PL214792B1

PL214792B1 - Wyizolowane polinukleotydy, wektor, wyizolowane enzymy lipolityczne, sposób wytwarzania enzymów lipolitycznych, rekombinowane komórki gospodarza, sposób wytwarzania ciasta, sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowanie enzymu lipolitycznego

Info

Publication number: PL214792B1
Application number: PL392183A
Authority: PL
Inventors: Richard Albang; Ulrike Flokers; Andreas Fritz; Beatrix Gerhard; Oliver Heinrich; Hilmar Ilgenfritz; Boer Lex De; Dieter Maier; Christian Wagner; Fabio Spreafico; Roelf Bernhard Meima
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2003-08-15
Publication date: 2013-09-30
Also published as: EA200500391A1; PL375355A1; EP1530630A2; EP2338986B1; JP2005535352A; CN1675355A; US8216586B2; WO2004018660A3; ES2527924T3; MXPA05001978A; CA2495198C; US20090232936A1; EP2338986A1; CA2495198A1; US20060281080A1; AU2003270088A1; EA200601823A1; EA008007B1; AR042417A1; WO2004018660A2

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów, wektora, wyizolowanych enzymów lipolitycznych oraz sposobu wytwarzania takich enzymów lipolitycznych, rekombinowanych komórek gospodarza, sposobu wytwarzania ciasta, sposobu wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowania enzymu lipolitycznego do wytwarzania ciasta i/lub wyrobu piekarniczego.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy nowo zidentyfikowanych sekwencji polinukleotydowych zawierających gen, który koduje nowy enzym lipolityczny z Aspergillus niger. Wynalazek opisuje pełnej długości sekwencję nukleotydową nowego genu, sekwencję cDNA zawierającą pełnej długości sekwencję kodującą nowy enzym lipolityczny, jak również pełnej długości sekwencję aminokwasową funkcjonalnego białka i jego funkcjonalnych odpowiedników. Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposoby zastosowania tych enzymów w procesach przemysłowych i sposoby diagnozowania zakażeń grzybami. Zgodnie z wynalazkiem opisano również komórki transformowane polinukleotydem według wynalazku i komórki, w których enzym lipolityczny według wynalazku jest genetycznie zmodyfikowany w celu zwiększenia jego aktywności i/lub poziomu ekspresji.

Tło wynalazku

Wyroby piekarnicze, takie jak pieczywo, są przygotowywane z ciasta, które jest zazwyczaj sporządzone z podstawowych składników mąki (pszennej), wody i opcjonalnie soli. W zależności od rodzaju wyrobów piekarniczych innymi dodanymi składnikami mogą być cukry, aromaty i tym podobne. W wyrobach na zaczynie używane są w pierwszym rzędzie drożdże piekarnicze przed chemicznymi systemami spulchniającymi, takimi jak kombinacja kwasu (składnika uwalniającego) i wodorowęglanu.

W celu udoskonalenia cech użytkowych i/lub ostatecznych właściwości wyrobów piekarniczych ciągle dąży się do opracowania substancji pomagających w przetwarzaniu o udoskonalonych właściwościach. Substancje pomagające w przetwarzaniu są tutaj zdefiniowane jako składniki, które poprawiają właściwości użytkowe ciasta i/lub ostateczne właściwości wyrobów piekarniczych. Właściwości ciasta, które mogą być ulepszone obejmują podatność na przetwarzanie automatyczne, pojemność zatrzymującą gaz, zmniejszoną lepkość, elastyczność, rozciągliwość, podatność na zarabianie i tym podobne. Właściwości wyrobów piekarniczych, które mogą być ulepszone obejmują objętość bochenka, chrupkość skórki, strukturę i delikatność miąższu, względną czerstwość, smakowitość i okres przechowywania. Te substancje ulepszające przetwarzanie ciasta i/lub wyrobów piekarniczych mogą być podzielone na dwie grupy: chemiczne dodatki i enzymy (także określane jako enzymy piekarnicze).

Drożdże, enzymy i dodatki chemiczne są zazwyczaj dodawane do ciasta osobno. Drożdże mogą być dodane jako płynna zawiesina, w formie zagęszczonej lub jako drożdże suche aktywne (ADY, ang. active dry yeast) lub błyskawiczne (IDY, ang. instant dry yeast). Różnica pomiędzy tymi preparatami drożdży polega na zawartości wody i suchej masy drożdży. Płynne drożdże posiadają zawartość suchej masy mniej niż 25% (wag./obj.). Krem drożdżowy jest szczególną formą płynnych drożdży i posiada zawartość suchej masy pomiędzy 17 a 23% (wag./obj.). Drożdże zagęszczone posiadają zawartość suchej masy drożdży pomiędzy 25-35% (wag./obj.), podczas gdy preparaty suchych drożdży posiadają zawartość suchej masy drożdży pomiędzy 92-98% (wag./obj.).

Enzymy mogą być dodane w postaci suchej np. zgranulowanej lub w postaci płynnej. Dodatki chemiczne są w większości przypadków dodawane w postaci sproszkowanej. Kompozycje substancji pomagających w przetwarzaniu, które są przystosowane do specyficznych zastosowań piekarniczych mogą się składać z zalecanej mieszaniny dodatków chemicznych i enzymu.

Wytwarzanie ciasta ze składników i substancji pomagających w przetwarzaniu opisanych powyżej jest dobrze znane w tej dziedzinie i obejmuje mieszanie tych składników i substancji pomagających w przetwarzaniu oraz jeden lub więcej etapów zarabiania i fermentacji.

Wytwarzanie wyrobów piekarniczych z takich ciast jest także dobrze znane w tej dziedzinie i może obejmować zarabianie i formowanie oraz późniejszą fermentację ciasta, po której następuje pieczenie w żądanych temperaturach i czasach pieczenia.

Dodatki chemiczne o polepszających właściwościach obejmują środki utleniające, takie jak kwas askorbinowy, bromian i azodiwęglan, środki redukujące, takie jak L-cysteina i glutation, emulgatory działające jako środki polepszające właściwości ciasta, takie jak diacetylowe estry kwasu winowego mono/diglicerydów (DATEM, ang. diacetyl tartaric esters of mono/diglicerides), stearoilomleczan

PL 214 792 B1 sodu (SSL, ang. sodium stearoyl lactylate) lub stearoilomleczan wapnia (CSL, ang. calcium stearyl lactylate), lub działające jako zmiękczacze miąższu, takie jak monostearynian glicerolu (GMS, ang. glycerol monostearate) i tym podobne, tłuszcze, takie jak triglicerydy (tłuszcz) lub lecytyna i inne.

W wyniku oczekiwań klientów co do zastąpienia dodatków chemicznych przez bardziej naturalne produkty, opracowano szereg enzymów piekarniczych o właściwościach poprawiających ciasto i/lub wyrób piekarniczy, które są używane we wszystkich możliwych kombinacjach w zależności od specyficznych warunków zastosowania piekarniczego. Odpowiednie enzymy obejmują enzymy rozkładające skrobię, enzymy rozkładające arabinoksylan i inne hemicelulozy, enzymy rozkładające celulozę, enzymy utleniające, enzymy rozkładające materiał tłuszczowy, enzymy modyfikujące lub tworzące wiązania krzyżowe.

Enzymy degradujące skrobię są na przykład enzymami działającymi wewnątrz cząsteczki, takimi jak alfa-amylaza, amylaza tworząca maltozę, pullulanaza lub inne enzymy usuwające rozgałęzienia i enzymami działającymi na koniec cząsteczki, które odcinają glukozę (amyloglukozydaza), maltozę (beta-amylaza), maltotriozę, maltotetriozę i dłuższe oligosacharydy.

Enzymy rozkładające arabinoksylan i inne hemicelulozy są na przykład ksylanazami, pentazami, hemicelulazą, arabinofuranozydazą, glukanazą i innymi.

Enzymy rozkładające celulozę są na przykład celulazą, celobiohydrolazą i beta-glukozydazą.

Enzymy utleniające są na przykład oksydazą glukozy, oksydazą heksozy, oksydazą piranozy, oksydazą grupy tiolowej, lipooksygenazą, oksydazą p-difenylową, oksydazą polifenolu i innymi.

Enzymy rozkładające materiał tłuszczowy są na przykład enzymami lipolitycznymi, takimi jak lipazy triacyloglicerolu, fosfolipazy (takie jak A1, A2, B, C i D) i galaktolipazy.

Enzymy rozkładające białka, modyfikujące lub tworzące wiązania krzyżowe są na przykład proteazami działającymi wewnątrz cząsteczki (proteazy serynowe, metaloproteazy, proteazy asparaginianowe, proteazy tiolowe), peptydazami działającymi na końce cząsteczki, które odcinają jeden aminokwas lub dipeptyd, tripeptyd i typ podobne z N-terminalnych (aminopeptydazy) lub C-terminalnych (karboksypeptydazy) końców łańcucha polipeptydowego, enzymami usuwającymi grupę aminową z asparaginy lub glutaminy, takimi jak deaminaza i peptydoglutaminaza lub enzymami tworzącymi wiązania krzyżowe, takimi jak transglutaminaza.

Enzymy piekarnicze mogą w dogodny sposób być produkowane w mikroorganizmach. Enzymy piekarnicze pochodzenia mikrobiologicznego są dostępne z różnych źródeł; Bacillus spec. są powszechnym źródłem enzymów bakteryjnych, podczas gdy enzymy grzybowe są powszechnie wytwarzane w Aspergillus spec.

Enzymy piekarnicze mogą być użyte w wielorakich produktach piekarniczych. Określenie „produkty piekarnicze” jest tutaj zdefiniowane jako produkty obejmujące pieczywo, takie jak chleb paczkowany, bochenki chleba, chleb francuski, jak również produkty, takie jak bułeczki, ciastka, placki, mufinki, ciasto drożdżowe oraz pączki i tym podobne.

W powyższych procesach, zalecane jest zastosowanie enzymów piekarniczych, które są uzyskane technikami rekombinacji DNA. Takie rekombinowane enzymy posiadają szereg dogodnych cech w porównaniu ze składnikami oczyszczanymi w sposób tradycyjny. Enzymy rekombinowane mogą być wytwarzane po niskich kosztach, z dużą wydajnością, mogą być wolne od zanieczyszczających czynników, takich jak bakterie lub wirusy, ale również wolne od toksyn bakteryjnych lub zanieczyszczających innych aktywności enzymatycznych.

Cele wynalazku

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych polinukleotydów kodujących nowe enzymy lipolityczne o udoskonalonych właściwościach. Dalszym celem jest dostarczenie enzymów lipolitycznych wytwarzanych w sposób naturalny lub rekombinowany, jak również rekombinowanych szczepów je wytwarzających. Celem wynalazku są także polipeptydy fuzyjne, jak również sposoby wytwarzania i zastosowania polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku.

Celem wynalazku jest także dostarczenie nowych enzymów lipolitycznych, które rozwiązują przynajmniej jeden powyżej wspomnianych problemów lub dostarczenie nowych enzymów lipolitycznych, które, jeśli są zastosowane w cieście i/lub wyrobach piekarniczych, mają jedną lub więcej ulepszonych właściwości wybranych z grupy składającej się ze zwiększonej wytrzymałości ciasta, zwiększonej elastyczności ciasta, zwiększonej stabilności ciasta, zmniejszonej lepkości ciasta, ulepszonej rozciągliwości ciasta, ulepszonej podatności na przetwarzanie automatyczne, zwiększonej objętości wyrobu piekarniczego, ulepszonej struktury miąższu wyrobu piekarniczego, ulepszonego aromatu wyrobu piekarniczego, ulepszonych właściwości opóźniających czerstwienie wyrobu piekarniczego,

PL 214 792 B1 ulepszonego koloru wyrobu piekarniczego, ulepszonej skórki wyrobu piekarniczego lub które mają szeroką specyficzność substratową.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd, który zawiera sekwencję aminokwasową o Nr Id. Sekw.: 12 i który ma aktywność lipolityczną, charakteryzujący się tym, że polinukleotyd ten zdolny jest do hybrydyzacji w bardzo ostrych warunkach do polinukleotydu o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

Korzystnie polinukleotyd według wynalazku można uzyskać z grzybów nitkowatych.

Korzystniej można go uzyskać z Aspergillus niger.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany polinukleotyd, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

Przedmiotem wynalazku jest też wyizolowany polinukleotyd, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera jedną z sekwencji polinukleotydowych określonych powyżej.

Korzystnie w wektorze według wynalazku taka sekwencja polinukleotydowa określona powyżej jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami regulatorowymi odpowiednimi do ekspresji tej sekwencji polinukleotydowej w odpowiedniej komórce gospodarza.

Korzystniej odpowiednią komórkę gospodarza stanowi grzyb nitkowaty.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany enzym lipolityczny, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.: 12.

Korzystnie wyizolowany enzym lipolityczny według wynalazku można uzyskać z Aspergillus niger.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany enzym lipolityczny, charakteryzujący się tym, że można go uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus niger.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger, który to sposób polega na tym, że obejmuje etapy, w których transformuje się odpowiednią komórkę gospodarza wyizolowanym polinukleotydem określonym powyżej albo wektorem określonym powyżej, hoduje się tę komórkę w warunkach pozwalających na ekspresję tego polinukleotydu i opcjonalnie oczyszcza się kodowany polipeptyd z tej komórki lub pożywki hodowlanej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera polinukleotyd określony powyżej albo wektor określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też rekombinowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że wykazuje ekspresję enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania ciasta, polegający na tym, że obejmuje on etap, w którym dodaje się enzym lipolityczny, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego, polegający na tym, że stosuje się w nim ciasto wytworzone sposobem wytwarzania ciasta określonym powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger, do wytwarzania z niego ciasta i/lub wyrobu piekarniczego.

Wynalazek dostarcza nowych polinukleotydów kodujących nowe enzymy lipolityczne. Bardziej szczegółowo, wynalazek dostarcza polinukleotydów posiadających sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, korzystnie w bardzo ostrych warunkach, do sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano także sekwencje polipeptydów które mogą hybrydyzować, zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach, z sekwencją wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. W związku z tym zgodnie z wynalazkiem opisano też kwasy nukleinowe, które są w ponad 40%, tak jak około w 60%, zwłaszcza w 65%, w szczególności w 70%, a nawet jeszcze dogodniej w 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,

PL 214 792 B1

96%, 97%, 98% lub 99% homologiczne do sekwencji wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też kwasy nukleinowe, które są bardziej niż w 40%, tak jak około w 60%, zwałszacza w 65%, w sczególności w 70%, zwłaszcza w 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologiczne do sekwencji wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW. : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38.

W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazek dostarcza takiego wyizolowanego polinukleotydu możliwego do uzyskania z grzybów nitkowatych, w szczególności korzystny jest Aspergillus niger.

W jednym z wykonań, wynalazek dostarcza wyizolowanego polinukleotydu zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Opisano też wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

Opisano tu także wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu o sekwencj NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano również polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

W zalecanym wykonaniu wynalazek dostarcza genu enzymu lipolitycznego o sekwencji NR ID. SEKW.: 10. Opisano też geny enzymu lipolitycznego o sekwencji wybranej spośród NR ID. SEKW.: 1, 4, 7, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 i 37. W innym aspekcie wynalazek dostarcza polinukleotydu, w szczególności cDNA, kodującego enzym lipolityczny z Aspergillus Niger o sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też polinukleotyd, w szczególności cDNA, kodujący enzym lipolityczny o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub wariantów lub fragmentów tego peptydu. W zalecanym wykonaniu cDNA posiada sekwencję NR ID. SEKW.: 11 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też cDNA posiadające sekwencje wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

W nawet bardziej zalecanym wykonaniu polinukleotydy zawierający sekwencję kodującą polinukleotydów według wynalazku zawiera w szczególności sekwencję polinukleotydową NR ID. SEKW.: 11. Opisano też polinukleotydy zawierające sekwencję kodującą polinukleotydów w szczególności sekwencję polinukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 i 38.

Wynalazek dotyczy także wektorów zawierających sekwencję polinukleotydową według wynalazku oraz starterów, sond i fragmentów, które mogą być użyte do namnożenia lub wykrycia DNA według wynalazku.

W dalszym korzystnym wykonaniu dostarczony jest wektor, w którym sekwencja polinukleotydowa według wynalazku jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami regulatorowymi odpowiednimi do ekspresji kodowanej sekwencji aminokwasowej w odpowiedniej komórce gospodarza, takiej jak Aspergillus niger lub Aspergillus oryzae. Opisano tu również sposoby wytwarzania polinukleotydów i wektorów według wynalazku.

Wynalazek także dotyczy komórek gospodarza uzyskanych technikami rekombinacji DNA, które zawierają heterologiczne lub homologiczne polinukleotydy według wynalazku.

W innym wykonaniu wynalazek dostarcza rekombinowanych komórek gospodarza, w których ekspresja enzymu lipolitycznego według wynalazku jest znacząco zwiększona lub w których aktywność enzymu lipolitycznego jest zwiększona.

W innym wykonaniu wynalazek dostarcza komórek gospodarza uzyskanych technikami rekombinacji, które zawierają heterologiczny lub homologiczny polinukleotyd według wynalazku, które są w stanie wytwarzać funkcjonalny enzym lipolityczny według wynalazku, zwłaszcza komórek z nadekspresją enzymu lipolitycznego według wynalazku, na przykład szczepu Aspergillus zawierającego zwiększoną liczbę kopii genu lub cDNA według wynalazku.

W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest oczyszczony polipeptyd. Polipeptydy według wynalazku obejmują polipeptydy kodowane przez polinukleotydy według wynalazku. Szczególnie korzystny jest polipeptyd o sekwencji NR ID. SEKW.: 12. Opisano też polipeptyd o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

PL 214 792 B1

Odpowiednio w jednym z aspektów niniejszego wynalazku opisano kompozycję enzymu lipolitycznego zawierającą jako składnik aktywny enzym o sekwencji NR ID. SEKW.: 12. Opisano też enzymy o sekwencjach wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

W innym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania wyrobów piekarniczych, w których do ciasta stosowanego do wyrobu wyrobów piekarniczych włączony jest (dodawany jest) jeden enzym według wynalazku lub ewentualnie większa liczba enzymów wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

Opisano tu także białka fuzyjne zawierające polipeptyd według wynalazku oraz sposoby otrzymywania polipeptydów według wynalazku.

Opisano tu także zastosowania enzymu lipolitycznego według wynalazku w dowolnym procesie przemysłowym jaki tutaj opisano.

Szczegółowy opis wynalazku

Enzym lipolityczny jest tutaj zdefiniowany jako enzym wykazujący przynajmniej jedną, a zwłaszcza dwie lub trzy lub cztery lub więcej z następujących aktywności: lipaza triacyloglicerolu, fosfolipaza A1 fosfolipaza A2, fosfolipaza B, fosfolipaza C, fosfolipaza D, lizofosfolipaza i galaktolipaza.

Polinukleotydy

Niniejszy wynalazek dostarcza polinukleotydów kodujących enzymy lipolityczne posiadające sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 12. Sekwencja genu kodującego ten enzym lipolityczny NBE031 została ustalona przez sekwencjonowanie klonów genomowych otrzymanych z Aspergillus niger. Opisano też polinukleotydy kodujące enzymy lipolityczne posiadające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Sekwencje tych genów kodujących poszczególne enzymy lipolityczne odpowiednio NBE028, NBE029, NBE030, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 i NBE042 zostały ustalone przez sekwencjonowanie klonów genomowych otrzymanych z Aspergillus niger. Zgodnie z wynalazkiem opisano też sekwencje polinukleotydowe zawierające geny kodujące enzymy lipolityczne NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 i NBE042, jak również ich kompletne sekwencje cDNA i ich sekwencje kodujące (Tabela 1). Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano wyizolowane polinukleotydy zawierające sekwencje nukleotydowe wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

T a b e l a 1

Enzym lipolityczny	Sekwencja (NR ID. SEKW.)
NBExxx	genomowa	cDNA	aminokwasowa
NBE028	1	2	3
NBE029	4	5	6
NBE030	7	8	9
NBE031	10	11	12
NBE032	13	14	15
NBE033	16	17	18
NBE034	19	20	21
NBE036	22	23	24
NBE038	25	26	27
NBE039	28	29	30
NBE043	31	32	33
NBE045	34	35	36
NBE042	37	38	39

PL 214 792 B1

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów, mogących hybrydyzować w bardzo ostrych warunkach do polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też wyizolowane polinukleotydy, mogące hybrydyzować w ostrych warunkach, zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach, do polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Takie polinukleotydy mogą być otrzymane z grzybów nitkowatych, w szczególności z Aspergillus niger. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów posiadających sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też wyizolowane polinukleotydy posiadające sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38.

Opisano tu także wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

Stosowane tutaj określenia „gen” i „gen rekombinowany” odnoszą się do cząsteczek kwasu nukleinowego, które mogą być wyizolowane z chromosomowego DNA, który zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą białko, np. enzym lipolityczny z Aspergillus niger. Gen może zawierać sekwencje kodujące, sekwencje niekodujące, introny i sekwencje regulatorowe. Ponadto, gen odnosi się do wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, jak to zdefiniowano tutaj.

Cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, taka jak cząsteczka kwasu nukleinowego posiadająca sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38, lub ich funkcjonalnych odpowiedników, może być wyizolowana przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej i informacji o sekwencji dostarczonej tutaj. Na przykład, przy użyciu całej lub fragmentu sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 jako sondy do hybrydyzacji, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, lub ewentualnie innych opisanych tu kwasów nukleinowych, mogą być wyizolowane przy użyciu standardowych technik hybrydyzacji i klonowania (np. jak opisano w Sambrook, J., Fritsh, E. F., i Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. drugie wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca całą lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 może być wyizolowana w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przy użyciu syntetycznych starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych w oparciu o informację o sekwencji zawartą w sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38.

Kwas nukleinowy według wynalazku może być namnożony przy użyciu cDNA, mRNA lub alternatywnie, DNA genomowego, jako matrycy oraz odpowiednich starterów oligonukleotydowych według standardowych technik namnażania z użyciem PCR. Tak namnożony kwas nukleinowy może być klonowany do odpowiedniego wektora i scharakteryzowany przez analizę sekwencji DNA.

Ponadto, oligonukleotydy odpowiadające lub hybrydyzujące do sekwencji nukleotydowej według wynalazku mogą być otrzymane przez standardowe techniki syntezy, np. przy użyciu automatycznego urządzenia do syntezy DNA.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:2. Sekwencja NR ID. SEKW.:2 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:1. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptyd NBE028 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:3.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:5. Sekwencja NR ID. SEKW.: 5 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:4. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE029 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:6.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:8. Sekwencja NR ID. SEKW.:8 odpowiada regionowi kodującemu genu

PL 214 792 B1 z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:7. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE030 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:9.

W korzystnym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:11. Sekwencja NR ID. SEKW.:11 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:10. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE031 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:12.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:14. Sekwencja NR ID. SEKW.:14 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:13. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE032 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:15.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:17. Sekwencja NR ID. SEKW.:17 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:16. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE033 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:18.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:20. Sekwencja NR ID. SEKW.:20 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:19. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:21.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:23. Sekwencja NR ID. SEKW.:23 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:22. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:24.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:26. Sekwencja NR ID. SEKW.:26 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:25. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:27.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:29. Sekwencja NR ID. SEKW.:29 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:28. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:30.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:32. Sekwencja NR ID. SEKW.:32 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:31. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:33.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:35. Sekwencja NR ID. SEKW.:35 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:34. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:36.

Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:38. Sekwencja NR ID. SEKW.:38 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:37. Ten cDNA obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:39.

W innym wykonaniu, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sekwencją komplementarną sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 lub funkcjonalnych odpowiedników tych sekwencji nukleotydowych. Opisano też wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sekwencją komplementarną sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub funkcjonalnych odpowiedników tych sekwencji nukleotydowych. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do innej sekwencji nukleotydowej, jest tą, która jest wystarczająco komplementarna do innej sekwencji nukleotydowej tak, że może ona hybrydyzować do innej sekwencji nukleotydowej formując w ten sposób stabilny dupleks.

Jeden z aspektów wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptyd według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik, taki jak biologicznie aktywny fragment lub domena, jak również cząsteczek kwasu nukleinowego wystarczających do zastosowania

PL 214 792 B1 jako sondy hybrydyzacyjne do identyfikacji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd według wynalazku oraz fragmentów takich cząsteczek kwasu nukleinowego odpowiednich do zastosowania jako startery PCR do namnażania lub mutowania cząsteczek kwasu nukleinowego. „Wyizolowanym polinukleotydem” lub „wyizolowanym kwasem nukleinowym” jest DNA lub RNA, który nie przylega bezpośrednio do obu sekwencji kodujących, do których przylega bezpośrednio (jedna na końcu 5' i jedna na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego on pochodzi. Tak więc, w jednym z wykonań, wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje część lub całe sekwencje niekodujące 5' (np. promotor), które bezpośrednio przylegają do sekwencji kodującej. Określenie zatem obejmuje, na przykład, rekombinowany DNA, który jest włączony do wektora, do ulegającego autonomicznej replikacji plazmidu lub wirusa lub do genomowego DNA prokariota lub eukariota, lub który istnieje jako oddzielna cząsteczka niezależnie od innych cząsteczek (np. cDNA lub fragment genomowego DNA wytworzonego przez PCR lub traktowanie endonukleazą restrykcyjną). Obejmuje ono również rekombinowany DNA, który jest zasadniczo wolny od materiału komórkowego, materiału wirusowego lub pożywki hodowlanej (jeżeli jest wytworzony technikami rekombinowanego DNA) lub chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych (jeżeli jest syntetyzowany chemicznie). Ponadto „wyizolowany fragment kwasu nukleinowego” jest fragmentem kwasu nukleinowego, który nie występuje w sposób naturalny jako fragment i nie byłby znaleziony w warunkach naturalnych.

Oczekuje się, że stosowane tutaj określenia „polinukleotydy” lub „cząsteczka kwasu nukleinowego” będą obejmować cząsteczki DNA (np. cDNA lub genomowy DNA) i cząsteczki RNA (np. mRNA) oraz analogi DNA lub RNA otrzymane przy użyciu analogów nukleotydów. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, ale dogodnie jest dwuniciowym DNA. Kwas nukleinowy może być zsyntetyzowany przy użyciu analogów oligonukleotydowych lub pochodnych (np. inozyny lub nukleotydów fosforosiarkowych). Takie oligonukleotydy mogą być zastosowane, na przykład, do przygotowania kwasów nukleinowych, które posiadają zmienione zdolności parowania zasad lub zwiększoną odporność na nukleazy.

W innym wykonaniu opisano wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest antysensowna do cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Opisano także nici komplementarne cząsteczek kwasu nukleinowego opisanego tutaj.

Błędy sekwencjonowania

Dostarczona tutaj informacja o sekwencji nie powinna być interpretowana tak wąsko, żeby wymagane było włączenie błędnie zidentyfikowanych zasad. Specyficzne sekwencje ujawnione tutaj mogą być z łatwością użyte do wyizolowania kompletnego genu z grzyba nitkowatego, w szczególności z Aspergillus niger, który może być z kolei w łatwy sposób poddany dalszym analizom sekwencji identyfikującym w ten sposób błędy sekwencjonowania.

Jeżeli nie wskazano inaczej wszystkie sekwencje ustalone tutaj przez sekwencjonowanie cząsteczki DNA były ustalone przy użyciu automatycznego urządzenia do sekwencjonowania DNA i wszystkie sekwencje aminokwasowe polipeptydów kodowanych przez cząsteczki DNA ustalone tutaj były przewidziane przez translację sekwencji DNA oznaczonych jak powyżej. Zatem, jak to jest znane w tej dziedzinie dla dowolnej sekwencji DNA oznaczonej przy podejściu zautomatyzowanym, dowolna sekwencja nukleotydową ustalona tutaj może zawierać pewne błędy. Sekwencje nukleotydowe ustalone w sposób automatyczny są typowo w przynajmniej 90% identyczne, bardziej typowo w przynajmniej 95% do 99,9% identyczne z faktyczną sekwencją nukleotydową cząsteczki DNA poddanej sekwencjonowaniu. Faktyczna sekwencja może być ustalona w sposób bardziej precyzyjny przez inne podejścia włączając w to sposoby ręcznego sekwencjonowania DNA znane w tej dziedzinie.

Jak to jest również znane w tej dziedzinie, pojedyncza insercja lub delecja w oznaczonej sekwencji nukleotydowej w porównaniu z faktyczną sekwencją spowoduje zmianę ramki odczytu w translacji sekwencji nukleotydowej, tak że przewidziana sekwencja aminokwasowa kodowana przez oznaczoną sekwencję nukleotydową będzie całkowicie różna od sekwencji aminokwasowej faktycznie kodowanej przez sekwencjonowaną cząsteczkę DNA, poczynając od położenia takiej insercji lub delecji.

Specjalista w tej dziedzinie jest zdolny do zidentyfikowania takich błędnie zidentyfikowanych zasad i wie, jak skorygować takie błędy.

Fragmenty, sondy i startery kwasu nukleinowego

Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może obejmować tylko część lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, na przykład

PL 214 792 B1 fragment, który może być użyty jako sonda lub starter lub fragment kodujący część białka według wynalazku. Opisano też cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą tylko część lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38, na przykład fragment, który może być użyty jako sonda lub starter lub fragment kodujący część opisanego tu białka. Sekwencja nukleotydowa oznaczona z klonowania genu enzymu lipolitycznego oraz cDNA pozwala na przygotowanie sond i starterów zaprojektowanych do zastosowania w identyfikacji i/lub klonowaniu innych członków rodziny enzymów lipolitycznych, jak również homologów enzymów lipolitycznych z innych gatunków. Sonda/starter typowo obejmuje zasadniczo oczyszczony oligonukleotyd, który typowo obejmuje region sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje, zwłaszcza w ostrych warunkach, do przynajmniej około 12 lub 15, zwłaszcza około 18 lub 20, zwłaszcza około 22 lub 25, bardziej korzystnie około 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, lub 75 lub więcej nukleotydów z rzędu sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 lub ich funkcjonalnych odpowiedników, ewentualnie sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

Sondy oparte na sekwencjach nukleotydowych dostarczonych tutaj mogą być zastosowane do wykrywania transkryptów lub sekwencji genomowych kodujących te same lub homologiczne białka, na przykład w innych organizmach. W zalecanych wykonaniach sonda ponadto zawiera dołączoną do niej grupę znacznika, np. grupa znacznika może być radioizotopem, związkiem fluorescencyjnym, enzymem lub kofaktorem enzymu. Takie sondy mogą być także zastosowane jako część zestawu do testu diagnostycznego do identyfikacji komórek, w których ulega ekspresji białko enzymu lipolitycznego.

Identyczność i homologia

Określenia „homologia lub „procent identyczności” są tutaj stosowane zamiennie. Na potrzeby tego wynalazku zdefiniowano tutaj, że w celu oznaczenia procentu identyczności dwie sekwencje aminokwasowe lub dwie sekwencje kwasu nukleinowego są przyrównywane w celu optymalnego dopasowania (np. do sekwencji aminokwasowej lub kwasu nukleinowego mogą być wprowadzone przerwy w celu optymalnego przyrównania z drugą sekwencją aminokwasową lub kwasu nukleinowego). Reszty aminokwasowe lub nukleotydy w odpowiadających sobie pozycjach aminowasowych lub pozycjach nukleotydowych są następnie porównywane. Jeżeli w danej pozycji w pierwszej sekwencji znajduje się ta sama reszta aminokwasowa lub nukleotyd jak w odpowiadającej jej pozycji w drugiej sekwencji, to cząsteczki są identyczne w tej pozycji. Procent identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji dzielonych przez długość sekwencji (tj. % identyczności = liczba identycznych pozycji/całkowita liczba pozycji (tj. nakładających się pozycji) x 100). Dogodnie, dwie sekwencje są tej samej długości.

Specjalista w tej dziedzinie wie, że dostępnych jest kilka różnych programów komputerowych do ustalania homologii pomiędzy dwiema sekwencjami. Na przykład, porównanie sekwencji i ustalenie procentu identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami może być dokonane przy użyciu algorytmu matematycznego. W zalecanym wykonaniu procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi jest ustalany przy użyciu algorytmu Needlemana i Wunscha (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), który został włączony do programu GAP w pakiecie programów GCG (dostępny na http://www.gcg.com), przy użyciu macierzy Blossom 62 lub macierzy PAM250, i wagi przerwy 16, 14, 12, 10, 8, 6 lub 4 oraz wagi za wydłużenie przerwy 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Specjalista w tej dziedzinie dostrzeże, że te wszystkie parametry zaowocują nieco różnymi wynikami, ale sumaryczny procent identyczności nie jest znacząco zmieniony po zastosowaniu różnych algorytmów.

W jeszcze innym wykonaniu procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi jest ustalany przy użyciu programu GAP w pakiecie programów GCG (dostępnym na http://www.gcg.com), przy użyciu macierzy NWSgapdna.CMP i wagi przerwy 40, 50, 60, 70 lub 80 oraz wagi wydłużenia przerwy 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. W innym wykonaniu procent identyczności dwóch sekwencji aminokwasowych lub nukleotydowych jest ustalony przy użyciu algorytmu E. Meyersa i W. Millera (CABIOS, 4: 11-17 (1989), który został włączony do programu ALIGN (wersja 2.0) (dostępnym na http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) przy użyciu tablicy wag reszt PAM120 kary za wydłużenie przerwy 12 i kary za przerwę 4 .

Sekwencje nukleotydowe i białkowe według niniejszego wynalazku mogą być także zastosowane jako „sekwencja zapytania” do wykonania przeszukiwania publicznych baz danych w celu, na przykład, identyfikacji innych członków rodziny lub sekwencji spokrewnionych. Takie przeszukiwania mogą

PL 214 792 B1 być wykonane przy użyciu programów BLASTN i BLASTX (wersja 2.0) opracowanych przez Altschul, i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Nukleotydowe wyszukiwania BLAST mogą być wykonane przy użyciu programu BLASTN, wynik = 100, długość słowa = 12 w celu uzyskania sekwencji nukleotydowych homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego PLP03 tu opisanych. Przeszukiwania białkowe BLAST mogą być wykonane przy użyciu programu BLASTX, wynik = 50, długość słowa = 3 w celu uzyskania sekwencji aminokwasowych homologicznych do cząsteczek białkowych PLP03 tu opisanych. W celu uzyskania przyrównań z przerwami do celów porównawczych może być wykorzystany BLAST wprowadzający przerwy, jak opisano w Altschul i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. (17): 3389-3402. Przy korzystaniu z BLAST i BLAST wprowadzającego przerwy mogą być zastosowane domyślne parametry odpowiednich programów (np. BLASTX i BLASTN). Zobacz http://www.ncbi.nim.nih.gov.

Hybrydyzacja

W stosowanym tu znaczeniu określenie „hybrydyzowanie” ma opisywać warunki hybrydyzacji i płukania w warunkach, w których nukleotydowe sekwencje homologiczne do siebie w przynajmniej około 50%, przynajmniej około 60%, przynajmniej około 70%, dogodnie w przynajmniej około 80%, zwłaszcza w przynajmniej około 85% do 90%, w szczególności w przynajmniej 95% typowo pozostaną do siebie zhybrydyzowane.

Zalecanymi, nieograniczającymi przykładami takich warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 6x chlorku sodu/cytrynianie sodu (SSC) w około 45°C, po której następuje jedno lub więcej płukań w 1x SSC, 0,1% SDS w 50°C, dogodnie w 55°C, dogodnie w 60°C, a nawet dogodniej w 65°C.

Bardzo ostre warunki obejmują, na przykład, hybrydyzowanie w 68°C w 5x SSC/5x roztworze Denhardta/1,0% SDS i płukanie w 0,2x SSC/0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Alternatywnie płukanie może być wykonane w 42°C.

Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedzieć, jakie warunki zastosować do ostrych i bardzo ostrych warunków hybrydyzacji. Dodatkowe informacje o takich warunkach są łatwo dostępne w tej dziedzinie, na przykład w Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; oraz Ausubel i wsp. (red.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (JohnWiley & Sons, N. Y.).

Oczywiście polinukleotyd, który hybrydyzuje tylko do sekwencji poliA, takiej jak 3'-końcowy trakt poli(A) cząsteczek mRNA lub do nici komplementarnej złożonej z reszt T (lub U) nie byłby włączony jako polinukleotyd według wynalazku stosowany do specyficznej hybrydyzacji do fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, gdyż taki polinukleotyd hybrydyzowałby do dowolnej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej ciąg poli(A) lub jego dopełnienie (np. do praktycznie dowolnego klonu dwuniciowego cDNA). Uzyskiwanie pełnej długości DNA z innych organizmów.

W typowym podejściu mogą być przeszukiwane biblioteki cDNA skonstruowane z innych organizmów, np. grzybów nitkowatych, w szczególności z gatunków Aspergillus.

Na przykład, szczepy Aspergillus mogą być przeszukiwane na homologiczne polinukleotydy przy użyciu analizy Northern blot. Po wykryciu transkryptów homologicznych do polinukleotydów według wynalazku, mogą być skonstruowane bibioteki cDNA z RNA wyizolowanego z odpowiedniego szczepu, przy wykorzystaniu standardowych technik dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Alternatywnie, biblioteka totalnego genomowego DNA może być przeszukana przy użyciu sondy zdolnej do hybrydyzacji do polinukleotydu według niniejszego wynalazku.

Sekwencje genu homologicznego mogą być wyizolowane, na przykład, przy wykonaniu PCR z użyciem dwóch zdegenerowanych puli starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydowych, jak było tutaj przedstawione.

Matrycą do reakcji może być cDNA uzyskany przez odwrotną transkrypcję mRNA przygotowanego ze szczepów, o których wiadomo lub podejrzewa się, że wykazują ekspresję polinukleotydu według wynalazku. Produkt PCR może być subklonowany i sekwencjonowany, aby upewnić się, że namnożone sekwencje reprezentują sekwencje nowej sekwencji kwasu nukleinowego PLP03, lub jego funkcjonalnego odpowiednika.

Fragment PCR może być następnie użyty do izolowania pełnej długości klonu cDNA różnymi znanymi sposobami. Na przykład, namnożony fragment może być wyznakowany i użyty do przeszukania biblioteki cDNA na bakteriofagach lub kosmidach. Alternatywnie, wyznakowany fragment może być użyty do przeszukania biblioteki genomowej.

Technika PCR może być także użyta do wyizolowania pełnej długości sekwencji cDNA z innych organizmów. Na przykład, RNA może być wyizolowany, przy użyciu standardowych procedur, z odpowiedniego źródła komórkowego lub tkankowego. Na RNA może być wykonana odwrotna transkryp12

PL 214 792 B1 cja przy użyciu startera oligonukleotydowego specyficznego do samego końca 5' namnażanego fragmentu w celu zapoczątkowania syntezy pierwszej nici.

Do otrzymanej hybrydy RNA/DNA może być następnie dodany „ogon” (np. z guanin) przy użyciu standardowej reakcji terminalnej transferazy, hybryda może być strawiona przy użyciu RNazy H i wtedy może być zapoczątkowana synteza drugiej nici (np. ze starterem poli-C). Tak więc, sekwencje cDNA po lewej stronie namnożonego fragmentu mogą być łatwo namnożone. Dla przejrzenia dogodnych strategii klonowania zobacz, np. Sambrook i wsp., powyżej; i Ausubel i wsp., powyżej.

Wektory

Inny aspekt wynalazku odnosi się do wektorów, zwłaszcza wektorów ekspresyjnych, zawierających kwas nukleinowy kodujący białko według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik. Stosowane tutaj określenie „wektor odnosi się cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona. Jednym z typów wektora jest „plazmid”, który odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której mogą być dołączone dodatkowe segmenty DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA mogą być włączone w genom wirusowy. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której są one wprowadzone (np. wektory bakteryjne posiadające bakteryjny początek replikacji oraz ssacze wektory episomalne). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) są wintegrowane w genom komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza, i przez to ulegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Ponadto pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, do których są one funkcjonalnie przyłączone. Takie wektory są określane tutaj, jako „wektory ekspresyjne”. Ogólnie, wektory ekspresyjne stosowane w technikach rekombinacji DNA mają często postać plazmidów. Określenia „plazmid” i „wektor mogą być tutaj używane zamiennie, jako że plazmid jest najczęściej używaną postacią wektora. Jednakże zgodnie z wynalazkiem możliwe jest wykorzystanie takich form innych wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. retrowirusy z defektywną replikacją, adenowirusy i wirusy adeno-satelitarne), które dostarczają takich samych funkcji.

Rekombinowane wektory ekspresyjne tu opisane zawierają kwas nukleinowy według wynalazku w postaci odpowiedniej do ekspresji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza, co oznacza, że rekombinowany wektor ekspresyjny zawiera jeden lub większą liczbę sekwencji regulatorowych wybranych na podstawie komórek gospodarza użytych do ekspresji, które są połączone w sposób funkcjonalny do sekwencji kwasu nukleinowego w celu jego ekspresji. Oczekuje się, że w rekombinowanym wektorze ekspresyjnym „połączony w sposób funkcjonalny” oznacza, że sekwencja nukleotydowa będąca przedmiotem zainteresowania jest przyłączona do sekwencji regulatorowej (regulatorowych) w sposób, który pozwala na ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. w systemie transkrypcji/translacji in vitro lub w komórce gospodarza, jeżeli wektor jest wprowadzony do komórki gospodarza). Oczekuje się, że określenie „sekwencja regulatorowa” obejmuje promotory, wzmacniacze transkrypcji i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnał poliadenylacji). Takie sekwencje regulatorowe są opisane, na przykład w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Sekwencje regulatorowe obejmują te, które kierują ekspresją konstytutywną lub indukowaną sekwencji nukleotydowej tylko w pewnej komórce gospodarza (np. sekwencje regulatorowe tkankowo-specyficzne). Zostanie doceniony przez specjalistę w tej dziedzinie fakt, że zaprojektowanie wektora ekspresyjnego może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza, która będzie transformowana, poziom ekspresji pożądanego białka, itp. Wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być wprowadzone do komórek gospodarza, aby produkować białka lub peptydy kodowane przez kwasy nukleinowe, jak to tutaj opisano (np. enzymy lipolityczne, zmutowane enzymy lipolityczne, ich fragmenty, warianty lub ich funkcjonalne odpowiedniki, białka fuzyjne itp.).

Rekombinowane wektory ekspresyjne tu opisane mogą być zaprojektowane do ekspresji enzymów lipolitycznych w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Na przykład, białko według wynalazku może ulegać ekspresji w komórkach bakteryjnych, takich jak E. coli i gatunki Bacillus, komórkach owadzich (przy użyciu bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), komórkach drożdży lub komórkach ssaczych. Odpowiednie komórki gospodarza są dalej dyskutowane w Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może ulegać transkrypcji i translacji in vitro, na przykład przy użyciu sekwencji regulatorowych promotora T7 i polimerazy T7.

Wektory ekspresyjne użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują wektory pochodzenia chromosomowego, episomalnego i wirusowego, np. wektory pochodzące od plazmidów bakteryjnych,

PL 214 792 B1 bakteriofagów, drożdżowych episomów, elementów chromosomowych drożdży, wirusów, takich jak, bakulowirusy, papowawirusy, wirusy krowianki, adenowirusy, wirusy ospy drobiu, wirusy rzekomej wścieklizny świń i retrowirusy, oraz wirusy pochodzące z ich kombinacji, takie jak te pochodzące z elementów genetycznych plazmidów i baktriofagów, takie jak kosmidy i fagmidy.

Wstawka DNA powinna być połączona w sposób funkcjonalny z odpowiednim promotorem, takim jak promotor faga lambda PL, promotory E. coli lac, trp i tac, wczesne i późne promotory SV40 oraz promotory retrowirusowe LTR, żeby wymieć kilka z nich. Specjalista w tej dziedzinie będzie znał inne odpowiednie promotory. W specyficznym wykonaniu zalecane są promotory, które są zdolne do kierowania wysokim poziomem ekspresji enzymów lipolitycznych w grzybach nitkowatych. Takie promotory są znane w tej dziedzinie. Konstrukty ekspresyjne mogą zawierać miejsca dla inicjacji, terminacji transkrypcji i, w obszarze ulegającym transkrypcji, miejsce wiązania rybosomu dla translacji. Część kodująca dojrzałych transkryptów ulegających ekspresji z konstruktów będzie zawierać kodon inicjacji translacji AUG na początku i kodon terminacji odpowiednio usytuowany na końcu polipeptydu ulegającego translacji.

DNA wektora może być wprowadzony do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych przy użyciu konwencjonalnych technik transformacji i transfekcji. Oczekuje się, że stosowane tutaj określenia „transformacja” i „transfekcja” będą się odnosiły do różnych technik stosowanych w tej dziedzinie do wprowadzenia obcego kwasu nukleinowego (np. DNA) do komórki gospodarza, włączając koprecypitację fosforanem wapnia lub chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem dekstranu DEAE, transdukcję, infekcję, lipofekcję, transfekcję za pośrednictwem lipidów kationowych lub elektroporację. Odpowiednie sposoby transformacji lub transfekcji komórek gospodarza mogą być znalezione w Sambrook, i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis i wsp., Basic Methods in Molecular Biology (1986) i innych podręcznikach laboratoryjnych.

W przypadku stabilnej transfekcji komórek ssaczych wiadomo, że w zależności od wektora ekspresyjnego i zastosowanej techniki transfekcji, tylko niewielka część komórek może wintegrować obcy DNA do ich genomu. W celu identyfikacji i selekcji tych integrantów do komórki gospodarza wraz z genem będącym przedmiotem zainteresowania w ogólności wprowadzany jest gen, który koduje marker selekcyjny (np. oporność na antybiotyki). Zalecane markery selekcyjne obejmują te, które nadają oporność na antybiotyki, takie jak G418, higromycyna i metotreksat. Kwas nukleinowy kodujący marker selekcyjny jest dogodnie wprowadzany do komórki gospodarza na tym samym wektorze, jak ten kodujący białko według wynalazku lub może być wprowadzany na odrębnym wektorze. Komórki stabilnie transfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym mogą być zidentyfikowane przez selekcję na antybiotyk (np. komórki, które włączyły gen markera selekcyjnego przetrwają, podczas gdy inne komórki zginą).

Ekspresja białek w prokariotach jest często przeprowadzana w E. coli przy użyciu wektorów zawierających konstytutywne lub indukowalne promotory kierujące ekspresją zarówno białek fuzyjnych jak i niefuzyjnych. Wektory fuzyjne dodają pewną liczbę aminokwasów do białka kodowanego przez nie, np. do końca aminowego rekombinowanego białka. Takie wektory fuzyjne typowo służą do trzech celów: 1) do zwiększenia ekspresji białka rekombinowanego; 2) do zwiększenia rozpuszczalności białka rekombinowanego; i 3) do ułatwienia oczyszczenia rekombinowanego białka przez działanie jako ligand w oczyszczaniu przez powinowactwo. Często w fuzyjnych wektorach ekspresyjnych wprowadzone jest miejsce cięcia proteolitycznego na połączeniu składnika fuzyjnego i białka rekombinowanego w celu umożliwienia odłączenia białka rekombinowanego od składnika fuzyjnego po oczyszczeniu białka fuzyjnego. Takie enzymy i pokrewne im rozpoznawane sekwencje obejmują czynnik Xa, trombinę i enterokinazę.

Jak wskazano, wektory ekspresyjne będą dogodnie zawierały markery selekcyjne. Takie markery obejmują reduktazę dihydrofolianu lub oporność na neomycynę dla komórek eukariotycznych oraz oporność na tetracyklinę lub ampicylinę dla hodowli w E. coli lub innych bakteriach. Wybrane przykłady odpowiedniego gospodarza obejmują komórki bakteryjne, takie jak E. coli, Streptomyces i Salmonella typhimurium; komórki grzybów, takie jak drożdże; komórki owadzie takie jak Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; komórki zwierzęce, takie jak CHO, COS i czerniak Bowsa; oraz komórki roślinne. Odpowiednie pożywki i warunki hodowli dla powyżej opisanych komórek gospodarza są znane w tej dziedzinie.

Wśród wektorów zalecanych do zastosowania w bakteriach są pQE70, pQE60 i PQE-9, dostępne z Qiagen; wektory pBS, wektory Phagescript, wektory Bluescript, pNH8A, ρΝΗ18Α, pNH18A,

PL 214 792 B1 pNH46A, dostępne ze Stratagene; i ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 dostępne z Pharmacia. Wśród zalecanych wektorów eukariotycznych są PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 i pSG dostępne ze Stratagene; oraz pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL dostępne z Pharmacia. Inne odpowiednie wektory będą z łatwością oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie.

Znane promotory bakteryjne do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują promotory E. coli IacI i IacZ, promotory T3 i T7, promotor gpt, promotory lambda PR, PL i promotor trp, promotor kinazy tymidynowej HSV, wczesne i późne promotory SV40, promotory retrowirusowe LTR, jak te z wirusa mięsaka Rousa („RSV) i promotory metaloproteinowe, takie jak promotor mysiej metalotioneiny-1.

