ES2719282T3 - Variantes de alfa-amilasa - Google Patents

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Jong René Marcel De
Hanna Elisabet Abbas
Rij Evert Tjeerd Van
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Abstract

Un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, I16T, M45L, W70Y, S72T, L75V, T94A, T94P, V129A, S133L, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, L210F, N234P, V254F, V281L, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, T323N, I325F, F652I, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de alfa-amilasa.
Campo
La invención se refiere a un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa. La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha variante, a un vector de expresión recombinante, a dicho constructo de ácido nucleico y a una célula huésped recombinante que comprende dicho vector de expresión. Adicionalmente, la invención se refiere a un método para producir una alfa-amilasa mediante el uso de dicha célula huésped. Asimismo, la invención se refiere a un método para producir una variante de polipéptido de alfa-amilasa. La invención adicionalmente se refiere a una composición que comprende una variante de alfa-amilasa, al uso de dicha variante de alfa-amilasa o composición que contiene una variante de alfa-amilasa en la preparación de un producto horneado, a un proceso para la producción de un producto horneado.
Antecedentes
En la fabricación de pan el almidón tiene un papel importante en la formación de la miga y la velocidad de rancidez de la miga del pan horneado. En la masa el almidón está presente como gránulos, absorbiendo solamente una pequeña cantidad de agua. Durante el horneado ocurre el proceso de gelatinización del almidón. La amilosa se filtra del gránulo y forma un gel continuo en la masa de horneado. Ya durante la parte de horneado de la amilosa se recristaliza, resultando en el endurecimiento del gel y endurecimiento de la miga. Al mismo tiempo el agua ingresa al gránulo e hidrata la amilopectina resultando en la hinchazón del gránulo. Durante el almacenamiento del pan luego de varios días, la amilopectina comienza a recristalizarse (que se denomina también retrogradación). Se cree que la rancidez del pan es un reflejo directo de la retrogradación de la amilopectina. El almidón y, por lo tanto, la miga se vuelven más rígidos.
La firmeza del pan después de determinado tiempo de almacenamiento depende de la suavidad inicial, que es la suavidad después del enfriamiento, y la velocidad de aumento de la firmeza, la velocidad de rancidez.
Los estudios sobre la rancidez del pan han indicado que la fracción de almidón en el pan se recristaliza durante el almacenamiento, provocando así un aumento en la firmeza de la miga, que puede medirse como un aumento en la dureza de las rebanadas de pan.
La presente invención se refiere a una alfa-amilasa. Las alfa-amilasas se han usado en la industria desde hace tiempo.
Las alfa-amilasas han sido tradicionalmente proporcionadas a través de la inclusión de harina de trigo o cebada malteada y brindan varias ventajas al panadero. La alfa-amilasa se usa para proporcionar una producción de gas y retención de gas satisfactorias durante la fermentación de la masa y para proporcionar un color de masa satisfactorio. Esto significa que si esta enzima no se usa en una cantidad suficiente, el volumen, textura y apariencia de la hogaza se ven básicamente afectados. La alfa-amilasa se produce naturalmente dentro del cultivo de trigo en sí y se mide de manera rutinaria por el Índice de Caída de Hagberg (método ICC 107), y se toman medidas para minimizar dichas variaciones mediante la adición de alfa-amilasa en el molino y a través del uso de ingredientes especiales en la panadería ya que la enzima es de gran importancia.
En tiempos más recientes, la alfa-amilasa del cereal se ha reemplazado en gran medida por enzimas de fuentes microbianas, incluyendo fuentes fúngicas y bacterianas. A través del uso de biotecnología en la selección, fermentación y procesamiento de la cepa, las enzimas pueden prepararse a partir de dichas fuentes microbianas y esto reúne ventajas sobre la harina de malta debido a que la enzima es de calidad más controlada, relativamente pura y más rentable en su uso.
Sin embargo, las propiedades de las alfa-amilasas y sus efectos tecnológicos muestran diferencias importantes. Además de influir en la producción de gas, retención de gas y color de la corteza, la alfa-amilasa puede tener incidencia en la vida útil del producto horneado.
El almidón dentro de la harina de trigo contiene dos fracciones principales, amilosa y amilopectina, y estas están organizadas en forma de gránulos de almidón. Una proporción de estos gránulos de variedades de trigo duro para moler se vuelven "dañadas", separándose los gránulos como consecuencia de la energía de la molienda. En el proceso de horneado, los gránulos de almidón se gelatinizan; este proceso implica una hinchazón del gránulo por la captación de agua y una pérdida de la naturaleza cristalina del gránulo; en particular se conoce que existen amilopectinas dentro del gránulo nativo como cristalitos y estas moléculas se disocian y pierden cristalinidad durante la gelatinización. Una vez que el pan se ha horneado, la amilopectina se recristaliza lentamente durante una cantidad de días y es esta recristalización, o retrogradación del almidón, la que se considera como la causa principal de la rancidez del pan.
Estas formas diversas del almidón y su interacción con la alfa-amilasa dictan el rol que la enzima tiene con respecto a la tecnología de horneado. La alfa-amilasa de fuentes fúngicas, más típicamente proveniente de la especie Aspergillus, actúa principalmente sobre el almidón dañado durante el mezclado de la masa y durante la fermentación/levado. La baja estabilidad térmica de la enzima significa que la enzima se inactiva durante el horneado y, críticamente antes de que ocurra la gelatinización del almidón, de manera tal que hay muy poca o casi ninguna ruptura del almidón desde la fracción sin dañar. Como consecuencia, la amilasa fúngica es útil para proporcionar azúcares para la fermentación y color, pero no tiene prácticamente valor para extender la vida útil. Por otro lado la alfa-amilasa bacteriana, más típicamente de Bacillus amyloliquifaciens, proporciona estabilidad y actividad de temperatura extendida durante el horneado del pan y mientras el almidón se somete a gelatinización. La amilasa bacteriana entonces conduce a una modificación del almidón más extensiva y, a su vez, la calidad del pan horneado; en particular la miga del pan horneado puede ser perceptiblemente más suave durante toda su vida útil y puede permitir que se aumente la vida útil. Sin embargo, mientras que la alfa-amilasa bacteriana puede ser útil con respecto a la extensión de la vida útil, es difícil de usar prácticamente ya que sobredosis pequeñas conducen a una estructura de la miga inaceptable de poros grandes y abiertos, mientras que la textura puede volverse demasiado suave y "gomosa".
Existe una necesidad para una alfa-amilasa con rendimiento mejorado en la industria, especialmente en la industria panadera.
El documento US 4.598.048 describe la preparación de una enzima de amilasa maltogénica. El documento US 4.604.355 describe una enzima amilasa maltogénica, la preparación y uso de la misma. El documento US RE38.507 describe un proceso y agente antienvejecimiento. El documento WO99/43793 divulga variantes de la enzima amilolítica. El documento WO99/43794 divulga variantes de alfa-amilasa maltogénica. El documento WO2004/081171 divulga una enzima. El documento WO2006/012899 divulga variantes de alfa-amilasa maltogénica.
Compendio
La divulgación se refiere a polipéptidos variantes que tienen actividad de alfa-amilasa, es decir, a variantes de alfaamilasa. Una variante de alfa-amilasa de la invención puede tener una o más propiedades mejoradas en comparación con un polipéptido de referencia, teniendo el polipéptido de referencia típicamente actividad de alfaamilasa. Un polipéptido de referencia puede ser una alfa-amilasa natural, tal como alfa-amilasa natural, por ejemplo, de Alicyclobacillus pohliae, en particular la cepa NCIMB14276 de Alicyclobacillus pohliae. Los polipéptidos variantes de la invención pueden denominarse una "variante de alfa-amilasa", una "alfa-amilasa mejorada" y similares.
La propiedad mejorada típicamente será una propiedad con relevancia al uso de la variante alfa-amilasa en la preparación de un producto horneado.
Una variante de alfa-amilasa con una propiedad mejorada relevante para la elaboración de un producto horneado puede demostrar menor dureza luego del almacenamiento de un producto horneado y/o pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de un producto horneado.
La propiedad mejorada puede incluir fuerza aumentada de la masa, elasticidad aumentada de la masa, estabilidad aumentada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, maquinabilidad mejorada de la masa, volumen aumentado del producto horneado, harina mejorada del producto horneado, estructura de la miga mejorada del producto horneado, suavidad de la miga mejorada del producto horneado, formación de ampollas reducida del producto horneado, crocantez mejorada, resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento, dureza reducida luego del almacenamiento y/o antirrancidez mejorada del producto horneado.
La propiedad mejorada puede incluir menor tiempo de desarrollo de masa de la masa y/o pegajosidad reducida de la masa.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de plegarse mejorada del producto horneado, tal como la capacidad de plegarse mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir flexibilidad mejorada del producto horneado incluyendo flexibilidad mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de apilarse mejorada de productos horneados planos incluyendo tortillas, crepes, panes ácimos, masas de pizza, panes roti.
La propiedad mejorada puede incluir pegajosidad reducida de fideos y/o flexibilidad aumentada de fideos.
La propiedad mejorada puede incluir aglutinación reducida de fideos cocidos y/o sabor mejorado de fideos aun después de un período de almacenamiento.
La propiedad mejorada puede incluir reducción de formación de fisuras delgadas en un producto en galletas saladas así como la creación de un efecto de fermentación y desarrollo de sabor mejorado.
La propiedad mejorada puede incluir sensación en la boca mejorada y/o suavidad al apretar mejorada.
La propiedad mejorada puede incluir daño reducido durante el transporte, incluyendo rotura reducida durante el transporte.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan libre de gluten.
La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan de centeno.
La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de pan de centeno. La propiedad mejorada puede incluir capacidad de ser cortado mejorada. Esto puede demostrarse observando la cantidad de migas después del corte. Menos migas indican una mejor capacidad de ser cortado. La propiedad mejorada puede incluir estructura de la miga mejorada y/o resiliencia, sin crear gomosidad.
La propiedad mejorada puede incluir cohesión mejorada del producto horneado, incluyendo cohesión mejorada de un bizcocho.
La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta, etc.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta, etc.
Cada una de estas mejoras puede determinarse en comparación con un polipéptido de referencia. La propiedad mejorada puede demostrarse preparando un producto horneado que comprende la variante de alfa-amilasa y otro que comprende un polipéptido base y comparando los resultados.
La propiedad mejorada puede demostrarse en un ensayo o análisis bioquímico.
En particular, una alfa-amilasa variante de la divulgación puede mostrar productividad mejorada en comparación con un polipéptido de referencia. De forma alternativa, o adicionalmente, una alfa-amilasa variante de la divulgación puede mostrar una estabilidad de temperatura alterada, tal como reducida o aumentada, o una actividad alterada a un pH relevante para el proceso de elaboración del producto horneado, tal como un pH más bajo o un pH más alto, en comparación con un polipéptido de referencia.
La propiedad mejorada puede incluir:
- termoestabilidad aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - actividad específica aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - mayor estabilidad/actividad en un rango diferente de pH en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa,
- cambio en el espectro del producto (que se define como la relación de un producto con respecto a otro) en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa,
- actividad aumentada en almidón bruto en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - temperatura óptima alterada,
- especificidad del sustrato alterada, o
- productividad aumentada en la producción de la variante de alfa-amilasa; en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
La invención también proporciona:
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de la invención;
- un constructo de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico enlazado operativamente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de una alfa-amilasa en un huésped de expresión adecuado;
- un vector de expresión recombinante que comprende dicho constructo de ácido nucleico; y
- una célula huésped recombinante que comprende dicho vector de expresión.
La invención también se refiere a un método para producir una alfa-amilasa que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones que conducen a la producción de la alfa-amilasa y recuperar la alfa-amilasa. Se proporciona un método para producir una variante de polipéptido de alfa-amilasa, comprendiendo el método: a) seleccionar un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa;
b) sustituir al menos un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
c) opcionalmente sustituir uno o más aminoácidos adicionales tal como se define en b);
d) preparar la variante que resulta de los pasos a)-c);
e) determinar una propiedad de la variante; y
f) seleccionar una variante que tiene una propiedad alterada en comparación con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, para producir, de este modo, una variante de polipéptido de alfa-amilasa. Adicionalmente, la invención se refiere a:
- una composición que comprende la variante de la invención - el uso de una alfa-amilasa variante de acuerdo con la invención o de una composición de la invención en la preparación de un producto horneado;
- un proceso para la producción de un producto horneado, comprendiendo el método que comprende agregar una cantidad efectiva de un polipéptido variante de acuerdo con la invención de una composición de acuerdo con la invención a la masa y llevar a cabo pasos de elaboración de horneado adicionales apropiados.; y
Descripción de las figuras
Figura 1. Establece el mapa plasmídico de pGBB09, el plásmido se utiliza para construir los vectores de expresión para variantes de alfa-amilasa.
Figura 2. Establece el mapa plasmídico de pGBB09DSM-AM1 que contiene el gen DSM-AM que se utiliza para la producción de una alfa-amilasa de referencia.
Descripción del listado de secuencias
La SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de polinucleótidos de NCIMB14276 de Alicydobacillus pohliae que codifica la secuencia señal natural (establecida en los nucleótidos 1 a 99), el polipéptido de alfa-amilasa natural (establecido en los nucleótidos 100 a 2157) y un codón de terminación en el extremo 3' (establecido en los nucleótidos 2157 a 2160).
La SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos del polipéptido de alfa-amilasa natural NCIMB14276 de Alicyclobacillus pohliae.
La SEQ ID NO: 3 establece un fragmento de ADN sintético que contiene el sitio de restricción de Pmel, el terminador amyQ y los sitios de restricción de SphI y HindIII.
La SEQ ID NO: 4 establece un fragmento de ADN sintético que contiene un sitio de unión al ribosoma y sitio de restricción de PacI.
La SEQ ID NO: 5 establece un fragmento de ADN sintético que contiene un codón de terminación doble y sitio de restricción de PmeI.
La SEQ ID NO 6: establece la secuencia de polinucleótidos de un constructo de ADN sintético excitante de un sitio de PacI, sitio de unión al ribosoma, secuencia de DSM-AM natural tal como se establece en la SEQ ID NO:1, codón de terminación doble y sitio de restricción de PmeI.
La SEQ ID NO 7: establece la secuencia de aminoácidos de una variante del polipéptido de alfa-amilasa natural NCIMB14276 de Alicydobacillus pohliae.
La SEQ ID NO 8: establece la secuencia de aminoácidos de otra variante del polipéptido de alfa-amilasa natural NCIMB14276 de Alicydobacillus pohliae.
Descripción detallada de la invención
A lo largo de toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden", "incluyen" y "que tienen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" deben interpretarse inclusivamente. Es decir, estas palabras pretenden transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no indicados específicamente, hasta donde el contexto lo permita.
Los artículos "uno" y "una" se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
Actividad de alfa-amilasa
La variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención y el polipéptido base en el presente documento son enzimas que degradan almidón. La variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención y el polipéptido base en el presente documento tienen actividad de alfa-amilasa. La actividad de alfa-amilasa puede determinarse de forma adecuada utilizando el procedimiento Ceralpha® recomendado por la Asociación Americana de Químicos Cerealeros (AACC). Actividad de NBAU
La actividad enzimática de una variante de alfa-amilasa y de un polipéptido base puede expresarse como NBAU. La actividad de NBAU puede determinarse de forma adecuada utilizando el ensayo NBAU tal como se describe en el presente documento.
Premezcla
El término "premezcla" se define en el presente documento para comprenderse con su significado convencional, es decir, como una mezcla de agentes de horneado, generalmente incluyendo harina, que puede utilizarse no solo en las plantas/instalaciones de horneado de pan industrial, sino también en panaderías minoristas. La premezcla puede prepararse al mezclar el polipéptido de alfa-amilasa y la amilasa formadora de G4 o la composición de la enzima de acuerdo con la invención con un portador adecuado tal como harina, almidón o una sal. La premezcla puede contener aditivos tal como se menciona en el presente documento.
Producto horneado
La expresión "producto horneado" se refiere a un producto alimenticio horneado preparado a partir de una masa. Ejemplos de productos horneados, ya sean de tipo de harina blanca, negra o integral, que pueden producirse de manera ventajosa por la presente invención incluyen pan (en particular blanco, integral o de centeno), típicamente en forma de hogazas o bollos, pan tipo baguette francesa, pasteles, croissants, brioche, panettone, pasta, fideos (hervidos o saltados), pan de pita y otros panes ácimos, tortillas, tacos, tortas, crepes, galletitas en particular bizcochos, rosquillas, incluyendo rosquillas de levadura, roscas, tapas de masa, pan al vapor, pan de centeno horneado, brownies, tortas rectangulares, tentempiés (por ejemplo, pretzels, chips de tortilla, tentempiés fabricados, papas fritas fabricadas). La expresión producto horneado incluye pan que contiene de 2 a 30%p de azúcar, pan que contiene fruta, cereales de desayuno, barras de cereal, torta sin huevo, bollos y pan libre de gluten. El pan libre de gluten en el presente documento y de aquí en adelante es pan que contiene a lo sumo 20 ppm de gluten. Varios granos y fuentes de almidón se consideran aceptables para una dieta libre de gluten. Las fuentes usadas frecuentemente son papas, arroz y tapioca (derivada de mandioca). El producto horneado incluye, a modo no taxativo, pan de molde, hogazas de pan, twists, panecillos, tales como panecillos para hamburguesas o panecillos hervidos, chapati, bizcocho tostado, rebanada de panecillo al vapor seco, miga de pan, pan ácimo, focaccia, tostada melba, biscote, croutón, pretzels suaves, pan suave y duro, palillos de pan, levadura fermentada y pan químicamente leudado , productos de masa laminada tales como hojaldre danés, croissants o productos hojaldrados, muffins, pan danés, roscas, recubrimientos de confitería, galletas saladas, obleas, masas de pizza, tortillas, productos de pasta, crepes, waffles, productos parcialmente horneados y productos de masa refrigerados y congelados.
Un ejemplo de un producto parcialmente horneado incluye, a modo no taxativo, pan parcialmente horneado que se completa en el punto de venta o consumo con un segundo proceso de horneado corto.
El pan puede ser pan blanco o negro; dicho pan puede por ejemplo, fabricarse utilizando el conocido método de la esponja y la masa estilo americano o un método directo de estilo americano.
