JP2001136987A - ホスホジエステラーゼ酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 PDEXV（環状ヌクレオチド・ホスホジエステ
ラーゼＸＶ型、時としてＰＤＥ１１Ａ３とも呼ばれる）
に関連するアミノ酸配列及びヌクレオチド配列の提供。 【解決手段】 ＰＤＥ活性を表示する能力をもつ人由来
の特定の配列を含むアミノ酸配列、又はその変異体、相
同体、フラグメント又は誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の背景 本発明は酵素に関する。本発明は同様に、この酵素をコ
ードするヌクレオチド配列にも関する。

【０００２】特に、本発明は、新しいホスホジエステラ
ーゼ酵素をコードする新規核酸配列に関する。本発明は
同様に、疾病の診断及び治療における新規核酸及びアミ
ノ酸配列の使用にも関する。本発明は同様に、ホスホジ
エステラーゼ活性を調節することのできる作用物質を評
価しかつ／又はスクリーニングするための新規核酸及び
アミノ酸配列の使用にも関する。

【０００３】本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ活
性を調節することのできる作用物質を評価しかつ／又は
スクリーニングするため新規核酸及びアミノ酸配列を含
む又は発現する遺伝子操作された宿主細胞にも関する。 背景技術 環状ヌクレオチド、例えば、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、
重要な細胞内第２メッセンジャーである。環状ヌクレオ
チド・ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥとしても知られて
いる）は、環状ヌクレオチドの分解を解媒する酵素のフ
ァミリーであり、かつそうすることで環状ヌクレオチド
の濃度を調節する細胞成分の中の１つである。

【０００４】近年になって、少なくとも７つのＰＤＥ酵
素（例えばＰＤＥＩ−ＰＤＥＶII）ならびにこれらの酵
素の数多くの亜型が、基質親和性及び補因子要求に基づ
いて定義されてきた（Beavo JA and Reifsnyder DH, Tr
ends Pharmacol, Sci.１１：１５０〔１９９０〕；Beav
o J,「環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ：構造、
調節及び医薬品作用」中，Beavo J and Housley MD(Ed
s.). Wiley. Chichester, pp.３−１５〔１９９
０〕）。

【０００５】ＰＤＥの例としては以下のものが含まれ
る：Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性ＰＤＥであるＰＤＥ
Ｉ；ｃＧＭＰ刺激されたＰＤＥであるＰＤＥII；ｃＧＭ
Ｐ阻害されたＰＤＥであるＰＤＥ III；高親和性のｃＡ
ＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥIV；及びｃＧＭＰ特異的
ＰＤＥであるＰＤＥＶ。各々のＰＤＥファミリーは、２
以上のイソ型を含むことができる（すなわち２以上のＰ
ＤＥイソ酵素が存在しうる）。一例を挙げると、Drosop
hila Dunce遺伝子の相同体である哺乳動物のＰＤＥ IV
(Chen CN et al., Proc. Nat. Acad Sci.(USA)８３：９
３１３〔１９８６〕）はラットにおいて４つのイソ型を
もつものとして知られている（Swinnen JV et al., Pro
c. Nat. Acad. Sci.(USA)８６：５３２５〔１９８
９〕）。ヒトＰＤＥも同様に、イソ型として発生しスプ
ライス変異体を有するものとして知られている。例え
ば、単球からのＰＤＥIVの１つのヒトイソ型のクローニ
ングは、１９９０年に報告された（Livi GP et al., Mo
l.Cell. Bio.,１０：２６７８〔１９９０〕）。さらな
る一例としては、その他の研究者が、現在ｈＰＤＥIV−
Ｂ１、ｈＰＤＥIV−Ｂ２及びｈＰＤＥIV−Ｂ３と呼称さ
れているＰＤＥIVの３つのスプライス変異体を独立して
クローニングした。

【０００６】環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ
についての教示は同様に、ＵＳ−Ａ−５９３２４２３及
びＵＳ−Ａ−５９３２４６５中にも見られる。さらにも
う１つの環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ、す
なわち、ＣＮＰＣＤＥ８についての教示はＷＯ−Ａ−９
７／３５９８９中に見られる。ＷＯ−Ａ−９７／３５９
８９に従うと、ＣＮ ＰＣＤＥ８は、ＣＮ ＰＣＤＥ８
Ａ及びＣＮ ＰＣＤＥ８Ｂと呼称された２つのイソ酵素
を有する。「イソ酵素」という語は、当該技術分野では
時として「イソ型」とも呼ばれる。

【０００７】ＷＯ−Ａ−９７／３５９８９に従って、異
なるＰＤＥの数多くの阻害物質が同定され、その一部は
臨床的評価を受けた。例えば、ＰＤＥIII 阻害物質は、
抗血栓症剤、そしてうっ血性心不全の治療において有用
な強心剤抗高血圧症薬、として開発されつつある。1 つ
のＰＤＥIII 阻害物質であるロリプラム（Rolipram）
は、うつ病治療において使用されてきており、ＰＤＥII
I のその他の阻害物質は、抗炎症剤としての評価を受け
ているところである。ロリプラムは同様に in vitro で
のＨＩＶ−１複製を増強させることが示されてきたリポ
多糖体（ＬＰＳ）によって誘発されたＴＮＦ−アルファ
を阻害することも示されてきた。従って、ロリプラム
は、ＨＩＶ−１複製を阻害することができる（Angel et
al １９９５AIDS ９：１１３７−４４）。さらに、Ｔ
ＮＦアルファ及びベータ及びインタフェロン・ガンマの
産生を抑制するその能力に基づき、ロリプラムは、多発
性硬化症についての実験動物モデルである脳脊髄炎の治
療において有効であることが示されており（Sommer et
al, １９９５ Nat Med １：２４４−２４８）、そして
晩発性運動障害の治療においても有効でありうる（Sasa
ki et al, １９９５ EurJ Phamacol ２８２：７１−７
６）。

【０００８】ＷＯ−Ａ−９７／３５９８９に従うと、気
管支ぜん息及びその他の呼吸器系統の病気の治療におい
て使用されるテオフィリン（theophylline）及び間欠性
跛行及び糖尿病誘発性末梢血管疾患の治療において用い
られるペントキシフィリン（pentoxifylline）といった
ような非特異的ＰＤＥ阻害物質も存在する。テオフィリ
ンは、気道平滑筋機能に対して、ならびに呼吸器系の病
気の治療での抗炎症又は免疫調節能力において作用する
と考えられており（Banner et al １９９５ Respir J
８：９９６−１０００）、これらの疾患において、それ
はＣＮ ＰＤＥｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ加水分解の両方を
阻害することにより作用するものと考えられている（Ba
nner et al １９９５ Monaldi Arch Chest Dis ５０：
２８６−２９２）。同様にＴＮＦ−アルファ産生を遮断
するものとして知られているペントキシフィリンは、Ｈ
ＩＶ−１複製を阻害することができる（Angel et al.,
前掲）。ＣＮ ＰＤＥ阻害物質のリストは、Beavo １９
９５前掲の中に示されている。

【０００９】ＰＤＥの選択的阻害物質は、そのイソ酵素
及びその亜型に加えて、より少ない副作用でより有効な
療法を導くことになることが示唆されてきた。例えば、
Wieshaar RE et al，(J. Med. Chem., ２８：５３７
〔１９８５〕），Giembycz MA (Biochem. Pharm.,４
３：２０４１〔１９９２〕）及び Lowe JA and Cheng J
B（将来の医薬品：１７：７９９−８０７〔１９９
２〕）のレビュー中の教示を参照のこと。

【００１０】かくして、一部の利用分野については、個
々のタイプのＰＤＥの選択的阻害を得ることが望まし
い。従って、新規ＰＤＥのクローニング及び発現は、選
択的阻害物質の発見に大きな助けとなることであろう。 本発明の要約 本発明の各態様はクレーム中及び以下の説明中で紹介さ
れる。

【００１１】広義の態様では、本発明は、新規アミノ酸
配列に関する。この点において、我々は、特異的な新規
アミノ酸配列を同定したが、本発明はこの配列と同様、
その新規変異体、フラグメント、誘導体、相同体をも網
羅するものと理解すべきである。もう１つの広義の態様
では、本発明は、新規核酸配列に関する。この点におい
て、我々は、特定の新規核酸配列を同定したが、本発明
はこの配列と同様、その新規変異体、フラグメント、誘
導体、相同体をも網羅するものと理解すべきである。

【００１２】かくして、要約すると、本発明の一部の態
様は、次のものに関する：すなわち、 １．新規アミノ酸 ２．新規ヌクレオチド配列 ３．前記新規配列を用いた検定、 ４．前記検定を使用することによって同定された化合物
／組成物 ５．前記新規配列を含むか又は発現する発現系、 ６．前記新規配列に基づく治療方法、 ７．前記新規配列に基づく医薬組成物。

【００１３】本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明の
ヌクレオチド配列に関するその他の態様としては、本発
明の配列を含むか又はそれを発現する能力をもつ構成
体；本発明の配列を含むか又はそれを発現する能力をも
つベクター；本発明の配列を含むか又はそれを発現する
能力をもつプラスミド；本発明の配列を含むか又はそれ
を発現する能力をもつ組織；本発明の配列を含むか又は
それを発現する能力をもつ器官；本発明の配列を含むか
又はそれを発現する能力をもつ形質転換された宿主；本
発明の配列を含むか又はそれを発現する能力を有する形
質転換された有機体が含まれる。本発明は同様に、微生
物の体内での発現といったような、その発現方法を、そ
の移入方法を含めて包含している。

【００１４】参照を容易にするため、次に適切な節見出
しの下で本発明の各態様について論述する。ただし、各
節の教示は必ずしも各々の特定の節に制限されるわけで
はない。以下の説明において、「本発明のヌクレオチド
配列」及び「本発明のアミノ酸配列」に対する言及は、
それぞれ、本書で紹介又は論述されたヌクレオチド配列
のうちのいずれか１つ又は複数、及び本書で紹介又は論
述されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つ又は複数を
意味する。同様に、以下で使用されているような「アミ
ノ酸配列」という語は、ペプチド又はタンパク質配列を
意味し、その一部分をも意味する可能性がある。さら
に、「本発明のアミノ酸配列」という語は、「本発明の
ポリペプチド配列」という句と同義語である。同様に
「本発明のヌクレオチド配列」という語は、「本発明の
ポリヌクレオチド配列」という句と同義語である。

【００１５】本発明の詳細な態様 本発明の１態様に従うと、配列番号１として示されてい
る配列を含むアミノ酸配列、又はその変異体、相同体、
フラグメント又は誘導体が提供されており、ここでアミ
ノ酸配列はＰＤＥ活性を表示する能力をもつ。配列番号
１は、ＰＤＥＸＶ（時としてＰＤＥ１１Ａ３とも呼ばれ
る）のアミノ酸配列である。ＰＤＥＸＶは６８４個のア
ミノ酸をもつ。理論により束縛されることは望まない
が、推定上のｃＧＭＰ結合モチーフ（Ｘ２）と結びつけ
られるアミノ酸配列には、下線をほどこした。２つのｃ
ＧＭＰ結合モチーフの存在は、スプライス変異体の示差
的調節のための潜在能を提供する。