Wstawienie sekwencji wzmacniającej transkrypcję do wektora może w wyższych eukariotach zwiększyć transkrypcję DNA kodującego polipeptydy według niniejszego wynalazku. Wzmacniacze transkrypcji są elementami DNA działającymi w pozycji cis, zazwyczaj około od 10 do 300 pz, które działają tak, że zwiększają transkrypcyjną aktywność promotora w danym typie komórki gospodarza. Przykłady takich wzmacniaczy transkrypcji obejmują wzmacniacz transkrypcji SV40, który jest położony na miejscu późnym startu replikacji w pozycji 100 do 270 pz, wzmacniacz transkrypcji wczesnego promotora wirusa cytomegalii, wzmacniacz transkrypcji poliomawirusa na stronie późnej miejsca startu replikacji oraz adenowirusowe wzmacniacze transkrypcji.

Do sekrecji białka ulegającego translacji do światła siateczki śródplazmatycznej, do przestrzeni międzybłonowej lub do środowiska zewnątrzkomórkowego może być użyty odpowiedni sygnał sekrecji włączony do polipeptydu ulegającego ekspresji. Sygnały mogą być endogenne dla polipeptydu lub mogą one być sygnałami heterologicznymi.

Polipeptyd może ulegać ekspresji w postaci zmodyfikowanej, takiej jak białko fuzyjne i może zawierać nie tylko sygnały sekrecji, ale także dodatkowe heterologiczne sygnały funkcjonalne. Tak więc, na przykład, region dodatkowych aminokwasów, szczególnie aminokwasów obdarzonych ładunkiem, może być dodany do N-końca polipeptydu w celu poprawienia stabilności i trwałości w komórce gospodarza podczas oczyszczania lub podczas dostawy i przechowywania. Także składniki peptydowe mogą być dodane do polipeptydu w celu usprawnienia oczyszczania.

Polipeptydy według wynalazku

Wynalazek dostarcza wyizolowanego peptydu posiadającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12, sekwencję aminokwasową możliwą do uzyskania przez ekspresję polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 w odpowiednim gospodarzu. Powyższe polipeptydy są wspólnie objęte określeniem „polipeptydy według wynalazku”. Opisano też wyizolowane peptydy posiadające sekwencje aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, sekwencje aminokwasowe możliwe do uzyskania przez ekspresję polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 w odpowiednim gospodarzu. Opisano także peptyd lub polipeptyd zawierający funkcjonalny odpowiednik powyższych polipeptydów.

Określenia „peptyd i „oligopeptyd są uważane za synonimiczne (jak się powszechnie uważa) i każde określenie może być użyte zamiennie, jeżeli kontekst wymaga wskazania łańcucha przynajmniej dwóch aminokwasów sparowanych przez wiązanie peptydowe. Słowo „polipeptyd jest stosowane tutaj dla łańcuchów zawierających więcej niż siedem reszt aminokwasowych. Wszystkie wzory oligopeptydów i polipeptydów lub sekwencje są tutaj napisane od lewej strony do prawej i w kierunku od końca aminowego do końca karboksylowego. Stosowany tutaj kod jednoliterowy aminokwasów jest powszechnie znany w tej dziedzinie i może być znaleziony w Sambrook, i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Przez „wyizolowany polipeptyd lub białko uważa się polipeptyd lub białko wyodrębnione z jego natywnego środowiska. Na przykład, polipeptydy i białka ulegające ekspresji w komórkach gospodarza są polipeptydami natywnymi lub rekombinowanymi, które zostały zasadniczo oczyszczone przez dowolną odpowiednią technikę, taką jak, na przykład, sposób jednoetapowego oczyszczania ujawnionego w Smith i Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Enzym lipolityczny według wynalazku może być odzyskany i oczyszczony z hodowli komórek rekombinowanych dobrze znanymi sposobami, w tym z użyciem precypitacji siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcji kwasem, anionową lub kationową chromatografią jonowymienną, chromatografią na fosfocelulozie, chromatografią oddziaływań hydrofobowych, chromatografią powinowactwa, chroPL 214 792 B1 matografią na hydroksyapatycie i chromatografią na lektynie. Najdogodniej do oczyszczenia jest stosowana wysokosprawna chromatografia cieczowa („HPLC”).

Polipeptydy według niniejszego wynalazku obejmują naturalnie oczyszczone produkty, produkty z procedur syntezy chemicznej i produkty otrzymane technikami rekombinacji DNA z prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza, włączając w to, na przykład, komórki bakteryjne, drożdżowe, wyższych roślin, owadzie i ssacze. W zależności od gospodarza użytego w procedurze wytwarzania opartej na technice rekombinacji DNA, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być glikozylowane lub mogą być nieglikozylowane. Dodatkowo polipeptydy według wynalazku mogą także w pewnych przypadkach zawierać zmodyfikowaną resztę początkowej metioniny jako rezultat procesów związanych z gospodarzem.

Enzym lipolityczny według wynalazku może być dogodnie stosowany w procesach piekarniczych. Ilość enzymu dodawanego do ciasta jest oznaczana empirycznie. Może to zależeć od ilości użytej mąki, stopnia ulepszenia, jaki jest pożądany, rodzaju pieczywa lub wyrobów piekarniczych, sposobu wytwarzania ciasta, proporcji innych składników i tym podobnych.

Fragmenty białek

Zgodnie z wynalazkiem opisano także biologicznie aktywne fragmenty polipeptydów według wynalazku.

Biologicznie aktywne fragmenty polipeptydów według wynalazku obejmują polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe wystarczająco identyczne z sekwencją aminokwasową enzymu lipolitycznego lub otrzymane z sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego o sekwencji NR ID. SEKW.: 12, które zawierają mniej aminokwasów niż białko pełnej długości i wykazują przynajmniej jedną aktywność biologiczną odpowiedniego białka pełnej długości. Opisano też biologicznie aktywne fragmenty opisanych tu polipeptydów obejmujące polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe wystarczająco identyczne z sekwencją lub otrzymane z sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego (np. sekwencja aminokwasowa wybrana z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33,36 i 39), które zawierają mniej aminokwasów niż białko pełnej długości i wykazują przynajmniej jedną aktywność biologiczną odpowiedniego białka pełnej długości. Typowo fragmenty aktywne biologicznie zawierają domenę lub motyw z przynajmniej jedną aktywnością odpowiadającego białka pełnej długości.

Biologicznie aktywny fragment białka według wynalazku może być polipeptydem, którego długość wynosi, na przykład, 10, 25, 50, 100 lub więcej aminokwasów. Ponadto inne biologicznie aktywne części, w których inne regiony białka są usunięte mogą być przygotowane przez techniki rekombinacji DNA i sprawdzone pod względem jednej lub większej liczby aktywności biologicznych natywnej formy polipeptydu według wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także fragmenty kwasu nukleinowego, które kodują powyższe biologicznie aktywne fragmenty białka enzymu lipolitycznego.

Białka fuzyjne

Białka według niniejszego wynalazku lub ich funkcjonalne odpowiedniki, np. ich biologicznie aktywne części, mogą być funkcjonalnie przyłączone do polipeptydu enzymu nie-lipolitycznego (np. heterologicznych sekwencji aminokwasowych) w celu utworzenia białek fuzyjnych. Stosowane tutaj określenie „białko chimerowe lub „białko fuzyjne enzymu lipolitycznego obejmuje polipeptyd enzymu lipolitycznego funkcjonalnie przyłączony do polipeptydu enzymunie-lipolitycznego. „Polipeptyd enzymu lipolitycznego” odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12, lub może się odnosić do polipeptydu o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, podczas, gdy „polipeptyd enzymu nielipolitycznego” odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą białku, które nie jest istotnie homologiczne do enzymu lipolitycznego, np. białku, które jest różne od enzymu lipolitycznego i które pochodzi z tego samego lub innego organizmu. Wewnątrz białka fuzyjnego enzymu lipolitycznego polipeptyd enzymu lipolitycznego może odpowiadać całemu lub części białka enzymu lipolitycznego. W zalecanym wykonaniu, białko fuzyjne enzymu lipolitycznego zawiera przynajmniej dwie biologicznie aktywne części białka enzymu lipolitycznego. Oczekuje się, że wewnątrz białka fuzyjnego określenie „funkcjonalnie połączony” oznacza, że polipeptyd enzymu lipolitycznego i polipeptyd enzymu nie-lipolitycznego są połączone ze sobą w ramce odczytu. Polipeptyd enzymu nie-lipolitycznego może być przyłączony do N-końca lub C-końca polipeptydu enzymu lipolitycznego.

PL 214 792 B1

Na przykład, w jednym z wykonań, białko fuzyjne jest białkiem fuzyjnym GST-enzym lipolityczny, w którym sekwencja enzymu lipolitycznego jest połączona z C-końcem sekwencji GST. Takie białka fuzyjne mogą ułatwić oczyszczanie rekombinowanego enzymu lipolitycznego (rekombinowanych enzymów lipolitycznych). W innym wykonaniu białko fuzyjne jest białkiem enzymu lipolitycznego zawierającym heterologiczną sekwencję sygnałową na jego N-końcu. W pewnych komórkach gospodarza (np. komórkach gospodarza ssaczego lub drożdżowego), ekspresja i/lub oczyszczanie enzymu lipolitycznego może być zwiększone przez zastosowanie heterologiczej sekwencji sygnałowej.

W innym przykładzie jako heterologiczna sekwencja może być użyta sekwencja sekrecyjna gp67 białka otoczki bakulowirusa (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp., red., John Wiley & Sons, 1992). Inne przykłady eukariotycznych heterologicznych sekwencji sygnałowych obejmują sekwencje sekrecyjne melityny i ludzkiej fosfatazy alkalicznej z łożyska (Stratagene; La Jolla, Kalifornia). W jeszcze innym przykładzie, użyteczne prokariotyczne heterologiczne sekwencje sygnałowe obejmują sygnał sekrecyjny phoA (Sambrook i wsp., powyżej) i sygnał sekrecyjny białka A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).

Sekwencja sygnałowa może być użyta do ułatwienia sekrecji i izolacji białka lub peptydu według wynalazku. Sekwencje sygnałowe są typowo scharakteryzowane przez rdzeń aminokwasów hydrofobowych, które w ogólności są odcinane od dojrzałego białka podczas sekrecji w jednym lub kilku etapach cięcia. Takie peptydy sygnałowe zawierają miejsca obróbki, które pozwalają na odcięcie sekwencji sygnałowej od dojrzałych białek po ich przejściu przez szlak sekrecyjny. Sekwencja sygnałowa kieruje sekrecję białka, na przykład z gospodarza eukariotycznego, do którego transformowano wektor ekspresyjny, a sekwencja sygnałowa jest po lub w trakcie sekrecji odcinana. Białko może być następnie z łatwością oczyszczone z środowiska pozakomórkowego sposobami znanymi w tej dziedzinie. Alternatywnie, sekwencja sygnałowa może być przyłączona do białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu sekwencji, która poprawia oczyszczanie, jak na przykład domena GST. Tak więc, na przykład, sekwencja kodująca polipeptyd może być przyłączona do sekwencji znacznikowej, takiej jak sekwencja kodująca peptyd, który ułatwia oczyszczanie takiego przyłączonego polipeptydu. W pewnych zalecanych wykonaniach tego aspektu wynalazku sekwencja znacznikowa jest peptydem heksa-histydynowym, takim jak znacznik dostarczony w wektorze pQE(Qiagen, Inc.), spośród innych, wiele z nich jest komercyjnie dostępnych. Jak opisano w Gentz i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), na przykład heksa-histydyny dostarczają wygodnego sposobu oczyszczania białka fuzyjnego. Znacznik HA jest innym peptydem użytecznym w oczyszczaniu, który odpowiada epitopowi pochodzącemu z białka hemaglutyniny z wirusa grypy, który na przykład był opisany przez Wilson i wsp., Cell 37 :767 (1984).

Dogodnie, białko chimerowe lub fuzyjne tu opisane jest wytwarzane standardowymi technikami rekombinacji DNA. Na przykład, fragmenty DNA kodujące sekwencje różnych polipeptydów są łączone ze sobą w ramce odczytu tradycyjnymi technikami, na przykład przy zastosowaniu tępo zakończonych lub lepko zakończonych końców do ligacji, trawienia enzymem restrykcyjnym w celu dostarczenia odpowiedniego końca, wypełniania spoistych końców jeśli konieczne, traktowania alkaliczną fosfatazą w celu uniknięcia niepożądanego łączenia i enzymatycznej ligacji. W innym wykonaniu gen fuzyjny może być zsyntetyzowany tradycyjnymi technikami, w tym zautomatyzowanych urządzeń do syntezy DNA. Alternatywnie, może być zastosowane namnażanie fragmentów genu w reakcji PCR przy użyciu starterów kotwiczących, które dają początek komplementarnym częściom wystającym pomiędzy dwoma nieprzerwanymi fragmentami genów, które mogą być następnie przyłączone i ponownie namnożone w celu wytworzenia sekwencji genu chimerowego (zobacz, na przykład, Current Protocols in Molecular Biology, red. Ausubel i wsp., JohnWiley & Sons: 1992). Ponadto, komercyjnie dostępnych jest wiele wektorów ekspresyjnych, które już kodują składnik fuzyjny (np. polipeptyd GST). Kwas nukleinowy kodujący enzym lipolityczny może być wklonowany do takiego wektora ekspresyjnego tak, że składnik fuzyjny jest przyłączony w ramce odczytu do białka enzymu lipolitycznego.

Funkcjonalne odpowiedniki

Określenia „funkcjonalne odpowiedniki” i „funkcjonalne warianty” są używane tutaj zamiennie. Funkcjonalne odpowiedniki DNA kodującego enzym lipolityczny są wyizolowanymi fragmentami DNA, które kodują polipeptyd, który wykazuje określoną funkcję enzymu lipolitycznego z Aspergillus niger, jak tutaj opisano. Funkcjonalne odpowiedniki zatem także obejmują fragmenty biologicznie aktywne.

Funkcjonalne odpowiedniki białka lub polipeptydu mogą zawierać tylko konserwatywne substytucje jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12, lub ewentualPL 214 792 B1 nie w sekwencjach aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub substytucje, insercje lub delecje nieistotnych aminokwasów. Odpowiednio, nieistotnym aminokwasem jest reszta, która może być zmieniona w sekwencjach aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 bez znaczącej zmiany funkcji biologicznej. Na przykład, przewiduje się, że reszty aminokwasowe konserwowane wśród białek enzymów lipolitycznych są specyficznie niepodatne na zmiany. Ponadto, aminokwasy konserwowane pośród białek enzymów lipolitycznych według niniejszego wynalazku i innych enzymów lipolitycznych najprawdopodobniej nie są podatne na zmiany.

Oczekuje się, że określenie „konserwatywna substytucja” będzie oznaczać substytucję, w której reszta aminokwasu jest zastąpiona resztą aminokwasu mającego podobny łańcuch boczny. Te rodziny są znane w tej dziedzinie i obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina i histydyna), kwaśnymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy i kwas glutaminowy), nienaładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treon ina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (np. treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna).

Funkcjonalne odpowiedniki kwasu nukleinowego mogą typowo zawierać mutacje ciche lub mutacje, które nie zmieniają biologicznej funkcji kodowanego polipeptydu. Stosownie do tego, wynalazek dostarcza cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka enzymów lipolitycznych, które zawierają zmiany w resztach aminokwasowych, które nie są istotne do określonej aktywności biologicznej. Takie białka enzymów lipolitycznych różnią się w sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 nadal zachowując przynajmniej jedną aktywność biologiczną. W jednym z wykonań wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko, które posiada istotnie homologiczną sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Opisano też wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą białko, które posiada istotnie homologiczną sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

Na przykład, informacje dotyczące, jak uzyskać fenotypowo ciche substytucje aminokwasowe są dostarczone przez Bowie, J.U. i wsp., Science 247:1306-1310 (1990), w którym autorzy wskazują, że istnieją dwa główne podejścia do badania tolerancji sekwencji aminokwasowej na zmianę. Pierwszy sposób polega na procesie ewolucji, w którym mutacje są zarówno akceptowane lub odrzucane przez dobór naturalny. Drugie podejście stosuje inżynierię genetyczną do wprowadzenia zmian aminokwasów w specyficznych pozycjach sklonowanego genu i wybiera lub przeszukuje w celu zidentyfikowania sekwencji, które zachowują funkcjonalność. Jak twierdzą autorzy, te badania ujawniły, że białka są zaskakująco tolerancyjne na substytucje aminokwasowe. Autorzy dalej wskazują, które zmiany będą prawdopodobnie dozwolone w pewnych pozycjach białka. Na przykład, najbardziej wewnętrzne reszty aminokwasowe wymagają niepolarnych łańcuchów bocznych, podczas gdy ogólnie niewiele cech powierzchniowych łańcuchów bocznych jest konserwowanych. Inne takie fenotypowo ciche substytucje są opisane w Bowie i wsp., powyżej, i referencjach tutaj cytowanych.

Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego białko homologiczne do białka wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 może być utworzona przez wprowadzenie jednej lub kilku substytucji nukleotydowych, addycji lub delecji do odpowiednich kodujących sekwencji nukleotydowych (Tabela 1) tak, że do kodowanego białka jest wprowadzona jedna lub więcej substytucji, delecji lub insercji. Takie mutacje mogą być wprowadzone przez standardowe techniki, takie jak mutageneza ukierunkowana i mutageneza za pośrednictwem PCR.

Określenie „funkcjonalne odpowiedniki także obejmuje ortologi dostarczonych tutaj enzymów lipolitycznych z Aspergillus niger. Ortologi enzymów lipolitycznych z Aspergillus niger są białkami, które mogą być wyizolowane z innych szczepów lub gatunków i posiadają podobną lub identyczną aktywność biologiczną. Takie ortologi mogą natychmiast być zidentyfikowane jako zawierające sekwencję aminokwasową, która jest istotnie homologiczna do sekwencji aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

PL 214 792 B1

Jak zdefiniowano tutaj, określenie „istotnie homologiczne” odnosi się do pierwszej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, która zawiera wystarczającą lub minimalną liczbę identycznych lub równocennych (np. z podobnym łańcuchem bocznym) aminokwasów lub nukleotydów w porównaniu z drugą sekwencją aminokwasową lub nukleotydową tak, że pierwsze i drugie sekwencje aminokwasowe lub nukleotydowe posiadają wspólną domenę. Na przykład, aminokwasowe lub nukleotydowe sekwencje, które zawierają wspólną domenę posiadającą około 60%, dogodnie 65%, zwłaszcza 70%, w szczególności 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności lub więcej są tutaj zdefiniowane jako wystarczająco identyczne.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także kwasy nukleinowe kodujące innych członków rodziny enzymów lipolitycznych, które przez to mają sekwencję nukleotydową, która różni się od sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Ponadto, opisano również kwasy nukleinowe kodujące białka enzymów lipolitycznych z różnych gatunków, które przez to mają sekwencję nukleotydową, która różni się od sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38.

Cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadające wariantom (np. naturalnym wariantom allelicznym) i homologom polinukleotydów według wynalazku mogą być wyizolowane na podstawie ich homologii do kwasów nukleinowych ujawnionych tutaj przy użyciu cząsteczek cDNA ujawnionych tutaj lub ich odpowiednich fragmentów jako sond hybrydyzacyjnych według standardowych technik hybrydyzacji w szczególności w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji.

Dodatkowo, do naturalnie występujących wariantów allelicznych sekwencji Aspergillus niger dostarczonych tutaj, specjalista rozpozna, że te zmiany mogą być wprowadzone przez mutację sekwencji nukleotydowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 prowadząc przez to do zmian w sekwencji aminokwasowej białka enzymu lipolitycznego bez istotnej zmiany w funkcji białka.

W innym aspekcie wynalazku dostarczone są ulepszone enzymy lipolityczne. Ulepszone enzymy lipolityczne są białkami, w których ulepszona jest przynajmniej jedna aktywność biologiczna. Takie białka mogą być uzyskane przez losowe wprowadzanie mutacji w całej lub części sekwencji kodującej enzym lipolityczny, tak jak przez mutagenezę wysycania a powstałe mutanty mogą ulegać ekspresji przy użyciu technik rekombinacji DNA i być przeszukiwane pod kątem aktywności biologicznej. Na przykład stn techniki dostarcza standardowych technik pomiaru aktywności enzymatycznej enzymów lipolitycznych i w ten sposób białka mogą być łatwo selekcjonowane.

Enzym lipolityczny według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12. Enzym lipolityczny może mieć także sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. W innym wykonaniu enzym lipolityczny jest istotnie homologiczny do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12 oraz zachowuje przynajmniej jedną aktywność biologiczną polipeptydu NR ID. SEKW.: 12, jednakże różni się w sekwencji aminokwasowej dzięki naturalnej zmienności lub mutagenezie, jak opisano powyżej. Może być ewentualnie homologiczny do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz zachowywać przynajmniej jedną aktywność biologiczną polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, jednakże różnić się w sekwencji aminokwasowej dzięki naturalnej zmienności lub mutagenezie, jak opisano powyżej.

W innym wykonaniu, enzym lipolityczny posiada sekwencję aminokwasową kodowaną przez wyizolowany fragment kwasu nukleinowego zdolny do hybrydyzacji do kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. W innym wykonaniu, enzym lipolityczny może posiadać sekwencję aminokwasową kodowaną przez wyizolowany fragment kwasu nukleinowego zdolny do hybrydyzacji do kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji.

Stosownie do tego, enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEK ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz zachowuje przynajmniej jedną funkcjonalną aktywność polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

PL 214 792 B1

W szczególności enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.:3 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.: 6, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:9, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:12 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazan ej w NR ID. SEKW.:15, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:18 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:21, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:24 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazan ej w NR ID. SEKW.:27, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:30 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:33, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:36 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:39.

Funkcjonalne odpowiedniki białka według wynalazku mogą być także zidentyfikowane np. przez przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek mutantów, np. mutantów skróconych, białka według wynalazku pod kątem aktywności enzymu lipolitycznego. W jednym z wykonań zróżnicowana biblioteka wariantów jest wytwarzana przez kombinatoryczną mutagenezę na poziomie kwasu nukleinowego. Zróżnicowana biblioteka wariantów może być stworzona przez, na przykład, enzymatyczne łączenie mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów w sekwencje genu tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji białkowych ulega ekspresji jako pojedyncze białka (np. w przypadku biblioteki prezentacji białka na powierzchni faga). Istnieją różne sposoby, które można zastosować do wytwarzania bibliotek potencjalnych wariantów polipeptydów według wynalazku ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Sposoby syntetyzowania zdegenerowanych oligonukleotydów są znane w tej dziedzinie (zobacz, np. Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i wsp. (1984) Science 198:1056; Ike i wsp. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477)

Dodatkowo, biblioteki fragmentów sekwencji kodującej polipeptyd według wynalazku mogą być użyte do wytwarzania zróżnicowan ej populacji polipeptydów do przeszukiwania i następnie selekcji wariantów. Na przykład, biblioteka fragmentów sekwencji kodującej może być wytworzona przez traktowanie dwuniciowego fragmentu PCR sekwencji kodującej będącej przedmiotem zainteresowania nukleazą w warunkach, których pojawia się pęknięcie około jeden raz na cząsteczkę, denaturowania dwuniciowego DNA, renaturowania DNA w celu powstania dwuniciowego DNA, które może zawierać sensowne/antysensowne pary z różnych pękniętych produktów, usuwania jednoniciowych fragmentów z ponownie powstałych dupleksów przez traktowanie nukleazą S1 ligacja

PL 214 792 B1 powstałej biblioteki z wektorem ekspresyjnym. Dzięki temu sposobowi może być otrzymana biblioteka ekspresyjna, która koduje N-końcowe i wewnętrzne fragmenty o różnej wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania.

W tej dziedzinie znanych jest kilka technik do przeszukiwania produktów genowych bibliotek kombinatorycznych wytworzonych przez punktowe mutacje powstałe po przycięciu DNA i do przeszukiwania bibliotek cDNA dla produktów genowych posiadających wybraną właściwość. Najbardziej rozpowszechnione techniki do przeszukiwania dużych bibliotek genowych, które są użyteczne do analizy w dużej skali, typowo obejmują klonowanie biblioteki genowej do wektorów ekspresyjnych ulegających replikacji, transformowanie odpowiednich komórek powstałą biblioteką wektorów, i ekspresję kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrycie pożądanej aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt został wykryty. W połączeniu ze sposobami przeszukiwania w celu identyfikacji wariantów białka według wynalazku może być zastosowana rekursywna mutageneza grupy mutantów (REM, ang. recursive ensemble mutagenesis), technika, która zwiększa częstość funkcjonalnych mutantów w bibliotekach, (Arkin i Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 9:7811-7815; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Dla specjalisty w tej dziedzinie będzie oczywiste, że w danej populacji mogą istnieć polimorfizmy sekwencji DNA, które mogą wprowadzać zmiany do sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego. Takie genetyczne polimorfizmy mogą istnieć w komórkach z różnych populacji lub wewnątrz populacji dzięki naturalnej zmienności alleli. Warianty alleliczne mogą także obejmować funkcjonalne odpowiedniki.

Fragmenty polinukleotydu według wynalazku mogą także zawierać polinukleotydy, które nie kodują funkcjonalnych polipeptydów. Takie polinukleotydy mogą funkcjonować jako sondy lub startery do reakcji PCR.

Kwasy nukleinowe według wynalazku, niezależnie czy kodują funkcjonalne lub niefunkcjonalne polipeptydy, mogą być stosowane jako sondy hybrydyzacyjne lub startery w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Zastosowania cząsteczek kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, które nie kodują polipeptydu posiadającego aktywności enzymu lipolitycznego obejmują, między innymi, (1) izolowanie genu kodującego białko enzymu lipolitycznego, lub jego allelicznych wariantów z biblioteki cDNA np. z innego organizmu niż Aspergillus niger; (2) hybrydyzację in situ (np. FISH) ramion chromosomów metafazowych w celu dostarczenia dokładnej lokalizacji na chromosomie genu enzymu lipolitycznego, jak opisano w Verma i wsp., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) analizę Northern blot do wykrywania ekspresji mRNA enzymu lipolitycznego w specyficznych tkankach i/lub komórkach i 4) sondy i startery, które mogą być zastosowane jako narzędzie diagnostyczne do analizy obecności kwasu nukleinowego zdolnego do hybrydyzacji do sondy enzymu lipolitycznego w danej próbce biologicznej (np. tkance).

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania genu lub cDNA kodującego funkcjonalny odpowiednik enzymu lipolitycznego. Taki sposób wymaga otrzymywania wyznakowanej sondy, która zawiera wyizolowany kwas nukleinowy, który koduje całą lub fragment sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich wariantów; przeszukiwania biblioteki fragmentów kwasu nukleinowego wyznakowaną sondą w warunkach, które pozwalają na hybrydyzację sondy do fragmentów kwasu nukleinowego w bibliotece, tworząc przez to dupleksy kwasu nukleinowego i sporządzenia sekwencji genu o pełnej długości z fragmentów kwasu nukleinowego z każdego wyznakowanego dupleksu w celu uzyskania genu spokrewnionego z genem enzymu lipolitycznego.

W jednym z wykonań kwas nukleinowy według wynalazku jest przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. W jednym z wykonań kwas nukleinowy tu opisany może być przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 25 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich dopełnienia.

W innym zalecanym wykonaniu polipeptyd według wynalazku jest przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Polipeptyd tu opisany może być przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,

PL 214 792 B1

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

Komórki gospodarza

W innym wykonaniu wynalazek opisuje komórki, np. transformowane komórki gospodarza lub rekombinowane komórki gospodarza, które zawierają kwas nukleinowy objęty wynalazkiem. „Komórką transformowaną” lub „komórką rekombinowaną” jest komórka, do której (lub do której przodka) wprowadzono, w znaczeniu technik rekombinowanego DNA, kwas nukleinowy według wynalazku. Obejmuje to zarówno komórki prokariotyczne jak i eukariotyczne, np. bakterie, grzyby, drożdże i tym podobne, szczególnie korzystne są komórki z grzybów nitkowatych, w szczególności Aspergillus niger.

Można wybrać komórkę gospodarza, która moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji, lub modyfikuje i obrabia produkt genowy w specyficzny, pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i obróbka (np. cięcie) produktów białkowych może polepszyć optymalne funkcjonowanie białka.

Różne komórki posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy posttranslacyjnej obróbki i modyfikacji białek oraz produktów genowych. W celu zapewnienia pożądanych w poprawnych modyfikacji i obróbki obcego białka ulegającego ekspresji mogą być wybrane odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarza znane specjalistom w dziedzinie biologii molekularnej i/lub mikrobiologii. W tym celu zastosowane mogą być eukariotyczne komórki gospodarza, które posiadają maszynerię komórkową do właściwej obróbki pierwotnego transkryptu, glikozylacji i fosforylacji produktu genowego. Takie komórki gospodarza są dobrze znane w tej dziedzinie.

Komórki gospodarza obejmują, ale bez ograniczenia, ssacze linie komórkowe, takie jak CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 i linie komórkowe splotu naczyniówkowego.

Jeśli to pożądane polipeptydy według wynalazku mogą być wytwarzane przez stabilnie transfekowane linie komórkowe. Publicznie dostępnych jest szereg wektorów odpowiednich do stabilnej transfekcji komórek ssaczych, sposoby otrzymywania takich linii komórkowych są także publicznie znane, np. w Ausubel i wsp. (powyżej).

Przeciwciała

Zgodnie z wynalazkiem opisano także przeciwciała, takie jak przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, które specyficznie wiążą białka enzymu lipolitycznego według wynalazku.

Przez stosowane tutaj określenie „przeciwciało” (Ab) lub „przeciwciało monoklonalne” (Mab) rozumie się, że obejmuje ono nienaruszone cząsteczki, jak również fragmenty przeciwciał (takie jak, na przykład, fragmenty Fab i F(ab')2, które są zdolne do specyficznego wiązania się do białka enzymu lipolitycznego. Fragmenty Fab i F(ab)2 nie posiadają fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, są szybciej usuwane z krwioobiegu, mogą posiadać mniej niespecyficzne wiązanie do tkanek od nienaruszonego przeciwciała (Wahl i wsp., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Tak więc, te fragmenty są zalecane.

Przeciwciała tu opisane mogą być wytwarzane dowolnym z różnych sposobów. Na przykład komórki z ekspresją białka enzymu lipolitycznego lub jego fragmentu antygenowego mogą być podane zwierzęciu w celu zapoczątkowania produkcji surowicy zawierającej przeciwciała poliklonalne. W zalecanym sposobie preparat białka enzymu lipolitycznego jest przygotowywany i oczyszczany w celu uczynienia go zasadniczo czystym od naturalnych zanieczyszczeń. Taki preparat jest następnie wprowadzany do zwierzęcia w celu produkcji poliklonalnej surowicy odpornościowej o większej aktywności specyficznej.

W najbardziej zalecanym sposobie przeciwciała tu opisane są przeciwciałami monoklonalnymi (lub ich fragmentami wiążącymi białko enzymu lipolitycznego). Takie przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowywane przy użyciu techniki hybrydomy (Kohler i wsp., Nature 256:495 (1975); Kohler i wsp., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Hammering i wsp., W: Monoclonal Antibodies andT-Cell

Hybridomas, Elsevier, N. Y., str. 563 - 681 (1981)). Ogólnie, takie procedury obejmują immunizację zwierzęcia (zwłaszcza myszy) antygenem białka enzymu lipolitycznego lub komórkami z ekspresją białka enzymu lipolitycznego. Limfocyty śledziony takiej myszy są izolowane i poddawane fuzji z odpowiednią linią komórkową szpiczaka. Zgodnie z wynalazkiem może być użyta dowolna linia komórkowa szpiczaka; jednakże zalecane jest wykorzystanie macierzystej linii komórkowej szpiczaka (SP20), dostępniej w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Po fuzji powstałe komórki hybrydomy są utrzymywane w pożywce selekcyjnej HAT a następnie klonowane przez seryjne rozcieńczenia, jak opisano w Wands i wsp. (Gastro-enterology 80:225-232 (1981)). Komórki hybrydomy uzyskane przez taką selekcję są następnie poddawane oznaczeniom w celu zidentyfikowania klonów

PL 214 792 B1 z sekrecją przeciwciał zdolnych do wiązania antygenu białka enzymu lipolitycznego. Ogólnie, polipeptydy mogą być łączone z białkiem nośnikowym, takim jak KLH, jak opisano w Ausubel i wsp., powyżej, mieszane z adiuwantem i wstrzykiwane do gospodarza ssaczego.

Różni gospodarze zwierzęcy mogą być immunizowani przez wstrzyknięcie peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Przykłady odpowiednich gospodarzy zwierzęcych obejmują króliki, myszy, świnki morskie i szczury. W zależności od gatunków gospodarza, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej mogą być zastosowane różne adiuwanty, w tym, ale bez ograniczenia, adiuwant Freunda (kompletny i niekompletny), żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluroniczne (polimery 2-metylooksiranu), polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa Megathura crenulata, dinitrofenol, BCG (bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Przeciwciała poliklonalne są heterogennymi populacjami cząsteczek przeciwciał otrzymanych z surowicy immunizowanych zwierząt.

Takie przeciwciała mogą być dowolną klasą immunoglobulin, w tym IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i dowolna ich podklasa. Hybrydomy wytwarzające mAb tu opisane mogą być hodowane in vitro lub in vivo.

Po otrzymaniu przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne są testowane pod kątem specyficznego rozpoznawania białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników w immunooznaczeniu, takim jak analiza Western blot lub immunoprecypitacja przy zastosowaniu standardowych technik, np. jak opisano w Ausubel i wsp., powyżej. Przeciwciała, które specyficznie wiążą się do białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników są użyteczne w wynalazku. Na przykład, takie przeciwciała mogą być użyte w immunooznaczeniu do wykrywania białka według wynalazku w patogennych lub niepatogennych szczepach Aspergillus (np. w ekstraktach z Aspergillus).

Zalecane jest otrzymywanie przeciwciał przy użyciu fragmentów białka według wynalazku, które przypuszczalnie mogą być antygenowe, stosując kryteria, takie jak duża częstość występowania reszt naładowanych. Na przykład, takie fragmenty mogą być wytwarzane przez standardowe techniki oparte o PCR i następnie klonowane do wektora ekspresyjnego pGEX (Ausubel i wsp., powyżej). Białka fuzyjne mogą następnie ulegać ekspresji w E. coli i być oczyszczane przy użyciu macierzy powinowactwa do agarozy glutationowej, jak opisano w Ausubel, i wsp., powyżej. Jeśli jest to pożądane, dla każdego białka można wytworzyć kilka (np. dwie lub trzy) fuzji i każda fuzja może być wstrzyknięta do przynajmniej dwóch zwierząt. Surowice odpornościowe mogą być przygotowane przez wstrzyknięcia w seriach, typowo obejmując przynajmniej trzy wstrzyknięcia przypominające. Typowo, surowice odpornościowe są sprawdzane pod kątem ich zdolności do immunoprecypitacji białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników, podczas gdy niespokrewnione białka mogą służyć jako kontrola dla specyficzności reakcji immunologicznej.

Alternatywnie, techniki opisane do produkcji przeciwciał o pojedynczych łańcuchach (Patenty USA 4946778 i 4704692) mogą być zaadaptowane do produkcji przeciwciał o pojedynczych łańcuchach przeciwko białku według wynalazku lub jego funkcjonalnemu odpowiednikowi. Zestawy do otrzymywania i przeszukiwania bibliotek prezentacji białka na powierzchni faga są komercyjnie dostępne, np. z Pharmacia.

Dodatkowo, przykłady sposobów i odczynników szczególnie zalecanych do zastosowania w otrzymywaniu i przeszukiwaniu biblioteki prezentacji białka na powierzchni faga mogą być znalezione, na przykład, w Patencie USA 5223409; Publikacji PCT Nr W092/18619; Publikacji PCT Nr WO 91/17271; Publikacji PCT Nr WO 20791; Publikacji PCT Nr WO 92/20791; Publikacji PCT Nr WO 92/15679; Publikacji PCT Nr WO 93/01288; Publikacji PCT Nr WO 92/01047; Publikacji PCT Nr WO 92/09690; Publikacji PCT Nr WO 90/02809; Fuchs i wsp. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay i wsp. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse i wsp. (1989) Science 246;1275-1281; Griffiths i wsp. (1993) EMBO J. 12:725-734.

Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, które specyficznie wiążą się do białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników mogą być stosowane, na przykład, do wykrywania ekspresji genu kodującego białko według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik, np. w innym szczepie Aspergillus. Na przykład, białko według wynalazku może być natychmiast wykrywane w konwencjonalnych immunooznaczeniach komórek lub ekstraktów z Aspergillus. Przykłady odpowiednich oznaczeń obejmują, bez ograniczeń, oznaczenie typu Western blot, testy ELISA, oznaczenia radioimmunologiczne i tym podobne.

PL 214 792 B1

Przez „wiąże się specyficznie” rozumie się, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże określony antygen, np. białko według wynalazku, lecz nie rozpoznaje i nie wiąże się w sposób istotny do innych niespokrewnionych cząsteczek w próbce.

Przeciwciała mogą być oczyszczane, na przykład, sposobami chromatografii powinowactwa, w których antygen polipeptydowy jest immobilizowany na żywicy.

Przeciwciało skierowane przeciwko polipeptydowi według wynalazku (np. przeciwciało monoklonalne) może być stosowane do izolacji polipeptydu przy użyciu standardowych technik, takich jakchromatografia powinowactwa lub immunoprecypitacja. Ponadto, takie przeciwciało może być stosowane do wykrywania białka (np. w lizacie komórek lub supernatancie komórek) w celu ustalenia częstości występowania i wzoru ekspresji polipeptydu. Przeciwciała mogą być także stosowane w celach diagnostycznych do monitorowania poziomów białka w komórkach lub tkance, jako część procedury testowania klinicznego, na przykład, do oznaczenia skuteczności danego trybu leczenia lub w diagnostyce grzybicy kropidlakowej.

Detekcja może być polepszona przez sprzężenie przeciwciała z wykrywalną substancją. Przykłady wykrywalnych substancji obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, galaktozydazę, lub acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminę fluoresceiny, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykłady materiałów luminescencyjnych obejmują luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i akworynę, i przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, lub ³H.

Zalecanymi epitopami objętymi przez peptyd antygenowy są regiony, które są położone na powierzchni białka, np. regiony hydrofilowe. Do identyfikacji regionów hydrofilowych mogą być użyte wykresy hydrofobowości białek według wynalazku.

Peptyd antygenowy białka według wynalazku zawiera przynajmniej 7 (zwłaszcza 10, 15, 20, lub 30) ciągłych reszt aminokwasowych sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEQ ID NR: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz obejmuje epitop białka tak, że przeciwciało otrzymane przeciwko peptydowi tworzy specyficzny kompleks immunologiczny z białkiem.

Zalecanymi epitopami objętymi przez peptyd antygenowy są regiony białka według wynalazku, które są położone na powierzchni białka, np. regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony alfa, regiony beta, regiony zakrętu, regiony zwrotu i regiony elastyczne.

Immunooznaczenia

Jakościowe lub ilościowe oznaczenia polipeptydu według niniejszego wynalazku w próbce biologicznej można przeprowadzić przy użyciu dowolnego sposobu znanego w tej dziedzinie. Techniki oparte na przeciwciałach dostarczają szczególnych korzyści w oznaczaniu poziomów określonego polipeptydu w próbce biologicznej.

W tych technikach specyficzne rozpoznanie jest dostarczone przez przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalne lub monoklonalne) ale drugorzędowy system detekcji może angażować przeciwciała drugorzędowe sprzężone ze związkiem fluorescencyjnym, enzymem lub innym. W wyniku uzyskuje się immunokompleks.

Stosownie do tego, zgodnie z wynalazkiem opisano sposób do rozpoznawania czy dany organizm jest zakażony grzybem Aspergillus składający się z etapów:

• izolowania próbki biologicznej z tego organizmu podejrzanego o zakażenie grzybem

Aspergillus, • reagowania tej próbki biologicznej z przeciwciałem według wynalazku, • oznaczenia czy powstały immunokompleksy.

Ekstrahowane mogą być także tkanki, np. mocznikiem i neutralnym detergentem, w celu uwolnienia białka do analizy Western blot lub oznaczenia dot/slot. Ta technika może być także zastosowana do płynów ustrojowych.

Inne oparte na przeciwciałach sposoby użyteczne do wykrywania białka według wynalazku obejmują immunooznaczenia, takie jak test immunosorpcji enzymozależnej (ELISA, ang. enzyme linked immunosorbent assay) i radioimmunooznaczenie (RIA, ang. radioimmunoassay). Na przykład, przeciwciała monoklonalne przeciwko białku według wynalazku mogą być użyte zarówno jako immuno-absorbent i jako sonda wyznakowana enzymem do wykrywania i ilościowego oznaczania białka według wynalazku. Ilość białka obecnego w próbce może być obliczona przez odniesienie do ilości

PL 214 792 B1 obecnej w preparacie używanym do standaryzacji przy użyciu komputerowego algorytmu regresji liniowej. W innym oznaczeniu ELISA do wykrycia białka według wynalazku w płynie biologicznym mogą być użyte dwa przeciwciała monoklonalne o różnej specyficzności. W tym oznaczeniu, jedno z przeciwciał stosowane jest jako immuno-absorbent a drugie jako sonda wyznakowana enzymem.

Powyższe techniki mogą być przeprowadzane zasadniczo jako oznaczenia „jednoetapowe lub „dwuetapowe”. Oznaczenie „jednoetapowe” obejmuje kontakt białka według wynalazku z immobilizowanym przeciwciałem i, bez płukania, kontakt mieszaniny z wyznakowanym przeciwciałem. Inne konwencjonalne sposoby mogą także być zastosowane jako odpowiednie. Oznaczenie „dwuetapowe” obejmuje płukanie przed kontaktem mieszaniny z wyznakowanym przeciwciałem. Inne konwencjonalne sposoby mogą być także zastosowane jako odpowiednie. Zazwyczaj jest pożądane immobilizowanie jednego składnika systemu oznaczenia na podłożu, i przez to pozwolenie innym składnikom systemu na wejście w kontakt ze składnikiem i łatwe usunięcie z próbki.

Odpowiednie znaczniki enzymatyczne obejmują, na przykład, te z grupy oksydaz, które katalizują wytwarzanie nadtlenku wodoru w reakcji z substratem. Aktywność znacznika w postaci oksydazy może być oznaczona przez pomiar stężenia nadtlenku wodoru powstałego w reakcji przeciwciało wyznakowane enzymem/substrat.

Oprócz enzymów, inne odpowiednie znaczniki obejmują radioizotopy, takie jak jod (¹²⁵I, ¹²¹I), węgiel (¹⁴C), siarka (³⁵S), tryt (³H), ind (¹¹²In), i technet (^99mTc), oraz znaczniki fluorescencyjne, takie jak fluoresceina i rodamina, oraz biotyna.

Specyficzne wiązanie testowego związku do białka według wynalazku może być wykryte, na przykład, in vitro przez odwracalną lub nieodwracalną immobilizację białka według wynalazku na substracie, np. powierzchni studzienki w 96-studzienkowej polistyrenowej płytce do mikromiareczkowania. Sposoby na immobilizację polipeptydów i innych małych cząsteczek są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, płytki do mikromiareczkowania mogą być pokryte białkiem według wynalazku przez dodanie białka w roztworze (typowo w stężeniu 0,05 do 1 mg/ml w objętości 1-100 μΐ) do każdego dołka i inkubację płytek w temperaturze pokojowej do 37°C przez 0,1 do 36 godzin. Białka, które nie są związane do płytki mogą być usunięte przez wytrząśnięcie nadmiaru roztworu z płytki i następnie przemycie płytki (jeden raz lub kilkukrotnie) wodą lub buforem. Typowo, białko jest trzymane w wodzie lub buforze. Płytka jest następnie płukana buforem, który nie zawiera związanego białka. Aby zablokować wolne miejsca wiążące białka na płytkach, płytki są blokowane białkiem, które nie jest spokrewnione ze związanym białkiem. Na przykład, odpowiednie jest 300 μΐ albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml w Tris-HCI. Odpowiednie substraty obejmują te substraty, które zawierają zdefiniowaną chemię wiązania krzyżowego (np. substraty plastikowe, takie jak polistyren, styren lub substraty polipropylenowe z Corning Costar Corp. (Cambridge, MA), na przykład). Jeśli jest to pożądane, jako substrat może być użyta cząsteczka w postaci kulki, np. agaroza w kulkach lub sefaroza w kulkach.

Wiązanie testowego związku do polipeptydu według wynalazku może być wykryte dowolnym z różnych sposobów znanych w tej dziedzinie. Na przykład, specyficzne przeciwciało może być użyte w immunooznaczeniu. Jeżeli jest to pożądane, przeciwciało może być wyznakowane (np. fluorescencyjnie lub radioizotopem) i wykrywane bezpośrednio (zobacz, np. West i McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977). Alternatywnie, do detekcji może być użyte drugie przeciwciało (np. wyznakowane przeciwciało, które wiąże część Fc przeciwciała anty-AN97). W alternatywnym sposobie detekcji, białko według wynalazku jest wyznakowane a wykrywany jest znacznik (np. przez wyznakowanie białka według wynalazku radioizotopem, fluoroforem, chromoforem, lub podobnym). W jeszcze innym sposobie, białko według wynalazku jest wytwarzane jako białko fuzyjne z białkiem, które może być wykryte optycznie, np. zielonym białkiem fluorescencyjnym (które może być wykryte w świetle UV). W alternatywnym sposobie białko według wynalazku może być kowalencyjnie przyłączone do enzymu posiadającego wykrywalną aktywność enzymatyczną lub poddane fuzji z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, alfa-galaktozydaza lub oksydaza glukozowa. Geny kodujące wszystkie te enzymy zostały sklonowane i są łatwo dostępne do użytku przez specjalistów w tej dziedzinie. Jeżeli jest to pożądane, białko fuzyjne może zawierać antygen, i taki antygen może być wykrywany i mierzony użyciem przeciwciała poliklonalnego lub monoklonalnego przy użyciu konwencjonalnych sposobów. Odpowiednie antygeny obejmują enzymy (np. peroksydazę chrzanową, alkaliczną fosfatazę i alfa-galaktozydazę) i polipeptydy nieenzymatyczne (np. białka surowicze, takie jak BSA i globuliny oraz białka mleka, takie jak kazeiny).

PL 214 792 B1

Epitopy, antygeny i immunogeny

Opisano tu również peptyd lub polipeptyd zawierający część polipeptydu według wynalazku niosącą epitop. Epitop tej części polipeptydu jest immunogennym lub antygenowym epitopem polipeptydu według wynalazku. „Immunogenny epitop” jest zdefiniowany jako część białka, która wywołuje odpowiedź przeciwciała, jeżeli całe białko jest immunogenem. Uznaje się, że te immunogenne epitopy są ograniczone do kilku miejsc na cząsteczce. Z drugiej strony, region cząsteczki białka, do której może związać się przeciwciało jest zdefiniowana jako „epitop antygenowy”. Liczba immunogennych epitopów białka ogólnie jest mniejsza niż liczba antygenowych epitopów. Zobacz, na przykład, Geysen, Η. M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984).

W odniesieniu do selekcji peptydów lub polipeptydów niosących antygenowy epitop (tj. który zawiera region cząsteczki białka, do której może związać się przeciwciało), jest dobrze znane w tej dziedzinie, że względnie krótkie syntetyczne peptydy, które naśladują fragment sekwencji białka są zazwyczaj zdolne do wzbudzenia surowicy odpornościowej, która reaguje z częściowo naśladowanym białkiem. Zobacz, na przykład, Sutcliffe, J. G. i wsp., Science 219:660-666 (1984). Peptydy zdolne do wzbudzenia surowicy reagującej z białkiem często są reprezentowane w pierwszorzędowej sekwencji białka, mogą być scharakteryzowane przez zestaw prostych reguł chemicznych, i nie są ograniczone do regionów nienaruszonych białek wywołujących odpowiedź immunologiczną (tj. epitopów immunogennych) ani do końców aminowych lub karboksylowych. Peptydy, które są ekstremalnie hydrofobowe i te o długości sześciu lub mniej reszt w ogólności są nieefektywne w indukowaniu przeciwciał, które wiążą te naśladowane białka; efektywne zazwyczaj są dłuższe, rozpuszczalne peptydy, szczególnie te zawierające reszty prolinowe. Sutcliffe i wsp., powyżej, na 661. Na przykład, 18 z 20 peptydów zaprojektowanych według tych wskazówek, zawierających 8-39 reszt pokrywających 75% sekwencji łańcucha polipeptydowego hemaglutyniny HAI wirusa grypy indukowało przeciwciała, które reagowały z białkiem HAI lub nienaruszonym wirusem; oraz 12/12 peptydów z polimerazy MuLV oraz 18/18 z glikoproteiny wirusa wścieklizny indukowało przeciwciała, które precypitowały odpowiednie białka.

