ES2549440T3 - Bibliotecas de fragmentos de Fab y métodos para su uso - Google Patents

Abstract

Método de producción de una biblioteca de Fab, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de vectores en la que cada vector de la pluralidad de vectores comprende: - una primera región de clonación y una segunda región de clonación, en la que - cada región de clonación comprende al menos un sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector, - estando cada región de clonación flanqueada en el extremo 5' por un sitio de unión a ribosomas y una secuencia señal, - un polinucleótido que codifica una región de anclaje, localizada en el extremo 3' de la segunda región de clonación, - un polinucleótido que codifica una región constante de cadena pesada o una porción de la misma localizada entre el sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector de la segunda región de clonación y la región de anclaje, - un polinucleótido que codifica un marcador, comprendiendo el método: introducir en la primera región de clonación un miembro de una primera pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una primera pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera de un anticuerpo posiblemente seguida por una región constante de cadena ligera de un anticuerpo, introducir por separado en la segunda región de clonación de cada vector un miembro de una segunda pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una segunda pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, e introducir cada uno de los vectores en una célula hospedadora para proporcionar una pluralidad de partículas de la cápside comprendiendo cada una de ellas un miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos variables y un miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos, para constituir de este modo la biblioteca de anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

E09151233

06-10-2015

hospedadores para alojar el ADN (véase el Ejemplo 38 del documento WO 92/01047). La expresión "población única" puede usarse para indicar una pluralidad de, por ejemplo, cadenas polipeptídicas, que no son genéticamente diversas, es decir, todas son iguales. Una población restringida es una que es diversa pero lo es menos que el repertorio completo de un animal. La diversidad puede haberse reducido mediante la

5 selección anterior, por ejemplo, usando la especificidad de unión antigénica.

La expresión "fago auxiliar" significa un fago que se usa para infectar células que contienen un genoma fágico defectuoso y que funciona para complementar el efecto. El genoma fágico defectuoso puede ser un fagémido o un fago con eliminación de alguna función que codifica secuencias génicas. Son ejemplos de fagos auxiliares son el gen III de M13K07, M13K07 Nº 3; y fagos que exponen o codifican una molécula de unión fusionada a una proteína de la cápside.

El término "homólogos" significa polipéptidos que tienen el mismo resto o restos conservados en una posición correspondiente en su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término también se extiende a dos o más

15 secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos homólogos. Son ejemplos de péptidos homólogos los isotipos de inmunoglobulina. La expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula procariota o eucariota en la cual pueden introducirse, expresase y/o propagarse los vectores del método de la invención. Las células hospedadoras de procariotas típicas incluyen diversas cepas de típicas de E. coli. Las células hospedadoras eucariotas típicas son levaduras u hongos filamentosos o células de mamíferos, tales como, las células de ovario de hámster chino, los fibroblastos murinos NIH 3t3 o las células 193 de riñón embrionario.

La expresión "superfamilia de inmunoglobulinas" significa una familia de polipéptidos, cuyos miembros tienen al menos un dominio con una estructura relacionada con la del dominio variable o constante de las moléculas de inmunoglobulina. El dominio contiene dos láminas B y habitualmente un enlace disulfuro conservado (véase A. F.

25 Williams y A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6 381-405). Son ejemplos de miembros de una superfamilia de inmunoglobulina CD4, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), la molécula de adhesión intercelular. (ICAM). Excepto cuando el contexto determine claramente lo contrario, las referencias a inmunoglobulinas y a homólogos de inmunoglobulinas en esta solicitud incluyen miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas y homólogos de las mismas.

El término "infección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora adecuada mediante el uso de un virus o vector viral.

La expresión "fragmento intermedio" significa un ácido nucleico de entre 5 y 1000 bases de longitud y 35 preferentemente entre 10 y 40 pb de longitud.

El término "aislado" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico o polipéptido separado no solamente de otros ácidos nucleicos o polipéptidos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico o el polipéptido, sino también de polipéptidos y preferentemente se refiere a un ácido nucleico o polipéptido encontrado en presencia de (si es que hay alguno) únicamente un disolvente, tampón, ion u otro componente normalmente presente en una solución del mismo. Los términos "aislado" y "purificado" no abarcan ácidos nucleicos

o polipéptidos presentes en su fuente natural.

La expresión "cepa mutante" significa una célula hospedadora que tiene un defecto genético que produce que el

45 ADN replicado dentro de ésta mute con respecto a su ADN parental. Son ejemplos de cepas mutantes NR9046mutD5 y NR9046 mut T1 (Véase el Ejemplo 38 del documento WO 92/01047).

La expresión "polipéptido de origen natural" se refiere a polipéptidos producidos por células que no se han modificado genéticamente y específicamente contempla diversos polipéptidos que surgen a partir de modificaciones post-traduccionales del polipéptido que incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación.

La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a un heteropolímero de nucleótidos o a la secuencia de estos nucleótidos. La expresión "ácido nucleico" y el término "polinucleótido" también se usan indistintamente en el

55 presente documento para referirse a un heteropolímero de nucleótidos. Generalmente, lo segmentos de ácidos nucleicos proporcionados por esta invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos del genoma y enlazadores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, o a partir de nucleótidos individuales, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores derivados de un operón microbiano o viral, o un gen eucariota.

Las expresiones "fragmento de oligonucleótido" o "fragmento de polinucleótido" y los términos "porción" o "segmento" son un tramo de restos de nucleótidos del polipéptido que es lo suficientemente largo para usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o diversos procedimientos de hibridación para identificar o amplificar partes idénticas o relacionadas de moléculas de ARNm o ADN.

65 El término "oligonucleótidos" o la expresión "sondas de ácidos nucleicos" se preparan basándose en las secuencias

E09151233

06-10-2015

polinucleotídicas proporcionadas en la presente divulgación. Los oligonucleótidos comprenden porciones de dicha secuencia de polinucleótidos que tienen al menos aproximadamente 15 nucleótidos y habitualmente al menos 20 nucleótidos. Las sondas de ácidos nucleicos comprenden porciones de dicha secuencia polinucleotídica que tienen menos de aproximadamente 6 kb de nucleótidos, habitualmente menos de aproximadamente 1 kb. Después del

5 ensayo apropiado para eliminar falsos positivos, estas sondas pueden utilizarse, por ejemplo, para determinar si las moléculas de ARNm específicas están presentes en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácidos nucleicos similares de ADN cromosómico tal como describen Walsh et al. (Walsh, P.S. et al., 1992, PCR Methods Appl 1:241250).

La expresión "fase de lectura abierta", ORF (del inglés "Open Reading Frame", significa una serie de tripletes de nucleótidos que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación y es una secuencia traducible en proteína.

La expresión "vector fágico" significa un vector derivado por modificación de un genoma fágico, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago, pero no uno para un plásmido.

15 La expresión "vector fagémido" significa un vector derivado por modificación de un genoma plasmídico, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago así como el origen de replicación de un plásmido. El término "fenotipo" se refiere a una propiedad física (por ejemplo, pigmento o forma celular) y/o a una propiedad metabólica de una célula que puede medirse o aprovecharse de algún modo y que efectúa el gen indicador.