【００１６】好ましくは、本発明のアミノ酸配列は２つ
のｃＧＭＰ結合モチーフを有する。便宜上、ここで、ア
ミノ酸のために使用されるコードを示す表を紹介する。

【００１７】

【表１】

【００１８】便宜上、本発明のＰＤＥは、時として、Ｐ
ＤＥＸＶと呼ばれる。我々は、本発明のＰＤＥがＰＤＥ
１１Ａ１の切断バージョンであると考えている。ＰＤＥ
１１Ａ１のための配列は、我々が本発明のＰＤＥに従っ
た変異体であると考えているＰＤＥ１１Ａ２と共に、添
付の配列表で紹介されている。本発明のＰＤＥは、ｃＡ
ＭＰ及び／又はｃＧＭＰの分解の触媒として作用するこ
とができる。

【００１９】配列番号１については、アミノ酸のいずれ
か１つ又は複数のものがその類似体でありうる。本書で
用いられている「類似体（analogue）」という語は、配
列番号１Ｉのものに類似する配列をもつものの非障害性
（すなわち酵素活性に有害でない）アミノ酸置換又は欠
失が行なわれた配列を意味する。

【００２０】本発明の第２の態様に従うと、本発明のア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供されて
いる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号２と
して示されている配列又はその変異体、相同体、フラグ
メント又は誘導体を含み、ここでヌクレオチド配列は、
ＰＤＥ活性を示す能力をもつアミノ酸配列についてコー
ドする。

【００２１】本発明の第３の態様に従うと、本発明に従
ったヌクレオチド配列に対しハイブリッド形成する能力
をもつヌクレオチド配列、又はそれに対し相補的な配列
が提供されている。本発明の第４の態様に従うと、本発
明の第３の態様に従ったヌクレオチド配列に対しハイブ
リッド形成する能力をもつヌクレオチド配列、又はそれ
に対し相補的な配列が提供されている。

【００２２】本発明の第５の態様に従うと、本発明に従
ったヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。本
発明の第６の態様に従うと、本発明に従ったヌクレオチ
ド配列を取込んだ宿主細胞が提供される。本発明の第７
の態様に従うと、ＰＤＥＸＶ活性又はその発現に影響を
及ぼす可能性のある作用物質（an agent）を同定するた
めの検定方法において、本発明に従ったアミノ酸又はヌ
クレオチド配列と作用物質を接触させる段階及びＰＤＥ
ＸＶの活性又は発現を測定する段階を含んで成る方法で
あって、ａ）作用物質の不在下でのＰＤＥ活性又は発現
と ｂ）作用物質の存在下でのＰＤＥ活性又は発現の間
の差が、その作用物質がＰＤＥＸＶ活性又は発現に影響
を及ぼしうることの指標であるような検定方法が提供さ
れている。

【００２３】好ましくは該検定は、海綿体（corpus cav
ernosum)、腎臓、肝臓、骨格筋、精巣（testis）、前立
腺のうちのいずれか１つ又は複数のものの中に見い出さ
れる単数又は複数の心臓血管障害の治療において有用な
作用物質についてスクリーニングするためのものであ
る。本発明の第８の態様に従うと、（ａ）本発明に従っ
て検定を実施する段階、（ｂ）ＰＤＥＸＶの活性又は発
現に対し正に影響を及ぼす単数又は複数の作用物質を同
定する段階及び（ｃ）これらの単数又は複数の同定され
た作用物質を一定量調製する段階を含んで成るプロセス
が提供されている。

【００２４】本発明の９番目の態様に従うと、１つの作
用物質で in vivo ＰＤＥＸＶ活性又は発現に影響を及
ぼす方法において、該作用物質が、 in vitro 検定方法
の中でＰＤＥＸＶ活性又は発現に影響を及ぼす能力を有
し、該 in vitro 検定方法が本発明の検定方法であるよ
うな方法が提供されている。本発明の１０番目の態様に
従うと、ＰＤＥＸＶに関連する疾患又は健康状態の治療
を目的とした医薬組成物の調製における１つの作用物質
の使用において、本発明の検定方法により in vitro で
検定されたとき該作用物質がＰＤＥの活性又は発現に対
し効果を及ぼす能力を有するような使用が提供されてい
る。

【００２５】本発明の１１番目の態様に従うと、ＰＤＥ
ＸＶに対して発生した抗体との免疫学的反応をもつこと
のできる酵素が提供されている。本発明の１２番目の態
様に従うと、ＮＣＩＭＢ４１０２５から得ることができ
る、ＰＤＥをコードするヌクレオチド配列が提供されて
いる。本発明の１３番目の態様に従うと、ＮＣＩＭＢ４
１０２５から得ることのできるヌクレオチド配列から発
現可能であるＰＤＥが提供される。

【００２６】本発明の１４番目の態様に従うと、ＰＤＥ
ＸＶに関連する疾病又は健康状態の治療のための医薬組
成物の調製における、ＰＤＥＸＶの活性又はその発現に
対する効果をもつ作用物質の使用が提供されている。本
発明のさらなる態様に従うと、以下のものから選択され
たヌクレオチド配列が提供されている： （ａ）配列番号２として提示されるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２として提示されたヌクレオチド配列の
変異体、相同体、誘導体又はフラグメントであるヌクレ
オチド配列； （ｃ）配列番号２として記述されているヌクレオチド配
列の相補体であるヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号２として提示されたヌクレオチド配列の
変異体、相同体、誘導体又はフラグメントの相補体であ
るヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号２として記述されたヌクレオチド配列に
ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号２として提示されたヌクレオチド配列の
変異体、相同体、誘導体又はフラグメントにハイブリダ
イズすることができるヌクレオチド配列； （ｇ）配列番号２として記述されたヌクレオチド配列に
ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相
補体であるヌクレオチド配列； （ｈ）配列番号２として提示されたヌクレオチド配列の
変異体、相同体、誘導体又はフラグメントにハイブリダ
イズすることができるヌクレオチド配列の相補体である
ヌクレオチド配列； （ｉ）配列番号２として記述されたヌクレオチド配列の
相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド
配列； （ｊ）配列番号２として提示されたヌクレオチド配列の
変異体、相同体、誘導体又はフラグメントの相補体にハ
イブリダイズすることができるヌクレオチド配列； （ｋ）上記 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)、
(g)、 (h)、 (i)又は(j)で定義されたヌクレオチドに遺
伝子コードの結果として縮重したヌクレオチド配列； （ｌ）上記 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)、
(g)、 (h)、 (i)、 (j)及び／又は(k) のいずれか１つ
を含むヌクレオチド配列。

【００２７】ここで本発明のその他の態様が以下で紹介
される：本発明に従って単離されたヌクレオチド配列又
は単離されたタンパク質配列。本発明に従った実質的に
純粋なヌクレオチド配列又は実質的に純粋なタンパク
質。本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその
発現産物の活性に影響を及ぼすことのできる作用物質を
同定するための検定方法において、本発明のヌクレオチ
ド配列又はその発現産物（「ＥＰ」）を１つの作用物質
に晒す段階；本発明のヌクレオチド配列又はその発現産
物を該作用物質が調節する（例えば発現パターン又は活
性に影響を及ぼす）か否かを決定する段階を含んで成る
検定方法。

【００２８】本発明の検定方法によって同定された作用
物質。本発明に従ったＰＤＥ調節効果をもつことがこれ
まで知られていなかった、本発明の検定方法によって同
定される作用物質。 （ａ）本発明の検定を実施する段階；（ｂ）本発明のヌ
クレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性
に影響を及ぼす１以上の作用物質を同定する段階；
（ｃ）これらの１以上の同定された作用物質を一定量調
製する段階を含んで成るプロセス。

【００２９】（ａ）本発明に従った検定を実施する段
階；（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又
はその発現産物の活性に影響を及ぼす１以上の作用物質
を同定する段階；（ｃ）１以上の同定された作用物質含
む医薬組成物を調製する段階を含んで成るプロセス。 （ａ）本発明に従った検定を実施する段階；（ｂ）本発
明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物
の活性に影響を及ぼす１以上の作用物質を同定する段
階；（ｃ）本発明のヌクレオチド配列の発現バターン又
はその発現産物の活性に対し異なる効果をひき起こすよ
う１以上の同定された作用物質を調節する段階を含んで
成るプロセス。

【００３０】本発明のヌクレオチド配列の発現パターン
又はその発現産物の活性に影響を及ぼす薬剤の製造にお
ける、本発明に従った検定によって同定された作用物質
の使用。本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又は
その発現産物の活性を調節する能力をもつ作用物質を有
効量を標的にデリバリーする（例えば投与又は暴露す
る）段階を含んで成る、（哺乳動物好ましくはヒトであ
りうる）標的の治療方法。

【００３１】本発明に従った検定により同定された作用
物質を有効量を標的にデリバリーする（例えば投与又は
暴露する）段階を含んで成る、（哺乳動物好ましくはヒ
トでありうる）標的の治療方法。本発明のヌクレオチド
配列又はその発現産物を被験体（a subject)に投与する
段階を含んで成る、被験体の中で免疫応答を誘発する方
法。

【００３２】ＰＤＥＸＶ（ＰＤＥ１１Ａ３） 上述のように、本発明は、我々がＰＤＥＸＶと呼んだ
（そうでなければＰＤＥ１１Ａ３と表現することもでき
る）新規ＰＤＥ酵素、及びこれをコードするヌクレオチ
ド配列に関する。本発明は同様に疾病の診断及び治療に
おける新規核酸及びアミノ酸配列の使用にも関する。本
発明は同様に、ホスホジエステラーゼ活性を調節するこ
とができる作用物質を評価する及び／又はスクリーニン
グするための新規核酸及びアミノ酸配列の使用にも関す
る。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ活性を調節
できる作用物質を評価及び／又はスクリーニングするた
め新規核酸及びアミノ酸配列を含むか又は発現する遺伝
子操作された宿主細胞に関する。

【００３３】ＰＤＥＸＶは、さまざまな供給源の中に存
在し、それらの供給源から得ることができると考えられ
ている。一例を挙げると、ＰＤＥＸＶは、心臓血管系、
海綿体、腎臓、肝臓、骨格筋、精巣、前立腺の中に発見
される。我々は同様に、ＰＤＥＸＶが、例えばウシ、ヒ
ツジ、ブタ及びウマといった一定数のその他の供給源の
中にも存在すると考えている。

【００３４】好ましくは、本発明は、上述の供給源のい
ずれかを内含するもののこれらに制限されない哺乳動物
のＰＤＥＸＶをも網羅している。より好ましくは、本発
明はヒトＰＤＥＸＶをも網羅する。ＰＤＥＸＶは、天然
形態と同じであってもよいし−この点で、好ましくはＰ
ＤＥＸＶは非天然アミノ酸配列（すなわちその天然の環
境内には存在しない）であるか、又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体であってもよい。付加的に
は、又は代替的には、ＰＤＥＸＶは単離したＰＤＥＸＶ
及び／又は精製されたＰＤＥＸＶである。ＰＤＥＸＶ
は、天然のものであるか否かに関わらず好適な任意の供
給源から得るか又はそれから産生することができ、そう
でなければ、合成、半合成又は組換え体であってもよ
い。