El término tortilla en el presente documento incluye tortilla de maíz y tortilla de trigo. Una tortilla de maíz es un tipo de pan plano y fino, a menudo no leudado hecho a partir de maíz finamente molido (a menudo se denomina "maíz" en los Estados Unidos). Una tortilla de harina es un tipo de pan plano y fino, a menudo no leudado, hecho a partir de harina de trigo finamente molida. El término tortilla adicionalmente incluye un pan similar de América del sur que se denomina arepa, aunque las arepas son típicamente mucho más gruesas que las tortillas. El término tortilla adicionalmente incluye un laobing, un "panqueque" grueso en forma de pizza de China y un roti indio, que está hecho esencialmente de harina de trigo. Una tortilla a menudo tiene una forma redonda u oval y puede variar en diámetro de aproximadamente 6 a más de 30 cm.
Masa
El término "masa" se define en el presente documento como una mezcla de harina y otros ingredientes. En un aspecto la masa es lo suficientemente firme para amasar o hacer panecillo. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o parcialmente horneada. La preparación de masa congelada es descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.
La masa está hecha utilizando ingredientes de masa, que incluyen a modo no taxativo harina (cereal), una fuente de lecitina incluyendo huevo, agua, sal, azúcar, saborizantes, una fuente de grasa incluyendo manteca, margarina, aceite y grasa, levadura para hornear, sistemas de fermentación química tales como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato, una fuente de proteína incluyendo leche, harina de soja, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), saborizantes, ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
Cereales incluyen maíz, arroz, trigo, cebada, sorgo, mijo, avena, centeno, triticalo, trigo sarraceno, quínoa, espelto, trigo escaña, farro, dürüm y kamut.
La masa a menudo se hace a partir de ingredientes de masa básicos incluyendo harina (cereal), tal como harina de trigo o harina de arroz, agua y opcionalmente sal. Para los productos fermentados, principalmente se usa levadura para hornear junto a sistemas de fermentación química tales como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato.
El término masa en el presente documento incluye una mezcla batida. Una mezcla batida es una mezcla semilíquida, que es lo suficientemente delgada como para caer o verterse desde una cuchara, de una o más harinas combinadas con líquidos tales como agua, leche o huevos usados para preparar varios alimentos, incluyendo torta.
La masa puede prepararse utilizando una mezcla que incluye una mezcla para torta, una mezcla para bizcocho, una mezcla para brownies, una mezcla para pan, una mezcla para panqueque y una mezcla para crepe.
El término masa incluye masa congelada, que también puede referirse a una masa refrigerada. Hay diferentes tipos de masa congelada; la que se congela antes del levado y la que se congela después de una etapa de levado parcial o completa. La masa congelada se usa típicamente para fabricar productos horneados incluyendo a modo no taxativo bizcochos, panes, palillos de pan y croissants.
Un gen o codificación de ADNc para una alfa-amilasa o pro-alfa-amilasa, por ejemplo, una variante de la invención, puede clonarse y sobreexpresarse en un organismo huésped. Organismos huéspedes bien conocidos que han sido usados para la sobreexpresión de alfa-amilasa en el pasado incluyen Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Escherichia coli, Pichia, Saccharomyces, Yarrowia, Neurospora o Bacillus.
La variante de alfa-amilasa puede elaborarse industrialmente utilizando tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, utilizando hongos filamentosos tales como cepas de levadura, especie Aspergillus, por ejemplo, de especie Klyuveromyces o especie bacteriana, por ejemplo, E. coli, como organismos huéspedes. Dichas cepas de producción microbiana recombinante son construidas y mejoradas continuamente utilizando tecnología de ADN así como medidas de mejora de cepa clásica dirigida hacia optimizar la expresión y secreción de una proteína heteróloga.
En la invención, una variante de alfa-amilasa puede proporcionarse en forma de variante de pre-alfa-amilasa o variante de alfa-amilasa (madura). También puede proporcionarse una correspondiente secuencia de ácido nucleico, es decir, puede proporcionarse un polinucleótido que codifica una pre-alfa-amilasa o una alfa-amilasa (madura). En el presente documento, las posiciones que pueden sustituirse para lograr una variante de la invención se definen con referencia a la SEQ ID NO: 2 que es una alfa-amilasa madura, es decir, es una secuencia que no incluye una presecuencia.
Se divulgan polipéptidos variantes que tienen actividad de alfa-amilasa en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa. El polipéptido de referencia típicamente puede ser un polipéptido natural que tiene actividad de alfa-amilasa, tal como la alfa-amilasa de la SEQ ID NO: 2. También puede hacerse referencia al polipéptido de referencia como un polipéptido base o polipéptido de comparación.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
Un polipéptido de referencia natural puede obtenerse a partir de cualquier organismo adecuado.
Los polipéptidos de referencia naturales adecuados pueden obtenerse a partir de NCIMB14276 de Alicydobacillus pohliae.
Preferiblemente, el polipéptido de referencia es la alfa-amilasa establecida en la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa es preferiblemente la alfa-amilasa establecida en la SEQ ID NO: 2.
Un polipéptido variante típicamente tendrá una propiedad mejorada en comparación con un polipéptido de referencia, en particular con respecto a una propiedad relevante para el uso del polipéptido variante en la elaboración de un producto horneado.
La productividad mejorada puede demostrarse mediante una variante de alfa-amilasa que muestra expresión mejorada en comparación con un polipéptido base.
La propiedad mejorada típicamente será una propiedad con relevancia al uso de la variante alfa-amilasa en la preparación de un producto horneado.
Una variante de alfa-amilasa con una propiedad mejorada relevante para la elaboración de un producto horneado puede demostrar menor dureza luego del almacenamiento de un producto horneado y/o pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de un producto horneado.
La propiedad mejorada puede incluir fuerza aumentada de la masa, elasticidad aumentada de la masa, estabilidad aumentada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, maquinabilidad mejorada de la masa, volumen aumentado del producto horneado, harina mejorada del producto horneado, estructura de la miga mejorada del producto horneado, suavidad de la miga mejorada del producto horneado, formación de ampollas reducida del producto horneado, crocantez mejorada, resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento, dureza reducida luego del almacenamiento y/o antirrancidez mejorada del producto horneado.
La propiedad mejorada puede incluir menor tiempo de desarrollo de masa de la masa y/o pegajosidad reducida de la masa.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de plegarse mejorada del producto horneado, tal como la capacidad de plegarse mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir flexibilidad mejorada del producto horneado incluyendo flexibilidad mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de apilarse mejorada de productos horneados planos incluyendo tortillas, crepes, panes ácimos, masas de pizza, panes roti.
La propiedad mejorada puede incluir pegajosidad reducida de fideos y/o flexibilidad aumentada de fideos.
La propiedad mejorada puede incluir aglutinación reducida de fideos cocidos y/o sabor mejorado de fideos aun después de un período de almacenamiento.
La propiedad mejorada puede incluir reducción de formación de fisuras delgadas en un producto en galletas saladas así como la creación de un efecto de fermentación y desarrollo de sabor mejorado.
La propiedad mejorada puede incluir sensación en la boca mejorada y/o suavidad al apretar mejorada.
La propiedad mejorada puede incluir daño reducido durante el transporte, incluyendo rotura reducida durante el transporte.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan libre de gluten.
La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan de centeno.
La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de pan de centeno. La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta, etc.
Cada una de estas mejoras puede determinarse en comparación con un polipéptido de referencia. La propiedad mejorada puede demostrarse preparando un producto horneado que comprende la variante de alfa-amilasa y otro que comprende un polipéptido base y comparando los resultados.
La propiedad mejorada puede demostrarse en un ensayo o análisis bioquímico.
En particular, una alfa-amilasa variante de la invención puede mostrar productividad mejorada en comparación con un polipéptido de referencia. De forma alternativa, o adicionalmente, una alfa-amilasa variante de la invención puede mostrar una estabilidad de temperatura alterada, tal como reducida o aumentada, o una actividad alterada a un pH relevante para el proceso de elaboración del producto horneado, tal como un pH más bajo o un pH más alto, en comparación con un polipéptido de referencia.
La propiedad mejorada puede incluir:
- termoestabilidad aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - actividad específica aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - mayor estabilidad/actividad en un rango diferente de pH en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa,
- cambio en el espectro del producto (que se define como la relación de un producto con respecto a otro) en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa,
- actividad aumentada en almidón bruto en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa, - temperatura óptima alterada,
- especificidad del sustrato alterada, o
- productividad aumentada en la producción de la variante de alfa-amilasa; en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa.
La termoestabilidad puede determinarse midiendo la actividad residual luego de la incubación a una temperatura más alta (por ejemplo, 50-100°C durante 1-20 min), utilizando un ensayo de actividad adecuado (tal como Ceralpha) o de forma alternativa el ensayo NBAU tal como se describe en el presente documento.
La termoestabilidad puede determinarse utilizando un ensayo descrito en el presente documento. La termoestabilidad puede determinarse a un pH adecuado tal como a pH4 o a pH5. La termoestabilidad puede determinarse en presencia de sacarosa.
En el presente documento se divulga una variante de polipéptido de alfa-amilasa, teniendo dicha variante al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
Una variante de polipéptido de alfa-amilasa tal como se divulga en el presente documento tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En el presente documento se divulga la variante de polipéptido de alfa-amilasa, teniendo dicha variante al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La actividad específica puede determinarse midiendo la actividad por mg de proteína (la cantidad de proteína puede, por ejemplo, estimarse a partir de SDS-PAGE, o si la muestra es lo suficientemente pura puede determinarse utilizando un ensayo de Bradford). Ejemplos adecuados de un ensayo para determinar la actividad específica incluyen el ensayo NBAU y el ensayo de Maltotriosa tal como se describe en el presente documento.
La tolerancia a la sacarosa puede determinarse midiendo la actividad en presencia de una concentración en aumento de sacarosa (por ejemplo, incubar con tabletas Phadebas durante 15 min a 60°C en presencia de 0 - 40% (en peso) de sacarosa. Expresar como un porcentaje de la actividad a 0% de sacarosa.) La actividad puede determinarse utilizando un ensayo de actividad adecuado (tal como Ceralpha) o, de forma alternativa, el ensayo NBAU tal como se describe en el presente documento.
La estabilidad del pH puede determinarse midiendo la termoestabilidad en un rango de pH (midiendo la termoestabilidad tal como se describió anteriormente, pero sin incubar en un rango de valores de pH, por ejemplo, 2­ 12).
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
Tolerancia a la sacarosa
La tolerancia a la sacarosa de una variante de acuerdo con la invención puede expresarse como la relación entre [Actividad de una variante en presencia de sacarosa] y [Actividad de la variante en ausencia de sacarosa],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa en presencia de sacarosa] y [Actividad del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa en ausencia de sacarosa].
La tolerancia a la sacarosa de una variante de acuerdo con la invención puede expresarse como la relación entre [Actividad en maltotriosa de una variante en presencia de sacarosa] y [Actividad en maltotriosa de la variante en ausencia de sacarosa],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad en maltotriosa de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa en presencia de sacarosa] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa en ausencia de sacarosa].
En un aspecto, la tolerancia a la sacarosa de una variante de acuerdo con la invención puede expresarse como la relación entre
[Actividad de la variante en el Ensayo 2B (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad de la variante en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2B (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)].
El porcentaje que se obtiene de esta manera puede utilizarse como medición para la tolerancia a la sacarosa de la variante de acuerdo con la invención. Una tolerancia a la sacarosa de más de 100% muestra que la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfaamilasa.
En un aspecto de la invención la variante de acuerdo con la invención tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 77, 88, 78, 134, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización de la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención, dicha variante tiene al menos 80% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
Q13E, I16T, M45L, W70Y, S72T, L75V, T94A, T94P, V129A, S133L, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, L210F, N234P, V254F, V281L, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, T323N, I325F, F652I,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende un aminoácido de cisteína en las posiciones 77 y 88 o un aminoácido de cisteína en las posiciones 78 y 134,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto de la invención la variante de acuerdo con la invención tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 77, 88, 78, 134, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización de la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención, dicha variante tiene al menos 80% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
Q13E, I16T, M45L, W70Y, S72T, L75V, T94A, T94P, V129A, S133L, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, L210F, N234P, V254F, V281L, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, T323N, I325F, F652I,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende un aminoácido de cisteína en las posiciones 77 y 88 o un aminoácido de cisteína en las posiciones 78 y 134,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización de la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención, dicha variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido
129 y/o 194,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización de la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención, dicha variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido
129 y/o 194,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a V129A y/o F194Y definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a V129A y/o F194Y definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 77, 88, 78, 134, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
Termoestabilidad a pH5
La termoestabilidad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre [Actividad residual de una variante determinada luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH5] y [Actividad de la variante determinada luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH5], que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH5] y [Actividad del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH5].
La termoestabilidad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre [Actividad residual en maltotriosa de una variante determinada luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH5] y [Actividad en maltotriosa de la variante determinada luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH5],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual en maltotriosa de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH5] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH5]. En un aspecto, la termoestabilidad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad de la variante en el Ensayo 2C (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad de la variante en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2C (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)].
El porcentaje que se obtiene de esta manera puede utilizarse como medición para la termoestabilidad a pH5 de la variante de acuerdo con la divulgación. Una termoestabilidad a pH5 de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfaamilasa.
La variante de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
61, 75, 88, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 264, 281, 327, 13, 70, 128, 282, 388, 261,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
L61F, L75F, G88A, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, A264S, V281L, N327S, Q13E, W70Y, F128I, L282F, L282M, L282M, A388L, D261G,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 129 y/o 225,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a V129A y/o L225F, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
61, 75, 88, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 264, 281, 327, 13, 70, 128, 282, 388, 261,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
L61F, L75F, G88A, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, A264S, V281L, N327S, Q13E, W70Y, F128I, L282F, L282M, L282M, A388L, D261G,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
Relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5
La Actividad a pH4 y Actividad a pH5 pueden determinarse utilizando un ensayo adecuado tal como el ensayo NBAU o ensayo de Maltotriosa tal como se describe en el presente documento y ajustar el pH consecuentemente.
La relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad de una variante determinada a pH4] y [Actividad de la variante determinada a pH5],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad de un polipéptido de referencia a pH4] y [Actividad del polipéptido de referencia a pH5].
La relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad en maltotriosa de una variante determinada a pH4] y [Actividad en maltotriosa de la variante determinada a pH5],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad en maltotriosa de un polipéptido de referencia a pH4] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia a pH5].
En un aspecto, la relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad de la variante en el Ensayo 2D (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad de la variante en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia en el Ensayo 2D (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)].
El porcentaje que se obtiene de esta manera puede utilizarse como medición para la relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de la variante de acuerdo con la divulgación. Una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% muestra que la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa. que la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfaamilasa.
Una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% puede utilizarse para demostrar un perfil de pH alterado en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa.
Una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% puede utilizarse para demostrar una actividad aumentada en un rango diferente de pH en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa. Una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% puede utilizarse para demostrar una actividad específica que es mayor que al menos un pH entre pH 3 y pH 7, en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa.
En un aspecto, una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% puede utilizarse para demostrar una actividad específica que es mayor que al menos un pH entre pH 3 y pH 6, en comparación con un polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa.
La variante de acuerdo con la divulgación tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
124, 126, 129, 136, 168, 186, 195, 199, 219, 222, 267, 269, 271, 288, 325, 331, 370, 377, 421, 450, 652, 20, 68, 72, 225, 282, 334,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
V124I, V126I, V129A, F136A, F168Y, K186Q, S195A, L199F, A219D, A222V, A222I, H267N, E269D, V271T, T288S, T288N, I325F, S331D, G370N, G377A, I421V, T450S, F652I, Y20L, Y20V, T68A, T68G, S72T, L225F, L282I, L282M, L334H,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 129 y/o 225,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a V129A y/o L225F, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
124, 126, 129, 136, 168, 186, 195, 199, 219, 222, 267, 269, 271, 288, 325, 331, 370, 377, 421, 450, 652, 20, 68, 72, 225, 282, 334,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
V124I, V126I, V129A, F136A, F168Y, K186Q, S195A, L199F, A219D, A222V, A222I, H267N, E269D, V271T, T288S, T288N, I325F, S331D, G370N, G377A, I421V, T450S, F652I, Y20L, Y20V, T68A, T68G, S72T, L225F, L282I, L282M, L334H,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
Termoestabilidad a pH4
La termoestabilidad a pH4 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre [Actividad residual de una variante determinada luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH4] y [Actividad de la variante determinada luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH4], que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad de un polipéptido de referencia luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH4] y [Actividad del polipéptido de referencia luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH4].
La termoestabilidad a pH4 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre [Actividad residual en maltotriosa de una variante determinada luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH4] y [Actividad en maltotriosa de la variante determinada luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH4],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad en maltotriosa de un polipéptido de referencia luego de incubar a una temperatura superior a 37 grados Celsius a pH4] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia luego de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius a pH4].
En un aspecto, la termoestabilidad a pH4 de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad de la variante en el Ensayo 2E (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad de la variante en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2E (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad del polipéptido de referencia en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)].
El porcentaje que se obtiene de esta manera puede utilizarse como medición para la termoestabilidad a pH4 de la variante de acuerdo con la divulgación. Una termoestabilidad a pH4 de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfaamilasa.
En un aspecto de la divulgación la variante de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización de la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación, dicha variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
88, 188, 200, 222, 70, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
En una realización la variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
G88A, F188I, S200N, A222V, W70Y, L282F, L282I, L282M, L282T, L282M,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
70, 188, 281, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
W70Y, F188I, L282F,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
88, 188, 200, 222, 70, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
G88A, F188I, S200N, A222V, W70Y, L282F, L282I, L282M, L282T, L282M,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
Termoestabilidad en presencia de sacarosa
La termoestabilidad en presencia de sacarosa de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad residual de una variante determinada luego de incubar en presencia de sacarosa a una temperatura superior a 37 grados Celsius] y [Actividad de la variante determinada luego de incubar en ausencia de sacarosa a una temperatura de 37 grados Celsius],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa determinada luego de incubar en presencia de sacarosa a una temperatura superior a 37 grados Celsius] y [Actividad del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa determinada luego de incubar en ausencia de sacarosa a una temperatura de 37 grados Celsius].