La expresión "región polienlazadora" significa un polinucleótido que contiene al menos dos sitios de enzimas de restricción que son únicos en el vector que contiene la región polienlazadora, es decir, estos sitios de restricción se usan fácilmente como sitios de restricción en el vector.

25 Un "fragmento", "porción" o "segmento" polipeptídico es un tramo de restos de aminoácidos de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, a menudo de al menos 7 aminoácidos, típicamente al menos de 9 a 13 aminoácidos, y en diversas realizaciones, al menos aproximadamente 17 o más aminoácidos. Para que sea activo, cualquier péptido debe tener la suficiente longitud para mostrar actividad biológica y/o inmunológica.

El término "sondas" incluye ácidos nucleicos mono o bicatenarios, de origen natural o sintetizados de manera recombinante o química. Estos pueden marcarse mediante traducción por cortes, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas de la presente divulgación, su preparación y/o su marcaje se explican en Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; o Ausubel, F.M. et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York

35 NY.

El término "purificado" tal como se usa en el presente documento, indica que el ácido nucleico o el polipéptido indicado está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, por ejemplo, polinucleótidos, proteínas y similares. En una realización, el polinucleótido o polipéptido se purifica de tal modo que este constituye al menos el 95 % en peso, más preferentemente al menos el 99,8 % en peso, de las macromoléculas biológicas indicadas presentes (aunque puede haber agua, tampones y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular menor de 1000 daltons).

Cuando el término "recombinante" se usa en el presente documento para referirse a un polipéptido o a una proteína,

45 significa que un polipéptido o una proteína proceden de sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo, microbiano o de mamífero). 'Microbiano' se refiere a polipéptidos o proteínas recombinantes producidos en sistemas de expresión bacterianos o fúngicos (por ejemplo, levaduras). Como un producto, 'microbiano recombinante’ define a un polipéptido o a una proteína que carece esencialmente de sustancias nativas endógenas, y no viene acompañado de glucosilación nativa asociada. Los polipéptidos o proteínas expresados en la mayor parte de los cultivos bacterianos, por ejemplo, E. coli, carecerán de modificaciones de glucosilación: los polipéptidos o proteínas expresados en levaduras tendrán un patrón de glucosilación en general distinto del patrón expresado en células de mamífero.

La expresión "vehículo o vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido o a un fago o a un virus o a un

55 vector, para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de ADN (ARN). Un vehículo de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprenda un ensamblaje de (1) uno o más elementos genéticos que tengan un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce a proteína y (3) secuencias de inicio y terminación de la transcripción apropiadas. Las unidades estructurales destinadas al uso en sistemas de expresión en levaduras

o eucariotas incluyen, preferentemente, una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. Como alternativa, cuando se expresa la proteína recombinante sin una secuencia líder o transportadora, esta puede incluir un resto de metionina N-terminal. Este resto puede escindirse o no posteriormente de la proteína o del polipéptido recombinante expresado para proporcionar un producto final.

65 La expresión "sistema de expresión recombinante" significa células hospedadoras que han integrado de un modo estable una unidad transcripcional recombinante en el ADN cromosómico o que portan la unidad transcripcional

imagen6

imagen7

E09151233

06-10-2015

de procedimientos de hibridación convencionales bien conocidos por los expertos en la materia. La expresión "codón de terminación traduccional suprimible" significa un codón que permite la traducción de una secuencia de nucleótidos aguas abajo del codón en un conjunto de condiciones, pero en otro conjunto de condiciones la traducción termina en el codón. Son ejemplos de codones traduccionales suprimibles los codones

5 ámbar, ocre y ópalo.

El término "marcador" significa una extensión del fragmento Fab del anticuerpo, por ejemplo expresado en el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada, que comprende al menos un aminoácido, pero más típicamente de cinco a quince aminoácidos, y que puede reconocer específicamente un anticuerpo u otro ligando de unión o matriz de unión para la secuencia. Los marcadores pueden combinarse en el mismo Fab. Son ejemplos un tramo de cinco restos de histidina que puede reconocer anticuerpos específicos e iones metálicos inmovilizados definidos y un tramo de los siguientes 12 aminoácidos (EQKLISEEDLN) reconocido por el anticuerpo 9E10 (Marks et al., 1991).

El término "diana" significa cualquier molécula que sea antigénica, por ejemplo, que pueda reconocer con 15 especificidad razonablemente un anticuerpo de la biblioteca de Fab.

La expresión "elemento diana" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que altera la expresión del gen diana. Los elementos diana incluyen, pero no se limitan a, promotores y secuencias moduladoras promotoras (elementos inducibles). Una clase de elementos diana son los fragmentos que inducen la expresión en respuesta a un factor regulador específico o evento fisiológico.

El término "transfección" se refiere a la incorporación de un vector de expresión en una célula hospedadora adecuada, se expresen de hecho o no cualquiera de las secuencias codificantes.

25 El término "transformación" significa la introducción de ADN en una célula hospedadora adecuada de modo que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.

La expresión "conjunto universal" se refiere a un conjunto de ácidos nucleicos, más preferentemente a un conjunto de oligonucleótidos, que representa todas las combinaciones de secuencias posibles para una longitud de nucleótidos dada por ejemplo, los 4096 insertos de oligonucleótidos de seis nucleótidos de longitud. En una realización preferente, la expresión conjunto universal se refiere al conjunto de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud dada, en los que una o más de las posiciones en el oligonucleótido se mantienen constantes (es decir, el mismo nucleótido en esta posición está presente en todos los miembros del conjunto).

35 Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento modulador de la captación", FMC, significa una serie de nucleótidos que media la captación del ADN unido en una célula. Los FMC pueden identificarse fácilmente usando FMC conocidos como una secuencia o motivo diana con los sistemas informáticos descritos más adelante.

La presencia y actividad de un FMC puede confirmarse uniendo el FMC sospechoso con una secuencia marcadora. La molécula de ácido nucleico resultante se incuba después con un hospedador apropiado en condiciones apropiadas y se determina la captación de la secuencia marcadora. Tal como se describe anteriormente, un FMC aumentará la frecuencia de captación de una secuencia marcadora ligada.

El término "vector" se refiere a un plásmido o fago o virus o vector, para la expresión de un polipéptido a partir de

45 una secuencia de ADN (ARN). El vector puede comprender una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) a una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína y (3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de la traducción. Las unidades estructurales destinadas para el uso en sistemas de expresión en levaduras o eucariotas pueden incluir una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora.

La expresión "polinucleótidos VL" significa polinucleótidos que codifican los dominios que contienen las CDR de algunos o todos los genes de la cadena ligera de las familias de VK-y/o V

55 La expresión "polinucleótidos VH" significa polinucleótidos que codifican los dominios que contienen las CDR de algunos o todos los genes de la cadena pesada de la familia de genes de cadena pesada.

Cada uno de los términos y expresiones anteriores tiene por objeto incluir todo lo que se describe para cada uno de ellos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Las construcciones recombinantes de la presente divulgación comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el que puede insertarse uno o más ácidos nucleicos de interés. El vector puede comprender adicionalmente secuencias reguladoras, incluyendo por ejemplo, un promotor, unido operativamente a uno o más ácidos nucleicos de interés. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos para los expertos 65 en la materia y están disponibles en el comercio para generar las construcciones recombinantes del método de la presente invención. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript,

E09151233

06-10-2015

PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).