【００３５】ＰＤＥＸＶコーティング配列は、天然形態
と同じであってもよいし−この点で、好ましくはＰＤＥ
ＸＶコーティング配列は非天然ヌクレオチド配列（すな
わちその天然の環境内には存在しない）である、又はそ
の変異体、相同体、フラグメント又は誘導体であっても
よい。付加的には、又は代替的には、ＰＤＥＸＶコーデ
ィング配列は単離したＰＤＥＸＶコーディング配列及び
／又は精製されたＰＤＥＸＶコーディング配列である。
ＰＤＥＸＶコーディング配列は、天然のものであるか否
かに関わらず好適な任意の供給源から得るか又はそれか
ら産生することができ、そうでなければ、合成、半合成
又は組換え体であってもよい。

【００３６】ＰＤＥＸＶ及び／又はそのコーディング配
列及び／又はそれにハイブリダイズすることができる配
列は、異なるＰＤＥ間での医薬品候補の選択性をテスト
するために有用である。ＰＤＥＸＶは、ｃＧＭＰからＧ
ＭＰへ及び／又はｃＡＭＰからＡＭＰへの変換を触媒す
ることができると考えられている。

【００３７】ｃＧＭＰは、雄の勃起応答におけるメッセ
ンジャーである。従って、ＰＤＥＸＶの活性を阻害は、
存在するｃＧＭＰの濃度が増大するようであり、従って
雄の勃起応答を増大させることができる。かくして、Ｐ
ＤＥＸＶ及び／又はそのコーディング配列及び／又はそ
れにハイブリダイズすることができる配列は、雄の勃起
機能障害（ＥＤ）の治療のための医薬品候補をスクリー
ニングするために有用でありうる。

【００３８】さらに、ＰＤＥＸＶ及び／又はそのコーデ
ィング配列及び／又はそれにハイブリダイズすることが
できる配列は、雌の性的機能障害の治療のための医薬品
候補をスクリーニングするために有用でありうると考え
られている。本発明の好ましい態様には、組換え型ＰＤ
ＥＸＶ酵素及びＰＤＥＸＶ酵素をコードする組換えヌク
レオチド配列が内含される。

【００３９】好ましくは、本発明の組換えＰＤＥＸＶ酵
素及び／又は組換えヌクレオチド配列は、組換えの哺乳
動物のＰＤＥＸＶ酵素及び／又は組換え哺乳動物 ヌク
レオチド配列である。好ましくは、本発明の組換えＰＤ
ＥＸＶ酵素及び／又は組換えヌクレオチド配列は、組換
えのヒトＰＤＥＸＶ酵素及び／又は組換えヒトヌクレオ
チド配列である。

【００４０】ＰＤＥＸＶについてコードするヌクレオチ
ド配列又はＰＤＥＸＶ酵素自体のいずれか又は両方を、
ＰＤＥＸＶ活性に影響を及ぼすことのできる作用物質に
ついてスクリーニングするのに使用することができる。
特に、ＰＤＥＸＶ又はＰＤＥＸＶ自体をコードするヌク
レオチド配列は、ＰＤＥＸＶ活性を阻害できる作用物質
をスクリーニングするために使用することができる。さ
らに、ＰＤＥＸＶ又はＰＤＥＸＶ酵素自体についてコー
ドするヌクレオチド配列は、ＰＤＥＸＶ活性を選択的に
阻害するといったようにＰＤＥＸＶ活性を、選択的に影
響を及ぼす作用物質をスクリーニングするのに使用でき
る。

【００４１】さらに、ＰＤＥＸＶについてコードするヌ
クレオチド配列又はそれに相補的な配列も又、ヒトの細
胞内のＰＤＥＸＶ コーディング配列の存在を検出する
ための検定において使用可能である。これらの検定は、
この酵素の組織分布及び特定の疾病状態に関するその生
物学的関連性についての情報を提供することになる。本
発明は同様に、ＰＤＥＸＶ（その誘導体、フラグメン
ト、相同体又はその変異体を含む）に対する抗体をも網
羅している。ＰＤＥＸＶに対する抗体は、ヒト細胞内の
ＰＤＥＸＶの存在を検出するための検定において使用可
能である。これらの検定は、この酵素の組織分布及び特
定の疾病状態に関するその生物学的関連性についての情
報を提供することになる。

【００４２】特に、ＰＤＥＸＶイソ酵素、これをコード
するヌクレオチド配列、これと相補的であるヌクレオチ
ド配列及びこれに対する抗体のうちのいずれか１つ又は
複数のものを、イソ酵素（isozymes）の１つに選択的に
影響を及ぼす作用物質をスクリーニングするための検定
において使用することができる。これらの検定は、イソ
酵素の各々の組織分布に関する情報を提供し、特定の疾
病状態に関するイソ酵素の各々の生物学的関連性につい
ての情報を提供することになる。これらの検定は同様に
研究者が、例えば特定の組織内又は特定の疾病状態での
ＰＤＥＸＶの発現又は活性に影響を及ぼすために有用で
ある作用物質についてテストしそれを同定することをも
可能にすることになる。

【００４３】本発明のポリペプチド 「タンパク質」という語と互換性ある「ポリペプチド」
という語には、個々の成分ペプチドが共有又は非共有結
合手段によって連結されている多ポリペプチド複合体な
らびに１本鎖ポリペプチド分子が含まれる。好ましく
は、本発明のポリペプチドは１本鎖ポリペプチドであ
る。

【００４４】本発明のポリペプチドは実質的に単離され
た形態をしていてよい。ポリペプチドは、ポリペプチド
の意図された目的と干渉せずしかもなお実質的に単離さ
れているものとみなされるような担体又は希釈剤と混合
可能であることがわかるだろう。本発明のポリペプチド
は、実質的に精製された形をしていてもよく、その場
合、それは一般に、中のポリペプチドの９０％以上、例
えば９５％、９８％又は９９％が本発明のポリペプチド
であるような調製物の中のポリペプチドを構成すること
になる。本発明のポリペプチドは例えば、それらの精製
を助けるためヒスチジン残基を付加することによって又
は以下で論述するように細胞からのそれらの分泌を促進
するためのシグナル配列の付加によって修飾されること
ができる。

【００４５】本発明のポリペプチドは、合成手段（例え
ば Geyson et al., １９９６ により論述されているよ
うな）によってか又は以下で記述するとおり組換えによ
って産生されうる。好ましい実施形態においては、本発
明のアミノ酸配列はそれ自体、その天然の環境内にある
とき及び同じくその天然の環境内にあるその天然ヌクレ
オチドコーディング配列によって発現されたとき、そし
てそのヌクレオチド配列が、同じくその天然の環境内に
あるその天然プロモータの制御下にあるとき、本発明に
従った天然ＰＤＥＸＶを網羅しない。参照を容易にする
ため、我々はこの好ましい実施形態を「非天然アミノ酸
配列」と呼んだ。

【００４６】本発明の酵素のためのアミノ酸配列との関
係における「変異体（variant）」「相同体（homologu
e）」又は「フラグメント（fragment）」という語は、
得られた酵素がＰＤＥＸＶ活性を有し好ましくは添付の
配列表に示された酵素と少なくとも同程度の生物活性を
もつことを条件として、その配列から又はその配列に対
する１つ（又は複数）のアミノ酸のあらゆる置換、変
更、修飾、交換、欠失又は付加を内含する。特に、「相
同体」という語は、構造及び／又は機能に関する相同性
を網羅する。配列相同性に関しては、好ましくは、配列
番号１として示されている配列に対する少なくとも７５
％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましく
は少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましく
は、配列番号１として示されている配列に対する少なく
とも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性
が存在する。

【００４７】好ましくは、本発明の変異体、相同体又は
フラグメントは、以下のＮ末端配列の少なくとも２５個
の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも４５個の隣接ア
ミノ酸、好ましくは少なくとも６５個の隣接アミノ酸、
好ましくは少なくとも８５個の隣接アミノ酸、好ましく
は少なくとも１０５個の隣接アミノ酸、好ましくは少な
くとも１２５個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも
１４５個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも１６５
個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも１８５個の隣
接アミノ酸を含む：

【００４８】

【化１】

【００４９】典型的には、本発明の変異体、相同体又は
フラグメントについて、行なうことのできるアミノ酸置
換のタイプは、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持し
なければならない。修飾された配列が本発明に従ったＰ
ＤＥ酵素として作用する能力を保持していることを条件
として、例えば１、２、又は３回〜１０、２０または３
０回のアミノ酸置換を行なうことができる。アミノ酸置
換は、例えば血漿半減期を増大させるため、非天然類似
体の使用を含むことができる。

【００５０】本発明のアミノ酸配列は、適切な発現系内
でそれをコードするヌクレオチド配列の発現によって産
生され得る。さらに、又は代替的には、タンパク質自体
は、ＰＤＥアミノ酸配列を全体的に又は部分的に合成す
るべく化学的方法を用いて産生することができる。例え
ば、ペプチドを固相技術によって合成し、樹脂から解裂
させ、前処理用高性能液体クロマトグラフィによって精
製可能である。（例えば Creighton（１９８３）タンパ
ク質構造と分子原理、WH Freeman and Co, New York NY
）合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定
によって確認できる（例えば Edman分解手順）。

【００５１】直接的ペプチド合成は、さまざまな固相技
術（Roberge JY et al（１９９５）Science ２６９：２
０２−２０４）を用いて実施でき、自動化された合成
は、例えばメーカーにより提供される指示事項に従って
ＡＢＩ４３ １Ａペプチド合成装置（Perkin Elmer）を
用いて達成可能である。さらに、ＰＤＥのアミノ酸配列
又はその任意の一部分を直接的合成中に改変し、かつ／
又は、その他のサブユニットからの配列又はその任意の
一部分と化学的方法を用いて組合せ、変異体ポリペプチ
ドを産生することができる。

【００５２】本発明のもう１つの実施形態においては、
融合タンパク質をコードするため、ＰＤＥ天然、修飾又
は組換え型配列を異種（heterologous）配列に連結する
ことができる。例えば、ＰＤＥ活性の阻害物質について
ペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市
販の抗体によって認識される異種エピトープを発現する
キメラＰＤＥタンパク質をコードすることが有用である
かもしれない。ＰＤＥがその異種部分から解裂され、そ
して精製され得るように、ＰＤＥ配列と異種タンパク質
配列の間に配置された解裂部位を含むように、融合タン
パク質を作ることも可能である。

【００５３】ＰＤＥは、タンパク質精製を容易にするよ
うに付加された単数又は複数の付加的なポリペプチドド
メインを伴う組換えタンパク質としても発現され得る。
かかる精製促進ドメインには、固定化された金属上の精
製を可能にするヒスチジン−トリプトファン・モジュー
ルといったような金属キレート化ペプチド（Porath J
（１９９２） Protein Expr Purif３−．２６３２８
１）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプ
ロテインＡドメイン及びＦＬＡＧＳ伸張／アフィニティ
ー精製系内で利用されるドメイン（Immunex Corp. Seat
tle, WA）が含まれるが、これらに制限されるわけでは
ない。精製ドメインとＰＤＥの間にＸＡ因子又はエンテ
ロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）といったよ
うな解裂可能なリンカー配列を内含することも、精製を
容易にするために有用である。

