & Gaal, T. (2000). Ups and downs in bacterial transcription initiation: the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition. Mol. Microbiol. 37, 687–695.
Hall, H., Vorherr, T. & Schachner, M. (1995). Characterization of a 21 amino acid peptide sequence of the laminin G2 domain that is involved in HNK-1 carbohydrate bindning and cell adhesion. Glycobiology 5, 435–441.
Holt, L. J., Büssow, K., Walter, G. & Tomlinson, M. (2000). By-passing selection: direct screening for antibody-antigen interactions using protein arrays. Nuclic Acids Res. 28, e72.
Joung, J. K., Ramm, E. I. & Pabo, C. O. (2000). A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7382–7387.
Karaivanova, I., Weigel, P., Takahashi, M., Fort, C., Versavaud, A., Van Duyne, G., Charlier, D., Hallet, J.-N., Glansdorff, N. & Sakanyan, V. (1999). Mutational analysis of the thermostable arginine repressor from Bacillus stearothermophilus: dissecting residues involved in DNA binding properties. J. Mol. Biol. 291, 843–855.
Kigawa, T., Yabuki, T., Yoshida, Y., Tsutsui, M., Ito, Y., Shibata, T. & Yokoyama, S. (1999). Cell-free production and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins. FEBS Letters 442, 15–19.
Kim, D.-M. & Swartz, J. R. (1999). Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotech. & Bioengin. 66, 180–188.
King, R. W., Lustig, K. p., Stukenberg, P. T., McGarry, T. J. & Kirschner, M. W. (1997). Expression, cloning in the test tube. Science 277, 973–974.
Kornilov, A. V., Sherman, A. A., Kononov, L. O., Shashkov, A. S. & Nifant'ev, N. E. (2000). Synthesis of 3-O-suffogfucuronyl lacto-N-neotetraose 2-aminoethyl glycoside and biotinylated neoglycoconjugates. Carbohydr Res. 329, 717–730.
Lesley, S. S., Brow, M. A. & Burgess, R. R. (1991). Use of in vitro protein synthesis from polymerase chain reaction-generated templates to study interaction of Escherichia coli transcription factors with core RNA polymerase and for epitope mapping of monoclonal antibodies. J. Biol. Chem. 266, 2632–2638.
Lustig, K. D., Stukenberg, P. T., McGarry, T. J., King, R. W., Cryns, V. L., Mead, P. E., Zon, L. I., Yuan, J. & Kirschner, M. W. (1997). Small pool expression screening: identification of genes involved in cell cycle control, apoptosis, and early development. Methods Enzymol. 283, 83–99.
Maas, W. (1994). The arginine repressor of Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58, 631–640.
MacBeath, G. & Schreiber, S. L. (2000). Printing proteins as microarrays for high-throughout function determination. Science 289, 1760–1763.
Mahlknecht, U., Ottmann, O. G. & Hoelzer, D. (2001). Far-Western based protein-protein interaction screening of high-density protein filter arrays. J. Biotechnol. 88, 89–94.
Malmqvist, M. (1993). Biospecific interaction analysis using biosensor technology. Nature 361, 186–187.
Miller, J. H. (1992). A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
Nelson, K. E. et al. (1999). Evidence for lateral gene transfer between Archaea and Bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature 399, 323–329.
Ni, J.-P., Sakanyan, V., Charlier, D., Glansdorff, N. & Van Duyne, G. D. (1999). Structure of the arginine repressor from Bacillus stearothermophilus. Nature Struct. Biol. 6, 427–432.
Oehler, S., Eisman, E., Krämer, H. & Müller-Hill, B. (1990). The three operators of the lac operon cooperate in repression. EMBO J. 9, 973–979.
Pabo, C. O. & Sauer, R. T. (1992). Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61, 1053–1095.
Pelham, H. R. & Jackson, R. J. (1976). An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. 677, 247–256.
Roberts, B. E. & Paterson, B. M. (1973). Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330–2334.
Ross, W., Gosink, K. K., Salomon, J., Igarashi, K., Zou, C., Ishihama, A., Severinov, K. & Gourse, R. L. (1993). A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the α subunit of RNA polymerase. Science 262, 1407–1413.
Roy, S., Garges, S. & Adhya, S. (1998). Activation and repression of transcription by differential contact: two sides of a coin. J. Biol. Chem. 273, 14059–14062.
Sakanyan, V. A., Hovsepyan, A. S., Mett, I. L., Kochikyan, A. V. & Petrosyan, P. K. (1990). Molecular cloning and structural-functional analysis of arginine biosynthesis genes of the thermophilic bacterium Bacillus stearothermophilus. Genetika (USSR) 26, 1915–1925.