La termoestabilidad en presencia de sacarosa de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad residual en maltotriosa de una variante determinada luego de incubar en presencia de sacarosa a una temperatura superior a 37 grados Celsius] y [Actividad en maltotriosa de la variante determinada luego de incubar en ausencia de sacarosa a una temperatura de 37 grados Celsius],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual en maltotriosa de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa determinada luego de incubar en presencia de sacarosa a una temperatura superior a 37 grados Celsius] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa determinada luego de incubar en ausencia de sacarosa a una temperatura de 37 grados Celsius].
En un aspecto, la termoestabilidad en presencia de sacarosa de una variante de acuerdo con la divulgación puede expresarse como la relación entre
[Actividad residual de la variante en el Ensayo 2F (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad de la variante en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual en maltotriosa del polipéptido de referencia en el Ensayo 2F (tal como se describe en el presente documento)] y [Actividad en maltotriosa del polipéptido de referencia en el Ensayo 2A (tal como se describe en el presente documento)].
El porcentaje que se obtiene de esta manera puede utilizarse como medición para la termoestabilidad en presencia de sacarosa de la variante de acuerdo con la divulgación. Una termoestabilidad en presencia de sacarosa de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
La variante de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
61, 75, 133, 168, 188, 200, 254, 264, 281, 327, 371, 68, 70, 282, 388, 261,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
L61F, L75F, S133T, F168Y, F188I, S200N, V254F, A264S, V281L, N327S, N371G, T68A, W70Y, L282F, L282I, L282M, L282T, L282M, A388L, D261G,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa, teniendo preferiblemente el polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
61, 75, 133, 168, 188, 200, 254, 264, 281, 327, 371, 68, 70, 282, 388, 261,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
L61F, L75F, S133T, F168Y, F188I, S200N, V254F, A264S, V281L, N327S, N371G, T68A, W70Y, L282F, L282I, L282M, L282T, L282M, A388L, D261G,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
70, 188, 200, 254, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
W70Y, F188I, S200N, V254F, L282M,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
70, 188, 200, 254, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
W70Y, F188I, S200N, V254F, L282M,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
61, 75, 133, 168, 188, 200, 254, 264, 281, 327, 371, 68, 70, 282, 388, 261,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
L61F, L75F, S133T, F168Y, F188I, S200N, V254F, A264S, V281L, N327S, N371G, T68A, W70Y, L282F, L282I, L282M, L282T, L282M, A388L, D261G,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia.
La actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. La actividad específica puede determinarse utilizando maltotriosa como sustrato.
La actividad a un pH diferente (determinar pH óptimo) puede determinarse midiendo la actividad en un rango de pH (por ejemplo, 2-12)
El espectro del producto puede determinarse midiendo la cantidad de oligosacáridos diferentes que se forman a partir de almidón, por ejemplo, utilizando HPLC.
La actividad en almidón bruto puede determinarse incubando la enzima con una suspensión de almidón nativo (por ejemplo, trigo o maíz), con posterior centrifugación para eliminar gránulos de almidón, y determinar la cantidad de azúcares reductores liberados (por ejemplo, con el método DNS).
La temperatura óptima alterada puede determinarse midiendo la actividad tal como se describió anteriormente durante un rango de temperatura (por ejemplo, 50-100°C).
La especificidad del sustrato puede determinarse midiendo la actividad tal como se describió anteriormente en diferentes sustratos.
La presente invención también se refiere a métodos para preparar una masa o un producto horneado que comprende incorporar a la masa una cantidad efectiva de la variante de alfa-amilasa, la cual mejora una o más propiedades de la masa o el producto horneado obtenidos a partir de la masa con relación a una masa o un producto horneado en el cual se incorpora un polipéptido base.
La frase "incorporar a la masa" se define en el presente documento como agregar la variante de alfa-amilasa o un polipéptido base a la masa, cualquier ingrediente a partir del cual se elaborará la masa y/o cualquier mezcla de ingredientes de masa con los cuales se elaborará la masa. En otras palabras, la variante de alfa-amilasa o un polipéptido base puede agregarse en cualquier paso de la preparación de la masa y puede agregarse en uno, dos o más pasos. La variante de alfa-amilasa o un polipéptido base para la masa se agregan a los ingredientes de una masa que es amasada y horneada para elaborar el producto horneado utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4.567.046 y los documentos EP-A-426, 211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 y JP-A-63-258528.
La expresión "cantidad efectiva" se define en el presente documento como una cantidad de la variante de alfaamilasa que es suficiente para proporcionar un efecto mensurable en al menos una propiedad de interés de la masa y/o producto horneado. Una cantidad adecuada de variante de alfa-amilasa se ubica en un rango de 0,5-1500 NBAU/kg harina, en una realización 5-200 NBAU/kg harina, en una realización adicional 20-100 NBAU/kg harina. Una cantidad adecuada incluye 1 ppm - 2000 ppm de una enzima que tiene una actividad en un rango de aproximadamente 700 a 1100 NBAU/g. En una realización una cantidad efectiva se ubica en un rango de 10 -200 ppm de una enzima que tiene una actividad en un rango de aproximadamente 700 a 1100 NBAU/g, en otra realización 30-100 ppm de una enzima que tiene una actividad en un rango de aproximadamente 700 a 1100 NBAU/g. En una realización una cantidad efectiva se ubica en un rango de 10 -200 ppm de una enzima que tiene una actividad de aproximadamente 700 a 1100 NBAU/g. En el presente documento, y de aquí en adelante, NBAU significa Nueva Unidad de Amilasa para Horneado, tal como se define en los ejemplos bajo el título Ensayo NBAU La expresión "propiedad mejorada" se define en el presente documento como cualquier propiedad de una masa y/o un producto que se obtienen a partir de la masa, particularmente un producto horneado, el cual se mejora mediante la acción de la variante de alfa-amilasa, la composición de acuerdo con la invención o la premezcla de acuerdo con la invención con relación a una masa o producto en el cual se incorpora un polipéptido base. La propiedad mejorada puede incluir, a modo no taxativo, fuerza aumentada de la masa, elasticidad aumentada de la masa, estabilidad aumentada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, maquinabilidad mejorada de la masa, volumen aumentado del producto horneado, harina mejorada del producto horneado, estructura de la miga mejorada del producto horneado, suavidad de la miga mejorada del producto horneado, formación de ampollas reducida del producto horneado, crocantez mejorada, resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento, dureza reducida luego del almacenamiento y/o antirrancidez mejorada del producto horneado.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona antirrancidez mejorada a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación proporciona antirrancidez mejorada a un producto horneado en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona antirrancidez mejorada a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación proporciona una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una pérdida reducida adicional de resiliencia luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación proporciona una pérdida reducida adicional de resiliencia luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una pérdida reducida adicional de resiliencia luego del almacenamiento a un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 61, 68, 70, 75, 88, 128, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282, 327, 371, 388,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante retrasa adicionalmente la rancidez de un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación retrasa adicionalmente la rancidez de un producto horneado en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a Q13E, L61F, T68A, W70Y, L75F, G88A, F128I, S133T, F168Y, F188I, S200N, A222V, V254F, D261G, A264S, V281L, L282F, L282M, L282I, L282T, N327S, N371G, A388L, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante retrasa adicionalmente la rancidez de un producto horneado en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La propiedad mejorada puede incluir menor tiempo de desarrollo de masa de la masa y/o pegajosidad reducida de la masa.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de plegarse mejorada del producto horneado, tal como la capacidad de plegarse mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir flexibilidad mejorada del producto horneado incluyendo flexibilidad mejorada de una tortilla, un crepe, un pan ácimo, una masa de pizza, un pan roti y/o una rebanada de pan.
La propiedad mejorada puede incluir capacidad de apilarse mejorada de productos horneados planos incluyendo tortillas, crepes, panes ácimos, masas de pizza, panes roti.
La propiedad mejorada puede incluir pegajosidad reducida de fideos y/o flexibilidad aumentada de fideos.
La propiedad mejorada puede incluir aglutinación reducida de fideos cocidos y/o sabor mejorado de fideos aun después de un período de almacenamiento.
La propiedad mejorada puede incluir reducción de formación de fisuras delgadas en un producto en galletas saladas, así como la creación de un efecto de fermentación y desarrollo de sabor mejorado.
La propiedad mejorada puede incluir sensación en la boca mejorada y/o suavidad al apretar mejorada.
La propiedad mejorada puede incluir daño reducido durante el transporte, incluyendo rotura reducida durante el transporte.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan libre de gluten.
La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir resiliencia mejorada tanto inicialmente como, en particular, luego del almacenamiento de pan libre de gluten. La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de pan de centeno.
La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de pan de centeno. La propiedad mejorada puede incluir pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta, etc.
La propiedad mejorada puede incluir dureza reducida luego del almacenamiento de un producto horneado que comprende al menos 5%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 8%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 12%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina, comprendiendo en un aspecto al menos 18%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 20%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 25%p de azúcar, comprendiendo en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina. En el presente documento, 5%p de azúcar significa 50 gramos de azúcar por 1000 gramos de harina utilizados en la receta, etc.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. El producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar, en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
I15V, I16T, M45L, L75V, T94A, T94P, V129A, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, F194Y, L210F, N234P, V254F, V281L, T323N, I325F, S358A, N371G, F652I, Q13E, W70Y, S72T, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, D261G, S133L,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante una dureza reducida adicional luego del almacenamiento a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
15, 16, 45, 75, 94, 94, 129, 134, 174, 177, 178, 186, 194, 210, 234, 254, 281, 323, 325, 358, 371, 652, 13, 70, 72, 282, 283, 284, 261, 133,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante proporciona una pérdida reducida adicional de resiliencia luego del almacenamiento a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar, en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación una pérdida reducida adicional de resiliencia a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar, en comparación con el polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
I15V, I16T, M45L, L75V, T94A, T94P, V129A, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, F194Y, L210F, N234P, V254F, V281L, T323N, I325F, S358A, N371G, F652I, Q13E, W70Y, S72T, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, D261G, S133L,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante una pérdida reducida adicional de resiliencia luego del almacenamiento a un producto horneado, comprendiendo dicho producto horneado al menos 5%p de azúcar en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 8%p de azúcar, en un aspecto al menos 12%p de azúcar, en un aspecto al menos 15%p de azúcar en base a la harina. En un aspecto adicional de esta realización, el producto horneado comprende al menos 18%p de azúcar, en un aspecto al menos 20%p de azúcar, en un aspecto al menos 25%p de azúcar, en un aspecto al menos 30%p de azúcar en base a la harina.
Sensación en la boca mejorada incluye sensación de suavidad en el primer bocado o luego de masticar, preferiblemente sin una sensación pegajosa en la boca y/o sin que el producto horneado se quede adherido a los dientes. Sensación en la boca mejorada incluye que el producto horneado se sienta menos seco en la boca en el primer bocado o luego de masticar. Sensación en la boca mejorada incluye que el producto horneado se sienta menos seco en la boca en el primer bocado o luego de masticar después de haber sido dejado fuera de su envase original o recipiente. La propiedad mejorada puede incluir que luego de que una rebanada de pan se sacó de su envase original o recipiente y se expuso a condiciones ambiente durante 5 minutos, en un aspecto durante 10 minutos, en un aspecto durante 20 minutos, ha mejorado su sensación en la boca.
La propiedad mejorada puede incluir que, luego de que una galletita se sacó de su envase original o recipiente y se expuso a condiciones ambiente durante 10 minutos, en un aspecto durante 20 minutos, en un aspecto durante 30 minutos, en un aspecto una hora, ha mejorado su sensación en la boca.
En un aspecto, condiciones ambiente en el presente documento y de aquí en adelante incluyen una temperatura de 20 grados C y un nivel de humedad del 40%.
Rotura reducida durante el transporte incluye que el producto horneado, incluyendo a modo no taxativo galletitas, pan tal como pan libre de gluten, no se rompe en más pedazos como consecuencia del transporte.
Suavidad al apretar mejorada incluye la experiencia táctil de sostener un bollo entre el pulgar y los otros dedos de una mano y, al acercar los dedos, menos fuerza es necesaria.
Capacidad de plegarse mejorada de un producto horneado puede determinarse como se indica a continuación. El producto horneado se coloca sobre una superficie plana. El producto horneado se pliega tomando un borde del producto y colocándolo sobre el borde opuesto del producto. De esta forma, se obtiene un producto horneado plegado que tiene una curvatura en un área ubicada en o cerca del centro. La superficie de la parte exterior de la curvatura del producto horneado plegado se inspecciona visualmente. La capacidad de plegarse mejora si se observan menos fisuras en o cerca de la curvatura. Esta puede ser una propiedad particularmente útil si el producto horneado es una tortilla y/o una rebanada de pan.
La capacidad de apilarse mejorada puede determinarse como se indica a continuación.
10 productos horneados se apilan uno sobre el otro y se sellan en un paquete de polímero, tal como una lámina de polietileno. Esto proporciona un paquete de productos horneados. 10 paquetes de productos horneados se apilan uno sobre el otro y se mantienen en condiciones ambiente durante 3 días, en un aspecto durante 5 días, en un aspecto durante 1 semana, en un aspecto durante 2 semanas. Las condiciones ambiente son condiciones tal como se definen en la presente. Después de este período se abre el paquete inferior de productos horneados, los productos horneados se separan entre sí y las superficies de los productos se inspeccionan visualmente. La capacidad de apilarse mejora si se observa menos daño en la superficie. El daño a la superficie puede ser causado por ejemplo, por la ruptura de la superficie durante la separación de dos productos horneados que se apilaron uno sobre el otro. Esta puede ser una propiedad particularmente útil si el producto horneado es una tortilla.
El menor tiempo de desarrollo de la masa puede determinarse como se indica a continuación.
El tiempo de desarrollo de la masa es el tiempo que la masa necesita para alcanzar la consistencia máxima, viscosidad máxima antes de que los hebras de gluten comiencen a romperse. Puede determinarse midiendo el tiempo pico, utilizando un Farinograph® de Brabender®, Alemania. Si se usa un farinógrafo para determinar el tiempo de desarrollo de la masa, el tiempo de desarrollo de la masa es el tiempo entre el momento que se agrega agua y el momento que la curva alcanza su punto más alto. El tiempo pico se expresa preferiblemente en minutos. La pegajosidad de la masa reducida puede determinarse como se indica a continuación.
La pegajosidad de la masa se determina preferiblemente en dos lotes separados de al menos 8 piezas de masa, con el Analizador de textura TAXT2i (Stable Micro Systems Ltd., Surrey, Reino Unido) equipado con una celda de carga de 5 kg en la fuerza de medición en el modo de compresión con una sonda cilíndrica (25 mm de diámetro). Utilizando las velocidades pre- y post-prueba de 2,0 mm/s, mientras que la velocidad de prueba es 1,0 mm/s. Las piezas de masa están centradas y comprimidas al 50% y la sonda se mantiene durante 10 s a una compresión máxima. Un valor pico negativo indica la pegajosidad de la masa. Un valor pico menos negativo indica una pegajosidad de masa reducida.
La flexibilidad aumentada puede determinarse como se indica a continuación.
El producto horneado se coloca sobre una superficie plana. El producto horneado se enrolla hasta obtener una forma similar a un tubo. De esta forma, se obtiene un producto horneado enrollado. La flexibilidad mejora si el producto horneado enrollado mantiene su forma enrollada y no se abre. Esta puede ser una propiedad particularmente útil si el producto horneado es una tortilla o un crepe.
La propiedad mejorada puede determinarse comparando una masa y/o un producto horneado preparado con y sin adición del polipéptido (aislado) de la presente invención de acuerdo con los métodos que se describen a continuación en los Ejemplos. Las cualidades organolépticas pueden evaluarse utilizando procedimientos bien establecidos en la industria panadera y puede incluir, por ejemplo, el uso de un panel de catadores entrenados. La expresión "fuerza aumentada de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que tiene generalmente más propiedades elásticas y/o requiere más agregado de trabajo para moldear y dar forma. La expresión "elasticidad aumentada de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que tiene una tendencia más alta para recuperar su forma original después de ser sometida a determinada cepa física.
La expresión "estabilidad aumentada de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que es menos susceptible a formar fallas como consecuencia de abuso mecánico manteniendo mejor así su forma y volumen y se evalúa mediante la relación entre altura: ancho de una sección transversal de una hogaza después de un levado normal y/o extendido.
La expresión "pegajosidad reducida de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que tiene menos tendencia a adherirse a superficies, por ejemplo, en la maquinaria de producción de masa, y es evaluada empíricamente por el panadero evaluador experto o medida mediante el uso de un analizador de textura (por ejemplo, un TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica.
La expresión "extensibilidad mejorada de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que puede someterse a mayor deformación o estiramiento sin ruptura.
La expresión "maquinabilidad mejorada de la masa" se define en el presente documento como la propiedad de una masa que generalmente es menos pegajosa y/o más firme y/o más elástica. Consecuentemente hay menos suciedad en el equipo de la planta y menos necesidad de limpieza.
La expresión "volumen aumentado del producto horneado" se mide preferiblemente como el volumen de una hogaza dada de pan determinada por un analizador de volumen de pan automatizado (por ejemplo, BVM-3, TexVol Instruments AB, Viken, Suecia), utilizando ultrasonido o detección láser tal como se conoce en la técnica. En el caso de que se aumente el volumen, la propiedad se mejora. De forma alternativa, la altura del producto horneado después del horneado en el mismo tamaño de molde es indicación del volumen del producto horneado. Cuando la altura del producto horneado ha aumentado, el volumen del producto horneado ha aumentado.
La expresión "formación de ampollas reducida del producto horneado" se define en el presente documento como una reducción en la formación de ampollas visualmente determinada en la corteza del pan horneado.
La expresión "estructura de la miga mejorada del producto horneado" se define en el presente documento como la propiedad de un producto horneado con alvéolos más delgados y/o paredes de alvéolos más delgadas en la miga y/o distribución más uniforme/homogénea de los alvéolos en la miga y normalmente se evalúa visualmente por el panadero o por análisis de imágenes digitales tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd, Appleton, Warrington, Reino Unido).
La expresión "suavidad del producto horneado mejorada" es el opuesto de "dureza" y se define en el presente documento como la propiedad de un producto horneado que se comprime más fácilmente y se evalúa ya sea empíricamente por el panadero experto o se mide por el uso de analizador de textura (por ejemplo, TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica. La "dureza" puede evaluarse de manera adecuada ya sea empíricamente por el panadero evaluador experto o medirse mediante el uso de un analizador de textura (por ejemplo, TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica.
