ES2527924T3 - Nuevas lipasas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 12.

Description

Nuevas lipasas y usos de las mismas.

Campo de la invención

La invención se refiere a una secuencia de polinucleótidos recién identificada que comprende un gen que codifica una nueva enzima lipolítica de Aspergillus niger. La invención presenta la secuencia de nucleótidos de longitud completa del nuevo gen, la secuencia de ADNc que comprende la secuencia codificadora de longitud completa de la nueva enzima lipolítica así como la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de longitud completa y equivalentes funcionales de las mismas. La invención también se refiere a métodos para usar estas enzimas en procedimientos industriales y métodos para diagnosticar infecciones fúngicas. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención y células en las que se modifica genéticamente una enzima lipolítica según la invención para mejorar su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención

Los productos horneados tales como pan se preparan a partir de una masa que normalmente se hace de los ingredientes básicos harina (trigo), agua y opcionalmente sal. Dependiendo de los productos horneados, otros ingredientes añadidos pueden ser azúcares, saborizantes, etcétera. Para productos leudados, principalmente se usa levadura de panadería junto a sistemas de leudado químico tales como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato.

Para mejorar las propiedades de manipulación de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados hay un continuo esfuerzo para desarrollar agentes auxiliares de elaboración con propiedades mejoradas. Se definen los agentes auxiliares de elaboración en la presente memoria como compuestos que mejoran las propiedades de manipulación de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados. Las propiedades de la masa que se pueden mejorar comprenden: mecanizabilidad, capacidad de retención de gases, pegajosidad reducida, elasticidad, extensibilidad, moldeabilidad, etcétera. Las propiedades de los productos horneados que se pueden mejorar comprenden: volumen de la barra de pan, carácter crujiente de la corteza, textura y suavidad de la miga, revenido relativo del sabor y tiempo de durabilidad. Estos agentes auxiliares de elaboración que mejoran la masa y/o el producto horneado se pueden dividir en dos grupos: aditivos químicos y enzimas (también referidas como enzimas para panadería).

Las levaduras, enzimas y aditivos químicos se añaden en general por separado a la masa. La levadura se puede añadir como una suspensión líquida, en una forma comprimida o como levadura seca activa (ADY) o levadura seca instantánea (IDY) (ambas por sus siglas en inglés). La diferencia entre estas formulaciones de levadura es el contenido de agua y de materia seca de levadura. La levadura líquida presenta un contenido de materia seca de levadura menor que 25% (p/v). La levadura en crema es una forma particular de levadura líquida y presenta un contenido en materia seca entre 17 y 23% (p/v). La levadura comprimida presenta un contenido de materia seca de levadura entre 25-35% (p/v) mientras las formulaciones de levadura seca presentan un contenido de materia seca de levadura entre 92-98% (p/v).

Se pueden añadir enzimas en una forma seca, por ej., granulada o en forma líquida. Los aditivos químicos se añaden en la mayoría de los casos en forma de polvo. También, las composiciones de agente auxiliar de elaboración que se adaptan a aplicaciones de horneado específicas, pueden constar de una mezcla dedicada de aditivos químicos y enzima.

La preparación de una masa a partir de los ingredientes y agentes auxiliares de elaboración descritos anteriormente es conocida en la técnica y comprende mezclar dichos ingredientes y agentes auxiliares de elaboración y una o más etapas de moldeado y fermentación.

La preparación de productos horneados de dichas masas es también conocida en la técnica y puede comprender moldeado y conformación y fermentación adicional de la masa seguido por horneado a las temperaturas y tiempos de horneado requeridos.

Los aditivos químicos con propiedades mejoradas comprenden agentes oxidantes tales como: ácido ascórbico, bromato y azodicarbonato, agentes reductores tales como L-cisteína y glutatión, emulsionantes que actúan como acondicionadores de la masa tales como (por sus siglas en inglés) ésteres diacetil tartáricos de mono/diglicéridos (DATEM), estearoil lactilato de sodio (SSL) o estearoil lactilato de calcio (CSL) o que actúan como suavizantes de la miga tales como monoestearato de glicerol (GMS), etcétera, materiales grasos tales como triglicéridos (grasa) o lecitina y otros.

Como resultado de una necesidad motivada por el consumidor de reemplazar los aditivos químicos por productos más naturales, se han desarrollado diversas enzimas para panadería con propiedades de mejora de la masa y/o el producto horneado y que se usan en todas las combinaciones posibles dependiendo de las condiciones específicas de aplicación de horneado. Enzimas adecuadas incluyen enzimas que degradan el almidón, enzimas que degradan el

arabinoxilano y otras hemicelulosas, enzimas que degradan la celulosa, enzimas oxidantes, enzimas que rompen el material graso, enzimas de degradación, modificación o reticulación de proteínas.

Las enzimas que degradan el almidón son por ejemplo enzimas endo-actuantes tales como alfa-amilasa, amilasa maltogénica, pullulanasa u otras enzimas desrramificadoras y enzimas exo-actuantes que separan por escisión glucosa (amiloglucosidasa), maltosa (beta-amilasa), maltotriosa, maltotetraosa y oligosacáridos superiores.

El arabinoxilano y otras enzimas que degradan la hemicelulosa son por ejemplo xilanasas, pentosanasas, hemicelulasa, arabinofuranosidasa, glucanasa y otras.

Enzimas que degradan la celulosa son por ejemplo celulasa, cellobiohidrolasa y beta-glucosidasa.

Enzimas oxidantes son por ejemplo glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfhidril oxidasa, lipoxigenasa, laccasa, polifenol oxidasas y otras.

Enzimas que rompen el material graso son por ejemplo enzimas lipolíticas tales como triacilglicerol lipasas, fosfolipasas (tales como A1, A2, B, C y D) y galactolipasas.

Enzimas de degradación, modificación o reticulación de proteínas son por ejemplo proteasas endo-actuantes (serina proteasas, metaloproteasas, aspartil proteasas, tiol proteasas), peptidasas exo-actuantes que separan por escisión un aminoácido o dipéptido, tripéptido, etcétera, de los extremos N-terminales (aminopeptidasas) o C-terminales (carboxipeptidasas) de la cadena de polipéptidos, enzimas desamidantes de asparaginas o glutamina tales como desamidasa y peptidoglutaminasa o enzimas reticulantes tales como transglutaminasa.

Se pueden producir convenientemente enzimas para panadería en microorganismos. Las enzimas microbianas para panadería están disponibles en una serie de fuentes; Bacillus spec, son una fuente común de enzimas bacterianas, mientras las enzimas fúngicas se producen comúnmente en Aspergillus spec.

Se pueden usar enzimas para panadería en una variedad de productos horneados. El término "productos horneados" se define en la presente memoria como que comprende productos de pan tales como: pan en lata, barras de pan, baguette así como panecillos, tartas, pasteles, magdalenas, rosquillas fermentadas con levadura y fermentadas químicamente y similares.

En los procedimientos anteriores, es ventajoso usar enzimas para panadería que se obtienen por técnicas de ADN recombinante. Dichas enzimas recombinantes presentan una serie de ventajas sobre sus equivalentes purificados de manera tradicional. Las enzimas recombinantes se pueden producir a un coste reducido, alto rendimiento, exentas de agentes contaminantes como bacterias o virus pero también exentas de toxinas bacterianas o contaminación de otras actividades enzimáticas.

Objeto de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polinucleótidos que codifiquen nuevas enzimas lipolíticas con propiedades mejoradas. Un objeto más es proporcionar enzimas lipolíticas producidas de manera natural y de manera recombinante así como cepas recombinantes que las producen. También son parte de la invención polipéptidos de fusión así como métodos para preparar y usar los polinucleótidos y polipéptidos según la invención.

También es un objeto de la invención proporcionar nuevas enzimas lipolíticas, que resuelvan al menos uno de los problemas ya mencionados o proporcionen nuevas enzimas lipolíticas, que presenten una o más propiedades mejoradas si se usan en masa y/o productos horneados, seleccionadas del grupo de fuerza mejorada de la masa, elasticidad mejorada de la masa, estabilidad mejorada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, mecanizabilidad mejorada de la masa, volumen mejorado del producto horneado, estructura mejorada de la miga del producto horneado, suavidad mejorada del producto horneado, sabor mejorado del producto horneado, anti-revenido mejorado del producto horneado, color mejorado del producto horneado, corteza mejorada del producto horneado o que presenten una amplia especificidad del sustrato.