5 Pueden usarse métodos muy conocidos para los expertos en la materia para construir vectores que contienen un polinucleótido usado en el método de la invención y señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y técnicas de recombinación/genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989).

Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Son dos vectores apropiados pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particulares nombrados incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Los promotores

15 eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato del CMV, el de timidina quinasa del VHS y el temprano y tardío de SV40, los LTR de retrovirus y la metalotioneína-l de ratón.

Generalmente, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permitan la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Dichos promotores pueden proceder de operones que codifican enzimas glucolíticas tales como la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), el factor a, la fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otras. El polinucleótido usado en el método de la invención se ensambla en una fase apropiada con secuencias de inicio y de terminación, y preferentemente con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la

25 proteína traducida al interior del espacio periplasmático o al medio extracelular. Opcionalmente, el polinucleótido usado en el método de la invención puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que otorga características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para bacterias se construyen insertando un polinucleótido usado en el método de la invención junto con señales adecuadas de inicio y de terminación de la traducción, opcionalmente en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos de selección y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable proporcionar amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis,

35 Salmonella typhimurium y diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como una cuestión de elección.

Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para bacterias pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el comercio que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl, EE.UU.). Estas secciones de "estructura" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.

45 Adicionalmente, la presente divulgación proporciona células hospedadoras que contienen los vectores de la presente divulgación, en las que se ha introducido el ácido nucleico en la célula hospedadora usando métodos de transformación, transfección o infección conocidos. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariota inferior, tal como una célula de levadura o una célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción recombinante en la célula hospedadora puede efectuarse, por ejemplo, mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE, dextrano o electroporación (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Puede usarse cualquier sistema de hospedador/vector para identificar uno o más de los elementos diana de la presente divulgación. Estos incluyen, pero no se limitan a, hospedadores eucariotas tales como las células HeLa, células Cv-1, células COS y células Sf9, así como hospedadores

55 procariotas tales como E. coli y B. subtilis. Las células más preferentes son aquellas que no expresan normalmente el polipéptido o proteína indicadora particular o que expresan el polipéptido o proteína indicadora particular a un nivel natural bajo.

El hospedador también puede ser una levadura u otro hongo. En las levaduras, pueden usarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión, véase, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Capítulo. 13 (1988); Grant et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzvmology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y. 153: 516-544 (1987); Glover, DNA Cloning. Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., capítulo 3 (1986); Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, en Methods in Enzymology, Berger & Kimmel editores, Acad. Press, N.Y.

65 152: 673-684 (1987); y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al. editores, Cold Spring Harbor Press, Vols. I y 11(1982).

E09151233

06-10-2015

El hospedador también puede ser una célula procariota tal como E. coli, otras Enterobacteriaceae tales como Serratia marescans, bacilos, diversas pseudomonas u otros procariotas que pueden transformarse, transfectarse, infectarse, etc. (es decir, existe un método para la introducción de ácidos nucleico en la célula hospedadora).

5 La presente divulgación proporciona adicionalmente células hospedadoras modificadas genéticamente para que contengan los polinucleótidos usados en el método de la invención. Por ejemplo, dichas células hospedadoras pueden contener ácidos nucleicos de la divulgación introducidos en la célula hospedadora usando métodos de transformación, transfección o infección conocidos. La presente divulgación aún proporciona adicionalmente células hospedadoras modificadas genéticamente para que expresen los polinucleótidos de la divulgación, en los que dichos polinucleótidos están en asociación operativa con una secuencia reguladora heteróloga para la célula hospedadora que conduce la expresión de los polinucleótidos en la célula.

La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una

15 célula hospedadora eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción recombinante en la célula hospedadora puede efectuarse por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE, dextrano o electroporación (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Las células hospedadoras que contienen uno de los polinucleótidos de la divulgación, pueden usarse de modos convencionales para producir el producto génico codificado por el fragmento aislado (en el caso de una ORF) o pueden usarse para producir una proteína heteróloga bajo el control del FME.

Puede usarse cualquier sistema de hospedador/vector para expresar una o más de las ORF de la presente divulgación. Estos incluyen, pero no se limitan a, hospedadores eucariotas tales como células HeLa, células Cv-1,

25 células COS y células Sf9 así como hospedadores procariotas tales como E. coli y B. subtilis. Las células más preferentes son aquellas que no expresan normalmente el polipéptido o proteína particular o que expresan el polipéptido o proteína particular a un nivel natural bajo. Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres de células también pueden emplearse para producir dichas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente divulgación. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con hospedadores procariotas y eucariotas se describen por Sambrook, et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivos celulares en mamíferos para expresar proteínas

35 recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresión en mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell 23: 175 (1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión en mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y también cualquiera de los sitios de unión a ribosomas, sitios de poliadenilación, sitios de escisión donantes y aceptores, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas flanqueantes de 5' necesarios. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen SV40, el promotor temprano, el potenciador, los sitios de escisión y poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios. Los polipéptidos y proteínas recombinantes producidos en cultivos bacterianos se aíslan habitualmente mediante la extracción inicial a partir de los sedimentos celulares, seguida de uno o más de etapas de desalinización, cromatografía acuosa de

45 intercambio iónico o exclusión molecular. También pueden usarse etapas de repliegue de las proteínas, siempre que sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación, sonicación, rotura mecánica o el uso de agentes de lisado celular.

Diversos tipos de células pueden actuar como células hospedadoras adecuadas para la expresión de la proteína. Las células hospedadoras de mamíferos incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñón humano, células humanas epidérmicas A431, células humanas Colo205, células 3T3, células CV-1, otras células transformadas de primates, células normales diploides, cepas celulares derivadas

55 del cultivo de tejidos primarios in vitro, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK o Jurkat.

Como alternativa, puede ser posible producir la proteína en eucariotas inferiores tal como una levadura o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de levadura posiblemente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. La cepas de levaduras posiblemente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas. Si la proteína se produce en levaduras o bacterias, puede ser necesario modificar la proteína producida en las mismas, por ejemplo mediante la fosforilación o glucosilación en los sitios apropiados, con el fin de obtener la proteína funcional. Dichas uniones

65 covalentes pueden llevarse a cabo usando métodos químicos o enzimáticos conocidos.

E09151233

06-10-2015

Las células y tejidos pueden modificarse por ingeniería genética para que expresen un gen endógeno que comprenda los polinucleótidos de la divulgación bajo el control de elementos reguladores inducibles, en cuyo caso las secuencias reguladoras del gen endógeno pueden reemplazarse por recombinación homóloga. Tal como se describe en el presente documento, el direccionamiento génico puede usarse para reemplazar una región génica

5 reguladora existente por una secuencia reguladora aislada de un gen distinto o una secuencia reguladora nueva sintetizada mediante métodos de ingeniería genética. Dichas secuencias reguladoras pueden estar comprendidas de promotores, potenciadores, regiones de plegamiento-unión, elementos reguladores negativos, sitios de inicio de la transcripción, sitios de unión a proteínas reguladoras o combinaciones de dichas secuencias. Como alternativa, las secuencias que afectan a la estructura o la estabilidad del ARN o de la proteína pueden reemplazarse, eliminarse, añadirse o modificarse de otro modo mediante el direccionamiento, incluyendo las señales de poliadenilación, elementos de estabilidad del ARNm, sitios de escisión, secuencias líder para potenciar o modificar las propiedades de transporte o secreción de la proteína u otras secuencias que alteran o mejoran la función o estabilidad de las moléculas de proteína o de ARN.