Niosące epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy według wynalazku są zatem użyteczne we wzbudzaniu przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się specyficznie do polipeptydu według wynalazku. Tak więc, wysoki odsetek hybrydom uzyskanych przez fuzję komórek śledziony z dawców immunizowanych peptydem niosącym epitop antygenowy zazwyczaj wydziela przeciwciało reagujące z białkiem natywnym. Sutcliffe i wsp., powyżej, na 663. Przeciwciała otrzymane przez immunizację peptydami lub polipeptydami niosącymi epitop antygenowy są użyteczne w detekcji naśladowanych białek, i przeciwciała specyficzne dla różnych peptydów mogą być użyte do śledzenia przeznaczenia różnych regionów prekursora białka, które przechodzi obróbkę posttranslacyjną. Peptydy i przeciwciała przeciwko peptydom mogą być zastosowane w różnych jakościowych lub ilościowych oznaczeniach naśladowanych białek, na przykład w oznaczeniach kompetycyjnych odkąd pokazano, że te nawet krótkie peptydy (np. około 9 aminokwasów) mogą wiązać i wypierać większe peptydy w oznaczeniach immunoprecypitacyjnych. Zobacz, na przykład Wilson, LA. i wsp., Cell 37:767-778 na 777 (1984). Opisane tu przeciwciała przeciwko peptydom są także użyteczne do oczyszczania naśladowanych białek, na przykład, przez dobrze znane w tej dziedzinie sposoby z użyciem chromatografii adsorpcyjnej.

Niosące epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy według wynalazku zaprojektowane według powyższych wskazówek dogodnie zawierają sekwencję przynajmniej siedmiu, w szczególności przynajmniej dziewięciu a zwłaszcza pomiędzy około 15 a około 30 aminokwasów, zawartą w sekwencji aminokwasowej polipeptydu według wynalazku. Jednakże, peptydy lub polipeptydy zawierające większą część sekwencji aminokwasowej peptydu według wynalazku obejmujące około 30 do około 50 aminokwasów, lub dowolną większą długość oraz obejmujące całą sekwencję aminokwasową polipeptydu według wynalazku, także są uważane za peptydy lub polipeptydy według wynalazku niosące epitop i także są użyteczne do indukowania przeciwciał, które reagują z naśladowanym białkiem. Dogodnie, sekwencja aminokwasowa peptydu niosącego epitop jest wybierana tak, aby zapewnić znaczącą rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj. sekwencja zawiera względnie hydrofilowe reszty a wysoce hydrofobowe sekwencje są dogodnie unikane); i sekwencje zawierające reszty prolinowe są szczególnie zalecane.

Peptydy i polipeptydy według wynalazku niosące epitop mogą być wytwarzane dowolnym konwencjonalnym sposobem wytwarzania peptydów lub polipeptydów, w tym sposobów z użyciem rekombinowanego DNA z wykorzystaniem cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku. Na przykład krótka sekwencja aminokwasowa niosąca epitop może być przyłączona do większego poli26

PL 214 792 B1 peptydu, który działa jako nośnik podczas rekombinowanego wytwarzania i oczyszczania, jak również podczas immunizacji w celu wytworzenia przeciwciał przeciwko peptydowi.

Peptydy niosące epitop mogą być także zsyntetyzowane przy użyciu znanych sposobów syntezy chemicznej. Na przykład, Houghten opisał prosty sposób syntezy dużej liczby peptydów, takiej jak 10-20 mg 248 różnych peptydów o 13 resztach reprezentujących pojedyncze warianty aminokwasowe segmentu polipeptydu HAI, które były przygotowane i scharakteryzowane (przez badania wiązania typu ELISA) w czasie krótszym niż cztery tygodnie. Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Ten proces „Jednoczesnej Wielotorowej Syntezy Peptydów” (SMPS, ang. Simultaneous Multiple Peptide Synthesis) (SMPS) jest dalej opisany w Patencie USA Nr 4631211 dla Houghten i wsp. (1986). W tej procedurze poszczególne żywice do syntezy w fazie stałej różnych peptydów są trzymane w odrębnych pojemnikach przepuszczalnych dla rozpuszczalnika umożliwiających optymalne użycie wielu identycznych powtarzalnych etapów występujących w sposobach syntezy w fazie stałej.

Całkowicie ręczna procedura pozwala na równoczesne przeprowadzenie 500-1000 lub więcej syntez. Houghten i wsp., powyżej, na 5134.

Niosące epitopy peptydy i polipeptydy według wynalazku niosące epitop są stosowane do indukowania przeciwciał sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Zobacz, na przykład, Sutcliffe i wsp., powyżej; Wilson i wsp., powyżej; Chow, M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; i Bittle, F. J. i wsp., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985).

Ogólnie, zwierzęta mogą być immunizowane wolnym peptydem; jednakże miano przeciwciała przeciwko peptydowi może być zwiększone przez sprzężenie peptydu z nośnikiem makrocząsteczkowym, takim jak hemocyjanina ze skałoczepa Megathura crenulata (KLH, ang. keyhole limpet hemocyanin) lub anatoksyna tężca. Na przykład, peptydy zawierające cysteinę mogą być sprzężone z nośnikiem przy użyciu łącznika, takiego jak ester maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidu (MBS, ang. maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), podczas gdy inne peptydy mogą być sprzężone z nośnikiem przy użyciu bardziej ogólnego środka łączącego, takiego jak glutaraldehyd.

Zwierzęta, takie jak króliki, szczury i myszy są immunizowane zarówno wolnymi jak i sprzężonymi z nośnikiem peptydami, na przykład, przez śródotrzewnowe i/lub śródskórne wstrzyknięcie emulsji zawierających około 100 μg peptydu lub białka nośnikowego oraz adiuwanta Freunda. Koniecznych może być kilka wstrzyknięć przypominających, w odstępach około dwóch tygodni, w celu otrzymania użytecznego miana przeciwciała przeciwko peptydowi, które może być wykryte, na przykład, przez oznaczenie ELISA przy użyciu wolnego peptydu zaadsorbowanego do powierzchni stałej. Miano przeciwciał przeciwko peptydowi w surowicy z immunizowanego zwierzęcia może być zwiększone przez selekcję przeciwciał przeciwko peptydowi, na przykład, przez adsorpcję peptydu na podłożu stałym i elucję wybranych przeciwciał sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie.

Niosące epitop immunogenne peptydy według wynalazku, tj. te części białka, które wywołują odpowiedź w postaci przeciwciał gdy całe białko jest immunogenem, są identyfikowane sposobami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, Geysen i wsp., 1984, powyżej, ujawnia procedurę szybkiej równoczesnej syntezy na podłożach stałych setek peptydów o wystarczającej czystości do reakcji w teście immunosorpcji enzymozależnej. Oddziaływanie zsyntetyzowanych peptydów z przeciwciałami jest wtedy łatwo wykrywane bez usuwania ich z podłoża. W ten sposób specjalista w tej dziedzinie może w sposób rutynowy zidentyfikować peptyd niosący epitop immunogenny pożądanego białka. Na przykład, immunologicznie ważny epitop w białku płaszcza wirusa powodującego chorobę pyska i racic został zlokalizowany przez Geysen i wsp. z rozdzielczością siedmiu aminokwasów przez syntezę nakładającego się zestawu wszystkich 208 możliwych heksapeptydów pokrywających całą sekwencję białka złożonego z 213 aminokwasów. Następnie został zsyntetyzowany kompletny zestaw zastąpionych aminokwasów, w którym wszystkie 20 aminokwasów było podstawionych kolejno w każdej pozycji wewnątrz epitopu i oznaczono specyficzność reakcji z przeciwciałem odpowiadającą poszczególnym aminokwasom. Tak więc, analogi peptydów według wynalazku niosące epitopy mogą być rutynowo wytwarzane przy użyciu tego sposobu. Patent USA Nr 4708781 dla Geysen (1987) dalej opisuje ten sposób identyfikacji peptydu niosącego epitop pożądanego białka.

Ponadto, Patent USA Nr 5194392 dla Geysen (1990) opisuje ogólny sposób wykrywania lub oznaczania sekwencji monomerów (aminokwasów lub innych związków), które są topologicznym odpowiednikiem epitopu (tj. „mimotopem”), która jest komplementarna do określonego paratopu (miejsca wiążącego antygen) przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. Bardziej ogólnie, Patent

PL 214 792 B1

USA Nr 4433092 dla Geysen (1989) opisuje sposób wykrywania lub oznaczania sekwencji monomerów, które są topologicznymi odpowiednikami liganda, który jest komplementarny do miejsca wiążącego ligand określonego receptora będącego przedmiotem zainteresowania. Podobnie, Patent USA Nr 5480971 dla Houghten, R. A. i wsp. (1996) dotyczący Mieszanin Całkowicie Alkilowanych Oligopeptydów ujawnia liniowe C1-C7-alkilo całkowicie alkilowane oligopeptydy oraz zestawy i biblioteki takich peptydów, jak również sposoby stosowania takich zestawów i bibliotek oligopeptydów do oznaczania sekwencji całkowicie alkilowanego oligopeptydu, który w sposób preferencyjny wiąże się do cząsteczki akceptorowej będącej przedmiotem zainteresowania. Tak więc, niepeptydowe analogi peptydów według wynalazku niosących epitop także mogą być wytworzone w sposób rutynowy przy użyciu tych sposobów.

Zastosowanie enzymów lipolitycznych w procesach przemysłowych.

Wynalazek dotyczy także zastosowania enzymu lipolitycznego według wynalazku w pewnych procesach przemysłowych. Pomimo długiego doświadczenia w zakresie tych procesów, enzymy lipolityczne według wynalazku cechują się szeregiem znaczących zalet względem enzymów dotychczas stosowanych. W zależności od określonego zastosowania te zalety mogą obejmować aspekty, takie jak niższe koszty produkcji, wyższa specyficzność względem substratu, mniejsza antygenność, mniejsze niepożądane aktywności uboczne, wyższe wydajności w porównaniu z produkcją przy użyciu odpowiedniego mikroorganizmu, bardziej odpowiednie zakresy pH i temperatury, lepsze smaki produktu końcowego, jak również jakość żywności i aspekty koszerności.

Niniejszy wynalazek także dotyczy sposobów wytwarzania ciasta lub wyrobu piekarniczego obejmujących dodawanie do ciasta skutecznej ilości enzymu lipolitycznego według niniejszego wynalazku, która polepsza jedną lub więcej właściwości ciasta lub wyrobu piekarniczego otrzymanego z ciasta w porównaniu z ciastem lub wyrobem piekarniczym, do którego polipeptyd nie został dodany.

Określenie „dodawanie do ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako dodawanie enzymu lipolitycznego według wynalazku do ciasta, do dowolnego składnika, z którego ciasto jest przygotowywane i/lub do wolnej mieszaniny składników ciasta, z których ciasto jest wytwarzane. Innymi słowy, enzym lipolityczny według wynalazku może być dodany na dowolnym etapie wytwarzania ciasta i może być dodany na jednym, dwóch lub większej liczbie etapów. Enzym lipolityczny według wynalazku jest dodawany do składników ciasta, które jest zagniatane i pieczone w celu wytworzenia wyrobu piekarniczego przy użyciu sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Zobacz, na przykład, Patent USA Nr 4567046, EP- A-426211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 i JP-A-63-258528.

Określenie „skuteczna ilość” jest zdefiniowane tutaj jako ilość enzymu lipolitycznego według wynalazku, która jest wystarczająca do dostarczenia mierzalnego efektu na przynajmniej jednej będącej przedmiotem zainteresowania właściwości ciasta i/lub wyrobu piekarniczego.

Określenie „polepszona właściwość” jest zdefiniowana tutaj jako dowolna właściwość ciasta i/lub wyrobu piekarniczego uzyskanego z ciasta, szczególnie wyrobu piekarniczego, która jest ulepszona przez działanie enzymu lipolitycznego według wynalazku w porównaniu do ciasta lub produktu, do którego enzym lipolityczny według wynalazku nie jest włączony. Ulepszona właściwość może obejmować, lecz bez ograniczenia, zwiększoną wytrzymałość ciasta, zwiększoną elastyczność ciasta, ulepszoną rozciągliwość ciasta, ulepszony smak wyrobu piekarniczego, ulepszone właściwości opóźniające czerstwienie wyrobu piekarniczego.

Ulepszona właściwość może być ustalona przez porównanie ciasta i/lub wyrobu piekarniczego wytwarzanego z i bez dodania polipeptydu według niniejszego wynalazku zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, które są opisane poniżej w Przykładach. Cechy organoleptyczne mogą być ocenione przy zastosowaniu procedur dobrze ustalonych w przemyśle piekarniczym i mogą obejmować, na przykład ocenę przez zespół przeszkolonych osób testujących smak.

Określenie „zwiększona wytrzymałość ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu ogólnie bardziej elastyczne właściwości i/lub wymaga więcej pracy włożonej do zarobienia i ukształtowania.

Określenie „zwiększona elastyczność ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu większą tendencję do ponownego przyjmowania jego oryginalnego kształtu po poddaniu pewnemu fizycznemu naprężeniu.

Określenie „zwiększona stabilność ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość, która nadaje mu mniejszą podatność na obróbkę mechaniczną, lepiej przez to utrzymując jego kształt i objętość.

Określenie „zmniejszona lepkość ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu mniejszą tendencję do przylegania do powierzchni, np. w urządzeniu wytwarzającym ciasto

PL 214 792 B1 i jest zarówno wyznaczana empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego lub mierzona przez zastosowanie urządzenia analizującego teksturę (np. TAXT2), jak to jest znane w tej dziedzinie.

Określenie „ulepszona rozciągliwość ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, dzięki której może ono być poddane zwiększonemu naprężeniu lub rozciągnięciu bez rozerwania.

Określenie „ulepszona podatność na przetwarzanie automatyczne ciasta” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu ogólnie mniejszą lepkość i/lub większą jędrność i/lub większą elastyczność.

Określenie „zwiększona objętość produktu piekarniczego” jest mierzone jako specyficzna objętość danego bochenka chleba (objętość/masa) ustalonej typowo w tradycyjnym sposobie wypierania siemienia rzepakowego (ang. rapeseed displacement method).

Określenie „ulepszona struktura miąższu wyrobu piekarniczego” jest zdefiniowane tutaj jako właściwość wyrobu piekarniczego charakteryzująca się delikatniejszymi i/lub cieńszymi ścianami komórek w miąższu i/lub bardziej jednolitym/homogennym rozmieszczeniem komórek w miąższu i jest zazwyczaj wyznaczana empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego.

Określenie „ulepszona delikatność wyrobu piekarniczego” jest przeciwna do „jędrności” i jest zdefiniowane tutaj jako właściwość wyrobu piekarniczego, dzięki której jest łatwiej ściskany i jest ona wyznaczana zarówno empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego lub mierzona przy zastosowaniu urządzenia analizującego teksturę (np. TAXT2), jak jest to znane w tej dziedzinie.

Określenie „ulepszony smak wyrobu piekarniczego” jest wyznaczany przez zespół przeszkolonych osób testujących smak.

Określenie „ulepszone właściwości wyrobu piekarniczego opóźniające czerstwienie” jest zdefiniowane tutaj jako właściwości produktu piekarniczego, dzięki którym posiada on zmniejszoną szybkość pogarszania się parametrów jakości, np. miękkości i/lub elastyczności podczas przechowywania.

Określenie „ciasto” jest zdefiniowane tutaj jako mieszanina mąki i innych składników wystarczająco jędrna do zagniatania i wałkowania. Ciasto może być świeże, mrożone, wstępnie wyrobione lub wstępnie upieczone. Wytwarzanie mrożonego ciasta jest opisane przez Kulp i Lorenz we Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

Określenie „wyrób piekarniczy” jest zdefiniowane tutaj jako dowolny produkt przygotowany z ciasta, zarówno o charakterze miękkim jak i chrupiącym. Przykładami wyrobów piekarniczych, typu czy to białego, lekkiego lub ciemnego, które mogą być w sposób dogodny wytwarzane według niniejszego wynalazku są chleb (w szczególności chleb biały, pełnoziarnisty lub żytni), typowo w postaci kromek lub bochenków, chleb typu francuskiej bagietki, makaron, pita, tortille, paszteciki taco, ciastka, naleśniki, biszkopty, ciasteczka, ciastka z nadzieniem, ciasto parowane, oraz pieczywo chrupkie, i tym podobne.

Enzym lipolityczny według niniejszego wynalazku i/lub enzymy dodatkowe do zastosowania w sposobach według niniejszego wynalazku mogą być w dowolnej postaci odpowiedniej do użycia w danym procesie, np. w postaci suchego proszku, proszku zbrylonego, lub granulatu, w szczególności granulatu niewytwarzającego pyłu, ciekłej, w szczególności stabilizowanej cieczy, lub enzymu zabezpieczonego, tak jak opisano w W001/11974 i W002/26044. Granulaty i proszki zbrylone mogą być przygotowane przy użyciu konwencjonalnych sposobów, np. przez natryskiwanie enzymu lipolitycznego według wynalazku na nośnik w granulatorze z ciekłym złożem. Nośnik może składać się z poszczególnych rdzeni posiadających odpowiedni rozmiar cząsteczki. Nośnik może być rozpuszczalny lub nierozpuszczalny, np. sól (taka jak NaCl lub siarczan sodu), cukier (taki jak sacharoza lub laktoza, alkohol cukrowy (taki jak sorbitol), skrobia, ryż, kasza kukurydziana lub soja. Enzym lipolityczny według wynalazku i/lub dodatkowe enzymy mogą być zawarte w preparatach o wolnym uwalnianiu składnika. Sposoby wytwarzania preparatów o wolnym uwalnianiu składnika są dobrze znane w tej dziedzinie. Dodanie stabilizatorów dopuszczalnych w żywności, takich jak cukier, alkohol cukrowy lub poliole i/lub kwas mlekowy lub inny kwas organiczny według opracowanych sposobów może, na przykład, stabilizować ciekłe preparaty enzymatyczne.

Enzym lipolityczny według wynalazku może także być włączony do kompozycji drożdży, jak ujawniono w EP-A-0619947, EP-A-0659344 i W002/49441.

W celu włączenia (dodawania) do wstępnych mieszanin mąki zalecane jest, by polipeptyd według wynalazku był w postaci produktu suchego, np. niepylącego granulatu, podczas gdy do włączenia do cieczy zalecana jest postać ciekła.

PL 214 792 B1

Do ciasta może być włączony jeden lub więcej dodatkowych enzymów. Dodatkowy enzym może być dowolnego pochodzenia, w tym pochodzenia ssaczego lub roślinnego i w szczególności mikrobiologicznego (bakteryjnego, drożdżowego lub grzybowego) i może być uzyskany technikami konwencjonalnie stosowanymi w tej dziedzinie.

W zalecanym wykonaniu dodatkowym enzymem może być amylaza, taka jak alfa-amylaza (użyteczna do dostarczania cukrów fermentowalnych przez drożdże i opóźniająca czerstwienie) lub beta-amylaza, glukanotransferaza cyklodekstranu, peptydaza, w szczególności, egzopeptydaza (użyteczna we wzmacnianiu smaku), transglutaminaza, lipaza (użyteczna do modyfikacji lipidów obecnych w cieście lub składnikach ciasta w celu niezmiękczenia ciasta), fosfolipaza, celulaza, hemicelulaza, w szczególności pentozonaza, taka jak ksylonaza (użyteczna do częściowej hydrolizy pentoz, które zwiększają rozciągliwość ciasta), proteaza (użyteczna do zmiękczania glutenu, w szczególności kiedy stosowana jest ciężka mąka pszenna), izomeraza wiązań dwusiarczkowych w białku, np. izomeraza wiązań dwusiarczkowych w białku, jak ujawniono w WO 95/00636, glikozylotransferaza, peroksydaza (użyteczna do polepszania konsystencji ciasta), laktaza, lub oksydaza, np. oksydaza glukozy, oksydaza heksozy, oksydaza aldozy, oksydaza piranozy, lipooksygenaza lub oksydaza L-arainokwasu (użyteczna w polepszaniu konsystencji ciasta).

W przypadku gdy jedna lub więcej dodatkowych aktywności enzymatycznych ma być dodanych w sposobach według niniejszego wynalazku, te aktywności mogą być dodane osobno lub razem z polipeptydem według wynalazku, opcjonalnie jako składnik(składniki) kompozycji polepszającej chleb i/lub polepszającej ciasto. Inne aktywności enzymatyczne mogą być dowolnymi enzymami opisanymi powyżej i mogą być dawkowane według opracowanych praktyk piekarniczych.

Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania wyrobu piekarniczego obejmującego pieczenie ciasta uzyskanego sposobem według niniejszego wynalazku w celu uzyskania wyrobu piekarniczego. Pieczenie ciasta w celu uzyskania wyrobu piekarniczego może być wykonane przy użyciu sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także odpowiednio ciasta i wyroby piekarnicze wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także mieszaninę wstępną, np. w postaci kompozycji mąki, do ciasta i/lub wyrobów piekarniczych wytworzonych z ciasta, w których wstępna mieszanina zawiera polipeptyd według niniejszego wynalazku. Określenie „mieszanina wstępna” jest zdefiniowane tutaj jako rozumiane w jego konwencjonalnym znaczeniu, tj. jako mieszanina środków piekarniczych, ogólnie obejmujących mąkę, które mogą być zastosowane nie tylko w przemysłowych fabrykach/urządzeniach do wypieku pieczywa, ale także w piekarniach detalicznych. Mieszanina wstępna może być przygotowana przez zmieszanie polipeptydu lub kompozycji polipeptydu według niniejszego wynalazku polepszającej chleb i/lub polepszającej ciasto z odpowiednim nośnikiem, takim jak mąka, skrobia, cukier lub sól. Mieszanina wstępna może zawierać inne aktywności polepszające ciasto i/lub aktywności polepszające chleb, np. dowolną aktywność, w tym enzymatyczną, wymienioną powyżej.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także dodatki piekarnicze w postaci granulatu lub zbrylonego proszku, który zawiera polipeptyd według niniejszego wynalazku. Dodatek piekarniczy dogodnie posiada wąski rozkład rozmiaru cząsteczki, w którym ponad 95% (masowo) cząsteczek jest w zakresie od 25 do 500 μm.

Przy wytwarzaniu ciasta i chleba niniejszy wynalazek może być stosowany w kombinacji z substancjami pomagającymi w przetwarzaniu zdefiniowanymi wcześniej, takimi jak chemiczne substancje pomagające w przetwarzaniu, takie jak oksydanty (np. kwas askorbinowy), środki redukujące (np. L-cysteina), oksydoreduktazy (np. oksydaza glukozy) i/lub inne enzymy, takie jak enzymy modyfikujące polisacharydy (np. α-amylaza, hemicelulaza, enzymy rozgałęziające, itp.) i/lub enzymy modyfikujące białka (endopeptydaza, egzopeptydaza, enzymy rozgałęziające, itp.).

P r z y k ł a d 1

Fermentacja Aspergillus niger

Enzymy lipolityczne kodowane przez sekwencję nukleotydową dostarczoną tutaj zostały uzyskane przez skonstruowanie plazmidów ekspresyjnych zawierających sekwencje DNA, transformację szczepu A. nidulans tym plazmidem i hodowlę szczepów Aspergillus niger w następujący sposób.

Świeże spory (10⁶-10⁷) szczepów A. niger zostały zaszczepione w 20 ml pożywki CSL (kolba 100 ml, korek) hodowane przez 20-24 godziny w 34°C i 170 rpm. Po zaszczepieniu 5-10 ml hodowli wstępnej w 100 ml pożywki CSM (kolba 500 ml, korek) szczepy podlegały fermentacji w 34°C i 170 rpm przez 3-5 dni.

PL 214 792 B1

Supernatanty pozbawione komórek zostały uzyskane przez wirowanie w probówkach Greinera 50 ml (30 minut, 5000 rpm). Supernatanty wstępnie przefiltrowano przez filtr z mikrowłóknami GF/A Whatman Glass (150 mm AE) w celu usunięcia większych cząstek, doprowadzono do pH przy użyciu 4 N KOH (jeśli konieczne) i przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 μm (nakładany na butelkę) z podciśnieniem w celu usunięcia materiału grzybowego. Supernatanty przechowywano w 4°C (lub - 20°C).

Pożywka CSL składała się z (w ilości na litr): 100 g kostek zmacerowanej kukurydzy (Roquette), 1 g NaH2PO4*H2O, 0,5 g MgSO4*7H2O, 10 g glukozy*H2O i 0,25 g Basildonu (środek przeciwpieniący). Składniki rozpuszczono w wodzie destylowanej i pH doprowadzono do 5,8 przy użyciu NaOH lub H2SO4; 100 ml kolby z korkiem i kulką z pianki napełniono 20 ml bulionu fermentacyjnego i sterylizowano przez 20 minut w 120°C po czym, po schłodzeniu do temperatury pokojowej do każdej kolby dodano 200 μl roztworu zawierającego 5000 IU/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny.

Pożywka CSM składała się z (w ilości na litr) : 150 g maltozy*H2O, 60 g Soytonu (pepton), 1 g NaH2PO4*H2O, 15 g MgS04*7H20, 0,08 g Tween 80, 0,02 g Basildonu (środek przeciwpieniący), 20 g MES, 1 g L-argininy. Składniki rozpuszczono w wodzie destylowanej i doprowadzono pH do 6,2 przy użyciu NaOH lub H2SO4; kolby 500 ml z korkiem i kulką z pianki napełniono 100 ml bulionu fermentacyjnego i sterylizowano przez 20 minut w 120°C po czym po schłodzeniu do temperatury pokojowej do każdej kolby dodano 1 ml roztworu zawierającego 5000 IU/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny.

P r z y k ł a d 2

Oczyszczanie enzymów lipolitycznych według wynalazku

Etap 1 - Wytwarzanie ultraprzesączów.

Supernatanty kultur uzyskanych jak w Przykładzie 1 ultrafiltrowano w celu usunięcia drobnocząsteczkowych zanieczyszczeń, które mogłyby wpływać na oznaczenia aktywności enzymatycznych i testów piekarniczych. Ultrafiltrację 30 ml supernatantu wykonano w systemie Millipore Labscale TFF wyposażonym w filtr zatrzymujący cząsteczki o wielkości powyżej 10 kDa.

W zależności od ich koloru, próbki przemyto 3-5 razy 40 ml objętościami zimnego 100 mM buforu fosforanowego pH 6,0 zawierającego 0,5 mM CaCl2. Końcowa objętość roztworu enzymu wynosiła 30 ml i jest dalej określana jako „ultraprzesącz”.

Etap 2 - Oznaczanie stężenia enzymów lipolitycznych przy użyciu A280 i HPSEC.

Stężenie enzymów lipolitycznych w ultraprzesączu obliczono z ekstynkcji w 280 nm (A280) przypisanej enzymom lipolitycznym i obliczonego molekularnego współczynnika ekstynkcji enzymów lipolitycznych. Pomiar A280 wykonano w spektrofotometrze Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Holandia).

Molekularny współczynnik ekstynkcji enzymu może być obliczony z liczby reszt tyrozyny, tryptofanu i cysteiny na cząsteczkę enzymu (S.C. Gill i P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989)). Molekularne współczynniki ekstynkcji tych aminokwasów wynoszą odpowiednio 1280, 5690

-1 -1 i 120 M^-1cm^-1. Liczba reszt tyrozyny, tryptofanu i cysteiny w enzymach lipolitycznych według wynalazku może być wywnioskowana z sekwencji białek wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. Obliczone współczynniki ekstynkcji enzymów lipolitycznych według wynalazku są zebrane w Tabeli 2.

T a b e l a 2

Enzym Iipolityczny	NR ID. SEKW.:	# aminokwasów	Obliczona M. W. (Da)	Obliczony współczynnik ekstynkcji w 280 nm
Trp	Tyr	Cys	M¹.cm¹	(1 mg/ml)¹.cm¹
1	2	3	4	5	6	7	8
NBE028	3	13	26	6	64141	107970	1.7
NBE029	6	14	27	6	63250	114940	1.8
NBE030	9	17	26	6	59952	130730	2.2
NBE031	12	9	27	4	61173	86250	1.4
NBE032	15	3	13	6	29683	34430	1.2
NBE033	18	7	24	2	44890	70790	1.6

PL 214 792 B1 cd. Tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8
NBE034	21	11	19	7	53796	87750	1.6
NBE036	24	10	23	7	64945	87180	1.3
NBE038	27	13	29	4	55161	111570	2.2
NBE039	30	11	26	6	59298	96590	1.6
NBE043	33	16	35	8	62564	136800	2.2
NBE045	36	0	6	6	26688	840.0	0.31
NBE042	39	14	30	7	61593	118900	1.9

Ekstynkcja ultraprzesączu w 280 nm (A280), która jest przyporządkowana enzymom lipolitycznym zależy od czystości próbki enzymu. Tę czystość oznaczono przy użyciu HPSEC (ang. High Performance Size Exclusion Chromatography, Wysokowydajna chromatografia na sitach molekularnych) na kolumnie TSK SW-XL(300*7,8 mm; zakres MW 10-300 kDa). Bufor do elucji składał się z 25 mM buforu fosforanu sodu pH 6,0 i został użyty przy przepływie 1 ml/min. Wstrzykiwano próbki o objętości 5-100 pi. Mierzono absorbancję w 280 nm.

A280 w ultrafiltracie przypisaną enzymowi lipolitycznemu według wynalazku uzyskano ze stosunku powierzchni piku odpowiedniego piku enzymu lipolitycznego w chromatogramie do całkowitej powierzchni pików absorbujących w 280 nm. Stężenie enzymu lipolitycznego w ultraprzesączu obliczono następnie poprzez pomnożenie A280 ultraprzesączu przez stosunek opisany powyżej i podzieleniu przez obliczony współczynnik ekstynkcji (roztwór 1 mg/ml - kolumna najbardziej po prawej stronie w Tabeli 2) dla każdego enzymu lipolitycznego.

P r z y k ł a d 3

Pomiary aktywności

Supernatanty wolne od komórek uzyskane w Przykładzie 1 poddano oznaczeniom na aktywność lipazy, fosfolipazy i galaktolipazy jak zebrano w Tabeli 3.

T a b e l a 3. Aktywności enzymów lipolitycznych w supernatantach wolnych od komórek, takich jak przygotowane w Przykładzie 1.

Enzym lipolityczny	lipaza	fosfolipaza A	lizofosfolipaza	galaktolipaza
NBE028	+	+	+	0
NBE029	+	+	+	0
NBE0 31	+ + +	+	+	+
NBE032	+ +	+	+	0
NBE033	+	+ +	+	+
NBE034	0	+	0	0
NBE036	0	+	+	0
NBE038	0	+	0	0
NBE039	+	0	0	0
NBE043	+	0	0	0

= brak różnicy z kontrolą; +/++/+++ = wyższe niż kontrola;

Aktywność lipazy oznaczono spektrofotometrycznie przy użyciu 2,3-merkapto-1-propanolotrimaślanu (TBDMP) jako substratu. Lipaza hydrolizuje wiązanie siarczkowe TBDMP uwalniając przez to kwas tiobutanowy, który w następnej reakcji z 4,4-ditiodipirydyną (DTDP) tworzy 4-tiopirydon. Ten ostatni jest w tautomerycznej równowadze z 4-merkaptopirydyną, która absorbuje w 334 nm. Reakcja jest przeprowadzana w 0,1 M buforze octanowym pH 5,0 zawierającym 0,2% Triton-X100, 0,65 mM TBDMP i 0,2 mM DTDP w 37°C. Jedna jednostka lipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która uwalnia 1 mikromol kwasu 4-tiobutanowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji.

PL 214 792 B1

Fosfolipazę A oznaczono spektrofotometrycznie przy użyciu 1,2-ditiodioktanoilo-fosfatydylocholiny jako substratu. Fosfolipaza A hydrolizuje wiązanie siarczkowe w pozycji 1 (PLA1) lub pozycji 2 (PLA2) uwalniając przez to kwas 4-tio-oktanowy, który następnie reaguje z 4,4'-ditiopirydyną tworząc 4-tiopirydon. Ten ostatni jest w tautomerycznej równowadze z 4-merkaptopirydyną, która absorbuje w 334 nm. Reakcja jest przeprowadzana w 0,1 M buforze octanowym pH 4,0 zawierającym 0,2% Triton-X100, 0,65 mM substrat i 0,2 mM DTDP w 37°C. Jedna jednostka fosfolipazy A lipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która uwalnia 1 mikromol kwasu 4 tio-oktanowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji.

Aktywność lizofosfolipazy oznaczono z zastosowaniem spektroskopii ³¹P-NMR przy użyciu lizofosfatydylocholiny jako substratu. Lizofosfolipaza hydrolizuje wiązanie estrowe uwalniając przez to kwas tłuszczowy od części glicerolowej. Tak powstała glicerolofosfocholina jest mierzona przy użyciu NMR.

Reakcja jest przeprowadzana w 50 mM buforze kwasu octowego pH 4,5 zawierającego ponadto 1 mg/ml lizofosfatydylocholiny i 5 mM CaCl2 przez 30 minut w 55°C. Jedna jednostka fosfolipazy (LPC) jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która tworzy 1 mikromol 4-glicerolofosfocholiny w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji.

Aktywność galaktolipazy oznaczono z zastosowaniem spektroskopii H-NMR przy użyciu digalaktozylodiglicerydu jako substratu, według sposobu opisanego przez Hirayama i Matsuda (1972) Agric. Biol. Chem. 36, 1831. Galaktolipaza hydrolizuje wiązanie estrowe pomiędzy kwasami tłuszczowymi i rdzeniem glicerolowym uwalniając przez to obydwa kwasy tłuszczowe. Reakcja jest przeprowadzana w 50 mM buforze kwasu octowego pH 4,5 zawierającego ponadto 4 mM CaCl2, 0,2% TritonX-100 i 1 mg/ml digalaktozylodiglicerydu (Lipid Products) przez 30 minut w 30°C. Jedna jednostka galaktolipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, który tworzy 1 mikromol kwasu tłuszczowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji.

Ultraprzesącze uzyskane w Przykładzie 2 poddano pomiarom aktywności enzymu FAU. Aktywność grzybowej alfa-amylazy mierzono przy użyciu tabletek testowych Phadebas Amylase (Pharmacia). Tabletki Phadebas zawierają substrat skrobiowy nierozpuszczalny w wodzie i niebieski barwnik związany przez wiązanie krzyżowe do substratu. Substrat jest hydrolizowany przez grzybową amylazę uwalniając zabarwione rozpuszczalne maltodekstryny, które przechodzą do roztworu. Krzywą kalibracyjną przygotowano przy użyciu roztworu zawierającego referencyjną aktywność grzybowej alfa-amylazy. Z odniesienia i nieznanych próbek przygotowano odpowiednie rozcieńczenia w 50 mM buforze kwasu jabłkowego pH 5,5. Próbki 5 ml inkubowano w 30°C przez 5 minut, dodano tabletkę Phadebas i po 15 minutach reakcja została zatrzymana przez dodanie 1,0 ml 0,5 N wodorotlenku sodu. Mieszaninę pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym dodano 4,0 ml wody, wstrząśnięto ręcznie i po 15 minutach próbki zostały żwirowane w 4700 rpm przez 10 minut. Zmierzono ekstynkcję górnych warstw w 620 nm. OD 620 nm jest miarą aktywności grzybowej alfa amylazy. Jedna jednostka grzybowej amylazy (FAU) jest zdefiniowana tutaj jako ilość enzymu, która przekształca 1 gram skrobi (100% suchej masy) w ciągu godziny w produkt posiadający transmisję w 620 nm po reakcji z roztworem jodu o znanym stężeniu w ustalonych warunkach reakcji.

T a b e l a 4. FAU i białko w ultraprzesączach takich, jak przygotowane w Przykładzie 2.

enzym lipolityczny	białko (mg/ml) z analizy 280 nm	drożdżowa amylaza (FAU/ml)
1	2	3
NBE28	2,3	4,5
NBE029	1,3	3,0
NBE030	0,4	2,6
NBE031	0,1	2,5
NBE032	1,0	0,3
NBE033	n.o.	0,3
NBE034	n.o.	2,7

PL 214 792 B1 cd. Tabeli 4

1	2	3
NBE036	n.o.	3,4
NBE038	2,0	3,7
NBE039	2,2	0,6
NBE043	0,1	0,2
NBE045	n.o.	4,0
NBE042	1,6	1,5

Dodatkowo do aktywności wspomnianych w Tabeli 4, obecne były także mniejsze aktywności glukoamylazy, jednak w tak małych ilościach, że te enzymy nie wpływały na doświadczenia piekarnicze opisane w przykładzie 4.

P r z y k ł a d 4

Doświadczenia piekarnicze - bochenki testowe

Bochenki testowe pieczono ze 150 g porcji ciasta uzyskanego przez zmieszanie 200 g mąki (Kolibri™/Ibis™ w stosunku 80/20), 1,4 g suszonych drożdży piekarniczych (Fermipan^®), 4 g soli, 3 g cukru, 10 mg kwasu askorbinowego, 116 g wody i 2 g tłuszczu. Po mieszaniu przez 6 minut i 15 sekund w mikserze szpilowym ciasto podzielono na porcje 150 g i pozostawiono do wyrośnięcia przez 45 minut w 30°C, podziurawiono, pozostawiono do wyrośnięcia przez następne 25 minut, zarobiono i uformowano. Wyrastanie zachodziło we względnej wilgotności 90-100%. Po końcowym wyrośnięciu trwającym 70 minut w 30°C, ciasto pieczono przez 20 minut w 225°C.

Różne efekty (Tabele 5 i 6) różnych enzymów lipolitycznych w doświadczeniach piekarniczych porównywano z kontrolą zawierającą tę samą ilość grzybowej amylazy, którą dodano zamiast dawki ultraprzesączu (dla aktywności grzybowej amylazy w ultraprzesączach zobacz Tabelę 4). Było to konieczne, ponieważ ilości grzybowej amylazy dodane z enzymami lipolitycznymi specyficznie wpływały na objętość bochenka, nie na inne parametry. Objętość wypieków z kontrolną ilością dodanej grzybiczej amylazy była przyjmowana jako 100%.

T a b e l a 5

Efekt	Wynik
1	2	3	4	5
Ciasto	Lepkość ciasta	Za lepkie	Lepkie	Wypiek kontrolny	Dużo Iepsza	Wyśmienicie suche
Rozciągliwość ciasta	Za krótkie	Krótsze niż kontrola	Wypiek kontrolny	Dobra	Zbyt długie
Upieczony wypiek	Struktura miąższu	Słaba	Nie-jednolita	Wypiek kontrolny	Dobra	Wyśmienita
Kolor skórki	Prawie biały	Zbyt jasny	Wypiek kontrolny	Wyśmienity	Zbyt ciemny
Kolor miąższu	Dużo za żółty	Za żółty	Wypiek kontrolny	Wyśmienity	Absolutnie biały
Czerstwienie	Dużo za jędrne	Za jędrne	Wypiek kontrolny	Miększy	Wyśmienity

Objętość bochenka oznaczono przy użyciu Urządzenia do Pomiaru Objętości Pieczywa BVM-3 (ang. Bread Volume Measurer BVM-3) (RI Cards Instruments AB, Viken, Szwecja). Zasada tego pomiaru polega na odbiciu ultradźwięku mierzonego przez czujnik wokół obracającego się pieczywa.

Jako czas pomiaru wybrano 45 sekund.

Lepkość i rozciągliwość ciasta ocenił wykwalifikowany piekarz przy użyciu skali przedstawionej w Tabeli 5. Mierzono średnią z dwóch bochenków na jeden obiekt.

Po tych testach kawałki ciasta wygładzono i pozostawiono do pierwszego wyrośnięcia przez 45 minut w 30°C, po czym ciasto podziurawiono, zarobiono, uformowano, pozostawiono do wyrośnięcia przez 75 minut w 30°C. Względna wilgotność podczas etapów wyrastania była ustawiona na 85%.

PL 214 792 B1

Następnie określono stabilność wyrośniętego ciasta na podstawie obecności pęcherzyków, zerwano boczną skórkę i nieregularne zakrzywione powierzchnie skórki. Porcje ciasta pieczono przez 20 minut w 225°C. Objętości bochenków ustalono przy użyciu sposobu BVM: w tabeli średnia jest przedstawiona dla 2 wypieków, które zostały upieczone z tego samego objektu.

Strukturę miąższu ocenił wykwalifikowany piekarz przy użyciu skali przedstawionej w Tabeli 5. Po przechowywaniu kromek przez trzy dni w torbach polietylenowych w temperaturze pokojowej zmierzono jędrność miąższu przy użyciu Urządzenia do Analizy Tekstury Stevensa (ang. Stevens Texture Analyser). Dwie kromki o grubości 2 cm ze środka każdego bochenka analizowano z zastosowaniem urządzenia do analizy tekstury przy użyciu sondy o średnicy 1,5 cala, głębokości ściśnięcia 5 mm (25%) i szybkości ściskania 0,5 mm/sek. W tabeli pokazano średnią z dwóch pomiarów.

Kolor skórki ocenił wykwalifikowany piekarz według skali przedstawionej w Tabeli 5. Jako odniesienia użyto standardowego przepisu na duński chleb paczkowany.

Kolor miąższu ocenił wykwalifikowany piekarz według skali przedstawionej w Tabeli 5. Kolor skórki wypieków kontrolnych określano jako normalny (3). Jako pozytywną kontrolę użyto wypieki dwóch obiektów z takim samym składem jak kontrola z dodatkiem 0,5% mąki sojowej. Procedury wyrastania i pieczenia są te same, jak te dla kontroli bez mąki sojowej. Ta druga jest oceniona jako „wyśmienita”.

Wystawanie góry wypieku oceniono na podstawie zwisania góry w porównaniu z formą piekarniczą, im niższe brzegi góry tym niższa ocena. Im mniejsze zwisanie, tym lepsza ocena.

Czerstwienie wypieku oceniano przez poczucie jędrności twardości miąższu kromek wypieku. Przed pokrojeniem wypiek był trzymany w plastikowej torbie w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Im miększy jest miąższ kromek, tym lepsza ocena.

T a b e l a 6. Skuteczność enzymów lipolitycznych według wynalazku w pieczeniu.

Enzym lipolityczny	Parametr
Objętość (%)	Lepkość ciasta	Rozciągliwość ciasta	Stabilność ciasta	Struktura miąższu	Kolor skórki	Kolor miąższu	Wystająca góra	Czerstwienie
NBE028	100	3	3	4	2	3	3	3	4
NBE029	104	3	3	4	3	4	4	4	3
NBE030	107	3	2	4	4	4	4	3	3
NBE031	102	3	2	4	5	4	4	4	4
NBE032	98	3	3	4	2	3	3	3	3
NBE033	105	3	2	4	2	4	3	3	3
NBE034	104	3	3	4	4	4	4	4	3
NBE036	100	3	3	4	3	4	4	4	3
NBE038	109	3	3	4	5	4	4	3	3
NBE039	109	3	3	4	4	3	4	3	3
NBE043	106	3	3	4	3	4	4	3	3
NBE045	110	3	3	4	4	3	4	4	4
NBE042	110	3	4	4	4	3	4	3	3

PL 214 792 B1

P r z y k ł a d 5

Doświadczenia piekarnicze 2 - batard

Użyteczność w pieczeniu enzymów lipolitocznych według wynalazku testowano na francuskim typie chleba zwanego „batard”. Wytwarzanie batardów w standardowym procesie piekarniczym wykonano przez zmieszanie 3000 g mąki pszennej w około 20°C, 70 g prasowanych drożdży, 60 g soli, 68 _® ppm kwasu askorbinowego, 30 ppm Bakezyme^® HS2000 (grzybowa hemicelulaza), 7 ppm Bakezy_® me P500 (grzybowa α-amylaza) i 1680 ml wody (8-10°C) w mikserze spiralnym (Diosna: 2 minuty przy szybkości 1; moc 100 Wh przy szybkości 2). Temperatura ciasta wynosiła 27°C. Podatność na przetwarzanie automatyczne ciasta analizował ręcznie piekarz. Ciasto poddano objętościowemu rośnięciu przez 15 minut w komorze do wyrastania w 32°C i 90% RH. Następnie ciasto podzielono na 6 części 350 g, wygładzono i pozostawiono do wyrośnięcia przez 15 minut w 32°C i 90% RH. Na końcu tego okresu kawałki ciasta zarobiono i ukształtowano oraz poddano końcowemu wyrastaniu przez 90 minut w 32°C i 90% RH. Całkowicie wyrośnięte ciasta pocięto wzdłuż kawałka ciasta i pieczono w piekarniku w 240°C przez 30 minut z dodaniem pary na początku. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej oznaczono objętości bochenków przy użyciu sposobu BVM (zobacz przykład 4).

Przerwa, postrzępienie i kształt wypieków analizował wykwalifikowany piekarz bezpośrednio po schłodzeniu do temperatury pokojowej przy użyciu skali z Tabeli 7. Po 16 godzinach (przez noc) przechowywania w zamkniętym pudełku w temperaturze pokojowej wykwalifikowany piekarz oceniał jakość miąższu. Objętość wypieków (Tabela 8) wzięto z obiektu 1.

T a b e l a 7

Efekt	Wynik
1	2	3	4	5
Przerwa i postrzępienie	Ekstremalnie słaby i miękki	Słaby i miękki	Wypiek kontrolny	Cienka i chrupiąca skórka twarda przerwa na przecięciu	Skórka zbyt cienka, zbyt twarda
Struktura miąższu	Uboga	Nie- jednorodna	Wypiek kontrolny	Dobra	Wyśmienita
Kształt	Wysokość	Płaski	Pośredni	Wypiek kontrolny	Większy niż (3)	Dużo większy niż (3)
Cięcie	Cięcie zamknięte	Cięcie zamknięte	Wypiek kontrolny	Całkowicie otwarte	Całkowicie otwarte; rozdarte

T a b e l a 8. Efektywność enzymów lipolitycznych według wynalazku w pieczeniu

Enzym lipolityczny	Parametr
Dawka*	Objętość kromki (%)	Przerwa & Postrzępienie	Kształt	Struktura miąższu
Żaden	0	100	3	3	3
NBE028	0,75	3	4	4	4
NBE030	3	103	4	4	3
NBE031	2,5	95	4	4	3
NBE036	n.o.	88	3	3	3
NBE038	30	100	4	4	3
NBE39	64	126	3	4	3
NBE045	n. o.	89	4	4	3
NBE042	12	98	3	4	4

* w ppm w oparciu o masę mąki i masę enzymu oznaczoną przy użyciu sposobu A280.