Sumario de la invención

La invención proporciona nuevos polinucleótidos que codifican nuevas enzimas lipolíticas. Más en particular, se describen t polinucleótidos con una secuencia de nucleótidos que se hibrida preferiblemente en condiciones muy rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. Por consiguiente, la descripción proporciona ácidos nucleicos que son más de 40% tal como aproximadamente 60%, preferiblemente 65%, más preferiblemente 70%, incluso más preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogos a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38.

La invención proporciona dicho polinucleótido aislado obtenible de un hongo filamentoso, en particular se prefiere Aspergillus niger.

En una realización, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12.

En una realización preferida la invención proporciona un gen de enzima lipolítica de la SEC ID Nº 10. En otro aspecto la invención proporciona un polinucleótido, preferiblemente un ADNc que codifica una enzima lipolítica Aspergillus niger cuya secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12.

En una realización preferida el ADNc presenta una secuencia de SEC ID Nº 11.

En una realización incluso más preferida, la invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de SEC ID Nº 11.

La invención también se refiere a vectores que comprenden una secuencia de polinucleótidos según la invención. Se describe que se pueden usar cebadores, sondas y fragmentos para aumentar o detectar el ADN según la invención.

En una realización más preferida, se proporciona un vector en el que la secuencia de polinucleótidos según la invención se liga de manera funcional con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de la secuencia codificada de aminoácidos en una célula huésped adecuada, tal como Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. La invención también proporciona métodos para preparar polinucleótidos y vectores según la invención.

Se describen células huésped producidas de manera recombinante que contienen polinucleótidos heterólogos u homólogos según la invención.

En otra realización, la invención proporciona células huésped recombinantes en las que la expresión de una enzima lipolítica según la invención aumenta significativamente o en las que se aumenta la actividad de la enzima lipolítica.

En otra realización, la invención proporciona una célula huésped producida de manera recombinante que contiene polinucleótido heterólogo u homólogo según la invención y en la que la célula es capaz de producir una enzima lipolítica funcional según la invención, preferiblemente una célula capaz de sobreexpresar la enzima lipolítica según la invención, por ejemplo una cepa Aspergillus que comprende un número aumentado de copias de un gen o ADNc según la invención.

También se proporciona un polipéptido purificado. Es especialmente preferido un polipéptido de la SEC ID Nº 12.

De acuerdo con esto, en un aspecto la presente invención proporciona una composición de enzima lipolítica que contiene como ingrediente activo una enzima de la SEC ID Nº 12.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar productos horneados en los que se incorpora en la masa usada para preparar los productos horneados una o más enzimas de la SEC ID Nº 12.

También están dentro del alcance de la invención proteínas de fusión que comprenden un polipéptido según la invención. La invención también proporciona métodos para preparar los polipéptidos según la invención.

La invención también se refiere al uso de la enzima lipolítica según la invención en cualquier procedimiento industrial como se describe en la misma.

Descripción detallada de la invención

Una enzima lipolítica se define en la presente memoria como una enzima que presenta al menos una y preferiblemente dos o tres o cuatro o más de las siguientes actividades lipolíticas: triacilglicerol lipasa, fosfolipasa A1, fosfolipasa A2, fosfolipasa B, fosfolipasa C, fosfolipasa D, lisofosfolipasa y galactolipasa.

Polinucleótidos

La presente descripción proporciona polinucleótidos que codifican enzimas lipolíticas con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39 o equivalentes funcionales de las mismas. Las secuencias de los siete genes que codifican las enzimas lipolíticas NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 y NBE042, respectivamente, se determinaron por secuenciación de clones genómicos obtenidos a partir de Aspergillus niger. La descripción proporciona secuencias de polinucleótidos que comprenden los genes que codifican las enzimas lipolíticas NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 y NBE042 así como sus secuencias de ADNc completas y sus secuencias codificadoras (Tabla 1). De acuerdo con esto, los polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o equivalentes funcionales de las mismas se describen en la presente memoria.

Tabla 1.

enzima lipolítica

Secuencia (SEC ID Nº)

NBE xxx

genómica ADNc aminoácido

NBE028

1 2 3

NBE029

4 5 6

NBE030

7 8 9

NBE031

10 11 12

NBE032

13 14 15

NBE033

16 17 18

NBE034

19 20 21

NBE036

22 23 24

NBE038

25 26 27

NBE039

28 29 30

NBE043

31 32 33

NBE045

34 35 36

NBE042

37 38 39

La descripción se refiere a un polinucleótido aislado que se puede hibridar en condiciones rigurosas, preferiblemente en condiciones muy rigurosas, a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38. De manera ventajosa, dichos polinucleótidos se pueden obtener a partir de hongos filamentosos, en particular de Aspergillus niger. Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido aislado con una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 10,11.

Como se usa en la presente memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ej., una enzima lipolítica Aspergillus niger. Un gen puede incluir secuencias codificadoras, secuencias no codificadoras, intrones y secuencias reguladoras. Por otra parte, un gen se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada como se define en la presente memoria.

Una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o un equivalente funcional de la misma, se puede aislar usando técnicas de biología molecular clásicas y la información de las secuencias proporcionada en las mismas. Por ejemplo, usando todo o una porción de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 como una sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácidos nucleicos según la invención usando técnicas de hibridación y clonación clásicas (por ej., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2º, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1.989).

Por otra parte, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que incluye todo o una porción de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados basándose en la información de las secuencias contenidas en la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38.

Un ácido nucleico de la invención se puede multiplicar usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos apropiados según técnicas de multiplicación PCR clásicas. El ácido nucleico así multiplicado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar por análisis de secuencias de

ADN.

Además, se pueden preparar oligonucleótidos que corresponden a o que se puedan hibridar a secuencias de nucleótidos según la invención por técnicas sintéticas clásicas, por ej., usando un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 11. La secuencia de SEC ID Nº 11 corresponde a la región codificadora del gen Aspergillus niger proporcionado en la SEC ID Nº 10. Este ADNc comprende la secuencia que codifica el polipéptido NBE031 Aspergillus niger como se muestra en la SEC ID Nº 12.

Una molécula de ácido nucleico aislada descrita en la presente memoria comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 y 38 o un equivalente funcional de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico, que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos, es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos de manera que se pueda hibridar a la otra secuencia de nucleótidos formando de ese modo un dúplex estable.

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o un equivalente funcional de las mismas tales como un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de dichas moléculas de ácidos nucleicos adecuadas para uso como cebadores PCR para la multiplicación o mutación de moléculas de ácidos nucleicos. Un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo con las dos secuencias codificadoras con que está inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma que se encuentra en la naturaleza del organismo del que procede. Así, un ácido nucleico aislado incluye alguna o todas las secuencias no codificadoras 5' (por ej., promotoras) que están inmediatamente contiguas a la secuencia codificadora. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, en un plásmido o virus que se replica de manera autónoma o en el ADN genómico de una procariota o eucariota o que existe como una molécula separada (por ej., un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente exento de material celular, material vírico o medio de cultivo (cuando es producido por técnicas de ADN recombinante) o precursores químicos u otros productos químicos (cuando son sintetizados de manera química). Por otra parte, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza como un fragmento y no se encontraría en el estado natural.

Como se usa en la presente memoria, los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" se destinan a incluir moléculas de ADN (por ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ej., inosina o nucleótidos de fosforotioato). Dichos oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que presentan capacidades de apareamiento de bases modificadas

o resistencia aumentada a las nucleasas.

Errores de secuenciación

La información de las secuencias como se proporciona en la presente memoria no se debería interpretar de manera reducida en cuanto a requerir la inclusión de bases identificadas de manera errónea. Las secuencias específicas descritas en la presente memoria se pueden usar fácilmente para aislar el gen completo de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger que a su vez se puede someter fácilmente a análisis de secuencias adicionales identificando de ese modo los errores de secuenciación.

A menos que se indique de otro modo, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de ADN en la presente memoria se determinaron usando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en la presente memoria fueron previstas por traducción de una secuencia de ADN determinada como anteriormente. Por lo tanto, como se sabe en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por esta propuesta automatizada, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar más precisamente por otras propuestas incluyendo métodos de secuenciación de ADN manual es conocida en la técnica. Como también se sabe en la técnica, una sola inserción o supresión en una determinada secuencia de nucleótidos comparada con la secuencia real causará un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de manera que la secuencia de aminoácidos prevista codificada por una secuencia de nucleótidos determinada sea completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada en realidad por la molécula de ADN secuenciada, empezando en el punto de dicha inserción o supresión.

El experto en la materia puede identificar dichas bases identificadas de manera errónea y sabe cómo corregir dichos errores.

Fragmentos de ácidos nucleicos, sondas y cebadores.