15 El acontecimiento de direccionamiento puede ser una inserción simple de la secuencia reguladora, colocando el gen bajo el control de una nueva secuencia reguladora, por ejemplo, insertando un nuevo promotor o potenciador o ambos aguas arriba de un gen. Como alternativa, el evento de direccionamiento puede ser una deleción simple de un elemento regulador, tal como la deleción de un elemento regulador negativo específico de tejido. Como alternativa, el evento de direccionamiento puede reemplazar un elemento existente; por ejemplo, un potenciador específico de tejido puede reemplazarse por un potenciador que tenga una especificidad más amplia o para distintos tipos celulares que los elementos de origen natural. En el presente documento, las secuencias de origen natural se eliminan y se añaden nuevas secuencias. En todos los casos, la identificación del acontecimiento de direccionamiento puede facilitarse mediante el uso de uno o más genes marcadores de selección que son contiguos al ADN de direccionamiento, permitiendo la selección de células en las que se integra el ADN exógeno en el

25 genoma de célula hospedadora. La identificación del acontecimiento de direccionamiento también puede facilitarse mediante el uso de uno o más genes marcadores que muestran las propiedades de la regulación negativa, tales como los marcadores de selección que se unen negativamente al ADN exógeno, pero que se configuran de tal modo que el marcador de selección flanquea las secuencias de direccionamiento y de tal modo que un acontecimiento de recombinación homóloga correcto con las secuencias del genoma de la célula hospedadora no da como resultado la integración estable del marcador de selección de manera negativa. Los marcadores útiles para este fin incluyen el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple o el gen bacteriano de la xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt).

Las técnicas de direccionamiento génico o activación génica que pueden usarse de acuerdo con este aspecto de la

35 invención se describen más particularmente en la Patente de Estados Unidos Nº 5.272.071 de Chappel; Patente de Estados Unidos Nº 5.578.461 a Sherwin et al.; documento WO 93/09222 por Selden et al.; y el documento WO 91/06667 por Skoultchi et al.

En general, las técnicas para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales así como hibridomas capaces de producir el anticuerpo deseado son muy conocidas en la técnica (Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Países Bajos (1984); St. Groth et al., J. Immunol. 35: 1-21 (1990); Kohler y Milstein, Nature 256: 495497 (1975)), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today

4:72 (1983); Cole et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), pág. 77-96).

45 Los métodos para la inmunización son muy conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen la inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Un experto en la materia reconocerá que la cantidad de proteína codificada por el gen indicador usada para la inmunización variará en función del animal al que se le inmuniza, de la antigenicidad del péptido y del sitio de inyección.

El polipéptido o la proteína de la divulgación que se usa como un inmunógeno puede modificarse o administrarse en un adyuvante con el fin de aumentar la antigenicidad del polipéptido o la proteína: Los métodos para aumentar la antigenicidad de un polipéptido o proteína son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (tal como una globulina o β-galactosidasa) o a través de la

55 inclusión de un adyuvante durante la inmunización. Para los anticuerpos monoclonales, se extraen células del bazo de los animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma, tales como las células de mieloma SP2/0-Ag14 y se les permite que se conviertan en células de hibridoma productoras de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse uno cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo con las características deseadas. Estos incluyen la exploración de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis de transferencia western o un radioinmunoensayo (Lutz et al., Exp. Cell Research.

175: 109-124 (1988)).

Los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados se clonan y la clase y la subclase se determinan usando

65 procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Editores, Ámsterdam, Países Bajos (1984)).

E09151233

06-10-2015

Para los anticuerpos policlonales, se aíslan los antisueros que contienen anticuerpos del animal inmunizado y se exploran con respecto a la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada usando uno de los procedimientos anteriormente descritos.

5 Las células hospedadoras se transfectan o preferentemente se infectan o se transforman con los vectores descritos anteriormente, y se cultivan en medios con nutrientes apropiados para la selección de los transductantes o transformantes que contienen el vector.

Las células hospedadoras que expresan el polipéptido o proteína del producto de la divulgación pueden identificarse mediante al menos cuatro enfoques generales; (a) hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones génicas; (c) la evaluación del nivel de la transcripción tal como se mide por la expresión de los transcritos de ARNm en la célula hospedadora; y (d) la detección del producto génico tal como se mide mediante inmunoensayo o mediante su actividad biológica.

15 En el primer enfoque, la presencia del polipéptido o de la proteína de la divulgación insertado(a) en el vector puede detectarse mediante hibridación del ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas al polipéptido o a la proteína de la divulgación, respectivamente, o a porciones o a sus derivados.

En el segundo enfoque, el sistema vector/hospedador de expresión recombinante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si el polipéptido o proteína de la divulgación se 25 inserta dentro de una secuencia génica marcadora del vector, las células recombinantes que contienen el polipéptido de la proteína de la divulgación pueden identificarse por la ausencia de la función génica del marcador. Como alternativa, puede colocarse un gen marcador en tándem con el polipéptido o proteína de la divulgación bajo el control del mismo o distinto promotor usado para controlar la expresión del polipéptido o proteína de la divulgación. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o la selección indica la expresión del polipéptido

o proteína de la divulgación.

En el tercer enfoque, la actividad transcripcional del polipéptido o proteína de la divulgación puede evaluarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, puede aislarse el ARN e hibridar mediante transferencia de Northern usando una sonda homóloga al polipéptido o proteína de la divulgación o porciones particulares de la misma. Como

35 alternativa, los ácidos nucleicos totales de la célula hospedadora pueden extraerse y ensayarse con respecto a la hibridación con dichas sondas.

En el cuarto enfoque, la expresión de un producto del polipéptido o de la proteína de la divulgación puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante transferencias de Western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas y similares.

Puede unirse un polinucleótido de acuerdo con la divulgación a cualquiera de una variedad de otras secuencias de nucleótidos mediante técnicas de ADN recombinantes bien establecidas (véase Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Las secuencias de nucleótidos útiles para la

45 unión con los polipéptidos incluyen una variedad de vectores, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados del fago lambda, fagémidos y similares, que son muy conocidos en la técnica. Por consiguiente, también se proporciona un vector que incluye un polinucleótido de la divulgación y una célula hospedadora que contiene el polinucleótido. En general, el vector contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de restricción por endonucleasas convenientes y un marcador de selección para la célula hospedadora. Los vectores de acuerdo con la divulgación incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. Una célula hospedadora de acuerdo con la divulgación puede ser una célula procariota o eucariota y puede ser un organismo unicelular o parte de un organismo multicelular.

