ES2235284T3 - Metodos para escrutar genotecas recombinantes. - Google Patents

Abstract

SE AISLAN SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PROTEINAS DE INTERES A PARTIR DE BIBLIOTECAS DE DNA UTILIZANDO UN BACTERIOFAGO PARA UNIR LA PROTEINA A LA SECUENCIA QUE LA CODIFICA. LAS BIBLIOTECAS DE DNA SE PREPARAN A PARTIR DE CELULAS QUE CODIFICAN LA PROTEINA DE INTERES Y SE INSERTAN EN O ADYACENTES A UNA PROTEINA DE LA CUBIERTA DE UN VECTOR BACTERIOFAGO, O EN UNA SECUENCIA QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE PUEDA ESTAR UNIDA POR MEDIO DE UN LIGANDO A UNA PROTEINA DE LA CUBIERTA DEL FAGO. MEDIANTE EL EMPLEO DE TECNICAS DE PURIFICACION POR AFINIDAD LAS PARTICULAS DE FAGO QUE CONTIENEN SECUENCIAS QUE CODIFICAN LA PROTEINA DESEADA PUEDEN SELECCIONARSE Y OBTENER A PARTIR DE ESTAS LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DESEADAS. ASI, POR EJEMPLO, PUEDEN PRODUCIRSE NUEVAS PROTEINAS TALES COMO ANTICUERPOS MONOCLONALES EVITANDO LA TECNOLOGIA DE HIBRIDOMAS CONVENCIONAL.

Description

Métodos para escrutar genotecas recombinantes.

Campo del invento

El presente invento se refiere en general a la tecnología del DNA recombinante y, más en particular, a métodos para escrutar genotecas de DNA en busca de secuencias de DNA que codifican proteínas de interés.

Antecedentes del invento

Aislar un gen que codifica una proteína deseada de una genoteca de DNA recombinante puede ser una tarea desalentadora. Las sondas de hibridación pueden facilitar el procedimiento, pero su empleo por lo general depende del conocimiento de al menos una porción de la secuencia del gen que codifica la proteína. En los casos en los que la secuencia no se conoce, se han expresado genotecas de DNA en un vector de expresión y se han utilizado anticuerpos para escrutar placas de lisis o colonias en busca del antígeno proteico deseado. Este procedimiento ha sido útil para escrutar genotecas pequeñas, pero secuencias que están representadas en una proporción menor que aproximadamente 1 clon de 10^{5} clones se pierden con facilidad, y escrutar genotecas mayores que 10^{6} clones puede ser difícil.

Las moléculas de anticuerpos están formadas por cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas, que tienen cada una de ellas una región variable (V) distinta, la combinación de las cuales produce una región de unión al antígeno. En base a los sucesos de combinaciones aleatorias de las cadenas pesadas y ligeras en una cualquiera de las células productoras de anticuerpos, el repertorio potencial de combinaciones de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos puede ser como mínimo 10^{12} o una cantidad mayor. Así pues, para tomar muestras de una fracción grande de este repertorio y obtener clones que expresen un anticuerpo que presenta una especificidad de unión a antígeno deseada, puede tener que construirse y escrutarse una genoteca extremadamente grande.

Huse W.D. y col. (1989), Science 146:1275-1281 informan sobre la preparación de genotecas de clonación de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en el fago lambda. Las cadenas de anticuerpos se ensamblan intracelularmente dentro del hospedador E. coli, independientemente de la formación de las partículas del fago.

Parmley S.F. y Smith G.P. (1988), Gene 73:305-318 instruyen sobre la presentación y el escrutinio de péptidos de una sola cadena situados sobre fagos de fusión.

Son necesarios métodos que faciliten el procedimiento de escrutinio, haciendo con ello posible que secuencias de DNA que codifican proteínas de interés, y en particular moléculas de anticuerpos, se identifiquen, reclonen y expresen con más facilidad. Que pueda disponerse de estos procedimientos, puede hacer posible hibridar con sondas un repertorio completo de anticuerpos de un animal, por ejemplo, para obtener un anticuerpo dirigido contra una molécula diana preseleccionada. De este modo pueden evitarse las dificultades y el procedimiento de trabajo intensivo para generar anticuerpos monoclonales, independientemente de la especie de origen, mediante la hibridación o transformación convencional de células linfoblastoides. De modo bastante sorprendente, el presente invento satisface estas y otras necesidades relacionadas.

El presente invento proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende efectuar la transformación de una célula hospedadora por medio de un vector bacteriofágico con (i) un primer miembro de las secuencias nucleotídicas de una genoteca de DNA fusionado a una secuencia que codifica una proteína de la cubierta del bacteriófago, y (ii) un segundo miembro de las secuencias nucleotídicas de dicha genoteca fusionado a una secuencia que codifica un péptido señal, de tal forma que la célula hospedadora es transformada con secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera; cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para que tengan lugar la expresión y el ensamblaje de partículas bacteriofágicas que presentan una colección de proteínas multicatenarias que comprenden las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras sobre la superficie externa de las partículas bacteriofágicas; seleccionar de la colección partículas bacteriofágicas que codifican las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de interés que se unen específicamente a una pareja en la unión de interés; reclonar los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés en un vector de expresión; y producir el anticuerpo o fragmento del mismo por medios recombinantes;

El método por lo tanto provee lo necesario para escrutar una genoteca de DNA en busca de secuencias nucleotídicas que codifican regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de interés. Los métodos, de modo general, implican unir físicamente las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés, en una forma biológicamente activa (que habitualmente presenta una actividad de unión), a las secuencias específicas de DNA que codifican esas cadenas. Esto permite el aislamiento e identificación de ese DNA por medio de técnicas de afinidad que dependen de la actividad de unión de la proteína de interés.

El invento utiliza métodos para escrutar una genoteca de DNA cuyos miembros están unidos a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de la cubierta de un vector bacteriofágico. El fago puede ser un fago filamentoso, tal como, por ejemplo, fd, fl, o M13. Típicamente las secuencias de la genoteca de DNA están insertadas en la región 5' de un gen que codifica una proteína de la cubierta del fago, tal como la pIII. De este modo, se produce una proteína de la cubierta del fago fusionada a una proteína codificada por un miembro de la genoteca de DNA y se ensambla en la partícula vírica. La segunda y cual(es)quiera otra(s) cadena(s) subsiguiente(s) se expresa(n) a partir del genoma del fago de forma que es(son) transportada(s) al periplasma, donde se ensamblan con la primera cadena que está fusionada a la proteína de la cubierta del fago, complejo que se asocia con la partícula de fago mientras la célula exista. Las partículas de fago que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés se seleccionan por medio de un ligando específico para la proteína.