La "resiliencia" de un producto horneado puede medirse mediante el uso de un analizador de textura (por ejemplo, TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica.
La "cohesión mejorada del producto horneado" puede demostrarse mediante la medición a través del uso de un analizador de textura (por ejemplo, TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica. Si se usa un analizador de textura, la cohesión es cuán bien el producto resistió una segunda deformación con relación a cómo se comportó en la primera deformación. Se mide como el área de trabajo durante la segunda compresión dividida por el área de trabajo durante la primera compresión. La cohesión puede utilizarse para evaluar el comportamiento de comer / masticar el producto horneado.
La expresión "sabor mejorado del producto horneado" se evalúa mediante un panel de catadores entrenados.
La expresión "antirrancidez mejorada del producto horneado" se define en el presente documento como las propiedades de un producto horneado que tienen una velocidad reducida de deterioro de parámetros de calidad, por ejemplo, dureza reducida luego del almacenamiento y/o pérdida reducida de resiliencia luego del almacenamiento. Las propiedades de antirrancidez pueden demostrarse mediante una dureza reducida luego del almacenamiento del producto horneado. La composición de la enzima de acuerdo con la invención o la premezcla de acuerdo con la invención pueden dar como resultado una dureza reducida, por ejemplo, en un producto horneado que se comprime más fácilmente. La dureza del producto horneado puede ser evaluada de forma empírica por un panadero catador experto o medirse mediante el uso de analizador de textura (por ejemplo, TAXT Plus) tal como se conoce en la técnica. La dureza medida dentro de las 24 horas después del horneado se denomina dureza inicial. La dureza medida 24 horas o más después del horneado se denomina dureza luego del almacenamiento y es también una medición para determinar la vida útil. En el caso de que la dureza inicial se haya reducido, ha mejorado. En el caso de que la dureza luego del almacenamiento se haya reducido, ha mejorado. Preferiblemente dureza se mide tal como se describe en el Ejemplo 9 en el presente documento. La resiliencia del producto horneado se mide preferiblemente mediante el uso de analizador de textura (por ejemplo, TAXTPlus) tal como se conoce en la técnica. La resiliencia medida dentro de las 24 horas posteriores al horneado se denomina resiliencia inicial. La resiliencia medida 24 horas o más después del horneado se denomina resiliencia luego del almacenamiento y es también una medición para determinar la vida útil. El producto recién horneado típicamente tiene una miga de gran resiliencia inicial pero la resiliencia se pierde a lo largo de su vida útil. Las propiedades de antirrancidez mejorada pueden demostrarse mediante una pérdida reducida de resiliencia durante el almacenamiento. Preferiblemente la resiliencia se mide tal como se describe en el Ejemplo 9 en el presente documento.
La expresión "crocantez mejorada" se define en el presente documento como la propiedad de un producto horneado de brindar una sensación más crocante que un producto de referencia tal como se conoce en la técnica, así como de mantener esta percepción más crocante durante un tiempo más prolongado que un producto de referencia. Esta propiedad puede cuantificarse midiendo una curva de fuerza versus distancia a una velocidad fija en un experimento de compresión utilizando por ejemplo, un analizador de textura TA-XT Plus (Stable Micro Systems Ltd, Surrey, Reino Unido), y obteniendo parámetros físicos de esta curva de compresión, a saber, (i) fuerza del primer pico, (ii) distancia del primer pico, (iii) la pendiente inicial, (iv) la fuerza del pico más alto, (v) el área bajo la gráfica y (vi) la cantidad de eventos de fractura (la fuerza disminuye más que determinado valor presente). Las indicaciones de una crocantez mejorada son una fuerza mayor del primer pico, una distancia menor del primer pico, una pendiente inicial más alta, una fuerza más alta del pico más alto, un área más alta bajo la gráfica y un mayor número de eventos de fractura. Un producto más crocante debería puntuar estadísticamente mejor de manera significativa en al menos dos de estos parámetros en comparación con un producto de referencia. En la técnica, "crocantez" también se refiere a textura crujiente, lo que significa un material con un comportamiento de fractura crocante y crujiente.
La presente divulgación puede proporcionar una masa que tiene al menos una de las propiedades mejoradas que se selecciona del grupo que consiste en fuerza aumentada, elasticidad aumentada, estabilidad aumentada, pegajosidad reducida, y/o extensibilidad mejorada de la masa.
La divulgación también puede proporcionar un producto horneado que tiene un volumen de hogaza aumentado. La divulgación puede proporcionar asimismo un producto horneado que tiene al menos una propiedad mejorada que se selecciona del grupo que consiste en volumen aumentado, sabor mejorado, estructura de la miga mejorada, suavidad de la miga mejorada, crocantez mejorada, formación de ampollas reducida y/o antirrancidez mejorada.
La composición de la enzima de acuerdo con la invención o la premezcla de acuerdo con la invención pueden utilizarse para retrasar la rancidez de un producto horneado tal como pan y/o torta. El retraso de la rancidez puede indicarse mediante una dureza reducida, en particular una dureza reducida luego del almacenamiento en comparación con un producto horneado, incluyendo pan y torta, que se produce con la variante de alfa-amilasa en comparación con un polipéptido base.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
La Tabla 1 establece posiciones que pueden influir en propiedades específicas de las variantes alfa-amilasa de la divulgación.
Por lo tanto, la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169., 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176, 77, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante demuestra cualquiera de a) termoestabilidad aumentada; o
b) actividad específica aumentada; o
c) tolerancia a la sacarosa aumentada; o
d) mayor estabilidad/actividad en un rango de pH diferente; o
e) cambio en el espectro del producto (que se define como la relación de un producto con respecto a otro); o
f) actividad aumentada en almidón bruto; o
g) temperatura óptima alterada; o
h) especificidad del sustrato alterada; o
i) productividad aumentada en la producción de la variante de alfa-amilasa; en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
Se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante demuestra cualquiera de a) termoestabilidad aumentada; o
b) actividad específica aumentada; o
c) tolerancia a la sacarosa aumentada; o
d) mayor estabilidad/actividad en un rango de pH diferente; o
e) cambio en el espectro del producto (que se define como la relación de un producto con respecto a otro); o f) actividad aumentada en almidón bruto; o
g) temperatura óptima alterada; o
h) especificidad del sustrato alterada; o
i) productividad aumentada en la producción de la variante de alfa-amilasa; en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
La variante de alfa-amilasa que se describe en el presente documento, es una variante de alfa-amilasa que tiene al menos 80% de identidad, en un aspecto al menos 85% de identidad, en un aspecto al menos 90% de identidad, en un aspecto al menos 95% de identidad, en un aspecto al menos 98% de identidad, en un aspecto al menos 99% de identidad, en un aspecto al menos 99,5% de identidad, con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
en donde al menos un residuo de aminoácido de la variante se sustituye en una posición que se selecciona del grupo que consiste en 4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una actividad específica que es mayor a al menos un pH, preferiblemente un pH entre 4 y 8, que la del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 medido al mismo pH y/o en donde la variante tiene un pH óptimo que es más alto que el del polipéptido tal como se establece en la SEQ iD NO: 2.
Una variante de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación puede tener un pH óptimo que está alterado en comparación con el polipéptido base.
Una variante de alfa-amilasa puede tener un pH óptimo que es más alto que el del polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa o más bajo que dicho polipéptido base. En un aspecto el pH óptimo de la proteína variante de alfa-amilasa es más alto que el del polipéptido base. Preferiblemente el polipéptido base es aquel de acuerdo con la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, la alfa-amilasa natural de Alicydobacillus pohliae (tal como se divulga en la SEQ ID NO: 2) tiene un pH óptimo de pH 4 a pH 5. Una variante de alfa-amilasa puede ser más alcalófila que dicha enzima natural, es decir, puede, por ejemplo, tener un pH óptimo de pH 5 a pH 8, preferiblemente de pH 6 a pH 7. Opcionalmente una proteína variante puede ser más acidófila que la alfa-amilasa natural.
Una variante de alfa-amilasa puede tener un pH, el cual es más alto que el pH óptimo y al cual todavía se encuentre presente el 50% de la actividad de alfa-amilasa, (que, de aquí en más, se indica como pH alcalino), que es más alto que el de la alfa-amilasa base. Cuando el polipéptido base que tiene actividad de alfa-amilasa es aquel de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 la proteína variante puede tener un pH alcalino al cual se observa el 50% de la actividad que es al menos 6,9, preferiblemente, al menos 7,0, al menos 7,5, preferiblemente al menos 8.
Una variante que exhibe una propiedad mejorada en relación con el polipéptido base que tiene actividad de alfaamilasa es una que demuestra una reducción o aumento mensurables en la propiedad relevante, de forma tal que típicamente la variante es más adecuada para utilizar tal como se establece más adelante, por ejemplo, en un método para la producción de un alimento.
Una variante de alfa-amilasa puede tener una actividad específica que es más alta que la del polipéptido base medida al mismo pH. En el presente documento, por actividad específica de una proteína variante se entiende la actividad de alfa-amilasa de la variante de alfa-amilasa medida en unidades/mg de proteína pura. Preferiblemente, la actividad específica de la variante de alfa-amilasa de acuerdo es mayor que al menos un pH, preferiblemente un pH entre 4 y 8, que el del polipéptido base medida al mismo pH.
la variante de alfa-amilasa puede tener un aminoácido Cys en cualquiera de 4 y 505, 77 y 88, 78 y 134, 82 y 144,
207 y 676, 207 y 676, 207 y 677, 240 y 583, 488 y 467, 536 y 548, 583 y 236, 588 y 651 o 677 y 204, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante tiene una o más propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
En una realización la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención el polipéptido de referencia es la alfaamilasa de la SEQ ID NO: 2
La variante de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195,
199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260,
261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334,
350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583,
588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2 y en donde la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada; o
b) actividad específica aumentada; o
c) tolerancia a la sacarosa aumentada; o
d) mayor estabilidad/actividad en un rango de pH diferente; o
e) cambio en el espectro del producto (que se define como la relación de un producto con respecto a otro); o
f) actividad aumentada en almidón bruto; o
g) temperatura óptima alterada; o
h) especificidad del sustrato alterada; o
i) productividad aumentada en la producción de la variante de alfa-amilasa; en comparación con un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa.
Un polipéptido de referencia preferido adecuado para utilizar en la invención es el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o que tiene al menos 80% de homología con la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, al menos 85% de homología con la SEQ ID NO: 2, tal como al menos 85% de homología con la SeQ ID NO: 2, tal como al menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%
o al menos 99,5% de homología con la SEQ ID NO: 2.
Los residuos de aminoácidos en una alfa-amilasa variante de la divulgación que pueden sustituirse en comparación con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 son los que corresponden a las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41 , 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,
116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,
139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,
162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184,
185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207,
208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 251, 253 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 551 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 378, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686,
tal como se define con relación a la secuencia de la SEQ ID NO: 2.
Los residuos de aminoácidos en una alfa-amilasa variante que pueden sustituirse en comparación con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 son los que corresponden a las posiciones
4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
tal como se define con relación a la secuencia de la SEQ ID NO: 2.
Una alfa-amilasa variante de la invención puede comprender una sustitución en una o más de dichas posiciones, por ejemplo, en dos, tres, cuatro, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45 o al menos 50 o en todas dichas posiciones.
Una alfa-amilasa variante de la invención puede comprender una o más sustituciones tal como se define anteriormente. Una "sustitución” en este contexto indica que una posición en la variante que corresponde a una de las posiciones establecidas anteriormente en la SEQ ID NO: 2 comprende un residuo de aminoácido que no aparece en dicha posición en el polipéptido de referencia (el polipéptido de referencia puede ser SEQ ID NO: 2).
En las siguientes Tabla 1 y Tabla 2 se establecen sustituciones preferidas (estando las posiciones definidas con relación a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2).
Una variante puede generarse utilizando cualquier combinación de sustituciones establecida en Tabla 1 y/o Tabla 2. Tabla 1. Sustituciones preferidas definidas con relación a la SEQ ID NO: 2
Los aminoácidos se describen de acuerdo con la anotación de una sola letra.
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Figure imgf000043_0002
*) significado de: A4C-A505C significa 2 sustituciones: tanto el aminoácido en la posición 4 como el aminoácido en la posición 505 se cambian a una C, es decir, A4 se cambia a 4C y A505 cambia a 505C, y como resultado la variante tiene un aminoácido Cys tanto en 4 como en 505; N77C-G88C significa que tanto N77 como G88 se cambian a un aminoácido C, como resultado la variante tiene un aminoácido Cys tanto en 77 como en 88, etc.
En otras palabras, A4C-A505C significa que tanto el aminoácido en la posición 4 como el aminoácido en la posición 505 se cambian a una C, es decir, Alanina en la posición 4 se cambia a Cisteína en la posición 4 y Alanina en la posición 505 se cambia a Cisteína en la posición 505, etc.
Tabla 2 Posibles sustituciones, posición con referencia a SEQ ID NO: 2
Los aminoácidos se describen de acuerdo con la anotación de una sola letra.
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El polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, puede ser la variante que tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende una sustitución del residuo de aminoácido 133, definiéndose dicha posición con referencia a la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, puede ser la variante que tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende una sustitución del residuo de aminoácido 133, definiéndose dicha posición con referencia a la SEQ ID NO: 2, en donde la sustitución es S133L.
El polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, puede ser la variante que tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende una sustitución del residuo de aminoácido 554, definiéndose dicha posición con referencia a la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, puede ser la variante que tiene una secuencia de aminoácidos que, al alinearse con la alfa-amilasa que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, comprende una sustitución del residuo de aminoácido 554, definiéndose dicha posición con referencia a la SEQ ID NO: 2, en donde la sustitución es A554G.
Una alfa-amilasa variante de la invención también puede comprender modificaciones adicionales en comparación con la base en posiciones diferentes a las especificadas anteriormente, por ejemplo, una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones adicionales. Una variante de la invención puede comprender una combinación de diferentes tipos de modificaciones de este tipo. Una variante puede comprender una, dos, tres, cuatro, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o más dichas modificaciones (que pueden ser todas del mismo tipo o pueden ser de diferentes tipos de modificación). Típicamente, las modificaciones adicionales serán sustituciones.
Una variante de acuerdo con la invención puede tener al menos 80% de homología con el polipéptido de alfaamilasa de referencia, tal como la alfa-amilasa de la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, al menos 85% de homología con el polipéptido base, tal como 90% de homología con el polipéptido base, al menos 95% de homología con el polipéptido base, al menos 98% de homología con el polipéptido base, al menos 99% de homología con el polipéptido base o al menos 99,5% de homología con el polipéptido base.
Una variante de la invención típicamente retendrá la actividad de alfa-amilasa. Es decir, una variante de la invención típicamente será capaz de presentar actividad de alfa-amilasa. La actividad de alfa-amilasa puede determinarse de forma adecuada utilizando el procedimiento Ceralpha® recomendado por la Asociación Americana de Químicos Cerealeros (AACC). Todas las variantes que se indican en la Tabla 1 en el presente documento mostraron actividad de alfa-amilasa en el ensayo CERALPHA. El polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 mostró actividad de alfa-amilasa en el ensayo CERALPHA.
Una variante de la invención típicamente será una enzima que degrada almidón.
En una realización del polipéptido variante de acuerdo con la divulgación, el polipéptido variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
y, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 15, 16, 20, 45, 61, 68, 70, 72, 75, 77, 78, 88, 94, 124, 126, 128, 129, 129, 133, 134, 136, 168, 174, 177, 178, 186, 188, 194, 195, 199, 200, 210, 219, 222, 225, 234, 254, 261, 264, 267, 269, 271, 281, 282, 283, 284, 288, 323, 325, 327, 331, 334, 358, 370, 371, 377, 388, 421, 450, 652,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada;
b) tolerancia a la sacarosa aumentada;
c) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
d) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
La variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la divulgación que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
13, 15, 16, 20, 45, 61, 68, 70, 72, 75, 77, 78, 88, 94, 124, 126, 128, 129, 129, 133, 134, 136, 168, 174, 177, 178, 186, 188, 194, 195, 199, 200, 210, 219, 222, 225, 234, 254, 261, 264, 267, 269, 271, 281, 282, 283, 284, 288, 323, 325, 327, 331, 334, 358, 370, 371, 377, 388, 421, 450, 652,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2; y
la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada;
b) tolerancia a la sacarosa aumentada;
c) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
d) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2;
y la variante tiene al menos 75%, en un aspecto al menos 80%, en un aspecto al menos 85%, en un aspecto al menos 90%, en un aspecto al menos 95%, en un aspecto al menos 96%, en un aspecto al menos 97%, en un aspecto al menos 98%, en un aspecto al menos 99%, en un aspecto al menos 99,5% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante de acuerdo con la divulgación, el polipéptido variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
y, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
45, 68, 70, 72, 88, 94, 133, 134, 168, 186, 188, 200, 222, 254, 261, 264, 281, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada;
b) tolerancia a la sacarosa aumentada;
c) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
d) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante de acuerdo con la divulgación, el polipéptido variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
y, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 68, 72, 88, 133, 168, 188, 200, 222, 254, 261, 281, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada;
b) tolerancia a la sacarosa aumentada;
c) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
d) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante de acuerdo con la divulgación, el polipéptido variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
y, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos
68, 282,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante demuestra cualquiera de
a) termoestabilidad aumentada;
b) tolerancia a la sacarosa aumentada;
c) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
d) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido variante de acuerdo con la divulgación, el polipéptido variante tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2,
y, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 13, 15, 16, 20, 45, 61, 68, 70, 72, 75, 77, 78, 88, 94, 124, 126, 128, 129, 129, 133, 134, 136, 168, 174, 177, 178, 186, 188, 194, 195, 199, 200, 210, 219, 222, 225, 234, 254, 261, 264, 267, 269, 271, 281, 282, 283, 284, 288, 323, 325, 327, 331, 334, 358, 370, 371, 377, 388, 421, 450, 652,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante demuestra cualquiera de
e) termoestabilidad aumentada;
f) tolerancia a la sacarosa aumentada;
g) relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada; o
h) termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa
en comparación con un polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, mientras que la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 10% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto de esta realización, la actividad específica de la variante se ha reducido a lo sumo 20%, en un aspecto a lo sumo 30%, en un aspecto a lo sumo 40%, en un aspecto a lo sumo 50% en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica de la variante es al menos igual o ha aumentado en comparación con el polipéptido de referencia. En un aspecto adicional de esta realización, la actividad específica se determina utilizando maltotriosa como sustrato.