PL 214 792 B1

LISTA SEKWENCJI <130> 21078WO <160> 39 <170> Patentin wersja 3.1 <210> 1 <211> 3728 <212» ΟΝΑ <213» Aspergillus niger <400> 1 cgggcaatta cgatccgagc gcgctatcta cgtgeaccgg aagcttgctc cttgatttgt 60 tgtttcataa tacttatttg tgctctttag cccgactgca gtggtggctg catgttgggc 120 aggtatttaa ctttgggcga taccaactac gcgtgcactt tgaagcatag cacggcgcgc 180 cggggatgcg tgtcgtctta tgectataat tgatgtggcc gactgactge ttggtgttag 240 ggatcttgtg tttatet&gg ttttctgtac ttagaagaga gtgccggtgg catggtggtc 300 gatataacta gagcaatgcg tgtctccatc ctcatcctca tcggccatcc cttataccct 360 gatggcgccg aagggtgaga atggcgatgg gcgagaataa tatactgtgt atagtctgtc 420 ctatcctcct tgtgcactgc asagfccagtt gatcatcatc ccctócaat cgtccactca 480 tgctctatat ccgagacaaa ccacaactta c&satttae gcccgagtcc ataatcatcc 540 acaaccaccc cacagccagg gtacatccag ggtctctttc cccccggaga eectaagccc 600 ttagętcetc actaggacct cccgccgcgt cttggctcct cateaccaac tttecaccU 660 taaactgcat caaacatgct gcaaagccac gactgctgct gcatgcaccc caacatcatc 720 ccogcaWt acatccatcc ctgaagcaat ęaagcttgac tctgttgttt cttcggagat 780 gttaaccatt cgtactttcc aaatgacatc aatccaactg atagacatcg ccatcctcct 849 caataccatg gacgccccac gtccatgtca aaagtaagac tagctcagct cggcgttaat 900 caattatgat tgcgagtctc aatecctgag fccMgtgfctc tctgtgtcgg agaattagac 960 tgaattcagc tgctcgttgc eactccUgc tccctgataa aggtcctcac ttcgtctcgt 1020 agctggctgg ctgcatattc tccggtgact aagtUacag aaccagcaac ttagtagcca 1080 tggcgagcgc actcctctgg ctctccctgc tgggtggcag caccctagcc tcaactcUg 1140 acaccagtaa tacccctacc atcaagagag cagacgcagg aaacaacacc tcctcaatce 1200 caacagccac cctcsacaac accgtcttca tcggccgttc cctgcccgag ttcgagcagg 1260 agttgttcct gggUtcaag tttgctgatg agcccgtgcg attcaccccg tcgacgttga 1320 aaaccgtcta tcgcgccaat gacagcgaca acggggtgta tcatgcttcc acagcatccg 1380 gactgcagac ttcctcgggg accgtgctct acaacgccac agagtatggg tatgattgcc 1440 ccgggtatgg atccgatgag acggagctgg cggaggaagg atatgcgcgg ttcgatgaga 1500

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt actgtatgaa cctgaatata attcggccca agagagagaa agaggatgag ttgttgcctg 1560 tgatgatttg gatctttggt ggtggttggg tgcagggtgc gactgctgat ccgaggtagg 1620 atactatagt tttgtgctgt gctgtgtggg gttgatgctg acgatgtgca aggtacaata 1680 tgagctatat tgttcgccag ggtgcgttga atgataagcc tgtcttgggt gtctcgatca 1740 attaccgtgt ggctgcgttt ggattccttg actctgtcga ggttatggtg cgtttcttcc 1800 ttcaccgtca agtatatggg tttcagctga catgacatct gtaggaatcc ggcaacacga 1860 acctaggact tcgtgatcag cgcgtcgcca tgcattgggt caaacaaaac atcaaggcgt 1920 ttggtggtga cccggacaag atcaccatct ggggagaatc agcgtgagat tataccctaa 1980 tagcattcga tatacagcgc ctgacatggc acagtggtgc ctacagcgtc ggagcccacc 2040 tggtcaccaa cgacggtgac aacgagggtc tattcagagc cggtatgcac accactcccc 2100 aattctcgtc tcctcatctg ctaaccagca tagccatcat ggaatccggc aacgcagtcg 2160 gaccccccta cascggcacg gactggtacc agccgatgta cgaccagatc gtgaacgcaa 2220 ccaagtatgt cctcaccttc cccaaaagac aatactcaaa tgactagtat atatactaac 2280 tacatgaaag ctgcaccacc tcaagcaaca cccttcaatg cctccgcgaa gtccccttct 2340 caacgatcta caccgccgca gacatcggcc tggaatggtt cgccaccatc gacggcacct 2400 tcatcaaaga atatccccaa atcagcatta cggagggccg cttcgccaag gtccccatcc 2460 tccatggcac caecaccgac gagggcgtga gtttcggtac gacgggcgtg aacactgatg 2520 ccgaagcgat ccagcagttg atgggtgagc cccccccccc cccccttccc accaatcccc 2580 aagatatata tatagtacga gatactaagg tgaaatgaaa atgatagcat ccaaacgctg 2640 ggtcctaaac gaaacccaag ccacgaccct cctatcgcac tatcccaaca tctccgccct 2700 aggctgtccc tacggatggg gcaacacgac ctggccgaag ctggggtatg aatataagcg 2760 ctacgagtcg atggcgggcg atctgtgcat ggttgctccg aggaggttgc tcagtcagaa 2820 gatgaaggag tatgaggagc aagtgtttgc gtatcggtgg gatgtcgctg cgttgaatga 2880 ttcgagtacg attggggtgg cgcattttgc tgaggtaatg ccatccatcc atcccctatt 2940 attggttttc cctgcggtat gatatttggt atgctaatga tgtgttactg cgtgcatgca 3000 tagatcccgt ttgttttcgc caaccctgtg cagaacatca ctccgttggg aagtgatccc 3060 gcaagactgg agttgggtaa tctggccgcg aggatgtgga cggcttttgt gacggatttg 3120 gatccgaatg ggcatggtgg tacgttcctc ttctccatct tattagaatt gtgaaatgaa 3180 gcgtgtggtt ctaatgaggg tgacagtctc tggtatcccc caćtggccga aatacaacct 3240 cactgatccg agggactttg tgttccggct accgagggat ggaagttatg tggagaagga 3300 tacttttagg acggggggga ttgattatat taatacaatt gtgcggtaag ttgctgctaa 3360 gtagtactac tatatgtata taggagggtg tgggtgaaaa gtagatagta gtactatatc 3420 aaggatggtt agatactata tactatttac tactactgta atgttactat aatcaagact 3480 agaagaaagt ctactgattg attacttcga ctgatcgatt gtattgatct agttagtata 3540 tcaaatcgac aaagagccgc cgtttttatt cattcatatt tcccgccact aagccagtat 3600 actataccat agtagtatag ctggtttagt tgatgccgag cagctcaacc tcgctaattg 3660 atatcagcat tccaatccat tttttcactg gcaaagaata ttagaagagg aaggaggagg 3720 aggataac 3728 <2ł0> 2 <211> 1749 <212> DNA <213> Aspergillus niger

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt <220>

<221> CDS <222> (1)..(1749) <400> 2 atg gcg agc gca ctc ctc tgg ctc tcc ctg ctg ggt ggc agc acc eta 48

Met Ala Ser Ala Leu Leu Trp Leu Ser Leu Leu Gly Gly Ser Thr Len 15 10 15 gee tea act eta gac acc agt aat acc cct acc atc aag aga gca gac 96

Ala Ser Thr Leu Asp Thr Ser Asn Thr Pro Thr Ile Lys Arg Ala Asp

25 30 gca gga aac aac acc tcc tea atc cca aca gee acc ctc aac aac acc 144

Ala Gly Asn Asn Thr Ser Ser Ile Pro Thr Ala Thr Leu Asn Asn Thr

40 45 gtc ttc atc ggc cgt tcc ctg ccc gag ttc gag cag gag ttg ttc ctg 192

Val Phe Ile Gly Arg Ser Leu Pro Glu Phe Glu Gin Glu Leu Phe Leu

55 60 ggt atc aag ttt get gat gag ccc gtg ega ttc acc ccg teg acg ttg 240

Gly Ile Lys Phe Ala Asp Glu Pro Val Arg Phe Thr Pro Ser Thr Leu

70 75 80 aaa acc gtc tat ege gee aat gac agc gac aac ggg gtg tat cat get 288

Lys

Thr

Val

Tyr

Arg Ala Asn Asp

Ser

Asp

Asn

Gly

Val

Tyr His

Ala

85

90

95

tcc

aca

gca

tcc

gga ctg cag act

tcc

teg

ggg

acc

gtg

ctc tac

aac

336

Ser

Thr

Ala

Ser

Gly Leu Gin Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Leu Tyr

Asn

100

105

110

gee

aca

gag

tat

ggg tat gat tgc

ccc

ggg

tat

gga

tcc

gat gag

acg

384

Ala

Thr

Glu

Tyr

Gly Tyr Asp Cys

Pro

Gly

Tyr

Gly

Ser

Asp Glu

Thr

115

120

125

gag

ctg

gcg

gag

gaa gga tat gcg

cgg

ttc

gat

gag

aac

tgt atg

aac

432

Glu

Leu

Ala

Glu

Glu Gly Tyr Ala

Arg

Phe

Asp

Glu

Asn

Cys Met

Asn

130

135

140

ctg

aat

ata

att

cgg ccc aag aga

gag

aaa

gag

gat

gag

ttg ttg

cct

480

Leu

Asn

Ile

Arg Pro Lys Arg

Glu

Lys

Glu

Asp

Glu

Leu Leu

Pro

145

150

155

160

gtg

atg

att

tgg

atc ttt ggt ggt

ggt

tgg

gtg

cag

ggt

gcg act

get

528

Val

Met

Ile

Trp

Ile Phe Gly Gly

Gly

Trp

Val

Gin

Gly

Ala Thr

Ala

165

170

175

gat

ccg

agg

tac

aat atg agc tat

att

gtt

ege

cag

ggt

gcg ttg

aat

576

Asp

Pro

Arg

Tyr

Asn. Met Ser Tyr

Ile

Val

Arg

Gin

Gly

Ala Leu

' Asn

180

185

190

gat

aag

cct

gtc

ttg ggt gtc teg

atc

aat

tac

cgt

gtg

get gcg

ttt

624

Asp

Lys

Pro

Val

Leu Gly Val Ser

Ile

Asn

Tyr

Arg

Val

Ala Ala

Phe

PL 214 792 B1

2i o;

78WO

.ST25.txt

195

200

205

gga

ttc

ctt

gac

tct

gtc

gag

gtt

a tg

gaa

tcc

ggc

aac

acg

aac

eta

672

Gly

Phe

Leu

Asp

Ser

Va1

Glu

Val

Met

Glu

Ser

Gly

Asn

Thr

Asn

Leu

210

215

220

gga

ctt

cgt

gat

cag

cgc

gtc

gcc

atg

cat

tgg

gtc

aaa

caa

aac

atc

720

Gly

Leu

Arg

Asp

Gin

Arg

Val

Ala

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Asn

Ile

225

230

235

240

aag

gcg

ttt

ggt

gac

ccg

gac

a ag

atc

a cc

atc

tgg

gga

gaa

tea

768

Lys

Ala

Phe

Gly

Asp

Pro

Asp

Lys

Ile

Thr

Ile

Trp

Gly

Glu

Ser

245

250

255

gct

ggt

gcc

tac

agc

gtc

gga

gcc

cac

ctg

gtc

a cc

aac

gac

ggt

gac

816

Ala Gly Ala Tyr Ser Val Gly Ala His Leu Val Thr Asn Asp Gly Asp

260

255

270

aac

gag

ggt

eta

ttc

aga

gcc

atc

atg

gaa

tcc

ggc

aac

gca

gtc

864

Asn

Glu

Gly

Leu

Phe

Arg

Ala

Ile

Met

Glu

Ser

Gly

Asn

Ala

Val

275

280

285

gga

ccc

tac

aac

ggc

acg

gac

tgg

tac

cag

ccg

atg

tac

gac

cag

912

Gly

Pro

Tyr

Asn

Gly

Thr

Asp

Trp

Tyr

Gin

Pro

Met

Tyr

Asp

Gin

290

295

300

atc

gtg

aac

gca

acc

aac

tgc

acc

tea

agc

aac

acc

ctt

caa

tgc

960

Ile

Val

Asn

Ala

Thr

Asn

Cys

Thr

Ser

Asn

Thr

Leu

Gin

Cys

305

310

315

320

ctc

cgc

gaa

gtc

ccc

ttc

tea

acg

atc

tac

acc

gcc

gca

gac

atc

ggc

1008

Leu

Arg

Glu

Val

Pro

Phe

Ser

Thr

Ile

Tyr

Thr

Ala

Asp

Ile

Gly

325

330

335

ctg

gaa

tgg

ttc

gcc

acc

atc

gac

ggc

acc

ttc

atc

aaa

gaa

tat

ccc

1056

Leu

Glu

Trp

Phe

Ala

Thr

Ile

Asp

Gly

Thr

Phe

Ile

Lys

Glu

Tyr

Pro

340

345

350

caa

atc

agc

att

acg

gag

ggc

cgc

ttc

gcc

aag

gtc

ccc

atc

ctc

cat

1104

Gin

Ile

Ser

Ile

Thr

Glu

Gly

Arg

Phe

Ala

Lys

Val

Pro

Ile

Leu

His

355

360

365

ggc

acc

aac

acc

gac

gag

ggc

gtg

agt

ttc

ggt

acg

ggc

gtg

aac

1152

Gly

Thr

Asn

Thr

Asp

Glu

Gly

Val

Ser

Phe

Gly

Thr

Gly

Val

Asn

370

375

380

act

gat

gcc

gaa

gcg

atc

cag

ttg

atg

gca

tcc

aaa

cgc

tgg

gtc

1200

Thr

Asp

Ala

Glu

Ala

Ile

Gin

Leu

Met

Ala

Ser

Lys

Arg

Trp

Va1

385

390

395

400

eta

aac

gaa

acc

caa

gcc

acg

acc

ctc

eta

teg

cac

tat

ccc

aac

atc

1248

Leu

Asn

Glu

Thr

Gin

Ala

Thr

Leu

Ser

His

Tyr

Pro

Asn

Ile

405

410

415

tćc

gcc

eta

ggc

tgt

ccc

tac

gga

tgg

ggc

aac

acg

acc

tgg

ccg

aag

1296

Ser

Ala

Leu

Gly

Cys

Pro

Tyr

Gly

Trp

Gly

Asn

Thr

Trp

Pro

Lys

420

425

430

ctg

ggg

tat

gaa

tat

aag

cgc

tac

gag

teg

atg

gcg

ggc

gat

ctg

tgc

1344

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Leu

Gly

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Arg

Tyr

Glu

Ser

Met

Ala

Gly

Asp

Leu

Cys

435

440

445

atg

gtt

gct

ccg

agg

ttg

ctc

agt

cag

aag

atg

aag

gag

tat

gag

1392

Met

Val

Ala

Pro

Arg

Leu

Ser

Gin

Lys

Met

Lys

Glu

Tyr

Glu

450

455

460

gag

ca a

gtg

ttt

gcg

tat

cgg

tgg

gat

gtc

gct

gcg

ttg

aat

gat

teg

1440

Glu

Gin

Val

Phe

Ala

Tyr

Arg

Trp

Asp

Val

Ala

Leu

Asn

Asp

Ser

465

470

475

480

agt

acg

att

ggg

gtg

gcg

cat

ttt

gct

gag

atc

ccg

ttt

gtt

ttc

gcc

1488

Ser

Thr

Ile

Gly

Val

Ala

His

Phe

Ala

Glu

Ile

Pro

Phe

Val

Phe

Ala

485

490

495

aac

cct

gtg

cag

aac

atc

act

ccg

ttg

gga

agt

gat

ccc

gca

aga

ctg

1536

Asn

Pro

Val

Gin

Asn

Ile

Thr

Pro

Leu

Gly

Ser

Asp

Pro

Ala

Arg

Leu

500

505

510

gag

ttg

ggt

aat

ctg

gcc

gcg

agg

atg

tgg

acg

gct

ttt

gtg

acg

gat

1584

Glu

Leu

Gly

Asn

Leu

Ala

Arg

Met

Trp

Thr

Ala

Phe

Val

Thr

Asp

515

520

525

ttg

gat

ccg

aat

ggg

cat

ggt

gtc

tct

ggt

atc

ccc

cac

tgg

ccg

aaa

1632

Leu

Asp

Pro

Asn

Gly

His

Gly

Val

Ser

Gly

Ile

Pro

His

Trp

Pro

Lys

530

535

540

tac

aac

ctc

act

gat

ccg

agg

gac

ttt

gtg

ttc

cgg

eta

ccg

agg

gat

1680

Tyr Asn Leu Thr Asp Pro Arg Asp Phe Val Phe Arg Leu Pro Arg Asp

545 550 555 560 gga agt tat gtg gag aag gat act ttt agg acg ggg ggg att gat tat 1728

Gly Ser Tyr Val Glu Lys Asp Thr Phe Arg Thr Gly Gly Ile Asp Tyr

565 570 575

att aat aca att gtg cgg taa	1749
Ile Asn Thr Ile Val Arg 580

<210> 3 <211> 582 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400 3

Met Ala Ser Ala Leu Leu Trp Leu Ser Leu Leu Gly Gly Ser Thr Leu 15 10 15

Ala Ser Thr Leu Asp Thr Ser Asn Thr Pro Thr Ile Lys Arg Al-a Asp

25' 30

Ala Gly Asn Asn Thr Ser Ser Ile Pro Thr Ala Thr Leu Asn Asn Thr

40 45

Val Phe Ile Gly Arg Ser Leu Pro Glu Phe Glu Gin Glu Leu Phe Leu

PL 214 792 B1

55

Gly Ile Lys Phe Ala Asp Glu Pro 65 70

Lys Thr Val Tyr Arg Ala Asn Asp

Ser Thr Ala Ser Gly Leu Gin Thr 100

Ala Thr Glu Tyr Gly Tyr Asp Cys 115 120

Glu Leu Ala Glu Glu Gly Tyr Ala

130 135

Leu Asn Ile Ile Arg Pro Lys Arg 145 150

Val Met Ile Trp Ile Phe Gly Gly

165

Asp Pro Arg Tyr Asn Met Ser Tyr 180

Asp Lys Pro Val Leu Gly Val Ser 195 200

Gly Phe Leu Asp Ser Val Glu Val

210 215

Gly Leu Arg Asp Gin Arg Val Ala 225 230

Lys Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asp

				245
Ala	Gly	Ala	Tyr	Ser	Val	Gly	Ala
			260
Asn	Glu	Gly	Leu	Phe	Arg	Ala	Ala
		275					280
Gly	Pro	Pro	Tyr	Asn	Gly	Thr	Asp
	290					295
Ile	Val	Asn	Ala	Thr	Asn	Cys	Thr
305					310
Leu	Arg	Glu	Val	Pro	Phe	Ser	Thr
				325
Leu	Glu	Trp	Phe	Ala	Thr	Ile	Asp
			340
Gin	Ile	Ser	Ile	Thr	Glu	Gly	Arg
		355					360
Gly	Thr	Asn	Thr	Asp	Glu	Gly	Val
	370					375
Thr	Asp	Ala	Glu	Ala	11 e	Gin	Gin
385					390
Leu	Asn	Glu	Thr	Gin	Ala	Thr	Thr

21C78W0.ST25.txt

Val Arg Phe Thr Pro Ser Thr Leu 75 80

Ser Asp Asn Gly Val Tyr His Ala 90 95

Ser Ser Gly Thr Val Leu Tyr Asn

105					110
Pro	Gly	Tyr	Gly	Ser	Asp	Glu	Thr
				125
Arg	Phe	Asp	G1U	Asn	Cys	Met	Asn
			140
Glu	Lys	Glu	Asp	Glu	Leu	Leu	Pro
		155					160
Gly	Trp	Val	Gin	Gly	Ala	Thr	Ala
	170					175
Ile	Val	Arg	Gin	Gly	Ala	Leu	Asn
185					190
Ile	Asn	Tyr	Arg	Val	Ala	Ala	Phe
				205
Met	Glu	Ser	Gly	Asn	Thr	Asn	Leu
			220
Met	His	Trp	Val	Lys	Gin	Asn	Ile
		235					240
Lys	Ile	Thr	Ile	Trp	Gly	Glu	Ser
	250					255
His	Leu	Val	Thr	Asn	Asp	Gly	Asp
265					270

Ile Met	Glu	Ser	Gly	Asn	Ala	Val
			285
Trp Tyr	Gin	Pro	Met	Tyr	Asp	Gin
		300
Thr Ser	Ser	Asn	Thr	Leu	Gin	Cys
	315					320
Ile Tyr	Thr	Ala	Ala	Asp	Ile	Gly
330					335
Gly Thr	Phe	Ile	Lys	Glu	Tyr	Pro
345				350
Phe Ala	Lys	Val	Pro	Ile	Leu	His
			365
Ser Phe	Gly	Thr	Thr	Gly	Val	Asn
		380
Leu Met	Ala	Ser	Lys	Arg	Trp	Val
	395					400
Leu Leu	Ser	His	Tyr	Pro	Asn	Ile

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

405

410

415

Ser

Ala

Leu

Gly

Cys

Pro

Tyr

Gly

Trp

Gly

Asn

Thr

Trp

Pro

Lys

420

425

430

Leu

Gly

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Arg

Tyr

Glu

Ser

Met

Ala

Gly

Asp

Leu

Cys

435

440

445-

Met

Val

Ala

Pro

Arg

Leu

Ser

Gin

Lys

Met

Lys

Glu

Tyr

Glu

450

455

460

Glu

Gin

Val

Phe

Ala

Tyr

Arg

Trp

Asp

Val

Ala

Leu

Asn

Asp

Ser

465

470

475

480

Ser

Thr

Ile

Gly

Val

Ala

His

Phe

Ala

Glu

Ile

Pro

Phe

Val

Phe

Ala

485

490

495

Asn Pro Val Gin Asn Ile Thr Pro Len Gly Ser Asp Pro Ala Arg Leu 500 505 510

Glu Leu Gly Asn Leu Ala Ala Arg Met Trp Thr Ala Phe Val Thr Asp 515 520 525

Leu

Asp

Pro

Asn

Gly

His

Gly

Val

Ser

Gly

Ile

Pro

His

Trp

Pro

Lys

530

535

540

Tyr

Asn

Leu

Thr

Asp

Pro

Arg

Asp

Phe

Val

Phe

Arg

Leu

Pro

Arg

Asp

545

550

555

560

Gly

Ser

Tyr

Val

Glu

Lys

Asp

Thr

Phe

Arg

Thr

Gly

Ile

Asp

Tyr

565

570

575

Ile

Asn

Thr

Ile

Val

Arg

580

<210> 4 <211> 3853 <212> ONA <213> Aspergillus niger <400> 4 ctttcctgtt gcccggtctt tgttgttgtc ataggataca attacccaga caacgttcgg 60 tttgtcgatc agttttaagt gtgcgtggac tgacagccaa ggccactggg gcccctgcct 120 ctatcattta attccacacg ctcgcctctg cagctctggc accagcgttg caaattccag 180 gggtcagcct acgtggcatt aggctctaag agaatctgag ggaaaggatt tcacttagaa 240 aaatttatcg gtccggcttg tccgatcggt aggaaggcat tgcttcccct catatgcggc 300 cccggttccc aagcagctga ttcgggacgt tttccggctt gatcgctata ctctcataat 360 ctctcctgca agagctggat aaacttggtt tcttatcttc cgtggggatg ccatagtcca 420 gtagacgctg tctcgaaatt gagtagcacc actatttacg ggcaagttaa tggcacatgt 480 attagctttg tactgacggt tgaaatgtgg agcaatttcc ggctatgtac cggatctgtt 540 ccggatatct tcatcgcaat tagttagtac ataaaactcc ctagtcacgc aagaacggtt 600 cgaacataac gaattaaaaa ttctcattct ctggcaaggc ttcgaaatgt ttgtttcctc 660 gcttgctcta ttagcactta ttgctccttt gatcgcaatt gcggtaaaaa tagaacagcc 720 aggaataaat ccaaatccca cagctactgt acgaaatggc acctactatg gtctccataa 780

PL 214 792 B1

21Q78W0.ST25.txt ccagcactat aatcaagacc tctttctcgg tattccatat gcacagcaac ctattggtga 840 ccttcgcttg cggaccccac gatcaatgaa cacctcctgg ccagtaccaa gaaatgcaac 900 agaatattca cccgcatgtg ttggatttaa tcagacagag ggtgcttccg aagcctgcct 960 tactctcaat gtcgtccgcc cggcaagcat cgctctttct gaaagtcttc ccgttgctgg 1020 tcagtatata ccccaaatct gatcagaagg gccagaactg actttgcgct cggccccagt 1080 ctggattcat ggcgggggat tcacctccgg ctcttcatca gagaaacaat acaatctgtc 1140 cttcatcgtt gatcagtcag tccaaatgga aaagcccgtt atcgcagtca gtctaaatta 1200 tcgtcttcaa tgctggggtt ttatgtggag caaggagatg aaggaagccg gagtagggaa 1260 cctgggactt agagaccaac gattagctct gcattggata caagaaagta ggtatctcga 1320 tagtgaagct cttccaagta cggatctgac catgacttag acattgctgc gtttggtgga 1380 gaccctgctc aggttacaat ttggggtgaa agtgccggcg ctaatagtgt tggcacacat 1440 ctggttgctt acggagggcg cgatgatggt atattccgtg cagctatcag tgaaagtggt 1500 gccccaagtg tttaccaacg ttatccaaca cctgctgaat ggcagcccta ttatgatggt 1560 attgtgaatg catcaggctg cagttcagca acggatactt tggcttgtct ccgaacaatt 1620 ccaactaaca tattgcatgg catctttgac aacacgtcta ttgtacccat gcacgctatt 1680 tcaggcctca gcggagcaaa attcattcct gtcatagatg acgacttcat taaagagagt 1740 gccacggttc agctccagaa gggcaacttc gtcaaagttc cctacttgat tggagctaac 1800 gccgacgaag ggactgcatt tgctgtggag ggagtcaaca cagatgctga gtttcgcgag 1860 ctagtcaaag gttggggcct caacaacgct accacggata tcttggaggc cctataccca 1920 gacattcctc agataggaat ccccgccata atggttggaa ggccaccgtc cggatatgga 1980 aatcaataca agcgtgtggc cgcatttcag ggtgatgtta acatccatgc cgcacgtagg 2040 ttgaccagtc agatctggtc atcccgcaat atctcagtat atagctacat gtttgacgtt 2100 atcagccctg gatatggccc ctctgctggt tcctatgctg gggctactca tggtactgat 2160 attccgtacg ttttctataa tctggatggc ctggggtatg actcgaacaa caagtccata 2220 gaaagcatac ctaacagtta ttcccgcatg agcaaaatta tgtcaagaat gtgggtcagt 2280 tttgtgacaa cattggaccc aaatcattct ggaggtatgg tcccacatcc cattcctatg 2340 attgcgcaat gtcagacccg agctgaatca actatcttct taggaactaa tgttcagtgg 2400 ccgccataca atatcgataa tccggagata atctttttcg ataccgatgt cacgaacctc 2460 acatatgtga gttctgacgt ttaccgtgcg gagggcataa aatacatcag tgatcacctt 2520 gcaagtgatt tcgggcactg agatcacata tcttctcggt ctaattttag aatgactgtg 2580 gtctcatcta accagacttg gcccgcaggt ctttacgccc actggtggta attgatgcaa 2640 cccccaagct atatagtgtc tggggctttg aactactgtc aatgagcgaa aattgactat 2700 ttccctttat gactcatgta gtagcatttg tgctggcact gtgatcaaga tatgtttttc 2760 gagattaccg gtagcagagt agtcgatgtc gccaatatta ttcatctata atgaatagta 2820 ataacttagg agtcattcag tatagtcgat actgacataa gtatcttttc ttgtgatatt 2880 tataatatgt cccgtttggc cttgtttgta gtaactctca tagcctgctg cttgagaact 2940 catctgttca atcatagaga taccaattat ggaaggatag gttggcatcg gtgtttgttt 3000 catcaagact actacctaat aagtcactga agaaggctgt agactgaaag cgcgacattg 3060 atgattagaa ttccaacttt ggtcaacata tgcattagac tataaaaggg acatgttaga 3120 agaactaagt acatacgacc atagggtgtg gaaaacaggg cttcccgtcc gctcagccgt. 3180 acttaagcca cacgccggga ggttagtagt tgggtgggtg accaccagcg aatcccttct 3240 gttgtatgtt tttgtttctc tataaaactt ttggtcgggc atctcgagat gtcttccagg 3300 atgctaaaac cttcgggttc ctcacagcgg agatggtgtc aactggcttt tttaatgcat 3360 tcttggctaa agtgctcgtg aacacggcaa tatagtacga tgatatctga agtttgtggt 3420

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt gtcaagacat atgcttattg tgaccaccag accataaatc ggagtattca cagcttatat 3480 catcctcaaa cattgattgc atagtagagt gtctaactct tgactcaagg gattgaaaat 3540 gattatttga aaatataggt agttttgaat aacattctgg cacacgagct ttagctggat 3600 tagtaagatg tgacgccgat tttgggtttg attatgtcat catttggcag ttcccccaga 3660 ggacagcccg gttaagaacg aaccttttct gagcccgtat acaaatgcgg ggaacagaga 3720 tgaggagatg ccgaagcatg ctttggcaaa cagaagccac tgtgaaaaac cattcacaga 3780 tatcttgtga tagttggatt gcactgactg tccgcgaaag cgagcatatc tatcccgtat 3840 actgagaact agt 3853 <210> 5 <211> 1743 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1743) <400> 5

atg

ttt

gtt

tcc

teg

ctt

get

eta

tta

gca

ctt

att

get

cct

ttg

atc

48

Met

Phe

Val

Ser

Leu

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Ala

Pro

Leu

Ile

1

5

10

15

gca

att

gcg

gta

aaa

ata

gaa

cag

cca

gga

ata

aat

cca

aat

ccc

aca

96

Ala

Ile

Ala

Val

Lys

Ile

Glu

Gin

Pro

Gly

Ile

Asn

Pro

Asn

Pro

Thr

20

25

30

get

act

gta

ega

aat

ggc

acc

tac

tat

ggt

ctc

cat

aac

cag

cac

tat

144

Ala

Thr

Val

Arg

Asn

Gly

Thr

Tyr

Gly

Leu

His

Asn

Gin

His

Tyr

35

40

45

aat

caa

gac

ctc

ttt

ctc

ggt

att

cca

tat

gca

cag

caa

cct

att

ggt

192

Asn

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Pro

Tyr

Ala

Gin

Pro

Ile

Gly

50

55

60

gac

ctt

ege

ttg

cgg

acc

cca

ega

tea

atg

aac

acc

tcc

tgg

cca

gta

240

Asp

Leu

Arg

Leu

Arg

Thr

Pro

Arg

Ser

Met

Asn

Thr

Ser

Trp

Pro

Val

65

70

75

80

cca

aga

aat

gca

aca

gaa

tat

tea

ccc

gca

tgt

gtt

gga

ttt

aat

cag

288

Pro Arg Asn Ala Thr Glu Tyr Ser Pro Ala Cys Va1 Gly Phe Asn Gin 85 90 95 aca gag ggt get tcc gaa gee tgc ctt act ctc aat gtc gtc ege ccg 336

Thr Glu Gly Ala Ser Glu Ala Cys Leu Thr Leu Asn Val Val Arg Pro

100 105 HO gca agc atc get ctt tet gaa agt ctt ccc gtt get gtc tgg att cat 384

Ala Ser Ile Ala Leu Ser Glu Ser Leu Pro Val Ala Val Trp Ile His

115 120 125

PL 214 792 B1

ggc	ggg	gga	ttc	acc	tcc	ggc	tct	tea
Gly	Gly	Gly	Phe	Thr	Ser	Gly	Ser	Ser
	130					135
tcc	ttc	atc	gtt	gat	cag	tea	gtc	caa
Ser	Phe	Ile	Val	Asp	Gin	Ser	Val	Gin
145					150
gtc	agt	eta	aat	tat	cgt	ctt	caa	tgc
Val	Ser	Leu	Asn	Tyr	Arg	Leu	Gin	Cys
				165
gag	atg	aag	gaa	gcc	gga	gta	ggg	aac
Glu	Met	Lys	Glu	Ala	Gly	Val	Gly	Asn
			180					185
tta	gct	ctg	cat	tgg	ata	caa	gaa	aac
Leu	Ala	Leu	His	Trp	Ile	Gin	Glu	Asn
		195					200
cct	gct	cag	gtt	aca	att	tgg	ggt	gaa
Pro	Ala	Gin	Val	Thr	Ile	Trp	Gly	Glu
	210					215
ggc	aca	cat	ctg	gtt	gct	tac	gga	ggg
Gly	Thr	His	Leu	Val	Ala	Tyr	Gly	Gly
225					230
gca	gct	atc	agt	gaa	agt	ggt	gcc	cca
Ala	Ala	Ile	Ser	Glu	Ser	Gly	Ala	Pro
				245
aca	cct	gct	gaa	tgg	cag	ccc	tat	tat

Thr Pro Ala Glu Trp Gin Pro Tyr Tyr

21078W0.ST25.txt

tea	gag	aaa	caa	tac	aat	ctg	432
Ser	Glu	Lys	Gin	Tyr	Asn	Leu
		140
atg	gaa	aag	ccc	gtt	atc	gca	480
Met	Glu	Lys	Pro	Val	Ile	Ala
	155					160
tgg	ggt	ttt	atg	tgg	age	aag	528
Trp	Gly	Phe	Met	Trp	Ser	Lys
170					175
ctg	gga	ctt	aga	gac	caa	ega	576
Leu	Gly	Leu	Arg	Asp	Gin	Arg

190

260 265

ggc	tgc	agt	tea	gca	acg	gat	act	ttg
Gly	Cys	Ser	Ser	Ala	Thr	Asp	Thr	Leu
		275					280
act	aac	ata	ttg	cat	ggc	atc	ttt	gac
Thr	Asn	Ile	Leu	His	Gly	Ile	Phe	Asp
	290					295
cac	gct	att	tea	ggc	ctc	age	gga	gca
His	Ala	Ile	Ser	Gly	Leu	Ser	Gly	Ala
305					310
gac	gac	ttc	att	aaa	gag	agt	gcc	acg
Asp	Asp	Phe	Ile	Lys	Glu	Ser	Ala	Thr
				325
ttc	gtc	aaa	gtt	ccc	tac	ttg	att	gga
Phe	Val	Lys	Val	Pro	Tyr	Leu	Ile	Gly
			340					345
gca	ttt	gct	gtg	gag	gga	gtc	aac	aca
Ala	Phe	Ala	Va1	Glu	Gly	Val	Asn	Thr

att gct gcg ttt ggt gga gac 624 Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp

205 agt gcc ggc gct aat agt gtt 672

Ser	Ala	Gly	Ala	Asn	Ser	Val
		220
ege	gat	gat	ggt	ata	ttc	cgt	720
Arg	Asp	Asp	Gly	Ile	Phe	Arg
	235					240
agt	gtt	tac	caa	cgt	tat	cca	768
Ser	Val	Tyr	Gin	Arg	Tyr	Pro
250					255
gat	ggt	att	gtg	aat	gca	tea	816
Asp	Gly	Ile	Val	Asn	Ala	Ser
				270
gct	tgt	ctc	ega	aca	att	cca	864
Ala	Cys	Leu	Arg	Thr	Ile	Pro
			285
aac	acg	tct	att	gta	ccc	atg	912
Asn	Thr	Ser	Ile	Val	Pro	Met
		300
aaa	ttc	att	cct	gtc	ata	gat	960
Lys	Phe	Ile	Pro	Val	Ile	Asp
	315					320
gtt	cag	ctc	cag	aag	ggc	aac	100·
Val	Gin	Leu	Gin	Lys	Gly	Asn
330					335
gct	aac	gcc	gac	gaa	ggg	act	105
Ala	Asn	Ala	Asp	Glu	Gly	Thr
				350
gat	gct	gag	ttt	ege	gag	eta	110
Asp	Ala	Glu	Phe	Arg	Glu	Leu

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

355 360 365

gtc	aaa	ggt	tgg	ggc	etc	aac	aac	get
Val	Lys	Gly	Trp	Gly	Leu	Asn	Asn	Ala
	370					375
eta	tac	cca	gac	att	cct	cag	ata	gga
Leu	Tyr	Pro	Asp	Ile	Pro	Gin	Ile	Gly
385					390
agg	cca	ccg	tcc	gga	tat	gga	aat	caa
Arg	Pro	Pro	Ser	Gly	Tyr	Gly	Asn	Gin
				405
cag	ggt	gat	gtt	aac	atc	cat	gee	gca
Gin	Gly	Asp	Va1	Asn	Ile	His	Ala	Ala
			420					425
tgg	tea	tcc	ege	aat	atc	tea	gta	tat
Trp	Ser	Ser	Arg	Asn	Ile	Ser	Val	Tyr
		435					440
age	cet	gga	tat	ggc	ccc	tet	get	ggt
Ser	Pro	Gly	Tyr	Gly	Pro	Ser	Ala	Gly
	450					455
ggt	act	gat	att	ccg	tac	gtt	ttc	tat
Gly	Thr	Asp	Ile	Pro	Tyr	Val	Phe	Tyr
465					470
gac	teg	aac	aac	aag	tcc	ata	gaa	age
Asp	Ser	Asn	Asn	Lys	Ser	Ile	Glu	Ser
				485
atg	age	aaa	att	atg	tea	aga	atg	tgg
Met	Ser	Lys	Ile	Met	Ser	Arg	Met	Trp
			500					505
gac	cca	aat	cat	tet	gga	ggt	atg	gtc
Asp	Pro	Asn	His	Ser	Gly	Gly	Met	Val
		515					520
gcg	caa	tgt	cag	acc	ega	get	gaa	tea
Ala	Gin	Cys	Gin	Thr	Arg	Ala	Glu	Ser
	530					535
gtt	cag	tgg	ccg	cca	tac	aat	atc	gat
Val	Gin	Trp	Pro	Pro	Tyr	Asn	Ile	Asp
545					550
gat	acc	gat	gtc	acg	aac	etc	aca	tat
Asp	Thr	Asp	Val	Thr	Asn	Leu	Thr	Tyr
				565
gee	cac	tgg	tgg	taa
Ala	His	Trp	Trp
			580

acc	acg	gat	atc	ttg	gag	gee	1152
Thr	Thr	Asp	Ile	Leu	Glu	Ala
		380
atc	ccc	gee	ata	atg	gtt	gga	1200
Ile	Pro	Ala	Ile	Met	Val	Gly
	395					400
tac	aag	cgt	gtg	gee	gca	ttt	1248
Tyr	Lys	Arg	Val	Ala	Ala	Phe
410					415
cgt	agg	ttg	acc	agt	cag	atc	1296
Arg	Arg	Leu	Thr	Ser	Gin	Ile
				430
age	tac	atg	ttt	gac	gtt	atc	1344
Ser	Tyr	Met	Phe	Asp	Val	Ile
			445
tcc	tat	get	ggg	get	act	cat	1392
Ser	Tyr	Ala	Gly	Ala	Thr	His
		460
aat	ctg	gat	ggc	ctg	ggg	tat	1440
Asn	Leu	Asp	Gly	Leu	Gly	Tyr
	475					480
ata	cct	aac	agt	tat	tcc	ege	1488
Ile	Pro	Asn	Ser	Tyr	Ser	Arg
490					495
gtc	agt	ttt	gtg	aca	aca	ttg	1536
Val	Ser	Phe	Val	Thr	Thr	Leu
				510
cca	cat	ccc	att	cct	atg	att	1584
Pro	His	Pro	Ile	Pro	Met	Ile
			525
act	atc	ttc	tta	gga	act	aat	1632
Thr	Ile	Phe	Leu	Gly	Thr	Asn
		540
aat	ccg	gag	ata	atc	ttt	ttc	1680
Asn	Pro	Glu	Ile	Ile	Phe	Phe
	555					560
act	tgg	ccc	gca	ggt	ctt	tac	1728
Thr	Trp	Pro	Ala	Gly	Leu	Tyr
570					575
							1743

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt <210> 6 <211> 580 <212> PRT <213> Aspergi11 us niger <400> 6

Met	Phe	Val	Ser	Ser	Leu	Ala	Leu
1				5
Ala	Ile	Ala	Val	Lys	Ile	Glu	Gin
			20
Ala	Thr	Val	Arg	Asn	Gly	Thr	Tyr
		35					40
Asn	Gin	Asp	Leu	Phe	Leu	Gly	Ile
	50					55
Asp	Leu	Arg	Leu	Arg	Thr	Pro	Arg
65					70
Pro	Arg	Asn	Ala	Thr	Glu	Tyr	Ser
				85
Thr	Glu	Gly	Ala	Ser	Glu	Ala	Cys
			100
Ala	Ser	Ile	Ala	Leu	Ser	Glu	Ser
		115					120
Gly	Gly	Gly	Phe	Thr	Ser	Gly	Ser
	130					135
Ser	Phe	Ile	Val	Asp	Gin	Ser	Val
145					150
Va1	Ser	Leu	Asn	Tyr	Arg	Leu	Gin
				165
Glu	Met	Lys	Glu	Ala	Gly	Val	Gly
			180
Leu	Ala	Leu	His	Trp	Ile	Gin	Glu
		195					200
Pro	Ala	Gin	Val	Thr	Ile	Trp	Gly
	210					215
Gly	Thr	His	Leu	Val	Ala	Tyr	Gly
225					230
Ala	Al a	Ile	Ser	Glu	Ser	Gly	Ala
				245
Thr	Pro	Ala	Glu	Trp	Gin	Pro	Tyr

260

Gly Cys Ser Ser Ala Thr Asp Thr 275 280

Thr Asn Ile Leu H1s Gly Ile Phe

Leu	Ala	Leu	Ile	Ala	Pro	Leu	Ile
	10					15
Pro	Gly	Ile	Asn	Pro	Asn	Pro	Thr
25					30
Tyr	Gly	Leu	His	Asn	Gin	His	Tyr
				45
Pro	Tyr	Ala	Gin	Gin	Pro	Ile	Gly
			60
Ser	Met	Asn	Thr	Ser	Trp	Pro	Val
		75					80
Pro	Ala	Cys	Val	Gly	Phe	Asn	Gin
	90					95
Leu	Thr	Leu	Asn	Val	Val	Arg	Pro
105					110
Leu	Pro	Val	Ala	Val	Trp	Ile	His
				125
Ser	Ser	Glu	Lys	Gin	Tyr	Asn	Leu
			140
Gin	Met	Glu	Lys	Pro	Val	Ile	Ala
		155					160
Cys	Trp	Gly	Phe	Met	Trp	Ser	Lys
	170					175
Asn	Leu	Gly	Leu	Arg	Asp	G1 n	Arg
185					190
Asn	Ile	Ala	Ala	Phe	Gly	Gly	Asp
				205
Glu	Ser	Ala	Gly	Ala	Asn	Ser	Val
			220
Gly	Arg	Asp	Asp	Gly	Ile	Phe	Arg
		235					240
Pro	Ser	Val	Tyr	Gin	Arg	Tyr	Pro
	250					255
Tyr	Asp	Gly	Ile	Val	Asn	Ala	Ser
265					270
Leu	Ala	Cys	Leu	Arg	Thr	Ile	Pro
				285
Asp	Asn	Thr	Ser	Ile	Val	Pro	Met

PL 214 792 B1

290 295

His	Ala	Ile	Ser	Gly	Leu	Ser	Gly
305					310
Asp	Asp	Phe	Ile	Lys	Glu	Ser	Ala
				325
Phe	Val	Lys	Val	Pro	Tyr	Leu	Ile
			340
Ala	Phe	Ala	Val	Glu	Gly	Val	Asn
		355					360
Val	Lys	Gly	Trp	Gly	Leu	Asn	Asn
	370					375
Leu	Tyr	Pro	Asp	Ile	Pro	Gin	Ile
385					390
Arg	Pro	Pro	Ser	Gly	Tyr	Gly	Asn
				405
Gin	Gly	Asp	Val	Asn	Ile	His	Ala
			420
Trp	Ser	Ser	Arg	Asn	Ile	Ser	Val
		435					440
Ser	Pro	Gly	Tyr	Gly	Pro	Ser	Ala
	450					455
Gly	Thr	Asp	Ile	Pro	Tyr	Val	Phe
465					470
Asp	Ser	Asn	Asn	Lys	Ser	Ile	Glu
				485
Met	Ser	Lys	Ile	Met	Ser	Arg	Met
			500
Asp	Pro	Asn	His	Ser	Gly	Gly	Met
		515					520
Ala	Gin	Cys	Gin	Thr	Arg	Ala	Glu
	530					535
Val	Gin	Trp	Pro	Pro	Tyr	Asn	Ile
545					550
Asp	Thr	Asp	Val	Thr	Asn	Leu	Thr
				565
Ala	His	Trp	Trp

580

210	78W0	.ST21	5.txt
			300
Ala	Lys	Phe	Ile	Pro	Val	Ile	Asp
		315					320
Thr	Val	Gin	Leu	Gin	Lys	Gly	Asn
	330					335
Gly	Ala	Asn	Ala	Asp	Glu	Gly	Thr
345					350
Thr	Asp	Ala	Glu	Phe	Arg	Glu	Leu
				365
Ala	Thr	Thr	Asp	Ile	Leu	Glu	Ala
			380
Gly	Ile	Pro	Ala	Ile	Met	Val	Gly
		395					400
Gin	Tyr	Lys	Arg	Val	Ala	Ala	Phe
	410					415
Ala	Arg	Arg	Leu	Thr	Ser	Gin	Ile
425					430
Tyr	Ser	Tyr	Met	Phe	Asp	Val	Ile
				445
Gly	Ser	Tyr	Ala	Gly	Ala	Thr	His
			460
Tyr	Asn	Leu	Asp	Gly	Leu	Gly	Tyr
		475					480
Ser	Ile	Pro	Asn	Ser	Tyr	Ser	Arg
	490					495
Trp	Val	Ser	Phe	Val	Thr	Thr	Leu
505					510
Val	Pro	His	Pro	Ile	Pro	Met	Ile
				525
Ser	Thr	Ile	Phe	Leu	Gly	Thr	Asn
			540
Asp	Asn	Pro	Glu	Ile	Ile	Phe	Phe
		555					560
Tyr	Thr	Trp	Pro	Ala	Gly	Leu	Tyr
	570					575

<210> 7 <211> 2759 <212> DNA <213> Aspergillus niger

PL 214 792 B1

2107SW0.ST25.txt <400> 7 gtgaacaatg attagacttg gagaacgtgg tctccgattg gaagtggact atctatttaa 60 tagtattgcc aaggctttct gatcggcaaa catattgtcc tcccgtggtg actggtttct 120 cgcctgatgt gaatagtgat tatcaattta tacccttcgt cagcactgat tgaataagaa 180 cttacctcac attgccctca tttctatgct ggaaccatgc acctattttt aagccatccg 240 gccgatctta ctcacggtat gggctgactt tgtatcacaa cccatacctg tcgaccgtct 300 aaagtggggt cagtgacaag catgatgccg gtcagcatca tcagctcaac aaattctagc 360 caacaacgga gatcagtggt ccgacatttg atgtagaatt aaacccgcac acgtcggaat 420 ggcttcattc tcggtcttag tttcccaatc gaagctggtt cagcgcccag acgcggagcg 480 tgggggtggg accccggatt ttcccccaca accttggctg tggttggcac tttttcatta 540 gcctccatcc tgtgcgcaga tactagagaa ctctacatca tgccatcgag gtttgttagt 600 tagatttgtt aactagctga gcggtgtagg tgcatgccgt acggtgagtt tgtctatctt 660 ttgtatagcc ggaagccgaa ggtaccccgc gtcatggcta tataaggctt gtatatccca 720 tgctctggta gatgggacaa caagaacggc gatccgatag aatcatggtg cagggtgtgg 780 cttttggact gctcgggctg gctgcctctg ctttgggcac ttatgcgccc tactacgcga 840 atttgacatg ggagcaacca cggactctgt ccaactggtc caaccttacc gtcgagacac 900 ggacagggac gttcattggt atgctcaatg acacttaccc agacgttcga cagtttctgc 960 gagttcctta tgccaaggta attctctcgc tgtacacatg tcatactgtg tctgacatga 1020 ccagcctcct attggggatt taagatggct tcctcctcat cggcttgaca actcaagcag 1080 aacatatgac tccaccttct atggcccagg taagtagtct tccatacaac tatgagcagt 1140 tccaattaac ccgagttcag cctgtccgca gtatgttcca gcagagagcg atttttggaa 1200 tgaatatgaa ccggagaatt tgctgctcaa tgtcggcgaa aggctcaacc agggctctac 1260 ggcatggtcc tcgtcagagg attgcctgtc cctagcggta tggactccat cgtatgctaa 1320 tgagacatcc aagctgccag ttgcgctgtt tgtcacggga ggtggtggca tcacaggggg 1380 tatcaacatt ccgtcccagc tgccctctgc ttgggtatct cgctctcagg agcatatcgt 1440 tgttaccatc aattaccgcg tcaatatttt tggcagtaag tatttgctct atatttgcaa 1500 atattagcct gacatgtata gatcccaaat cgcgtgcgtt gaatgatacg tcgcttacgc 1560 tgatggacgt gcgcgctgct gtggagtggg tatatgagaa cattgaagcg ttcggtggta 1620 atcccgaaaa tattatggtc agactacaag tttcctctca catgactaga gctaacagta 1680 agcagctatg gggacagtca caaggtgctt tgctgacgca tctgtacacc ctcgcatggc 1740 cagaagagcc tcttgccgcc aagttcggcg tcatctccca aggagcatct gccacactca 1800 acctctctac cacgcccgat gtgtaccaag actttgacat cgtggccaag ggactaggct 1860 gcaattatgg tgatgatgcc gaggccgagc tggagtgcat gcgtgggatt tcctgggtgc 1920 agatcgagga gtatatcaac cgctacaata gctctccttc tattgctttc acgaactata 1980 ttcgtatgta cccatcttgc tcttttaact gcccctacta acaatatcag ccgatgagaa 2040 atacatcttc tccgacgaaa gacagcgtta ccttgagcgg aaggttgccc gaggcccgtc 2100 aattcgatct gacacggcgc gagaattccc tagcacaaac acgacctcag taaatattga 2160 agaaggcgaa tcagactgtc tggcagtgac tgaccttgcg ctacgtgcgt ccsttgggct 2220 cgagacctat cgctactact gggctggtat gtccaatgac tttccatact gaagatagtg 2280 ctaacataaa caggcaactt ctccaatatc agtcccgtac cgtggctagg agcattccac 2340 tggaccgacc tgctgatgat cttcggtacg tataatctgg acgtcggcga gatctcgcag 2400 ttggaagtcg acacctctgc cacgatgcaa gattatctac tcgcctttct gaaggactca 2460 tcaaccgtca gcgagacggt cggatggccg ttatatctgg gcaacgagac caacggagga 2520 ctcatcctgg agttcggtaa cggcacagca gtgcggacca tcacaggtga ctggctcgac 2580

PL 214 792 B1

21Q78W0.ST25.txt gcgggatgtt tcaattcatc tatcccattc agaatctggg ggtagcctat acacaccatc 2640 atcagagtag tatatacatc atatccacaa atccatctcc acctatatac ataaacccca 2700 actgaatcta caacagcgcc tggtccttct tcccctcccc ctctttaatt tccctcgcct 2760 tctccccat 2769 <210> 8 <211> 1623 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1623) <400> 8 atg gtg cag ggt gtg gct ttt gga ctg