La presente divulgación proporciona adicionalmente construcciones recombinantes que comprenden un ácido

55 nucleico de la divulgación o un fragmento del mismo. Las construcciones recombinantes de la presente divulgación comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado un ácido nucleico de la divulgación o un fragmento del mismo, en una orientación directa o inversa. En el caso de un vector que comprende una de las ORF de la presente divulgación, el vector puede comprender además secuencias reguladoras, que incluyen por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la ORF. Para los vectores que comprender los FME y los FMC de la presente divulgación, el vector puede comprender además una secuencia marcadora o una ORF heteróloga unida operativamente al FME o UMF. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos para los expertos en la materia y están disponibles en el comercio para generar las construcciones recombinantes de la presente divulgación. Los siguientes vectores proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A,

65 pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).

E09151233

06-10-2015

El polinucleótido aislado de la divulgación puede estar unido operativamente a una secuencia de control de la expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED divulgados en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991), con el fin de producir la proteína o polipéptido recombinantemente. Muchas secuencias de control

5 de la expresión adecuadas son conocidas en la técnica. Los métodos generales de expresión de proteínas recombinantes también son conocidos y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990). Tal como se define en el presente documento, "unido operativamente" significa que el polinucleótido aislado y una secuencia de control de la expresión están situados dentro de un vector o célula de tal modo que la proteína o el polipéptido se expresan por una célula hospedadora que se ha transformado (transfectado) con el polinucleótido/secuencia de control de la expresión ligado.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particulares nombrados incluyen, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR y trc. Los promotores

15 eucariotas incluyen el intermedio temprano de CMV, el de timidina quinasa de VSH, y el temprano y tardío de SV40, los LTR de retrovirus y la metalotioneína-l de ratón. La selección del vector apropiado y el promotor está muy dentro del nivel de una experiencia habitual en la técnica. Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permiten la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el genTRP1 de S. cerevisiae y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Dichos promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glucolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor a, fosfatasa ácida o proteínas del choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase adecuada con las secuencias de inicio y de terminación de la traducción, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína o glucopéptido traducido al espacio periplasmático o el medio

25 extracelular. Opcionalmente, la secuencia de heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que aporta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano se construyen insertando una secuencia estructural de ADN que codifica una proteína polipeptídica deseada junto con señales de inicio y de terminación de la traducción adecuadas en una fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos de selección y un origen de replicación para asegurarse del mantenimiento del vector para, si es deseable, proporcionar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores eucariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como una materia de elección.

35 Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para el uso en bacterias pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles en el comercio que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl, EE.UU.). Estas secciones de la 'estructura' de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Después de la transformación en una cepa de hospedador adecuada y del crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce o se deprime por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se recogen típicamente mediante centrifugación,

45 se rompen mediante un método físico o químico, y el extracto sin procesar resultante se retiene para la purificación posterior.

Los polinucleótidos de la divulgación se dirigen adicionalmente a secuencias que codifican variantes de polipéptidos

o proteínas de la divulgación. Estas variantes de la secuencia de aminoácidos pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica introduciendo cambios apropiados en los nucleótidos en un polinucleótido nativo o de la variante. Existen dos variables en la construcción de variantes de la secuencia de aminoácidos: la localización de la mutación y la naturaleza de la mutación. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los ácidos nucleicos se construyen preferentemente mutando el polinucleótido para producir una secuencia de aminoácidos que no se da en la naturaleza. Estas alteraciones de los aminoácidos pueden producirse en sitios que difieren de los ácidos nucleicos 55 de distintas especies (posiciones variables) o en regiones altamente conservadas (regiones constantes). Los sitios en dichas localizaciones típicamente se modificarán en serie, por ejemplo, sustituyendo primero las elecciones conservativas (por ejemplo, un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófobo distinto) y después con elecciones más distantes (por ejemplo, un aminoácido hidrófobo por un aminoácido cargado), y después pueden hacerse deleciones e inserciones en el sitio diana. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 30 restos, preferentemente de aproximadamente 1 a 10 restos y típicamente son contiguas. Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo terminales que varían en su longitud de uno a cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o múltiples restos de aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia pueden variar generalmente de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos, preferentemente de 1 a 5 restos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen las secuencias

65 señal heterólogas necesarias para la secreción o para el direccionamiento intracelular en distintas celulares hospedadoras.

imagen8

imagen9

E09151233

06-10-2015

Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medias hidrófobos de RP-HPLC, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente la proteína o el polipéptido. También pueden

5 emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína o polipéptido recombinante sustancialmente homogéneo. La proteína o el polipéptido purificado de este modo están sustancialmente libre de otras proteínas de mamíferos y se define de acuerdo con la presente divulgación como una "proteína aislada".

Como una elección de formato de anticuerpo, se prefirió el formato Fab sobre el formato scFv, ya que el formato Fab permite realizar ensayos de exploración de afinidad de flujo continuo alto para preparaciones de anticuerpo sin procesar. Muchos de los scFv forman, en efecto, especies de un peso molecular más alto que incluyen dímeros (Weidner, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267,10281-10288; Holliger, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 6444-6448) y trímeros (Korttet et.al. (1997) Protein Eng. 10, 423-433), lo que complica tanto la selección como la

15 caracterización. Se ha elegido el formato de presentación de Fab en el que un dominio variable de un gen de una cadena pesada o una ligera se une a una proteína de recubrimiento fágico, y en algunas realizaciones, también porta un marcador para la detección y la purificación. La otra cadena se expresa como un fragmento distinto secretado en el periplasma, donde puede emparejarse con el gen que está en una proteína de fusión con la proteína de recubrimiento fágico (Hoogenboom, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4133-4137). En algunas realizaciones, la proteína de recubrimiento fágico es una proteína de recubrimiento pIll. En otras realizaciones, el dominio variable de un gen de la cadena pesada se fusiona a la proteína de recubrimiento fágico y el gen de la cadena ligera se expresa como un fragmento distinto.

La elección del formato Fab se basó en la noción de que el aspecto monomérico de los Fab permite la exploración

25 rápida de un gran número de clones con respecto a su cinética de unión (velocidad de disociación) con fracciones de proteínas sin procesar. Esto reduce drásticamente el tiempo del análisis post-selección cuando se compara con el necesario para los anticuerpos de Fv monocatenarios (scFv) a partir de bibliotecas de fagémidos (Vaughan, et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14.309-314; Sheets, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95, 6157-6162) o fragmentos Fab de otras fagotecas (Griffiths, et al., (1993) EMBOJ. 12, 725-734).