Savchenko, A., Charlier, D., Dion, M., Weigel, P., Hallet, J.-N., Holtham, C., Baumberg, S., Glansdorff, N. & Sakanyan, V. (1996). The arginine operon of Bacillus stearothermophilus: characterization of the control region and its interaction with the heterologous B. subtilis arginine repressor. Mol. Gen. Genet. 252, 69–78.
Savchenko A., Weigel P., Dimova O., Lecocq M. & Sakanyan V. (1998). The Bacillus stearothermophilus argCJBD operon harbours a strong promoter as evaluated in Escherichia coli cells. Gene 212, 167–177.
Schutz, A. R., Altschuler, Y., Mostov, K. E. & Olive, D. M. (2000). Highly sensitive detection of proteins on membranes with near-infrared fluorescence. On-line posters, www.licor.com
Song, S. & Park, C. (1997). Organization and regulation of the D-xylose operons in Escherichia coli K-12: XylR acts as a transcriptional activator. J. Bacteriol. 179, 7025–7032.
Strekalova, T., Wotjak, C. T. & Schachner, M. (2001). Intrahippocampal Administration of an Antibody against the HNK-1 Carbohydrate Impairs Memory Consolidation in an Inhibitory Learning Task in Mice. Mol Cell Neurosci. 17, 1102–1113.
Sunnerhagen, M., Nilges, M., Otting, G. & Carey, J. (1997). Solution structure of the DNA binding domain and model for the complex multifunctional hexameric arginine repressor with DNA. Nature Struct. Biol. 4, 819–826.
Tong, S., Porco, A., Isturiz T., & Conway T. (1996). Cloning and molecular genetic characterization of the Escherichia coli gntR, gntK, and gntU genes of GntI, the main system for gluconate metabolism. J. Bacteriol. 178, 3260–3269.
Valentin-Hansen, P., Sogaard-Andersen, L. & Pedersen, H. (1996). A flexible partnership: the CytR anti-activator and the cAMP-CRP activator protein, comrades in transcriptional control. Mol. Microbiol. 20, 461–466.
van Essen, A. J., Kneppers, A. L., van der Hout, A. H., Scheffer, H., Ginjaar, I. B., ten Kate, L. P., van Ommen, G. J., Buys, C. H. & Bakker, E. (1997). The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular distrophy: an updated protocol. J. Meth. Genet. 34, 805–812.
Vidal, M. & Legrain, P. (1999). Yeast forward and reverse "n"-hybrid systems. Nucleic Acids Res. 27, 919–929.
Wang, H., Glansdorff, N. & Charlier, D. (1998). The arginine repressor of Escherichia coli K-12 makes direct contacts to minor and major groove determinants of the operators. J. Mol. Biol. 277, 805–824.
Zubay, G. (1973). In vitro synthesis of protein in microbial systems. Ann. Rev. Genet. 7, 267–287.

Claims

Verfahren zum Nachweis von intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Sonde(n) und Proteinzielen, wobei die Proteinziele vorzugsweise mindestens ein in vivo nichtherstellbares Protein oder Polypeptid, das bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet, einschließen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte kombiniert: a) Vorsehen von Proteinzielen durch serielles in vitro-Synthetisieren dieser unter Verwendung eines zellfreien Proteinsyntheseverfahrens mit einem Überschuss der α-Untereinheit von RNA-Polymerase im Vergleich zu anderen Untereinheiten derselben; b) Binden der Proteinziele an einen Träger an definierten Positionen, um einen Protein-Array herzustellen, c) Vorsehen von Sonde(n), die mit einem Nah-Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, d) Kontaktieren des Protein-Arrays mit den markierten Sonde(n) in einem Medium, das zum Ermöglichen einer spezifischen Bindung geeignet ist, e) Nachweisen, auf dem Protein-Array, der Proteinziel(e), an welche(n) die markierten Sonde(n) spezifisch bindet bzw. binden, wobei eine Infrarot-Bilderzeugungsvorrichtung angewandt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zellfreie Proteinsyntheseverfahren die Verwendung eines zellfreien Extraktes, vorzugsweise eines bakteriellen zellfreien Extraktes, bevorzugt eines zellfreien E.coli-Extraktes, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein zellfreies Proteinsynthesesystem die Verwendung einer durch PCR erzeugten DNA-Matrize umfasst, wobei die PCR-erzeugte DNA-Matrize einen das Protein oder Polypeptid codierenden offenen Leserahmen und eine zusätzliche DNA-Sequenz, welche mindestens 3 bp lang, vorzugsweise länger als 100 bp und weiter bevorzugt länger als 200 bp ist, die unmittelbar stromabwärts des Stop-Codons des für das Protein oder Polypeptid codierenden offenen Leserahmens lokalisiert ist, aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Matrize einen starken Promotor mit mindestens einem UP-Element, der stromaufwärts des ORF lokalisiert ist, umfasst.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 4, wobei die RNA-Polymerase eine gereinigte thermostabile Polymerase, vorzugsweise aus T.thermophilus, ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Sondenmolekül eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder ein Protein ist, das mit einem Nah-Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die synthetisierten Proteine oder Polypeptide vor dem Binden an den Träger nicht gereinigt werden.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner die Schritte zur Normierung der Menge an synthetisiertem Protein vor dem Binden an einen Träger umfasst, wobei die Normierungsschritte aus folgendem bestehen: a) Markieren jedes synthetisierten Proteins, vorzugsweise durch Zuführen einer radioaktiven Aminosäure in das zellfreie System, b) Quantifizieren jedes markierten Proteins, c) Vorsehen einer äquivalenten Menge jedes synthetisierten Proteins vor dem Binden an einen Träger zur Normierung.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei mindestens zwei verschiedene Sonden verwendet werden, wobei die Sonden mit IR-Farbstoffen von verschiedener Wellenlänge markiert sind.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nah-Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffe eine Wellenlänge über 680 nm aufweisen.