Preferiblemente, una variante divulgada en el presente documento típicamente exhibirá propiedades mejoradas en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa de referencia del cual deriva. Dicha propiedad mejorada típicamente será una que es relevante si la variante fuera usada tal como se establece en el presente documento, por ejemplo, en un método para preparar un producto horneado.
Una variante que exhibe una propiedad mejorada en relación con la alfa-amilasa de referencia es una que demuestra una reducción o aumento mensurables en la propiedad relevante, de forma tal que típicamente la variante es más adecuada para utilizar tal como se establece en el presente documento, por ejemplo, en un método para la producción de un producto horneado.
La propiedad puede reducirse de esta forma al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99%. De forma alternativa, la propiedad puede aumentar al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 100%, al menos, 200%, al menos 500% o al menos 1000%. La disminución o aumento del porcentaje en este contexto representa la disminución o aumento del porcentaje en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa de referencia. El experto en la técnica sabe bien cómo pueden medirse dichos cambios porcentuales - es una comparación de la actividad de la alfa-amilasa de referencia y la variante alfa-amilasa.
Las variantes descritas en el presente documento están comprendidas colectivamente en los términos "un polipéptido de acuerdo con la invención" o "una variante de acuerdo con la invención".
Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término puede usarse de manera intercambiable según lo requiera el contexto para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces de peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de aproximadamente siete residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en el presente documento están escritas de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. El código de una letra de aminoácidos usados en el presente documento se conoce comúnmente en la técnica y puede encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Un polipéptido de la invención puede estar en forma aislada, tal como forma básicamente aislada. Por polipéptido o proteína "aislada" se pretende un polipéptido o proteína retirada de su ambiente nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos recombinantemente expresados en células huéspedes son considerados aislados a efectos de la invención como lo son los polipéptidos recombinantes que han sido básicamente purificados por cualquier técnica adecuada. Un polipéptido variante de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en la técnica.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos por técnicas recombinantes de un huésped procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, planta superior, insecto y mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el huésped.
La divulgación también proporciona fragmentos biológicamente activos de las variantes de polipéptido de acuerdo con la invención. Dichos fragmentos se consideran abarcados en la expresión "una variante de la divulgación". Fragmentos biológicamente activos de una variante de polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos lo suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de una proteína variante de la invención que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa pero que exhiben al menos una actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una proteína variante de la invención. Un fragmento biológicamente activo de una proteína de la divulgación puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Más aun, pueden prepararse otras porciones biológicamente activas, en las cuales se eliminan otras regiones de la proteína, mediante técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención.
Típicamente, un fragmento de proteína comprenderá una o más de las sustituciones definidas en la presente.
La divulgación también proporciona fragmentos de ácido nucleico que codifican el activo biológicamente anterior. Como se estableció anteriormente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican las variantes de polipéptidos de la invención. La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido variante de la invención. Típicamente, dicho dominio comprenderá una o más de las sustituciones descritas en la presente.
La secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es una variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más truncaciones y/o al menos una sustitución, eliminación y/o inserción de un aminoácido en comparación con la alfa-amilasa base. Sin embargo, dicho polipéptido típicamente comprenderá una o más de las sustituciones descritas en la presente.
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una variante tal como se describe en el presente documento. Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias de codificantes, intrones y secuencias reguladoras. Es decir, un "gen", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse a una molécula de ácido nucleico aislada tal como se define en la presente. Por lo tanto, el término "gen", en el contexto de la presente solicitud, no se refiere solamente a secuencias naturales.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede generarse utilizando técnicas biológicas moleculares estándar bien conocidas para los expertos en la técnica tomadas en combinación con la información de secuencia proporcionada en la presente.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede adaptarse de acuerdo con el método que se describe en la solicitud de patente US090286280.
Por ejemplo, utilizando técnicas sintéticas estándar, la molécula de ácido nucleico requerida puede sintetizarse de novo. Dicho proceso sintético típicamente será un proceso automatizado.
De forma alternativa, una molécula de ácido nucleico de la invención puede generarse por el uso de mutagénesis dirigida al sitio de una molécula de ácido nucleico existente, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico natural. La mutagénesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo utilizando una cantidad de técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica.
En dicho método, mencionado aquí meramente a modo de ejemplo, se lleva a cabo la PCR en una plantilla de plásmido utilizando "cebadores" de oligonucleótidos que codifican la sustitución deseada. Debido a que los cebadores son los extremos de hebras recientemente sintetizadas, en caso de que haya una no coincidencia durante el primer ciclo al unir la hebra de ADN de la plantilla, después de esa primera ronda, la hebra en base a cebador (que contiene la mutación) tendría la misma concentración que la plantilla original. Después de sucesivos ciclos, crecería exponencialmente, y después de 25, superaría a la hebra original sin mutar en la región de 8 millones: 1, resultando en una solución casi homogénea de los fragmentos amplificados mutados. El ADN de plantilla puede eliminarse entonces mediante digestión enzimática, por ejemplo, utilizando una enzima de restricción que escinde solamente ADN metilado, tal como Dpn1. La plantilla, que deriva de una preparación de plásmido de lisis alcalino y de esta manera se metila, se destruye en este paso, pero el plásmido mutado se conserva debido a que se generó in vitro y no se metila como resultado.
En dicho método más de una mutación (que codifica una sustitución tal como se describe en el presente documento) puede introducirse en una molécula de ácido nucleico en una única reacción de PCR, por ejemplo, al utilizar uno o más oligonucleótidos, comprendiendo cada uno una o más no coincidencias. De forma alternativa, puede introducirse más de una mutación en una molécula de ácido nucleico al llevar a cabo más de una reacción de PCR, introduciendo cada reacción una o más mutaciones, de manera que los ácidos nucleicos alterados se introduzcan en el ácido nucleico de manera secuencial e iterativa.
Un ácido nucleico de la invención puede generarse utilizando ADNc, ARNm o de forma alternativa, ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos no coincidentes apropiados de acuerdo con la técnica de mutagénesis dirigida al sitio descrita anteriormente. Una molécula de ácido nucleico derivada de esta manera puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de ADN.
Una secuencia de ácido nucleico de la invención puede comprender una o más eliminaciones, es decir, brechas, en comparación con la alfa-amilasa base. Dichas eliminaciones/brechas también pueden generarse utilizando una mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos apropiados. Las técnicas para generar dichas eliminaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Más aun, los oligonucleótidos que corresponden a o que son hibridables con secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden preparase mediante técnicas sintéticas, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.
Asimismo, las moléculas de ácido nucleico complementarias se incluyen en la presente invención. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una que es lo suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos de manera que puede hibridarse con la otra secuencia de nucleótidos, formando así un complejo estable.
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una variante de la invención, o un fragmento o dominio biológicamente activo de las mismas, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de dichas moléculas de ácido nucleico adecuadas para utilizar como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico, tal como para la preparación de moléculas de ácido nucleico de la invención.
Un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo con ambas de las secuencias de codificación con las cuales es inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del cual deriva. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias 5' no codificantes (por ejemplo, promotoras) que están inmediatamente contiguas a la secuencia de codificación. La expresión, por lo tanto, incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus autónomamente replicante, o en el ADN genómico de una procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o a fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está básicamente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se producen por técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u otros químicos (cuando se sintetizan químicamente). Más aun, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no es natural como un fragmento y no se encontraría en el estado natural.
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede tener una única hebra o doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra. El ácido nucleico puede sintetizarse utilizando análogos de ligonucleótidos o derivados (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato). Dichos oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o mayor resistencia a las nucleasas.
Los términos "homología" o "identidad porcentual" se usan de manera intercambiable en la presente. A efectos de esta invención, se define aquí que para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean a efectos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse brechas en la secuencia de un primer aminoácido o ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico). Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones que se superponen) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.
Puede llevarse a cabo una comparación de secuencias sobre las longitudes completas de las dos secuencias siendo comparadas o sobre un fragmento de las dos secuencias. Típicamente, la comparación se llevará a cabo sobre la longitud completa de las dos secuencias siendo comparadas. Sin embargo, la identidad de la secuencia puede llevarse a cabo sobre una región de, por ejemplo, veinte, cincuenta, cien o más residuos de aminoácidos contiguos. El experto en la técnica será consciente del hecho de que hay disponibles varios programas informáticos diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una comparación de secuencias y determinación de identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. La identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácido o de ácido nucleico se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), utilizando ya sea una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la técnica apreciará que todos estos parámetros diferentes proporcionarán resultados levemente diferentes pero que la identidad porcentual general de dos secuencias no se ve significativamente alterada cuando se utilizan diferentes algoritmos.
Las secuencias de proteína o secuencias de ácido nucleico de la presente divulgación pueden usarse adicionalmente como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse utilizando los programas BLASTN y BLASTP (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteína BLAST pueden realizarse con el programa BLASTP, puntaje = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas para moléculas de proteína de la divulgación. Para obtener alineaciones con brechas a efectos comparativos, puede usarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTP y BLASTN). Consultar la página de inicio del National Center for Biotechnology Information en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de alfa-amilasa variante de la invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomáticos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomáticos) están integrados en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y por lo tanto son replicados junto con el genoma huésped. Más aun, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Estos términos "plásmido" y "vector" pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huéspedes a usar para la expresión, que están operativamente ligadas a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente ligado" se pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a las secuencias reguladoras de manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señal de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, cA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen una expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes y aquellas que dirigen una expresión de la secuencia de nucleótidos solo en cierta célula huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huéspedes para producir así proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, una variante de alfaamilasa de la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, un equivalente o fragmento funcional, o una proteína de fusión que comprende una o más de dichas variantes).
Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse para la expresión de proteínas variantes de la divulgación en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, una proteína variante de la divulgación puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se describen células huéspedes adecuadas en mayor detalle en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). De forma alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras promotoras de T7 y polimerasa de T7.
Vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episomáticos y derivados de virus por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia, adenovirus, viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.
El inserto de ADN debería estar operativamente ligado a un promotor apropiado, tal como al promotor PL fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos SV40 y los promotores de LTR retrovirales, entre otros. Otros promotores adecuados serán conocidos para el experto en la técnica. Se prefieren promotores que son capaces de dirigir un nivel de expresión alto de alfa-amilasa en hongos filamentosos. Dichos promotores son conocidos en la técnica. Los constructos de expresión pueden contener sitios para la iniciación, terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para su traducción. La porción codificante de los transcriptos maduros expresados por los constructos incluirán un AUG de iniciación de traducción en el comienzo y un codón de terminación posicionado aproximadamente en el extremo del polipéptido a traducir.
El ADN vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico ajeno (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio , transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónica o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huéspedes pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.
Para una transfección estable de células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y las técnicas de transfección usadas, solo una pequeña fracción de células puede integrarse en el ADN ajeno en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huéspedes junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metatrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica una proteína variante de la divulgación o puede introducirse en un vector separado. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
La expresión de las proteínas en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles dirigiendo la expresión de proteínas ya sea de fusión o no fusión.
Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden clonarse en un vector adecuado y después de la introducción en un huésped adecuado, la secuencia puede expresarse para producir las variantes de alfaamilasa correspondientes de acuerdo con técnicas de clonación y expresión estándar, que son conocidas para el experto en la técnica (por ejemplo, tal como se describe en (Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). La divulgación también se refiere a aquellos vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación.
Vectores adecuados son los vectores normalmente usados para la clonación y expresión y son conocidos para el experto en la técnica. Ejemplos de vectores adecuados para la expresión en E. coli son proporcionados por ejemplo, en la Tabla 1 en Makrides, S. C., Microbiological Reviews, Vol. 60, No. 3, (1996), 512-538. Preferiblemente, el vector contiene un promotor corriente arriba del sitio de clonación que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad de alfa-amilasa, que puede encenderse después de que el huésped haya sido cultivado para expresar el polipéptido correspondiente que tiene actividad de alfa-amilasa. Los promotores, que pueden encenderse y apagarse son conocidos para el experto en la técnica y son por ejemplo, el promotor lac, el promotor aroH, el promotor araBAD, el promotor T7, el promotor trc, el promotor tac y el promotor trp. Particularmente útiles en el marco de trabajo de la divulgación son por ejemplo, los vectores tales como se describen en el documento WO 00/66751, por ejemplo, pKAFssECtrp o pKAFssECaro sin el inserto, el gen de penicilina G acilasa. Huéspedes adecuados son los huéspedes usados normalmente para la clonación y expresión y son conocidos para el experto en la técnica. Ejemplos de cepas de huésped adecuadas son por ejemplo, cepas de Echerichia coli, por ejemplo, TOP10F', TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21(DE3) y BL21 (DE3)pLysS de E. coli. Particularmente útiles en el marco de trabajo de la divulgación son las cepas K-12 de Escherichia coli, por ejemplo, DH1, HB101, RV308, RR1, W3110, C600 y/o derivados de estas cepas. La elección del vector a veces puede depender de la elección del huésped y viceversa. Si se usa, por ejemplo, un vector con el promotor araBAD, se prefiere una cepa huésped de E. coli que sea incapaz de romper el inductor de arabinosa (ara-).
Los vectores de fusión agregan una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, por ejemplo, al extremo amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación de la afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, el sitio de escisión proteolítico se introduce en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir una separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión.
Como se indica, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables. Dichos marcadores incluyen reductasa de dihidrofolato o resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucariotas y resistencia a la tetraciclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces Salmonella typhimurium y ciertas especies de Bacillus; células fúngicas tales como especies de Aspergillus, por ejemplo, A. niger, A. oryzae y A. nidulans, tales como levadura tal como Kluyveromyces, por ejemplo, K. lactis y/o Puchia, por ejemplo, P. pastoris; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS y Bowes melanoma; y células de plantas. Medios de cultivo y condiciones apropiadas para las células huéspedes descritas anteriormente se conocen en la técnica.
Los vectores preferidos para su uso en bacterias se divulgan por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468, que se incluyen en la presente a modo de referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica.
Promotores bacterianos conocidos incluyen los promotores divulgados en el documento WO-A1-2004/074468. La transcripción del ADN que codifica una variante de la presente invención por eucariotas superiores puede aumentarse al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, a menudo de aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo célula huésped dado. Ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador SV40, que está ubicado en el lado tardío del origen de replicación en los bp 100 a 270, potenciador de promotor temprano citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores del adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, hacia el espacio periplasmático o hacia el ambiente extracelular, una señal de secreción apropiada puede incorporarse en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Una variante de la invención puede expresarse de tal forma que puede incluir regiones funcionales heterólogas adicionales, por ejemplo, señales de secreción. Una variante de la invención también puede comprender, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, agregados al extremo N del polipéptido por ejemplo, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento posterior. Asimismo, pueden agregarse restos de péptido a una variante de la invención para facilitar la purificación, por ejemplo, mediante la adición de residuos de histidina o una etiqueta T7.
Las variantes de la invención, tales como proteínas de la presente invención o equivalentes funcionales de las mismas, por ejemplo, porciones biológicamente activas y fragmentos de las mismas, pueden estar operativamente ligadas a un polipéptido no variante (por ejemplo, secuencias de aminoácidos heterólogas) para formar proteínas de fusión. Un "polipéptido no variante" en este contexto se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es básicamente homóloga a una alfa-amilasa variante de la invención.
Dentro de una proteína de fusión, la variante de la invención puede corresponder a una secuencia de longitud completa o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la invención. Una proteína de fusión puede comprender al menos dos porciones biológicamente activas. Dentro de la proteína de fusión, la expresión "operativamente ligada" pretende indicar que el polipéptido variante y el polipéptido no variante están fusionados dentro del marco entre sí. El polipéptido no variante puede fusionarse al extremo N o extremo C del polipéptido variante.
La expresión y secreción de una alfa-amilasa variante puede mejorarse al expresar la variante en forma de una proteína de fusión. En este contexto, una secuencia de ácido nucleico puede codificarse para una proteína de fusión que comprende pre-alfa-amilasa o alfa-amilasa. Más específicamente, el compañero de fusión puede ser glucoamilasa o un fragmento de la misma. La pre-alfa-amilasa o alfa-amilasa, o una proteína de fusión de la misma, puede secretarse sobre la membrana de la célula huésped.
Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión en la que las secuencias variantes se fusionan al extremo C de las secuencias GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de una variante recombinante de acuerdo con la invención. La proteína de fusión puede ser una variante de la invención que contiene una secuencia de señal heteróloga en su extremo N. En ciertas células huéspedes (por ejemplo, células huéspedes de mamífero y levadura), la expresión y/o secreción de una variante de la invención puede aumentarse a través del uso de una secuencia de señal heteróloga.
En otro ejemplo, la secuencia secretoria de gp67 de la proteína de sobre de baculovirus puede usarse como una secuencia de señal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). Otros ejemplos de secuencias de señal heterólogas eucariotas incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina placentaria humana (Stratagene; La Jolla, California). En otro ejemplo, secuencias de señal heterólogas procariotas útiles incluyen la señal secretoria foA (Sambrook et al., supra) y la señal secretoria de proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nueva Jersey).
Una secuencia de señal puede usarse para facilitar la secreción y aislamiento de una variante de la invención. Las secuencias de señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que generalmente se escinden de la proteína madura durante la secreción de uno o más eventos de escisión. Dichos péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de las proteínas maduras a medida que pasan por la vía secretoria. La secuencia señal puede dirigir la secreción de la variante, tal como desde un huésped eucariota en el que el vector de expresión se transforma, y la secuencia señal puede escindirse entonces posteriormente o simultáneamente. La variante de la invención puede purificarse entonces fácilmente a partir del medio extracelular por métodos conocidos. De forma alternativa, la secuencia señal puede estar ligada a la variante de interés utilizando una secuencia, que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia que codifica la variante de la invención puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación de la variante fusionada de la invención. La secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales están disponibles en el mercado. Tal como se describe en Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza, que se ha descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo. Una proteína de fusión puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptido están ligados junto dentro del marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos de punta roma o punta escalonada para la ligadura, restricción de la digestión de enzimas para proporcionar extremos apropiados, rellenando extremos cohesivos según corresponda, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligadura enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. De forma alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden aparearse y reamplificarse posteriormente para generar una secuencia de genes quiméricos (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Más aun, muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) están disponibles en el mercado. Una variante que codifica ácido nucleico puede clonarse en dicho vector de expresión de manera que el resto de fusión se liga dentro del marco a dicha variante.