Met	Val	Gin	Gly	Val	Ala	Phe	Gly	Leu
1				5
ttg	ggc	act	tat	gcg	ccc	tac	tac	gcg
Leu	Gly	Thr	Tyr	Ala	Pro	Tyr	Tyr	Ala
			20					25
cgg	act	ctg	tcc	aac	tgg	tcc	aac	ctt
Arg	Thr	Leu	Ser	Asn	Trp	Ser	Asn	Leu
		35					40
acg	ttc	att	ggt	atg	ctc	aat	gac	act
Thr	Phe	Ile	Gly	Met	Leu	Asn	Asp	Thr
	50					55
ctg	ega	gtt	cct	tat	gee	aag	cct	cct
Leu	Arg	Val	Pro	Tyr	Ala	Lys	Pro	Pro
65					70
cct	cct	cat	cgg	ctt	gac	aac	tea	age
Pro	Pro	His	Arg	Leu	Asp	Asn	Ser	Ser
				85
tat	ggc	cca	gee	tgt	ccg	cag	tat	gtt
Tyr	Gly	Pro	Ala	Cys	Pro	Gin	Tyr	Val
			100					105
aat	gaa	tat	gaa	ccg	gag	aat	ttg	ctg
Asn	G1 u	Tyr	Glu	Pro	Glu	Asn	Leu	Leu
		115					120
aac	cag	ggc	tet	acg	gca	tgg	tcc	tcg
Asn	Gin	Gly	Ser	Thr	Ala	Trp	Ser	Ser
	130					135

gcg gta tgg act cca tcg tat gct aat

ctc	ggg	ctg	gct	gee	tet	gct	48
Leu	Gly	Leu	Ala	Ala	Ser	Ala
10					15
aat	ttg	aca	tgg	gag	caa	cca	96
Asn	Leu	Thr	Trp	Glu	Gin	Pro
				30
acc	gtc	gag	aca	cgg	aca	ggg	144
Thr	Val	Glu	Thr	Arg	Thr	Gly
			45
tac	cca	gac	gtt	ega	cag	ttt	192
Tyr	Pro	Asp	Val	Arg	Gin	Phe
		60
att	ggg	gat	tta	aga	tgg	ctt	240

Ile Gly Asp Leu Arg Trp Leu 75 80

aga	aca	tat	gac	tcc	acc	ttc	288
Arg	Thr	Tyr	Asp	Ser	Thr	Phe
90					95
cca	gca	gag	age	gat	ttt	tgg	336
Pro	Ala	Glu	Ser	Asp	Phe	Trp
				110
ctc	aat	gtc	ggc	gaa	agg	ctc	384
Leu	Asn	Val	Gly	Glu	Arg	Leu
			125
tea	gag	gat.	tgc	ctg	tcc	eta	432
Ser	Glu	Asp	Cys	Leu	Ser	Leu
		140
gag	aca	tcc	aag	ctg	cca	gtt	480

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt

Ala

Val

Trp Thr

Pro

Ser

Tyr

Ala

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Leu

Pro

Val

145

150

155

160

gcg

ctg

ttt gtc

acg

gga

ggt

ggc

atc

aca

ggg

ggt

atc

aac

att

528

Ala

Leu

Phe Val

Thr

Gly

Ile

Thr

Gly

Ile

Asn

Ile

165

170

175

ccg

tcc

cag ctg

ccc

tct

gct

tgg

gta

tct

cgc

tct

cag

gag

cat

atc

576

Pro Ser Gin Leu Pro Ser Ala Trp Val Ser Arg Ser Gin Glu His Ile 180 185 190 gtt gtt acc atc aat tac cgc gtc aat att ttt ggc aat ccc aaa teg 624

Val Val Thr Ile Asn Tyr Arg Val Asn Ile Phe Gly Asn Pro Lys Ser

195 200 205 cgt gcg ttg aat gat acg teg ctt acg ctg atg gac gtg cgc gct gct 672

Arg

Ala

Leu

Asn

Asp

Thr

Ser

Leu

Thr

Leu

Met

Asp

Val

Arg

Ala

210

215

220

gtg

gag

tgg

gta

tat

gag

aac

att

gaa

gcg

ttc

ggt

aat

ccc

gaa

720

Val

Glu

Trp

Val

Tyr

Glu

Asn

Ile

Glu

Ala

Phe

Gly

Asn

Pro

G1 u

225

230

235

240

aat

att

atg

gtc

aga

eta

caa

gtt

tcc

tct

cac

atg

act

aga

gct

aac

768

Asn

Ile

Met

Val

Arg

Leu

Gin

Val

Ser

His

Met

Thr

Arg

Ala

Asn

245

250

255

agt

aag

cag

eta

tgg

gga

cag

tea

caa

ggt

gct

ttg

ctg

acg

cat

ctg

816

Ser

Lys

Gin

Leu

Trp

Gly

Gin

Ser

Gin

Gly

Ala

Leu

Thr

His

Leu

260

265

270

tac

acc

ctc

gca

tgg

cca

gaa

gag

cct

ctt

gcc

aag

ttc

ggc

gtc

864

Tyr Thr Leu Ala Trp Pro Glu GTu Pro Leu Ala Ala Lys Phe Gly Val 275 280 285 atc tcc caa gga gca tct gcc aca ctc aac ctc tct acc acg ccc gat 912

Ile Ser Gin Gly Ala Ser Ala Thr Leu Asn Leu Ser Thr Thr Pro Asp

290 295 300 gtg tac caa gac ttt gac atc gtg gcc aag gga eta ggc tgc aat tat 960

Val Tyr Gin Asp Phe Asp Ile Va1 Ala Lys Gly Leu Gly Cys Asn Tyr

305 310 315 320 ggt gat gat gcc gag gcc gag ctg gag tgc atg cgt ggg att tcc tgg 1008

Gly Asp Asp Ala Glu Ala Glu Leu Glu Cys Met Arg Gly Ile Ser Trp

325 330 335

gtg

cag

atc

gag

tat atc

aac

cgc

tac

aat

agc

tct

cct

tct

att

1056

Val

Gin

Ile

Glu

Tyr Ile

Asn

Arg

Tyr

Asn

Ser

Pro

Ser

Ile

340

345

350

gct

ttc

acg

aac

tat

att ccc

gat

gag

aaa

tac

atc

ttc

tcc

gac

gaa

1104

Ala

Phe

Thr

Asn

Tyr

Ile Pro

Asp

Glu

Lys

Tyr

Ile

Phe

Ser

Asp

Glu

355

360

365

aga

cag

cgt

tac

ctt

gag cgg

aag

gtt

gcc

ega

ggc

ccg

tea

att

ega

1152

Arg

Gin

Arg

Tyr

Leu

Glu Arg

Lys

Val

Ala

Arg

Qiy

Pro

Ser

Ile

Arg

370

375

380

PL 214 792 B1 tct gac acg gcg ega gaa ttc cct age Ser Asp Thr Ala Arg Glu Phe Pro Ser 385 390

att	gaa	gaa	ggc	gaa	tea	gac	tgt	ctg
Ile	Glu	Glu	Gly	Glu	Ser	Asp	Cys	Leu
				405
cgt	gcg	tcc	att	ggg	ctc	gag	acc	tat
Arg	Ala	Ser	Ile	Gly	Leu	Glu	Thr	Tyr
			420					425
ttc	tcc	aat	atc	agt	ccc	gta	ccg	tgg
Phe	Ser	Asn	Ile	Ser	Pro	Val	Pro	Trp
		435					440
gac	ctg	ctg	atg	atc	ttc	ggt	acg	tat
Asp	Leu	Leu	Met	Ile	Phe	Gly	Thr	Tyr
	450					455
teg	cag	ttg	gaa	gtc	gac	acc	tct	gcc
Ser	Gin	Leu	Glu	Val	Asp	Thr	Ser	Ala
465					470
gcc	ttt	ctg	aag	gac	tea	tea	acc	gtc
Ala	Phe	Leu	Lys	Asp	Ser	Ser	Thr	Val
				485
tta	tat	ctg	ggc	aac	gag	acc	aac	gga
Leu	Tyr	Leu	Gly	Asn	Glu	Thr	Asn	Gly
			500					505
aac	ggc	aca	gca	gtg	cgg	acc	atc	aca
Asn	Gly	Thr	Ala	Val	Arg	Thr	Ile	Thr
		515					520
tgt	ttc	aat	tea	tct	atc	cca	ttc	aga
Cys	Phe	Asn	Ser	Ser	Ile	Pro	Phe	Arg
	530					535

21078Wu.ST25.txt

aca	aac	acg	acc	tea	gta	aat	1200
Thr	Asn	Thr	Thr	Ser	Val	Asn
	395					400
gca	gtg	act	gac	ctt	gcg	eta	1248
Ala	Val	Thr	Asp	Leu	Ala	Leu
410					415
ege	tac	tac	tgg	gct	ggc	aac	1296
Arg	Tyr	Tyr	Trp	Ala	Gly	Asn
				430
eta	gga	gca	ttc	cac	tgg	acc	1344
Leu	Gly	Ala	Phe	His	Trp	Thr
			<445
aat	ctg	gac	gtc	ggc	gag	atc	1392
Asn	Leu	Asp	Val	Gly	Glu	Ile
		460
acg	atg	caa	gat	tat	eta	ctc	1440
Thr	Met	Gin	Asp	Tyr	Leu	Leu
	475					480
age	gag	acg	gtc	gga	tgg	ccg	1488
Ser	Glu	Thr	Val	Gly	Trp	Pro
490					495
gga	ctc	atc	ctg	gag	ttc	ggt	1536
Gly	Leu	Ile	Leu	Glu	Phe	Gly
				510
ggt	gac	tgg	ctc	gac	gcg	gga	1584
Gly	Asp	Trp	Leu	Asp	Ala	Gly

525 atc tgg ggg tag 1623

Ile Trp Gly

540 <210> 9 <211> 540 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 9

Met Val Gin Gly Val Ala Phe Gly Leu Leu Gly Leu Ala Ala Ser Ala 15 10 15

Leu Gly Thr Tyr Ala Pro Tyr Tyr Ala Asn Leu Thr Trp Glu Gin Pro

25 30

Arg Thr Leu Ser Asn Trp Ser Asn Leu Thr Val Glu Thr Arg Thr Gly

40 45

PL 214 792 B1

2101

78WO

.ST2J

3.txt

Thr

Phe

Ile

Gly

Met

Leu

Asn

Asp

Thr

Tyr

Pro

Asp

Yal

Arg

Gin

Phe

50

55

60

Leu

Arg

Val

Pro

Tyr

Ala

Lys

Pro

Ile

Gly

Asp

Leu

Arg

Trp

Leu

65

70

75

80

Pro

His

Arg

Leu

Asp

Asn

Ser

Arg

Thr

Tyr

Asp

Ser

Thr

Phe

85

90

95

Tyr

Gly

Pro

Ala

Cys

Pro

Gin

Tyr

Yal

Pro

Ala

G1 u

Ser

Asp

Phe

Trp

100

105

110

Asn

Glu

Tyr

Glu

Pro

Glu

Asn

Leu

Asn

Yal

Gly

Glu

Arg

Leu

115

120

125

Asn

Gin

Gly

Ser

Thr

Ala

Trp

Ser

Glu

Asp

Cys

Leu

Ser

Leu

130

135

140

Ala

Val

Trp

Thr

Pro

Ser

Tyr

Ala

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Leu

Pro

Yal

145

150

155

160

Ala

Leu

Phe

Val

Thr

Gly

Ile

Thr

Gly

Ile

Asn

Ile

165

170

175

Pro

Ser

Gin

Leu

Pro

Ser

Ala

Trp

Yal

Ser

Arg

Ser

Gin

Glu

His

Ile

180

185

190

Val

Thr

Ile

Asn

Tyr

Arg

Yal

Asn

Ile

Phe

Gly

Asn

Pro

Lys

Ser

195

200

205

Arg

Ala

Leu

Asn

Asp

Thr

Ser

Leu

Thr

Leu

Met

Asp

Yal

Arg

Ala

210

215

220

Val

Glu

Trp

Val

Tyr

Glu

Asn

Ile

Glu

Ala

Phe

Gly

Asn

Pro

Glu

225

230

235

240

Asn

Ile

Met

Yal

Arg

Leu

Gin

Yal

Ser

His

Met

Thr

Arg

Ala

Asn

245

250

255

Ser Lys Gin Leu Trp Gly Gin Ser Gin Gly Ala Leu Leu Thr His Leu 260 265 270

Tyr Thr Leu Ala Trp Pro Glu Glu Pro Leu Ala Ala Lys Phe Gly Val 275 280 285

Ile Ser Gin Gly Ala Ser Ala Thr Leu Asn Leu Ser Thr Thr Pro Asp 290 295 300

Val Tyr Gin Asp Phe Asp Ile Val Ala Lys Gly Leu Gly Cys Asn Tyr

305

310

315

320

Gly

Asp

Ala

Glu

Ala

Glu

Leu

Glu

Cys

Met

Arg

Gly

Ile

Ser

Trp

325

330

335

Yal

Gin

Ile

Glu

Tyr

Ile

Asn

Arg

Tyr

Asn

Ser

Pro

Ser

Ile

340

345

350

Ala

Phe

Thr

Asn

Tyr

Ile

Pro

Asp

Glu

Lys

Tyr

Ile

Phe

Ser

Asp

Glu

355

360

365

Arg

Gin

Arg

Tyr

Leu

Glu

Arg

Lys

Val

Ala

Arg

Gly

Pro

Ser

Ile

Arg

370

375

380

Ser

Asp

Thr

Ala

Arg

Glu

Phe

Pro

Ser

Thr

Asn

Thr

Ser

Yal

Asn

385

390

395

400

PL 214 792 B1

210:

78WO

.ST2!

5.tx‘

t

Ile

Glu

Gly

Glu

Ser

Asp

Cys

Leu

Ala

Val

Thr

Asp

Leu

Ala

Leu

405

410

415

Arg

Ala

Ser

Ile

Gly

Leu

Glu

Thr

Tyr

Arg

Tyr

Trp

Ala

Gly

Asn

420

425

430

Phe

Ser

Asn

Ile

Ser

Pro

Val

Pro

Trp

Leu

Gly

Ala

Phe

His

Trp

Thr

435

440

445

Asp

Leu

Met

Ile

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asn

Leu

Asp

Val

Gly

Glu

Ile

450

455

460

Ser

Gin

Leu

Glu

Val

Asp

Thr

Ser

Ala

Thr

Met

Gin

Asp

Tyr

Leu

465

470

475

480

Al a

Phe

Leu

Lys

Asp

Ser

Thr

Val

Ser

Glu

Thr

Val

Gly

Trp

Pro

485

490

495

Leu

Tyr

Leu

Gly

Asn

Glu

Thr

Asn

Gly

Leu

Ile

Leu

Glu

Phe

Gly

500

505

510

Asn

Gly

Thr

Ala

Val

Arg

Thr

Ile

Thr

Gly

Asp

Trp

Leu

Asp

Ala

Gly

515

520

525

Cys

Phe

Asn

Ser

Ile

Pro

Phe

Arg

Ile

Trp

Gly

530

535

540

<210> 10 <211> 3235 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 10 gttttcaatt tggactgaat tttggcggca tttcttgtat aaaattaaaa ggggcgttga 60 ctggattttg gtacttggga tttattctta gctttgactg tacatagttt gggcgtggtt 120 tgatagccga cgatcggccg acccacgaac cagatttgca tatgattaca ttccttcaat 180 tttggtccga gtcccaaccc gcctttcaac cccaacaact acaagcacgt tgtgtttgct 240 acattgactc actcgatatt gctgaaccat gcaggccgcc caactgagtt attacaceaa 300 gcatgcgaat cggaaagttc gacaaagcgg gtgaaatgtc cgagttggcg aaccaaagcg 360 caacggtcga ggctcctttc cccgcagagg cagccattct gcagcctttg aactgcgggg 420 gaaacggcat ttgatcaact cggcactgat gcagtgacca acaggatgtt agcaatgttg 480 gcctaatata ttcttactga tctgctgata cgtccctccc ttgcatcagc ctcggtttgc 540 gcatgagaac gggttcgaac gttcctgggc cacccggttg gcgtgatatt ctccgcccac 600 gctgtctgtc cccctgatgg gaaaccttcg gatcagcgat catcaggcca gttggctatg 660 agaatagggg ctttgctgtc ttgatgccta aaatgcaggt ctcatagcaa gatccacagc 720 cgaggaggca catggcgatg tcgaaaccca tgggagctga tttttcggtt ctcggatcgt 780 gctccaagac atagaaggat attgagcact tgaaacgaag gggtgaaaaa tggaactgta 840 tatagagtta ctcccagccc gatccgagag cctatgaccc atagcggtac agatcatggc 900 catcatgaag gccctccttt ggctctccct ttccctcgcc gtctgggcga ctccagttca 960 acgggatgca gctcctactg tcactattgc gcatccatcg gccaccgtca ttggaaaatc 1020 tggcaatgtc gagagcttca acaatattcc ctttgcgcag gcccccacag gctcgctgcg 1080

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt tctgaagccc ccacaaccct tggaaactgc cctcggcact gttcaggcca caggagcctc 1140 gcaatcgtgt ccgcagatgt acttcaccac ggatgagagc gaattcccga catcggtcat 1200 tggcctcctc gctgatctcc ctttggtaca gtcggctacc aatgctctcg aggattgcct 1260 gaacattgac attcggcgtc cggccgggac caccgcggac tcgaagctgc ctgtgctggt 1320 ctggatcttt ggcggaggct ttgaacttgg ttcaaaggcg atgtatgatg gtacaacgat 1380 ggtatcatcg tcgatagaca agaacatgcc tatcgtgttt gtagcaatga attatcgcgt 1440 gggeggtttc gggttcttgc ccggaaagga gatcctggag gacgggtccg cgaacctagg 1500 gctcctggac caacgccttg ccctgcagtg ggttgccgac aacatcgagg cctttggtgg 1560 agacccggac aaggtgacga tttggggaga atcagcagga gccatttccg tttttgatca 1620 gatgatcttg tacgacggaa acatcactta caaggataag cccttgttcc ggggggccat 1680 catggactcc ggtagtgttg ttcccgcaga ccccgtcgat ggggtcaagg gacagcaagt 1740 atatgatgcg gtagtggaat ctgcaggctg ttcctcttct aacgacaccc tagettgtct 1800 gcgtgaacta gactacaccg acttcctcaa tgcggcaaac tccgtgccag gcattttaag 1860 ctaccattct gtggcgttat catatgtgcc tcgaccggac gggacggcgt tgtcggcatc 1920 accggacgtt ttgggcaaag cagggaaata tgctcgggtc ccgttcatcg tgggcgacca 1980 agaggatgag gggaccttat tcgccttgtt tcagtccaac attacgacga tcgacgaggt 2040 ggtcgactac ctggcctcat acttcttcta tgacgctagc cgagagcagc ttgaagaact 2100 agtggccctg tacccagaca ccaccacgta cgggtctccg ttcaggacag gcgcggccaa 2160 caactggtat ccgcaattta agcgattggc cgccattctc ggcgscttgg tcttcaccat 2220 tacccggcgg gcattcctct cgtatgcaga ggaaatctcc cctgatcttc cgaactggtc 2280 gtacctggcg acctatgact atggcacccc agttctgggg accttccacg gaagtgacct 2340 gctgcaggtg ttctatggga tcaagccaaa ctatgcagct agttctagcc acacgtacta 2400 tctgagcttt gtgtatacgc tggatccgaa ctccaaccgg ggggagtaca ttgagtggcc 2460 gcagtggaag gaatcgcggc agttgatgaa tttcggagcg aacgacgcca gtctccttac 2520 ggatgatttc cgcaacggga catatgagtt catcctgcag aataccgcgg cgttccacat 2580 ctgatgccat tggcggaggg gtccggacgg tcaggaactt agccttatga gatgaatgat 2640 ggacgtgtct ggcctcggaa aaggatatat ggggatcatg atagtactag ccatattaat 2700 gaagggcata taccacgcgt tggacctgcg ttatagcttc ccgttagtta tagtaccatc 2760 gttataccag ccaatcaagt caccacgcac gaccggggac ggcgaatccc cgggaattga 2820 aagaaattgc atcccaggcc agtgaggcca gcgattggcc acctctccaa ggcacagggc 2880 cattctgcag cgctggtgga ttcatcgcaa tttcccccgg cccggcccga caccgctata 2940 ggctggttct cccacaccat cggagattcg tcgcctaatg tctcgtccgt tcacaagctg 3000 aagagcttga agtggcgaga tgtctctgca ggaattcaag ctagatgcta agcgatattg 3060 catggcaata tgtgttgatg catgtgcttc ttccttcagc ttcccctcgt gcagatgagg 3120 tttggctata aattgaagtg gttggtcggg gttccgtgag gggctgaagt gcttcctccc 3180 ttttagacgc aactgagagc ctgagcttca tccccagcat cattacacct cagca 3235 <210> 11 <21168 i <212> DN4 <213> Aspergillus niger <220>

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt <221> CDS <222> (1)..(1689) <400> 11 atg gcc atc atg aag gcc ctc ctt tgg ctc tcc ctt tcc ctc gcc gtc 48

Met	Ala	Ile	Met	Lys	Ala	Leu	Leu	Trp
1				5
tgg	gcg	act	cca	gtt	caa	cgg	gat	gca
Trp	Ala	Thr	Pro	Val	Gin	Arg	Asp	Ala
			20					25
cat	cca	teg	gcc	acc	gtc	att	gga	aaa
His	Pro	Ser	Ala	Thr	Val	Ile	Gly	Lys
		35					40
aac	aat	att	ccc	ttt	gcg	cag	gcc	ccc
Asn	Asn	Ile	Pro	Phe	Ala	Gin	Ala	Pro
	50					55
ccc	cca	caa	ccc	ttg	gaa	act	gcc	ctc
Pro	Pro	Gin	Pro	Leu	Glu	Thr	Ala	Leu
65					70
gcc	teg	caa	teg	tgt	ccg	cag	atg	tac
Ala	Ser	Gin	Ser	Cys	Pro	Gin	Met	Tyr
				85
ttc	ccg	aca	teg	gtc	att	ggc	ctc	ctc
Phe	Pro	Thr	Ser	Val	Ile	Gly	Leu	Leu
			100					105
teg	get	acc	aat	get	ctc	gag	gat	tgc
Ser	Ala	Thr	Asn	Ala	Leu	Glu	Asp	Cys
		115					120
ccg	gcc	ggg	acc	acc	gcg	gac	teg	aag
Pro	Ala	Gly	Thr	Thr	Ala	Asp	Ser	Lys
	130					135
ttt	ggc	gga	ggc	ttt	gaa	ctt	ggt	tea
Phe	Gly	Gly	Gly	Phe	Glu	Leu	Gly	Ser
145					150
acg	atg	gta	tea	teg	teg	ata	gac	aag
Thr	Met	Val	Ser	Ser	Ser	Ile	Asp	Lys
				165
gca	atg	aat	tat	ege	gtg	gga	ggt	ttc
Ala	Met	Asn	Tyr	Arg	Val	Gly	Gly	Phe
			180					185
atc	ctg	gag	gac	ggg	tcc	gcg	aac	eta
Ile	Leu	Glu	Asp	Gly	Ser	Ala	Asn	Leu
		195					200
gcc	ctg	cag	tgg	gtt	gcc	gac	aac	atc

Leu	Ser	Leu	Ser	Leu	Ala	Val
10					15
get	cct	act	gtc	act	att	gcg	96
Ala	Pro	Thr	Val	Thr	Ile	Ala
				30
tet	ggc	aat	gtc	gag	agc	ttc	144

Ser	Gly	Asn	Val	Glu	Ser	Phe
			45
aca	ggc	teg	ctg	cgt	ctg	aag	192
Thr	Gly	Ser	Leu	Arg	Leu	Lys
		60
ggc	act	gtt	cag	gcc	aca	gga	240
Gly	Thr	Val	Gin	Ala	Thr	Gly
	75					80
ttc	acc	acg	gat	gag	agc	gaa	288
Phe	Thr	Thr	Asp	Glu	Ser	G1 u
90					95
get	gat	ctc	cct	ttg	gta	cag	336
Ala	Asp	Leu	Pro	Leu	Val	Gin
				110
ctg	aac	att	gac	att	cgg	cgt	384
Leu	Asn	Ile	Asp	Ile	Arg	Arg
			125
ctg	cct	gtg	ctg	gtc	tgg	atc	432
Leu	Pro	Val	Leu	Val	Trp	Ile
		140
aag	gcg	atg	tat	gat	ggt	aca	480
Lys	Ala	Met	Tyr	Asp	Gly	Thr
	155					160
aac	atg	cct	atc	gtg	ttt	gta	528
Asn	Met	Pro	Ile	Val	Phe	Val
170					175
ggg	ttc	ttg	ccc	gga	aag	gag	576
Gly	Phe	Leu	Pro	Gly	Lys	Glu
				190
ggg	ctc	ctg	gac	caa	ege	ctt	624
Gly	Leu	Leu	Asp	Gin	Arg	Leu
			205
gag	gcc	ttt	ggt	gga	gac	ccg	672

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Ala

Leu

Gin

Trp

Val

Ala

Asp

Asn

Ile

Glu

Ala

Phe

Gly

Asp

Pro

210

215

220

gac

aag

gtg

acg

att

tgg

gga

gaa

tea

gca

gga

gcc

att

tcc

gtt

ttt

720

Asp

Lys

Val

Thr

Ile

Trp

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Ala

Ile

Ser

Va1

Phe

225

230

235

240

gat

cag

atg

atc

ttg

tac

gac

gga

aac

atc

act

tac

aag

gat

aag

ccc

768

Asp

Gin

Met

Ile

Leu

Tyr

Asp

Gly

Asn

Ile

Thr

Tyr

Lys

Asp

Lys

Pro

245

250

255

ttg

ttc

cgg

ggg

gcc

atc

atg

gac

tcc

ggt

agt

gtt

ccc

gca

gac

816

Leu

Phe

Arg

Gly

Ala

Ile

Met

Asp

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Asp

260

265

270

ccc gtc gat ggg gtc aag gga cag caa gta tat gat gcg gta gtg gaa 864

Pro

Val

Asp

Gly

Val

Lys

Gly

Gin

Val

Tyr

Asp

Ala

Val

Glu

275

280

285

tct

gca

ggc

tgt

tcc

tct

aac

gac

acc

eta

gct

tgt

ctg

cgt

gaa

912

Ser

Ala

Gly

Cys

Ser

Asn

Asp

Thr

Leu

Ala

Cys

Leu

Arg

Glu

290

295

300

eta

gac

tac

acc

gac

ttc

ctc

aat

gcg

gca

aac

tcc

gtg

cca

ggc

att

960

Leu

Asp

Tyr

Thr

Asp

Phe

Leu

Asn

Ala

Asn

Ser

Val

Pro

Gly

Ile

305

310

315

320

tta

agc

tac

cat

tct

gtg

gcg

tta

tea

tat

gtg

cct

CCf3

ccg

gac

ggg

1008

Leu

Ser

Tyr

His

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Tyr

Val

Pro

Arg

Pro

Asp

Gly

325

330

335

acg

gcg

ttg

teg

gca

tea

ccg

gac

gtt

ttg

ggc

aaa

gca

ggg

aaa

tat

1056

Thr

Ala

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Val

Leu

Gly

Lys

Ala

Gly

Lys

Tyr

340

345

350

gct

cgg

gtc

ccg

ttc

atc

gtg

ggc

gac

caa

gag

gat

gag

ggg

acc

tta

1104

Ala

Arg

Val

Pro

Phe

Ile

Val

Gly

Asp

Gin

Glu

Asp

Glu

Gly

Thr

Leu

355

360

365

ttc

gcc

ttg

ttt

cag

tcc

aac

att

acg

atc

gac

gag

gtg

gtc

gac

1152

Phe

Ala

Leu

Phe

Gin

Ser

Asn

Ile

Thr

Ile

Asp

Glu

Val

Asp

370

375

380

tac

ctg

gcc

tea

tac

ttc

tat

gac

gct

agc

ega

gag

cag

ctt

gaa

1200

Tyr Leu Ala Ser Tyr Phe Phe Tyr Asp Ala Ser Arg Glu Gin Leu Glu

385 390 395 400 gaa eta gtg gcc ctg tac cca gac acc acc acg tac ggg -tct ccg ttc 1248

Glu Leu Val Ala Leu Tyr Pro Asp Thr Thr Thr Tyr Gly Ser Pro Phe

405 410 415 agg aca ggc gcg gcc aac aac tgg tat ccg caa ttt aag ega ttg gcc 1296

Arg Thr Gly Ala Ala Asn Asn Trp Tyr Pro Gin Phe Lys Arg Leu Ala

420 425 430 gcc att ctc ggc gac ttg gtc ttc acc att acc cgg cgg gca ttc ctc 1344

Ala Ile Leu Gly Asp Leu Val Phe Thr Ile Thr Arg Arg Ala Phe Leu

435 440 445

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt tcg tat gca gag gaa atc tcc cct gat ctt ccg aac tgg tcg tac ctg 1392

Ser Tyr Ala Glu Glu Ile Ser Pro Asp Leu Pro Asn Trp Ser Tyr Leu

450

455

460

gcg

acc

tat

gac

tat

ggc

acc

cca

gtt

ctg

ggg

acc

ttc

cac

gga

agt

1440

Ala

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

Thr

Pro

Yal

Leu

Gly

Thr

Phe

His

Gly

Ser

465

470

475

480

gac

ctg

cag

gtg

ttc

tat

ggg

atc

aag

cca

aac

tat

gca

get

agt

1488

Asp

Leu

Gin

Yal

Phe

Tyr

Gly

Ile

Lys

Pro

Asn

Tyr

Ala

Ser

485

490

495

tet

age

cac

acg

tac

tat

ctg

age

ttt

gtg

tat

acg

ctg

gat

ccg

aac

1536

Ser

His

Thr

Tyr

Leu

Ser

Phe

Val

Tyr

Thr

Leu

Asp

Pro

Asn

500

505

510

tcc

aac

cgg

ggg

gag

tac

att

gag

tgg

ccg

cag

tgg

aag

gaa

tcg

cgg

1584

Ser

Asn

Arg

Gly

Glu

Tyr

Ile

Glu

Trp

Pro

Gin

Trp

Lys

Glu

Ser

Arg

'515

520

525

cag

ttg

atg

aat

ttc

gga

gcg

aac

gac

gee

agt

ctc

ctt

acg

gat

1632

Gin

Leu

Met

Asn

Phe

Gly

Ala

Asn

Asp

Ala

Ser

Leu

Thr

Asp

530

535

540

ttc

ege

aac

ggg

aca

tat

gag

ttc

atc

ctg

cag

aat

acc

gcg

ttc

1680

Phe Arg Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Ile Leu Gin Asn Thr Ala Ala Phe

545 550 555 560 cac atc tga 1689

His Ile <210> 12 <211> 562 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 12

Met Ala Ile Met Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ser Leu Ser Leu Ala Val 15 10 15

Trp Ala Thr Pro Yal Gin Arg Asp Ala Ala Pro Thr Val Thr Ile Ala

25 30

His Pro Ser Ala Thr Yal Ile Gly Lys Ser Gly Asn Val Glu Ser Phe

35

40

45

Asn

Ile

Pro

Phe

Ala

Gin

Ala

Pro

Thr

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Lys

50

55

60

Pro

Gin

Pro

Leu

Glu

Thr

Ala

Leu

Gly

Thr

Val

Gin

Ala

Thr

Gly

65

70

75

80

Ala

Ser

Gin

Ser

Cys

Pro

Gin

Met

Tyr

Phe

Thr

Asp

Glu

Ser

Glu

85

90

95

Phe

Pro

Thr

Ser

Yal

Ile

Gly

Leu

Ala

Asp

Leu

Pro

Leu

Yal

Gin

PL 214 792 B1

100

Ser	Ala	Thr	Asn	Ala	Leu	Glu	Asp
		115					120
Pro	Ala	Gly	Thr	Thr	Ala	Asp	Ser
	130					135
Phe	Gly	Gly	Gly	Phe	Glu	Leu	Gly
145					150
Thr	Met	Val	Ser	Ser	Ser	Ile	Asp
				165
Ala	Met	Asn	Tyr	Arg	Val	Gly	Gly
			180
Ile	Leu	Glu	Asp	Gly	Ser	Ala	Asn
		195					200
Ala	Leu	Gin	Trp	Val	Ala	Asp	Asn
	210					215
Asp	Lys	Val	Thr	Ile	Trp	Gly	Glu
225					230
Asp	Gin	Met	Ile	Leu	Tyr	Asp	Gly
				245
Leu	Phe	Arg	Gly	Ala	Ile	Met	Asp
			260
Pro	Val	Asp	Gly	Val	Lys	Gly	Gin
		275					280
Ser	Ala	Gly	Cys	Ser	Ser	Ser	Asn
	290					295
Leu	Asp	Tyr	Thr	Asp	Phe	1—OLJ	Asn
305					310
Leu	Ser	Tyr	His	Ser	Val	Ala	Leu
				325
Thr	Ala	Leu	Ser	Ala	Ser	Pro	Asp
			340
Ala	Arg	Val	Pro	Phe	Ile	Val	Gly
		355					360
Phe	Ala	Leu	Phe	Gin	Ser	Asn	Ile
	370					375
Tyr	Leu	Ala	Ser	Tyr	Phe	Phe	Tyr
385					390
Glu	Leu	Val	Ala	Leu	Tyr	Pro	Asp
				405
Arg	Thr	Giy	Ala	Ala	Asn	Asn	Trp
			420
Ala	Ile	Leu	Gly	Asp	Leu	Val	Phe
		435					440
Ser	Tyr	Ala	Glu	Glu	Ile	Ser	Pro

21078WO.ST25.txt

105 110

Cys	Leu	Asn	Ile	Asp	Ile	Arg	Arg
				125
Lys	Leu	Pro	Val	Leu	Val	Trp	Ile
			140
Ser	Lys	Ala	Met	Tyr	Asp	Gly	Thr
		155					160
Lys	Asn	Met	Pro	Ile	Val	Phe	Val
	170					175
Phe	Gly	Phe	Leu	Pro	Gly	Lys	Glu
185					190
Leu	Gly	Leu	Leu	Asp	Gin	Arg	Leu
				205
Ile	Glu	Ala	Phe	Gly	Gly	Asp	Pro
			220
Ser	Ala	Gly	Ala	Ile	Ser	Val	Phe
		235					240
Asn	Ile	Thr	Tyr	Lys	Asp	Lys	Pro
	250					255
Ser	Gly	Ser	Val	Val	Pro	Ala	Asp
265					270
Gin	Val	Tyr	Asp	Ala	Val	Val	Glu
				285
Asp	Thr	Leu	Ala	Cys	Leu	Arg	Glu
			300
Ala	Ala	Asn	Ser	Val	Pro	Gly	Ile
		315					320
Ser	Tyr	Val	Pro	Arg	Pro	Asp	Gly
	330					335
Val	Leu	Gly	Lys	Ala	Gly	Lys	Tyr
345					350
Asp	Gin	Glu	Asp	Glu	Gly	Thr	Leu
				365
Thr	Thr	Ile	Asp	Glu	Val	Va1	Asp
			380
Asp	Ala	Ser	Arg	Glu	Gin	Leu	Glu
		395					400
Thr	Thr	Thr	Tyr	Gly	Ser	Pro	Phe
	410					415
Tyr	Pro	Gin	Phe	Lys	Arg	Leu	Al a
425					430
Thr	Ile	Thr	Arg	Arg	Ala	Phe	Leu
				445
Asp	Leu	Pro	Asn	Trp	Ser	Tyr	Leu

PL 214 792 B1

450 455

Ala Thr Tyr Asp Tyr Gly Thr Pro 465 470

Asp Leu Leu Gin Val Phe Tyr Gly

485

Ser Ser His Thr Tyr Tyr Leu Ser 500

Ser Asn Arg Gly Glu Tyr Ile Glu 515 520

Gin Leu Met Asn Phe Gly Ala Asn

530 535

Phe Arg Asn Gly Thr Tyr Glu Phe 545 550

His Ile

21078WO.ST25.txt

460

Val	Leu	Gly	Thr	Phe	His	Gly	Ser
		475					480
Ile	Lys	Pro	Asn	Tyr	Ala	Ala	Ser
	490					495
Phe	Val	Tyr	Thr	Leu	Asp	Pro	Asn
505					510
Trp	Pro	Gin	Trp	Lys	Glu	Ser	Arg
				525
Asp	Ala	Ser	Leu	Leu	Thr	Asp	Asp
			540
Ile	Leu	Gin	Asn	Thr	Ala	Ala	Phe
		555					560

<210> 13 <211> 2097 <212> ONA <213> Aspergillus niger <400> 13 cctggctgac gctataccga agacgatgtc gatgtcgtct ttgctcagag gccccgagtc 60 gtttggggca cgtcaagaaa gtagtcttcg ctgctgcttg aagacatgat caggacacgc 120 ggttcgacct tcgagtgtac atgatatccg tagaatttgc ttgtgactac caaggcatat 180 gttagttcgt gcagtggtaa aagcggcttc tcttcttcaa tctgcgaggt ggagatgcct 240 actatgatcg tcatccaact tggtgtctac aagacgaaca caagcttagt tccgacgaac 300 cagtgaaaac tctgtaagat atataagagc atcaagagtc ggacttgctt aggagagtgg 360 atagttgttg atgctcgcgg aagctctcat atagtataga tatgaagtat cggtgagtcg 420 tagtagtctt tgtattatat agggagaggc tgaatggtgt gggtcatgat aatttccaca 480 taatagcgat taaagcccta gatcgagggt atcttgaggc ataaatgata gtatcagtgg 540 acatatcctg agatgaggat gatatgagat gatagagatg aggaagaaag aggaaagaga 600 gaggcaagaa cagagatttt tatacctttg cagagcagcc catccgtcac tgaattcagg 660 catcttcact ccatactatc acgagtcaac gtgaagttgt ataagcgtag tgacaggccg 720 cagtgacgat gatccgtcac tgcggtggct atccgcgact gatcttgcta tccgtgactg 780 cgttgactct ggtgaaccaa gtgttcggga aggggtgaaa atgaagctga agcgggtcag 840 ggaacattcc aagcaacact agacgagtca gcgacgagtc agcgatccac tcggtctcac 900 acgctcccaa tagtctcaat ttggtgccaa tggcaactaa gtattccatc cacttttaat 960 taaagtgatc agcggtgcac gaattcacat gctggatctg gtacagatca gattaatatc 1020 tcctggaata cgatgaaggc ccacctcagg attcacgata aatttctggt gactgccagc 1080 tcgaatggca ttctccgtca ctctacacct gccgttggtt aattctccga acctctaatt 1140 gtcaatttct gccaaaatgc gtctatcatc gctggccctg gcatccagcg ccatcctacc 1200 cgccttagge tacagcatca acgacttctc ctgcaatagc accgaacacc cgaatccagt 1260 tgtgctccta catgggctag gcgccaccta ctacgaagac ttgaattacc tgcaaggttg 1320

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt gctacagacc caaggctatt gcacttacgc caaaacctac ggtgcatatg aaggcttccc 1380 ctttgtcggc ggcctcaagg ccatcgccga atcggccacg gaaatcgccg cgtacatccg 1440 cgaggtgaaa gaaaagacgg gcgccgacaa gattgacctt gtcggtcact ccgaaggcgc 1500 cttccagacc ctctacgtcc ctaagttcga ggatggtatc tcggagatgc tggataagct 1560 ggtggccatt gcacctccca ccagaggcac caacttggcg gggatctatg acatcgcata 1620 tgttctggga aatctatcgc gcgatctgat aggcgacgtc ctggataccg tgggctgcgc 1680 cgcctgtgat gatctgggtc cggatggagc agcgattgac cgcttgaacg atggcgagcc 1740 tatcgtgcag ccgggaaata atctaacggt gattgcatcg cggtccgacg aattggtcac 1800 cccaaccacc acctccttcg tgcatgaaga tggggtgacc aatgaatggg tgcaagacac 1860 ttgtcctcta gaccctgtcg gtcatatcgg tgaggcatac gatctgaacg tctggaattt 1920 ggtcaaaaac gccttggact ctacgccgaa gcgtgagttc gtctgctcgc tgggatctcc 1980 cggcaggtga gactatcatc ttctgaaaat ttgtatataa gcatttatat ttggataccc 2040 ggttaccagt cattagtgtc ataatgtata ataatatcac cacaacttcc tccaagc 2097 <210> 14 <2Π> 834 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(834) <400> 14

atg

cgt

eta

tea

tcg

ctg

gcc

ctg

gca

tcc age

gcc

atc

eta

ccc

gcc

48

Met

Arg

Leu

Ser

Leu

Ala

Leu

Ala

Ser Ser

Ala

Ile

Leu

Pro

Ala

1

5

10

15

tta

ggc

tac

age

atc

aac

gac

ttc

tcc

tgc aat

age

acc

gaa

cac

ccg

96

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

Asp

Phe

Ser

Cys Asn

Ser

Thr

Glu

His

Pro

20

25

30

aat

cca

gtt

gtg

ctc

eta

cat

ggg

eta

ggc gcc

acc

tac

gaa

gac

144

Asn

Pro

Val

Leu

His

Gly

Leu

Gly Ala

Thr

Tyr

Glu

Asp

35

40

45

ttg

aat

tac

ctg

caa

ggt

tgg

eta

cag

acc caa

ggc

tat

tgc

act

tac

192

Leu

Asn

Tyr

Leu

Gin

Gly

Trp

Leu

Gin

Thr Gin

Gly

Tyr

Cys

Thr

Tyr

50

55

60

gcc

aaa

acc

tac

ggt

gca

tat

gaa

ggc

ttc ccc

ttt

gtc

ggc

ctc

240

Ala

Lys

Thr

Tyr

Gly

Ala

Tyr

Glu

Gly

Phe Pro

Phe

Val

Gly

Leu

65

70

75

80

aag

gcc

atc

gcc

gaa

tcg

gcc

acg

gaa

atc gcc

gcg

tac

atc

ege

gag

288

Lys

Ala

Ile

Ala

Glu

Ser

Ala

Thr

Glu

Ile Ala

Ala

Tyr

Ile

Arg

Glu

85

90

95

gtg

aaa

gaa

aag

acg

ggc

gcc

gac

aag

att gac

ctt

gtc

ggt

cac

tcc

336

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt

Val Lys Glu Lys Thr Gly Ala Asp Lys Ile Asp Leu Yal Gly His Ser 100 105 110

gaa ggc	gcc	ttc	cag	acc	ctc	tac	gtc
Glu Gly	Ala	Phe	Gin	Thr	Leu	Tyr	Val
	115					120
teg gag	atg	ctg	gat	aag	ctg	gtg	gcc
Ser Glu	Met	Leu	Asp	Lys	Leu	Yal	Ala
130					135
acc aac	ttg	gcg	ggg	atc	tat	gac	atc
Thr Asn	Leu	Ala	Gly	Ile	Tyr	Asp	Ile
145				150
teg ege	gat	ctg	ata	ggc	gac	gtc	ctg
Ser Arg	Asp	Leu	Ile	Gly	Asp	Yal	Leu
			165

tgt gat gat ctg ggt ccg gat gga gca

Cys Asp Asp Leu Gly Pro Asp Gly Ala

180 185 ggc gag cct atc gtg cag ccg gga aat

Gly Glu Pro Ile Yal Gin Pro Gly Asn

195 200 cgg tcc gac gaa ttg gtc acc cca acc Arg Ser Asp Glu Leu Val Thr Pro Thr

210 215 gat ggg gtg acc aat gaa tgg gtg caa

Asp Gly Val Thr Asn Glu Trp Val Gin

225 230 gtc ggt cat atc ggt gag gca tac gat

Yal Gly His Ile Gly Glu Ala Tyr Asp

245 aaa aac gcc ttg gac tct acg ccg aag

Lys Asn Ala Leu Asp Ser Thr Pro Lys

260 265 gga tct ccc ggc agg tga

Gly Ser Pro Gly Arg

275 <210> 15 <211> 277 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 15

Met Arg Leu Ser Ser Leu Ala Leu Ala

cct	aag	ttc	gag gat	ggt	atc	384
Pro	Lys	Phe	Glu Asp	Gly	Ile
			125
att	gca	cct	ccc acc	aga	ggc	432
Ile	Ala	Pro	Pro Thr	Arg	Gly
		140
gca	tat	gtt	ctg gga	aat	eta	480
Ala	Tyr	Yal	Leu Gly	Asn	Leu
	155				160
gat	acc	gtg	ggc tgc	gcc	gcc	528
Asp	Thr	Yal	Gly Cys	Ala	Ala
170				175
gcg	att	gac	ege ttg	aac	gat	576
Ala	Ile	Asp	Arg Leu	Asn	Asp
			190
aat	eta	acg	gtg att	gca	teg	624
Asn	Leu	Thr	Val Ile	Ala	Ser
			205
acc	acc	tcc	ttc gtg	cat	gaa	672

Thr Thr Ser Phe Val His Glu 220 gac act tgt cct eta gac cct 720 Asp Thr Cys Pro Leu Asp Pro

235 240 ctg aac gtc tgg aat ttg gtc 768 Leu Asn Yal Trp Asn Leu Yal 250 255 cgt gag ttc gtc tgc teg ctg 816 Arg Glu Phe Val Cys Ser Leu

270

834

Ser Ser Ala Ile Leu Pro Ala

PL 214 792 B1

21078WQ.ST25.txt

5 10 |5

Leu Gly Tyr Ser Ile Asn Asp Phe Ser Cys Asn Ser Thr Glu His Pro

25 30

Asn Pro Val Val Leu Leu His Gly Leu Gly Ala Thr Tyr Tyr Glu Asp

40 45

Leu Asn Tyr Leu Gin Gly Trp Leu Gin Thr Gin Gly Tyr Cys Thr Tyr

55 60

Ala Lys Thr Tyr Gly Ala Tyr Glu Gly Phe Pro Phe Val Gly Gly Leu ⁶⁵ 70 75 80

Lys Ala Ile Ala Glu Ser Ala Thr Glu Ile Ala Ala Tyr Ile Arg Glu

90 95

Val Lys Glu Lys Thr Gly Ala Asp Lys Ile Asp Leu Val Gly His Ser

100 105 110

Glu Gly Ala Phe Gin Thr Leu Tyr Val Pro Lys Phe Glu Asp Gly Ile

115 120 125

Ser Glu Met Leu Asp Lys Leu Val Ala Ile Ala Pro Pro Thr Arg Gly

130 135 140

Thr Asn Leu Ala Gly Ile Tyr Asp Ile Ala Tyr Val Leu Gly Asn Leu

I⁴⁵ 150 155 160

Ser Arg Asp Leu Ile Gly Asp Val Leu Asp Thr Val Gly Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Asp Asp Leu Gly Pro Asp Gly Ala Ala Ile Asp Arg Leu Asn Asp

180 185 190

Gly Glu Pro Ile Val Gin Pro Gly Asn Asn Leu Thr Val Ile Ala Ser

195 200 205

Arg Ser Asp Glu Leu Val Thr Pro Thr Thr Thr Ser Phe Val His Glu

210 215 220

Asp Gly Val Thr Asn Glu Trp Val Gin Asp Thr Cys Pro Leu Asp Pro

225 230 235 240

Val Gly His Ile Gly Glu Ala Tyr-Asp Leu Asn Val Trp Asn Leu Val

246 guu

Lys Asn Ala Leu Asp Ser Thr Pro Lys Arg Glu Phe Val Cys Ser Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Gly Arg

275 <210> 16 <211> 1881 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 16 ccgagtgatc cgcgacttct gggtcagctt tgttetgcgg gctccaccag tgccgtcatc 60