【００５４】ＰＤＥＸＶの特異的アミノ酸配列が配列番
号１に示されている。しかしながら、本発明は、その特
異的アミノ酸配列に対する少なくとも６０％の同一性
（より好ましくは少なくとも７５％の同一性）をもつア
ミノ酸配列を内含することになるＰＤＥＸＶファミリー
からのその他の構成員をコードするアミノ酸配列を包含
する。

【００５５】本発明のポリペプチドは同様に、提示され
たアミノ酸配列のフラグメント及びその変異体をも内含
する。適切なフラグメントは、少なくともそのサイズが
アミノ酸５個、例えば１０、１２、１５又は２０個とな
る。本発明のポリペプチドは同様に、保存置換を含め、
単数又は複数の（例えば少なくとも２、３、５又は１０
個の）置換、欠失又は挿入を含むように修飾され得る。
これらの態様については、後の節で論述されている。

【００５６】本発明のヌクレオチド配列 本書で使用されている「ヌクレオチド配列」という語
は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列
及びその変異体、相同体、フラグメント及び誘導体（例
えばその一部分）のことを意味する。ヌクレオチド配列
は、センスストランド又はアンチセンスストランドのい
ずれを表わすものであれ２本鎖又は１本鎖であってよい
ゲノム由来又は合成又は組換えのものでありうるＤＮＡ
又はＲＮＡであると考えられる。

【００５７】好ましくは、「ヌクレオチド配列」という
語はＤＮＡを意味する。より好ましくは、「ヌクレオチ
ド配列」という語は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製
されたＤＮＡ（すなわち組換えＤＮＡ）を意味する。好
ましい実施形態においては、本発明のヌクレオチド配列
はそれ自体、同じくその天然の環境にあるその天然プロ
モータの制御下にあるとき、その天然環境内の本発明に
従った天然コーディング配列を網羅しない。参照を容易
にするため、我々はこの好ましい実施形態を「非天然ヌ
クレオチド配列」と呼んだ。

【００５８】本発明のヌクレオチド配列はその中に合成
又は修飾済みヌクレオチドを内含する可能性がある。当
該技術分野においては、オリゴヌクレオチドに対する数
多くの異なるタイプの修飾が知られている。これらに
は、メチルホスホネート及びホスホロチオエート・バッ
クボーン、分子の３’及び／又は５’末端におけるアク
リジン又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明にお
いては、本書に記述されているヌクレオチド配列が当該
技術分野において利用可能なあらゆる方法によって修飾
できるものと理解すべきである。かかる修飾は、本発明
のヌクレオチド配列の in vivo活性又は寿命を高めるた
めに実施可能である。

【００５９】本発明は同様に、本書で提示されている配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその何らかの変異
体、フラグメント又は誘導体をも包含する。配列がその
フラグメントに相補的である場合、その配列はその他の
生体内の類似のコーディング配列同定するためのプロー
ブとして使用可能である。本発明は同様に、本書で提示
されている配列にハイブリダイズすることができるヌク
レオチド配列又はその変異体、フラグメント又は誘導体
をも包含する。

【００６０】本発明は同様に、本書で提示されている配
列に相補的である配列にハイブリダイズすることができ
るヌクレオチド配列又はその変異体、フラグメント又は
誘導体も包含する。「変異体」という語は同様に、本書
で提示されているヌクレオチド配列に対しハイブリダイ
ズすることができる配列に対し相補的な配列をも包含す
る。

【００６１】好ましくは「変異体」という語は、本書に
提示されているヌクレオチド配列に対し緊縮性条件（例
えば６５℃及び０.１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ
のＮａＣｌ、０.０１５Ｎａ₃シトレートｐＨ７.０｝）
下でハイブリッド形成する能力をもつ配列に相補的であ
る配列を包含する。本発明は同様に（本書に提示されて
いる配列の相補的配列を含めた）本発明のヌクレオチド
配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配
列にも関する。

【００６２】本発明は同様に、（本書に提示されている
配列の相補的配列を含めた）本発明のヌクレオチド配列
にハイブリダイズすることができる配列に対して相補的
であるヌクレオチド配列にも関する。同様に本発明の範
囲内に含まれるのは、中乃至最高ストリンジェント条件
下でここに紹介されているヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズすることができるポリヌクレオチド配列である。

【００６３】好ましい一態様においては、本発明は、ス
トリンジェント条件（例えば６５℃及び０.１×ＳＳ
Ｃ）下で本発明のヌクレオチド配列又はその補体にハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチド配列を網羅す
る。核酸例は、代替的にはＰＤＥＸＶタンパク質をコー
ドし、添付の配列表に示されているＤＮＡ配列にハイブ
リダイズするようなヌクレオチド配列として特徴づけす
ることができる。好ましいのは、添付の配列表中に示さ
れた配列又はその補体に対し高ストリンジェント条件下
でハイブリダイズするＰＤＥＸＶをコードする配列であ
る。

【００６４】有利には、本発明は、添付の配列表中に示
された配列又はその相補体のフラグメントにストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸配
列を提供する。好ましくは、フラグメントの長さは１５
〜５０塩基である。有利には、その長さは約２５塩基で
ある。本発明の好ましい酵素についてコードするヌクレ
オチド配列に関連する「変異体」、「相同体」又は「フ
ラグメント」は、結果として得られるヌクレオチド配列
が、ＰＤＥＸＶ活性を有しかつ好ましくは少なくとも添
付の配列表に示された配列によってコードされた酵素と
同程度の生物活性をもつ酵素についてコードするか又は
この酵素についてコードする能力をもつことを条件とし
て、その配列から又はその配列に対する単数（又は複数
の）核酸のあらゆる置換、変更、修飾、交換、欠失又は
付加を内含する。特に「相同体」という語は、結果とし
て得たヌクレオチド配列がＰＤＥＸＶ活性をもつ酵素を
コードするか又はコードすることができることを条件と
して、構造及び／又は機能に関する相同性を網羅する。
配列相同性に関しては、好ましくは、配列番号１として
示されているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列に対する少なくとも７５％、より好ましくは少なくと
も８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性
が存在する。より好ましくは、配列番号１として示され
ているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対
する少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８
％の相同性が存在する。好ましくは、配列相同性に関し
て、好ましくは、配列番号２として示されている配列に
対する少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８
５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性が存
在する。より好ましくは、配列番号２として示されてい
る配列に対する少なくとも９５％、より好ましくは少な
くとも９８％の相同性が存在する。

【００６５】好ましくは、本発明の変異体、相同体又は
フラグメントは、以下のＮ末端配列の少なくとも２５個
の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも４５個の隣接ア
ミノ酸、好ましくは少なくとも６５個の隣接アミノ酸、
好ましくは少なくとも８５個の隣接アミノ酸、好ましく
は少なくとも１０５個の隣接アミノ酸、好ましくは少な
くとも１２５個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも
１４５個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも１６５
個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも１８５個の隣
接アミノ酸を含む：

【００６６】

【化２】

【００６７】かかる適切なＮ末端配列の一例をコードす
るヌクレオチド配列の一例を以下に提示する：

【００６８】

【化３】

【００６９】ここで示されているように、本発明は、Ｐ
ＤＥＸＶをコードするＤＮＡ配列（好ましくはｃＤＮＡ
配列）に関する。特に、本発明は、ＰＤＥＸＶをコード
するｃＤＮＡ配列に関する。本発明は同様に、添付の配
列表の中に示された配列又はかかる配列の対立遺伝子変
形形態のＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントにも関す
る。

【００７０】本発明は同様に、前出のＤＮＡ配列又はそ
の対立遺伝子変形形態が取込まれた宿主細胞内での発現
によって産生されたポリペプチドにも関する。本発明は
同様に、添付の配列表の中に示されたＤＮＡ配列又はそ
の対立遺伝子変形形態を含むＤＮＡにも関する。本発明
は同様に、添付の配列表の中に示されたＤＮＡ配列又は
その対立遺伝子変形形態を含む非天然ＤＮＡにも関す
る。

【００７１】本発明の非常に好ましい態様は、添付の配
列表に示されているＤＮＡ配列又はその対立遺伝子変形
形態を含む組換えＤＮＡにも関する。本発明のポリヌク
レオチドは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレ
オチド酸配列を内含する。一範囲の異なるポリヌクレオ
チドが遺伝子コードの縮重の結果として、一定の与えら
れたアミノ酸配列をコードするということがわかるだろ
う。

【００７２】本書中に記述されているアミノ酸配列を知
ることにより、本発明のポリペプチドをコードするｃＤ
ＮＡ及び／又はゲノミック・クローンといったような部
分長及び全長の核酸配列を考案することが可能である。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本書に提示され
ているアミノ酸配列をコードする配列をターゲテンィグ
するように設計されたプライマを使用することになる縮
重ＰＣＲを用いて得ることができる。プライマは、標準
的に、多数の縮重位置を含むことになる。しかしなが
ら、縮重を最小限におさえるためには、唯一のトリプレ
ットによってコードされるメチオニンといったようなア
ミノ酸を含有する本書で提示されたアミノ酸配列の領域
をコードする配列が選択されることになる。さらに、Ｐ
ＣＲ手順のための鋳型ＤＮＡとして用いられる核酸をも
つ生体の中でのコドン利用を考慮に入れるように配列が
選択されることになる。ＰＣＲは、既知の配列に対する
単一配列の（非縮重）プライマを用いて配列をクローニ
ングするのに使用されるものよりも低いストリンジェン
ト条件で使用されることになる。

【００７３】このとき本発明のポリペプチドフラグメン
トをコードするＰＣＲにより得られた核酸配列は、ハイ
ブリダイゼーション・ライブラリー・スクリーニング技
術を用いてより大きな配列を獲得するために使用するこ
とができる。例えば、ＰＣＲクローンを放射性原子で標
識づけし、その他の種、好ましくはその他の哺乳動物種
からｃＤＮＡ又はゲノミック・ライブラリをスクリーニ
ングするために使用することができる。ハイブリダイゼ
ーション条件は、中乃至高ストリンジェント条件となる
（例えば約５０℃〜約６０℃の温度で塩化ナトリウム
０.０３Ｍ及びクエン酸ナトリウム０.０３Ｍ）。

【００７４】アミノ酸配列の全部又は一部分をコードす
る縮重した核酸プローブも同様に、その他の種、好まし
くはその他の哺乳動物種からｃＤＮＡ及び／又はゲノミ
ックライブラリをプローブ探査するために使用すること
ができる。しかしながら、最初に、さらなるスクリーニ
ング手順で使用するために単一配列を得るべくＰＣＲ技
術を実施することが好ましい。

【００７５】本発明に従うと、適切な宿主細胞内でＰＤ
ＥＸＶの発現指令する組換えＤＮＡ分子を生成するため
に、ＰＤＥＸＶ、ポリペプチドのフラグメント、融合タ
ンパク質又はその機能的等価物をコードするＰＤＥＸＶ
ポリヌクレオチド配列を用いることができる。遺伝子コ
ードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか又は機能
的に等価のアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配
列を用いてＰＤＥＸＶをクローニングし発現することが
可能である。当業者であればわかるように、天然に発生
しないコドンを有するＰＤＥをコードするヌクレオチド
配列を産生することが有利でありうる。特定の原核又は
真核宿主により好まれるコドン（MurrayE et al（１９
８９）Nuc Acids Res １７：４７７−５０８）を、例え
ばＰＤＥＸＶの発現速度を高くし又は天然配列から産生
された転写物よりも長い半減期といったような望ましい
特性をもつ組換え型ＤＮＡ写しを産生するために選択す
ることができる。