Las expresiones "equivalentes funcionales" y "variantes funcionales" se usan de manera intercambiable en la presente. Los equivalentes funcionales son fragmentos de ADN aislado que codifican un polipéptido que exhibe una función particular de una variante tal como se define en la presente. Los equivalentes funcionales, por lo tanto, también abarcan fragmentos biológicamente activos y están ellos mismos incluidos dentro de la expresión "una variante" de la invención.
Preferiblemente, un equivalente funcional comprende una o más de las sustituciones descritas en la presente. Sin embargo, un equivalente funcional puede comprender una o más modificaciones además de las sustituciones descritas anteriormente.
Los equivalentes de ácido nucleico funcionales pueden contener típicamente mutaciones silenciosas o mutaciones que no alteran la función biológica del polipéptido codificado. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína alfa-amilasa variante que contiene cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica en particular. Dichas proteínas variantes difieren en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de alfa-amilasa base de la cual derivan pero aún retienen al menos una actividad biológica de la misma, preferiblemente retienen al menos la actividad de la alfa-amilasa. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos básicamente homóloga de al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, la que se muestra en la SEQ ID NO: 2).
Tal como se define en el presente documento, la expresión "básicamente homóloga" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de manera que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio común. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio común que tienen aproximadamente 60%, preferiblemente 65%, más preferiblemente 70%, incluso más preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o más se definen en el presente documento como suficientemente idénticas.
El experto en la técnica reconocerá que pueden introducirse cambios mediante mutación en las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante sin alterar básicamente la función de dicha proteína.
Por lo tanto, una variante de alfa-amilasa de la invención es preferiblemente una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la secuencia de aminoácidos de referencia, por ejemplo, que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y típicamente también retiene al menos una actividad funcional del polipéptido de referencia. Variantes de la invención, por ejemplo, también pueden identificarse por ejemplo, mediante bibliotecas combinatorias de detección de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncación, de la proteína de la invención para la actividad de alfa-amilasa. Una biblioteca variada de variantes se genera mediante mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico. Una biblioteca variada de variantes puede producirse, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias de genes de manera que un conjunto degenerado de posibles secuencias de proteína es expresable como polipéptidos individuales, o de forma alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la expresión de bacteriófagos). Existe una variedad de métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de posibles variantes de los polipéptidos de la invención de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. Métodos para sintetizar los oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).
Adicionalmente, las bibliotecas de fragmentos de la secuencia que codifica un polipéptido de la invención pueden usarse para generar una población variada de polipéptidos para detectar una selección posterior de variantes. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante puede generarse al tratar un fragmento de PCR de doble hebra de la secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en donde el corte ocurre solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble hebra, renaturalizando el ADN para formar un ADN de doble hebra que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos fragmentados, retirando las porciones de única hebra de dúplex reformados por el tratamiento con nucleasa S1, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica el extremo N y fragmentos internos de varios tamaños de la proteína de interés.
Se conocen varias técnicas en la técnica para detectar productos de genes de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones puntuales de truncación, y para detectar bibliotecas de ADNc para productos de genes que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles a análisis de mayor rendimiento, para detectar bibliotecas de genes grandes típicamente incluyen clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM), una técnica que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de detección para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Los fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Dichos polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales pueden usarse como sondas de hibridación o cebadores de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa incluyen, entre otros, (1) hibridación in situ (por ejemplo, FISH) para dispersiones cromosómicas de metafase para proporcionar una ubicación cromosómica precisa de un gen que codifica alfaamilasa tal como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (2) Análisis Northern blot para detectar la expresión de ARNm de alfa-amilasa en tejidos y/o células específicos; y (3) sondas y cebadores que pueden usarse como una herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable con dicha sonda o cebador en una muestra biológica dada (por ejemplo, tejido).
Variantes de una enzima de alfa-amilasa de referencia dada pueden obtenerse mediante el siguiente procedimiento estándar:
- Mutagénesis (susceptible a errores, oligo adulterado, oligo marcado) o síntesis de variantes
- Transformación en, por ejemplo, B. subtilis
- Cultivo de transformantes, selección de transformantes
- Expresión
- Purificación y concentración opcionales
- Detección primaria
- Identificación de una variante mejorada (por ejemplo, en relación con una actividad específica)
Un método para identificar una alfa-amilasa variante comprende comprende:
a) seleccionar un polipéptido de alfa-amilasa de referencia;
b) sustituir al menos un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 81, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99i, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106i, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 116, 117 118 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, ' 95, 196, 197, 198, ■99, 200,
201 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 224 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246 247 248, 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269 270 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 293 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338 339 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384 385 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407 408 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430 431 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545 546, 547, 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683 684, 685, 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
c) opcionalmente sustituir uno o más aminoácidos adicionales tal como se define en b);
d) preparar la variante que resulta de los pasos a)-c);
e) determinar una propiedad de la variante, por ejemplo, tal como se establece en la descripción; y
f) seleccionar una variante una propiedad alterada en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa de referencia. Un método para identificar una alfa-amilasa variante comprende dicho método comprende:
a) seleccionar un polipéptido de alfa-amilasa de referencia;
b) sustituir al menos un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de
4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
c) opcionalmente sustituir uno o más aminoácidos adicionales tal como se define en b);
d) preparar la variante que resulta de los pasos a)-c);
e) determinar una propiedad de la variante, por ejemplo, tal como se establece en la descripción; y
f) seleccionar una variante una propiedad alterada en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa de referencia. Se proporciona un método para producir una variante de polipéptido de alfa-amilasa de acuerdo con la invención comprendiendo el método:
a) seleccionar un polipéptido de alfa-amilasa de referencia;
b) sustituir al menos un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 81, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99', 100 , 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107., 108, 109, 110, 111, 112., 113, 114, 115, 116, 117 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 251, 253, 254, 255 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347 348, 349, 350, 351, 351, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 451, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 551, 553, 554 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646 647, 648, 649, 650, 651, 651, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 680, 381, 682, 683, 684, 685, 686,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
c) opcionalmente sustituir uno o más aminoácidos adicionales tal como se define en b);
d) preparar la variante que resulta de los pasos a)-c);
e) determinar una propiedad de la variante, por ejemplo, tal como se establece en la descripción; y
f) seleccionar una variante una propiedad alterada en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa de referencia. En una realización en el método para producir una variante de polipéptido de alfa-amilasa, el polipéptido de alfaamilasa de referencia tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2.
Preferiblemente en el paso b) del método al menos un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de 4, 6, 13, 14, 15, 16, 20, 45, 47, 51, 54, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 87, 88, 94, 95, 100, 103, 104, 117, 124, 125, 126, 128, 130, 133, 134, 136, 143, 144, 146, 168, 174, 177, 178, 183, 186, 188, 189, 190, 194, 195, 199, 200, 201, 204, 207, 210, 214, 217, 219, 222, 225, 227, 233, 234, 235, 236, 240, 251, 252, 254, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 269, 271, 273, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 299, 322, 323, 325, 327, 328, 331, 334, 350, 356, 358, 367, 370, 371, 374, 377, 378, 388, 391, 414, 421, 422, 445, 450, 467, 488, 505, 536, 548, 554, 583, 588, 603, 637, 648, 651, 652, 660, 676, 677,
se sustituye, definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2. El polipéptido de referencia puede tener al menos aproximadamente 80% de homología con la SEQ ID NO: 2.
Se proporcionan células, por ejemplo, células huéspedes transformadas o células huéspedes recombinantes que contienen un ácido nucleico incluido en la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la cual (o en el ancestro de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen las células procariotas y eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levadura, y similares, especialmente preferidas son las células de levaduras, por ejemplo, K. lactis. Las células huéspedes también incluyen, a modo no taxativo, líneas celulares de mamífero tales como CHO, VERO, BHK, HeLa, Co S, MDCK, 293, 3T3, WI38, y líneas celulares del plexo coroideo.
Ejemplos de organismos huéspedes bacterianos adecuados son especies bacterianas gram positivas tales como Bacillaceae incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis, especies Streptomyces tal como Streptomyces murinus, especies bacterianas de ácido láctico incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp. y Streptococcus spp. De forma alternativa, pueden seleccionarse cepas de una especie bacteriana gram positiva, tal como una especie que pertenece a Enterobacteriaceae, incluyendo E. coli, o a Pseudomonadaceae, como el organismo huésped.
Un organismo huésped de levadura adecuado puede seleccionarse ventajosamente de una especie de Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenezca a Schizosaccharomyces. Adicionalmente, organismos huéspedes de levadura útiles incluyen Pichia spp. tal como especies metilotróficas de la misma, incluyendo Pichia pastoris, y Klyuveromyces spp. incluyendo Klyuveromyces lactis.
Organismos huéspedes adecuados entre hongos filamentosos incluyen especies de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophtora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma, tal como, por ejemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o Aspergillus niger, incluyendo Aspergillus nigervar. awamori, Fusarium bactridioides, Fusarium cereals, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichiodes, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola langinosa, Mucor miehei, Myceliophtora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium chrysogenum, Penicillium camenbertii, Penicillium purpurogenum, Rhizomucor miehei, Thielavia terestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesii o Trochoderma viride.
Puede elegirse una célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto codificado por la secuencia de ácido nucleico incorporada de manera específica y deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína codificada.
Varias células huéspedes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-translacional y modificación de proteínas y productos génicos. Líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados familiares para los expertos en la técnica de biología molecular y/o microbiología pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento deseados y correctos de la proteína ajena expresada. Con este fin, pueden usarse células huéspedes eucariotas que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación, y fosforilación del producto génico. Dichas células huéspedes son bien conocidas en la técnica.
Si se desea, una línea celular establemente transfectada puede producir una variante de acuerdo con la invención. Una cantidad de vectores adecuados para la transfección estable de células de mamífero están disponibles para el público. Métodos para construir dichas líneas celulares son también públicamente conocidos, por ejemplo, en Ausubel et al. (supra).
Se proporciona una composición enzimática en una forma seca para permitir una fácil adición a la masa, los ingredientes de la masa, pero las formas líquidas también son posibles. Una forma líquida incluye, a modo no taxativo, una emulsión, una suspensión y una solución. Independientemente de la formulación de la composición de la enzima, puede aplicarse cualquier aditivo o aditivos que se conocen son útiles en la técnica para mejorar y/o mantener la actividad de la enzima, la calidad de la masa y/o el producto horneado.
La presente invención adicionalmente describe una composición que comprende las variantes de alfa-amilasa de acuerdo con la invención y uno o más componentes que se seleccionan del grupo que consiste en leche en polvo, gluten, grasa granulada, una enzima adicional, un aminoácido, una sal, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y Azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), saborizantes, ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
En un aspecto de la composición de acuerdo con la invención, la enzima adicional puede incluir una alfa-amilasa adicional, tal como una alfa-amilasa fúngica (que puede ser útil para proporcionar azúcares fermentables por levadura y retardar la rancidez), beta-amilasa, una glucanotransferasa de ciclodextrina, una proteasa, una peptidasa, en particular, una exopeptidasa (que puede ser útil en potenciar el sabor), transglutaminasa, lipasa de triacilglicerol (que puede ser útil para la modificación de lípidos presentes en la masa o constituyentes de la masa para ablandar la masa), galactolipasa, fosfolipasa, celulasa, hemicelulasa, en particular una pentosanasa tal como xilanasa (que puede ser útil para la hidrólisis parcial de pentosanos, más específicamente arabinoxilano, que aumenta la extensibilidad de la masa), proteasa (que puede ser útil para debilitar el gluten en particular cuando se utiliza harina de trigo duro), proteína disulfuro isomerasa, por ejemplo, una proteína disulfuro isomerasa tal como se divulga en el documento WO 95/00636, glicosiltransferasa, peroxidasa (que puede ser útil para mejorar la consistencia de la masa), lacasa u oxidasa, hexosa oxidasa, por ejemplo, una glucosa oxidasa, aldosa oxidasa, piranosa oxidasa, lipoxigenasa o L-aminoácido oxidase (que puede ser útil en mejorar la consistencia de la masa) o una proteasa. En una realización de la composición de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una enzima lipolítica, preferiblemente una fosfolipasa, una galactolipasa o una enzima que tiene tanto actividad fosfolipasa como galactolipasa.
En una realización de la composición de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una fosfolipasa.
En una realización de la composición de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una galactolipasa.
En una realización de la composición de la enzima de acuerdo con la invención la enzima adicional es una enzima que tiene tanto actividad fosfolipasa como galactolipasa.
Enzima lipolítica
Una enzima lipolítica, también denominada lipasa en el presente documento, es una enzima que hidroliza el triacilglicerol y/o galactolípido y/o fosfolípidos.
La actividad de lipasa puede determinarse espectrofotométricamente utilizando el sustrato cromogénico p-nitrofenil palmitato (pNPP, Sigma N-2752). En este ensayo el pNPP se disuelve en 2-propanol (40mg pNPP por 10ml 2-propanol (Merck 1,09634)) y se suspende en solución amortiguadora de acetato 100 mM pH=5,0 que contiene 1,0% de Tritón X-100 (Merck 1,12298) (5ml de sustrato en 45ml de solución amortiguadora). La concentración de sustrato final es 1,1 mM. La lipasa se incuba con esta solución de sustrato a 37°C durante 10 minutos. La reacción se detiene mediante la adición de solución amortiguadora de detención 2% de TRIS (Merck 1,08387) 1% de Triton X-100 en una relación 1:1 con respecto a la mezcla de reacción y posteriormente el p-nitrofenol formado (pNP) se mide a 405 nm. Este ensayo también puede aplicarse a diferentes valores de pH para determinar la dependencia del pH de una lipasa. Se debería comprender que a diferentes valores de pH podrían requerirse diferentes tampones o diferentes detergentes podrían ser necesarios para emulsionar el sustrato. Una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones de reacción establecidas. Se debería comprender que no es una práctica poco común en el análisis de rutina usar soluciones enzimáticas de calibración estándar con actividad conocida determinada en un ensayo diferente para correlacionar la actividad de un ensayo dado con unidades como se determinaría en el ensayo de calibración.
De forma alternativa, la actividad de lipasa puede determinarse utilizando 2, 3-mercapto-1-propanol-tributirato (TBDMP) como sustrato. La lipasa hidroliza los enlaces de tioéster de TBDMP liberando así ácido butanoico y 2, 3-mercapto-1-propanol-dibutirato, 2, 3-mercapto-1-propanol-monobutirato o 2, 3-mercapto-1-propanol. Los grupos de tiol liberados están titulados en una reacción posterior con 4, 4, -ditiodipiridina (DTDP) formando 4-tiopiridona. La última está en equilibrio tautomérico con la 4-mercaptopiridina que absorbe a 334 nm. La reacción se lleva a cabo en solución amortiguadora de acetato 0,1 M pH 5,0 que contiene 0,2% de Triton-X100, TBDMP 0,65 mM y DTDP 0,2 mM a 37°C. Una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de 4-tiopirridona por minuto en las condiciones de reacción establecidas.
Además de la medición espectrofotométrica la actividad de lipasa también puede determinarse utilizando una medición de valoración volumétrica. Por ejemplo, la actividad de esterasa de una enzima lipolítica puede medirse sobre tributirina como sustrato de acuerdo con Food Chemical Codex, Forth Edition, National Academy Press, 1996, p803.
Una fosfolipasa es una enzima que cataliza la liberación de grupos acilo grasos de un fosfolípido. Puede ser una fosfolipasa A2 (PLA2, EC 3.1.1.4) o una fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32). Puede o no tener otras actividades tal como actividad de triacilglicerol lipasa ( E c 3.1.1.3) y/o galactolipasa (EC 3.1.1.26).
La fosfolipasa puede ser una enzima nativa de fuentes de mamífero o microbianas. Un ejemplo de una fosfolipasa de mamífero es PLA2 pancreática, por ejemplo, PLA2 bovina o porcina tal como el producto comercial Lecitase 10L (PLA2 porcina, producto de Novozymes A/S).
Las fosfolipasas microbianas pueden ser de Fusarium, por ejemplo, fosfolipasa A1 de F. oxysporum (WO 1998/026057), fosfolipasa A1 de F. venenatum (que se describe en el documento WO 2004/097012 como una fosfolipasa A2 que se denomina FvPLA2), de Tuber, por ejemplo, fosfolipasa A2 de T. borchii (que se denomina TbPLA2, WO 2004/097012).
La fosfolipasa también puede ser una variante de enzima lipolítica con actividad de fosfolipasa, por ejemplo, tal como se describe en los documentos WO 2000/032758 o WO 2003/060112.
La fosfolipasa también puede catalizar la liberación de grupos de acilo graso de otros lípidos presentes en la masa, particularmente lípidos de trigo. Por lo tanto, la fosfolipasa puede tener actividad de triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3) y/o actividad de galactolipasa (EC 3.1.1.26). La fosfolipasa puede ser una enzima lipolítica tal como se describe en el documento WO2009/106575, tal como el producto comercial Panamore®, producto de DSM.
En una realización la enzima adicional es una enzima lipolítica, incluyendo una triacilglicerol lipasa, una fosfolipasa, una galactolipasa y una enzima que tiene tanto actividad de galactolipasa como de fosfolipasa.
La triacilglicerol lipasa puede ser una lipasa fúngica, preferiblemente de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Penicillum, Thermomyces o Rhizomucor. La triacilglicerol lipasa puede ser de Rhyzopus. En una realización adicional se usa una triacilglicerol lipasa de Rhyzopus oryzae. Opcionalmente, puede usarse una combinación de dos o más triacilglicerol lipasas.