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt gcacgcgaga cccgccccgg atgcttagct gaagccggca tagtccatcc ccgctcgggc 120 gtgatgccca acggtcactg gaggagaggt gcagggagga tgccgttgca tgaatcaagc 180 ccggggtttg actttcatcc gctcgtttcc tactggcggg ttcgccctct ccatcgaagc 240 cacggatcct tccatccgga tcctggcaga acagtgagga agcagagctt ggttatagta 300 gaaattatta ataccgagct ggtctgccca tttttcccaa accttccctc tttccatccc 360 tctcgcctcg cacccccttt atcctccctc ccgccatgta tatcccctcg gtgctgcttc 420 tggccgcgag cctgttccat ggcgcaacgg cgctgcccac gcccggctcc acgcccatcc 480 cgcccagcca ggatccctgg tacagtgcgc ccgagggctt cgaggaggct gatcccggtg 540 ccatcctgcg cgtgcggccc gcgcccggca acttgaccgt ggtagtgggc aatgcgtcgg 600 cggcctacaa catcctctac cgcactacag acagtcagta caagccctcc tgggctgtga 660 ccaccctgct ggtgcccccc gtggccgcct ccgccgccgt caaccagagt gtcctgctct 720 cccaccagat cgcctacgat tcgttcgacg tcaatgccag tcccagctac gccatgtaca 780 ccagcccgcc ctccgatatt atcctcgccc tgcagcgcgg ctggttcgtt sacgtccccg 840 attacgaggg ccccaatgcc tctttcaccg ccggtgtgca gtccggccat gccaccctcg 900 actcggtccg cagcgtgctc gcctccggat tcggcctgaa cgaggacgcc cagtacgctc 960 tgtggggtta ctctggcggt gccttggcca gcgaatgggc tgctgaactg cagatgcaat 1020 acgctcccga gttgaacatt gccggtctgg ccgtgggtgg tctcactccc aatgttacca 1080 gcgtcatgga cacggtgacc tcgaccatca gtgcgggact catccccgcc gccgccctgg 1140 gtctgtcgag ccagcacccc gagacctacg agttcatcct cagccagctc aagacgacgg 1200 gaccctacaa ccgcacagga ttcctagccg ccaaggacct gaccctgtcc gaggcggagg 1260 tcttctacgc cttccagaac atcttcgatt actttgtcaa cggatcggcc acgttccagg 1320 cggaggtggt gcagaaggcg ctgaaccagg acggatacat gggctaccat gggttcccgc 1380 agatgccggt gctcgcgtac aaggctattc acgatgagat cagtcccatc caggatacgg 1440 atcgcgtgat caagcgctac tgtggtctgg gattgaacat cttgtatgag cggaacacca 1500 tcggtggcca ctcggcagag caggtgaatg gcaacgccag ggcgtggaac tggttgacga 1560 gcattttcga cggaacgtat gcgcagcagt acaagaccga ggggtgcacg atccgcaatg 1620 tcactctgaa cacgacttcc tccgtttatt agagaggggg ctgttgttat gtgaataatg 1680 ctgaagatgg ctgtgtatgg acggtccgct ctcctgtata gtaatgggct aatgcatgcg 1740 gcttcatgaa catggtacga aagattagat tatgtatata gtgtggaagt ggtaatgatg 1800 atataatatc tgtctatgat ctatgttcct gctattctat acaaacgcga ccattcacag 1860 aatgactact ggcacatctg c 1881 <210> 17 <211> 1257 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1257) <40Q> 17 atg tat atc ccc tcg gtg.,ctg ctt ctg gcc gcg age ctg ttc cat ggc 48

PL 214 792 B1

2101

78W0

.ST25.txt

Met

Tyr

Ile

Pro

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

Leu

Phe

His

Gly

1

5

10

15

gca

acg

gcg

ctg

ccc

acg

ccc

ggc

tcc

acg

ccc

atc

ccg

ccc

agc

cag

96

Ala

Thr

Ala

Leu

Pro

Thr

Pro

Gly

Ser

Thr

Pro

Ile

Pro

Ser

Sin

20

25

30

gat

ccc

tgg

tac

agt

gcg

ccc

gag

ggc

ttc

gag

get

gat

ccc

ggt

144

Asp

Pro

Trp

Tyr

Ser

Ala

Pro

Glu

Gly

Phe

Glu

Ala

Asp

Pro

Gly

35

40

45

gcc

atc

ctg

ege

gtg

cgg

ccc

gcg

ccc

ggc

aac

ttg

acc

gtg

gta

gtg

192

Ala

Ile

Leu

Arg

Val

Arg

Pro

Ala

Pro

Gly

Asn

Leu

Thr

Val

yal

Val

50

55

60

ggc

aat

gcg

teg

gcg

gcc

tac

aac

atc

ctc

tac

ege

act

aca

gac

agt

240

Gly Asn Ala Ser Ala Ala Tyr Asn Ile Leu Tyr Arg Thr Thr Asp Ser

65

70

75

80

cag

tac

aag

ccc

tcc

tgg

get

gtg

acc

ctg

gtg

ccc

gtg

288

Gin

Tyr

Lys

Pro

Ser

Trp

Ala

Val

Thr

Leu

Val

Pro

Mai

85

90

95

gcc

tcc

gcc

gtc

aac

cag

agt

gtc

ctg

ctc

tcc

cac

cag

atc

336

Ala

Ser

Ala

Al a

Val

Asn

Gin

Ser

Val

Leu

Ser

His

Gin

Ile

100

105

110

gcc

tac

gat

teg

ttc

gac

gtc

aat

gcc

agt

ccc

agc

tac

gcc

atg

tac

384

Ala

Tyr

Asp

Ser

Phe

Asp

Val

Asn

Ala

Ser

Pro

Ser

Tyr

Ala

Met

Tyr

115

120

125

acc

agc

ccg

ccc

tcc

gat

att

atc

ctc

gcc

ctg

cag

ege

ggc

tgg

ttc

432

Thr

Ser

Pro

Ser

Asp

Ile

Leu

Ala

Leu

Gin

Arg

siy

Trp

Phe

130

135

140

gtt aac gtc ccc gat tac gag ggc ccc aat gcc tet ttc acc gcc ggt 480

Val Asn Val Pro Asp Tyr Glu Gly Pro Asn Ala Ser Phe Thr Ala Gly

145 150 155 160 gtg cag tcc ggc cat gcc acc ctc gac teg gtc ege agc gtg ctc gcc 528

Val Sin Ser Gly His Ala Thr Leu Asp Ser Va1 Arg Ser Val Leu Ala

165 170 175 tcc gga ttc ggc ctg aac gag gac gcc cag tac get ctg tgg ggt tac 576

Ser Gly Phe Gly Leu Asn Glu Asp Ala Gin Tyr Ala Leu Trp Gly Tyr

180 185 190 tet ggc ggt gcc ttg gcc agc gaa tgg get get gaa ctg cag atg caa 624

Ser Gly Gly Ala Leu Ala Ser Glu Trp Ala Ala Glu Leu Gin Met Gin

195 200 205 tac get ccc gag ttg aac att gcc ggt ctg gcc gtg ggt ggt ctc act 672

Tyr Ala Pro Glu Leu Asn'Ile Ala Gly Leu Ala Val Gly Gly Leu Thr

210 215 . 220 ccc aat gtt acc agc gtc atg gac acg gtg acc teg acc atc agt gcg 720

Pro Asn Val Thr Ser Val Met Asp Thr Val.Thr Ser Thr Ile Ser Ala

225 230 .235 240

PL 214 792 B1

oga	ctc	atc	ccc	gcc	gcc	gcc	ctg	ggt
Gly	Leu	Ile	Pro	Ala	Ala	Ala	Leu	Gly
				245
acc	tac	gag	ttc	atc	ctc	age	cag	ctc
Thr	Tyr	Glu	Phe	Ile	Leu	Ser	Gin	Leu
			260					265
cgc	aca	gga	ttc	eta	gcc	gcc	aag	gac
Arg	Thr	Gly	Phe	Leu	Ala	Ala	Lys	Asp
		275					280
gtc	ttc	tac	gcc	ttc	cag	aac	atc	ttc
Val	Phe	Tyr	Ala	Phe	Gin	Asn	Ile	Phe
	290					295
gcc	acg	ttc	cag	gcg	gag	gtg	gtg	cag
Ala	Thr	Phe	Gin	Ala	Glu	Val	Val	Gin
305					310
tac	atg	ggc	tac	cat	ggg	ttc	ccg	cag
Tyr	Met	Gly	Tyr	His	Gly	Phe	Pro	Gin
				325
gct	att	cac	gat	gag	atc	agt	ccc	atc
Ala	Ile	His	Asp	Glu	Ile	Ser	Pro	Ile
			340					345
aag	cgc	tac	tgt	ggt	ctg	gga	ttg	aac
Lys	Arg	Tyr	Cys	Gly	Leu	Gly	Leu	Asn
		355					360
atc	ggt	ggc	cac	tcg	gca	gag	cag	gtg
Ile	Gly	Gly	His	Ser	Ala	Glu	Gin	Val
	370					375
aac	tgg	ttg	acg	age	att	ttc	gac	gga
Asn	Trp	Leu	Thr	Ser	Ile	Phe	Asp	Gly
385					390
acc	gag	ggg	tgc	acg	atc	cgc	aat	gtc
Thr	Glu	Gly	Cys	Thr	Ile	Arg	Asn	Val

405

21078wO.ST25.txt

ctg	tcg	age	cag	cac	ccc	gag	768
Leu	Ser	Ser	Gin	His	Pro	Glu
250					255
aag	acg	acg	gga	ccc	tac	aac	816
Lys	Thr	Thr	Gly	Pro	Tyr	Asn
				270
ctg	acc	ctg	tcc	gag	gcg	gag	864

Leu Thr Leu Ser Glu Ala Glu 285 gat tac ttt gtc aac gga tcg 912 Asp Tyr Phe Val Asn Gly Ser

300 aag gcg ctg aac cag gac gga 960 Lys Ala Leu Asn Gin Asp Gly

315 320 atg ccg gtg ctc gcg tac aag 1008 Met Pro Val Leu Ala Tyr Lys 330 335 cag gat acg gat cgc gtg atc 1056 Gin Asp Thr Asp Arg Val Ile

				350
atc	ttg	tat	gag	cgg	aac	acc	1104
Ile	Leu	Tyr	Glu	Arg	Asn	Thr
			365
aat	ggc	aac	gcc	agg	gcg	tgg	1152
Asn	Gly	Asn	Ala	Arg	Ala	Trp
		380
acg	tat	gcg	cag	cag	tac	aag	1200
Thr	Tyr	Ala	Gin	Gin	Tyr	Lys
	395					400
act	ctg	aac	acg	act	tcc	tcc	1248
Thr	Leu	Asn	Thr	Thr	Ser	Ser
410					415

1257 gtt tat tag Val Tyr <210> 18 <211> 418 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 18

Met Tyr Ile Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly

PL 214 792 B1

5

Ala Thr Ala Leu Pro Thr Pro Gly 20

Asp Pro Trp Tyr Ser Ala Pro Glu 35 40

Ala Ile Leu Arg Val Arg Pro Ala 50 55

Gly Asn Ala Ser Ala Ala Tyr Asn

70

Gin Tyr Lys Pro Ser Trp Ala Val

Ala Ala Ser Ala Ala Val Asn Gin 100

Ala Tyr Asp Ser Phe Asp Val Asn

		115					120
Thr	Ser	Pro	Pro	Ser	Asp	Ile	Ile
	130					135
Val	Asn	Val	Pro	Asp	Tyr	Glu	Gly
145					150
Val	Gin	Ser	Gly	H1s	Ala	Thr	Leu
				165
Ser	Gly	Phe	Gly	Leu	Asn	Glu	Asp
			180
Ser	Gly	Gly	Ala	Leu	Ala	Ser	Glu
		195					200
Tyr	Ala	Pro	Glu	Leu	Asn	Ile	Ala
	210					215
Pro	Asn	Val	Thr	Ser	Val	Met	Asp
225					230
Gly	Leu	Ile	Pro	Ala	Ala	Ala	Leu
				245
Thr	Tyr	Glu	Phe	Ile	Leu	Ser	Gin
			260
Arg	Thr	Gly	Phe	Leu	Ala	Ala	Lys
		275					280
Val	Phe	Tyr	Ala	Phe	Gin	Asn	Ile
	290					295
Ala	Thr	Phe	Gin	Ala	Glu	Val	Val
305					310
Tyr	Met	Gly	Tyr	His	Gly	Phe	Pro
				325
Ala	Ile	His	Asp	Glu	Ile	Ser	Pro
			340
Lys	Arg	Tyr	Cys	Gly	Leu	Gly	Leu

21078WO.ST25.txt

15

Ser Thr Pro Ile Pro Pro Ser Gin

30

Gly Phe Glu Glu Ala Asp Pro Gly

Pro Gly Asn Leu Thr Val Val Val 60

Ile Leu Tyr Arg Thr Thr Asp Ser 75 80

Thr Thr Leu Leu Val Pro Pro Val 90 95

Ser Val Leu Leu Ser His Gin Ile

105 110

Ala Ser Pro Ser Tyr Ala Met Tyr

125

Leu	Ala	Leu	Gin	Arg	Gly	Trp	Phe
			140
Pro	Asn	Ala	Ser	Phe	Thr	Ala	Gly
		155					160
Asp	Ser	Val	Arg	Ser	Val	Leu	Ala
	170					175
Ala	Gin	Tyr	Ala	Leu	Trp	Gly	Tyr
185					190
Trp	Ala	Ala	Glu	Leu	Gin	Met	Gin
				205
Gly	Leu	Ala	Val	Gly	Gly	Leu	Thr
			220
Thr	Val	Thr	Ser	Thr	Ile	Ser	Ala
		235					240
Gly	Leu	Ser	Ser	Gin	His	Pro	Glu
	250					255
Leu	Lys	Thr	Thr	Gly	Pro	Tyr	Asn
265					270
Asp	Leu	Thr	Leu	Ser	Glu	Ala	Glu
				285
Phe	Asp	Tyr	Phe	Val	Asn	Gly	Ser
			300
Gin	Lys	Ala	Leu	Asn	Gin	Asp	Gly
		315					320
Gin	Met	Pro	Val	Leu	Ala	Tyr	Lys
	330					335
Ile	Gin	Asp	Thr	Asp	Arg	Val	Ile
345					350
Asn	Ile	Leu	Tyr	Glu	Arg	Asn	Thr

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

355 360 365

Ile Gly Gly His Ser Ala Glu Gin Yal Asn Gly Asn Ala Arg Ala Trp

370 375 380

Asn Trp Leu Thr Ser Ile Phe Asp Gly Thr Tyr Ala Gin Gin Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Glu Gly Cys Thr Ile Arg Asn Yal Thr Leu Asn Thr Thr Ser Ser

405 410 415

Yal Tyr <210 19 <211> 2809 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 19 agtaatgtat catttgaaag atcagtaaat gaaatctgct gcacaatgca cgctttgaga 60 acgacgatgc gaatcgtaga atgcccaagt cagtctgcgt ggtcagacga gacccataca 120 ttgcatatgt acaatetagt agtataatat ggtgtaaatc cccataacct gatactcata 180 cacactatca gggcttgggt acatgagcga agtagtccca acaatcaaac aatcatccaa 240 actccaagcc aaatgccagc gaaaacaaca aaagcacaac atgatgttac agtgcactag 300 ggaaaccaat ctgtgtcacc atcactcagg acaccagata taacgaaccc ccctcacaga 360 ccacgagtct tctccggatc catctgcacc tcatcaccgc taatttcctt gaccgtctca 420 aacgccggct tgcccgcata tagctgctgg gacgagctgg agccgccgcc ttccgtcgtc 480 gataccgaga tgggctggtt tccgcggaac cgcttgcgca tatcgatcag gccgcgtcta 540 tagaaggaca aacagttagt aaccctgatg acttggcggt gattgcgttt tacaagaagg 600 tagcggctct ttactcactt gcactcgctg aatcccttcc gcaattgctg gcatcgcatg 660 ggaagctcgt cgacgtacgg ctcactcaga cattcgcggg gcgagcgccg ttgcaccatg 720 atgcagtctg attcttggag acattgggcc agagcatttc ctgttcatcc aggtgagatt 780 gattagagag tgtggagctg aagctgaagt tggggacaat gaggtggtga tctccgttcg 840 gggatacgtc gagtatccaa gccgcaattt aagagtatgg taaaggatat aagggtcaaa 900 cgtactgatc tcttggcagg aactcggcat tttggcgaac aacaatggcc gaattgctca 960.

gccaactgac aagcaggaac aataccggtc tgcggcggcg gacatctgga gataatttgt 1020 ctgatcggaa aacaaactea aecaacgggc cttgccccgg attaggtaag ccatcacatg 1080 aagaaggccc ccatgacgtc tggggggaat cctgacttgc tgcttgttcc gcttgattta 1140 tcctcttccc ctagtcatgc ggtcttgggt etttgaagca ttgcttcggc gcattatggt 1200 tcactactac tactgcaggt gataagtatt ttagttggtt gatttgcaaa ttgtccatcc 1260 cttttcgata ataggaggtt tggtcttaat cgtcatggcg cgcgttccgg tcattggacg 1320 gctgttttgg ttcgagtatt tggccctttt tgggtcgctg attttggtat tgctggaatg 1380 ggttatacat attatcacat tctgtctgcg taagtagtgt gttcattctc tggaattgtg 1440 gtctatgtcg aggggcaaga gctaactgac gcagctgaac .ctgttattaa gttctgttac 1500 gatcgatcca agactatctt caacgccttc attcctcccg atgacccggc taagcgcggt 1560 aaagaagaga aaattgctgc gtcggttgct ctggcgtcgg acttcacgga tatatgcgcg 1620 ctgttcggat atgaggcgga ggaacatate .gtccagacag gggatggeta tctgcttggt 1680

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt ctgcaccgac tgccctatcg gaaaggagag gaggggagga agatcaacca gggcgaaggg 1740 agcatcaaga agaaggtcgt ctatctccac catggtctca tgatgtgcag tgaagtctgg 1800 atctgtctgt cagaggagca gcgatgcctt ccgtttcaat tagtcgaaag gggctatgac 1860 gtgtggttgg ggaacaatag aggaaacaag tactcgaaga agtccgtcaa gcattcgccc 1920 ctgtcgaacg agttctggga cttttcgatc gatcagttct cgttccatga tatcccagac 1980 agcatcaagt atatcctgga agtgacaggg cagccctccc tgtcatacgt ggggttctcg 2040 cagggaacag cgeaggcatt tgcgacgctg tccattcatc ctttgttgaa tcagaagatc 2100 gatgtctttg tggctctcgc gccggcaatg gctccgacag gtcttccaaa tcatctcgtg 2160 gactcgctca tgaaggcttc gccgaacttc ctgtttctgc tgtttggcag acgcagcatc 2220 cttagctcaa cgacgatgtg gcagacaatt ctctacccgc ctatctttgt ttggatcatc 2280 gacacgtcac ttcgcggcct gttcaattgg aggtgcaaga acatcagccg ctggcagaag 2340 ctggcagggt acctgcatct gttttccttc actagcacca agtcggtcgt ccattggttc 2400 cagattattc ggcaccggaa tttccagttc tacgatgacg aaatccatgc cccgctcagt 2460 attgtggcca gtgagcgatt ttacaagccg gtcaagtacc cgactaagaa cattaagacg 2520 cccattgtcc tgttgtatgg cggtagcgat agtctcgttg atatcaacgt gatgttgtcc 2580 gagctccctc gcgggaccgt ggcgaaggaa atcccgcagt atgagcattt agatttcttg 2640 tgggcgcgtg atgtggacca attggtattc aaccatgtct tcgaagcgct ggagcggtac 2700 agctcggaga atcagaaagg gacattgatg gagaaggtta atggtgccgc gggcacatat 2760 gtaccgacat aaagtacgag gtcctgcacc aatgaagaca cgcataatc 2809 <210> 20 <211> 1413 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1413) <400 20 atg gcg cgc gtt ccg gtc att gga cgg ctg ttt tgg ttc gag tat ttg 48

Met Ala Arg Va1 Pro Val Ile Gly Arg Leu Phe Trp Phe Glu Tyr Leu 15 10 15 gcc ctt ttt ggg teg ctg att ttg gta ttg ctg gaa tgg gtt ata cat 96

Ala

Leu

Phe

Gly

Ser

Leu

Ile

Leu

Val

Leu

Glu

Trp

Val

Ile

His

20

25

30

att

atc

aca

ttc

tgt

ctg

cct

gaa

cct

gtt

att

aag

ttc

tgt

tac

gat

144

Ile

Thr

Phe

Cys

Leu

Pro

Glu

Pro

Val

Ile

Lys

Phe

Cys

Tyr

Asp

35

40

.45

ega

tcc

aag

act

atc

ttc

aac

gcc.

ttc

att

cct

ccc

gat

gac

ccg

gct

192

Arg

Ser

Lys

Thr

Ile

Phe

Asn

Ala

Phe

Ile

Pro

Asp

Pro

Ala

50

55

60

aag

cgc

ggt

aaa

gaa

gag

aaa

att

gct

gcg

teg

gtt

gct

ctg

gcg

teg

240

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Lys

Arg

Gly

Lys

Glu

Lys

Ile

Ala

Ser

Va1

Ala

Leu

Ala

Ser

'65

70

75

80

gac

ttc

acg

gat

ata

tgc

gcg

ctg

ttc

gga

tat

gag

gcg

gag

gaa

cat

288

Asp

Phe

Thr

Asp

Ile

Cys

Ala

Leu

Phe

Gly

Tyr

Glu

Ala

Glu

His

85

90

95

atc

gtc

cag

aca

ggg

gat

ggc

tat

ctg

ctt

ggt

ctg

cac

ega

ctg

ccc

336

Ile

Val

Gin

Thr

Gly

Asp

Gly

Tyr

Leu

Gly

Leu

His

Arg

Leu

Pro

100

105

110

tat

cgg

aaa

gga

gag

ggg

agg

aag

atc

aac

cag

ggc

gaa

ggg

age

384

Tyr

Arg

Lys

Gly

Glu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

Gin

Gly

Glu

Gly

Ser

115

120

125

atc

aag

gtc

tat

ctc

cac

cat

ggt

ctc

atg

tgc

agt

432

Ile

Lys

Val

Tyr

Leu

His

Gly

Leu

Met

Cys

Ser

130

135

140

gaa

gtc

tgg

atc

tgt

ctg

tea

gag

cag

ega

tgc

ctt

ccg

ttt

caa

480

Glu

Val

Trp

Ile

Cys

Leu

Ser

Glu

Gin

Arg

Cys

Leu

Pro

Phe

Gin

145

150

155

160

tta

gtc

gaa

agg

ggc

tat

gac

gtg

tgg

ttg

ggg

aac

aat

aga

gga

aac

528

Leu

Val

Glu

Arg

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Arg

Gly

Asn

165

170

175

aag

tac

tcg

aag

tcc

gtc

aag

cat

tcg

ccc

ctg

tcg

aac

gag

ttc

576

Lys

Tyr

Ser

Lys

Ser

Val

Lys

His

Ser

Pro

Leu

Ser

Asn

Glu

Phe

180

185

190

tgg

gac

ttt

tcg

atc

gat

cag

ttc

tcg

ttc

cat

gat

atc

cca

gac

age

624

Trp

Asp

Phe

Ser

Ile

Asp

Gin

Phe

Ser

Phe

His

Asp

Ile

Pro

Asp

Ser

195

200

205

atc

aag

tat

atc

ctg

gaa

gtg

aca

ggg

cag

ccc

tcc

ctg

tea

tac

gtg

672

Ile

Lys

Tyr

Ile

Leu

Glu

Val

Thr

Gly

Gin

Pro

Ser

Leu

Ser

Tyr

Val

210

215

220

ggg

ttc

tcg

cag

gga

aca

gcg

cag

gca

ttt

gcg

acg

ctg

tcc

att

cat

720

Gly

Phe

Ser

Gin

Gly

Thr

Ala

Gin

Ala

Phe

Ala

Thr

Leu

Ser

Ile

His

225

230

235

240

cct ttg ttg aat cag aag atc gat gtc ttt gtg gct ctc gcg ccg gca 768

Pro Leu Leu Asn Gin Lys Ile Asp Val Phe Val Ala Leu Ala Pro Ala

245 250 255 atg gct ccg aca ggt ctt cca aat cat ctc gtg gac tcg ctc atg aag 816

Met Ala Pro Thr Gly Leu Pro Asn His Leu Val Asp Ser Leu Met Lys

260 265 270 gct tcg ccg aac ttc ctg ttt ctg ctg ttt ggc aga cgc age atc ctt 864

Ala Ser Pro Asn Phe Leu Phe Leu Leu Phe Gly Arg Arg Ser Ile Leu .·

275 . 280 285 age tea acg acg atg tgg cag aca att ctc tac ccg cct atc ttt gtt 912

Ser Ser Thr Thr Met Trp Gin Thr Ile Leu Tyr Pro Pro Ile Phe Val ~ ' 290 , 295 300

PL 214 792 B1

21078yo.ST25.txt tgg atc atc gac acg tea ctt ege ggc ctg ttc aat tgg agg tgc aag 960

Trp Ile Ile Asp Thr Ser Leu Arg Gly Leu Phe Asn Trp Arg Cys Lys

305 310 315 320 aac atc age ege tgg cag aag ctg gca ggg tac ctg cat ctg ttt tcc 1008

Asn Ile Ser Arg Trp Gin Lys Leu Ala Gly Tyr Leu His Leu Phe Ser

325 330 335 ttc act age acc aag tcg gtc gtc cat tgg ttc cag att att cgg cac 1056

Phe Thr Ser Thr Lys Ser Yal Yal His Trp Phe Gin Ile Ile Arg His

340 345 350 cgg aat ttc cag ttc tac gat gac gaa atc cat gcc ccg ctc agt att 1104

Arg Asn Phe Gin Phe Tyr Asp Asp Glu Ile His Ala Pro Leu Ser Ile

355 360 365 gtg gcc agt gag ega ttt tac aag ccg gtc aag tac ccg act aag aac 1152

Yal Ala Ser Glu Arg Phe Tyr Lys Pro Val Lys Tyr Pro Thr Lys Asn

370 375 380 att aag acg ccc att gtc ctg ttg tat ggc ggt age gat agt ctc gtt 1200

Ile Lys Thr Pro Ile Val Leu Leu Tyr Gly Gly Ser Asp Ser Leu Yal

385 390 395 400 gat atc aac gtg atg ttg tcc gag ctc cct ege ggg acc gtg gcg aag 1248

Asp Ile Asn Yal Met Leu Ser Glu Leu Pro Arg Gly Thr Yal Ala Lys

405 410 415 gaa atc ccg cag tat gag cat tta gat ttc ttg tgg gcg cgt gat gtg 1296

Glu

Ile

Pro

Gin

Tyr

Glu

His

Leu

Asp

Phe

Leu

Trp

Ala

Arg

Asp

Val

420

425

430

gac

caa

ttg

gta

ttc

aac

cat

gtc

ttc

gaa

gcg

ctg

gag

cgg

tac

age

1344

Asp

Gin

Leu

Yal

Phe

Asn

His

Yal

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Tyr

Ser

435

440

445

tcg

gag

aat

cag

aaa

ggg

aca

ttg

atg

gag

aag

gtt

aat

ggt

gcc

gcg

1392

Ser

Glu

Asn

Gin

Lys

Gly

Thr

Leu

Met

Glu

Lys

Val

Asn

Gly

Ala

450 455 460 ggc aca tat gta ccg aca taa 1413

Gly Thr Tyr Val Pro Thr

465 470 <210 21 <211> 470 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400 21

Met Ala Arg Yal Pro Yal Ile Gly Arg Leu Phe Trp Phe Glu Tyr Leu

5 . 10 15

Ala Leu Phe Gly Ser .Leu Ile Leu Yal Leu Leu Glu Trp Yal Ile His

PL 214 792 B1

2101

78WO

.ST25.txt

20

25

30

Ile

Thr

Phe

Cys

Leu

Pro

Glu

Pro

Val

Ile

Lys Phe Cys

Tyr

Asp

35

40

45

Arg

Ser

Lys

Thr

Ile

Phe

Asn

Ala

Phe

Ile

Pro

Pro Asp Asp

Pro

Ala

50

55

60

Lys

Arg

Gly

Lys

Glu

Lys

Ile

Ala

Ser

Val Ala Leu

Ala

Ser

65

70

75

80

Asp Phe Thr Asp Ile Cys Ala Leu Phe Gly Tyr Glu Ala Glu Glu His 85 90 95

Ile Val Gin Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Gly Leu His Arg Leu Pro 100 105 110

Tyr Arg Lys Gly Glu Glu Gly Arg Lys Ile Asn Gin Gly Glu Gly Ser 115 120 125

Ile Lys Lys Lys Val Val Tyr Leu His His Gly Leu Met Met Cys Ser 130 135 140

Glu Val Trp Ile Cys Leu Ser Glu Glu Gin Arg Cys Leu Pro Phe Gin 145 150 1 55 150 Leu Val Glu Arg Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Asn Arg Gly Asn

165

170

175

Lys Tyr

Ser

Lys

Ser

Val

Lys

His

Ser

Pro

Leu

Ser

Asn

Glu

Phe

180

185

190

Trp Asp

Phe

Ser

Ile

Asp

Gin

Phe

Ser

Phe

His

Asp

Ile

Pro

Asp

Ser

195

200

205

Ile Lys

Tyr

Ile

Leu

Glu

Val

Thr

Gly

Gin

Pro

Ser

Leu

Ser

Tyr

Val

210

215

220

Gly Phe

Ser

Gin

Gly

Thr

Ala

Gin

Ala

Phe

Ala

Thr

Leu

Ser

Ile

His

225

230

235

240

Pro Leu Leu Asn Gin Lys Ile Asp Val Phe Val Ala Leu Ala Pro Ala 245 250 255

Met Ala Pro Thr Gly Leu Pro Asn His Leu Val Asp Ser Leu Met Lys 250 265 270

Ala Ser Pro Asn Phe Leu Phe Leu Leu Phe Gly Arg Arg Ser Ile Leu 275 280 285

Ser Ser Thr Thr Met Trp Gin Thr Ile Leu Tyr Pro Pro Ile Phe Val

290

295

300

Trp

Ile

Asp

Thr

Ser

Leu Arg

Gly

Leu

Phe

Asn

Trp

Arg

Cys

Lys

305

310

315

320

Asn

Ile

Ser

Arg

Trp

Gin

Lys Leu

Ala

6iy

Tyr

Leu

His

Leu

Phe

Ser

325

330

335

Phe

Thr

Ser

Thr

Lys

Ser

Val Val

His

Trp

Phe

Gin

Ile

Arg

His

340

345

350

Arg

Asn

Phe

Gin

Phe

Tyr

Asp Asp

G1 u

Ile

His

Ala

Pro

Leu

Ser

11 e

355

360

365

Val

Ala

Ser

Glu

Arg

Phe

Tyr Lys

Pro

Val

Lys

Tyr

Pro

Thr

Lys

Asn

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

370

375

380

Ile

Lys

Thr

Pro

Ile

Val

Leu

Tyr

Gly

Ser

Asp

Ser

Leu

Val

385

390

395

400

Asp

Ile

Asn

Val

Met

Leu

Ser

Glu

Leu

Pro

Arg

Gly

Thr

Val

Ala

Lys

405

410

415

G1 u

Ile

Pro

Gin

Tyr

Glu

His

Leu

Asp

Phe

Leu

Trp

Ala

Arg

Asp

Val

420

425

430

Asp

Gin

Leu

Val

Phe

Asn

His

Val

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Tyr

Ser

435

440

445

Ser

Glu

Asn

Gin

Lys

Gly

Thr

Leu

Met

Glu

Lys

Val

Asn

Gly

Ala

450

455

460

Gly Thr Tyr Val Pro Thr 465 470 <210> 22 .

<211> 3328 <212> ONA <213> Aspergillus niger <400> 22 gatttatgaa gacaggggag ctctcagtag atgatcttcg cacaattgca cttcctgggg 60 agcctgttta gtctctagtg aattattgat agacaggtca tctgcctcga gggggttcta 120 ctaacaacgt gatatctatg ttgctccttt actttagaag aaaggttctg cttggtagct 180 ggaacccagt atatagttga tgtgagtata tgaagattcc aatgctttgg aatattccgc 240 cgtggctgaa tgatgggact ctcactgcca agccaaggga ttcctcccga aatttttgca 300 catatgttgt tgatgcctta tccctctggc attcactcgt tgctgcctcg ggtgggaccc 360 gacagtcctc aaacgatgaa atcttattgg ctctgctagt tgagctcggt ttcaccattt 420 ctattggcgc tttctcactc tactccatat tacagcttcc gctttgcaat gcggggctgt 480 gctgcgactt tgaattgctc gcatagcaag agacactgac cagcaatcca gctcttctgc 540 ccacatatgt tgcctttgcc ttagtatctc ataatttatg tgtccagtga gacagtttgt 600 ttgtactgta gcttgagttg ggaatcgtgt cctgtgacca tggaaatata tattctggat 660 ctcagaacat ctctaccgtt tgtaattttt gatatacttc ccaggatggg acaatgggga 720 cgatgagtat tgggatgcca tatcacttga aagcctctta gacagactgc acctattttt 780 attatgctaa attctttacg agacactttc ttcaagtttc tggccctttg tgaggcagag 840 tgaaacacga gcgttcaa’ac ttgtgttgta gatgtttatg atatttatct cagacagtct 900 ttccacatcc tgtaatcccc aacagaaaaa gatacacagt atatcactag aagctcctaa 960 tagttatcat gctgcaccct aacagcaatg cagtcaccct gctgcgtcag cgaccccgat 1020 tccggagaag tatccgagat agcgataagg atgcggagat aagattggca agtggagatg 1080 agaaagatat cctcggcctc agaagtaggc ccgatgataa ataactagtg aacaagtccc 1140 ccgcccttct ccgagcaaac tacacttcaa catgctgaat gcacgctcca ttgctctggc 1200 ctcgttgcca gttcttctcc tactattcgc ccagcaactt gcctctcacc caaccgagca 1260 gattcaagcc attctggctc cgtgggtccc ggccgcacta caagatgtcg tgctctataa 1320 tcgacctcgc gtcataatcc cccagggcac tgtcgtcggc acgaccttga cagacacgct 1380

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt caagtccccg gtagatgctt tccgaggaat tccatacgca ttgcctccaa ttggggatag 1440 acggtttcgc cgtgcggagg ctgtccatgc gacggacgag attatcgatg ctagtgaatt 1500 cggcccaagg tatgcttctt atacgacatt cagatcatat ctgacctttc aggtgccctg 1560 gaaagcagct cttgaatcca aatgacatag gtggtgatga agactgtctc acagtcaatg 1620 tcttccggcc tcatggcgct cagggaaaac tccctgtcgc tgtatacgtg cacggcggag 1680 cctacaatcg cggcactggt aggtgtatca ccctcagtcc tctatatacc cacagctaaa 1740 tatccagcct ccggacacaa cacggcctcg atggtcggct ggtcggacga gcccttcgtt 1800 gcagtcagct tcaactaccg gtacgtcctc aaacctgtcc tccgaatcaa ctcaactaac 1860 aacccatcag catcggcgcc ctcggcttcc tcccatccac cctaaccgcc aaagaaggaa 1920 tcctcaacct aggcctccat gaccagatcc tcctgctgca atgggtccaa gaaaacatcg 1980 cacatttcaa cggcgaccca acccaagtca ctctaatcgg cctctccgcc ggcgcgcact 2040 ccgtatgccc ccttctaaga tacaaataga actcagtccc ctacccccaa actaacgcca 2100 cacagatagc ccaccacatc atgaactaca acccaccaaa cacccccctc tttcaccgcg 2160 ccatcatcga atccggcgcc gccacctccc gcgccgtcca cccctacaac gcctccctcc 2220 acgaatccca attcacagac ttcctcactg aaacgggctg cactaacctc cccgacactg 2280 ccattttgcc ctgtctccgc gccctcccat cctcagccat taccaccgcc tccatctccg 2340 tcttcgacaa atacaacccc tccatccgct gggccttcca acccgtcatc gaccacgaga 2400 tcatccaccg ccggcccatc gacgcctggc gctcaggaaa gtggaatagg atgcccatcc 2460 taacgggctt caactcgaac gaggggacat actacgtccc tcgcaacctc tctctctccg 2520 aggatttcac ttcgttcttc cgaaccctcc tccccgcgta ccccgagagc gacatccaga 2580 ccatcgatga gatctacccc gatccgaatg tatatgctac ggcgtcgcca tacctcgaga 2640 caaggccgat cccgagtcta ggaaggcagt ttaagcggct ggaggcggcg tatgggcatt 2700 atgcgtatgc gtgtccagta cggcagacgg cggggtttgt tgctaatgat gatggttgtg 2760 gtgagccggt gtttttgtat cgctgggcgt tgaataagac tgttattgga ggcgcgaacc 2820 atggtgatca gatggagtat gagacgttta atcctgcggt tagggatatt tcggaggctc 2880 agagggaggt tgcggggttg tttcatgcgt atgtgacttc gtttgtggtg catggggatc 2940 cgaatgttct ggggggtagg tatgagggga gggaggtttg ggagaggtat agtggggagg 3000 gaggggaggt gatggtgttt ggggagggga atgatgaacg tgctgggggg gatggagttg 3060 gggttgcggc gaggttgaag agggatgagt ggggggtgaa ggagtgtgga ttttggtctg 3120 ggaggagtgg gatttccgag tgatggtttg tttatatata gtctagtgga aggggatgta 3180 tatactgtag tcactatctg tagaacttta cttggtgtgt agatagtaaa tactacaact 3240 gctgaagacc ttgggataga acgacatgct gtttaatcct caaccctgac tagatatatt 3300 gtgcattact tgcatccacg cctaacat 3328 <210> 23 <211> 1779 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1779)

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt <400> 23

atg

ctg

aat

gca

cgc

tcc

att

gct

ctg

gcc

tcg

ttg

cca

gtt

ctt

ctc

48

Met

Leu

Asn

Ala

Arg

Ser

Ile

Ala

Leu

Ala

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

ł

5

10

15

eta

ttc

gcc

cag

caa

ctt

gcc

tet

cac

cca

acc

gag

cag

att

caa

96

Leu

Phe

Ala

Gin

Leu

Ala

Ser

His

Pro

Thr

Glu

Gin

Ile

Gin

20

25

30

gcc

att

ctg

gct

ccg

tgg

gtc

ccg

gcc

gca

eta

caa

gat

gtc

gtg

ctc

144

Ala

Ile

Leu

Ala

Pro

Trp

Val

Pro

Ala

Leu

Gin

Asp

Val

Leu

35

40

45

tat

aat

ega

cct

cgc

gtc

ata

atc

ccc

cag

ggc

act

gtc

ggc

acg

192

Tyr Asn Arg Pro Arg Val Ile Ile Pro Gin Gly Thr Val Val Gly Thr 50 55 60 acc ttg aca gac acg ctc aag tcc ccg gta gat gct ttc ega gga att 240

Thr Leu Thr Asp Thr Leu Lys Ser Pro Val Asp Ala Phe Arg Gly Ile

70 75 80 cca tac gca ttg cct cca att ggg gat aga cgg ttt cgc cgt gcg gag 288

Pro Tyr Ala Leu Pro Pro Ile Gly Asp Arg Arg Phe Arg Arg Ala Glu

90 95 gct gtc cat gcg acg gac gag att atc gat gct agt gaa ttc ggc cca 336

Ala Val His Ala Thr Asp Glu Ile Ile Asp Ala Ser Glu Phe Gly Pro

100 105 110 agg tgc cct gga aag cag ctc ttg aat cca aat gac ata ggt ggt gat 384

Arg Cys Pro Gly Lys Gin Leu Leu Asn Pro Asn Asp Ile Gly Gly Asp

115 120 125 gaa gac tgt ctc aca gtc aat gtc ttc cgg cct cat ggc gct cag gga 432

Glu Asp Cys Leu Thr Val Asn Val Phe Arg Pro His Gly Ala Gin Gly

130 135 140 aaa ctc cct gtc gct gta tac gtg cac ggc gga gcc tac aat cgc ggc 480

Lys Leu Pro Va1 Ala Val Tyr Val His Gly Gly Ala Tyr Asn Arg Gly

145 150 155 160 act gct aaa tat cca gcc tcc gga cac aac acg gcc tcg atg gtc ggc 528

Thr Ala Lys Tyr Pro Ala Ser Gly His Asn Thr Ala Ser Met Val Gly

165 170 175 tgg tcg gac gag ccc ttc gtt gca gtc age ttc aac tac cgc atc ggc 576

Trp Ser Asp Glu Pro Phe Val Ala Val Ser Phe Asn Tyr Arg Ile Gly

180 185 190 gcc ctc ggc ttc ctc cca tcc acc eta acc gcc aaa gaa gga atc ctc 624

Ala Leu Gly Phe Leu Pro Ser Thr Leu Thr Ala Lys Glu Gly Ile Leu

195

200

205

aac

eta

ggc

ctc

cat

gac

cag

atc

ctc

ctg

caa

tgg

gtc

caa

gaa

672

Asn

Leu

Gly

Leu

His

Asp

Gin

Ile

Leu

Gin

Trp

Val

Gin

Glu

210

215

220

aac

atc

gca

cat

ttc

aac

ggc

gac

cca

acc

caa

gtc

act

eta

atc

ggc

720

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Asn Ile Ala His Phe Asn Gly Asp Pro Thr Gin Val Thr Leu Ile Gly 225 230 235 240 ctc tcc gcc ggc gcg cac tcc ata gcc cac cac atc atg aac tac aac 768

Leu Ser Ala Gly Ala His Ser Ile Ala His His Ile Met Asn Tyr Asn

245 250 255 cca cca aac acc ccc ctc ttt cac cgc gcc atc atc gaa tcc ggc gcc 816

Pro Pro Asn Thr Pro Leu Phe His Arg Ala Ile Ile Glu Ser Gly Ala

260 265 270 gcc acc tcc cgc gcc gtc cac ccc tac aac gcc tcc ctc cac gaa tcc 864

Ala Thr Ser Arg Ala Val His Pro Tyr Asn Ala Ser Leu His Glu Ser

275 280 285 caa ttc aca gac ttc ctc act gaa acg ggc tgc act aac ctc ccc gac 912

Gin Phe Thr Asp Phe Leu Thr Glu Thr Gly Cys Thr Asn Leu Pro Asp

290 295 ' 300 act gcc att ttg ccc tgt ctc cgc gcc ctc cca tcc tea gcc att acc 960

Thr Ala Ile Leu Pro Cys Leu Arg Ala Leu Pro Ser Ser Ala Ile Thr

305 310 315 320 acc gcc tcc atc tcc gtc ttc gac aaa tac aac ccc tcc atc cgc tgg 1008

Thr Ala Ser Ile Ser Val Phe Asp Lys Tyr Asn Pro Ser Ile Arg Trp

325 330 335 gcc ttc caa ccc gtc atc gac cac gag atc atc cac cgc cgg ccc atc 1056

Ala Phe Gin Pro Val Ile Asp His Glu Ile Ile His Arg Arg Pro Ile

340 345 350 gac gcc tgg cgc tea gga aag tgg aat agg atg ccc atc eta acg ggc 1104

Asp Ala Trp Arg Ser Gly Lys Trp Asn Arg Met Pro Ile Leu Thr Gly

355 360 365 ttc aac teg aac gag ggg aca tac tac gtc cct cgc aac ctc tct ctc 1152

Phe Asn Ser Asn Glu Gly Thr Tyr Tyr Val Pro Arg Asn Leu Ser Leu

370 375 380 tcc gag gat ttc act teg ttc ttc ega acc ctc ctc ccc gcg tac ccc 1200

Ser Glu Asp Phe Thr Ser Phe Phe Arg Thr Leu Leu Pro Ala Tyr Pro

385 390 395 400 gag agc gac atc cag acc atc gat gag atc tac ccc gat ccg aat gta 1248

Glu Ser Asp Ile Gin Thr Ile Asp Glu Ile Tyr Pro Asp Pro Asn Val

405

410

415

tat

gct

acg

gcg

teg

cca

tac

ctc

gag

aca

agg

ccg

atc

ccg

agt

eta

1296

Tyr

Ala

Thr

Ala

Ser

Pro

Tyr

Leu

Glu

Thr

Arg

Pro

Ile

Pro

Ser

Leu

420

425

430

gga

agg

cag

ttt

aag

cgg

ctg

gag

gcg

tat

ggg

cat

tat

gcg

tat

1344

Gly

Arg

Gin

Phe

Lys

Arg

Leu

Glu

Ala

Tyr

Gly

His

Tyr

Ala

Tyr

435

440

445

gcg

tgt

cca

gta

cgg

cag

acg

gcg

ggg

ttt

gtt

gct

aat

gat

ggt

1392

Ala

Cys

Pro

Val

Arg

Gin

Thr

Ala

Gly

Phe

Val

Ala

Asn

Asp

Gly

450

455

460

PL 214 792 B1

21078WG.ST25.txt

tgt

ggt

gag

ccg

gtg

ttt

ttg

tat

ege

tgg

gcg

ttg

aat

aag

act

gtt

1440

Cys

Gly

Glu

Pro

Yal

Phe

Leu

Tyr

Arg

Trp

Ala

Leu

Asn

Lys

Thr

Yal

465

470

475

480

att

gga

ggc

gcg

aac

cat

ggt

gat

cag

atg

gag

tat

gag

acg

ttt

aat

1488

Ile

Gly

Ala

Asn

His

Gly

Asp

Gin

Met

Glu

Tyr

Glu

Thr

Phe

Asn

485

490

495

cct

gcg

gtt

agg

gat

att

tcg

gag

get

cag

agg

gag

gtt

gcg

ggg

ttg

1536

Pro

Ala

Val

Arg

Asp

Ile

Ser

Glu

Ala

Gin

Arg

Glu

Val

Ala

Gly

Leu

500

505

510

ttt

cat

gcg

tat

gtg

act

tcg

ttt

gtg

cat

ggg

gat

ccg

aat

gtt

1584

Phe

His

Ala

Tyr

Yal

Thr

Ser

Phe

Val

Yal

His

Gly

Asp

Pro

Asn

Val

515

520

525

ctg

ggg

ggt

agg

tat

gag

ggg

agg

gag

gtt

tgg

gag

agg

tat

agt

ggg

1632

Leu Gly Gly Arg Tyr Glu Gly Arg Glu Val Trp Glu Arg Tyr Ser Gly 530 535 540 gag gga ggg gag gtg atg gtg ttt ggg gag ggg aat gat gaa cgt get 1680

Glu Gly Gly Glu Val Met Val Phe Gly Glu Gly Asn Asp Glu Arg Ala

545 550 555 560

990 ggg gat gga gtt ggg gtt gcg gcg agg ttg aag agg gat gag tgg 1728

Gly Gly Asp Gly Yal Gly Yal Ala Ala Arg Leu Lys Arg Asp Glu Trp

565 570 575 ggg gtg aag gag tgt gga ttt tgg tet ggg agg agt ggg att tcc gag 1776

Gly Yal Lys Glu Cys Gly Phe Trp Ser Gly Arg Ser Gly Ile Ser Glu

580 585 590 tga 1779 <210> 24 <211> 592 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 24

Met Leu Asn Ala Arg Ser Ile Ala Leu Ala Ser Leu Pro Yal Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Phe Ala Gin Gin Leu Ala Ser His Pro Thr Glu Gin Ile Gin

25 30

Ala Ile Leu Ala Pro Trp Yal Pro Ala Ala Leu Gin Asp Val Val Leu

40 45

Tyr Asn Arg Pro Arg Yal Ile Ile Pro Gin Gly Thr Va1 Yal Gly Thr

55 60

Thr Leu Thr Asp Thr Leu Lys Ser Pro Val Asp Ala Phe Arg Gly Ile

70 75 80

Pro Tyr Ala Leu Pro Pro Ile Gly Asp Arg Arg Phe Arg Arg Ala Glu

PL 214 792 B1

				85
Ala	Val	His	Ala	Thr	Asp	Glu	Ile
			100
Arg	Cys	Pro	Gly	Lys	Gin	Leu	Leu
		115					120
Glu	Asp	Cys	Leu	Thr	Val	Asn	Val
	130					135
Lys	Leu	Pro	Val	Ala	Val	Tyr	Val
145					150
Thr	Ala	Lys	Tyr	Pro	Ala	Ser	Gly
				165
Trp	Ser	Asp	Glu	Pro	Phe	Val	Ala
			180
Ala	Leu	Gly	Phe	Leu	Pro	Ser	Thr
		195					200
Asn	Leu	Gly	Leu	His	Asp	Gin	Ile
	210					215
Asn	Ile	Ala	His	Phe	Asn	Gly	Asp
225					230
Leu	Ser	Ala	Gly	Ala	His	Ser	Ile
				245
Pro	Pro	Asn	Thr	Pro	Leu	Phe	His
			260
Ala	Thr	Ser	Arg	Ala	Val	His	Pro
		275					280
Gin	Phe	Thr	Asp	Phe	Leu	Thr	Glu
	290					295
Thr	Ala	Ile	Leu	Pro	Cys	Leu	Arg
305					310
Thr	Ala	Ser	Ile	Ser	Val	Phe	Asp
				325
Ala	Phe	Gin	Pro	Va1	Ile	Asp	His
			340

Asp	Ala	Trp	Arg	Ser	Gly	Lys	Trp
		355					360
Phe	Asn	Ser	Asn	Glu	Gly	Thr	Tyr
	370					375
Ser	Glu	Asp	Phe	Thr	Ser	Phe	Phe
385					390
Glu	Ser	Asp	Ile	Gin	Thr	Ile	Asp
				405
Tyr	Ala	Thr	Ala	Ser	Pro	Tyr	Leu
			420
Gly	Arg	Gin	Phe	Lys	Arg	Leu	Glu