Por medio del presente invento se proporcionan por lo tanto métodos para identificar convenientemente clones de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras deseadas producidas por métodos recombinantes. Un método de enriquecimiento por afinidad permite el escrutinio de genotecas para identificar clones que presentan las especificidades de ligandos deseadas, en el que hasta aproximadamente 10^{9} o más clones pueden ser fácilmente escrutados. Esto representa una importante mejora en la técnica, en la que los procedimientos convencionales típicamente permiten escrutar aproximadamente 10^{6} clones en una genoteca de DNA, a veces hasta 10^{7} clones pero con incrementos proporcionales en tiempo y trabajo.

En un aspecto el invento permite unir las regiones variables de las cadenas pesada y ligera deseadas al DNA que las codifica. Realizando luego un enriquecimiento con respecto a las cadenas, como por medio de técnicas de afinidad, por ejemplo, el DNA que codifica las cadenas también se enriquece y puede luego aislarse. El DNA así obtenido puede después clonarse y expresarse en otros sistemas, produciendo cantidades potencialmente grandes del anticuerpo o fragmento de unión del mismo deseados, o puede someterse a secuenciación y posterior clonación y a manipulaciones genéticas antes de su expresión.

La proteína con respecto a la que el DNA se enriquece y se clona según el presente invento, es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

El anticuerpo puede ser de cualquiera de los isotipos o subclases conocidas para una especie particular, y puede ser un complejo de unión de una única cadena o de dos cadenas o una porción del mismo. Por ejemplo, sólo las regiones variables de unión al antígeno de las cadenas pesadas (V_{H}) y/o ligeras (V_{L}), pueden identificarse y clonarse; los fragmentos de unión (F_{V}) o Fab codificados por ellas pueden de este modo encontrar utilización ya sea como fragmento de unión, unidos a las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras, o unidos a otras proteínas que presentan las funciones efectoras deseadas. Las características de los dominios de las regiones constantes dependerán en gran medida de la utilización que se quiera dar al anticuerpo, p. ej., aplicaciones diagnósticas y/o terapéuticas, anticuerpos catalíticos, etc.

Típicamente, la pareja en la unión de la proteína, es decir, un antígeno o un hapteno, es conocida, y los presentes métodos proporcionan un medio para crear y/o identificar un anticuerpo o fragmento de unión (y el DNA que codifica el anticuerpo o fragmento de unión) que se une específicamente a la pareja en la unión de interés. Así pues, el presente invento proporciona un nuevo medio para producir anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, dirigidos contra antígenos y determinantes antigénicos predeterminados, evitando de este modo el procedimiento laborioso, largo y a menudo impredecible, de la tecnología convencional sobre anticuerpos monoclonales. Aunque la producción de anticuerpos monoclonales de múridos suele ser relativamente directa, es un trabajo intensivo. Además, el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos aplicando estrategias convencionales ha sido entorpecido por diversas dificultades técnicas que, en gran medida, se evitarían por medio del presente invento.

De acuerdo con el presente invento, se prepara una genoteca de DNA a partir de células capaces de codificar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera deseadas. Existen diversas técnicas para preparar la genoteca, la cual puede prepararse a partir de DNA genómico o cDNA. Véase, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989. Se entiende que cuando aquí se hace referencia a DNA, se quiere decir que se incluye tanto DNA genómico como cDNA, salvo que se especifique lo contrario. Las células que sirven como fuente de RNA o DNA pueden ser cualesquiera de las células capaces de codificar la proteína de interés. Pueden emplearse procedimientos de enriquecimiento y medios para amplificar las regiones que contienen el(los) gen(es), si se conocen.

El RNA y el cDNA pueden prepararse a partir de células de bazo de animales no inmunizados, de animales inmunizados con antígenos o haptenos de interés, células de hibridoma, o células linfoblastoides, por ejemplo. El empleo de células de bazo procedentes de animales no inmunizados proporciona una mejor representación del repertorio de anticuerpos posibles, mientras que las células de bazo procedentes de animales inmunizados están enriquecidas en secuencias dirigidas contra epítopos del antígeno o haptenos inmunizantes. Las células pueden obtenerse a partir de diversas especies animales, tales como seres humanos, ratón, rata, lagomorfos, equinos, bóvidos, aves, etc., soliendo depender la selección de la proteína de interés y del empleo que se le quiere dar.

La amplificación de secuencias que representan RNA mensajero (mRNA) aisladas de células de interés, tales como células de bazo o de hibridoma, puede realizarse conforme a protocolos descritos en, p. ej., el documento U.S. 4.683.202, Orlandi, y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837 (1989), Sastry y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732 (1989), y Huse y col. Science 246: 1275-1281 (1989). Los cebadores oligonucleotídicos útiles en los protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerados o pueden incorporar inosina en las posiciones degeneradas. Así pues, los cebadores se utilizarían para la amplificación de secuencias que codifican las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras. En los cebadores pueden incorporarse secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción que permiten la clonación del fragmento amplificado en un vector en un marco de lectura predeterminado para su expresión.

Las genotecas de expresión que contienen el cDNA amplificado se preparan típicamente en un vector tal como un bacteriófago. Las características del bacteriófago adecuado dependen de la realización específica empleada, y serán por lo general aquellos bacteriófagos que permiten convenientemente la inserción del DNA recombinante en las células hospedadoras mediante empaquetamiento in vitro o mediante transformación genética, que infectan células hospedadoras capaces de expresar las proteínas deseadas, y cuyo DNA contiene sitios de restricción, útiles para la clonación, que están localizados en regiones del genoma del fago donde la inserción de DNA extraño no trastorna sustancialmente las funciones esenciales del fago.