En una realización adicional, la enzima lipolítica es una fosfolipasa o una enzima que tiene tanto actividad de galactolipasa como de fosfolipasa. Se conoce que dichas lipasas son activas en los lípidos endógenos de trigo y en fuentes de lípidos externos, por ejemplo, como se proporciona mediante la adición de grasa alimentaria o de lecitina. Preferentemente la lipasa escinde los lípidos polares y tiene actividad de fosfolipasa, actividad de galactolipasa o una combinación de actividad de fosfolipasa y galactolipasa para crear lisofosfolípidos, tales como lisofosfotidilcolina, y lisogalactolípidos tales como digalactosilmonoglicérido. La especificidad de la lipasa puede mostrarse a través de un ensayo in vitro haciendo uso de un sustrato apropiado, por ejemplo, lípido de triacilglicerol, fosfotidilcolina y diglactosil diglicérido, o preferiblemente a través de análisis de los productos de reacción que se generan en la masa durante el mezclado y fermentación.
Panamore®, Lipopan® F, Lipopan® 50 y Lipopan® S se comercializan para actividad lipolítica estandarizada, utilizando una medición de DLU para Panamore® de DSM y una medición de LU para la familia de Lipopan® de Novozymes. DLU se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 micromol/min de p-nitrofenol de pnitrofenil palmitato a un pH 8,5 a 37°C, mientras que LU se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1micromol/min de ácido butírico de tributirina a un pH 7 a 30°C. Las lipasas se usan óptimamente con la alfa-amilasa de la invención a 2-850 DLU/kg de harina o a 50-23500 LU/kg de harina.
En una realización de la composición de la enzima de acuerdo con la invención, la enzima adicional es Panamore® tal como se describe en el documento WO2009/106575.
En una realización de la composición de la enzima de la invención, la enzima adicional es una enzima tal como se describe en el documento WO9826057.
En un aspecto de la composición de la enzima de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una enzima tal como se describe en el documento US RE38.507.
En un aspecto de la composición de la enzima de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una enzima tal como se describe en el documento WO 9943794, en particular en el documento EP1058724B1.
Si deben agregarse una o más actividades enzimáticas adicionales de acuerdo con los métodos de la presente invención, estas actividades pueden agregarse por separado o juntas con el polipéptido de acuerdo con la invención, por ejemplo, como la composición de la enzima de acuerdo con la invención, que incluye una composición que mejora el pan y/o una composición que mejora la masa. Las otras actividades enzimáticass pueden ser cualquiera de las enzimas descritas anteriormente y pueden dosificarse de acuerdo con las prácticas de horneado establecidas. La triacilglicerol lipasa puede ser una lipasa fúngica, preferiblemente de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Penicillum, Thermomyces o Rhizomucor. En una realización, la triacilglicerol lipasa es de Rhyzopus. En una realización adicional se usa una triacilglicerol lipasa de Rhyzopus oryzae. Opcionalmente, puede usarse una combinación de dos o más triacilglicerol lipasas.
Celulasa
Una celulasa puede ser de A. niger o de Trichoderma reesei.
Amiloglucosidasa
La amiloglucosidasa, puede ser una amiloglucosidasa de Aspergillus tal como de A. oryzae o A. niger, preferiblemente de A. niger.
Enzima adicional
La enzima adicional puede incluir, a modo no taxativo, una enzima tal como se divulga es cualquiera de los documentos WO2006/032281, WO2008/148845, WO2006/012902, WO2006/012899, WO2004/081171, WO99/43793 o WO2005/066338.
La enzima adicional puede incluir una amilasa formadora de G4.
Una amilasa formadora de G4 es una enzima que es, entre otras cosas, capaz de catalizar la degradación del almidón. En particular, es capaz de escindir enlaces a-D-(I->4) O-glucosídicos en almidón. Pueden denominarse una glucan 1, 4-alfa-maltotetraohidrolasa (EC 3.2.1.60). Asimismo pueden denominarse una maltotetraohidrolasa.
Pseudomonas saccharophila (GenBank Acc. No. X16732) expresa una amilasa formadora de G4.
La amilasa formadora de G4 puede ser una amilasa formadora de G-4 como se expresa por Pseudomonas saccharophila. La amilasa formadora de G-4 es capaz de producir maltotetraosa de almidón licuado u otra fuente de maltodextrinas a una temperatura alta, por ejemplo, aproximadamente 60°C hasta aproximadamente 75°C.
Tal como se usa en el presente documento, el término almidón se refiere a cualquier material compuesto por los carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas tales como maíz, que comprende amilosa y amilopectina. La amilasa con actividad formadora de G4 se dosificó a un nivel para lograr el efecto apropiado al hornear. El ensayo para determinar la actividad usado se conoce en la técnica, como por ejemplo el ensayo Betamyl (Megazyme); ensayo Phadebas (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB); NBAU (Ceralpha, Megazyme tal como se describe en el presente documento).
Las amilasas formadoras de G4 adecuadas pueden ser las amilasas formadoras de G4 que se describen en cualquiera de los documentos WO9950399, WO2005007818, WO2004111217, WO2005003339, WO2005007818, WO2005007867, WO2006003461, W02007007053, WO2007148224, WO2009083592 o WO2009088465.
Una composición de acuerdo con la invención comprende el polipéptido variante de la invención o uno que pueda obtenerse mediante un método para identificar una alfa-amilasa variante.
Una premezcla de acuerdo con la invención comprende harina y el polipéptido variante de la invención o uno que pueda obtenerse mediante un método para identificar una alfa-amilasa variante.
La invención adicionalmente se refiere al uso de un polipéptido variante de acuerdo con la invención o de una composición de acuerdo con la invención o de una premezcla de acuerdo con la invención en la preparación de una masa y/o un producto horneado.
La divulgación adicionalmente se refiere a una masa que comprende un polipéptido variante de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención o una premezcla de acuerdo con la invención.
Preparar una masa puede comprender el paso de combinar la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención o la composición de acuerdo con la invención con al menos un ingrediente de la masa. “Combinar” incluye, a modo no taxativo, agregar el polipéptido o la composición de la enzima de acuerdo con la invención a dicho al menos un ingrediente de la masa, agregar dicho al menos un ingrediente de la masa al polipéptido o la composición de la enzima de acuerdo con la invención, mezclar el polipéptido de acuerdo con la invención y dicho al menos un ingrediente de la masa.
Un ingrediente de la masa incluye cualquier componente que se seleccione de harina, huevo, agua, sal, azúcar, saborizantes, grasa (incluyendo manteca, margarina, aceite y grasa), levadura para hornear, un sistema de fermentación química, leche, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y Azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
En un aspecto para preparar una masa de acuerdo con la invención, dicho método puede comprender los pasos de combinar la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención y al menos un componente que se selecciona de harina, huevo, agua, sal, azúcar, saborizantes, grasa (incluyendo manteca, margarina, aceite y grasa), levadura para hornear, un sistema de fermentación química, leche, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y Azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
En un aspecto para preparar una masa de acuerdo con la invención, dicho método puede comprender los pasos de combinar la composición de acuerdo con la invención y al menos un componente que se selecciona de harina, huevo, agua, sal, azúcar, saborizantes, grasa (incluyendo manteca, margarina, aceite y grasa), levadura para hornear, un sistema de fermentación química, leche, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y Azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
'Combinar' incluye, a modo no taxativo, agregar la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención o la composición de acuerdo con la invención a, al menos, un componente indicado anteriormente, agregar dicho al menos un componente indicado anteriormente a la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención o la composición de acuerdo con la invención, mezclar la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención o la composición de acuerdo con la invención y dicho al menos un componente indicado anteriormente.
La divulgación también se refiere al uso de la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención en una cantidad de procesos industriales. A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, la alfa-amilasa de acuerdo con la invención puede proporcionar ventajas sobre las enzimas actualmente usadas. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos como costes de producción más bajos, especificidad más alta hacia el sustrato, actividades secundarias menos antigénicas, menos indeseables, rendimientos más altos cuando se produce en un microorganismo adecuado, pH y rangos de temperatura más adecuados, mejor sabor del producto final, así como grado de alimento y aspectos kosher.
En una realización la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención puede utilizarse en la industria de alimentos, incluida en la elaboración de alimentos.
Un ejemplo de una aplicación industrial de la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención en alimentos es su uso en aplicaciones para hornear. La alfa-amilasa de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, utilizarse en productos horneados tales como pan o torta. Por ejemplo, para mejorar la calidad de la masa y/o el producto horneado.
La levadura, enzimas y opcionalmente aditivos generalmente se agregan por separado a la masa.
Las enzimas pueden agregarse en una forma seca, por ejemplo, granulada, en una forma líquida o en forma de una pasta. En la mayoría de los casos los aditivos se agregan en forma de polvo. Aditivos adecuados incluyen oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y Azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluyendo L-cisteína), emulsionantes (incluyendo mono/diglicéridos, monoglicéridos tales como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma de xantano), saborizantes, ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
En la técnica se conoce bien la preparación de una masa a partir de los ingredientes de la masa e incluye mezclar dichos ingredientes y opcionalmente uno o más pasos de moldeado y fermentación.
La invención adicionalmente se refiere a un proceso para la producción de un producto horneado, comprendiendo el método hornear la masa de acuerdo con la invención. En una realización del proceso para la producción de un producto horneado el producto horneado es pan o torta.
En un aspecto, la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención, la composición de acuerdo con la invención o la premezcla de acuerdo con la invención pueden utilizarse en la producción de una torta y en la producción de una mezcla batida a partir de la cual puede elaborarse una torta.
La variante de alfa-amilasa, composición de la enzima de acuerdo con la invención o la premezcla de acuerdo con la invención pueden utilizarse en la preparación de una amplia variedad de tortas, incluyendo tortas tradicionales, tales como por ejemplo, ponqué y torta de manteca, y incluyendo tortas de espuma, tal como por ejemplo, merengues, bizcocho, torta de chocolate trufa, enrollado, genovesa y chifón. Bizcocho es un tipo de bizcochuelo a base de harina de trigo, azúcar, polvo de hornear y huevos (y opcionalmente polvo de hornear). La única grasa presente es de la yema de huevo, que a veces se agrega separada de la clara. A menudo se usa como base para otros tipos de tortas y postres. Un ponqué se prepara tradicionalmente a partir de una libra de harina, manteca, huevos, y azúcar, opcionalmente complementado con polvo de hornear. En el chifón la manteca/margarina se ha reemplazado por aceite. El azúcar y yema de huevo se disminuyen en comparación con ponqué o bizcocho y se aumenta el contenido de clara de huevo.
Un método para preparar una mezcla batida preferiblemente comprende los pasos de:
a. preparar la mezcla batida de la torta agregando al menos:
i. azúcar;
ii. harina;
iii. la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención;
iv. al menos un huevo; y
v. opcionalmente una fosfolipasa.
Un método para preparar una torta de acuerdo con la invención comprende adicionalmente el paso de
b. hornear la mezcla batida para obtener una torta.
El experto en la técnica sabe cómo preparar una mezcla batida o una torta a partir de los ingredientes de la masa. Opcionalmente, pueden estar presentes uno o más ingredientes en la composición, por ejemplo, para permitir la reducción de huevos y/o grasa en la torta, tales como hidrocoloides, extracto de levadura, emulsionantes, calcio. La divulgación adicionalmente se refiere a un producto horneado que puede obtenerse mediante el proceso para la producción de un producto horneado de acuerdo con la invención o mediante el uso de acuerdo con la invención. Las aplicaciones industriales mencionadas anteriormente de la enzima de alfa-amilasa de acuerdo con la invención comprenden solamente unos pocos ejemplos y esta lista no pretende ser restrictiva.
Otros usos de la variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención pueden incluir:
- la producción de jarabes de glucosa, fructosa y maltosa;
- la producción de hidrolizados de almidón tales como maltodextrinas;
- la producción de almidones modificados;
- la modificación de componentes de almidón en pienso animal;
- el reemplazo de malta en la producción de cerveza;
- el uso en un pegamento, incluyendo pegamento para empapelado;
- el uso en objetos plásticos hechos utilizando almidón, incluyendo bolsas de plástico hechas a partir de películas de almidón polimerizadas; y/o
- el uso en el reprocesamiento de pan de desecho.
La divulgación se refiere al uso de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ NO:7 y/o SEQ ID NO: 8 en la preparación de una masa y/o un producto horneado.
La divulgación se refiere a una masa que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ NO:7 y/o SeQ ID NO: 8.
La divulgación se refiere a una premezcla que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ NO:7 y/o SEQ ID NO: 8.
La divulgación se relaciona con una composición que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ NO:7 y/o SEQ ID NO: 8 y uno o más componentes que se seleccionan del grupo que consiste en leche en polvo, gluten, grasa granulada, una enzima adicional, un aminoácido, una sal, oxidantes, agentes reductores, emulsionantes, estearoil lactilato de sodio, estearoil lactilato de calcio, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos, gomas, saborizantes, ácidos, almidón, almidón modificado, gluten, humectantes y conservantes.
Una referencia en el presente documento a un documento de patente u otro asunto que se proporciona como técnica anterior no debe tomarse como una admisión de que ese documento o asunto era conocido o que la información que contiene era parte del conocimiento general común a la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.
La presente invención se ilustra de forma adicional mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplos
El polipéptido base puede producirse tal como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. No.
13/532072 no prepublicada. El polipéptido base puede producirse tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos US 8.426.182 B1.
Materiales y métodos
Ensayo NBAU
La actividad enzimática de la variante de alfa-amilasa y del polipéptido base puede expresarse como NBAU. Una NBAU se define como la cantidad de enzima resultante en la liberación de 1 pmol de pNP (para-nitrofenol) por minuto utilizando el sustrato Ceralpha pNP-G7 con extremo bloqueado a un pH = 5,2 y T = 37°C.
El principio de la prueba de actividad de NBAU se origina desde un kit de prueba (manual) de a-amilasa de Megazyme (Ceralpha). El ensayo se realizó de manera adecuada para la aplicación del analizador. El ensayo se ejecutó a pH 5,20 tomando en cuenta el pH óptimo para a-glucosidasa y amiloglucosidasa (rango de pH 5 - 6). La prueba se realiza con un analizador Konelab Arena 30 (Thermo Scientific, Vantaa, Finlandia).
La actividad enzimática se determina a 37°C y pH 5,20 utilizando un sustrato de p-nitrofenil maltoheptaosida con extremo bloqueado no reductor (= BPNPG7, Ceralpha) combinado con niveles en exceso de a-glucosidasa y amiloglucosidasa termostables (ambos de Ceralpha: Reactivo de a-Amilasa R-CAAR4, Megazyme, Irlanda). La hidrólisis del sustrato BPNPG7 por una alfa-amilasa resulta en fragmentos de p-nitrofenil maltosacárido. La reacción se termina (y se desarrolla el color) mediante la adición de una solución alcalina. Se determina la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm y es una medición para la actividad enzimática. La actividad se calcula a partir de una determinación del coeficiente de extinción molar, a través de una calibración con una solución de para-nitrofenol de concentración conocida.
1) Método AACC 22-02.01
Medición de la alfa-amilasa en materiales de plantas y microbianos utilizando el método Ceralpha®
La actividad de alfa-amilasa se analizó midiendo la actividad utilizando un kit de ensayo de alfa-amilasa Megazyme CERALPHA (Megazyme International Ireland Ltd., Co. Wicklow, Irlanda) de acuerdo con la instrucción del fabricante. Todas las variantes que se describen en los ejemplos mostraron actividad de alfa-amilasa en el ensayo CERALPHA.
El polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 mostró actividad de alfa-amilasa en el ensayo CERALPHA.
2) Ensayo 2A Ensayo de maltotriosa
Este ensayo puede utilizarse para determinar la actividad en sustrato de maltotriosa.
Una Unidad de Maltotriosa (MU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de glucosa por minuto utilizando sustrato de maltotriosa en las siguientes condiciones de ensayo. La actividad enzimática se determinó en una incubación de 30 minutos a 37°C y pH 5,0 utilizando maltotriosa como sustrato. La hidrólisis enzimática de maltotriosa resulta en una liberación cuantitativa de glucosa, que es una medición de la actividad enzimática.
Se diluyeron muestras de aproximadamente 0,4-4 mg/ml de proteína en un rango entre 0,0125 y 0,125 MU/ml en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N. Se prepararon 10 mg/ml de sustrato de maltotriosa en NaCl 2,5 mM en agua MQ. Se precalentaron 160 microlitros de sustrato durante aproximadamente 30 minutos en un termociclador de PCR ajustado a 37°C en una placa para PCR de 96 pocillos. Se agregaron 40 microlitros de muestra diluida al sustrato precalentado en el termociclador y mezclado bien mediante pipeteo hacia arriba y abajo varias veces. 30 minutos después de la adición de la muestra se agregaron 20 microlitros de NaOH 0,33 N y se mezcló bien para terminar la reacción y la placa para PCR se quitó del termociclador. La glucosa liberada se midió mediante incubación de 55 microlitros de la mezcla de reacción terminada con 195 microlitros de monorreactivo de hexoquinasa (Ecoline Glucose Hexokinase FS, DiaSys Diagnostic systems GmbH, Holzheim, Alemania) durante 15 minutos a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se retiraron las burbujas de aire de la superficie mediante centrifugación, luego de lo cual se leyó la absorbancia a 340 nm utilizando una lectora de placas de microtitulación. La cantidad de glucosa liberada se determinó con relación a una línea de calibración de glucosa.
Ensayo 2B Tolerancia a la sacarosa
De la misma forma que se describe en el Ensayo 2A), excepto que el sustrato consistía en 10 mg/ml de maltotriosa a lo cual se agregaron 6,25 mg/ml de sacarosa.
Ensayo 2C Termoestabilidad a pH5
Se diluyeron muestras de aproximadamente 0,4-4 mg/ml de proteína 75 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N. Se transfirieron 100 microlitros de estas muestras diluidas a una placa para PCR de 96 pocillos y se expuso a una incubación de 30 minutos a 79,3°C, con posterior enfriamiento inmediato hasta 4°C en un termociclador de PCR. Las muestras tratadas a estas temperaturas luego se diluyeron adicionalmente 100 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N. La actividad Residual se determinó como se describe en el Ensayo 2A.
Ensayo 2D Relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5
De la misma forma que se describe en el Ensayo 2A, excepto que las muestras se diluyeron en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 4,0 utilizando NaOH 4 N.