21Q78WO.ST25.txt

95

Ile	Asp	Ala	Ser	Glu	Phe	Gly	Pro
105					110
Asn	Pro	Asn	Asp	Ile	Gly	Gly	Asp
				125
Phe	Arg	Pro	His	Gly	Ala	Gin	Gly
			140
His	Gly	Gly	Ala	Tyr	Asn	Arg	Gly
		155					160
His	Asn	Thr	Ala	Ser	Met	Val	Gly
	170					175
Val	Ser	Phe	Asn	Tyr	Arg	Ile	Gly
185					190
Leu	Thr	Ala	Lys	Glu	Gly	Ile	Leu
				205
Leu	Leu	Leu	Gin	Trp	Val	Gin	Glu
			220
Pro	Thr	Gin	Val	Thr	Leu	Ile	Gly
		235					240
Ala	His	His	Ile	Met	Asn	Tyr	Asn
	250					255
Arg	Ala	Ile	Ile	Glu	Ser	Gly	Ala
265					270
Tyr	Asn	Ala	Ser	Leu	His	Glu	Ser
				285
Thr	Gly	Cys	Thr	Asn	Leu	Pro	Asp
			300
Ala	Leu	Pro	Ser	Ser	Ala	Ile	Thr
		315					320
Lys	Tyr	Asn	Pro	Ser	Ile	Arg	Trp
	330					335
Glu	Ile	Ile	His	Arg	Arg	Pro	Ile
345					350
Asn	Arg	Met	Pro	Ile	Leu	Thr	Gly
				365
Tyr	Val	Pro	Arg	Asn	Leu	Ser	Leu
			380
Arg	Thr	Leu	Leu	Pro	Ala	Tyr	Pro
		395					400
Glu	Ile	Tyr	Pro	Asp	Pro	Asn	Va1
	410					415
Glu	Thr	Arg	Pro	Ile	Pro	Ser	Leu

425 430

Ala Ala Tyr Gly His Tyr Ala Tyr

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

435 440 445

Ala Cys Pro Val Arg Gin Thr Ala Gly Phe Val Ala Asn Asp Asp Gly

450 455 460

Cys Gly Glu Pro Val Phe Leu Tyr Arg Trp Ala Leu Asn Lys Thr Val

465 470 475 480

Ile Gly Gly Ala Asn His Gly Asp Gin Met Glu Tyr Glu Thr Phe Asn

485 490 495

Pro Ala Val Arg Asp Ile Ser Glu Ala Gin Arg Glu Val Ala Gly Leu

500 505 510

Phe His Ala Tyr Val Thr Ser Phe Val Va1 His Gly Asp Pro Asn Val

515 520 525

Leu Gly Gly Arg Tyr Glu Gly Arg Glu Val Trp Glu Arg Tyr Ser Gly

530 535 540

Glu Gly Gly Glu Val Met Val Phe Gly Glu Gly Asn Asp Glu Arg Ala

545 550 555 560

Gly Gly Asp Gly Val Gly Val Ala Ala Arg Leu Lys Arg Asp Glu Trp

565 570 575

Gly Val Lys Glu Cys Gly Phe Trp Ser Gly Arg Ser Gly Ile Ser Glu

580 585 590 <210> 25 <211> 3932 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 25 cagataacgt tttgagtttg gggatcttga ttatctcggc tccaaacaga ctcgcctatc 60 cgagagatca agtacataat gcaactagct attagtcaaa tataacgccg gcagaagtct 120 attttgtcct tttctctttc tttcctcgaa gaaaacccgt ggattaactt gagccggtcg 180 gcctcaaagt cggctcaacc ggcgcgttgc caactttaaa tgcagacaac catcgtttcc 240 ggccgttgtg ggggcgatgt agatcagatc caaattccca aaacatccat ggggtaaatc 300 aagaattgag gttacatcga ccgatagggc tcttaatcca accctcttca cggggaaaac 360 cttctatatg atacatggtt tactcctctg tttctettcc tccccggagg tgccaaatcc 420 gggcgcatcg tgtctattct tagcaaccag cgaatttgac aaattgatcc aatcccatag 480 aatcagagta actctacaac ccaatcagtc gcctaatacg cacagcaaaa gaagatgcat 540 tcggacagcc aacgcaagaa aagagattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaggcctc ecctcatcac ctcaccaaag tcgcaatcaa tcagcgacca ctagctacat 660 cgcgactgaa cgatagcatt ccgcatggtg ttaaagttca agacagttgc tatgcttgce 720 cgaaccttta cacattcttg ccctttccgt agaattccaa gctcatcgga cagagagtag 780 tgtttctgtg aatgtggtgg tttaccaceg ttacctctgc tgtctatcac ttgctcctac 840 ccctgagcac aggcaccata gttacaacac ccccacgggg ccattgtctg ttttcagctt 900 cagcttcgtc gacaatggac tgtcatatcc ectcatctca aaagaatgtc ggaaacactg 960 tatggcatgg cgtgtgggaa ccgatcaatt tgtataatat cttaggccca cctcttcccc 1020 tccgagaggt ttgacatcag ggggtttcag agatagtccg tcgatattta tggcttcctc 1080

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt tgtcttcttg ccgctacttg cggcctcatt actgcccaca ctcgcttcta cacagaatgc 1140 cgatacaccg acatccgctc ctactgtgca agtccgcaat ggcacatacg agggtctcta 1200 taatcccacg tacaatcagg acttgttcct cggcataccg tatgcgcagc ctccggttgg 1260 tgagctacga ttccgtccac cacaaccgct caacacgacg tggactggca ctcgaaatgc 1320 aacagcctat tacaatgaat gtatcggtta tggtagcgac gactggtatt ggaccgacgt 1380 agtctccgaa gattgtctcg ctctcagtgt gattcgacct cacggcatcg actcaagcgc 1440 gaagctgccc gtcgtcttct ggatgcatgg tggagaattc gcagaaggag gcactcgcga 1500 ctcccgttac aacctctcct acatcgtcca acaatcccag gagatgcaat ctcccatcat 1560 tggcgtgact gtcaactacc gcctttcggg atggggattc ctctatagcc aggaagtcgc 1620 cgacgaaggc tccgccaact taggactccg cgaccaacgg cacgctctgt actggctcca 1680 agagaatatc gcttccttcg gcggcgaccc gtcgcggctc accatctggg gccaaagtgc 1740 cggtgccaac agcgtcggtc tccatttagt ggcatacgac ggccagaatg atggcatctt 1800 ccgtgccggg atcgccgaga gcggctccgt accctccctc gcagcataca tgagcgccga 1860 agatgcacaa ccatactatg atgccgtcgt caacgcaacc aactgcaccg gctcttccaa 1920 cacccttact tgtctccgtg aagttcccac cgacgtcctc agctccatct tcaacagctc 1980 cctcgtcgct ggggcaggat atcatcccgt cattgacggc gatttcctca gagcctcggg 2040 gatagttaat ctccagactg gccaattcgc caaaaccccg cttcttatcg gcaccaactt 2100 cgacgaaggg accaagtatg cccctcatgg ctataatacc accgaccaat ttgtctccct 2160 cgtccaagcc aacggaacca attataccag cgctcfccacc attgcatccc tgtacccaga 2220 tgacccagcc gttggtattc cgggaaccct tcaaggtcgt cccccaccgt catacggtta 2280 ccagtggaag cgcgtggctg ccttcctcgg cgatctgctc atgcacgcgc ctcgccgcgt 2340 gacaacccag tggctggcac actggaatgt acctgcctac gtgtatcact ggaacgtgat 2400 gacactaggg ccattagatg gagccgcgca tggctatgaa gtccccttca gtttccataa 2460 ttatgatggt ttgggcgatg aacggggaaa cgacagcgtg acctggccac aactatcgac 2520 tatgatgtca cggatgtggg tgagctttat taatcatttg gatccgaatt atagtaatag 2580 tgagtgattt gccccaccta cctctggaca ctgctttagg agcttgaggg taaggaagga 2640 tgctgacacg ctgctctgct agtgacggat atccactggc ctgtctacac aacagaaacc 2700 ccgcaaaata tggtctttga tgtcaatgtg actggactgg cttatgttga accagatacc 2760 tatagagcgg agggaattgc gtatatcact agcattctgc agagtgcctt taatcggtag 2820 ggtagactag aggcttcaat atcaatagat atcacacata caggagagca gcccatgttt 2880 ccctccagat caagagctat tccgttaaaa ggtagtgcat ccccgcaccg gggggaaggc 2940 csgggagtgc ttacctctgt gtgaaactag aattccagca acgatggttt tagaaaggcc 3000 agatctgttg actcattgtt tgatcctccg atgttgcatc cgagaaagct tctgcttggt 3060 cgtgccaagg atgttaacag ctgctgttga ggcaactcta gaaaccccat agacctttac 3120 tatctcgctg actagagggt acagtaggtc ctactttgaa ttccttggcg gttgggattt 3180 cgcggaaggt tgtctcaacc ctcaatgctt gtćacgacag acggcttggc aatgagacga 3240 gaccacgggc gattgacatg tgtcaagcag tagctatcgg gaatctgaaa aagcatggct 3300 gtcatggact ttgcaggcaa aggctgtctg ttctagacca tcggctagag cgcggtgagc 3360 atactaggcg agctgaaaag cctagaagcg gttgccggtt atccgctttg tttgtgccct 3420 ttccgtttcc gggcgtaggc aatcacattt aggcaatgcc gtgtgggcct tggagatctc 3480 acctaacctt attgcatttt acctcacggt gatacaacct gagtgactat cagggaaact 3540 gagcctattg atcatcacat attagcacca cacaaagctg ccaaggaaca atagtaatgt 3600 gagcgccaag gagatatctt tgaactttgt ctccagatct tgtactacat acccagccag 3660 acaggggttc gtatcgatgg ctccacagcg ggatatcatg aatcttcatg tcgtcacgac 3720

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt tcatacctcg agcgataggg ccgggtatta ctccatctgg aaattgtcat gactgtagag 3780 ctcagctgtc cgggatacga gcattatccg tcagtttata aattccaggg ccatcctgct 3840 caatctcaac atgtgggctc ttacgctgtc atcatattag ttagggtcca agagaatcac 3900 agaatcattg gcattgttct tcatcgttcc aa 3932 <210> 26 <211> 1518 <212> DNA <213> Aspergillus niger <22G>

<221> CDS <222> (1). .(1518) <40 0> 26

atg	gct	tcc	tet	gtc	ttc	ttg	ccg	eta
Met	Ala	Ser	Ser	Val	Phe	Leu	Pro	Leu
1				5
aca	ctc	gct	tet	aca	cag	aat	gcc	gat
Thr	Leu	Ala	Ser	Thr	Gin	Asn	Ala	Asp
			20					25
gtg	caa	gtc	cgc	aat	ggc	aca	tac	gag
Val	Gin	Val	Arg	Asn	Gly	Thr	Tyr	Glu
		35					40
aat	cag	gac	ttg	ttc	ctc	ggc	ata	ccg
Asn	Gin	Asp	Leu	Phe	Leu	Gly	Ile	Pro
	50					55
gag	eta	ega	ttc	cgt	cca	cca	caa	ccg
Glu	Leu	Arg	Phe	Arg	Pro	Pro	Gin	Pro
65					70
act	ega	aat	gca	aca	gcc	tat	tac	aat
Thr	Arg	Asn	Ala	Thr	Ala	Tyr	Tyr	Asn
				85
gac	gac	tgg	tat	tgg	acc	gac	gta	gtc

ctt	gcg	gcc	tea	tta	ctg	ccc	48
Leu	Ala	Ala	Ser	Leu	Leu	Pro
10					15
aca	ccg	aca	tcc	gct	cct	act	96
Thr	Pro	Thr	Ser	Ala	Pro	Thr
				30
ggt	ctc	tat	aat	ccc	acg	tac	144
Gly	Leu	Tyr	Asn	Pro	Thr	Tyr
			45
tat	gcg	cag	cct	ccg	gtt	ggt	192
Tyr	Ala	Gin	Pro	Pro	Val	Gly
		60
ctc	aac	acg	acg	tgg	act	ggc	240

Leu Asn Thr Thr Trp Thr Gly 75 80 gaa tgt atc ggt tat ggt age 288 Glu Cys Ile Gly Tyr Gly Ser 90 95

Asp Asp Trp Tyr Trp Thr Asp Val Val

100			105
agt gtg att ega cct cac	ggc	atc	gac
Ser Val Ile Arg Pro His	Gly	Ile	Asp
115		120
gtc ttc tgg atg cat ggt	gga	gaa	ttc
Val Phe Trp Met His Gly	Gly	Glu	Phe
130	135
tcc cgt tac aac ctc tcc	tac	atc	gtc

tcc	gaa	gat	tgt	ctc	gct	ctc	336
Ser	Glu	Asp	Cys	Leu	Ala	Leu
				110
tea	age	gcg	aag	ctg	ccc	gtc	384
Ser	Ser	Ala	Lys	Leu	Pro	Val
			125
gca	gaa	gga	ggc	act	cgc	gac	432
Ala	G1 u	Gly	Gly	Thr	Arg	Asp
		140
caa	caa	tcc	cag	gag	atg	caa	480

PL 214 792 B1

21078WG.ST25.txt

Ser Arg Tyr Asn Leu Ser Tyr Ile Val Gin Gin Ser Gin Glu Met Gin

145 150 155 160 tct ccc atc att ggc gtg act gtc aac tac cgc ctt teg gga tgg gga 528

Ser Pro Ile Ile Gly Val Thr Yal Asn Tyr Arg Leu Ser Gly Trp Gly

165 170 175 ttc ctc tat age cag gaa gtc gcc gac gaa ggc tcc gcc aac tta gga 576

Phe Leu Tyr Ser Gin Glu Yal Ala Asp Glu Gly Ser Ala Asn Leu Gly

180 185 190 ctc cgc gac caa cgg cac get ctg tac tgg ctc caa gag aat atc get 524

Leu Arg Asp Gin Arg His Ala Leu Tyr Trp Leu Gin Glu Asn Ile Ala

195 200 205 tcc ttc ggc ggc gac ccg teg cgg ctc acc atc tgg ggc caa agt gcc 672

Ser Phe Gly Gly Asp Pro Ser Arg Leu Thr Ile Trp Gly Gin Ser Ala

210 215 220

ggt

gcc

aac

age

gtc

ggt

ctc

cat

tta

gtg

gca

tac

gac

ggc

cag

aat

720

Gly

Ala

Asn

Ser

Yal

Gly

Leu

His

Leu

Yal

Ala

Tyr

Asp

Gly

Gin

Asn

225

230

235

240

gat

ggc

atc

ttc

cgt

gcc

ggg

atc

gcc

gag

age

ggc

tcc

gta

ccc

tcc

768

Asp

Gly

Ile

Phe

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Glu

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Ser

245

250

255

ctc

gca

tac

atg

age

gcc

gaa

gat

gca

caa

cca

tac

tat

gat

gcc

816

Leu

Ala

Tyr

Met

Ser

Ala

Glu

Asp

Ala

Gin

Pro

Tyr

Asp

Ala

260

265

270

gtc

aac

gca

acc

aac

tgc

acc

ggc

tct

tcc

aac

acc

ctt

act

tgt

864

Yal

Asn

Ala

Thr

Asn

Cys

Thr

Gly

Ser

Asn

Thr

Leu

Thr

Cys

275

280

285

ctc

cgt

gaa

gtt

ccc

acc

gac

gtc

ctc

age

tcc

atc

ttc

aac

age

tcc

912

Leu

Arg

Glu

Yal

Pro

Thr

Asp

Yal

Leu

Ser

Ile

Phe

Asn

Ser

290 295 300 ctc gtc get ggg gca gga tat cat ccc gtc att gac ggc gat ttc ctc 960

Leu Yal Ala Gly Ala Gly Tyr His Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Leu

305 310 315 320 aga gcc teg ggg ata gtt aat ctc cag act ggc caa ttc gcc aaa acc 1008

Arg Ala Ser Gly Ile Yal Asn Leu Gin Thr Gly Gin Phe Ala Lys Thr

325 330 335 ccg ctt ctt atc ggc acc aac ttc gac gaa ggg acc aag tat gcc cct 1056

Pro Leu Leu Ile Gly Thr Asn Phe Asp Glu Gly Thr Lys Tyr Ala Pro

340 345 350 cat ggc tat aat acc acc gac caa ttt gtc tcc ctc gtc caa gcc aac 1104

His Gly Tyr Asn Thr Thr Asp Gin Phe Yal Ser Leu Val Gin Ala Asn

355 360 365 gga acc aat tat acc age get ctc acc att gca tcc ctg tac cca gat 1152

Gly Thr Asn Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Ile Ala Ser Leu Tyr Pro Asp

370 375 380

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

gac	cca	gcc	gtt	ggt	att	ccg	gga	acc
Asp	Pro	Ala	Val	Gly	Ile	Pro	Gly	Thr
385					390
tca	tac	ggt	tac	cag	tgg	aag	cgc	gtg
Ser	Tyr	Gly	Tyr	Gin	Trp	Lys	Arg	Val
				405
ctc	atg	cac	gcg	cct	cgc	cgc	gtg	aca
Leu	Met	His	Ala	Pro	Arg	Arg	Val	Thr
			420					425
aat	gta	cct	gcc	tac	gtg	tat	cac	tgg
Asn	Val	Pro	Ala	Tyr	Val	Tyr	His	Trp
		435					440
tta	gat	gga	gcc	gcg	cat	ggc	tat	gaa
Leu	Asp	Gly	Ala	Ala	His	Gly	Tyr	Glu
	450					455
tat	gat	ggt	ttg	ggc	gat	gaa	cgg	gga
Tyr	Asp	Gly	Leu	Gly	Asp	Glu	Arg	Gly
465					470
caa	eta	tcg	act	atg	atg	tca	cgg	atg
Gin	Leu	Ser	Thr	Met	Met	Ser	Arg	Met
				485
ttg	gat	ccg	aat	tat	agt	aat	agt	gag
Leu	Asp	Pro	Asn	Tyr	Ser	Asn	Ser	Glu
			500					505

ctt caa ggt cgt ccc cca ccg 1200 Leu Gin Gly Arg Pro Pro Pro

395 400 gct gcc ttc ctc ggc gat ctg 1248 Ala Ala Phe Leu Gly Asp Leu 410 415 acc cag tgg ctg gca cac tgg 1296 Thr Gin Trp Leu Ala His Trp .

430

aac	gtg	atg	aca	eta	ggg	cca	1344
Asn	Val	Met	Thr	Leu	Gly	Pro
			445
gtc	ccc	ttc	agt	ttc	cat	aat	1392
Val	Pro	Phe	Ser	Phe	His	Asn
		460
aac	gac	age	gtg	acc	tgg	cca	1440
Asn	Asp	Ser	Val	Thr	Trp	Pro
	475					480
tgg	gtg	age	ttt	att	aat	cat	1488
Trp	Val	Ser	Phe	Ile	Asn	His

490 495 tga 1518 <210> 27 <211> 505 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 27

Met

Ala

Ser

Val

Phe

Leu

Pro Leu

Leu

Ala

Ser

Leu Leu

Pro

1

5

10

15

Thr

Leu

Ala

Ser

Thr

Gin

Asn

Ala Asp

Thr

Pro

Thr

Ser

Ala Pro

Thr

20

25

30

Val

Gin

Val

Arg

Asn

Gly

Thr

Tyr Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Pro Thr

Tyr

35

40

45

Asn

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile Pro

Tyr

Ala

Gin

Pro

Pro Val

Gly

50

55

60

Glu

Leu

Arg

Phe

Arg

Pro

Gin Pro

Leu

Asn

Thr

Trp Thr

Gly

65

70

75

80

Thr

Arg

Asn

Ala

Thr

Ala

Tyr

Tyr Asn

Glu

Cys

Ile

Gly

Tyr Gly

Ser

85

90

95

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Asp Asp Trp Tyr Trp Thr Asp Val Val Ser Glu Asp Cys Leu Ala Leu 100 105 110

Ser Val Ile Arg Pro His Gly Ile Asp Ser Ser Ala Lys Leu Pro Val 115 120 125

Val Phe Trp Met His Gly Gly Glu Phe Ala Glu Gly Gly Thr Arg Asp 130 135 140

Ser Arg Tyr Asn Leu Ser Tyr Ile Val Gin Gin Ser Gin Glu Met Gin

145

150

155

160

Ser

Pro

Ile

Gly

Val

Thr

Val

Asn

Tyr

Arg

Leu

Ser

Gly

Trp

Gly

165

170

175

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gin

Glu

Val

Ala

Asp

Glu

Gly

Ser

Ala

Asn

Leu

Gly

180

185

190

Leu

Arg

Asp

Gin

Arg

His

Ala

Leu

Tyr

Trp

Leu

Gin

Glu

Asn

Ile

Ala

195

200

205

Ser

Phe

Gly

Asp

Pro

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Trp

Gly

Gin

Ser

Ala

210

215

220

Gly

Ala

Asn

Ser

Val

Gly

Leu

His

Leu

Val

Ala

Tyr

Asp

Gly

Gin

Asn

225

230

235

240

Asp

Gly

Ile

Phe

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Glu

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Ser

245

250

255

Leu

Ala

Tyr

Met

Ser

Ala

Glu

Asp

Ala

Gin

Pro

Tyr

Asp

Ala

260

265

270

Val

Asn

Ala

Thr

Asn

Cys

Thr

Gly

Ser

Asn

Thr

Leu

Thr

Cys

275

280

285

Leu

Arg

Glu

Val

Pro

Thr

Asp

Val

Leu

Ser

Ile

Phe

Asn

Ser

290

295

300

Leu

Val

Ala

Gly

Ala

Gly

Tyr

His

Pro

Val

Ile

Asp

Gly

Asp

Phe

Leu

305

310

315

320

Arg Ala Ser Gly Ile Val Asn Leu Gin Thr Gly Gin Phe Ala Lys Thr 325 330 335

Pro Leu Leu Ile Gly Thr Asn Phe Asp Glu Gly Thr Lys Tyr Ala Pro 340 345 350

His Gly Tyr Asn Thr Thr Asp Gin Phe Val Ser Leu Val Gin Ala Asn 355 360 365

Gly Thr Asn Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Ile Ala Ser Leu Tyr Pro Asp 370 375 380

Asp Pro Ala Val Gly Ile Pro Gly Thr Leu Gin Gly Arg Pro Pro Pro

385 390 395 400

Ser Tyr Gly Tyr Gin Trp Lys Arg Val Ala Ala Phe Leu Gly Asp Leu

405 410 415

Leu Met His Ala Pro Arg Arg Val Thr Thr Gin Trp Leu Ala His Trp

420 425 430

Asn Val Pro Ala Tyr Val Tyr His Trp Asn Val Met Thr Leu Gly Pro

435 440 445

PL 214 792 B1

21078WQ.ST25.txt

Leu

Asp

Gly

Ala

His

Gly

Tyr

Glu

Va1

Pro

Phe

Ser

Phe

His

Asn

450

455

460

Tyr

Asp

Gly

Leu

Gly

Asp

Glu

Arg

Gly

Asn

Asp

Ser

Va1

Thr

Trp

Pro

465

470

475

480

Gin

Leu

Ser

Thr

Met

Ser

Arg

Met

Trp

Val

Ser

Phe

Ile

Asn

His

485

490

495

Leu Asp Pro Asn Tyr Ser Asn Ser Glu

500 505 <210> 28 <211> 3091 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400 28 ggcgaacggg cctgagcgtg cgtcggaggc agaagtagag ccgggactat ggatattggc 60 gaggaatata ttatagtaga ttatagggag tcgaatgcag ctcggattgg gttgttactt 120 tgagtcagat ggacattgtt ggaaaagatg aacgcgacgg gaaaaaaaca tgaggatttg 180 cggggatttc gtcaeatgcg gaggcgcgga ttttcccctc cggatttact tcctcaactc 240 tcctttctct ttcatttcca tccgatttga gtccaactca tctcactcga agaatctcat 300 taatttcagg gtcctgctca gcccagtcaa ggttccttag tttcgatcct tcagttggcc 360 cgtcatgtcc attgaccagg aatggagcaa gccccgatga ggatcggcca gcggagacaa 420 ctgccaatcc ttggtatcca tacccttaac agcgcaatgg caccagctct ctgccgattc 480 acgtcatctg cacagcctag ctgccgatta ggcttgaccc cttctcactt gcggcatcag 540 tgccgctgat actagccccc acagagtgtt tctcccttcg actgtggctc ggaacgtggg 600 ggcgggttcc aagttcttat gcceagagtt ggttggctsg ccttgctcat ctgggtggcc 660 agcacacctc ccatacaata ggatccgtgg tgttggcagg attcttgtca tttcgccatg 720 tcgaatcacc gcatgcggaa ggaggacgcc ttgccttgca atgttttctc cacatctgcg 780 accctattgt tcagaccctg gagccgattc cgcgagatgt attcctgccg ggccactgaa 840 agtgctttat aacgtctggg gtgtcctttt attgatgaga gcatgatctt tcgcgttaca 900 gttctcacaa tcggttaaag cattcgtggc cccgaggctc gttgcacaac acaatatgat 960 tttctttcat ctggcaccgt tcttctttct ctttggtcta gtagtatctt ctcsgaaccc 1020 tacggtggac cttggctaca caagatataa aggcaaatct ctgcccaatg gtatcagtca 1080 gtggctgggg atacgctacg cggctgcacc taccgggtct ctgcggttct ctgcgccsca 1140 ggatcctgac acggtagatg gcgttcaaga agcattcaag gtatggtttt ttctacaata 1200 aataaaaaga tatattgcga gtctgtgctt tgctaatacc cagggcacag catggtcccc 1260 ggtgtgttcc caccagccaa tatcccactc ccgcaggcac gtccgaggat tgtctcttcc 1320 tcgatgtata cgctcccagc tcggtggaag ctactacgag gctgcccgtt ttcgtttgga 1380 ttcaaggagg cggcttcaat gccaactcca gccccaacta caatggaaca ggattgatcg 1440 aagcggccaa tatgtccatg gtggtggtca ccttcaacta cagggtcggt ccgtacgggt 1500 tcctctctgg atccgaggtg ctggagggag gaagcgtgaa caatggcctg aaggaccaaa 1560 tcaaggtcct gaagtgggtg caagagcata teagcaaggt atgcggacac tcaccaaccc 1620 acagcaaatc accgctaatt gcagccgcag tttggaggcg stcccagtca cgttgttatc 1680

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt ggcggcgaca gcgcaggcgc agcgtctatc actctccatc tttcagccca cggtggcaga 1740 gacgacgaac tattccacgc tgccgccgca gagtcccaaa gctttgctcc tatgttgacc 1800 gtcaatcaaa gccaattcgc ctataacaac ctggtcatcc gcgccggctg cgcaagcgat 1860 tcagacaccc tcgcctgctt acgccgacta aacaccacag aactgcagcg catcaacatc 1920 aacacaccct tacccaccgc ccaacaagca cctctctacc tgtacggtcc cgtcgtcgac 1980 ggctccctca tcccagacta cacataccgg cttttccagc aaggcaaatt catcaaagtc 2040 cccgtaatct tcggcgacga caccaacgaa ggaacaatct tcgtccccaa aacgacctcc 2100 accgtcggcg aagccgacac cttcatccaa gaccaattcc ccaacatcaa cttcacccac 2160 ctaaccaagc tgaacgactg gtatctcaaa gaaaaccaaa ctcgcgagtt ccccaattcc 2220 tccccctact ggcgtcccgc tagcaccgcg tacggtgaaa tcagatatat ctgtccgggg 2280 atctacatgt cctctgtgtt tgctagtgcc ggtgtcaaca gctggaacta tcattatgct 2340 gtgcaggacc ccgccgcgga agcctcaggc agaggtgtca gtcatactgt ggaagaaaat 2400 gccatttggg gcccgcagta tgtgagtggc acaccgccgg cgtcgtatct cactgagaat 2460 gcgccaattg tgccggtgat gcagggctac tggacgagtt tcattagagt gtttgatccg 2520 aatccgctga ggtatccggg gagtccggag tggaagacgt ggagtgatgg acatggggag 2580 gattatcggc ggatatttgt ccgcacgaat gagacgagga tggagacggt gtcggaggcg 2640 cagagggaaa ggtgcgaata ttggagtagt gttgggccgg acttgtcgca gtgattgcac 2700 ttattatctt tgttcggtgg taaggtatat atatagatag tataatattg taagctatag 2760 agtgatggta cgtgaattga atatatggag aaagatggtc ttgtataaat caaaacattc 2820 ttttttggct gccattccac gatcatcatt cccaatgatc aaaccaagta actataaccg 2880 aatatataca tctatatcaa cctgcttctc atcagaatta ccaaaagacg ggtccggcac 2940 acacagctag accgagcaga tacgtcgaca tgaacccagg tgatgaaaca taatgcaaca 3000 aaagaaagag aaaagaaggc aaaacaagtg agaagcacta ctgctccaca tagagcagta 3060 aacgaacgat gaatgaggga tatcatcatc a 3091

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

40 45 gcg gct gca cct acc ggg tct ctg cgg ttc tct gcg cca cag gat cct 192

Ala	Ala	Ala	Pro	Thr	Gly	Ser	Leu	Arg
	50					55
gac	acg	gta	gat	ggc	gtt	caa	gaa	gca
Asp	Thr	Val	Asp	Gly	Val	Gin	Glu	Ala
65					70
gtt	ccc	acc	age	caa	tat	ccc	act	ccc
Val	Pro	Thr	Ser	Gin	Tyr	Pro	Thr	Pro
				85
ctc	ttc	ctc	gat	gta	tac	gct	ccc	age
Leu	Phe	Leu	Asp	Val	Tyr	Ala	Pro	Ser
			100					105
ctg	ccc	gtt	ttc	gtt	tgg	att	caa	gga
Leu	Pro	Val	Phe	Val	Trp	Ile	Gin	Gly
		115					120
age	ccc	aac	tac	aat	gga	aca	gga	ttg
Ser	Pro	Asn	Tyr	Asn	Gly	Thr	Gly	Leu
	130					135
atg	gtg	gtg	gtc	acc	ttc	aac	tac	agg
Met	Val	Val	Val	Thr	Phe	Asn	Tyr	Arg
145					150
tct	gga	tcc	gag	gtg	ctg	gag	gga	gga
Ser	Gly	Ser	Glu	Val	Leu	Glu	Gly	Gly
				165
gac	caa	atc	aag	gtc	ctg	aag	tgg	gtg
Asp	Gin	Ile	Lys	Vąl	Leu	Lys	Trp	Val
			180					185
gga	ggc	gat	ccc	agt	cac	gtt	gtt	atc
Gly	Gly	Asp	Pro	Ser	His	Val	Val	Ile
		195					200
gcg	tct	atc	act	ctc	cat	ctt	tea	gcc
Ala	Ser	Ile	Thr	Leu	His	Leu	Ser	Ala
	210					215
eta	ttc	cac	gct	gcc	gcc	gca	gag	tcc
Leu	Phe	His	Ala	Ala	Ala	Ala	Glu	Ser
225					230
acc	gtc	aat	caa	age	caa	ttc	gcc	tat
Thr	Val	Asn	Gin	Ser	Gin	Phe	Ala	Tyr
				245
ggc	tgc	gca	age	gat	tea	gac	acc	ctc
Gly	Cys	Ala	Ser	Asp	Ser	Asp	Thr	Leu
			260					265
acc	aca	gaa	ctg	cag	cgc	atc	aac	atc

Phe	Ser	Ala	Pro	Gin	Asp	Pro
		60
ttc	aag	cat	ggt	ccc	cgg	tgt	240
Phe	Lys	His	Gly	Pro	Arg	Cys
	75					80
gca	ggc	acg	tcc	gag	gat	tgt	288
Ala	Gly	Thr	Ser	Glu	Asp	Cys
90					95
teg	gtg	gaa	gct	act	acg	agg	336
Ser	Val	Glu	Ala	Thr	Thr	Arg
				110
ggc	ggc	ttc	aat	gcc	aac	tcc	384
Gly	Gly	Phe	Asn	Ala	Asn	Ser
			125
atc	gaa	gcg	gcc	aat	atg	tcc	432
Ile	Glu	Ala	Ala	Asn	Met	Ser
		140
gtc	ggt	ccg	tac	ggg	ttc	ctc	480
Val	Gly	Pro	Tyr	Gly	Phe	Leu
	155					160
age	gtg	aac	aat	ggc	ctg	aag	528
Ser	Val	Asn	Asn	Gly	Leu	Lys
170					175
caa	gag	cat	atc	age	aag	ttt	576
Gin	Glu	His	Ile	Ser	Lys	Phe
				190
ggc	ggc	gac	age	gca	ggc	gca	624
Gly	Gly	Asp	Ser	Ala	Gly	Ala
			205
cac	ggt	ggc	aga	gac	gac	gaa	672

His Gly Gly Arg Asp Asp Glu 220 caa age ttt gct cct atg ttg 720 Gin Ser Phe Ala Pro Met Leu

235 240

aac	aac	ctg	gtc	atc	cgc	gcc	768
Asn	Asn	Leu	Val	Ile	Arg	Ala
250					255
gcc	tgc	tta	cgc	ega	eta	aac	816
Ala	Cys	Leu	Arg	Arg	Leu	Asn
				270
aac	aca	ccc	tta	ccc	acc	gcc	864

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Thr

Glu

Leu

Gin

Arg

Ile

Asn

Ile

Asn

Thr

Pro

Leu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

caa

gca

cct

ctc

tac

ctg

tac

ggt

ccc

gtc

gac

ggc

tcc

ctc

912

Gin

Ala

Pro

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Pro

Yal

Asp

Gly

Ser

Leu

290

295

300

atc

cca

gac

tac

aca

tac

cgg

ctt

ttc

cag

caa

ggc

aaa

ttc

atc

aaa

960

Ile

Pro

Asp

Tyr

Thr

Tyr

Arg

Leu

Phe

Gin

Gly

Lys

Phe

Ile

Lys

305

310

315

320

gtc

ccc

gta

atc

ttc

ggc

gac

acc

aac

gaa

gga

aca

atc

ttc

gtc

1008

Val

Pro

Val

Ile

Phe

Gly

Asp

Thr

Asn

Glu

Gly

Thr

Ile

Phe

Yal

325

330

335

ccc

aaa

acg

acc

tcc

acc

gtc

ggc

gaa

gcć

gac

acc

ttc

atc

caa

gac

1056

Pro

Lys

Thr

Ser

Thr

Yal

Gly

Glu

Ala

Asp

Thr

Phe

Ile

Gin

Asp

340

345

350

caa

ttc

ccc

aac

atc

aac

ttc

acc

cac

eta

acc

aag

ctg

aac

gac

tgg

1104

Gin

Phe

Pro

Asn

Ile

Asn

Phe

Thr

His

Leu

Thr

Lys

Leu

Asn

Asp

Trp

355

350

365

tat

ctc

aaa

gaa

aac

caa

act

ege

gag

ttc

ccc

aat

tcc

ccc

tac

1152

Tyr

Leu

Lys

Glu

Asn

Gin

Thr

Arg

Glu

Phe

Pro

Asn

Ser

Pro

Tyr

370

375

380

tgg

cgt

ccc

get

agc

acc

gcg

tac

ggt

gaa

atc

aga

tat

atc

tgt

ccg

1200

Trp

Arg

Pro

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ile

Arg

Tyr

Ile

Cys

Pro

385

390

395

400

ggg

atc

tac

atg

tcc

tet

gtg

ttt

get

agt

gcc

ggt

gtc

aac

agc

tgg

1248

Gly

Ile

Tyr

Met

Ser

Val

Phe

Ala

Ser

Ala

Gly

Val

Asn

Ser

Trp

405

410

415

aac

tat

cat

tat

get

gtg

cag

gac

ccc

gcc

gcg

gaa

gcc

tea

ggc

aga

1296

Asn

Tyr

His

Tyr

Ala

Val

Gin

Asp

Pro

Ala

Glu

Ala

Ser

Gly

Arg

420

425

430

ggt

gtc

agt

cat

act

gtg

gaa

aat

gcc

att

tgg

ggc

ccg

cag

tat

1344

Gly

Yal

Ser

His

Thr

Yal

Glu

Asn

Ala

Ile

Trp

Gly

Pro

Gin

Tyr

435

440

445

gtg

agt

ggc

aca

ccg

gcg

teg

tat

ctc

act

gag

aat

gcg

cca

att

1392

Yal

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

Ala

Pro

Ile

450

455

460

gt-g

ccg

gtg

atg

cag

ggc

tac

tgg

acg

agt

ttc

att

aga

gtg

ttt

gat

1440

Yal

Pro

Yal

Met

Gin

Gly

Tyr

Trp

Thr

Ser

Phe

Ile

Arg

Val

Phe

Asp

465

470

475

480

ccg

aat

ccg

ctg

agg

tat

ccg

ggg

agt

ccg

gag

tgg

aag

acg

tgg

agt

1488

Pro

Asn

Pro

Leu

Arg

Tyr

Pro

Gly

Ser

Pro

Glu

Trp

Lys

Thr

Trp

Ser

485

490

495

gat

gga

cat

ggg

gag

gat

tat

cgg

ata

ttt

gtc

ege

acg

aat

gag

1536

Asp

Gly

His

Gly

Glu

Asp

Tyr

Arg

Ile

Phe

Yal

Arg

Thr

Asn

Glu

500

505

510

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt acg agg atg gag acg gtg teg gag gcg cag agg gaa agg tgc gaa tat 1584

Thr Arg Met Glu Thr Val Ser Glu Ala Gin Arg Glu Arg Cys Glu Tyr

515 520 525 tgg agt agt gtt ggg ccg gac ttg teg cag tga 1617

Trp Ser Ser Val Gly Pro Asp Leu Ser Gin

530 535 <210> 30 <211> 538 <212> PRT <213> Aspergillus niger

<400 30

Met Ile

Phe

His

Leu Ala

Pro

Phe

Leu

Phe

Gly

Leu

Val

1

5

10

15

Val Ser

Ser

Gin

Asn

Pro Thr

Val

Asp

Leu

Gly

Tyr

Thr

Arg

Tyr

Lys

20

25

30

Gly Lys

Ser

Leu

Pro

Asn Gly

Ile

Ser

Gin

Trp

Leu

Gly

Ile

Arg

Tyr

35

40

45

Ala Ala

Ala

Pro

Thr

Gly Ser

Leu

Arg

Phe

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

Pro

50

55

60

Asp Thr

Val

Asp

Gly

Val Gin

Glu

Ala

Phe

Lys

His

Gly

Pro

Arg

Cys

65

70

75

80

Val Pro

Thr

Ser

Gin

Tyr Pro

Thr

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Glu

Asp

Cys

85

90

95

Leu Phe

Leu

Asp

Val

Tyr Ala

Pro

Ser

Val

Glu

Ala

Thr

Arg

100

105

110

Leu Pro Val Phe Val Trp Ile Gin Gly Gly Gly Phe Asn Ala Asn Ser 115 120 125

Ser Pro Asn Tyr Asn Gly Thr Gly Leu Ile Glu Ala Ala Asn Met Ser

130

135

140

Met

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

Tyr

Gly Phe

Leu

145

150

155

160

Ser

Gly

Ser

Glu

Val

Leu

Glu

Gly

Ser

Val

Asn

Gly Leu

Lys

165

170

175

Asp

Gin

Ile

Lys

Val

Leu

Lys

Trp

Val

Gin

Glu

His

Ile

Ser Lys

Phe

180

185

190

Gly

Asp

Pro

Ser

His

Val

Ile

Gly

Asp

Ser

Ala Gly

Ala

195

200

205

Ala

Ser

Ile

Thr

Leu

His

Leu

Ser

Ala

His

Gly

Arg

Asp Asp

Glu

210

215

220

Leu

Phe

His

Ala

Glu

Ser

Gin

Ser

Phe

Ala

Pro Met

Leu

225

230

235

240

PL 214 792 B1

21078WO

.ST2i

5.txt

Thr

Val

Asn

Gin

Ser

Gin

Phe

Ala

Tyr Asn

Asn

Leu Val

Ile

Arg

Ala

245

250

255

Gly

Cys

Ala

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr

Leu Ala

Cys

Leu Arg

Arg

Leu

Asn

260

265

270

Thr

Glu

Leu

Gin

Arg

Ile

Asn

Ile Asn

Thr

Pro Leu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

Gin

Ala

Pro

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Gly Pro

Val

Val Asp

Gly

Ser

Leu

290

295

300

Ile

Pro

Asp

Tyr

Thr

Tyr

Arg

Leu

Phe Gin

Gin

Gly Lys

Phe

Ile

Lys

305

310

315

320

Val

Pro

Val

Ile

Phe

Gly

Asp

Thr Asn

Glu

Gly Thr

Ile

Phe

Val

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Ser

Thr

Val

Gly

Glu Ala

Asp

Thr Phe

Ile

Gin

Asp

340

345

350

Gin Phe Pro Asn Ile Asn Phe Thr His Leu Thr Lys Leu Asn Asp Trp 355 360 365

Tyr Leu Lys Glu Asn Gin Thr Arg Glu Phe Pro Asn Ser Ser Pro Tyr 370 375 380

Trp Arg Pro Ala Ser Thr Ala Tyr Gly Glu Ile Arg Tyr Ile Cys Pro 385 390 395 400 Gly Ile Tyr Met Ser Ser Val Phe Ala Ser Ala Gly Val Asn Ser Trp

405

410

415

Asn

Tyr

His

Tyr

Ala

Val

Gin

Asp

Pro

Ala

Glu

Ala

Ser

Gly

Arg

420

425

430

Gly

Val

Ser

His

Thr

Val

Glu

Asn

Ala

Ile

Trp

Gly

Pro

Gin

Tyr

435

440

445

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

Ala

Pro

Ile

450

455

460

Va1

Pro

Val

Met

Gin

Gly

Tyr

Trp

Thr

Ser

Phe

Ile

Arg

Val

Phe

Asp

465

470

475

480

Pro

Asn

Pro

Leu

Arg

Tyr

Pro

Gly

Ser

Pro

Glu

Trp

Lys

Thr

Trp

Ser

485

490

495

Asp

Gly

His

Gly

Glu

Asp

Tyr

Arg

Ile

Phe

Val

Arg

Thr

Asn

Glu

500

505

510

Thr

Arg

Met

Glu

Thr

Val

Ser

Glu

Ala

Gin

Arg

Glu

Arg

Cys

Glu

Tyr

515

520

525

Trp

Ser

Val

Gly

Pro

Asp

Leu

Ser

Gin

530

535

<210> 31 <211> 4575 <21-2> DNA <213> Aspergillus niger

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt <400> 31 gatgcaactt cagtgaaatt gagacgattg taactcatca tcgcatctca catggaaagg 60 ttgtacaccc aacaattaga cctcaacata tttcacggat attcctgcaa gatatataat 120 aaagccatca ctccactttg gtagatatgt tagccaaccg ggtttgagcg agtttcttga 180 atggactcat taagggtagg atcaattctg atgtccacaa ttggtcccta tttgccagat 240 gtaggcccag agaattcggt atcttgcaga tttgcgatgc tatcccggtt tccagtaaac 300 tattaggttc ggctcggtca caccagacag acacgactga cccatgcgct gccaggaatc 360 ctgataggcc tagcagtccc gcgtgcacat atcggcttgg tagaaaagga tagccgtgaa 420 tgtataatct ttcagatgac ggttaaatgc gtttctgtat ggtgagaagc tgtgtagatg 480 ggagatgagc tgtaaatggc ttcgcagtgg caacctctag gctgctgcag gccggaatac 540 tgcatggcgt gattttcgtc gtgaatcttg ttcatataca ggtgtaaaac acacgtaagg 600 aaaatcttgt tatagcaggg ttgaaaacag ttgctagaat tggcagtgac tgttgcggtt 660 gcaagggttt attttgcacc cttgaagtac actgcgcttg gtcaaaggca aatcacccca 720 tcaagtaata aatatatatc tctgttatca agtcggctcc tctagtagtg cagcctcagt 780 acagacaaca gggactaaca gcactcttgc tgttgagctt gagcgcacct cacctttctc 840 tccggcctct ttcgtatttg gcatttcaat ggcctgttat gggacttctg agcctgcttg 900 attgagtgat atggtagtgc gagcgcaaaa aaggtgattt tcaaacacca tgatgcaaag 960 tcagaggtaa gtgcgagagg gagatcagga ggaggagagc tttatataag gccgcgtagg 1020 cggcagagac ggcaagacat ctggtgaagt accagcattc agtgaatttt ataacagtat 1080 tatttgtcat cacgactctg cattgccttt aataagctcg gcgtaatttg gtagggaccc 1140 taggtttgga tagccccagg ggggcttggt gtcggttgtg gagcttgctg cccgagattc 1200 attttacacc tagtcaggga tccgggcggg ttttatacct ccctggaggc ggaatgtacc 1260 tttgttatca ctgaaaattc cggccatttt gttctatttt actggctatg gggtttgcca 1320 ctatcgctca catcctcgca aggcacctcc cgatactgca gtcaaacgtg ggagttgccg 1380 atagaaacta caagatcaaa tctcgttccc tgggttggac ggtcacattc ggtgaaagag 1440 gtttatcttc gctccaacca gcctttcatg tcgggcgctc agtgcataag atccaagcaa 1500 ttttaagcac tgtactccac tagtcacact gttttagcag tgcatgcttc tgaatcagga 1560 ctaaactccg atttttctca gtgaatactg ctaaagacaa ttatgatcct acagactatc 1620 tctgtgaaaa agcgcagtta acttctcgtc aatcatgaag ccattttgag cctttctccg 1680 tcaatcattc acccctactg ttgactatat cagccctaag ggaataaaac atttgccgta 1740 gaggtgaact ataactcaat caatgactga aagcttaacg tatctcacaa ttcatctcac 1800 cgtgaagagt catttacatt tacgatccag ccaggccgcg ctgacatcag caggcgtgag 1860 agcgcatcca tgcttgctcg gacataagcc gaatccattg catgatgcga ccttcccgaa 1920 agagtatggg tgtccgaact gaccatgtca gtggccccat atggctctca actacacgaa 1980 cacagacctt tatcagtccc ggtccccaca acttaaatcc ggagatgcgg gggtgcagga 2040 atggaacacg gatacatgtg tggaatgtag gaccaaacaa attggctgtc gtggacattc 2100 gactcgactt gacccctcaa tgcgctggcc ggaggactga gccatagggt ataagaacac 2160 cgtgatcact catgcctcgt tatcgctttt ctatcattat gtctcgatat caggaagaca 2220 tagcatgacc gtgaacacga tgaagggaat gctcccgacg cttagttggt tggcactggg 2280 catggccagc ctggcaacct gcaccaaccc agtagcccag acaaagaacg gaagttatta 2340 tggtgtctac atgcctcagt ataatgagga ttattttctt ggaattccat ttgctaagcc 2400 cccgttggca cacttgcgtt gggccaaccc cgagagtctt aatgagtctt ggtcgggatt 2460 gcgccctgct accggctatg cgatggtaag tagcctgaac agactgctaa acgaccatgt 2520

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt acttactaac agcgcgtgtg ataggaatgt ataggttacg gcagtgatca aaaaggttat 2580 ctgcaggtga ggatttgacg ccactttctt tacgctgttc tctactaacc agcaaaatag 2640 agcgaggact gtctctacct aaacgtggtc cgtcccgctg aatacgacaa tgccagtctt 2700 ccagtccttg tatggattca tggtatgtag tgaaatctac ctcaacgaca agttactccc 2760 gacgctgaat gaacaaaaca ggcggtggct tcgcacaagg cggcactccc gaccttcgat 2820 acaatcttac atttattgtt gaacactcgg tcaatatcgg ccagccaatt atcgcagtga 2880 gcgttgccta tcgtctcggt ccttggggtt tcttcaatgg ggtcgagctc gccaatgagg 2940 gatcgttaaa tctcgggctg aaggaccagc gcttggccct gcattgggtg aaagagaaca 3000 ttgcaggttt cggtggtggg tttccataaa gctattaaac gtacacagtc caaaattact 3060 aatgacagtc actcctatac aggcgaccct agtaaagtcg tgatttacgg acaaagtgcc 3120 ggctccgaaa gcgtgggata ccaaatccgc gcgtacaacg gccgagatga cgggctcttc 3180 cgcggaggca tgatggagtc cggcgcggtg ttacctggca gtgccttgaa cctcacctgg 3240 acatatgagc cttggttcca gcaaatagca gacgaggcag gatgttccca gaccacccgc 3300 aaactggact gtctacgccg cacgcccttc acagtcctaa acaacattct gaacaccacc 3360 gccaacgaca cgacgcctta caactggagg cccacagtgg acggtgactt cgtagcgcga 3420 tatcccagcg agcaactcga cacaggagac ttcgtcaaag taccaatcat aatcggctac 3480 accacggacg aaggaacaac agagtgccca gaaccagtga acaccaccgc cgaattaaaa 3540 gaatacctca gctgtacgta cctccttccc ttcctccctt atccccccat ccccatccca 3600 ataacaccaa cccagcaaca acaacctacg gctgggccct cgactcacag gtagtatcct 3660 cgctcctgga cctctacccc aacaccacct ccttcggcat cccatcatcc gaagaactcg 3720 gcggcaacgt caccttccca cagccctacg gcgccgcatt ccgccagacg gcagcatact 3780 acggcgacgc ccagttcata gccgcgacgc gctacacctg tgagctatgg gcggcacata 3840 acctgacagc atattgctac cgattcaaca ccaagacaga cgattacaac agggaagaag 3900 gcgtggcgca tttctcggac gtgatcttca tcttcaacaa ccttaatggt tatgggttca 3960 gtccgaaccc gttcaccaat gctccagaga gctatactga gcttagctac ctcatgtccg 4020 gctcgtggat cagcttcact aatagtctgg atcctaataa gtggactggt cgcggaagga 4080 acgctacgaa gacggagaat tggcccgtgt atgatctgga gaatcccttg agtatgatct 4140 gggatgcgaa tgtcacttcg tatgcggcgc cggatacttg gcgtaaggag ggtattgcgt 4200 tgattaatgc taatcggagg gcgtatcaga ggtgaatgtg gtgtagcttg cagccgttgc 4260 ctacttgttc gactttcaaa ctcaaaactt tctattgaga gagaaaattg tgcgaggaaa 4320 gtactaccgc gggcagaaca ctctgcgcac aggtccatat ctacaaactc actgaacaga 4380 gtctatagca gattaggtag attgtcaagc ttacatacag acataacccc accacaatat 4440 cgtggtaaga tagcacattt ctttaaagaa gaaaaaaaaa gatgaataca tataatcggc 4500 tacgtcaata attcaaaaca gaatatgtca gctgtgcaca catccgacca ttacactagt 4560 aaagtgagcg gcggc 4575 <210 32 <211> 1695 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220 <221> CDS