También se describen métodos para lograr la recombinación eficiente de genotecas que codifican las cadenas proteicas de forma independiente, incluyendo el uso de sitios de clonación múltiples y poco comunes (p. ej., Not I y Sfi I) para subclonar secuencias de una genoteca en la otra; o utilizar vectores de fagos que existen en forma bicatenaria similar a la de los plásmidos en algún punto de su ciclo de vida (p. ej., el DNA en forma replicativa, "RF", de un fago filamentoso), y clonar las genotecas de forma independiente en diferentes versiones del vector que contienen diferentes sitios de clonación y diferentes marcadores que permiten su selección (Amp^{R} y Tet^{R}, por ejemplo). Las secuencias de las genotecas independientes se unen de tal forma que una secuencia de interés y un correspondiente marcador que permite la selección de cada genoteca reside en cada genoma individual de fago. La aplicación de una selección doble dará lugar al enriquecimiento en aquellos hospedadores que contengan los genomas de fago combinados. Alternativamente, según el presente invento, las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se pueden expresar a partir de plásmidos independientes.

También se describen métodos en los que los dominios de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se pueden expresar en el mismo polipéptido, unidos mediante una secuencia enlazadora flexible para formar un fragmento Fv de cadena única, secuencias génicas que se pueden clonar luego en el vector deseado. Tal como ha sido descrito en general en McCafferty y col., Nature 348:552-554 (6 de diciembre de 1990), los dominios V completos de un anticuerpo anti-lisozima, unidos por una secuencia enlazadora (Gly_{4}-Ser_{3}) flexible y clonados en el vector del fago fd fdCAT1 en la región del extremo N-terminal de la proteína del gen III, producen una fusión anticuerpo-gen III que se puede detectar en el fago recombinante. El fago recombinante se puede purificar por afinidad en una columna de lisozima-Sefarosa y a continuación experimentar un enriquecimiento adicional propagando el fago aislado.

En otra estrategia, una de ellas o tanto la cadena ligera como la pesada del anticuerpo (o las regiones V de las mismas) pueden ser expresadas por un fagémido, es decir, un vector que combina características de plásmidos, tales como un origen bacteriano de replicación ColE1, y bacteriófagos filamentosos, tales como la región intergénica principal. Los fagémidos se discuten de forma general en Sambrooke y col., supra, en las páginas 4.17-4.19 y 4.44-4.50.

El vector se puede mantener como un vector plasmídico pequeño mediante selección, o se puede empaquetar el plásmido de forma eficiente en viriones, o partículas de fagémido, mediante la infección con un fago auxiliar, tal como M13KO7. Tal como está descrito de forma general en Bass y col.; Proteins 8:309-314 (1990), controlar el número de copias de las proteínas de fusión del gen III que se producen en una mezcla tanto de proteína del gen III de tipo silvestre como de proteína de fusión del gen III en partículas de fagémidos permite el adecuado plegamiento de una proteína de fusión, permitiendo al mismo tiempo un eficiente "panning" (técnica que consiste en revestir una superficie con anticuerpos que reconocen antígenos o marcadores específicos, con el fin de seleccionarlos) de grandes genotecas de epítopos. Así, es posible seleccionar partículas de fagémidos cuyos péptidos son de una afinidad relativamente alta, con constantes de unión en el rango de micromolar a nanomolar.

Como se ha mencionado, los vectores pueden construirse por ingeniería genética para clonar de modo eficiente los productos de amplificación de la genoteca. Por ejemplo, pueden utilizarse oligonucleótidos para introducir sitios de restricción asimétricos, un sitio de unión a ribosomas situado a una distancia óptima para la expresión de la secuencia clonada, y sitios de clonación para los productos de amplificación de la genoteca.

Para enriquecer en y aislar fagos que contienen secuencias clonadas en una genoteca que codifican una proteína deseada, y así aislar finalmente esas mismas secuencias de ácido nucleico, los fagos recogidos de los restos celulares bacterianos se purifican por afinidad. Un ligando o pareja en la unión, específico para la proteína deseada clonada en la genoteca, se utiliza en la purificación por afinidad.

El antígeno o el determinante se utilizan para recuperar el fago que tiene la proteína deseada sobre su superficie externa o sobre una parte de ella. El ligando se adsorbe típicamente en un sustrato insoluble, tal como una partícula, bolita o placa. El fago así obtenido puede luego amplificarse infectando con él células hospedadoras. Pueden utilizarse rondas adicionales de enriquecimiento por afinidad, como mínimo de 10^{4} veces por ronda o más, y de amplificación, hasta que se alcanza el nivel deseado de enriquecimiento o hasta que ya no haya un enriquecimiento del fago diana con relación al fago de referencia.

El fago enriquecido que porta el anticuerpo puede también escrutarse con técnicas de detección adicionales tales como el alzado de las placas de lisis (o colonias) de expresión (véase, p. ej., Young y Davis, Science, 222:778-782 (1983)), para lo cual se utiliza como sonda la misma u otra pareja en la unión. El escrutinio puede emplear ensayos adicionales (de una actividad catalítica, por ejemplo) que se utilizan para detectar, in situ, placas de lisis que expresan proteínas que tienen las características deseadas. Con los fagos obtenidos con el protocolo de escrutinio se infectan células, se propagan, y el DNA de los fagos se aísla y se secuencia, y/o se reclona en un vector diseñado para la expresión del gen en procariotas o eucariotas, para obtener cantidades más grandes de la proteína particular seleccionada.

De acuerdo con el invento, la proteína deseada es transportada a un compartimento extra-citoplásmico de la célula hospedadora, tal como el periplasma bacteriano, pero en forma de una proteína de fusión con una proteína de la cubierta vírica. Una de las cadenas polipeptídicas se expresa fusionada a una proteína de la cubierta vírica, la cual se procesa y transporta a la membrana celular interna. La otra cadena se expresa con una secuencia conductora de la secreción y de este modo se transporta también al periplasma o a otra localización intracelular pero extra-citoplásmica. Las cadenas (p. ej., las cadenas ligeras y pesadas) presentes en el extra-citoplasma se ensamblan luego formando una proteína completa (o fragmento de unión de la misma). Las moléculas ensambladas terminan incorporadas en el fago en virtud de su unión a la proteína de la cubierta del fago cuando el fago es expulsado a través de la membrana del hospedador y las proteínas de la cubierta se ensamblan alrededor del DNA del fago. El fago que porta el complejo que lleva el anticuerpo puede luego escrutarse mediante un enriquecimiento por afinidad.