Una molécula de ácido nucleico según la invención puede comprender sólo una porción o un fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 10, 11, por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o un cebador o un fragmento que codifica una porción de proteína según la invención. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen de enzima lipolítica y ADNc permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de enzimas lipolíticas, así como homólogos de enzimas lipolíticas de otras especies. La sonda/el cebador comprende típicamente el oligonucleótido purificado sustancialmente que comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida preferiblemente en condiciones muy rigurosas para al menos aproximadamente 12 ó 15, preferiblemente aproximadamente 18 ó 20, preferiblemente aproximadamente 22 ó 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia 10, 11 de nucleótidos.

Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria se pueden usar para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifiquen las mismas proteínas o proteínas homólogas por ejemplo en otros organismos. La sonda comprende además un grupo de etiqueta unido a la misma, por ej., el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Dichas sondas también se pueden usar como parte de un estuche de ensayo de diagnóstico para identificar células que expresen una proteína de enzima lipolítica.

Identidad y homología

Los términos "homología" o "porcentaje de identidad" se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Para el fin de esta invención, se define en la presente que para determinar el porcentaje de identidad dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptimos (por ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Los restos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos se comparan entonces. Cuando está ocupada una posición en la primera secuencia por el mismo resto aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones superpuestas) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

El experto conocerá el hecho de que están disponibles diversos programas informáticos diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1.970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250 y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El experto apreciará que todos estos diferentes parámetros proporcionarán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad completo de dos secuencias no se modifica de manera significativa cuando se usan algoritmos diferentes.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1.989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en: http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Hibridación

Como se usa en la presente memoria, el término "hibridar" se destina a describir condiciones para hibridación y lavado en que las secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 85% a 90%, más preferiblemente al menos 95% homólogas entre sí quedan típicamente hibridadas entre sí.

Un ejemplo no limitante, preferido, de dichas condiciones de hibridación son hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC, por sus siglas en inglés) x6 a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC x 1, SDS

al 0,1 % a50°C, preferiblemente a 55°C, preferiblemente a 60°C e incluso más preferiblemente a 65°C.

Condiciones muy rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridar a 68°C en SSC x5 / disolución de Denhardt x5/ SDS al 1,0% y lavar en SSC x 0,2 / SDS al 0,1% a temperatura ambiente. Alternativamente, se puede llevar a cabo lavado a 42°C.

El experto conocerá qué condiciones aplicar para condiciones de hibridación rigurosas y muy rigurosas. Hay guía adicional fácilmente disponible en la técnica teniendo en cuenta dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1.989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1.995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Obtención de ADN de longitud completa de otros organismos

En una propuesta típica, se pueden investigar bibliotecas de ADNc construidas a partir de otros organismos, por ej., hongos filamentosos, en particular de las especies Aspergillus.

Por ejemplo, se pueden investigar polinucleótidos homólogos en cepas Aspergillus por análisis Northern. En la detección de homólogos de transcripción a polinucleótidos según la invención, se pueden construir bibliotecas de ADNc a partir de ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas clásicas conocidas para los expertos en la materia. Alternativamente, se puede investigar una biblioteca de ADN genómico total usando una sonda que se pueda hibridar a un polinucleótido según la invención.

Se pueden aislar secuencias de genes homólogas, por ejemplo, realizando PCR usando dos conjuntos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados sobre la base de secuencias de nucleótidos como se explica en la presente memoria.

La plantilla para la reacción se puede obtener de ADNc por transcripción inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se conoce o se sospecha que se expresan en un polinucleótido según la invención. El producto PCR se puede subclonar y secuenciar para asegurar que las secuencias multiplicadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácidos nucleicos PLP03 o un equivalente funcional de las mismas.

El fragmento PCR se puede usar después para aislar un clon de ADNc de longitud completa por una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento multiplicado se puede etiquetar y usar para identificación sistemática de un bacteriófago o bibliotecas de ADNc cósmido. Alternativamente, el fragmento etiquetado se puede usar para identificación sistemática de una biblioteca genómica.

También se puede usar tecnología PCR para aislar secuencias de ADNc de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, se puede aislar ARN, siguiendo procedimientos clásicos, de una fuente celular o de tejido apropiada. Se puede realizar una reacción de transcripción inversa en el ARN usando un cebador de oligonucleótidos específico para la mayor parte de extremo 5' del fragmento multiplicado para el cebado de primera síntesis de cadena.

El híbrido de ARN/ADN resultante puede "tener cola" entonces (por ej., con guaninas) usando una reacción de transferasa terminal clásica, el híbrido se puede digerir con RNasa H, y se puede cebar después la segunda síntesis de cadena (por ej., con un cebador poli-C). Así, las secuencias de ADNc aguas arriba del fragmento multiplicado se pueden aislar fácilmente. Para una revisión de estrategias de clonación útiles, véase por ej., Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra.

Vectores

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína según la invención o un equivalente funcional del mismo. Como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en que se introducen (por ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales). Se integran otros vectores (por ej., vectores de mamíferos no episomales) en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y se replican de ese modo junto con el genoma huésped. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a que se ligan de manera operativa. Dichos vectores se refieren en la presente memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar de forma intercambiable en la presente memoria ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, se desea que la invención incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ej., retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación anormal), que sirven funciones equivalentes.

Un experto sabe cómo expresar una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo como se describe en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1.990).

Vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episomales y procedentes de virus por ej., vectores procedentes de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, virus papova, virus vaccinia, adenovirus, virus de cólera aviar, virus y retrovirus pseudorabies y vectores procedentes de combinaciones de los mismos, tales como los procedentes de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.

Se puede introducir ADN del vector en células procariotas o eucariotas por técnicas de transformación o transinfección convencionales. Como se usa en la presente memoria, los términos "transformación" y "transinfección" se destinan a referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ej., ADN) en una célula huésped, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transinfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transinfección o electroporación mediada por lípidos catiónicos. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transinfectar células huésped en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1.989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology

(1.986) y otros manuales de laboratorio.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias están pQE70, pQE60 y PQE-9, disponibles en Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos están PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 y pSG disponibles en Stratagene y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Otros vectores adecuados serán evidentes fácilmente para el experto.

Activadores bacterianos conocidos para uso en la presente invención incluyen activadores lacl y lacZ de E. coli, los activadores T3 y T7, el activador gpt, los activadores lambda PR, PL y el activador trp, el activador de la timidina cinasa de HSV, los activadores SV40 tempranos y tardíos, los activadores de los LTR retrovíricos, tales como los del virus del sarcoma de Rous ("RSV", por sus siglas en inglés) y activadores de metalotioneína, tales como el activador de metalotioneína-l de ratón.

El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, se puede añadir al extremo N del polipéptido una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos cargados, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la posterior manipulación y almacenamiento. También, se pueden añadir restos de péptidos al polipéptido para facilitar la purificación.

Polipéptidos según la invención

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 12, una secuencia de aminoácidos que se puede obtener por expresión del polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID Nº 10, 11, en un huésped apropiado. También, se describe un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos anteriores.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término se puede usar de forma intercambiable ya que el contexto requiere indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidilo. El término "polipéptido" se usa en la presente memoria para cadenas que contienen más de siete restos aminoácido. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en la presente memoria se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. El código de una letra de los aminoácidos usados en la presente memoria es comúnmente conocido en la técnica y se puede encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1.989).

Por polipéptido o proteína "aislados" se refiere un polipéptido o proteína retirados de su entorno natural. Por ejemplo, los polipéptidos y las proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el fin de la invención ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que han sido purificados sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación en una sola etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67: 31-40 (1.988).

La enzima lipolítica según la invención se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos conocidos incluyendo precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectinas. Lo más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC", por sus siglas en inglés) para purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de manera natural, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota, incluyendo por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glucosilados o pueden ser no glucosilados. Además, los polipéptidos de la

invención también pueden incluir un resto metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por huésped.

Se puede usar de manera ventajosa una enzima lipolítica según la invención en procedimientos de horneado. La cantidad de enzima que se tiene que añadir a la masa se determina de manera empírica. Puede depender de la calidad de la harina usada, el grado de mejora que se requiera, la clase de pan o productos horneados, el método de preparación de la masa, la proporción de otros ingredientes, etcétera.