【００７６】上述の技術を用いて得られた本発明のポリ
ヌクレオチド配列は、上述の技術を用いてさらなる相同
な配列及び変異体を得るのに使用可能である。これらは
同様に、例えばポリヌクレオチド配列が中で発現されつ
つある特定の宿主細胞のためにコドンの選好を最適化さ
せるために、さまざまな宿主細胞内で本発明のポリペプ
チドを発現する上で使用するべく修飾可能である。制限
酵素認識部位を導入するため又はポリヌクレオチドによ
ってコードされたポリペプチドの特性又は機能を改変す
るため、その他の配列変更が望まれる可能性もある。

【００７７】本発明に従って使用できる改変されたＰＤ
ＥＸＶポリヌクレオチド配列は、同じ又は機能的に等価
のＰＤＥをコードするポリヌクレオチドを結果としても
たらす異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入又は置換を
内含する。該タンパク質は、サイレント変化を生み出し
機能的に等価のＰＤＥを結果としてもたらすアミノ酸残
基の欠失、挿入又は置換を有することもできる。ＰＤＥ
の生物活性が保持されるかぎり、残基の極性、電荷、可
溶性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基
づいて、計画的なアミノ酸置換を行なうことが可能であ
る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラ
ギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ
酸としてはリジン及びアルギニンがあり、類似の親水性
値をもつ帯電していない有極先端基を伴うアミノ酸とし
ては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、ア
ラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニ
ン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれる。

【００７８】本発明の範囲内に内含されるのは、ＰＤＥ
の対立遺伝子である。本書で使用されるような「対立遺
伝子（allele）」又は「対立遺伝子配列（allelic sequ
ence）」は、ＰＤＥの代替的形態である。対立遺伝子は
突然変異すなわち核酸配列内の変化の結果としてもたら
され、一般に、構造又は機能は改変されていてもいなく
てもよい改変されたｍＲＮＡ又はポリペプチドを産生す
る。一定の与えられた遺伝子は全て、対立遺伝子形態を
全くもたないか、１つもつか又は数多く有している。対
立遺伝子を発生させる共通の突然変異変化の原因は、一
般にアミノ酸の欠失、付加又は置換にある。これらのタ
イプの変化は各々、一定の与えられた配列の中で一回又
は複数回、単独で発生することもあれば、又その他の変
化と組合わさった形で発生することもある。

【００７９】本発明のヌクレオチド配列は、制限的な意
味なく遺伝子産物のクローニング、処理及び／又は発現
を修正する改変を含め、さまざまな理由でＰＤＥコーデ
ィング配列を改変するために操作できる。例えば、新し
い制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを改
変するため又はコドン選好を変更するため、例えば部位
特異的突然変異誘発といったような当該技術分野におい
て周知である技術を用いて突然変異を導入することがで
きる。

【００８０】本発明のポリヌクレオチドは、例えばＰＣ
Ｒプライマといったプライマー、代替的増幅反応のため
のプライマー、例えば放射性又は非放射性標識を用いた
従来の手段により顕示用標識で標識づけされたプローブ
を産生するために使用することができ、またこのポリヌ
クレオチドをベクター内にクローニングすることも可能
である。かかるプライマー、プローブ及びその他のフラ
グメントは、長さが少なくともヌクレオチド１５個、好
ましくは少なくとも２０個、例えば少なくとも２５、３
０又は４０個であり、同様に、本書で用いる本発明のポ
リヌクレオチドという語によって包含される。

【００８１】本発明のポリヌクレオチド又はプライマー
は、顕示用標識を支持していてよい。適切な標識として
は、³²Ｐ又は³⁵Ｓといったような放射性同位元素、酵素
標識又はビオチンといったようなその他のタンパク質標
識を内含する。かかる標識は、本発明のポリヌクレオチ
ド又はプライマーに付加でき、それ自体既知の技術を用
いて検出できる。

【００８２】本発明に従ったＤＮＡポリヌクレオチド及
びプライマーといったポリヌクレオチドは、組換え、合
成、又は当業者が利用できるあらゆる手段によって産生
可能である。これらは、標準的技術によってもクローニ
ングできる。一般に、プライマは、一度に１つのヌクレ
オチドの割合で所望の核酸配列の段階的製造が関与する
合成手段によって産生されることになる。自動的技術を
用いてこれを達成するための技術は、当該技術分野にお
いて容易に利用可能である。

【００８３】より長いポリヌクレオチドは、組換え型手
段例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング
技術を用いて産生される。これには、クローニングした
いヌクレオチド配列の領域に対し一対のプライマー（例
えば約１５〜３０個のヌクレオチドの）を作ること、真
菌、植物又は原核細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮ
Ａとプライマーを接触させること、所望の領域の増幅を
もたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施するこ
と。増幅されたフラグメントを分離すること（例えばア
ガロースゲル上の反応混合物を精製することによる）、
及び増幅したＤＮＡを回収することが関与することにな
る。プライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクローニン
グベクターへとクローニングされ得るような形で、適切
な酵素認識部位を含有するように設計することができ
る。

【００８４】ＤＮＡ分子は、細胞内安定性及び半減期を
増大させるように修飾可能である。考えられる修飾とし
ては、分子の５’末端及び／又は３’末端のフランキン
グ配列の付加又は分子のバックボーン内でのホスホジエ
ステラーゼリンケージではなくホスホロチオエート又は
２’Ｏ−メチルの使用があるが、これらに制限されるわ
けではない。

【００８５】以上で言及したように、本発明は同様に、
添付の配列表中で示されている配列のうちの全て又は一
部分又はその対立遺伝子変形形態にハイブリダイズする
ことができるヌクレオチド配列にも関する。これらのヌ
クレオチド配列は、ＰＤＥＸＶ発現を修正するべくアン
チセンス技術において使用可能である。あるいは、これ
らの配列（又はその一部分）をプローブとして用いるこ
ともできるし、或いは又はポリメラーゼ連鎖反応プライ
マとして用いられる場合にはかかる配列の全て又は一部
分を増幅するために使用することもできる。

【００８６】組換え型ＤＮＡ配列に加えて、ゲノミック
配列も同様に、医薬品発見という状況下で有用である。
特定のイソ型のｍＲＮＡ転写を阻害することの方が、そ
の翻訳されたタンパク質を阻害するよりも貴重でありう
る。このことは、スプライス変異体が存在する場合及び
これらの異なるスプライス変異体が異なるプロモータか
ら転写されうる。ＰＤＥＸＶについても言えることであ
る。マウス脳２'，３'−環式ヌクレオチド３'ホスフォ
ジエステラーゼの転写を導く多数のプロモータについて
は先例が存在する（Kurihara T et al., Biochem. Biop
hys. Res. Comm. １７０：１０７４〔１９９０〕）。

【００８７】本発明のもう１つの有用性は、ＤＮＡ配列
が、ひとたびわかった時点で、イソ酵素又はスプライス
変異体を特異的に検出するための検定を設計するのに必
要な情報を与えるという点にある。イソ酵素特異的ＰＣ
Ｒプライマ対は、イソ酵素又はスプライス変異体の特異
的ＤＮＡ配列の知識に完全に依存する検定のただ１つの
例である。かかる検定は、特定の疾病状態に対する各イ
ソ酵素の生物学的関連性及び組織分布にアクセスするべ
くそのイソ酵素のためのｍＲＮＡの検出を可能にする。
これは又、組換え型遺伝子を発現する必要性を軽減する
可能性のある１つの発見である、１つのイソ酵素のみ天
然に発現しうる細胞系統の同定をも可能にする。特異的
ＰＤＥＸＶイソ酵素が特定の疾病状態と関連することが
立証されているならば、本発明は、イソ酵素ｍＲＮＡの
存在を検出するための診断用検定の設計において価値あ
るものとなるだろう。

【００８８】生体標本中のＰＤＥＸＶをコードするヌク
レオチド配列の異常レベルが、核酸の欠失又は突然変異
といったような染色体異常を反映する可能性がある。従
って、ＰＤＥＸＶをコードするヌクレオチド配列は、Ｐ
ＤＥをコードする遺伝子内の欠失、突然変異又は染色体
転座といったような染色体異常を検出するべく診断用に
使用できるプローブのためのベースを提供する。かかる
疾病状態においてＰＤＥＸＶ遺伝子発現が改変される可
能性があり、そうでなければ、ＰＤＥＸＶをコードする
遺伝子の領域内に染色体異常が存在する可能性もある。

【００８９】本発明の１つの変形実施形態においては、
ＰＤＥのコーディング配列は、当該技術分野において周
知の化学的方法を用いて、全体的に又は部分的に合成さ
れ得る（Caruthers MH et al（１９８０）Nuc Acids Re
s Symp Ser２１５−２３，Horn T et al (１９８０）Nu
c Acids Res Symp Ser２２５−２３２参照）。 天然（naturally occurring) 本書で使用される「天然」という語は、自然界で発見さ
れるアミノ酸配列をもつＰＤＥＸＶを意味する。

【００９０】単離された／精製された（isolated/purif
ied) 本書で使用されている「単離された」及び「精製され
た」という語は、その天然の環境からとり出され、天然
に結びつけられていた少なくとも１つのその他の成分か
ら単離又は分離された核酸又はアミノ酸配列のいずれか
である分子のことを意味する。

【００９１】生物活性をもつ（bidogically active） 本書で使用する「生物活性をもつ」という語は、天然に
発生するＰＤＥＸＶの類似の構造的機能（ただし必ずし
も同程度ではない）、及び／又は類似の調節機能（ただ
し必ずしも同程度ではない）及び／又は類似の生化学的
機能（ただし必ずしも同程度ではない）及び／又は免疫
活性（ただし必ずしも同程度ではない）をもつ、組換え
型ＰＤＥＸＶといったような本発明に従ったＰＤＥＸＶ
を意味する。特定的に言うと、本発明のＰＤＥＸＶは、
環式ヌクレオチドを加水分解する能力をもち、これは、
本発明のＰＤＥ酵素の特徴的活性の１つである。

【００９２】免疫活性（immunological activity） 本書で使用する「免疫活性」という語は、天然の、組換
え型の又は合成のＰＤＥＸＶ又はそのあらゆるオリゴペ
プチドがもつ、適切な動物又は細胞の中で特異的免疫応
答を誘発し特異的抗体と結合する能力として定義され
る。 誘導体（derivative） アミノ酸配列に関連して、本書で使用されるような「誘
導体」という語は、ＰＤＥＸＶの化学的修飾を内含す
る。かかる修飾の例としては、アルキル、アシル又はア
ミノ基による水素の交換がある。

【００９３】欠失（deletion） ここで使用される「欠失」という語は、それぞれ単数又
は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が不在である、
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のいずれかにおける
変化として定義される。 挿入／付加（insertion/additon) 本書で使用される「挿入」又は「付加」というのは、天
然に発生するＰＤＥと比べて、それぞれ単数又は複数の
ヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加という結果をもた
らしたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列内の変化であ
る。