En esta realización, la síntesis y amplificación de los cDNA se prepara como se ha descrito anteriormente, y luego se clona en, o cerca de, una secuencia de un vector que codifica una proteína de la cubierta, en la que el vector es, o deriva de, un fago filamentoso, tal como f1, fd, Pf1, M13, etc. En una realización preferida, el fago filamentoso es fd-tet. El vector fágico se escoge de manera que contiene un sitio de clonación localizado en la región 5' de un gen que codifica una proteína de la cubierta del fago, tal como, por ejemplo, la proteína pIII de la cubierta. Un vector apropiado (p. ej., el fd-tet B1 que se describe más adelante) permite la clonación orientada de secuencias extrañas de manera que éstas se expresan en el extremo N-terminal de la proteína de cubierta madura, o cerca de él.

Se construye una genoteca clonando el cDNA (p. ej., de la región V_{H}) procedente de las células donantes en un sitio de clonación de un gen de una proteína de la cubierta (p. ej., el gen III, "gIII"). Las secuencias clonadas de, por ejemplo, los dominios V_{H}, se expresan finalmente en forma de polipéptidos o proteínas (de hasta aproximadamente 120 aminoácidos en el caso de la proteína V_{H}) fusionadas al extremo N-terminal de la proteína de cubierta madura presente sobre la superficie externa y accesible de las partículas ensambladas del fago. Aunque un fragmento peptídico grande situado cerca del extremo N-terminal de la proteína de la cubierta puede causar una disminución en la infectividad y/o en la producción del fago, en comparación con un fago con fragmentos mucho más pequeños situados de modo similar, los fragmentos más grandes puede aún así ser enriquecidos de modo efectivo por medio de los procedimientos que aquí se describen.

Algunos péptidos, debido a su tamaño y/o a su secuencia, pueden causar defectos graves en la infectividad de los fagos que los portan. Esto produce una pérdida de fagos en la población durante la reinfección y amplificación que siguen a cada uno de los ciclos de "panning". Para minimizar los problemas asociados con una infectividad defectuosa, el DNA preparado a partir del fago eluido se transforma en células hospedadoras mediante electroporación o mediante medios químicos muy conocidos. Las células se cultivan durante un período de tiempo suficiente para conseguir la expresión del marcador, y se aplica una selección como se hace típicamente en una transformación con DNA. Las colonias se amplifican, y los fagos se recogen como se describe más adelante para (una) posterior(es) ronda(s) de "panning".

El cDNA que codifica la(s) cadena(s) no clonada(s) en una proteína de la cubierta del fago, puede clonarse directamente en un sitio apropiado (como se describe más adelante) del vector que contiene la genoteca de los complejos formados por primera cadena-proteína de la cubierta; o, preferiblemente, la(s) siguiente(s) cadena(s) puede(n) clonarse en forma de una genoteca independiente en un vector plasmídico diferente, puede amplificarse, y posteriormente los fragmentos pueden instalarse en el vector de la genoteca de los complejos formados por primera cadena-proteína de la cubierta. Por ejemplo, cuando la primera cadena es una cadena pesada de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión, el destino final de la secuencia de cDNA de la cadena ligera V_{L} está en un DNA RF de un vector fágico que ya contiene una secuencia V_{H} en un gen correspondiente a una proteína de la cubierta, recombinando de este modo al azar secuencias V_{H} y secuencias V_{L} en un solo genoma de fago.

La segunda cadena o la cadena siguiente de la proteína multicatenaria deseada, como por ejemplo la V_{L}, se clona de manera que se expresa con una secuencia conductora del péptido señal que dirigirá su secreción al periplasma de la célula hospedadora. Por ejemplo, se ha demostrado que varias secuencias conductoras dirigen la secreción de secuencias de anticuerpos en E. coli, tales como las secuencias conductoras de OmpA (Hsiung, y col., Biotechnology 4:991-995 (1986)), pelB (Better, y col., Science 240:1041-1043 (1988)), phoA (Skerra y Pluckthun, Science 240:1038-1043 (1988)), y \beta-lactamasa (Zemel-Dreasen y Zamfir, Gene 27:315-322 (1984)).

El sitio de clonación de la siguiente cadena de cDNA debe estar situado de manera que no interfiera sustancialmente con la función normal del fago. Un locus de este tipo es la región intergénica descrita por Zinder y Boeke, Gene 19:1-10 (1982). La secuencia V_{L} se expresa preferiblemente a un nivel igual o superior que el producto V_{H}/pIII para mantener una concentración de V_{L} en el periplasma lo suficientemente alta para proporcionar un ensamblaje (asociación) eficiente de V_{L} con las cadenas V_{H}.

En general, la estrategia para una clonación correcta que utiliza una proteína de cubierta de un fago, como la pIII del fago filamentoso fd, proporcionará: (1) la expresión de una primera cadena polipeptídica, p. ej., la cadena V_{H}, fusionada al extremo N-terminal de una proteína de la cubierta de tamaño completo (o de tamaño casi completo (p. ej., pIII), y el transporte a la membrana interna del hospedador cuando el dominio hidrófobo presente en la región C-terminal de la proteína de la cubierta, ancla la proteína de fusión en la membrana, quedando el extremo N-terminal que contiene la cadena sobresaliendo en el espacio periplásmico, y disponible para la interacción con una segunda cadena o siguiente cadena (p. ej., la V_{L} para formar un fragmento F_{V} o Fab) que queda de este modo unida a la proteína de la cubierta; (2) la expresión adecuada de una segunda cadena polipeptídica o de una siguiente cadena polipeptídica si está presente (p. ej., V_{L}) y el transporte de esta cadena al compartimento soluble del periplasma; y (3) producirá de modo habitual, pero no necesariamente, una interferencia escasa o nula con la función normal del fago o con la viabilidad de la célula hospedadora.

El número de combinaciones posibles de cadenas ligeras y pesadas probablemente excede de 10^{12}. Tomar muestras de tantas combinaciones como sean posibles depende, en parte, de la capacidad para recuperar cantidades grandes de transformantes. Para los fagos con formas similares a plásmidos (como los fagos filamentosos), la electrotransformación proporciona una eficiencia comparable a la de la transfección del fago \lambda con empaquetamiento in vitro, además de una capacidad muy alta de entrada de DNA. Esto permite que se utilicen cantidades grandes de DNA del vector para obtener cantidades muy grandes de transformantes. El método descrito por Dower y col., Nucleic Acids Res., 16:6127-6145 (1988), puede utilizarse para transformar recombinantes derivados de fd-tet en proporción de aproximadamente 10^{7} transformantes/\mug de vector ligado en E. coli (como por ejemplo la cepa MC1061), y pueden construirse genotecas en fd-tet B1 de hasta aproximadamente 3 x 10^{8} miembros o más. Aumentando la entrada de DNA y realizando modificaciones en el protocolo de clonación dentro de la capacidad del técnico experto, se pueden producir aumentos mayores que aproximadamente 10 veces en la recuperación de los transformantes, proporcionando genotecas de hasta 10^{10} recombinantes o más.