Proteínas de fusión

Las proteínas de la presente invención o equivalentes funcionales de las mismas, por ej., porciones biológicamente activas de las mismas, se pueden ligar de manera operativa a un polipéptido de enzimas no lipolíticas (por ej., secuencias de aminoácidos heterólogos) para formar proteínas de fusión. Como se usa en la presente memoria, una "proteína quimérica " o "proteína de fusión" de enzima lipolítica comprende un polipéptido de enzimas lipolíticas ligado de manera operativa a un polipéptido de enzimas no lipolíticas. Un "polipéptido de enzimas lipolíticas " se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39, mientras un "polipéptido de enzimas no lipolíticas " se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la enzima lipolítica, por ej., una proteína que es diferente de la enzima lipolítica y que procede del mismo organismo o de uno diferente. Dentro de una proteína de fusión de enzimas lipolíticas el polipéptido de enzimas lipolíticas puede corresponder a todo o a una porción de una proteína de enzimas lipolíticas. Una proteína de fusión de enzimas lipolíticas comprende al menos un fragmento biológicamente activo de una proteína de enzima lipolítica. Una proteína de fusión de enzimas lipolíticas puede comprender al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína de enzimas lipolíticas. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado de manera operativa " se destina a indicar que el polipéptido de enzimas lipolíticas y el polipéptido de enzimas no lipolíticas se fusionan en el marco entre sí. El polipéptido de enzimas no lipolíticas se puede fusionar al extremo N o al extremo C del polipéptido de enzimas lipolíticas.

Se puede usar una secuencia señal para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención.

Preferiblemente, se produce una proteína quimérica o de fusión de la invención por técnicas de ADN recombinante clásicas. Por ejemplo, se ligan juntos en el marco fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos según técnicas convencionales, por ejemplo empleando los términos extremos romos o extremos escalonados para ligadura, digestión de enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, relleno de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable y ligadura enzimática. El gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la multiplicación PCR de fragmentos génicos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que den lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que con posterioridad se pueden hibridar y volver a multiplicar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Curren Protocolas in Molecular Biología, eds. Ausubel et al. John Giley & Son: 1.992). Por otra parte, están comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ej., un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico codificador de enzimas lipolíticas en dicho vector de expresión para que el resto de fusión se una en el marco a la proteína de enzimas lipolíticas.

Células huésped

En otra realización, la invención presenta células, por ej., células huésped transformadas o células huésped recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en que (o en un predecesor de la cual) se ha introducido, mediante técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico según la invención. Se incluyen células tanto procariotas como eucariotas, por ej., bacterias, hongos, levadura y similares, especialmente se prefieren células de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger.

Se puede elegir una célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y trate el producto génico de un modo deseado, específico. Dichas modificaciones (por ej., glucosilación) y tratamiento (por ej., escisión) de productos proteicos puede facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células huésped presentan mecanismos característicos y específicos para tratamiento postraduccional y modificación de proteínas y productos génicos. Las estirpes celulares apropiadas o los sistemas huésped familiares para los expertos en la materia de biología molecular y/o microbiología se pueden elegir para asegurar la modificación y el tratamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. Con este propósito, se pueden usar células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para tratar de manera apropiada la transcripción primaria, glucosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células huésped son conocidas en la técnica.

Las células huésped también incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares de mamíferos tales como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 y estirpes celulares del plexo coroideo.

Si se desea, los polipéptidos según la invención se pueden producir por una estirpe celular transinfectada de manera estable. Una serie de vectores adecuados para transinfección estable de células de mamíferos está disponible para el público, métodos para construir dichas estirpes celulares son conocidos también públicamente, por ej., en Ausubel et al. (supra).

Anticuerpos

La invención además presenta anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que unen de manera específica proteínas de enzimas lipolíticas según la invención.

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) significa que incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo (tal como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unir de manera específica la proteína de enzima lipolítica. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, liberado más rápidamente de la circulación y puede presentar menos unión de tejido no específico de un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1.983)). Así, se prefieren estos fragmentos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar por cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, las células que expresan la proteína de enzima lipolítica o un fragmento antigénico de la misma se pueden administrar a un animal para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de proteína de enzima lipolítica y se purifica para hacerla sustancialmente exenta de contaminantes naturales. Dicha preparación se introduce entonces en un animal para producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión de proteínas de enzimas lipolíticas de los mismos). Dichos anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature 256: 495 (1.975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1.976); Hammerling et al., En: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., págs. 563-681 (1.981)). Wands et al. (Gastro-enterology 80: 225-232 (1.981)). Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos procedentes de los sueros de los animales inmunizados.

Una vez producidos, se ensayan los anticuerpos policlonales o monoclonales para reconocimiento específico de una proteína según la invención o equivalente funcional de la misma en un inmunoensayo, tal como un análisis Western o análisis de inmunoprecipitación usando técnicas clásicas, por ej., como se describe en Ausubel et al., supra. Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína según la invención o equivalentes funcionales de los mismos son útiles en la invención. Por ejemplo, dichos anticuerpos se pueden usar en un inmunoensayo para detectar una proteína según la invención en cepas patógenas o no patógenas de Aspergillus (por ej., en extractos de Aspergillus).

Preferiblemente, se producen anticuerpos de la invención usando fragmentos de una proteína según la invención que parece probable que sean antigénicos, por criterios tales como alta frecuencia de restos cargados. Por ejemplo, dichos fragmentos se pueden generar por técnicas clásicas de PCR, y después se clonan en el vector de expresión pGEX (Ausubel et al., supra). Se pueden expresar después proteínas de fusión en E. coli y purificar usando una matriz de afinidad de glutatión agarosa como se describe en Ausubel, et al., supra. Si se desea, se pueden generar diversas fusiones (por ej., dos o tres) para cada proteína y se puede inyectar cada fusión en al menos dos conejos. Se pueden aumentar los antisueros por inyecciones en una serie, incluyendo típicamente al menos tres inyecciones reforzantes. Típicamente, se comprueba en los antisueros su capacidad para inmunoprecipitar la proteína según la invención o equivalentes funcionales de la misma mientras las proteínas no relacionadas pueden servir como un control para especificidad de la reacción inmunitaria.

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de EE.UU.

4.946.778 y 4.704.692) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena contra una proteína según la invención o equivalentes funcionales de la misma. Estuches para generar e identificar sistemáticamente bibliotecas que muestran fagos están comercialmente disponibles por ej., en Pharmacia.

Adicionalmente, se pueden encontrar ejemplos de métodos y reactivos susceptibles en particular de uso en la generación e identificación sistemática de una biblioteca que muestre anticuerpos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.223.409; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 92/18619; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 91/17271; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 20791; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 92/20791; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 92/15679; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 93/01288; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 92/01047; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 92/09690; Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1.991) Bio/Technology 9: 1.370-1.372; Hay et al. (1.992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1.989) Science 246; 1.275-1.281; Griffiths et al. (1.993) EMBO J. 12: 725-734.

Se pueden usar anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen específicamente a una proteína según la invención o equivalentes funcionales de la misma, por ejemplo, para detectar la expresión de un gen que codifica una

proteína según la invención o un equivalente funcional de la misma por ej., en otra cepa de Aspergillus.

Inmunoensayos

La determinación cualitativa o cuantitativa de un polipéptido según la presente invención en una muestra biológica puede tener lugar usando cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas basadas en anticuerpos proporcionan ventajas especiales para ensayar niveles de polipéptidos específicos en una muestra biológica.

En éstas, el reconocimiento específico es proporcionado por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) pero el sistema de detección secundario puede utilizar anticuerpos secundarios fluorescentes, de enzimas u otros conjugados. Como resultado, se obtiene un inmunocomplejo.

De acuerdo con esto, se describe un método para diagnosticar si está infectado un cierto organismo con Aspergillus que comprende las etapas de:

•

Aislar una muestra biológica de dicho organismo sospechoso de estar infectado con Aspergillus,

•

hacer reaccionar dicha muestra biológica con un anticuerpo según la invención,

•

determinar si se forman inmunocomplejos.

También se pueden extraer tejidos, por ej., con urea y detergente neutro, para la liberación de proteína para análisis Western o ensayo de punto/ranura. Esta técnica también se puede aplicar a fluidos corporales.

Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar una proteína según la invención incluyen inmunoensayos, tales como el inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

Las etiquetas de enzimas adecuadas incluyen, por ejemplo, las del grupo oxidasa, que cataliza la producción de peróxido de hidrógeno reaccionando con sustrato. La actividad de una etiqueta de oxidasa se puede ensayar midiendo la concentración de peróxido de hidrógeno formado por la reacción anticuerpo marcado con enzima/sustrato.

Además de las enzimas, otras etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos, tales como yodo (125l, 12ll), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112ln) y tecnecio (99mTc) y etiquetas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina y biotina.

Se puede detectar unión específica de un compuesto de ensayo a una proteína según la invención, por ejemplo in vitro inmovilizando de manera reversible o de manera irreversible la proteína según la invención sobre un sustrato, por ej., la superficie de un pozo de una placa de microtítulo de poliestireno de 96 pozos. Los métodos para inmovilizar polipéptidos y otras moléculas pequeñas son conocidos en la técnica.