【００９４】置換（substitution） 本書で使用する「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチ
ド又はアミノ酸による単数又は複数のヌクレオチド又は
アミノ酸交換の結果としてもたらされる。 相同体（homologue) 本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列に
関する「相同体」という語は、配列の対立遺伝子変形形
態と同義でありうる。

【００９５】特に、ここで用いられる「相同体」という
語は、「同一性」という語と同一視されうる。ここで、
本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列と
の関係における配列相同性は、その他の配列がその配列
に対し少なくとも７５％の同一性をもつか否かを見るた
め配列のうちの任意の単数又は複数の配列ともう１つの
配列を単に「眼球」比較（すなわち厳密な比較）するこ
とによって決定可能である。２つ以上の配列の間の相同
性％を計算できる市販のコンピュータプログラムによっ
て、相対的配列相同性（すなわち配列同一性）を決定す
ることも可能である。かかるコンピュータプログラムの
標準的な例は、ＣＬＵＳＴＡＬである。

【００９６】相同性％は、隣接配列全体にわたり計算さ
れ得る。すなわち１つの配列がもう１つの配列と整列さ
せられ、１つの配列中の各アミノ酸が、一度に一残基の
割合でもう１つの配列の中の対応するアミノ酸と直接比
較される。これは「無間隙」アラインメントと呼ばれ
る。標準的には、かかる無間隙アラインメントは、比較
的短かい数の残基（例えば５０未満の隣接アミノ酸）の
みにわたり実施される。

【００９７】これは非常に単純で一貫性ある方法である
ものの、例えば、そうでなければ同一である配列対にお
いて、１つの挿入又は欠失が後続するアミノ酸残基をア
ラインメント外に置かせかくして包括的アラインメント
が行なわれた時点での相同性の大幅な減少を潜在的に結
果としてもたらすことになるという事実を考慮に入れる
ことができない。従って、大部分の配列比較方法は、全
体的な相同性評点に不当に不利に作用することなく可能
性ある挿入及び欠失を考慮に入れるような最適なアライ
ンメントを産性するように設計されている。このこと
は、局所的相同性を最大限にしようとして配列アライン
メント内に「間隙」を挿入することにより達成される。

【００９８】しかしながら、これらのさらに複雑な方法
は、同じ数の同一のアミノ酸について（２つの比較対象
の配列間におけるより高い関連性を反映する）可能なか
ぎり少ない間隙をもつ配列アラインメントが、数多くの
間隙をもつものに比べ高い評点を達成するように、アラ
インメント内に発生する各間隙に対し「間隙ペナルテ
ィ」を割当てる。１つの間隙の存在に対し相対的に高い
コストを課し、その間隙内のその後の残基各々について
は比較的小さいペナルティを課すような「擬似変換間隙
コスト(Affine gap costs)」が標準的に用いられる。こ
れは、最も一般的に用いられる間隙評点付けシステムで
ある。高い間隙ペナルティは当然のことながら、より少
ない間隙をもつ最適化されたアラインメントを生み出す
ことになる。大部分のアラインメントプログラムは、間
隙ペナルティの修正を可能にする。しかしながら、配列
比較のためにかかるソフトウエアを使用するときには、
デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣ
Ｇ Wisconsin Bestfit パッケージ（以下参照）を使用
するときには、アミノ酸配列に対するデフォルト間隙ペ
ナルティは、１つの間隙について−１２で、各拡張につ
いて−４である。

【００９９】従って最大相同性％の計算は、まず第１
に、間隙ペナルティを考慮に入れる最適なアラインメン
トの生成を必要とする。かかるアラインメントを実施す
るための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Wis
consin Bestfitパッケージ（ウィスコンシン大学、U.S.
A ；Devereux et al., １９８４，核酸研究 １２：３８
７）である。配列比較を行なうことのできるその他のソ
フトウェア例としては、制限的な意味なく、ＢＬＡＳＴ
パッケージ（Ausubel et al,１９９９前掲−第１８章参
照）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al,１９９０，J. Mol.
Biol.,４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ 比較
ツール総合ソフトウエアがある。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳ
ＴＡは両方共オフライン及びオンライン探索のために利
用可能である（Ausubel et al., １９９９ 前掲、ｐ７
−５８〜７−６０）。しかしながら一部の利用分野につ
いては、ＧＣＧ Bestfitプログラムを使用することが好
ましい。

【０１００】最終的相同性％は同一性の形で測定できる
ものの、一部のケースではアラインメントプロセス自体
は標準的に全か無かの対比較に基づいていない。その代
り一般に、化学的類似性又は進展的距離に基づく各々の
対による比較に対して評点を割当てる基準化された類似
性評点マトリクス（scaled similarity score matrix)
が用いられる。一般に使用されるかかるマトリクスの一
例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスつまりＢＬＡ
ＳＴプログラム総合ソフトウェアのためのデフォルトマ
トリクスがある。ＧＣＧ ウィスコンシンプログラムは
一般に、供給されている場合には公開デフォルト値又は
特注記号比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細に
ついてはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパ
ッケージについては公開デフォルト値を用いることが好
ましく、そうでなければその他のソフトウェアの場合、
ＢＬＯＳＵＭ６２といったようなデフォルトマトリクス
を使用することが好ましい。

【０１０１】ひとたびソフトウェアが最適なアライメン
トを生成したならば、相同性％、好ましくは配列同一性
％を計算することが可能である。ソフトウェアは標準的
にこれを配列比較の一部として行ない、数値的結果を生
成する。すでに示したとおり、一部の利用分野について
は、配列相同性（又は同一性）を、例えばデフォルトパ
ラメータを用いて任意の適切な相同性アルゴリズムによ
り決定することができる。

【０１０２】配列データベースの類似性探索における基
本的問題の論述については、Altschul et al（１９９
４）Nature Genetics ６；１１９−１２９を参照のこ
と。一部の利用分野については、ＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムは、パラメータが省略値解釈値にセットされた状態で
利用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、http://www.n
cbi.nih.gov／ＢＬＡＳＴ／blast＿help. html におい
て詳細に記述されている。有利には、ＢＬＡＳＴにより
査定された場合の「実質的相同性」は、少なくとも約
７、好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは
１０以上のＥＸＰＥＣＴ値で整合する配列に匹敵する。
ＢＬＡＳＴ探索におけるＥＸＰＥＣＴについてのデフォ
ルト閾値は通常１０である。

【０１０３】配列同一性を決定するときに万一間隙ペナ
ルティが使用されるならば、好ましくは以下のパラメー
タが用いられる。

【０１０４】

【表２】

【０１０５】２つの配列の間の同一性及び類似性を決定
するためのその他のコンピュータプログラム方法として
はＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al １９
８４Nucleic Acid Research １２；３８７）及びＦＡＳ
ＴＡ（Atschul et al,１９９０ J. Molec Biol ４０３
−４１０）が含まれるが、これらに制限されるわけでは
ない。

【０１０６】ポリペプチド変異体及び誘導体 本発明のアミノ酸配列との関係における「変異体」又は
「誘導体」という語は、結果として得られるアミノ酸配
列がＰＤＥ活性を有し、好ましくは少なくとも配列表に
提示されているポリペプチドと同じ活性を有することを
条件として、該配列から又は配列に対する１つ（又は複
数）のアミノ酸のあらゆる置換、変更、修飾、交換、欠
失又は付加を内含する。

【０１０７】本発明の配列は、本発明における使用のた
めに修正することができる。標準的には、配列のＰＤＥ
活性を維持する修正が行なわれる。修正された配列がＰ
ＤＥ活性を保持することを条件として、例えば１，２，
又は３から１０，２０又は３０個といったアミノ酸置換
を行なうことができる。アミノ酸置換は、例えば、治療
用に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増大させる
ため、天然に発生しない類似体の使用を内含することが
できる。

【０１０８】例えば、以下の表に従って保存的置換を行
なうことができる。第２欄内の同じブロック中、及び好
ましくは第３欄内の同じ行内のアミノ酸を互いに置換す
ることができる。

【０１０９】

【表３】

【０１１０】上述のように、本発明のタンパク質は典型
的には、例えば本書で記述されているような組換え手段
により及び／又は 固相合成といったような当業者にと
って周知の技術を用いて合成手段を使用することによっ
て作られる。かかる配列の変異体及び誘導体には、融合
タンパク質が含まれ、ここで該融合タンパク質は、もう
１つのアミノ酸配列に（直接的又は間接的に）リンクさ
れている本発明のアミノ酸配列を含んで成る。時として
融合タンパク質パートナーと呼ばれるこれらのその他の
アミノ酸配列は標準的に、（例えば本発明のアミノ酸配
列の抽出及び精製を助けるべく）有利な官能性を付与す
ることになる。融合タンパク質パートナーの例として
は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ），６×His,ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活
性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。
融合タンパク質パートナーと本発明のタンパク質配列の
間にタンパク質分解による分割部位を含め、このタンパ
ク質配列の除去を可能にすることも適切でありうる。好
ましくは、融合タンパク質パートナーは、本発明のタン
パク質の機能を妨げない。

【０１１１】ポリヌクレオチド変異体及び誘導体 本発明のヌクレオチド配列との関係における「変異体」
又は「誘導体」という語は、結果として得られるヌクレ
オチド配列がＰＤＥ活性をもつポリペプチドについてコ
ードし、好ましくは少なくとも配列表に提示されている
配列と同じ活性を有することを条件として、該配列から
又は配列に対する１つ（又は複数）の核酸のあらゆる置
換、変更、修飾、交換、欠失又は付加を内含する。

【０１１２】以上で記述されているように、配列相同性
に関しては、本書で配列表に示されている配列に対する
少なくとも７５％，より好ましくは少なくとも８５％、
さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在す
る。より好ましくは、少なくとも９５％，より好ましく
は少なくとも９８％の相同性が存在する。以上で記述し
た通りにヌクレオチド相同性比較を行なうことができ
る。いくつかの応用分野について、好ましい配列比較プ
ログラムは、上述のＧＣＧ Wisconsin Bestfitプログラ
ムである。デフォルト評点マトリクスは、各々の同一ヌ
クレオチドについては１０，各々の不整合について−９
の整合値を有する。デフォルト間隙生成ペナルティは各
ヌクレオチドについて−５０であり、デフォルト間隙拡
張ペナルティは−３である。

【０１１３】本書で使用されている「変異体」、「相同
体」、「フラグメント」及び「誘導体」という語は、配
列の対立遺伝子変形形態を包含する。「変異体（valian
t)」という語は同様に、本書で提示されたヌクレオチド
配列にハイブリダイズすることができる配列に対し相補
的な配列をも包含する。 ハイブリダイゼーション 本書で使用する「ハイブリダイゼーション」という語
は、核酸ストランドが塩基対合を通して相補的ストラン
ドと結合するプロセス（Coombs J（１９９４）Dictiona
ry of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）
ならびに Dieffenbach CW 及び GS Dveksler（１９９
５，ＰＣＲプライマ、実験室マニュアル、Cold Spring
Harbor Press, Plainview NY) により記述されているよ
うなポリメラーゼ連鎖反応技術で実施されるような増幅
プロセスを内含する。