La biblioteca de Fab obtenible mediante el método de la invención produjo, por término medio, 14 Fab distintos contra los 6 antígenos que se ensayaron. Estos incluyeron el toxoide tetánico, el hapteno de fenil-oxazolona, el antígeno MUC1 asociado a cáncer de mama y tres hormonas glucoproteicas altamente relacionadas: la gonadotropina coriónica humana ("hCG"), la hormona luteinizante humana ("hLH") y la hormona estimulante del 35 folículo humana ("hFSH"). Para las hormonas glucoproteicas, la biblioteca de Fab obtenible por el método de la invención produjo un panel bien de anticuerpos específicos de hormonas o de anticuerpos de reactividad cruzada. Por lo tanto, sin usar protocolos de selección sofisticados, se recuperaron los Fab específicos así como los que tenían reactividad cruzada contra estas glucohormonas altamente homólogas, demostrando que la biblioteca es una fuente rica de especificidades de anticuerpo. Las afinidades de los anticuerpos anti-glucohormonas varió entre 2,7 y 38 nM. Finalmente, el formato de Fab permitió, en efecto, la exploración rápida y la clasificación fiable de clones individuales basándose en la velocidad de disociación usando fracciones sin procesar. Además, las especificidades de los anticuerpos obtenidos mediante selecciones en las gonadotropinas son únicas: debido al alto grado de homología entre hLH y hCG ha sido muy difícil aislar anticuerpos monoclonales específicos para hCG con la tecnología del hibridoma, mientras que hay muy pocos anticuerpos específicos de hLH (Moyle, y col, (1990) J. Biol. 45 Chem. 265, 8511-8518; Cole, (1997) Clin. Chem. 43, 2233-2243). Usando un procedimiento de selección directa, sin tomar ninguna precaución para impedir la selección de Fab con reactividad cruzada, se han aislado fácilmente fragmentos con todas las especificidades posibles: Los Fab específicos para cualquiera de las tres hormonas hCG, hLH y hFSH, y los Fab de reactividad cruzada que reconocen las cadenas-α o epítopos comunes en la cadena β compartida por hCG y hLH. Estas selecciones demostraron que pueden recuperarse anticuerpos dirigidos contra distintos epítopos dentro de moléculas antigénicas únicas a partir de la biblioteca. La biblioteca de Fab obtenible por el método de la invención permite el control de las selecciones con preparaciones de fagos policlonales y la exploración a gran escala de las velocidades de disociación de los anticuerpos con fragmentos de Fab no purificados. En su conjunto, se recuperaron anticuerpos con unas velocidades de disociación en el orden de 10-2 a 10-4 s-1 y afinidades de hasta 2,7 nM. La cinética de estas fagotecas es del mismo orden de magnitud que la de los

55 anticuerpos asociados con una respuesta inmunitaria secundaria.

Una indicación de que los anticuerpos de la biblioteca de Fab se comportan de una manera similar o mejor que los anticuerpos de una biblioteca de scFV con respecto a su afinidad procede de una comparación de las selecciones de dos bibliotecas de anticuerpos distintas en los mismos dos antígenos en condiciones idénticas. Los anticuerpos para MUC1 seleccionados a partir de una biblioteca de scFv vírgenes de gran tamaño (Henderikx et al., (1998) Cancer Res. 58, 4324-4332) pueden tener velocidades de disociación más rápidas que los Fab equivalentes aislados a partir de la biblioteca descrita en este estudio. Además, estos muestran un uso muy distinto de los genes V y tienen una especificidad fina distinta. De un modo similar, cuando se comparan las velocidades de disociación de los anticuerpos fágicos contra el marcador de pancarcinoma Glucoproteína Epitelial 2, uno de los Fab

65 seleccionados a partir de la presente biblioteca parece tener una velocidad de disociación 10 veces más lenta que el mejor scFv (Vaughan et al.,(1996) Nat. Biotechnol. 14, 309-314).

E09151233

06-10-2015

Las afinidades de los fragmentos de anticuerpo seleccionados son, sin embargo, muy dependientes del antígeno usado para la selección. Sheets y colaboradores notificaron una afinidad que variaba entre 26 y 71 nM para los fragmentos scFv específicos seleccionados para el anti-neurotoxina de tipo A de Clostridia botulinum, mientras que

5 para los anticuerpos para el dominio extracelular del Erb-2 humano, se encontraron Kd entre 0,22 y 4,03 nM (Sheets et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95, 6157-6162). Las afinidades de los Fab específicos de gonadotropinas seleccionados a partir de esta biblioteca variaron entre 2,7 y 38 nM, Lo que es comparable a los scFv de la proteína de unión de la biblioteca virgen producida por Vaughan et al. y Sheets et al. y se aproxima a los valores de los mejores anticuerpos de su tipo. El tamaño de la biblioteca de Fab obtenible mediante el método de la invención no solamente es importante por su afinidad, sino que también determina la tasa de éxito de la selección de anticuerpos contra un gran conjunto de antígenos distintos. A este respecto, la biblioteca de Fab obtenible por el método de la invención funciona muy bien: se seleccionaron por encima de 24 anticuerpos para el hapteno phOx y un promedio de 13 anticuerpos contra los otros antígenos.

15 En el conjunto limitado de 14 clones de Fab que se secuenciaron, se identificaron anticuerpos con genes de la región variable de la totalidad de las grandes familias génicas V, incluyendo VH1/3/4, VKΚ1/3 y V1/2, pero también se recuperaron los segmentos usados con menor frecuencia de la familia VH6, VΚ2/7y V7. Lo más probable, es que el uso de un conjunto extenso de cebadores de genes de la región variable, diseñados basándose en la información de secuencia más reciente de las regiones V de la línea germinal y/o las PCR separadas, combinadas con la clonación parcialmente separada, aseguró el acceso a una muestra altamente diversa del repertorio de genes V humanos.

Se prepara una biblioteca a partir de polinucleótidos que son capaces de codificar el miembro del par de unión específico deseado. Existe una variedad de técnicas para la preparación de la biblioteca, que puede prepararse, por ejemplo, bien a partir de ADN genómico o ADNc. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A 25 Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Las células pueden servir como la fuente de los polinucleótidos que codifican los miembros de pares específicos de unión de interés. Pueden emplearse procedimientos enriquecimiento y medios para amplificar las regiones que contienen el/los gene(s). Por ejemplo, cuando el miembro del par de unión específico es un anticuerpo, puede prepararse ARN y/o ADN genómico, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas a partir de un animal no inmunizado, a partir de un animal inmunizado con la(s) diana(s) de interés, a partir de células de hibridoma o a partir de células linfoblastoides. La biblioteca de anticuerpos obtenidos a partir de los animales no inmunizados contiene una representación no sesgada del repertorio completo de anticuerpos, mientras que la biblioteca de anticuerpos obtenidos a partir de los animales inmunizados contiene una población sesgada de anticuerpos dirigidos contra epítopos de la(s) diana(s). Las células de bazo o las células inmunitarias de otros tejidos o del sistema circulatorio

35 pueden obtenerse a partir de una variedad de especies animales, tales como seres humanos, ratón, rata, equinos, bovinos, aves, etc.

La amplificación del ARN mensajero (ARNm) aislado de células de interés, tales como de células de bazo o de hibridoma, puede realizarse de acuerdo con protocolos esquematizados, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.683.202, Orlandi, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:3833-3837 (1989)). Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:5728-5732 (1989)) y Huse et al. Science 246:1275-1281 (1989), Abelson, J. y Simon, M. (eds), Methods in Enzymology, combinatorial chemistry, Vol. 267, San Diego: Academic Press (1996), Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (eds), Phage Display of peptides and Proteins, a Laboratory Manual, San Diego: Academic Press (1996). Los cebadores oligonucleotídicos útiles en los protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerar o

45 incorporar inosina en posiciones degeneradas. Por lo tanto, para las inmunoglobulinas multicatenarias, deberían usarse los cebadores generalmente para la amplificación de secuencias que codifican las regiones variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Pueden incorporarse secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un vector en una fase de lectura abierta predeterminada para su expresión.