Los transformantes se seleccionan mediante cultivo en un(os) antibiótico(s) apropiado(s) que, en el caso del vector fd-tet, es tetraciclina. Este cultivo puede hacerse sobre un medio de cultivo sólido o en un medio de cultivo líquido. Para el cultivo sobre un medio sólido, las células se cultivan a una densidad alta (de \sim10^{8} a 10^{9} tfs por m^{2}) sobre una superficie grande de, por ejemplo, L-agar que contiene el antibiótico selectivo para formar esencialmente un césped confluente. Las células y los fagos expulsados se raspan de la superficie, y los fagos se preparan para la primera ronda de "panning", esencialmente de la manera descrita por Parmley y Smith, Gene, 73:305-318 (1988). Para el crecimiento en un cultivo líquido, las células pueden cultivarse en caldo L y antibiótico a través de aproximadamente 10 o más repeticiones. Los fagos se recogen por medio de procedimientos estándar (véase Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning, 2ª ed. (1989), supra, para la preparación del fago M13) de la manera posteriormente modificada como se describe más adelante. El crecimiento en un cultivo líquido puede ser más conveniente debido al tamaño de las genotecas, mientras que el crecimiento sobre medios sólidos probablemente proporciona una menor oportunidad de un sesgo experimental durante el procedimiento de amplificación.

Para un enriquecimiento por afinidad de los clones deseados, aproximadamente de 10^{3} a 10^{4} equivalentes de genoteca (un equivalente de una genoteca es un equivalente de cada uno de los recombinantes -- 10^{4} equivalentes de una genoteca de 10^{9} miembros es 10^{9} x 10^{4} = 10^{13} fagos) se incuban con un hapteno (ligando) para el que se busca la proteína deseada. El hapteno está en una de las varias formas apropiadas para los esquemas de enriquecimiento por afinidad. En un ejemplo, el hapteno se encuentra inmovilizado sobre una superficie o partícula, generalmente anclado por medio de una ligadura de longitud suficiente (de 3 a 12 carbonos, por ejemplo) para sostener el hapteno lo suficientemente alejado de la superficie para permitir la libre interacción con el sitio de combinación con el anticuerpo. La genoteca de un fago que porta anticuerpos es luego sometida a "panning" sobre el hapteno inmovilizado, generalmente según el procedimiento descrito más adelante en la sección correspondiente al Ejemplo.

Un segundo ejemplo de presentación de un hapteno es un hapteno unido a un ligando reconocible (de nuevo con una ligadura de cierta longitud). Un ejemplo específico de un ligando de este tipo es la biotina. El hapteno, así modificado, se incuba con la genoteca de fagos y la unión tiene lugar con ambas sustancias reaccionantes presentes en la disolución. Los complejos resultantes se unen luego a estreptavidina (o avidina) a través del resto de biotina. La estreptavidina puede estar inmovilizada sobre una superficie, tal como una placa de plástico, o sobre partículas, en cualquiera de los casos los complejos (fago-anticuerpo-hapteno-biotina-estreptavidina) quedan retenidos físicamente; o la estreptavidina puede ir marcada, con un fluoróforo, por ejemplo, para etiquetar el fago activo/anticuerpo para su detección y/o aislamiento por medio de procedimientos de separación, p. ej., en un aparato de separación con una celda activada por fluorescencia.

Los fagos que portan anticuerpos sin la especificidad deseada se separan mediante lavado. El grado y la astringencia del lavado requerido se determinarán para cada una de las proteínas de interés. Puede ejercerse un cierto grado de control sobre las características de unión de los anticuerpos recuperados, ajustando las condiciones de la incubación en la que tiene lugar la unión y del lavado posterior. La temperatura, pH, fuerza iónica, concentración de cationes divalentes, y el volumen y duración del lavado, harán una selección de anticuerpos dentro de intervalos concretos de afinidad por el hapteno. Una selección basada en una velocidad de disociación lenta, que por lo general hace predecir una afinidad alta, es la vía más práctica. Esto puede realizarse ya sea mediante una incubación continuada en presencia de una cantidad saturante de hapteno libre, o aumentando el volumen, número y duración de los lavados. En cada uno de los casos, se impide la nueva unión del complejo anticuerpo-fago disociado, y con el aumento del tiempo, se recuperan complejos anticuerpo-fago de una afinidad cada vez más elevada.

Pueden aplicarse modificaciones adicionales de los procedimientos de unión y lavado para encontrar anticuerpos con características especiales. Las afinidades de algunos anticuerpos dependen de la fuerza iónica o de la concentración de cationes. Esta es una característica útil para anticuerpos que van a utilizarse en una purificación por afinidad de diversas proteínas cuando se requieren condiciones suaves para separar la proteína del anticuerpo. Ejemplos específicos los constituyen anticuerpos que dependen de Ca^{++} para la actividad de unión y que soltaron sus haptenos en presencia de EGTA. Véase Hopp y col., Biotechnology 6:1204-1210 (1988). Estos anticuerpos pueden identificarse en la genoteca de anticuerpos recombinantes mediante una técnica de doble escrutinio, aislando en primer lugar los anticuerpos que se unen al hapteno en presencia de Ca^{++}, e identificando después los anticuerpos de este grupo que no logran unirse en presencia de EGTA.