【０１１４】ハイブリダイゼーション条件は Berger 及
び Kimmel（１９８７，分子クローニング技術の手引
き、Methods in Enzymology, 第１５２巻 Academic Pre
ss, San Diego CA)で教示されているように、核酸結合
複合体の融点（Ｔm）に基づくものであり、以下で説明
するような規定の「緊縮性（ストリンジェンシー strin
gency)」を付与する。

【０１１５】ハイブリダイゼーションの緊縮性というの
は、ポリ核酸ハイブリッドが安定している条件のことで
ある。かかる条件は当業者にとっては明白なものであ
る。当業者にとって既知であるように、ハイブリッドの
安定性は、配列相同性の１％の減少毎に約１〜１.５℃
減少するハイブリッドの融点（Ｔm）に反映される。一
般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオンの濃
度及び温度の関数である。標準的には、ハイブリダイゼ
ーション反応は、より高い緊縮性の条件下で行なわれ、
その後に変動する緊縮性の洗浄が行なわれる。

【０１１６】本書で使用されるように、高い緊縮性とい
うのは、６５〜６８℃で１ＭのＮａ ⁺中で安定したハイ
ブリッドを形成するような核酸配列のみのハイブリダイ
ゼーションを可能にする条件のことである。最大の緊縮
性は、標準的には、約Ｔm−５℃（プローブのＴm より
５℃低い）で起こる。

【０１１７】プローブのＴm より約５〜１０℃低い温度
での高い緊縮性。高い緊縮性条件は、例えば、６×ＳＳ
Ｃ，５×Denhardt, １％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、０.１Ｎａ⁺ピロリン酸及び非特異的競合物質と
しての０.１mg／mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む水溶液
中でのハイブリダイゼーションによって提供されうる。

【０１１８】ハイブリダイゼーションに続いて、０.２
〜０.１×ＳＳＣ、０.１％のＳＤＳ中でのハイブリダイ
ゼーション温度での最終洗浄（約３０分）を伴って、数
ステップで高緊縮性洗浄を行なうことができる。中庸つ
まり中間の緊縮性は、標準的にプローブのＴm より約１
０℃〜２０℃低い温度で起こる。

【０１１９】低緊縮性は標準的に、プローブのＴmより
も約２０〜２５℃低い温度で起こる。当業者であれば理
解できるように、類似の又は関係するポリヌクレオチド
配列を同定又は検出するためには中間（又は低）緊縮性
のハイブリダイゼーションを使用できる一方で、同一の
ポリヌクレオチド配列を同定又は検出するためには、最
大緊縮性のハイブリダイゼーションを使用することがで
きる。

【０１２０】中庸の緊縮性というのは、上述の溶液中で
のハイブリダイゼーションと同等であるものの約６０〜
６２℃での条件のことを意味する。この場合、最終洗浄
は、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ中でハイブリダイゼー
ション温度で行なわれる。低緊縮性というのは、上述の
溶液中でのハイブリダイゼーションと同等であるものの
約５０〜５２℃での条件を意味する。この場合、最終洗
浄は、２×ＳＳＣ，０.１％のＳＤＳ中でハイブリダイ
ゼーション温度で行なわれる。

【０１２１】これらの条件は、さまざまな緩衝液、例え
ばホルムアミドベースの緩衝液及び温度を用いて適合及
び重複させることが可能であるということがわかる。De
nhardt溶液及びＳＳＣは、その他の適当なハイブリダイ
ゼーション緩衝液がそうであるように、当業者にとって
は周知のものである（例えば Sambrook, et al., eds.
（１９８９）分子クローニング；実験室マニュアル、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, New York又は、A
usubel, et al., eds.（１９９０）分子生物学における
現行のプロトコル、John Wiley & Sons. Inc. を参照の
こと）。プローブの長さ及びＧＣ含有量も役割を果たす
ことから、最適なハイブリダイゼーション条件を経験的
に決定することが必要である。

【０１２２】本書で提示されているヌクレオチド配列に
対して選択的にハイブリダイズすることができる本発明
のポリヌクレオチドは一般に、本書に提示されている対
応するヌクレオチド配列に対し、少なくとも２０，好ま
しくは少なくとも２５又は３０，例えば少なくとも４
０，６０，１００以上の隣接ヌクレオチドの領域にわた
り、少なくとも７０％，好ましくは少なくとも８０又は
９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％又は９８
％の相同性を有することになる。

【０１２３】「選択的にハイブリダイズすることができ
る（selectively hybridisable）」という語は、プロー
ブとして使用されるポリヌクレオチドが、バックグラウ
ンドよりも著しく高いレベルで本発明の標的ポリヌクレ
オチドがプローブにハイブリダイズすることがわかって
いる条件下で使用されるということを意味する。バック
グウランドハイブリダイゼーションは、例えばスクリー
ニング中のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡライブラリの
中に存在するその他のポリヌクレオチドを原因として発
生する可能性がある。この場合、バックグラウンドは、
標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の１０分の１好
ましくは１００分の１未満である、ライブラリーの非特
異的ＤＮＡ構成員とプローブの間の相互作用により生成
されるシグナルレベルを暗に意味している。相互作用の
強度は、例えば、³²Ｐでプローブを放射性標識づけする
ことによって測定可能である。

【０１２４】好ましい態様においては、本発明は、緊縮
性条件（例えば６５℃及び０.１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ
＝０.１５Ｍ ＮａＣｌ，０.０１５Ｍ Ｎａ₃シトレー
ト；ｐＨ７.０）で本発明のヌクレオチド配列のうちの
任意の単数又は複数のヌクレオチド配列に対しハイブリ
ッド形成できるヌクレオチド配列を網羅する。本発明の
ポリヌクレオチドが２本鎖である場合、２重鎖のうちの
両方のストランドが、個別に又は組合わさった形で本発
明により包含される。ポリヌクレオチドが１本鎖である
場合には、このポリヌクレオチドの相補的配列が同じく
本発明の範囲内に含まれるということを理解すべきであ
る。

【０１２５】本発明の配列に対し１００％の相同性をも
たないものの本発明の範囲内に入るポリヌクレオチド
は、数多くの方法で得ることができる。本書に記述され
ている配列のその他の変異体は、例えば、異なる個体群
からの個体といったような一範囲の個体から作られたＤ
ＮＡライブラリをプローブ探査することによって得るこ
とができる。さらに、その他のウイルス／細菌、又は細
胞相同体、特に哺乳動物細胞（例えばラット、マウス、
ウシ及び霊長類の細胞）の中で見い出される相同体も獲
得することができ、かかる相同体及びそのフラグメント
全般は、本書の配列表中に示された配列に対し選択的に
ハイブリッド形成する能力を有することになる。かかる
配列は、その他の動物種から作られたｃＤＮＡライブラ
リー又はその他の動物種からのゲノミックＤＮＡライブ
ラリーをプローブ探査すること及び、中乃至高緊縮性の
条件下で添付の配列表内の配列の全て又は一部分を含む
プローブでかかるライブラリをプローブ探査することに
よって得ることができる。類似の考慮事項は、本発明の
ポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立
遺伝子変異体の獲得にもあてはまる。

【０１２６】変異体及び菌種／種相同体は同様に、本発
明の配列内の保存されるアミノ酸配列をコードする変異
体及び相同体内の配列をターゲティングするように設計
されたプライマを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることも
できる。保存された配列は、例えば複数の変異体／相同
体からのアミノ酸配列を整列させることによって予測可
能である。配列アラインメントは、当該技術分野におい
て既知のコンピュータソフトウェアを用いて実施可能で
ある。例えば、ＧＣＧ Wisconsin Pile Upプログラムが
広く使用されている。

【０１２７】縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマー
は、単数又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対す
る単一の配列プライマーで配列をクローニングするのに
使用されるものよりも低い緊縮性条件で使用されること
になる。あるいは、かかるポリヌクレオチドは、特徴づ
けされた配列の部位特異的突然変異誘発によって得るこ
ともできる。これは、例えばポリヌクレオチド配列が中
で発現されつつある特定の宿主細胞に対するコドン選好
を最適化するために、サイレントコドン変化が配列にと
って必要とされる場合に有用でありうる。制限酵素認識
部位を導入するか又はポリヌクレオチドによりコードさ
れたポリペプチドの特性又は機能を改変するため、その
他の配列変化が望まれる可能性もある。

【０１２８】本発明のポリヌクレオチドは、例えばＰＣ
Ｒプライマといったプライマ、代替的増幅反応のための
プライマ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来
の手段により顕示用標識で標識づけされたプローブを産
生するために使用することができ、そうでなければ、こ
のポリヌクレオチドベクターへとクローニングすること
もできる。かかるプライマー、プローブ及びその他のフ
ラグメントは、長さが少なくとも１５，好ましくは少な
くとも２０，例えば好ましくは２５，３０又は４０ヌク
レオチドとなり、同様に本書で使用されている本発明の
ポリヌクレオチドという語によって包含されている。

【０１２９】本発明に従ったＤＮＡポリヌクレオチドと
いったポリヌクレオチド及びプローブは、組換え、合成
又は当業者にとって利用可能なあらゆる手段によって産
生可能である。これらは同様に、標準的技術によっても
クローニング可能である。一般に、プライマーは、一度
に一個のヌクレオチドの割合での所望の核酸配列の段階
的製造が関与する合成手段によって産生される。自動化
された技術を用いて、これを達成するための技術は、当
該技術分野において容易に利用可能である。

【０１３０】より長いポリヌクレオチドは一般には、組
換え型手段を用いて、つまり例えばＰＣＲ（ポリメラー
ゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて産生されること
になる。これには、クローニングすることが望まれてい
る脂質ターゲティング配列の１領域をフランキングする
一対のプライマー（例えば約１５〜３０個のヌクレオチ
ドのもの）を作る段階、動物又はヒトの細胞から得たｍ
ＲＮＡ又はｃＤＮＡとプライマを接触させる段階、所望
の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応
を実施する段階、増幅されたフラグメントを単離する段
階（例えばアガロースゲル上で反応混合物を精製するこ
とによる）及び増幅されたＤＮＡを回収する段階が関与
することになる。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適
切なクローニングベクターへとクローニングされうるよ
うな形で、適切な制限酵素認識部位を含むように設計す
ることができる。

【０１３１】調節配列 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、例えば選択
された宿主細胞によるコーディング配列の発現を提供す
る能力をもつ調節配列に対し操作可能な形にリンクされ
る。一例を挙げると、本発明は、かかる調節配列に操作
可能な形にリンクされた本発明のポリヌクレオチドを含
むベクターを網羅する。すなわち、このベクターは発現
ベクターである。

【０１３２】「操作可能な形にリンクされた（operably
linked)」という語は、記述された成分が、その意図さ
れた要領で機能できるような関係にある並置のことを意
味する。コーディング配列に対し「操作可能な形にリン
クされた」調節配列は、コーディング配列の発現が制御
配列と相容性ある条件下で達成されるような形で連結さ
れる。

【０１３３】「調節配列」という語は、プロモーター及
びエンハンサ及びその他の発現調節信号を内含する。
「プロモーター」という語は、当該技術分野の通常の意
味合い、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位の意味合い
で用いられる。本発明のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドの増強された発現は同様に、選ばれて、発
現宿主からの問題のタンパク質の発現そして望まれる場
合には分泌のレベルを増大するため及び／又は本発明の
ポリペプチドの発現の誘発可能な制御を提供するために
役立つ。例えばプロモーター、分泌リーダー及びターミ
ネーター領域といった非相同性調節領域を選択すること
によっても達成可能である。