Las bibliotecas de expresión que contienen el ADNc amplificado se preparan típicamente en un vector tal como un bacteriófago o un fagémido. Las características del bacteriófago o fagémido adecuado dependen de la realización específica empleada, y generalmente serán aquellos que permiten convenientemente la inserción de los polinucleótidos recombinantes en células hospedadoras mediante el empaquetamiento in vitro o la transformación.

55 Después, se infectan las células hospedadoras con el fago o fagémido y el fago auxiliar y se cultivan en condiciones que permitan la expresión y el ensamblaje de las partículas fágicas. En una realización, se eligen las células hospedadoras apropiadas para los bacteriófagos o fagémidos del método de la invención son diversas cepas de E.coli, los ejemplos específicos de las cuales dependen de los diversos vectores adecuados. Por supuesto, también puede usarse un fago o fagémido que tenga hospedadores bacterianos distintos a E.Coli.

Para enriquecer y aislar las partículas fágicas o fagos que contienen las secuencias clonadas de la biblioteca que codifican un miembro de un par de unión específico deseado y, por lo tanto, aislar finalmente las secuencias de ácidos nucleicos en sí mismas, se purifican por afinidad partículas fágicas o fagos recogidos de las células 65 hospedadoras. Se usa una diana o un compañero de unión para el miembro del par de unión específico en la purificación por afinidad. Por ejemplo, cuando el miembro del par de unión específico deseado es un anticuerpo, que

imagen10

E09151233

06-10-2015

Dreasen y Zamir, Gene 27:315-322 (1984). y aquellas descritas en Abelson, J. y Simon, M. (eds), Methods in Enzymology, combinatorial chemistry, Vol. 267, San Diego: Academic Press (1996), y Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (eds), Phage Display of peptides and Proteins, a Laboratory Manual, San Diego: Academic Press (1996).

5 Generalmente, la estrategia de clonación exitosa que utiliza una proteína de recubrimiento fágico, tal como pIll del fago filamentoso fd, proporcionará; (1) la expresión de una cadena proteica (o una primera cadena polipeptídica cuando la proteína deseada es multicatenaria, por ejemplo, la cadena VH) fusionada al extremo N-terminal de una proteína de recubrimiento de tamaño completo (o casi de tamaño completo) (por ejemplo, pIll) y transporte a la membrana interna del hospedador donde el dominio hidrófobo de la región C-terminal de la proteína de recubrimiento ancla la proteína de fusión en la membrana, conteniendo el extremo N-terminal la cadena que protruye en el espacio periplasmático y que está disponible para la interacción con una segunda cadena o posterior (por ejemplo, VL para formar un fragmento Fab) que, por lo tanto, está unido a la proteína de recubrimiento; y (2) la expresión adecuada de una segunda cadena polipeptídica o posterior si está presente (por ejemplo, VL) y el

15 transporte de esta cadena al compartimento soluble del periplasma.

En una realización para el enriquecimiento por afinidad de los clones deseados, se incuban aproximadamente de 103 a 104 equivalentes de biblioteca (un equivalente de biblioteca es cada uno de los equivalentes recombinantes -104 de una biblioteca de 109 miembros es 109 x 104 = 1013 partículas fágicas o fagos) con una diana para la cual se busca el miembro del par de unión específico deseado (por ejemplo, anticuerpo). La diana está en una de varias formas apropiadas para los esquemas enriquecimiento por afinidad. En un ejemplo la diana está inmovilizada sobre una superficie o una partícula, opcionalmente anclada mediante una fijación de la longitud suficiente (de 3 a 12 carbonos, por ejemplo) por ejemplo para mantener la diana lo suficientemente lejos de la superficie para permitir la interacción libre con el sitio de combinación del anticuerpo. La biblioteca de partículas fágicas o fagos que portan los

25 anticuerpos se criba después sobre la diana inmovilizada generalmente de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en Abelson, J. y Simon, M. (eds), Methods in Enzymology, combinatorial chemistry, vol. 267, San Diego: Academic Press (1996), Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (eds), Phage Display of peptides and Proteins, a Laboratory Manual, San Diego: Academic Press (1996).

Un segundo ejemplo de presentación de diana es una diana unida a un ligando reconocible (de nuevo opcionalmente con una fijación de alguna longitud). Un ejemplo específico de dicho ligando es la biotina. La diana, modificada de este modo, se incuba con la biblioteca partículas fágicas o fagos y se da la unión con ambos reactantes en solución. Los complejos resultantes se unen después con estreptavidina (o avidina) a través del resto de biotina. La estreptavidina puede inmovilizarse sobre una superficie tal como una placa de plástico o sobre

35 partículas, en cuyo caso los complejos se retienen físicamente; o la estreptavidina puede estar marcada, con un fluoróforo, por ejemplo, al marcador del fago/anticuerpo activo para la detección y/o aislamiento mediante procedimientos de separación, por ejemplo, en un separador celular de fluorescencia activada.

En una realización, las partículas fágicas o fagos que portan anticuerpos sin la especificidad deseada se retiran por diversos medios, por ejemplo, por lavado. El grado y la rigurosidad del lavado necesario se determinarán para cada miembro de par de unión específico de interés. Puede ejercerse un determinado grado de control sobre las características de unión de los anticuerpos recuperados ajustando las condiciones de la incubación de unión y los lavados posteriores. La temperatura, el pH, la fuerza iónica, la concentración de los cationes divalentes y el volumen y la duración del lavado se seleccionarán para anticuerpos dentro intervalos particulares de afinidad para el hapteno.

45 La selección basada en la velocidad de disociación lenta que, es habitualmente predictiva de una alta afinidad, es la ruta más práctica. Esta puede hacerse bien mediante la incubación continua en presencia de una cantidad saturante del hapteno libre, o aumentando el volumen, número y longitud de los lavados. En cada caso, se impide la re-unión del anticuerpo-fago disociado, y con tiempo creciente, se recupera el anticuerpo-fago con una afinidad cada vez más alta.

Los anticuerpos con determinadas actividades catalíticas pueden enriquecerse en grupos de anticuerpos con alta afinidad para reactantes (sustratos e intermedios) pero baja afinidad para los productos. Una doble exploración para enriquecer en anticuerpos con estas características puede ser útil para encontrar anticuerpos para catalizar determinadas reacciones. Además, también pueden seleccionarse anticuerpos catalíticos capaces de determinadas

55 reacciones de escisión. Una categoría de dichas reacciones es la escisión de un grupo terminal específico de una molécula. Por ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo catalítico para que escinda un aminoácido específico de un extremo de un péptido mediante la inmovilización del péptido y el cribado de la biblioteca de anticuerpos en condiciones de las que se espera que promuevan la unión pero no la escisión (por ejemplo, baja temperatura, fuerza iónica particular, pH, concentraciones de cationes, etc., dependiendo de la naturaleza del grupo terminal y de la reacción de escisión) y seguido por un lavado. Esto permite que los anticuerpos que reconocen el grupo terminal se unan y se inmovilicen y a partir de este grupo estos serán capaces de la escisión. Para encontrar aquellos que son capaces de la escisión, las condiciones se desplazan a aquellas que son favorables para la escisión. Esta etapa liberará los anticuerpos-fago capaces de escindirse en sí mismos, liberándose del péptido inmovilizados.