Puede hacerse un enriquecimiento en anticuerpos con determinadas actividades catalíticas, en grupos de anticuerpos con una elevada afinidad por las sustancias reaccionantes (sustratos y productos intermedios) pero con una baja afinidad por los productos. Un doble escrutinio para realizar un enriquecimiento en anticuerpos con estas características, puede ser útil para encontrar anticuerpos que catalizan determinadas reacciones. Además, también pueden seleccionarse anticuerpos catalíticos capaces de realizar determinadas reacciones de escisión. Una de las categorías de este tipo de reacciones es la escisión desde una molécula de un grupo terminal específico. Por ejemplo, un anticuerpo catalítico que escinde un aminoácido específico de un extremo de un péptido puede seleccionarse inmovilizando el péptido y realizando un "panning" de la genoteca de anticuerpos en condiciones que se espera promueven la unión pero no la escisión (p. ej., una temperatura baja, una fuerza iónica, un pH, una concentración de cationes concretos, etc, dependiendo de la naturaleza del grupo terminal y de la reacción de escisión), y seguido de un lavado. Esto permite a los anticuerpos que reconocen el grupo terminal, unirse y quedar inmovilizados, y en este grupo de anticuerpos entrarán los anticuerpos capaces de realizar la escisión. Para encontrar los anticuerpos capaces de realizar la escisión, las condiciones se cambian con respecto a aquellos anticuerpos favorables para realizar la escisión. Esta etapa liberará los complejos de anticuerpo-fago capaces de escindirse por sí mismos y quedar libres del péptido inmovilizado.

Un modo alternativo de llevar esto a cabo, es realizar un "panning" con respecto a anticuerpos que se unen al grupo terminal específico, uniendo ese grupo terminal a un enlace diferente del enlace que ha de escindirse (un enlace no peptídico, por ejemplo). Mediante un "panning" posterior (de los fagos positivos procedentes del primer escrutinio) realizado sobre el grupo terminal unido a través del enlace apropiado en condiciones de escisión, la fracción no unida se enriquecerá con respecto a los anticuerpos con la actividad catalítica deseada.

Para eluir el complejo de anticuerpo-fago activo desde el hapteno inmovilizado, después de lavar con la astringencia apropiada, el fago unido (activo) se recupera por lo general eluyendo con un cambio de pH. Por ejemplo, puede utilizarse pH 2 o pH 11, pH que luego se neutraliza, y el fago eluido se amplifica infectando o transformando las células hospedadoras. Como ejemplos de esos hospedadores están E. coli, MC1061-F'KAN o K91. Las células después se cultivan en forma de colonias resistentes a tetraciclina. Las colonias se recogen raspándolas y los fagos expulsados se purifican mediante procedimientos estándar como se ha expuesto anteriormente. Estos fagos se utilizan luego en otra ronda de enriquecimiento por afinidad ("panning"), y este ciclo se repite hasta que se alcanza el nivel de enriquecimiento deseado o hasta que el fago diana ya no se enriquece más con relación al fago de referencia. Rondas de "panning" repetidas y amplificaciones interpuestas pueden proporcionar niveles de enriquecimiento que exceden las 10^{7} veces. Para aislar clones individuales, con los fagos procedentes de la última ronda de "panning" y elución, se infectan células, o con su DNA se transforman células, y se cultivan sobre agar (generalmente L-agar) y antibióticos (generalmente tet) para formar colonias individuales perfectamente independientes, cada una de las cuales constituye un clon que porta genomas de fagos con ambas secuencias V_{H} y V_{L}. El DNA monocatenario de las partículas fágicas expulsadas procedentes de cada una de las colonias puede aislarse y el DNA que codifica los fragmentos V_{H} y V_{L} puede secuenciarse. La forma replicativa del DNA fágico (bicatenario) puede aislarse mediante medios estándar, y el DNA presente en los sitios de clonación (secuencias V_{H} y V_{L}) puede reclonarse en el interior de un vector diseñado para la expresión de un producto génico en procariotas o eucariotas, para obtener cantidades mayores de los anticuerpos particulares seleccionados en el procedimiento de escrutinio.

Los fagos identificados por poseer un anticuerpo reconocido por el ligando diana, se propagan del modo apropiado para el vector fágico particular utilizado. En el caso del fd-tet esto se hace en un cultivo líquido de un medio rico (caldo L, por ejemplo) con una selección por antibiótico (Tet). Los fagos se recogen y el DNA se prepara y se secuencia mediante métodos estándar para determinar la secuencia de DNA y de aminoácidos del anticuerpo particular.

El DNA puede reclonarse en un vector de expresión adecuado eucariótico o procariótico, y transfectarse en un hospedador apropiado para la producción de grandes cantidades de proteína. El anticuerpo se purifica del sistema de expresión utilizando procedimientos estándar. La afinidad de unión del anticuerpo se confirma mediante inmunoensayos muy conocidos con el antígeno diana o con una actividad catalítica, como se describe en Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

El siguiente ejemplo se ofrece a modo de ilustración, no a modo de limitación.

Ejemplo I

Este ejemplo describe un procedimiento para aislar un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, y de este modo aislar las secuencias nucleotídicas que codifican el anticuerpo. Se prepara una genoteca de expresión de inmunoglobulinas a partir de células de bazo de ratón, utilizando un fago filamentoso, el fd. Las cadenas pesadas del anticuerpo se expresan en forma de proteínas de fusión con la proteína de cubierta pIII. Las partículas fágicas que contienen el anticuerpo de la especificidad de unión deseada, se aíslan por medio de un procedimiento de "panning" utilizando el antígeno preseleccionado.

Construcción de vectores

Un vector bacteriofágico filamentoso, el fdTetB1, se construyó a partir del vector fdTet (Zacher y col., 1980) que transduce resistencia a tetraciclina. El sitio de clonación presente en fdTetB1 se construyó por ingeniería genética en la región N-terminal del gen III, y comprende dos sitios BstXI no complementarios, separados por 18 bases. Esto se realizó eliminando primero un sitio de restricción BstXI que ya estaba presente en la región TN10 del fdTet. El DNA RF se digirió con la endonucleasa de restricción BstXI, seguido de la adición de la polimerasa de T4 para eliminar los extremos protuberantes en las terminaciones 3'. Moléculas con extremos romos se ligaron luego y se electrotransformaron en el MC1061. El DNA RF se aisló procedente de varios transformantes resistentes a tetraciclina y se digirió con la endonucleasa de restricción BstXI. Un clon que no se había digerido con esta enzima se seleccionó para la inserción del sitio de clonación mediante mutagénesis dirigida a un sitio (Kunkel y col., Meth. Enzymol., 154:367-382 (1987)) con el oligonucleótido 5'-TATGAGGTTTTGCCAGACAACTGGAACAGTTTCAGCGGA GTGCCAGTAGAATGGAACAACTAAAGG-3'. La inserción de la secuencia mutagénica correcta se confirmó mediante una secuenciación con didesoxi del DNA RF que se aisló procedente de varios transformantes resistentes a tetraciclina.