Ensayo 2E Termoestabilidad a pH4
Se diluyeron muestras de aproximadamente 0,4-4 mg/ml de proteína 75 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM solución amortiguadora de ácido cítrico que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 4,0 utilizando NaOH 4 N. Se transfirieron 100 microlitros de estas muestras diluidas a una placa para PCR de 96 pocillos y se expuso a una incubación de 30 minutos a 57,8°C, con posterior enfriamiento inmediato hasta 4°C en un termociclador de PCR. Las muestras tratadas a estas temperaturas luego se diluyeron adicionalmente 100 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N. La actividad Residual se determinó como se describe en el Ensayo 2A.
Ensayo 2F Termoestabilidad en presencia de sacarosa
Se diluyeron muestras de aproximadamente 0,4-4 mg/ml de proteína 75 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N y se agregó 2,5% de sacarosa. Se transfirieron 100 microlitros de estas muestras diluidas a una placa para PCR de 96 pocillos y se expuso a una incubación de 30 minutos a 79,3°C, con posterior enfriamiento inmediato hasta 4°C en un termociclador de PCR. Las muestras tratadas a estas temperaturas luego se diluyeron adicionalmente 100 veces en solución amortiguadora de ácido cítrico 100 mM que contenía 1 g/L de BSA, ajustado a pH 5,0 utilizando NaOH 4 N. La actividad Residual se determinó como se describe en A).
Determinación de propiedades alteradas.
Las propiedades alteradas de variantes de alfa-amilasa en comparación con un polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 se obtuvieron como se indica a continuación.
En primer lugar, las propiedades de las variantes y el polipéptido de referencia se midieron tal como se describe en el Ensayo 2A al Ensayo 2F anteriormente.
En segundo lugar, los porcentajes (%) que se indican en las Tablas 4-8 a continuación se obtuvieron a partir de estas mediciones. Esta forma de obtener los porcentajes que se indican en las tablas a continuación se explica mediante una determinación y cálculo de tolerancia a la sacarosa ejemplares de N° de variante. Los % para las propiedades Termoestabilidad a pH5 (Ensayo 2C), relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 (Ensayo 2D), Termoestabilidad a pH4 (Ensayo 2e ) y Termoestabilidad en presencia de sacarosa (Ensayo 2F) se obtuvieron de forma análoga.
Los valores que se indican en las Tablas 4-8 a continuación son un promedio de 2 mediciones en la misma muestra. Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante
La actividad de N° de variante se determinó en presencia de sacarosa (que se midió tal como se describe en el Ensayo 2B) y que se expresa como una relación con respecto a la actividad medida para la misma variante en ausencia de sacarosa (que se midió tal como se describe en el Ensayo 2A precedente).
El polipéptido de referencia (la alfa-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2) se sometió a las mismas condiciones experimentales.
Si la actividad de N° de variante fuera 850 unidades/ml en presencia de sacarosa (Ensayo 2B), y 1000 unidades/ml en ausencia de sacarosa (Ensayo 2A), la relación entre la actividad en presencia de sacarosa y la actividad en ausencia de sacarosa para el N° de variante sería 0,85.
Si la actividad del polipéptido de referencia fuera 600 unidades/ml en presencia de sacarosa (Ensayo 2B), y 1000 unidades/ml en ausencia de sacarosa (Ensayo 2A), entonces la relación entre la actividad en presencia de sacarosa y la actividad en ausencia de sacarosa para el polipéptido de referencia sería 0,60.
Este valor del polipéptido de referencia luego se normaliza a 100%.
En este cálculo ejemplar, la tolerancia a la sacarosa de N° de variante en comparación con el polipéptido de referencia sería entonces (0,85/0,60) x 100% = 142%. 142% (para el N° de variante) es un aumento en comparación con 100% (para el polipéptido de referencia). Como resultado se dice que el N° de variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia.
En resumen, la Tabla 4 indica: la relación entre
[Actividad de N° de variante en el Ensayo 2B] : [Actividad de N° de variante en el Ensayo 2A],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2B] : [Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2A]. El porcentaje que se obtiene de esta manera es la tolerancia a la sacarosa tal como se muestra en la Tabla 4.
Cepas y plásmidos
La cepa BS154 de Bacillus subtilis (CBS 363.94) (AaprE, AnprE, amyE-, spo-) es descrita en Quax y Broekhuizen 1994 Appl Microbiol Biotechnol. 41: 425-431.
El vector transportador pBHA12 de E. coli/ B. subtilis es descrito en el documento (W02008/000632). NCIMB14276 de Alicyclobacillus pohliae es descrita por Imperio et al (Int. J. Syst. Evol. Microbiol 58:221-225, 2008).
Técnicas biológicas moleculares
Las técnicas biológicas moleculares conocidas por el experto en la técnica se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se lleva a cabo en un termociclador con polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion (Finnzymes OY, Aspoo, Finlandia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 1
Constructos de ADN y transformación
El vector transportador pBHA12 de E. coli / B. subtilis se describe en (WO2008/000632). Este vector se modifica mediante la introducción de un sitio de restricción de Pmel y el terminador de amyQ de Bacillus amyloliquefaciens. El vector pBHA12 se digiere con SphI y HindIII y se inserta un fragmento de ADN sintético (SEQ ID NO: 3) que contiene el sitio de restricción de PmeI, el terminador de amyQ y los sitios de restricción de SphI y HindIII. Esta modificación da como resultado el vector pGBB09 y este vector se utiliza para la expresión de las variantes de alfaamilasa (Fig. 1).
5'-GCAT G CGTTT AAAC AAAAACACCT CC AAGCT G AGT G CGG GTAT C AGCTT G GAG GT G
CGTTTATTTTTTCAGCCGTATGACAAGGTCGGCATCAGAAGCTT-3’ (SEQ ID NO: 3)
Los cambios de aminoácido que se introducen en las 173 variantes de alfa-amilasa se describen en la Tabla 3. Posiciones de los cambios de aminoácido se indican en comparación con la SEQ ID NO: 2 (un ejemplo de un polipéptido de referencia que tiene actividad de alfa-amilasa).
Tabla 3: Cambio de aminoácido a introducirse en el polipéptido base, en donde el polipéptido base tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos se describen de acuerdo con la anotación de una sola letra.
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*) significado de: A4C-A505C significa 2 cambios: tanto el aminoácido en la posición 4 como el aminoácido en la posición 505 se cambian a una C, es decir, A4 se cambia a 4C y A505 cambia a 505C; N77C-G88C significa que tanto N77 como G88 se cambian a un aminoácido C, etc. En otras palabras, A4C-A505C significa que tanto el aminoácido en la posición 4 como el aminoácido en la posición 505 se cambian a una C, es decir, Alanina en la posición 4 se cambia a Cisteína y Alanina en 505 se cambia a Cisteína en 505, etc.
Los constructos de ADN sintético que contienen la secuencia de ácido nucleico que codifica las variantes de alfaamilasa también contienen un sitio de unión al ribosoma y sitio de restricción de PacI en el extremo 5', tal como se muestra en la SEQ ID NO: 4.
5-TTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACAT-3' (SEQ ID NO: 4)
y un codón de terminación doble y sitio de restricción de Pmel en el extremo 3' tal como se muestra en la SEQ ID NO: 5
5'-TAATAAGTTTAAAC-3' (SEQ ID NO: 5).
A modo de ejemplo, un constructo de ADN sintético que existe de un sitio de PacI, sitio de unión al ribosoma, secuencia de DSM-AM natural tal como se establece en la SEQ ID NO: 1, codón de terminación doble y sitio de restricción de PmeI se indica como SEQ ID NO: 6. Todas las secuencias de ácido nucleico que codifican las variantes de alfa-amilasa se diseñan de forma similar y se clonan como fragmentos de PacI, PmeI en el vector pGBB09. Por ejemplo, el vector pGBB09 que contiene la secuencia de DSM-AM natural tal como se establece en la SEQ ID NO: 1 se denominó pGB09DSM-AM1 (Fig. 2). Estos vectores se transforman en la cepa BS154 de B. subtilis. La secuencia del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN. Las cepas BS154 de B. subtilis que contienen estos vectores y la cepa que produce el polipéptido de referencia se denominan DSM-AMB154-1 y las cepas que expresan las variantes de DSM-AM se denominan DSM-AMB154-01 hasta DSM-AMB154-170.
Ejemplo 2
Expresión de variantes de alfa-amilasa, también denominadas variantes de DSM-AM en matraces de oscilación Las cepas de Bacillus subtilis que albergan variantes del gen DSM-AM se colocan en placas de agar 2*TY y se cultivan durante 24 horas a 37°C. Un pre-cultivo de 20 ml de medio 2*TY compuesto por 1,6% (p/v) de triptona Bacto, 1% (p/v) de Extracto de levadura y 0,5% (p/v) de NaCl en matraces Erlenmeyer de 100 ml se inocula con las células B. subtilis tomadas de las placas. Los cultivos se agitan vigorosamente a 37°C y 250 rpm durante 16 horas y se usan 0,2 ml de medio de cultivo para inocular 20 ml de medio SMM. El pre-medio SMM contiene 1,25% (p/p) de extracto de levadura, 0,05% (p/p) de CaCl2, 0,075% (p/p) de MgCl2.6H2O, 15 |jg/l de MnSO4.4H2O, 10 |jg/l de CoCl2.6H2O, 0,05% (p/p) de ácido cítrico, 0,025% (p/p) de antiespuma 86/013 (Basildon Chemicals, Abingdon, Reino Unido). Para completar el medio SMM, 20 ml de maltosa al 5% (p/v) y 20 ml de una solución concentrada tamponada de Nafosfato 200 mM (pH 6,8), ambas preparadas y esterilizados por separado, se agregan a 60 ml de pre-medio SMM. Estos cultivos se incuban durante 48 horas a 37°C y 250 rpm. Los sobrenadantes se cosechan y se analiza la productividad enzimática. La actividad de alfa-amilasa de las variantes de alfa-amilasa se mide de acuerdo con el ensayo NBAU tal como se describió anteriormente.
La SEQ ID NO 6: establece la secuencia de polinucleótidos de un constructo de ADN sintético excitante de un sitio de PacI, sitio de unión al ribosoma, secuencia de DSM-AM natural tal como se establece en la SEQ ID NO: 1, codón de terminación doble y sitio de restricción de Pmel.
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La SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos del polipéptido de alfa-amilasa natural NCIMB14276 de Alicydobacillus pohliae maduro sin los primeros 33 aminoácidos que codifican el péptido señal.
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Ejemplo 3 Tolerancia a la sacarosa de variantes de acuerdo con la invención
La tolerancia a la sacarosa de variantes de acuerdo con la invención que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 incluyendo un cambio de aminoácido tal como se indica en la Tabla 4 a continuación y del polipéptido de alfa-amilasa de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ iD NO: 2 se determinó tal como se describe en el presente documento bajo Materiales y Métodos anteriormente (Ensayo 2A, Ensayo 2B y "Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante").
Tabla 4. Tolerancia a la sacarosa de variantes de acuerdo con la invención en comparación con el polipéptido de referencia. La tolerancia a la sacarosa del polipéptido de referencia (polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2), se fijó en 100%. Una tolerancia a la sacarosa de más de 100% muestra que la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia.
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*) significado de: A4C-A505C significa 2 cambios: tanto el aminoácido en la posición 4 como el aminoácido en la posición 505 se cambian a una C, es decir, Alanina en la posición 4 se cambia a Cisteína en la posición 4 y Alanina en la posición 505 cambia a Cisteína en la posición 505; N77C-G88C significa que tanto N77 como G88 se cambian a un aminoácido de Cisteína, etc.
Ejemplo 4 Termoestabilidad a pH5 de variantes
La termoestabilidad a pH5 de variantes que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 incluyendo un cambio de aminoácido tal como se indica en la Tabla 5 a continuación y del polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 se determinó tal como se describe en el presente documento bajo Materiales y Métodos anteriormente. Esto se llevó a cabo utilizando el Ensayo 2A, Ensayo 2C y “Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante” tal como se describió anteriormente, que se aplicó de forma análoga a la relación entre
[Actividad residual de N° de variante en el Ensayo 2C] : [Actividad de N° de variante en el Ensayo 2A],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual de polipéptido de referencia en el Ensayo 2C] : [Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2A].
El porcentaje que se obtiene de esta manera es la termoestabilidad a pH5 tal como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Termoestabilidad a pH5 de variantes en comparación con el polipéptido de referencia. La termoestabilidad a pH5 del polipéptido de referencia (polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2), se fijó en 100%. Una termoestabilidad a pH5 de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia.
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Ejemplo 5 Relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de variantes
La relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de variantes que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 incluyendo un cambio de aminoácido tal como se indica en la Tabla 4 a continuación y del polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 se determinó tal como se describe en el presente documento bajo Materiales y Métodos anteriormente. Esto se llevó a cabo utilizando el Ensayo 2A, Ensayo 2D y “Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante” tal como se describió anteriormente, que se aplicó de forma análoga a la relación entre
[Actividad de N° de variante en el Ensayo 2D] : [Actividad de N° de variante en el Ensayo 2A],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2D] : [Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2A]. El porcentaje que se obtiene de esta manera es la relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 tal como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6. Relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de variantes en comparación con el polipéptido de referencia. La relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 del polipéptido de referencia (polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2), se fijó en 100%. Una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 de más de 100% muestra que la variante tiene una relación Actividad a pH4 : Actividad a pH5 aumentada en comparación con el polipéptido de referencia.
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Ejemplo 6 Termoestabilidad a pH4 de variantes
La termoestabilidad a pH4 de variantes que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 incluyendo un cambio de aminoácido tal como se indica en la Tabla 7 a continuación y del polipéptido base que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2) se determinó tal como se describe en el presente documento bajo Materiales y Métodos anteriormente. Esto se llevó a cabo utilizando el Ensayo 2A, Ensayo 2E y “Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante” tal como se describió anteriormente, que se aplicó de forma análoga a la relación entre
[Actividad residual de N° de variante en el Ensayo 2E] : [Actividad de N° de variante en el Ensayo 2A],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual de polipéptido de referencia en el Ensayo 2E] : [Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2A].
El porcentaje que se obtiene de esta manera es la termoestabilidad a pH4 tal como se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7. Termoestabilidad a pH4 de variantes en comparación con el polipéptido de referencia. La termoestabilidad a pH4 del polipéptido de referencia (polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2), se fijó en 100%. Una termoestabilidad a pH4 de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada a pH4 en comparación con el polipéptido de referencia.
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Ejemplo 7 Termoestabilidad en presencia de sacarosa de variantes
La termoestabilidad en presencia de sacarosa de variantes que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 incluyendo un cambio de aminoácido tal como se indica en la Tabla 8 a continuación y del polipéptido base que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 se determinó tal como se describe en el presente documento bajo Materiales y Métodos anteriormente. Esto se llevó a cabo utilizando el Ensayo 2A, Ensayo 2F y “Determinación ejemplar y cálculo de tolerancia a la sacarosa de N° de variante” tal como se describió anteriormente, que se aplicó de forma análoga a la relación entre
[Actividad residual de N° de variante en el Ensayo 2F] : [Actividad de N° de variante en el Ensayo 2A],
que se expresa como un porcentaje de la relación entre
[Actividad residual de polipéptido de referencia en el Ensayo 2F] : [Actividad de polipéptido de referencia en el Ensayo 2A].
El porcentaje que se obtiene de esta manera es la termoestabilidad en presencia de sacarosa tal como se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8. Termoestabilidad en presencia de sacarosa de variantes en comparación con el polipéptido de referencia. La termoestabilidad en presencia de sacarosa del polipéptido de referencia (polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2), se fijó en 100%. Una termoestabilidad en presencia de sacarosa de más de 100% muestra que la variante tiene una termoestabilidad aumentada en presencia de sacarosa en comparación con el polipéptido de referencia.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido variante que tiene actividad de alfa-amilasa, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a
Q13E, I16T, M45L, W70Y, S72T, L75V, T94A, T94P, V129A, S133L, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, L210F, N234P, V254F, V281L, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, T323N, I325F, F652I,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
2. El polipéptido variante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada a pH5 en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
4. Un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3 enlazado operativamente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de una alfa-amilasa en un huésped de expresión adecuado.
5. Un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 4.
6. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.
7. Un método para producir una alfa-amilasa que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 en condiciones que conducen a la producción de la alfa-amilasa y recuperar la alfa-amilasa.
8. Una composición que comprende el polipéptido variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y uno o más componentes que se seleccionan del grupo que consiste en leche en polvo, gluten, grasa granulada, una enzima adicional, un aminoácido, una sal, oxidantes, agentes reductores, emulsionantes, estearoil lactilato de sodio, estearoil lactilato de calcio, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos, gomas, saborizantes, ácidos, almidón, almidón modificado, humectantes y conservantes.
9. Una premezcla que comprende harina y un polipéptido variante, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia del polipéptido tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 que, al alinearse con la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos Q13E, I16T, M45L, W70Y, S72T, L75V, T94A, T94P, V129A, S133L, T134S, I174L, W177F, D178N, K186Q, L210F, N234P, V254F, L282F, L282M, L282T, D283N, D283S, F284W, V281L, T323N, I325F, S358A, F652I,
definiéndose dichas posiciones con referencia a la SEQ ID NO: 2;
y en donde la variante tiene una tolerancia a la sacarosa aumentada en comparación con el polipéptido de referencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.
10. Una premezcla de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende al menos una enzima adicional.
11. El uso del polipéptido variante tal como se define en la reivindicación 1 o 2; o de una composición que comprende el polipéptido variante tal como se define en la reivindicación 8 y uno o más componentes que se seleccionan del grupo que consiste en leche en polvo, gluten, grasa granulada, una enzima adicional, un aminoácido, una sal, oxidantes, agentes reductores, emulsionantes, estearoil lactilato de sodio, estearoil lactilato de calcio, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono y diglicéridos, gomas, saborizantes, ácidos, almidón, almidón modificado, humectantes y conservantes, o de la premezcla de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, en la preparación de una masa y/o un producto horneado.
12. Una masa que comprende el polipéptido variante tal como se define en la reivindicación 1 o 2; la composición tal como se define en la reivindicación 8; o la premezcla de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.
13. Un método para preparar una masa que comprende el paso de incorporar a la masa una cantidad efectiva del polipéptido variante tal como se define en la reivindicación 1 o 2.
14. Un proceso para la producción de un producto horneado, comprendiendo el método hornear la masa de acuerdo con la reivindicación 12.
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