65 Un modo alternativo de llevar a cabo esto es hacer un cribado de anticuerpos que se unen al grupo terminal específico mediante la unión del grupo terminal a un enlace distinto del que se va a escindir (un enlace no peptídico,

E09151233

06-10-2015

por ejemplo). Para el cribado posterior (del fago positivo a partir de la primera exploración) del grupo terminal unido por medio del enlace apropiado en condiciones de escisión, la fracción de hibridación se enriquecerá para aquellos con la actividad catalítica deseada.

5 Para eluir la partícula de anticuerpo-fago activa o el fago de la diana inmovilizada, después de la lavar con la rigurosidad apropiada, la partícula fágica o fago unido (activo) puede recuperarse eluyendo mediante un desplazamiento del pH. Por ejemplo, puede usarse pH 2 o pH 11 que después se neutraliza y el fago eluido se amplifica mediante la infección o transformación de las células hospedadoras. Las células crecen después como colonias resistentes a tetraciclina. Las colonias se raspan y el fago extruido se purifica mediante procedimientos convencionales tal como se hizo anteriormente. Estos fagos se usan después en otra ronda de enriquecimiento por afinidad (cribado) y este ciclo se repite hasta que se alcanza el nivel de enriquecimiento deseado o hasta que el fago diana no se enriquece más con respecto a las partículas fágicas o fago de fondo. Para aislar clones individuales, las partículas fágicas o fago de la ronda final de cribado y elución se infectan en células o su ADN se transforman en células y crece sobre agar (habitualmente agar L) y antibióticos (habitualmente tet) para formar colonias individuales

15 bien separadas, cada una de las cuales es un clon porta vectores tanto con secuencias VH como VL. Puede aislarse el ADN monocatenario de las partículas fágicas o fagos extruidos a partir de cada colonia y secuenciarse el ADN que codifica para los fragmentos VH y VL. La forma replicativa del ADN del fago (bicatenario) puede aislarse mediante medios convencionales y el ADN de los sitios de clonación (secuencias VH y VL) reclonarse en un vector diseñado para la expresión de producto génico en procariotas o eucariotas para obtener cantidades mayores de los anticuerpos particulares seleccionados en el proceso de exploración. Los fagos identificados por tener un anticuerpo reconocido por el ligando diana se propagan tal como sea apropiado para el vector fágico particular usado. Para fd-tet, esto se hace en un cultivo líquido de un medio rico (caldo L, por ejemplo) con selección de antibiótico (Tet). Se recogen los fagos y se prepara el ADN y se secuencia mediante métodos convencionales para determinar la secuencia de ADN y de aminoácidos del anticuerpo particular.

25 El ADN puede reclonarse en un vector de expresión eucariota o procariota adecuado y transfectarse en un hospedador apropiado para la producción de grandes cantidades de proteína. El anticuerpo se purifica a partir del sistema de expresión usando procedimientos convencionales. La afinidad de unión del anticuerpo se confirma mediante inmunoensayos bien conocidos con el antígeno diana o actividad catalítica tal como se describe en Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988), Abelson, J. y Simon, M. (eds), Methods in Enzymology, combinatorial chemistry, vol. 267, San Diego: Academic Press (1996), Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (eds), Phage Display of peptides and Proteins, a Laboratory Manual, San Diego: Academic Press (1996).

35 En otra realización, se purifican por afinidad las partículas fágicas o fagos que muestran miembro del par de unión específico deseado del siguiente modo: aproximadamente de 103 -104 equivalentes de bibliotecas de partículas fágicas o fagos reaccionan durante toda la noche con 1 picogramo de anticuerpo purificado a 4 °C. La mezcla se criba mediante un procedimiento del siguiente modo. Se recubre una placa petri de poliestireno con 1 ml de solución de estreptavidina (1 mg/ml en NaHCO3 0,1 M, pH 8,6, NaN3 al 0,02 %) y se incuba durante toda la noche a 4 °C. Al siguiente día se retira la solución de estreptavidina. Se rellena la placa con 10 ml de solución de bloqueo (30 mg/ml de BSA, 3 microgramos/ml de estreptavidina en NaHCO3 0,1 M, pH 9,2, NaN3 al 0,02 %) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añaden dos microgramos de IgG de cabra anti-ratón biotinilada (BRL) a la biblioteca de anticuerpos con sometida a reacción con el anticuerpo y se incuba durante 2 horas a 4 °C. Inmediatamente antes del cribado, se retira la solución de bloqueo de la placa recubierta de estreptavidina y se lava la placa 3 veces con

45 TBS/Tween 20 al 0,05 %. Después, se añade la biblioteca que se somete a reacción con el anticuerpo a la placa y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. También pueden usarse esferas de agarosa recubiertas de estreptavidina (BRL) para esta purificación por afinidad. Se retira la solución de la biblioteca y se lava la placa diez veces con TBS/Tween 20 al 0,05 % a lo largo del periodo de 60 minutos. Se retira el fago unido mediante la adición de un tampón de elución (1 mg/ml de BSA, HCl 0,1 N, pH ajustado a 2,2 con glicina) a la placa petri y se incuba durante 10 minutos para disociar los complejos inmunitarios. Se retira el eluato, se neutraliza con Tris 2 M (pH sin ajustar) y se usa para infectar células bacterianas que contienen F' en la fase log. Estas células se siembran después en placas de agar LB que contienen tetraciclina (20 .mu.g/ml) y crecen durante toda la noche a 37 °C. Las partículas fágicas o los fagos se aíslan a partir de estas placas tal como se describe y el proceso de purificación por afinidad se repite durante dos o tres rondas. Después en la última ronda de purificación, se usa una porción del

55 eluato para infectar células y se siembra a baja densidad en placas de LB tetraciclina. Las colonias individuales se transfirieren a tubos de cultivo que contienen 2 ml de LB tetraciclina y crecen hasta la saturación. El ADN del fago o fagémido se aisla usando un método diseñado para la estación de trabajo Beckman Biomek (Mardis y Roe., Biotechniques, 7:840-850 (1989)) que emplea placas de microtitulación de 96 pocillos. Se secuencia El ADN monocatenario mediante el método didesoxi usando una Secuencia (U.S. Biochemicals) y un cebador oligonucleotídico de secuenciación (5'-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCT-3' SEC ID Nº: 2) que es complementario a la secuencia localizada a 40 nucleótidos 3' del segundo sitio de BstXI en fdTetB1.

Se consideran una serie de variables para abordar la construcción de una nueva biblioteca fágica de un tamaño muy grande; (i) el diseño de los cebadores se optimizó para la amplificación de conjuntos génicos variables para

65 mantener la máxima diversidad; (ii) se desarrolló un método de clonación en dos etapas muy eficaz para obtener una biblioteca virgen de gran tamaño (iii) se seleccionó un formato de anticuerpo y un vector de clonación

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

Claims (1)

1. imagen1