La unión del compuesto de ensayo a los polipéptidos según la invención se puede detectar por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

Uso de enzimas lipolíticas en procedimientos industriales

La invención también se refiere al uso de la enzima lipolítica según la invención en una serie de procedimientos industriales seleccionada. A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procedimientos, la enzima lipolítica según la invención presenta una serie de ventajas significativas sobre las enzimas usadas en la actualidad. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos como costes de producción inferiores, mayor especificidad hacia el sustrato, menos actividades antigénicas, menos actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, mejores sabores del producto final así como calidad alimenticia y aspectos kosher.

La presente invención también se refiere a métodos para preparar una masa o un producto horneado que comprende incorporar a la masa una cantidad eficaz de una enzima lipolítica de la presente invención que mejore una o más propiedades de la masa o el producto horneado obtenido a partir de la masa en relación a una masa o un producto horneado en que no se incorpora el polipéptido.

La expresión "incorporar a la masa" se define en la presente memoria como añadir la enzima lipolítica según la invención a la masa, cualquier ingrediente del que se tiene que hacer la masa y/o cualquier mezcla de ingredientes de la masa a partir de los cuales se tiene que formar la masa. En otras palabras, la enzima lipolítica según la invención se puede añadir en cualquier etapa de la preparación de la masa y se puede añadir en una, dos o más etapas. La enzima lipolítica según la invención se añade a los ingredientes de una masa que se amase y se hornee para hacer el producto horneado usando métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.567.046, la patente europea EP-A-426.211, las patentes japonesas JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 y JP-A-63-258528.

El término "cantidad eficaz" se define en la presente memoria como una cantidad de la enzima lipolítica según la invención que es suficiente para proporcionar un efecto medible sobre al menos una propiedad de interés de la masa y/o producto horneado.

El término "propiedad mejorada" se define en la presente memoria como cualquier propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, en particular un producto horneado, que se mejora por la acción de la enzima lipolítica según la invención relativa a una masa o un producto en que no se incorpora la enzima lipolítica según la invención. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a, resistencia mejorada de la masa, elasticidad mejorada de la masa, estabilidad mejorada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, sabor mejorado del producto horneado, anti-revenido mejorado del producto horneado.

Se puede determinar la propiedad mejorada por comparación de una masa y/o un producto horneado preparado con y sin adición de un polipéptido de la presente invención según los métodos de la presente invención se describen a continuación en los Ejemplos. Las cualidades organolépticas se pueden evaluar usando procedimientos establecidos en la industria de la panadería y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de comprobadores de sabor especializados.

El término "fuerza mejorada de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que presenta en general más propiedades elásticas y/o requiere más entrada de trabajo para moldear y conformar.

El término "elasticidad mejorada de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que presenta una mayor tendencia a recuperar su forma original después de ser sometido a una cierta deformación física.

El término "estabilidad mejorada de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que es menos susceptible de abuso mecánico manteniendo mejor así su forma y volumen.

El término "pegajosidad reducida de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que presenta menos tendencia a adherirse a superficies, por ej., en la maquinaria de producción de masa y es evaluada de manera empírica por el panadero de ensayo experto o es medida por el uso de un analizador de la textura (por ej., TAXT2) como se sabe en la técnica.

El término "extensibilidad mejorada de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que se puede someter a deformación o estiramiento mejorados sin ruptura.

El término "mecanizabilidad mejorada de la masa" se define en la presente memoria como la propiedad de una masa que es en general menos pegajosa y/o más firme y/o más elástica.

El término "volumen mejorado del producto horneado" se mide como el volumen específico de una barra de pan dada (volumen/peso) determinado típicamente por el método de desplazamiento de colza tradicional.

El término "estructura mejorada de la miga del producto horneado" se define en la presente memoria como la propiedad de un producto horneado con paredes celulares más finas y/o más delgadas en la miga y/o distribución más uniforme/homogénea de las células en la miga y se evalúa normalmente de manera empírica por el panadero de ensayo experto.

El término "suavidad mejorada del producto horneado" es el opuesto de "firmeza" y se define en la presente memoria como la propiedad de un producto horneado que se comprime más fácilmente y se evalúa de manera empírica por el panadero de ensayo experto o se mide por el uso de un analizador de textura (por ej., TAXT2) como se sabe en la técnica.

El término "sabor mejorado del producto horneado" se evalúa por un equipo de pruebas especializado.

El término "anti-revenido mejorado del producto horneado" se define en la presente memoria como las propiedades de un producto horneado que presenta una velocidad reducida de deterioro de parámetros de calidad, por ej., suavidad y/o elasticidad, durante el almacenamiento.

El término "masa" se define en la presente memoria como una mezcla de harina y otros ingredientes suficientemente firme para amasar o enrollar. La masa puede ser fresca, congelada, pre-desnuda o pre-horneada. La preparación de masa congelada se describe por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

El término "producto horneado" se define en la presente memoria como cualquier producto preparado a partir de una masa, de un carácter suave o uno crujiente. Ejemplos de productos horneados, sean de un tipo blanco, claro u oscuro, que se pueden producir de manera ventajosa por la presente invención son pan (en particular pan blanco, integral o de centeno), típicamente en forma de barras o panecillos, pan de tipo baguette, pasta, pan de pita, tortillas, tacos, tartas, panqueques, galletas, cookies, tapas de masa, pan al vapor y pan crujiente y similares.

La enzima lipolítica de la presente invención y/o enzimas adicionales que se tienen que usar en los métodos de la presente invención pueden ser de cualquier forma adecuada para el uso en cuestión, por ej., en forma de un polvo

seco, polvo aglomerado o granulado, en particular un granulado no suelto, líquido, en particular un líquido estabilizado

o enzima protegida tal como se describe en las patentes internacionales WO 01/11974 y WO 02/26044. Los granulados y los polvos aglomerados se pueden preparar por métodos convencionales, por ej., pulverizando la enzima lipolítica según la invención sobre un portador en un granulador de lecho fluido. El portador puede consistir en núcleos en forma de partículas con un tamaño de partícula adecuado. El portador puede ser soluble o insoluble, por ej., una sal (tal como NaCI o sulfato de sodio), azúcar (tales como sacarosa o lactosa), alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz o soja. La enzima lipolítica según la invención y/o enzimas adicionales pueden estar contenidas en formulaciones de liberación lenta. Los métodos para preparar formulaciones de liberación lenta son conocidos en la técnica. Añadir estabilizantes nutricionalmente aceptables tales como azúcar, alcohol de azúcar u otro poliol y/o ácido láctico u otro ácido orgánico según métodos establecidos pueden estabilizar, por ejemplo, preparaciones de enzimas líquidas.

La enzima lipolítica según la invención también se puede incorporar en composiciones que comprenden levadura tal como se describe en las patentes europeas EP-A-0619947, EP-A-0659344 y la patente internacional WO 02/49441.

Para inclusión en premezclas de harina es ventajoso que el polipéptido según la invención esté en la forma de un producto seco, por ej., un granulado no suelto, mientras para inclusión junto con un líquido está de manera ventajosa en una forma líquida.

También se puede incorporar una o más enzimas adicionales a la masa. La enzima adicional puede tener cualquier origen, incluso de mamífero y planta y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, levadura o fúngico) y se puede obtener por técnicas usadas en la técnica de manera convencional.

La enzima adicional puede ser una amilasa, tal como una alfa-amilasa (útil para proporcionar azúcares fermentables por levadura y retardar el revenido) o beta-amilasa, ciclodextrina glucanotransferasa, peptidasa, en particular, una exopeptidasa (útil en la mejora del sabor), transglutaminasa, lipasa (útil para la modificación de lípidos presentes en la masa o constituyentes de la masa de manera que se ablande la masa), fosfolipasa, celulasa, hemicelulasa, en particular una pentosanasa tal como xilanasa (útil para la hidrólisis parcial de pentosanos que aumenta la extensibilidad de la masa), proteasa (útil para debilitar el gluten en particular cuando se usa harina de trigo duro), proteína disulfuro isomerasa, por ej., una proteína disulfuro isomerasa, como se describe en la patente internacional WO 95/00636, glucosiltransferasa, peroxidasa (útil para mejorar la consistencia de la masa), laccasa u oxidasa, por ej., una glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, aldosa oxidasa, piranosa oxidasa, lipoxigenasa o L-aminoácido oxidasa (útil para mejorar la consistencia de la masa).