Verfahren zur Herstellung eines Protein-Arrays, umfassend Proteinziele, vorzugsweise einschließlich eines Proteins oder Polypeptids, das in vivo nicht-herstellbar ist, welches bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) paralleles Synthetisieren von Proteinzielen unter Anwendung eines zellfreien Proteinsyntheseverfahrens mit einem Überschuss der α-Untereinheit von RNA-Polymerase entsprechend anderen Untereinheiten derselben; b) Gewinnen der synthetisierten Proteine oder Polypeptide; und c) Herstellen eines Protein-Arrays durch Binden von synthetisierten Proteinen oder Polypeptiden an einen Träger an definierten Positionen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das zellfreie Proteinsyntheseverfahren die Verwendung eines bakteriellen zellfreien Extraktes, bevorzugt eines zellfreien E.coli-Extraktes, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das zellfreie Proteinsyntheseverfahren die Verwendung einer PCR-erzeugten DNA-Matrize umfasst, wobei die PCR-erzeugte DNA-Matrize einen das Protein oder Polypeptid codierenden offenen Leserahmen und eine zusätzliche DNA-Sequenz, welche mindestens 3 bp lang, vorzugsweise länger als 100 bp und weiter bevorzugt länger als 200 bp ist, die unmittelbar stromabwärts des Stop-Codons des das Protein oder Polypeptid codierenden offenen Leserahmens lokalisiert ist, umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die DNA-Matrize einen starken Promotor mit mindestens einem UP-Element umfasst, der stromaufwärts des ORF lokalisiert ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 bis 14, wobei eine gereinigte thermostabile RNA-Polymerase, vorzugsweise aus T.thermophilus, in den bakteriellen zellfreien Extrakt zugesetzt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die synthetisierten Proteine oder Polypeptide vor dem Binden an den Träger nicht gereinigt werden.
Verwendung von Zielproteinen für die Herstellung von Protein-Arrays, wobei die Zielproteine auf dem Array als ein Rohextrakt abgeschieden werden, ohne Reinigung nach ihrer Synthese, der erhalten wird durch ein zellfreies Proteinsynthesesystem mit einem Überschuss der α-Untereinheit von RNA-Polymerase im Vergleich zu anderen Untereinheiten derselben.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das zellfreie Proteinsynthesesystem einen bakteriellen zellfreien Extrakt, vorzugsweise zellfreien E.coli-Extrakt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die in dem Rohextrakt enthaltenen Proteine oder Polypeptide synthetisiert werden von einer PCR-erzeugten DNA-Matrize, wobei die PCR-erzeugte DNA-Matrize den das Protein oder Polypeptid codierenden offenen Leserahmen und eine zusätzliche Sequenz, welche mindestens 3 bp lang, vorzugsweise länger als 100 bp und weiter bevorzugt länger als 200 bp ist, die unmittelbar stromabwärts des Stop-Codons des das Protein oder Polypeptid codierenden Gens lokalisiert ist, umfasst.
Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die DNA-Matrize DNA-Matrize einen starken Promotor mit mindestens einem UP-Element umfasst, der stromaufwärts des ORF lokalisiert ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 17 bis 20, wobei eine gereinigte thermostabile RNA-Polymerase, vorzugsweise aus T.thermophilus, in den bakteriellen zellfreien Extrakt zugesetzt wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 17 bis 21, wobei mindestens eines von dem Protein oder Polypeptid bei Expression in vivo in Wirtszellen toxisch für die Wirtszellen ist oder nicht gereinigt werden kann oder sich nicht korrekt faltet.