Construcción de una genoteca de oligonucleótidos degenerados

Se construyó un vector fdTetBSN con el fin de contener un par de sitios SfiI no complementarios en la región TN10. Este sitio es el destino final de la casete de expresión de la genoteca de cadenas ligeras. El fdTetB1 se abrió por el sitio único HindIII. Dos oligonucleótidos complementarios, sintéticos, se trataron con quinasa y se reasociaron para formar la estructura:

1

Este oligo se ligó al sitio HindIII del fdTetB1 por métodos estándar. Una molécula correctamente ligada y circularizada no debería contener sitios HindIII, de manera que, después de desactivar la ligasa, la reacción se cortó de nuevo con HindIII para linearizar los plásmidos que no habían recibido un inserto. Este material se transformó luego en E. coli y se seleccionó sobre tetraciclina. La estructura de las moléculas resultantes se comprobó y se les designó fdTetBSN.

Para construir el vector fdTetSXNS, fdTetBSN se abrió en los sitios BstXI y un oligonucleótido, reasociado para proporcionar la siguiente estructura

2

se ligó a los sitios BstXI de fdBSN para proporcionar sitios únicos XhoI y SpeI para recibir los fragmentos de las cadenas pesadas.

El vector plasmídico pVL se construyó digiriendo el pUC19 con A1wNI y limando los extremos hasta hacerlos romos. Un sitio SfiI se introdujo ligando los oligonucleótidos reasociados

3

al sitio A1wNI hecho romo.

El sitio AatII de este pUC19 modificado se abrió y un fragmento que contenía la casete de expresión de la cadena ligera descrita por Huse y col., estaba flanqueado en el lado aguas abajo (con respecto a la transcripción) por un sitio SfiI de secuencia GGCCGGTCCGGCC. Este plásmido ahora contiene (en la dirección de las agujas del reloj) un sitio SfiI, un gen de \beta-lactamasa, un promotor lac Z, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de péptido señal pel B, sitio SacI, sitio XbaI, sitio(s) de terminación de la traducción, y sitio SfiI.

Construcción de las genotecas independientes de cadenas pesadas y ligeras

Se sintetizan secuencias de cDNA que representan los dominios de unión a antígeno de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, a partir de RNA de células productoras de anticuerpos, de la manera descrita por Huse y col., supra. Se utilizan células de bazo procedentes de ratones que han sido inmunizados con el antígeno preseleccionado al que se unen los anticuerpos deseados. El cDNA se amplifica por PCR utilizando cebadores que se reasocian con las regiones comunes a muchas secuencias de anticuerpos, que flanquean los dominios variables de unión a antígeno. Los cebadores contienen también secuencias de sitios de restricción apropiados, como se describe más adelante. Los fragmentos amplificados, bicatenarios, se digieren con las nucleasas de restricción apropiadas y se ligan a los sitios compatibles presentes en los respectivos vectores. En el caso de los fragmentos de las cadenas pesadas esto se realiza mediante la incorporación de sitios XhoI en los cebadores de 5' para PCR, y de sitios SpeI en los cebadores de 3'. Estos sitios quedan luego expuestos mediante una digestión y se ligan a los sitios correspondientes en el vector fdTetSXNS digerido. Los productos resultantes de la ligación se transformaron por electroporación en E. coli MC1061 y, después del crecimiento, se seleccionaron sobre tetraciclina.

En el caso de la genoteca de las cadenas ligeras, los fragmentos de las cadenas ligeras se amplifican con cebadores 5' para PCR que contienen sitios SacI, y con cebadores 3' que contienen sitios XbaI. Los sitios presentes en los fragmentos se abren y se ligan a los sitios correspondientes en el pVL. Los productos resultantes de la ligación se transforman luego por electroporación en E. coli MC1061. Después del crecimiento, los transformantes se recuperaron mediante selección sobre ampicilina.

Construcción de la genoteca de expresión combinada de cadenas ligeras y pesadas

DNA procedente de la genoteca de las cadenas ligeras (en pVL) se digirió con SfiI. El mayor de los dos fragmentos resultantes, que contiene la casete de expresión de una cadena ligera, se aísla y se liga en un exceso molar de varias veces con el DNA de la genoteca de cadenas pesadas (en fdTetSXNS) que ha sido digerido con SfiI. Los productos resultantes de la ligación se transforman por electroporación en células de E. coli MC1061. Después de un período de crecimiento, los transformantes se someten a una doble selección sobre ampicilina (100 \mug/ml) y sobre tetraciclina (20 \mug/ml). Los transformantes resultantes constituyen una genoteca combinada de fragmentos de cadenas pesadas y ligeras en el fdTetSXNS.

Los métodos de síntesis de cDNA, digestiones con enzimas de restricción, fosforilación de fragmentos, y ligación, son esencialmente como se describen en Sambrook y col., supra. En todos los casos, el DNA que ha de ser transformado se precipita en etanol en presencia de acetato sódico 0,3 M y se resuspende en agua. Las electrotransformaciones se realizan de la manera descrita por Dower y col., supra. Después de 1 hora de crecimiento no selectivo a 37ºC en medio SOC (Bactotriptona al 2%, Bacto extracto de levaduras al 0,5%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 M, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM), se extrae una alícuota y se siembran varias diluciones en placas LB que contienen el antibiótico apropiado (tetraciclina 20 \mug/ml, ampicilina 100 \mug/ml, o ambos). El resto de la transformación se utiliza para inocular un litro de caldo L que contiene el antibiótico apropiado, y se hace crecer varias veces para amplificar la genoteca. Los fagos se aíslan de este cultivo y se almacenan a 4ºC.

Aislamiento de los fagos

Se obtienen fagos purificados procedentes de los cultivos líquidos clarificando el sobrenadante dos veces por centrifugación, y precipitando las partículas fágicas con polietilenglicol (concentración final 3,3%, polietilenglicol 8000, NaCl 0,4 M). Después de la centrifugación, los sedimentos que contienen los fagos se resuspenden en TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) y se almacenan a 4ºC. Los fagos también se aíslan de esta manera procedentes de las existencias de placas, después de raspar las colonias de la superficie del agar y resuspenderlas en caldo L.