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt <222> (1)..(1695) <400> 32 atg aag gga atg ctc ccg acg ctt agt tgg ttg gca ctg ggc atg gcc 48

Met Lys Gly Met Leu Pro Thr Leu Ser Trp Leu Ala Leu Gly Met Ala

10 15 age ctg gca acc tgc acc aac cca gta gcc cag aca aag aac gga agt 96

Ser Leu Ala Thr Cys Thr Asn Pro Val Ala Gin Thr Lys Asn Gly Ser

25 30

tat

ggt

gtc

tac atg

cct

cag

tat

aat

gag

gat

tat

ttt

ctt

gga

144

Tyr

Gly

Yal

Tyr Met

Pro

Gin

Tyr

Asn

Glu

Asp

Tyr

Phe

Leu

Gly

35

40

45

att

cca

ttt

get

aag ccc

ccg

ttg

gca

cac

ttg

cgt

tgg

gcc

aac

ccc

192

Ile

Pro

Phe

Ala

Lys Pro

Pro

Leu

Ala

His

Leu

Arg

Trp

Ala

Asn

Pro

50

55

60

gag agt ctt aat gag tet tgg tcg gga ttg ege cct get acc ggc tat 240

Glu Ser Leu Asn Glu Ser Trp Ser Gly Leu Arg Pro Ala Thr Gly Tyr

70 75 80 gcg atg gaa tgt ata ggt tac ggc agt gat caa aaa ggt tat ctg cag 288

Ala Met Glu Cys Ile Gly Tyr Gly Ser Asp Gin Lys Gly Tyr Leu Gin

90 95 age gag gac tgt ctc tac eta aac gtg gtc cgt ccc get gaa tac gac 336

Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Val Arg Pro Ala Glu Tyr Asp

100 105 110 aat gcc agt ctt cca gtc ctt gta tgg att cat ggc ggt ggc ttc gca 384

Asn Ala Ser Leu Pro Val Leu Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ala . 115 120 125 caa ggc ggc act ccc gac ctt ega tac aat ctt aca ttt att gtt gaa 432

Gin Gly Gly Thr Pro Asp Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Phe Ile Val Glu

130 135 140 cac tcg gtc aat atc ggc cag cca att atc gca gtg age gtt gcc tat 480

His Ser Val Asn Ile Gly Gin Pro Ile Ile Ala Val Ser Yal Ala Tyr

145 150 155 160 cgt ctc ggt cct tgg ggt ttc ttc aat ggg gtc gag ctc gcc aat gag 528

Arg Leu Gly Pro Trp Gly Phe Phe Asn Gly Val Glu Leu Ala Asn Glu

165 170 175 gga tcg tta aat ctc ggg ctg aag gac cag ege ttg gcc ctg cat tgg 576

Gly Ser Leu Asn Leu Gly Leu Lys Asp Gin Arg Leu Ala Leu His Trp . 180 185 190 gtg aaa gag aac att gca ggt ttc ggt ggc gac cct agt aaa gtc gtg 624

Val Lys Glu Asn Ile Ala Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Yal

195 200 205 att tac gga caa agt gcc ggc tcc gaa age gtg gga tac caa atc ege 672

Ile Tyr Gly Gin Ser Ala Gly Ser Glu Ser Val Gly Tyr Gin Ile Arg

PL 214 792 B1

21078Wu.ST25.txt 210 215 220

gcg	tac	aac	ggc	ega	gat	gac	ggg	ctc
Ala	Tyr	Asn	Gly	Arg	Asp	Asp	Gly	Leu
225					230
tcc	ggc	gcg	gtg	tta	cct	ggc	agt	gcc
Ser	Gly	Ala	Val	Leu	Pro	Gly	Ser	Ala
				245
gag	cct	tgg	ttc	cag	caa	ata	gca	gac
Glu	Pro	Trp	Phe	Gin	Gin	Ile	Ala	Asp
			260					265
acc	cgc	aaa	ctg	gac	tgt	eta	cgc	cgc
Thr	Arg	Lys	Leu	Asp	Cys	Leu	Arg	Arg
		275					280
aac	att	ctg	aac	acc	acc	gcc	aac	gac
Asn	Ile	Leu	Asn	Thr	Thr	Ala	Asn	Asp
	290					295
ccc	aca	gtg	gac	ggt	gac	ttc	gta	gcg
Pro	Thr	Val	Asp	Gly	Asp	Phe	Val	Ala
305					310
gac	aca	gga	gac	ttc	gtc	aaa	gta	cca
Asp	Thr	Gly	Asp	Phe	Val	Lys	Val	Pro
				325
gac	gaa	gga	aca	aca	gag	tgc	cca	gaa
Asp	Glu	Gly	Thr	Thr	Glu	Cys	Pro	Glu
			340					345
tta	aaa	gaa	tac	ctc	agc	tea	aca	aca
Leu	Lys	Glu	Tyr	Leu	Ser	Ser	Thr	Thr
		355					360
tea	cag	gta	gta	tcc	teg	ctc	ctg	nar¹y c*L·
Ser	Gin	Val	Val	Ser	Ser	Leu	Leu	Asp
	370					375
ttc	ggc	atc	cca	tea	tcc	gaa	gaa	ctc

Phe Gly ile Pro Ser Ser Glu Glu Leu 385 390 cag ccc tac ggc gcc gca ttc cgc cag

Gin Pro Tyr Gly Ala Ala Phe Arg Gin

405 gcc cag- ttc ata gcc gcg acg cgc tac

Ala Gin Phe Ile Ala Ala Thr Arg Tyr

420 425 cat aac ctg aca gca tat tgc tac ega

His Asn Leu Thr Ala Tyr Cys Tyr Arg

435 440 tac aac agg gaa gaa ggc gtg gcg cat

ttc	cgc	gga	ggc	atg	atg	gag	720
Phe	Arg	Gly	Gly	Met	Met	Glu
	235					240
ttg	aac	ctc	acc	tgg	aca	tat	768
Leu	Asn	Leu	Thr	Trp	Thr	Tyr
250					255
gag	gca	gga	tgt	tcc	cag	acc	816
Glu	Ala	Gly	Cys	Ser	Gin	Thr
				270
acg	ccc	ttc	aca	gtc	eta	aac	864
Thr	Pro	Phe	Thr	Val	Leu	Asn
			285
acg	acg	cct	tac	aac	tgg	agg	912
Thr	Thr	Pro	Tyr	Asn	Trp	Arg
		300
ega	tat	ccc	agc	gag	caa	ctc	960
Arg	Tyr	Pro	Ser	Glu	Gin	Leu
	315					320
atc	ata	atc	ggc	tac	acc	acg	1008
Ile	Ile	Ile	Gly	Tyr	Thr	Thr
330					335
cca	gtg	aac	acc	acc	gcc	gaa	1056
Pro	Val	Asn	Thr	Thr	Ala	Glu
				350
acc	tac	ggc	tgg	gcc	ctc	gac	1104
Thr	Tyr	Gly	Trp	Ala	Leu	Asp
			365
ctc	tac	ccc	aac	acc	acc	tcc	1152
Leu	Tyr	Pro	Asn	Thr	Thr	Ser
		380
ggc	ggc	aac	gtc	acc	ttc	cca	1200
Gly	Gly	Asn	Val	Thr	Phe	Pro
	395					400
acg	gca	gca	tac	tac	ggc	gac	1248
Thr	Ala	Ala	Tyr	Tyr	Gly	Asp
410					415
acc	tgt	gag	eta	tgg	gcg	gca	1296
Thr	Cys	Glu	Leu	Trp	Ala	Ala
				430
ttc	aac	acc	aag	aca	gac	gat	1344
Phe	Asn	Thr	Lys	Thr	Asp	Asp
			445
ttc	teg	gac	gtg	atc	ttc	atc	1392

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Tyr

Asn

Arg

Glu

Gly

Val

Ala

His

Phe

Ser

Asp

Yal

Ile

Phe

Ile

450

455

460

ttc

aac

ctt

aat

ggt

tat

ggg

ttc

agt

ccg

aac

ccg

ttc

acc

aat

1440

Phe

Asn

Leu

Asn

Gly

Tyr

Gly

Phe

Ser

Pro

Asn

Pro

Phe

Thr

Asn

465

470

475

480

get

cca

gag

age

tat

act

gag

ctt

age

tac

ctc

atg

tcc

ggc

tcg

tgg

1488

Ala

Pro

Glu

Ser

Tyr

Thr

Glu

Leu

Ser

Tyr

Leu

Met

Ser

Gly

Ser

Trp

485

490

495

atc

age

ttc

act

aat

agt

ctg

gat

cct

aat

aag

tgg

act

ggt

ege

gga

1536

Ile

Ser

Phe

Thr

Asn

Ser

Leu

Asp

Pro

Asn

Lys

Trp

Thr

Gly

Arg

Gly

500

505

510

agg

aac

get

acg

aag

acg

gag

aat

tgg

ccc

gtg

tat

gat

ctg

gag

aat

1584

Arg

Asn

Ala

Thr

Lys

Thr

Glu

Asn

Trp

Pro

Val

Tyr

Asp

Leu

Glu

Asn

515

520

525

ccc

ttg

agt

atg

atc

tgg

gat

gcg

aat

gtc

act’

tcg

tat

gcg

ccg

1632

Pro

Leu

Ser

Met

Ile

Trp

Asp

Ala

Asn

Yal

Thr

Ser

Tyr

Ala

Pro

530

535

540

gat

act

tgg

cgt

aag

gag

ggt

att

gcg

ttg

att

aat

get

aat

cgg

agg

1680

Asp

Thr

Trp

Arg

Lys

Glu

Gly

Ile

Ala

Leu

Ile

Asn

Ala

Asn

Arg

545

550

555

560

gcg

tat

cag

agg

tga

1695

Ala

Tyr

Gin

Arg

<210> 33

<211> 564

<212> PRT

<213> Aspergillus u

iger

<400> 33

Met

Lys

Gly

Met

Leu

Pro

Thr

Leu

Ser

Trp

Leu

Ala

Leu

Gly

Met

Ala

1

5

10

15

Ser

Leu

Ala

Thr

Cys

Thr

Asn

Pro

Val

Ala

Gin

Thr

Lys

Asn

Gly

Ser

20

25

30

Tyr Tyr Gly Val Tyr Met Pro Gin Tyr Asn Glu Asp Tyr Phe Leu Gly 35 40 45

Ile

Pro

Phe

Ala

Lys

Pro

Leu

Ala

His

Leu

Arg

Trp

Ala

Asn

Pro

50

55

60

Glu

Ser

Leu

Asn

Glu

Ser

Trp

Ser

Gly

Leu

Arg

Pro

Ala

Thr

Gly

Tyr

65

70

75

80

Ala

Met

Glu

Cys

Ile

Gly

Tyr

Gly

Ser

Asp

Gin

Lys

.Gly

Tyr

Leu

Gin

85

90

95

Ser

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Leu

Asn

Val

Yal

Arg

Pro

Ala

Glu

Tyr

Asp

100

105

110

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Asn Ala Ser Leu Pro Val Leu Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ala 115 120 125

Gin Gly Gly Thr Pro Asp Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Phe Ile Val Glu

130 135 140

His Ser Val Asn Ile Gly Gin Pro Ile Ile Ala Val Ser Val Ala Tyr

145 150 155 160

Arg Leu Gly Pro Trp Gly Phe Phe Asn Gly Val Glu Leu Ala Asn Glu

165 170 175

Gly Ser Leu Asn Leu Gly Leu Lys Asp Gin Arg Leu Ala Leu His Trp

180 185 190

Val Lys Glu Asn Ile Ala Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Val

195 200 205

Ile Tyr Gly Gin Ser Ala Gly Ser Glu Ser Val Gly Tyr Gin Ile Arg

210 215 220

Ala Tyr Asn Gly Arg Asp Asp Gly Leu Phe Arg Gly Gly Met Met Glu

225 230 235 240

Ser Gly Ala Val Leu Pro Gly Ser Ala Leu Asn Leu Thr Trp Thr Tyr

245 250 255

Glu Pro Trp Phe Gin Gin Ile Ala Asp Glu Ala Gly Cys Ser Gin Thr

260 265 270

Thr Arg Lys Leu Asp Cys Leu Arg Arg Thr Pro Phe Thr Val Leu Asn

275

280

285

Asn

Ile

Leu

Asn

Thr

Ala Asn

Asp

Thr

Pro

Tyr

Asn

Trp

Arg

290

295

300

Pro

Thr

Val

Asp

Gly

Asp

Phe Val

Ala

Arg

Tyr

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu

305

310

315

320

Asp

Thr

Giy

Asp

Phe

Val

Lys Val

Pro

Ile

Gly

Tyr

Thr

325

330

335

Asp

Glu

Gly

Thr

Glu

Cys Pro

Glu

Pro

Val

Asn

Thr

Ala

Glu

340

345

350

Leu

Lys

Glu

Tyr

Leu

Ser

Ser Thr

Thr

Tyr

Gly

Trp

Ala

Leu

Asp

355

360

365

Ser

Gin

Val

Ser

Leu Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Ser

370

375

380

Phe

Gly

Ile

Pro

Ser

Glu Glu

Leu

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

Pro

385

390

395

400

Gin

Pro

Tyr

Gly

Ala

Phe Arg

Gin

Thr

Ala

Tyr

Gly

Asp

405

410

415

Ala

Gin

Phe

Ile

Ala

Thr Arg

Tyr

Thr

Cys

Glu

Leu

Trp

Ala

420

425

430

His

Asn

Leu

Thr

Ala

Tyr

Cys Tyr

Arg

Phe

Asn

Thr

Lys

Thr

Asp

435

440

445

Tyr

Asn

Arg

Glu

Gly

Val Ala

His

Phe

Ser

Asp

Val

Ile

Phe

Ile

450

455

460

PL 214 792 B1

21078ki0.ST25.txt

Phe Asn Asn Leu Asn Gly Tyr Gly Phe Ser Pro Asn Pro Phe Thr Asn

465 470 475 480

Ala Pro Glu Ser Tyr Thr Glu Leu Ser Tyr Leu Met Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ile Ser Phe Thr Asn Ser Leu Asp Pro Asn Lys Trp Thr Gly Arg Gly

500 505 510

Arg Asn Ala Thr Lys Thr Glu Asn Trp Pro Val Tyr Asp Leu Glu Asn

515 520 525

Pro Leu Ser Met Ile Trp Asp Ala Asn Val Thr Ser Tyr Ala Ala Pro

530 535 540

Asp Thr Trp Arg Lys Glu Gly Ile Ala Leu Ile Asn Ala Asn Arg Arg 545 550 555 560

Ala Tyr Gin Arg <210> 34 <211> 2371 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 34 gccctgacat ggacggtgtc agatagagac cgttggaagg ctgaaccaca gggcacacgg 60 cacgttgagg accctgcatg ccggtgtatc cggataatgg cagataatcc cggctaattg 120 ggggcgacgg cagctacggc tcacaaattg tgatggaata gacacggcat gatgtttcaa 180 tgaagctcca aactttacag tgctaggctg taaacgtgat tataatcacg atgtaattga 240 ttatcatcta caactcaacc cccgcaccaa gaaatgaatc ctctcgtcgg aagaaaaaga 300 cggcattcca gaagaacttt ttcctagata acaaacagta atcagtccat ccgtccctga 360 cgatcccccc atcgaacctc ggtaagacgc tcgacccaaa aaccagaccg acaagctttt 420 caacctccct aaacgaaaca acggctgtgt tgatcgtgaa cgtggttgcc tataccaata 480 cgagaaccat ataggataga aattgagttt accgtggaaa agccacccgc tacagtttaa 540 ttaaecaacc cacccacatg cccaaggcac ctgtaacagg gactactgtc cagagagtgg 600 atagtggcta gtgggcagac gtcggatgaa ctccggaaga ccctaactga tacgtagaac 660 catcgtgaac cctggtttgt ccctagttcg gggcgctatt cccagcgtag aaaagcggcc 720 gatcctctga aacagttttc ccccggggta tacttgctag ttagtcacta tcatacaaaa 780 gtagtgtagt ggacaagacc agggtctact actattagtt agttctgttt catcccgact 840 ceattttgcg tcccaagacc ctgggttgtc cgggcctgtc ttgcccaaca cgagatgtat 900 ggagtaagta tggagggaga ctaacctcgg aatattcttg tctcttttta gtactatcta 960 gcccttagtg agactatagc agtagtgaac cagagagaga gagagatgtc tatataagta 1020 cagtcgtaga tccctaaaca tgaccagctt cagactcaga ctcgagcagc cagtgcagtc 1080 cagtccactc tttcattctc accccttctt tactatctta caataatttc tattcaataa 1140 gtctgcagtg cagcacccac acacattcat tctctgagag ataaaaaata acaaaatgge 1200 ccccctcaaa tccctcctcc tcggcgcctc cctggccacc ctcgcccttt ccaccccact 1260 ggcaaecgac gccgaaaacc tctacgcacg tcaattcggc acgggctcta cagccaacga 1320 actcgagcag ggaagctgca aggatgtgac tctcatcttt gcgagggggt caactgagct 1380

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt tgggaatatg gtatgcttgt tgcctgcctt tacccgtact atactatccc agaacatacc 1440 aagcacaaca tcacaaaaca tgtggagcca ggagctaatc agtggtggtg atgatatgat 1500 gtagggcacc gtaatcggcc cccctctctg cgacaacctg aaatccaaac tcggatccga 1560 caaagtcgcc tgccagggtg tcggcggcca atacagcgcc ggactcgtgc agaatgccct 1620 gccccagaac accgatccgg ggagtatctc cgccgcgaag cagatgttcg aggaggcgaa 1680 ttcgaagtgt cccaatacta agattgttgc gggtggttat aggtatatat ccctttcccc 1740 tttaccttcc cccatatcaa tgctagaggc aaaggaatat catgctaatg tagatgttgg 1800 ggaaacagtc aaggaagcgc tgtgattgac aacgccgtgc aagaactcag caccaccgtg 1860 aaagaccaag tgaagggtgt cgtgctcttc gggttcacga gaaacgtgca ggatcacggg 1920 cagatcccta attaccctaa ggatgacgtg aaggtttatt gtgccgtggg cgatctggtc 1980 tgtgatgata cgttggttgt tacggcgatg catctgacgt atggcatgga tgcgggtgat 2040 gcggcgagct ttttggccga gaaggtgcag tcttccagta gttcgactac tagctccagc 2100 tcggatgccg cgagtagttc atctgctgcg gggacgtcgt cgtcggggtt gtcgggactg 2160 tcttcttttt ttggaggtct ctaaatagaa ttagatgaga tgagtggtcc gggtgggggt 2220 tiaggggatt gttgttcgtt tctcttggat gatttagttt ccgttattta cttagctggg 2280 ataagatata tggtacatag tatagatgtg ttgtgatgtt attctggcta ttttgtacac 2340 tttgacatga tctgcgatat gggagcgtct a 2371 <210> 35 <211> 789 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(789) <400> 35

atg

gcc

ccc

ctc

aaa

tcc

ctc

ggc

gcc

tcc

ctg

gcc

acc

ctc

48

Met

Ala

Pro

Leu

Lys

Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

gcc

ctt

tcc

acc

cca

ctg

gca

acc

gac

gcc

gaa

aac

ctc

tac

gca

cgt

96

Ala

Leu

Ser

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Asp

Ala

Glu

Asn

Leu

Tyr

Ala

Arg

25 30 caa ttc ggc acg ggc tct aca gcc aac gaa ctc gag cag gga age tgc 144

Gin Phe Gly Thr Gly Ser Thr Ala Asn Glu Leu Glu Gin Gly Ser Cys

40 45 aag gat gtg act ctc atc ttt gcg agg ggg tca act gag ctt ggg aat 192

Lys Asp Val Thr Leu Tle Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Leu Gly Asn

55 60 atg ggc acc gta atc ggc ccc cct ctc tgc gac aac ctg aaa tcc aaa 240

Met Gly Thr Val Ile Gly Pro Pro Leu Cys Asp Asn Leu Lys Ser Lys

70 75 80

PL 214 792 B1

21078WQ.ST25.txt

ctc

gga

tcc

gac

aaa

gtc

gcc

tgc

cag

ggt

gtc

ggc

caa

tac

age

288

Leu

Gly

Ser

Asp

Lys

Val

Ala

Cys

Gin

Gly

Val

Gly

Gin

Tyr

Ser

85

90

95

gcc

gga

ctc

gtg

cag

aat

gcc

ctg

ccc

cag

aac

acc

gat

ccg

ggg

agt

336

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Asn

Ala

Leu

Pro

Gin

Asn

Thr

Asp

Pro

Gly

Ser

100

105

110

atc

tcc

gcc

gcg

aag

cag

atg

ttc

gag

gcg

aat

teg

aag

tgt

ccc

384

Ile

Ser

Ala

Lys

Gin

Met

Phe

Glu

Ala

Asn

Ser

Lys

Cys

Pro

115

120

125

aat

act

aag

att

gtt

gcg

ggt

tat

agt

caa

gga

age

gct

gtg

att

432

Asn

Thr

Lys

Ile

Val

Ala

Gly

Tyr

Ser

Gin

Gly

Ser

Ala

Val

Ile

130

135

140

gac

aac

gcc

gtg

caa

gaa

ctc

age

acc

gtg

aaa

gac

caa

gtg

aag

480

Asp

Asn

Ala

Va1

Gin

Glu

Leu

Ser

Thr

Val

Lys

Asp

Gin

Val

Lys

145

150

155

160

ggt

gtc

gtg

ctc

ttc

ggg

ttc

acg

aga

aac

gtg

cag

gat

cac

ggg

cag

528

Gly

Val

Leu

Phe

Gly

Phe

Thr

Arg

Asn

Val

Gin

Asp

His

Gly

Gin

165

170

175

atc

cct

aat

tac

cct

aag

gat

gac

gtg

aag

gtt

tat

tgt

gcc

gtg

ggc

576

Ile

Pro

Asn

Tyr

Pro

Lys

Asp

Val

Lys

Val

Tyr

Cys

Ala

Val

Gly

180 185 190 gat ctg gtc tgt gat gat acg ttg gtt gtt acg gcg atg cat ctg acg 624

Asp Leu Val Cys Asp Asp Thr Leu Val Val Thr Ala Met His Leu Thr

195 200 205 tat ggc atg gat gcg ggt gat gcg gcg age ttt ttg gcc gag aag gtg 672

Tyr Gly Met Asp Ala Gly Asp Ala Ala Ser Phe Leu Ala Glu Lys Val

210 215 220 cag tct tcc agt agt teg act act age tcc age teg gat gcc gcg agt 720

Gin Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ala Ala Ser

225 230 235 240 agt tea tct gct gcg ggg acg teg teg teg ggg ttg teg gga ctg tct 768

Ser Ser Ser Ala Ala Gly Thr Ser Ser Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser

245 250 255 tct ttt ttt gga ggt ctc taa 789

Ser Phe Phe Gly Gly Leu

260 <210> 36 <211> 262 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 36

100

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

Met

Ala

Pro

Leu

Lys

Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ala

Leu

Ser

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Asp

Ala

Glu

Asn

Leu

Tyr

Ala

Arg

20

25

30

Gin

Phe

Gly

Thr

Gly

Ser

Thr

Ala

Asn

Glu

Leu

Glu

Gin

Gly

Ser

Cys

35

40

45

Lys

Asp

Val

Thr

Leu

Ile

Phe

Ala

Arg

Gly

Ser

Thr

Glu

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Met

Gly

Thr

Yal

Ile

Gly

Pro

Leu

Cys

Asp

Asn

Leu

Lys

Ser

Lys

65

70

75

80

Leu Gly Ser Asp Lys Yal Ala Cys Gin Gly Yal Gly Gly Gin Tyr Ser 85 90 95

Ala Gly Leu Yal Gin Asn Ala Leu Pro Gin Asn Thr Asp Pro Gly Ser 100 105 110

Ile Ser Ala Ala Lys Gin Met Phe Glu Glu Ala Asn Ser Lys Cys Pro 115 120 125

Asn Thr Lys Ile Yal Ala Gly Gly Tyr Ser Gin Gly Ser Ala Val Ile 130 135 140

Asp Asn Ala Val Gin Glu Leu Ser Thr Thr Yal Lys Asp Gin Yal Lys 145 150 155 150

Gly Yal Yal Leu Phe Gly Phe Thr	Arg	Asn	Val	Gin Asp	His	Gly	Gin
165		170				175
Ile Pro Asn Tyr Pro Lys Asp Asp	Yal	Lys	Yal	Tyr Cys	Ala	Yal	Gly
180	185				190
Asp Leu Yal Cys Asp Asp Thr Leu	Yal	Yal	Thr	Ala Met	His	Leu	Thr
195 200				205
Tyr Gly Met Asp Ala Gly Asp Ala	Ala	Ser	Phe	Leu Ala	Glu	Lys	Val
210 215				220
Gin Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr	Ser	Ser	Ser	Ser Asp	Ala	Ala	Ser
225 230			235				240
Ser Ser Ser Ala Ala Gly Thr Ser	Ser	Ser	Gly	Leu Ser	Gly	Leu	Ser

245 250 255

Ser Phe Phe Gly Gly Leu 260 <210> 37 <211> 2981 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 37 tcctcatccc atgctctccc ggcagaaccc cggagacaac ccacactaat gcacccaaag 60 caaaatgaca tggattgaat tatccggggt gcatccatct tgttccccca cacattggac 120

PL 214 792 B1

101

21078WO.ST25.txt cctttcctta taatggctgc cccggcaaac ccccaattgc tgtttaggcc agcgcagata 180 gcaaatctct cgtctgatta acgatgctaa agctcgctgt tgctcttttt tcgttacttg 240 ccgtgggcaa tgcagcgcca accaaagtgg cccgttccac ggccagtcct acggccaagg 300 ttcgcaacgg tacatatgtc ggagtgacaa atgcgcatta ccagcaagat ttctttttgg 360 gaatgccgta tgcccagcag cctttaggtg acttgcgctt cacggtgcct cagtccctga 420 acgaaagctg gagtggcgag cgcgacgcga aggaatattc caatatctgt gtaggatacg 480 gtgtgagtgc gcaaatcttc ttcgagagcc aggccctact agctgcatcc tggcactatg 540 aatataatct aatgggtaga tctgttagac cgactcgatt tggtacccac agtccgaagc 600 ttgtctaacc ttgaatgtca tccgcgattc ttctgcaaat gagaactcga agctccccgt 660 gggcgtctgg atacatggag gtggcttctt tgagggatct agtgctgacc agcgctacaa 720 catgtccgcg attgttgcca actcctataa gatcggtatg tcgacgtatg cggttgtaga 780 attagactga ctcggcttgc tcgcattgta ggaaagccgt tcattgctgt cagcttaaac 840 tatcgccttt cggcatgggg cttcttgagt tccagtcaag tctggggcac tggcaatacc 900 aatctaggta tcagggatca aaggttagca ctccattgga tcaaggagaa tatcgcggca 960 ttcggaggag acccagataa gatcactatc tggggcgaat ctgccggagc gatgtccgtg 1020 ggttatcacc ttgcagcata cggcggtagg gacgatggac tcttccgtgg aggaattatg 1080 gagtcaggag ggactattgc agctagtcca gccaactata ccgggtacca agcgcactat 1140 gatgagctcg cgggtcaagt cggttgctcc gacgtagtag attcgttgca gtgcctgcgc 1200 gaagttccgt tcgagaaatt gaacgctgct ctcaacacca ccagtggtaa ctcggatttc 1260 aatttcgggc ccgtcattga tggagatata atcagggact ggggcagcct ccagctagac 1320 aagcatgaat tcgtcaaagt ccctattctt gcaggtacca ataccgacga agggacagcc 1380 tttgggccca caggtatcaa cacgacagag gagttctatg catatctcac aggtatgtgt 1440 gataatgagt taacatcctg aaagaacccc agagcagcaa aacgggctaa tctcactggc 1500 agatggcgaa tctggattcc agctaccccc cacgatcgcc caggaaatcc tgcagctcta 1560 ccctgatgat ccagcactgg gcatccccga atttctcggt gacactagag tcccgtccaa 1620 aggctaccaa tggcggcgca cctgtgcata cgcaggggac tatgtaatgc atgccaaccg 1680 tcgccgacaa tgtgaggcgt ggacagagac ctcgacgacg gcgtactgtt atcgattcaa 1740 tatgcgtgcg gccgatgtcc ccatcctgtc tggcgccacc cattttgaag aagttgcttt 1800 tgtattcaac aacattgcag gactcgggta ccattacgga aagccgttcg cagggatgcc 1860 cgagtcctac gtacagctaa gcaacttgat gaccagcatg tgggcatcct tcatccacga 1920 tttagaccct aattcgggca tcaaggactc agctgtacag tggcaaccgt acgggaagga 1980 tcagccggtt gatctagtgt ttgatgcgaa tgtcacgagc tacagctaca tggagccaga 2040 cacgtggcgg aaggagggga tcgactatat caattccgtg gccaacgcgt actggcgata 2100 agcttcatgc tatcgaaaac acatgtgatg agcgtgagag tttttgcctt ccgcttgatg 2160 ttgcctgcga gaggaaaagg ttaaggcaaa caaggatggt agggggtgcg agcgcatcta 2220 agtcggccac ggtagttgat tgatggttcc ctcgttagaa gcaaatacag atgccatact 2280 tcctgcaaca aacccagaac ttgttgtaat caagtttttt caaacggatg gtagatcggt 2340 tccgatttgt aaaaagcaag atcctagcgt tacgagggaa ccaagacacc cacacagagg 2400 agcattacga attccaaatt accaaagcct gtataacaaa aaccagcaga gaccgcctaa 2460 ttagtcaact acagcattgg ttcaatgtac ctgcaaggac ctttacacgc gtggtcaccc '2520 atgtaccaag ccaagccaac ggccaagaca cggaaataac caagaggaaa ccactccctc 2580 caagaatcaa gaacccaggg ggtcaagaga atctggaagc gataaagggg tcttcttttt 2640 tttctttgct tacctagaga gggaggagtc ggcgttcatc gtcaatcagt agagtgttct 2700 ccgccctgag tggtgtagtc tatatccgga ccatcgggga catgattatc atacgatcca 2760

102

PL 214 792 B1

21078W0.ST25.txt taaccaagtc cccgattgta ctacggctac caaaactaga atgatgaaaa tattggagta 2820 cgaaaggaac taaaccaata ctaagaaaaa aaaaaaagag taaagaaaaa agagtaaaaa 2880 accaagctcg gaaagtaaaa atttcccctg gtcttgttgt cattccccta cctattgaga 2940 accgggttca ccaatgacag cggatccccg atttgacatc g 2981 <210> 38 <211> 1686 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220>

<221> CDS <222> (1)..(1686) <400> 38 atg eta aag ctc gct gtt gct ctt ttt tcg tta ctt gcc gtg ggc aat 48

Met Leu Lys Leu Ala Val Ala Leu Phe Ser Leu Leu Ala Val Gly Asn

10 15 gca gcg cca acc aaa gtg gcc cgt tcc acg gcc agt cct acg gcc aag 96

Ala Ala Pro Thr Lys Val Ala Arg Ser Thr Ala Ser Pro Thr Ala Lys

25 30 gtt cgc aac ggt aca tat gtc gga gtg aca aat gcg cat tac cag caa 144

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Val Gly Val Thr Asn Ala His Tyr Gin Gin

40 45 gat ttc ttt ttg gga atg ccg tat gcc cag cag cct tta ggt gac ttg 192

Asp Phe Phe Leu Gly Met Pro Tyr Ala Gin Gin Pro Leu Gly Asp Leu

55 60 cgc ttc acg gtg cct cag tcc ctg aac gaa age tgg agt ggc gag cgc 240

Arg Phe Thr Val Pro Gin Ser Leu Asn Glu Ser Trp Ser Gly Glu Arg

65

70

75

80

gac

gcg

aag

gaa

tat

tcc

aat

atc

tgt

gta

gga

tac

ggt

acc

gac tcg

•288

Asp

Ala

Lys

Glu

Tyr

Ser

Asn

Ile

Cys

Val

Gly

Tyr

Gly

Thr

Asp Ser

85

90

95

att

tgg

tac

cca

cag

tcc

gaa

gct

tgt

eta

acc

ttg

aat

gtc

atc cgc

336

Ile

Trp

Tyr

Pro

Gin

Ser

Glu

Ala

Cys

Leu

Thr

Leu

Asn

Val

Ile Arg

100

105

110

gat

tet

gca

aat

gag

aac

tcg

aag

ctc

ccc

gtg

ggc

gtc

tgg ata

384

Asp

Ser

Ala

Asn

Glu

Asn

Ser

Lys

Leu

Pro

Val

Gly

Val

Trp Ile

115

120

125

cat

gga

ggt

ggc

ttc

ttt

gag

gga

tet

agt

gct

gac

cag

cgc

tac aac

432

His Gly Gly Gly Phe Phe Glu Gly Ser Ser Ala Asp Gin Arg Tyr Asn 130 135 140 atg tcc gcg att gtt gcc aac tcc tat aag atc gga aag ccg ttc att 480

PL 214 792 B1

103

21078NO.ST25.txt

Met

Ser

Ala

Ile

Val

Ala

Asn

Ser

Tyr

Lys

Ile

Gly

Lys

Pro

Phe

Ile

145

150

155

160

gct

gtc

age

tta

aac

tat

cgc

ctt

tcg

gca

tgg

ggc

ttc

ttg

agt

tcc

528

Ala

Val

Ser

Leu

Asn

Tyr

Arg

Leu

Ser

Ala

Trp

Gly

Phe

Leu

Ser

165

170

175

agt

caa

gtc

tgg

ggc

act

ggc

aat

acc

aat

eta

ggt

atc

agg

gat

caa

576

Ser

Gin

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Asn

Thr

Asn

Leu

Gly

Ile

Arg

Asp

Gin

180

185

190

agg

tta

gca

ctc

cat

tgg

atc

aag

gag

aat

atc

gcg

gca

ttc

gga

624

Arg

Leu

Ala

Leu

His

Trp

Ile

Lys

Glu

Asn

Ile

Ala

Phe

Gly

195

200

205

gac

cca

gat

aag

atc

act

atc

tgg

ggc

gaa

tct

gcc

gga

gcg

atg

tcc

672

Asp

Pro

Asp

Lys

Ile

Thr

Ile

Trp

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Ala

Met

Ser

210

215

220

gtg

ggt

tat

cac

ctt

gca

tac

ggc

ggt

agg

gac

gat

gga

ctc

ttc

720

Val

Gly

Tyr

His

Leu

Ala

Tyr

Gly

Arg

Asp

Gly

Leu

Phe

225

230

235

240

cgt

gga

att

atg

gag

tca

gga

ggg

act

att

gca

gct

agt

cca

gcc

768

Arg

Gly

Ile

Met

Glu

Ser

Gly

Thr

Ile

Ala

Ser

Pro

Ala

245

250

255

aac

tat

acc

ggg

tac

caa

gcg

cac

tat

gat

gag

ctc

gcg

ggt

caa

gtc

816

Asn

Tyr

Thr

Gly

Tyr

Gin

Ala

His

Tyr

Asp

Glu

Leu

Ala

Gly

Gin

Val

260

265

270

ggt

tgc

tcc

gac

gta

gat

tcg

ttg

cag

tgc

ctg

cgc

gaa

gtt

ccg

864

Gly

Cys

Ser

Asp

Val

Asp

Ser

Leu

Gin

Cys

Leu

Arg

Glu

Val

Pro

275

280

285

ttc

gag

aaa

ttg

aac

gct

ctc

aac

acc

agt

ggt

aac

tcg

gat

912

Phe Glu Lys Leu Asn Ala Ala Leu Asn Thr Thr Ser Gly Asn Ser Asp 290 295 300 ttc aat ttc ggg ccc gtc att gat gga gat ata atc agg gac tgg ggc 960

Phe Asn Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Ile Ile Arg Asp Trp Gly

305

310

315

320

age

ctc

cag

eta

gac

aag

cat

gaa

ttc

gtc

aaa

gtc

cct

att

ctt

gca

1008

Ser

Leu

Gin

Leu

Asp

Lys

His

Glu

Phe

Val

Lys

Val

Pro

Ile

Leu

Ala

325

330

335

ggt

acc

aat

acc

gac

gaa

ggg

aca

gcc

ttt

ggg

ccc

aca

ggt

atc

aac

1056

Gly

Thr

Asn

Thr

Asp

Glu

Gly

Thr

Ala

Phe

Gly

Pro

Thr

Gly

Ile

Asn

340

345

350

acg

aca

gag

ttc

tat

gca

tat

ctc

aca

gat

ggc

gaa

tct

gga

ttc

1104

Thr

Glu

Phe

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Thr

Asp

Gly

Glu

Ser

Gly

Phe

355

360

365

cag

eta

ccc

CCC

acg

atc

gcc

cag

gaa

atc

ctg

cag

ctc

tac

cct

gat

1152

Gin

Leu

Pro

Thr

Ile

Ala

Gin

Glu

Ile

Leu

Gin

Leu

Tyr

Pro

Asp

370

375

380

104

PL 214 792 B1

2101

78WO

.ST2!

5.txt

gat

cca

gca

ctg

ggc

atc

ccc

gaa

ttt

ctc

ggt

gac

act

aga

gtc

ccg

1200

Asp

Pro

Ala

Leu

Gly

Ile

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

Asp

Thr

Arg

Val

Pro

385

390

395

400

tcc

aaa

ggc

tac

caa

tgg

cgg

cgc

acc

tgt

gca

tac

gca

ggg

gac

tat

1248

Ser

Lys

Gly

Tyr

Gin

Trp

Arg

Thr

Cys

Ala

Tyr

Ala

Gly

Asp

Tyr

405

410

415

gta

atg

cat

gcc

aac

cgt

cgc

ega

caa

tgt

gag

gcg

tgg

aca

gag

acc

1296

Val

Met

His

Ala

Asn

Arg

Gin

Cys

Glu

Ala

Trp

Thr

Glu

Thr

420

425

430

tcg

acg

gcg

tac

tgt

tat

ega

ttc

aat

atg

cgt

gcg

gcc

gat

gtc

1344

Ser Thr Thr Ala Tyr Cys Tyr Arg Phe Asn Met Arg Ala Ala Asp Yal

435

440

445

ccc atc ctg

tet ggc

gcc

acc cat

ttt gaa

gaa

gtt get ttt gta

ttc

1392

Pro Ile Leu

Ser Gly Ala

Thr His

Phe Glu

Glu

Yal

Ala

Phe Yal

Phe

450

455

460

aac aac att

gca gga

ctc

ggg

tac

cat

tac

gga

aag

ccg

ttc gca

ggg

1440

Asn Asn Ile Ala Gly

Leu

Gly

Tyr

His

Tyr

Gly

Lys

Pro

Phe Ala

Gly

465

470

475

480

atg ccc gag

tcc tac

gta

cag

eta

age

aac

ttg

atg

acc

age

atg

tgg

1488

Met Pro Glu

Ser Tyr

Yal

Gin

Leu

Ser

Asn

Leu

Met

Thr

Ser

Met

Trp

485

490

495

gca tcc ttc

atc cac

gat

tta

gac

cct

aat

tcg

ggc

atc

aag

gac

tea

1536

Ala Ser Phe

Ile His

Asp Leu Asp

Pro

Asn

Ser

Gly

Ile

Lys Asp

Ser

500

505

510

get gta cag

tgg caa

ccg tac ggg

aag

gat

cag

ccg

gtt gat

eta

gtg

1584

Ala Yal Gin

Trp Gin Pro Tyr Gly Lys Asp

Gin

Pro

Val

Asp

Leu

Val

515

520

525

ttt gat gcg

aat gtc acg age tac

age tac

atg

gag

cca

gac

acg

tgg

1632

Phe Asp Ala

Asn Yal

Thr Ser Tyr

Ser Tyr

Met

Glu

Pro

Asp Thr Trp

530

535

540

cgg aag gag

ggg atc

gac tat

atc

aat

tcc

gtg

gcc

aac

gcg

tac tgg

1680

Arg Lys Glu Gly Ile

Asp Tyr

Ile

Asn

Ser

Val

Ala

Asn

Ala

Tyr Trp

545 ega taa Arg

550

555

550

1686

<210 39 <211> 561 <212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400>· 39

Met Leu Lys Leu Ala

Yal

Ala

Leu

Phe

Ser

Leu

Ala

Va1

Gly Asn

PL 214 792 B1

105

210'

78W0

.ST21

5.txt

1

5

10

15

Ala

Pro

Thr

Lys

Yal Ala

Arg

Ser

Thr

Ala

Ser Pro

Thr

Ala

Lys

20

25

30

Yal

Arg

Asn

Gly

Thr

Tyr Val

Gly

Yal

Thr

Asn

Ala His

Tyr

Gin

35

40

45

Asp

Phe

Leu

Gly

Met Pro

Tyr

Ala

Gin

Pro Leu

Gly

Asp

Leu

50

55

60

Arg

Phe

Thr

Val

Pro

Gin Ser

Leu

Asn

Glu

Ser

Trp Ser

Gly

Glu

Arg

65

70

75

80

Asp

Ala

Lys

Glu

Tyr

Ser Asn

Ile

Cys

Yal

Gly

Tyr Gly

Thr

Asp

Ser

90 95

Ile Trp Tyr Pro Gin Ser Glu Ala Cys Leu Thr Leu Asn Yal Ile Arg 100 105 110

Asp Ser Ser Ala Asn Glu Asn Ser Lys Leu Pro Yal Gly Yal Trp Ile Π5 120 125

His Gly Gly Gly Phe Phe Glu Gly Ser Ser Ala Asp Gin Arg Tyr Asn 130 135 140

Met Ser Ala Ile Yal Ala Asn Ser Tyr Lys Ile Gly Lys Pro Phe Ile

145 150 155 160

Ala Yal Ser Leu Asn Tyr Arg Leu Ser Ala Trp Gly Phe Leu Ser Ser

165 170 175

Ser Gin Yal Trp Gly Thr Gly Asn Thr Asn Leu Gly Ile Arg Asp Gin 180 185 190

Arg Leu Ala Leu His Trp Ile Lys Glu Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly 195 200 205

Asp Pro Asp Lys Ile Thr Ile Trp Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser 210 215 220

Yal Gly Tyr His Leu Ala Ala Tyr Gly Gly Arg Asp Asp Gly Leu Phe

225

230

235

240

Arg

Gly

Ile

Met

Glu

Ser

Gly

Thr Ile

Ala

Ser

Pro

Ala

245

250

255

Asn

Tyr

Thr

Gly

Tyr

Gin

Ala

His

Tyr

Asp Glu

Leu

Ala

Gly

Gin

Yal

260

265

270

Gly

Cys

Ser

Asp

Yal

Asp

Ser

Leu

Gin Cys

Leu

Arg

Glu

Yal

Pro

275

280

285

Phe

G1 u

Lys

Leu

Asn

Ala

Leu

Asn

Thr Thr

Ser

Gly

Asn

Ser

Asp

290

295

300

Phe

Asn

Phe

Gly

Pro

Yal

Ile

Asp

Gly

Asp Ile

Ile

Arg

Asp

Trp

Gly

305

310

315

320

Ser

Leu

Gin

Leu

Asp

Lys

His

G1 u

Phe

Yal Lys

Yal

Pro

Ile

Leu

Ala

325 330 335

Gly Thr Asn Thr Asp Glu Gly Thr Ala Phe Gly Pro Thr Gly Ile Asn

340 345 350

Thr Thr Glu Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Thr Asp Gly Glu Ser Gly Phe

106

PL 214 792 B1

21078WO.ST25.txt

355 360 365

Gin Leu Pro Pro Thr Ile Ala Gin Glu Ile Leu Gin Leu Tyr Pro Asp

370 375 380

Asp Pro Ala Leu Gly Ile Pro Glu Phe Leu Gly Asp Thr Arg Val Pro

385 390 395 400

Ser Lys Gly Tyr Gin Trp Arg Arg Thr Cys Ala Tyr Ala Gly Asp Tyr

405 410 ' 415

Val Met His Ala Asn Arg Arg Arg Gin Cys Glu Ala Trp Thr Glu Thr

420

425

430

Ser

Thr

Ala

Tyr

Cys

Tyr

Arg

Phe

Asn

Met

Arg

Ala

Asp

Val

435

440

445

Pro

Ile

Leu

Ser

Gly

Ala

Thr

His

Phe

Glu

Val

Ala

Phe

Val

Phe

450

455

460

Asn

Ile

Ala

Gly

Leu

Giy

Tyr

His

Tyr

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

Gly

465

470

475

480

Met

Pro

Glu

Ser

Tyr

Val

Gin

Leu

Ser

Asn

Leu

Met

Thr

Ser

Met

Trp

485

490

495

Ala

Ser

Phe

Ile

His

Asp

Leu

Asp

Pro

Asn

Ser

Gly

Ile

Lys

Asp

Ser

500

505

510

Ala

Va1

Gin

Trp

Gin

Pro

Tyr

Gly

Lys

Asp

Gin

Pro

Val

Asp

Leu

Va1

515

520

525

Phe Asp Ala Asn Val Thr Ser Tyr Ser Tyr Met Glu Pro Asp Thr Trp 530 535 540

Arg Lys Glu Gly Ile Asp Tyr Ile Asn Ser Val Ala Asn Ala Tyr Trp

545 Arg

550

555

560

PL 214 792 B1

107

Claims

1. Wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd, który zawiera sekwencję aminokwasową o Nr Id. Sekw.: 12 i który ma aktywność lipolityczną, znamienny tym, że polinukleotyd ten zdolny jest do hybrydyzacji w bardzo ostrych warunkach do polinukleotydu o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

2. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że można go uzyskać z grzybów nitkowatych.

3. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że można go uzyskać z Aspergillus niger.

4. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

5. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że składa się z sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11.

6. Wektor, znamienny tym, że zawiera sekwencję polinukleotydową określoną w zastrz. od 1 do 5.

7. Wektor według zastrz. 6, znamienny tym, że ta sekwencja polinukleotydowa określona w zastrz. od 1 do 5 jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami regulatorowymi odpowiednimi do ekspresji tej sekwencji polinukleotydowej w odpowiedniej komórce gospodarza.

8. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że odpowiednią komórkę gospodarza stanowi grzyb nitkowaty.

9. Wyizolowany enzym lipolityczny, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.: 12.

10. Wyizolowany enzym lipolityczny według zastrz. 9, znamienny tym, że można go uzyskać z Aspergillus niger.

11. Wyizolowany enzym lipolityczny, znamienny tym, że można go uzyskać przez ekspresję polinukleotydu określonego w zastrz. od 1 do 5 albo wektora określonego w zastrz. od 6 do 8 w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus niger.

12. Sposób wytwarzania enzymu lipolitycznego określonego w zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których transformuje się odpowiednią komórkę gospodarza wyizolowanym polinukleotydem określonym w zastrz. od 1 do 5 albo wektorem określonym w zastrz. od 6 do 9, hoduje się tę komórkę w warunkach pozwalających na ekspresję tego polinukleotydu i opcjonalnie oczyszcza się kodowany polipeptyd z tej komórki lub pożywki hodowlanej.

13. Rekombinowana komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. od 1 do 5 albo wektor określony w zastrz. od 6 do 8.

14. Rekombinowana komórka gospodarza, znamienna tym, że wykazuje ekspresję enzymu lipolitycznego określonego w zastrz. 11.

15. Sposób wytwarzania ciasta, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym dodaje się enzym lipolityczny określony w zastrz. 11.

16. Sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego, znamienny tym, że stosuje się w nim ciasto wytworzone sposobem określonym w zastrz. 15.

17. Zastosowanie enzymu lipolitycznego określonego w zastrz. 11 do wytwarzania z niego ciasta i/lub wyrobu piekarniczego.