Cuando se tienen que añadir una o más actividades enzimáticas adicionales según los métodos de la presente invención, estas actividades se pueden añadir por separado o junto con el polipéptido según la invención, opcionalmente como constituyente o constituyentes de la composición que mejora el pan y/o que mejora la masa. Las otras actividades enzimáticas pueden ser cualesquiera de las enzimas descritas anteriormente y se pueden dosificar según prácticas de horneado establecidas.

La presente invención se refiere también a métodos para preparar un producto horneado que comprende hornear una masa obtenida por un método de la presente invención para producir un producto horneado. El horneado de la masa para producir un producto horneado se puede realizar usando métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también se refiere a masas y productos horneados, respectivamente, producidos por los métodos de la presente invención.

La presente descripción se refiere además a una premezcla, por ej., en forma de una composición de harina, para masa y/o productos horneados hechos a partir de la masa, en que la premezcla comprende un polipéptido de la presente invención. El término "pre-mezcla" se define en la presente memoria para que se entienda en su significado convencional, es decir, como una mezcla de agentes de horneado, generalmente incluyendo harina, que se puede usar no sólo en plantas/instalaciones de horneado del pan industriales, sino también en panaderías minoristas. La premezcla se puede preparar mezclando el polipéptido o una composición que mejora el pan y/o que mejora la masa de la invención que comprende el polipéptido con un portador adecuado tal como harina, almidón, un azúcar o una sal. La premezcla puede contener otros aditivos que mejoran la masa y/o que mejoran el pan, por ej., cualquiera de los aditivos, incluyendo enzimas, mencionados anteriormente.

La presente invención se refiere además a aditivos de horneado en la forma de un granulado o polvo aglomerado, que comprende un polipéptido de la presente invención. El aditivo de horneado presenta preferiblemente una distribución de tamaño de partícula estrecha con más de 95% (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 µm.

En la preparación de la masa y pan se puede usar la presente invención junto con los agentes auxiliares de elaboración definidos anteriormente tales como los agentes auxiliares de elaboración químicos como oxidantes (por ej., ácido ascórbico), agentes reductores (por ej., L-cisteína), oxidorreductasas (por ej., glucosa oxidasa) y/u otras enzimas tales como enzimas que modifican polisacáridos (por ej., α-amilasa, hemicelulasa, enzimas ramificantes, etc.) y/o enzimas que modifican proteínas (endoproteasa, exoproteasa, enzimas ramificantes, etc.).

Ejemplo 1

Fermentación de Aspergillus niger

Las enzimas lipolíticas codificadas por la secuencia de nucleótidos como se proporciona en la presente memoria se obtuvieron por construcción de plásmidos de expresión que contenían las secuencias de ADN, transformando una cepa A. niger con este plásmido y cultivando las cepas Aspergillus niger de la siguiente manera de la siguiente manera.

Se inocularon esporas frescas (106-107) de A. niger en 20 ml de medio CSL (matraz de 100 ml, deflector) y se cultivaron durante en 20-24 horas a 34°C y 18 rad/s (170 rpm). Después de inoculación de 5-10 ml de precultivo de

CSL en 100 ml de medio CSM (matraz de 500 ml, deflector) se fermentaron las cepas a 34°C y 18 rad/s (170 rpm) durante 3-5 días.

Se obtuvieron sobrenadantes exentos de células por centrifugación en tubos Greiner de 50 ml (30 minutos, 524 rad/s

(5.000 rpm)). Los sobrenadantes se pre-filtraron por un filtro de microfibra de Vidrio GF/A Whatman (150 mm AE) para retirar las partículas más grandes, se ajustaron a pH 5 con KOH 4 N (si es necesario) y se filtró estéril por un filtro de 0,2 µm (parte superior del frasco) con succión para retirar el material fúngico. Los sobrenadantes se almacenaron a 4

°C (o -20°C).

El medio CSL consistió en (en cantidad por litro): 100 g de Sólidos de Maceración de Maíz (Roquette), 1 g de NaH2PO4*H2O, 0,5 g de MgSO4*7H2O, 10 g de glucosa*H2O y 0,25 g de Basildon (antiespumante). Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada y el pH se ajustó a pH 5,8 con NaOH o H2SO4; se llenaron matraces de 100

ml con deflector y bola de espuma con 20 ml de caldo de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120°C después de lo cual se añadieron 200 µl de una disolución que contenía 5.000 Ul/ml de penicilina y 5 mg/ml de Estreptomicina a cada matraz después de enfriamiento a temperatura ambiente.

El medio CSM consistió en (en cantidad por litro): 150 g de maltosa*H2O, 60 g de Soytone (peptona), 1 g de NaH2PO4*H2O, 15 g de MgSO4*7H2O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (antiespumante), 20 g de MES, 1 g de L-arginina. Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada y se ajustó el pH a pH 6,2 con NaOH o H2SO4; se llenaron matraces de 500 ml con deflector y bola de espuma con 100 ml de caldo de fermentación y se esterilizaron

durante 20 minutos a 120°C después de lo cual se añadió 1 ml de una disolución que contenía 5.000 Ul/ml de penicilina y 5 mg/ml de Estreptomicina a cada matraz después de enfriamiento a temperatura ambiente.

Ejemplo 2

Purificación de las enzimas lipolíticas de la invención

Etapa 1 -Preparación de ultrafiltrados

Se ultrafiltraron los sobrenadantes de los cultivos, como se obtuvieron en el Ejemplo 1, para retirar las contaminaciones de bajo peso molecular que podían interferir con las determinaciones de la actividad enzimática y los ensayos de horneado. Se llevó a cabo ultrafiltración de 30 ml de sobrenadante en un sistema Millipore Labscale TFF provisto de un filtro con un corte de 10 kDa.

Dependiendo de su color, se lavaron las muestras 3-5 veces con volúmenes de 40 ml de tampón de fosfato 100 mM frío, pH 6,0, incluyendo CaCI2 0,5 mM. El volumen final de la disolución enzimática fue 30 ml y se refirió además como "ultrafiltrado".

Etapa 2 -Determinación de la concentración de enzimas lipolíticas por A280 y HPSEC.

La concentración de las enzimas lipolíticas en el ultrafiltrado se calculó a partir de la extinción a 280 nm (A280) atribuible a las enzimas lipolíticas y el coeficiente de extinción molecular calculado de las enzimas lipolíticas. La medición de la A280 se realizó en un espectrofotómetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Países Bajos).

El coeficiente de extinción molecular de una enzima se puede calcular a partir del número de restos tirosina, triptófano y cisteína por molécula de enzima (S. C. Gill y P. H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1.989)). El coeficiente de extinción molecular de estos aminoácidos fue 1.280, 5.690 y 120 M-1.cm-1, respectivamente. El número de restos tirosina, triptófano y cisteína en las enzimas lipolíticas de la invención se puede deducir de las secuencias de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la SEC ID Nº 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39. Los coeficientes de extinción calculados de las enzimas lipolíticas de la invención se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2

Enzima lipolítica

SEC ID Nº # aminoácidos P. M. calculado (Da) Coeficiente de extinción calculado a 280 nm

Trp

Tyr Cys M-1.cm -1 (1 mg/ml)-1. cm -1

NBE028

3 13 26 6 64141 107970 1,7

NBE029

6 14 27 6 63250 114940 1,8

NBE030

9 17 26 6 59952 130730 2,2

NBE031

12 9 27 4 61173 86250 1,4

NBE032

15 3 13 6 29683 34430 1,2

NBE033

18 7 24 2 44890 70790 1,6

NBE034

21 11 19 7 53796 87750 1,6

NBE036

24 10 23 7 64945 87180 1,3

NBE038

27 13 29 4 55161 111570 2,2

NBE039

30 11 26 6 59298 96590 1,6

NBE043

33 16 35 8 62564 136800 2,2

NBE045

36 0 6 6 26688 8400 0,31

NBE042

39 14 30 7 61593 118900 1,9

La A280 en el ultrafiltrado atribuible a la enzima lipolítica de la invención se obtuvo a partir de la razón de la superficie del pico del respectivo pico de la enzima lipolítica en el cromatograma y la superficie total de los picos que absorben a

La extinción del ultrafiltrado a 280 nm (A280) que es atribuible a las enzimas lipolíticas depende de la pureza de la muestra enzimática. Esta pureza se determinó usando HPSEC (Cromatografía de Exclusión por Tamaños de Alta

5 Realización) con una columna TSK SW-XL (300*7,8 mm; intervalo de P. M. 10-300 kDa). El tampón de elución consistió en tampón de fosfato de sodio 25 mM pH 6,0 y se usó a un caudal de 1 ml/min. Se inyectaron muestras de 5-100 µl. Se midió la absorbancia a 280 nm.