Purificación por afinidad

Una cantidad de fagos de aproximadamente 10^{3} - 10^{4} equivalentes de genoteca, se hacen reaccionar durante toda la noche con 1 \mug de anticuerpo purificado, a 4ºC. La mezcla se somete a "panning" mediante un procedimiento como el que se expone a continuación. Una placa de Petri de poliestireno, de 60 x 15 mm, se reviste con 1 ml de disolución de estreptavidina (1 mg/ml en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,6, NaN_{3} al 0,02%) y se incuba durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente la disolución de estreptavidina se extrae. La placa se llena con 10 ml de disolución de bloqueo (BSA 30 mg/ml, estreptavidina 3 \mug/ml en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 9,2, NaN_{3} al 0,02%) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añaden 2 microgramos de IgG anti-ratón, procedente de cabra, biotinilada (BRL) a la genoteca de fagos que reaccionan con el anticuerpo y se incuban 2 horas a 4ºC. Inmediatamente antes del procedimiento de "panning", la disolución de bloqueo se extrae de la placa revestida con estreptavidina, y la placa se lava tres veces con TBS/Tween® 20 al 0,05%. La genoteca de fagos que reaccionan con el anticuerpo se añade entonces a la placa y ésta se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. Para esta purificación por afinidad también pueden utilizarse bolitas de agarosa revestidas con estreptavidina (BRL). La disolución que contiene los fagos se extrae y la placa se lava diez veces con TBS/Tween® 20 al 0,05% a lo largo de un período de 60 minutos. Los fagos unidos se separan añadiendo un tampón de elución (BSA 1 mg/ml, HCl 0,1 N, pH ajustado a 2,2 con glicina) a la placa de Petri e incubando 10 minutos para disociar los inmunocomplejos. El eluido se separa, se neutraliza con Tris 2 M (pH no ajustado) y se utiliza para infectar células bacterianas que contienen F' en fase logarítmica. Estas células se siembran luego sobre placas de agar LB que contienen tetraciclina (20 \mug/ml), y se cultivan toda la noche a 37ºC. Los fagos se aíslan de estas placas de la manera descrita, y el procedimiento de purificación por afinidad se repitió de dos a tres rondas. Después de la última ronda de purificación, una porción del eluido se utiliza para infectar las células y se siembran a una densidad baja sobre placas de LB con tetraciclina. Colonias individuales se transfieren a tubos de cultivo que contienen 2 ml de medio LB y tetraciclina y se hacen crecer hasta alcanzar la saturación. El DNA de los fagos se aísla utilizando un método diseñado por la "Beckman Biomek® Workstation" (Mardis y Roe., Biotechniques, 7:840-850 (1989)) que emplea placas de microtitulación de 96 pocillos. El DNA monocatenario se secuencia mediante el método de los didesoxi utilizando Sequenase® (U.S. Biochemicals) y un cebador oligonucleotídico para la secuenciación (5'-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCT-3') que es complementario a la secuencia localizada a 40 nucleótidos en dirección 3' del segundo sitio BstXI presente en fdTetB1.

De lo anteriormente expuesto se evidencia que se proporcionan métodos que aumentan sustancialmente la capacidad para aislar secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas de anticuerpos de interés, procedentes de una genoteca grande de DNA. Esto es especialmente alentador, ya que estos métodos y composiciones pueden emplearse para recuperar o producir de novo muchas proteínas, y en particular anticuerpos monoclonales, útiles como composiciones terapéuticas o profilácticas, reactivos de diagnóstico, compuestos catalíticos, etc. que anteriormente se obtenían sólo mediante una experimentación extensiva, en caso de obtenerse. El presente invento proporciona un medio para evitar muchas de las dificultades asociadas con métodos tradicionales de la tecnología sobre anticuerpos monoclonales. Además, las proteínas identificadas por medio del presente invento, son producidas por medios recombinantes, proporcionando ventajas adicionales de, inter alia, conveniencia, pureza sustancial y aspectos económicos.

Aunque el anterior invento se ha descrito con cierto detalle por medio de una ilustración y un ejemplo con el propósito de aportar claridad en su comprensión, resultará obvio que pueden practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

1. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, que comprende:

(a) efectuar la transformación de una célula hospedadora por medio de un vector de expresión bacteriofágico, con (i) un primer miembro de las secuencias nucleotídicas de una genoteca de DNA fusionado a una secuencia que codifica una proteína de la cubierta del bacteriófago, y (ii) un segundo miembro de las secuencias nucleotídicas de dicha genoteca de DNA, fusionado a una secuencia que codifica un péptido señal, de tal forma que la célula hospedadora es transformada con secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera;

(b) cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para que tengan lugar la expresión y el ensamblaje de partículas bacteriofágicas que presentan una colección de proteínas multicatenarias que comprenden las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras sobre la superficie externa de las partículas bacteriofágicas;

(c) seleccionar de entre las partículas bacteriofágicas que presentan una colección de proteínas multicatenarias expresadas y ensambladas en la etapa (b) partículas bacteriofágicas que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés que se unen específicamente a una pareja en la unión de interés;

(d) reclonar los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés en un vector de expresión; y

(e) producir el anticuerpo o fragmento del mismo por medios recombinantes.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el vector bacteriofágico es un bacteriófago filamentoso, preferiblemente M13, fd o f1, más preferiblemente fd o un derivado del mismo.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína de la cubierta es pIII.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido señal es un péptido señal de Omp A, pel B, phoA, pIII o \beta-lactamasa.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células hospedadoras transformadas se lisan después de su cultivo y las partículas bacteriofágicas se seleccionan de los restos celulares; opcionalmente, en el que las partículas bacteriofágicas que codifican la proteína de interés se enriquecen repitiendo la etapa de selección al menos una vez.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho primer miembro de las secuencias nucleotídicas de la genoteca codifica una proteína que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que dicha región variable de cadena pesada de anticuerpo está localizada en el extremo amino de dicha proteína de la cubierta, sobre dicha superficie bacteriofágica.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que dicha proteína de la cubierta es una proteína de la cubierta pIII de tamaño completo.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer y el segundo miembro de la genoteca de DNA comprenden cDNA amplificado.

10. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el vector de expresión es un vector de expresión eucariótico, o un vector de expresión procariótico.

11. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es un fragmento de anticuerpo Fab que comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés.

12. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que las secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de interés se seleccionan tras múltiples rondas de las etapas (a), (b) y (c).

13. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que método comprende además la recombinación al azar de secuencias aisladas de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, para su transformación en dichas células hospedadoras.

14. Un método según cualquier reivindicación precedente, que comprende además la etapa de incorporar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo a una composición terapéutica, profiláctica o diagnóstica.