10 280 nm. La concentración de enzima lipolítica en el ultrafiltrado se calculó después multiplicando la A280 del ultrafiltrado por la razón descrita anteriormente y dividido por el coeficiente de extinción calculado (1 mg/ml de disolución -Tabla 2 columna más a la derecha) para cada enzima lipolítica.

Ejemplo 3

Mediciones de actividad.

15 Los sobrenadantes exentos de células obtenidos en el Ejemplo 1 se sometieron a los ensayos de lipasa, fosfolipasa y galactolipasa como se resume en la Tabla 3.

Tabla 3. Actividades de las enzimas lipolíticas en los sobrenadantes exentos de células como se prepararon en el Ejemplo 1.

Enzima lipolítica

Lipasa fosfolipasa A lisofosfolipasa galactolipasa

NBE028

+ + + 0

NBE029

+ + + 0

(continuación)

Enzima lipolítica

Lipasa fosfolipasa A lisofosfolipasa galactolipasa

NBE031

+++ + + +

NBE032

++ + + 0

NBE033

+ ++ + +

NBE034

0 + 0 0

NBE036

0 + + 0

NBE038

0 + 0 0

NBE039

+ 0 0 0

NBE043

+ 0 0 0

0 = no diferente del blanco; +/++/+++ = mayor que el blanco;

Se determinó la actividad de lipasa de manera espectrofotométrica usando 2,3-mercapto-1-propanol-tributirato (TBDMP) como un sustrato. La lipasa hidroliza el enlace sulfuro de TBDMP liberando de ese modo ácido tiobutanoico que en una reacción posterior con 4,4,-ditiodipiridina (DTDP) forma 4-tiopiridona. La última está en un equilibrio tautómero con 4-mercaptopiridina que absorbe a 334 nm. La reacción se realiza en tampón de acetato 0,1 M, pH 5,0, que contenía Tritón-X100 al 0,2%, TBDMP 0,65 mM y DTDP 0,2 mM a 37°C. Se define una unidad lipasa como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido 4 tiobutanoico por min en las condiciones de reacción indicadas. Se determinó de manera espectrofotométrica fosfolipasa A usando 1,2-ditiodioctanoil-fosfatidilcolina como un sustrato. La fosfolipasa A hidroliza el enlace sulfuro en la posición 1 (PLA1) o la posición 2 (PLA2) liberando de ese modo ácido 4 tiooctanoico que, en una reacción posterior reacciona con 4,4'-ditiopiridina para formar 4-tiopiridona. La última está en equilibrio tautómero con 4-mercaptopiridina que absorbe a 334 nm. La reacción se realiza en tampón

de acetato 0,1 M, pH 4,0, que contenía Tritón-X100 al 0,2%, sustrato 0,65 mM y DTDP 0,2 mM a 37°C. Se define una unidad de fosfolipasa A (PLA) como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido 4 tio-octanoico por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

Se determinó la actividad de lisofosfolipasa con espectroscopía de RMN de 31P usando lisofosfatidil-colina como un sustrato. La lisofosfolipasa hidroliza el enlace éster liberando de ese modo el ácido graso del resto glicerol. Se cuantifica la glicerolfosfocolina así formada usando RMN. La reacción se realiza en tampón de ácido acético 50 mM,

pH 4,5, que contenía además 1 mg/ml de lisofosfatidilcolina y CaCI2 5 mM durante 30 minutos a 55°C. Una unidad de lisofosfolipasa (LPC) se define como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de 4 glicerolfosfocolina por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

Se determinó la actividad de galactolipasa con espectroscopía de RMN de H usando digalactosildiglicérido como un sustrato, según el método descrito por Hirayama y Matsuda (1.972) Agric. Biol. Chem. 36, 1.831. La galactolipasa hidroliza el enlace éster entre los ácidos grasos y la cadena principal de glicerol liberando de ese modo uno o ambos ácidos grasos. La reacción se realiza en tampón de ácido acético 50 mM, pH 4,5, que contiene además CaCI2 4 mM,

Tritón X-100 al 0,2% y 1 mg/ml de digalactosildiglicérido (Lipid Products) durante 30 minutos a 30°C. Se define una unidad de galactolipasa como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de ácido graso por minuto en las condiciones de reacción indicadas.

Los ultrafiltrados obtenidos en el Ejemplo 2, se sometieron a la medición de actividad enzimática FAU. La actividad de la alfa-amilasa fúngica se midió usando comprimidos de ensayo de Amilasa de Phadebas (Pharmacia). Los comprimidos de Phadebas contienen un sustrato de almidón insoluble en agua y un colorante azul, ligado por reticulación al sustrato. El sustrato se hidroliza por amilasa fúngica, liberando maltodextrinas solubles coloreadas que van a la disolución. Se preparó una curva de calibración con una disolución que contenía una actividad de alfa-amilasa fúngica de referencia. A partir de las muestras de referencia y desconocidas se prepararon diluciones

apropiadas en tampón de ácido málico 50 mM, pH 5,5. Se incubaron muestras de 5 ml con 30°C durante 5 minutos, se añadió un comprimido de Phadebas y después de 15 minutos se detuvo la reacción por la adición de 1,0 ml de hidróxido de sodio 0,5 N. Se dejaron enfriar las mezclas a temperatura ambiente durante 5 minutos después de lo cual se añadieron 4,0 ml de agua, se agitar a mano y después de 15 minutos se centrifugaron las muestras a 492 rad/s (4.700 rpm) durante 10 minutos. Se midió la extinción de las capas superiores a 620 nm. La DO 620 nm es una medida para actividad de alfa-amilasa fúngica. Se define una unidad de amilasa fúngica (FAU, por sus siglas en inglés) en la presente memoria como la cantidad de enzima que convierte 1 gramo de almidón (100% de materia

seca) por hora en un producto con una transmisión a 620 nm después de reacción con una disolución de yodo de concentración conocida en las condiciones de reacción indicadas.

Tabla 4. FAU y proteína en los ultrafiltrados como se preparan en el Ejemplo 2.

enzima lipolítica

Proteína (mg/ml) del análisis a 280 nm amilasa fúngica (FAU/ml)

NBE028

2,3 4,5

NBE029

1,3 3,0

NBE030

0,4 2,6

NBE031

0,1 2,5

NBE032

1,0 0,3

NBE033

ND 0,3

NBE034

ND 2,7

NBE036

ND 3,4

NBE038

2,0 3,7

NBE039

2,2 0,6

NBE043

0,1 0,2

NBE045

ND 4,0

NBE042

1,6 1,5

5 Además de las actividades mencionadas en la Tabla 4, también estuvieron presentes actividades minoritarias de glucoamilasa, sin embargo en cantidades bajas tales que estas enzimas no interfirieron en los experimentos de horneado descritos en el ejemplo 4.

Ejemplo 4

Experimentos de horneado 1 -barritas

10 Se hornearon barritas de trozos de masa de 150 gramos obtenidos mezclando 200 g de harina (Kolibri™/lbis™ en una relación de 80/20), 1,4 g de levadura de panadería seca (Fermipan®), 4 g de sal, 3 g de azúcar, 10 mg de ácido ascórbico, 116 g de agua y 2 g de grasa. Después de mezclamiento durante 6 minutos y 15 segundos en una mezcladora de púas, se dividió la masa en trozos de 150 gramos y se fermentó durante 45 minutos a 30°C, se golpeó, se fermentó durante otros 25 minutos, se moldeó y se puso en un molde para hornear. La fermentación tuvo lugar a

15 una humedad relativa de 90-100%. Después de una fermentación final de 70 minutos a 30°C, se horneó la masa

durante 20 minutos a 225°C.

Los diversos efectos (Tablas 5 y 6) de las diferentes enzimas lipolíticas en los experimentos de horneado se compararon con un control que contenía la misma cantidad de amilasa fúngica que se añadió de otro modo por la dosificación del ultrafiltrado (para la actividad de la amilasa fúngica en los ultrafiltrados véase la Tabla 4). Esto fue

20 necesario puesto que las cantidades de amilasa fúngica añadidas con las enzimas lipolíticas afectaron en particular al volumen de la barra, no a los otros parámetros. El volumen de los panes con la cantidad de control de amilasa fúngica añadida se tomó como 100%.

Tabla 5

efecto

Puntuación

1

2 3 4 5

Masa

pegajosidad de la masa demasiado pegajosa pegajosa pan de control mucho mejor excelente seca

extensibilidad de la masa

Demasiado baja Más baja que el control pan de control buena demasiado larga

pan horneado

estructura de la miga deficiente no uniforme pan de control buena excelente

color de la corteza

Casi blanca demasiado clara pan de control excelente demasiado oscura

color de la miga

Demasiado amarilla demasiado amarilla pan de control excelente totalmente blanca

revenido

Demasiado firme demasiado firme pan de control más suave excelente

Se determinó el volumen de la barra mediante el Medidor de Volumen de Pan BVM-3 (Rl Cards Instruments AB, Viken, Suecia). El principio de esta medición está basado en la reflexión de ultrasonidos medida por un sensor 5 alrededor de un pan rotando. Se tomó un tiempo de medición de 45 segundos.

Se evaluaron la pegajosidad y extensibilidad de la masa mediante un panadero cualificado usando la escala representada en la Tabla 5. Se midió el promedio de 2 barras por objeto.

Después de estos ensayos se bolearon los trozos de masa y se llevó a cabo una primera fermentación durante 45 minutos a 30ºC y a partir de ahora se golpeó la masa, se moldeó, se puso en moldes, se fermentó durante 75 minutos

10 a 30ºC. La humedad relativa durante las fermentaciones se fijó a 85%.

Con posterioridad se juzgó la estabilidad de la masa fermentada por la presencia de vesículas, corteza lateral rota y superficies curvadas irregulares de la corteza. Se hornearon los trozos de masa durante 20 minutos a 225ºC. Se determinaron los volúmenes de barra por el método BVM-3: en la tabla se presenta el promedio de 2 panes que se hornean del mismo objeto.

15 Se juzgó la estructura de la miga por un panadero cualificado usando la escala representada en la Tabla 5. Después de almacenar las barras durante tres días en bolsas de polietileno a temperatura ambiente se midió la firmeza de la miga usando un Analizador de Textura Stevens. Se analizaron dos rebanadas de 2 cm de espesor desde el centro de cada barra mediante el analizador de textura usando una sonda de 3,8 cm (1,5 pulg.) de diámetro, una profundidad de compresión de 5 mm (25%) y una velocidad de compresión de 0,5 mm/s. En la tabla se muestra el promedio de

20 dos mediciones.

Se juzgó el color de la corteza por un panadero cualificado según la escala representada en la Tabla 5. Como una referencia se usó la receta clásica para pan en lata Dutch.

Se juzgó el color de la miga por un panadero cualificado según la escala representada en la Tabla 5. El color de la miga de los panes de control se juzgó como normal (3). Como un control positivo se usan los panes de 2 objetos con

25 la misma composición como el control más 0,5% de harina de soja. El procedimiento de fermentación y horneado son los mismos que del control sin harina de soja. Lo último se juzga como "excelente".

La parte superior pendiente del pan se juzgó por lo pendiente de la parte superior en relación a la lata de horneado,

cuanto más bajos los bordes de la parte superior inferior el juicio. Cuanto menos pendiente, mejor el juicio.

El revenido del pan se juzgó por la sensación de firmeza de la miga de rebanadas del pan. Antes de que tuviera lugar el rebanado, se almacenó el pan en una bolsa de plástico a temperatura ambiente durante 4 días. Cuanto más blanda la miga de las rodajas, mejor el juicio.

Tabla 6. Realización de horneado de las enzimas lipolíticas de la invención.

Enzima lipolítica

Parámetro

Volumen (%)

Pegajosidadde la masa Extensibilidadde la masa Estabilidad dela masa Estructura dela miga Color de lacorteza Color de lamiga Parte superiorpendiente Revenido

NBE028

100 3 3 4 2 3 3 3 4

NBE029

104 3 3 4 3 4 4 4 3

NBE030

107 3 2 4 4 4 4 3 3

NBE031

102 3 2 4 5 4 4 4 4

NBE032

98 3 3 4 2 3 3 3 3

NBE033

105 3 2 4 2 4 3 3 3

NBE034

104 3 3 4 4 4 4 4 3

NBE036

100 3 3 4 3 4 4 4 3

NBE038

109 3 3 4 5 4 4 3 3

NBE039

109 3 3 4 4 3 4 3 3

NBE043

106 3 3 4 3 4 4 3 3

NBE045

110 3 3 4 4 3 4 4 4

NBE042

110 3 4 4 4 3 4 3 3

Ejemplo 5

Experimentos de horneado 2 -batard

La realización de horneado de las enzimas lipolíticas según la invención se ensayó en el tipo Francés de pan 10 denominado "batard". La preparación de los batard en un procedimiento de horneado clásico se realizó mezclando

3.000 g de harina de trigo a hacia 20°C, 70 g de levadura comprimida, 60 g de sal, 68 ppm de ácido ascórbico, 30 ppm de Bakezyme® HS2000 (hemicelulasa fúngica), 7 ppm de Bakezyme® P500 (α-amilasa fúngica) y 1.680 ml de agua (8-10°C) en un mezclador espiral (Diosna: 2 minutos en velocidad 1; entrada de 100 Wh en velocidad 2). La temperatura de la masa fue 27°C. Se analizó la mecanizabilidad de la masa a mano por un panadero. Se proporcionó 15 a la masa una fermentación volumétrica de 15 minutos en una cámara de fermentación a 32°C y 90% de HR. Después se dividió la masa en 6 trozos de 350 g, se boleó y se fermentó durante 15 minutos a 32°C y 90% de HR. Al final de este periodo los trozos de masa de moldearon y se conformaron y se les proporcionó una fermentación final de 90 minutos a 32°C y 90% de HR. Se cortaron las masas fermentadas completamente en la longitud del trozo de masa y se hornearon en un horno a 240°C durante 30 minutos con adición inicial de vapor. Después de enfriamiento 20 a temperatura ambiente se determinaron los volúmenes de las barras por el método BVM (véase el ejemplo 4).

(durante la noche) en una caja cerrada a temperatura ambiente se evaluó la calidad de la miga por un panadero cualificado. El valor para los panes (Tabla 8) procedió de 1 objeto.

Tabla 7

Efecto

Puntuación

1

2 3 4 5

Rotura y desmenuzado

Extremadamente débil y blando Débil y blando pan de control corteza delgada y crujiente rotura firme del corte corteza demasiado fina, demasiado dura

Estructura de la miga

deficiente no uniforme pan de control buena excelente

conformación

altura plana media pan de control mayor que (3) mucho mayor que (3)

corte

corte cerrado corte cerrado pan de control completamente abierto completamente abierto; desgarrado

Tabla 8. Realización de horneado de las enzimas lipolíticas de la invención.

enzima lipolítica

parámetro

Dosificación*

Volumen de la barra (%) Rotura y Desmenuzado Conformación Estructura de la miga

ninguna

0 100 3 3 3

NBE028

0,75 3 4 4 4

NBE030

3 103 4 4 3

NBE031

2,5 95 4 4 3

NBE036

ND 88 3 3 3

NBE038

30 100 4 4 3

NBE039

64 126 3 4 3

NBE045

ND 89 4 4 3

NBE042

12 98 3 4 4

* en ppm basado en peso de harina y peso de enzima determinado por el método A280.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 12.

2. 2.

   Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 10 y 11.

3. 3.

   Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 10 y 11.

4. 4.

   Un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos según las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Un vector según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de polinucleótidos según las reivindicaciones 1 a 3 está ligado de manera operativa con secuencias reguladoras adecuadas para expresión de dicha secuencia de polinucleótidos en una célula huésped adecuada.

6. 6.

   Un vector según la reivindicación 5, en el que dicha célula huésped adecuada es un hongo filamentoso.

7. 7.

   Un método para preparar un polinucleótido según las reivindicaciones 1 -3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula huésped.

8. 8.

   Una enzima lipolítica aislada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 12.

9. 9.

   Una enzima lipolítica aislada que se puede obtener por expresión de un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6 en una célula huésped apropiada, por ej., Aspergillus niger.

10. 10.

    Un método para fabricar una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9, que comprende las etapas de transformar una célula huésped adecuada con un polinucleótido aislado según las reivindicaciones 1 a 3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6, cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente purificar el polipéptido codificado de dicha célula o medio de cultivo.

11. 11.

    Una célula huésped recombinante que comprende un vector según las reivindicaciones 4 a 6.

12. 12.

    Una célula huésped recombinante que sobreexpresa una enzima lipolítica según las reivindicaciones 8 a 10.

13. 13.

    Anticuerpos purificados reactivos con una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9.

14. 14.

    Proteína de fusión que comprende una secuencia de enzimas lipolíticas según la reivindicación 8 ó 9.

15. 15.

    Un procedimiento para la producción de masa que comprende incorporar una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 a la masa.

16. 16.

    Un procedimiento para la producción de un producto horneado de una masa como se prepara por el procedimiento de la reivindicación 15.

17. 17.

    Uso de una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 para la preparación de una masa y/o un producto horneado de la misma.

18. 18.

    Una pre-mezcla que comprende una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 y harina.