【０１３４】好ましくは、本発明のヌクレオチド配列
は、少なくとも１つのプロモーターに対し操作可能な形
にリンクされ得る。本発明のポリペプチドをコードする
遺伝子に対し天然プロモーターとは別に、本発明のポリ
ペプチドの発現を導くためにその他のプロモータを使用
することかできる。プロモーターは、所望の発現宿主内
での本発明のポリペプチドの発現を導くその効率を考え
て選択することができる。

【０１３５】もう１つの実施形態においては、本発明の
所望のポリペプチドの発現を導くために構成性プロモー
ターを選択することができる。かかる発現構成体は、誘
発用基質を含有する培地上で発現宿主を培養する必要性
を回避することから、付加的な利点を提供することがで
きる。真菌発現宿主の中で使用するために好まれる強い
構成性及び／又は誘発性プロモーターの例としては、キ
シラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンタ
ーゼ、サブユニット９（oliC）、トリオースリン酸イソ
メラーゼ（tpi)、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ
Ａ）、α−アミラーゼ（amy)、アミログルコシダーゼ
（作用物質−glaＡ遺伝子からのもの）、アセタミダー
ゼ（amｄＳ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（gpd）プロモーターのために真菌遺伝子
から得ることのできるものがある。

【０１３６】強い酵母プロモーターの例としては、アル
コールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスフォグ
リセレートキナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼ
のために遺伝子から得ることのできるものがある。強い
細菌プロモーターの例としては、α−アミラーゼ及びＳ
Ｐ０２プロモーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子
からのプロモーターがある。

【０１３７】発現構成体の誘発可能な調節を改善するた
めに、ハイブリッドプロモータも同様に使用可能であ
る。プロモーターは、さらに、適切な宿主内での発現を
確保し或いは又それを増大させるための特長を内含する
ことができる。例えば、これらの特長は、プリブナウ配
列又はＴＡＴＡボックスといったような保存された領域
でありうる。プロモーターはさらに、本発明のヌクレオ
チド配列の発現レベルに影響を及ぼす（例えばそれを維
持する、増強する、低下させる）ためにその他の配列を
含むことさえできる。例えば、適切なその他の配列に
は、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンが含まれ
る。その他の配列には、誘発可能な要素、例えば温度、
化学物質、光又は応力により誘発可能な要素が含まれ
る。同様に、転写又は翻訳を増強するのに適切な要素も
存在していてよい。後者の要素の例としては、ＴＭＶ
５'シグナル配列がある（Sleat Gene２１７〔１９８
７〕２１７−２２５；及び Dawson Plant Mol. Biol.２
３〔１９９３〕９７を参照のこと） 分泌 往々にして、本発明のポリペプチドは、このポリペプチ
ドをより容易に回収できる培地内へと発現宿主から分泌
されることが望ましい。本発明に従うと、分泌リーダー
配列は、所望の発現宿主に基づいて選択可能である。本
発明の状況下ではハイブリッドシグナル配列も同様に使
用することができる。

【０１３８】非相同な分泌リーダー配列の標準的な例は
真菌アミログリコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（glaＡ−例
えば Aspergillus からの１８個及び２４個の両方のア
ミノ酸バージョン）、ａ−因子遺伝子（酵母、例えば S
accharomyces 及び Kluyveromyces）又はα−アミラー
ゼ遺伝子（Bacillus) に由来するものである。 構成体（constracts) 「接合体（conjugate)」、「カセット」及び「ハイブリ
ッド」といった語と同義である「構成体」という語に
は、直接的又は間接的にプロモーターに付着された本発
明に従ったヌクレオチド配列が含まれる。間接的付着の
例は、本発明のヌクレオチド配列とプロモータの中間
に、ＡＤＨイントロン又はＳｈ１イントロンといったよ
うなイントロン配列といった適切なスペーサ基を提供す
ることである。このことは、直接的又は間接的付着を内
含する本発明との関係における「融合した」という語に
ついても言えることである。各々の場合において、これ
らの語は、両方共その天然の環境にあるときの及び野生
型遺伝子プロモーターと通常会合させられているタンパ
ク質についてコードするヌクレオチド配列の天然の組合
せを網羅するものではない。

【０１３９】構成体は、さらに、例えば細菌、好ましく
は Bacillus subtilisといったバシラス属又はそれが移
入された植物の中で、遺伝子構成体の選択を可能にする
マーカーを含有又は発現することさえできる。例えば
（特に植物のための）マンノース−６−リン酸イソメラ
ーゼをコードするもの又は抗生物質耐性例えばＧ４１
８，ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン
及びゲンタマイシンに対する耐性を提供するマーカーと
いったように、使用可能なさまざまなマーカーが存在す
る。

【０１４０】好ましくは、本発明の構成体は、プロモー
タに操作可能な形にリンクされた本発明のヌクレオチド
配列を少なくとも含む。 ベクター 「ベクター」という語は、発現ベクター及び形質転換ベ
クター及びシャトルベクターを内含する。

【０１４１】「発現ベクター」という語は、in vivo 又
は in vitro 発現の能力をもつ構成体を意味する。「形
質転換ベクター」という語は、その種のものであっても
異なる種のものであってもよいもう１つの実体へと１つ
の実体から移入される能力をもつ構成体を意味する。こ
の構成体が、E. coli プラスミドから細菌例えばバシラ
ス属の細菌へといったように、１つの種からもう１つの
種へと移入される能力をもつ場合には、形質転換ベクタ
ーは、時として「シャトルベクター」と呼ばれる。それ
は、アグロバクテリウムに対する E.coli プラスミドか
ら植物へと移送される能力をもつ構成体でさえあり得
る。

【０１４２】本発明のベクターは、本発明のポリペプチ
ドの発現を提供するため、以下で記述する通り、適切な
宿主細胞内に形質転換することができる。かくして、さ
らなる１態様においては、本発明は、ポリペプチドをコ
ードするコーディング配列のベクターによる発現を提供
するための条件下で上述のとおりに発現ベクターを用い
て形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を
培養する段階及び発現されたポリペプチドを回収する段
階を含んで成る本発明に従ったポリペプチドを調製する
方法を提供する。

【０１４３】ベクターは、例えば、複製起点が備わった
プラスミド、ウイルス又はファージベクター、任意には
前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモータ、そし
て任意にはプロモータの調節遺伝子でありうる。本発明
のベクターは、単数又は複数の選択可能なマーカー遺伝
子を含むことができる。工業用微生物のための最も適切
な選択系は、宿主生体内での突然変異を必要としない一
群の選択マーカーによって形成されるものである。真菌
（fungal）選択マーカーの例としては、アセタミダーゼ
（amd Ｓ），ＡＴＰシンターゼ、サブユニット９（oli
Ｃ）、オロチジン−５'−リン酸−デカルボキシラーゼ
（pvrＡ）、フレオマイシン及びベノミル耐性（benＡ）
のための遺伝子がある。非真菌選択マーカーの例として
は、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これは同様に酵母中で使
用できるが糸状真菌内では使用されない、アンピシリン
耐性遺伝子（E.coli), ネオマイシン耐性遺伝子（Baci
llus）及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードす
る E.coli uidＡ遺伝子がある。

【０１４４】ベクターは、例えばＲＮＡの産生のため、
in vitro で使用することもできるし、或いは又宿主細
胞をトランスフェクション又は形質転換するために使用
することもできる。かくして、本発明のポリヌクレオチ
ドは、例えばクローニング又は発現ベクターといったよ
うな組換え型ベクター（標準的には複製可能なベクタ
ー）内に取り込まれ得る。このベクターは、相容性ある
宿主細胞内で核酸を複製するために使用できる。かくし
て、さらなる実施形態においては、本発明は、複製可能
なベクター内に本発明のポリヌクレオチドを導入し、相
容性ある宿主細胞内にベクターを導入し、ベクターの複
製をもたらす条件下で宿主細胞を生成させることによっ
て、本発明のポリヌクレオチドを作る方法を提供する。
ベクターは、宿主細胞から回収可能である。適切な宿主
細胞については以下で、発現ベクターに関連して記述さ
れている。

【０１４５】本発明は同様に、ホスホジエステラーゼ活
性を変調させかくして環式ヌクレオチドレベルを変調さ
せることになるＰＤＥＸＶの阻害物質及びアンタゴニス
トの同定のためのスクリーニング方法における、ＰＤＥ
ＸＶ又はその変異体、相同性、フラグメント又は誘導体
を発現する遺伝子操作された宿主細胞の使用にも関す
る。かかる遺伝子操作された宿主細胞は、ＰＤＥＸＶ活
性を変調させることのできるペプチドライブラリ又は有
機分子をスクリーニングするために使用可能である。抗
体、ペプチド又は小さい有機分子といったようＰＤＥＸ
Ｖのアンタゴニスト及び阻害物質は、例えばＰＤＥＸＶ
と関連した疾病の治療のための薬学組成物のベースを提
供することになる。かかる阻害物質又はアンタゴニスト
は、単独で投与されてもよいし或いは又、かかる疾病の
治療のためのその他の療法と組合わせた形で投与するこ
ともできる。

【０１４６】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶタンパク質の
in vivo 又は in vitro 産生のため、又はＰＤＥＸＶ
の発現又は活性に影響を及ぼすことのできる作用物質に
ついてスクリーニングするための、ＰＤＥＸＶはその変
異体、相同体、フラグメント又は誘導体をコードするポ
リヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び宿主細胞に
も関する。

【０１４７】組織 本書で使用される「組織」という語には、組織自体と器
官が含まれる。 宿主細胞 本発明との関係における「宿主細胞」という語には、宿
主細胞内に存在するとき本発明に従ったヌクレオチド配
列の発現をプロモータが可能にする、本発明に従った組
換え型タンパク質についてコードするヌクレオチド配列
を含み得るあらゆる細胞及び／又はそれから得られた産
物が内含される。

【０１４８】かくして、本発明のさらなる実施形態は、
本発明のポリヌクレオチドで形質転換されたか又はトラ
ンスフェクションされた宿主細胞を提供する。好ましく
は、前記ポリヌクレオチドは、その複製及び発現のため
ベクター内で運ばれている。細胞は、このベクターと相
容性をもつように選択されることになり、例えば原核生
物（例えば細菌）、真菌、酵母又は植物の細胞でありう
る。

【０１４９】異種遺伝子発現のための宿主としては、グ
ラム陰性菌 E. coliが広く用いられている。しかしなが
ら、大量の異種タンパク質が、細胞内部に蓄積する傾向
をもつ。E. coli 細胞内タンパク質の塊からの望ましい
タンパク質のその後の精製は、時として困難であり得
る。E. coli とは対照的に、バシラス属からの細菌は、
培地内のタンパク質を分泌するその能力のため異種宿主
として非常に適している。宿主として適しているその他
の細菌は、ストレプトマイセス属及びシェードモナス属
からのものである。

【０１５０】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの性質及び／又は発現されたタンパク質のさ
らなる処理の望ましさに応じて、酵母又はその他の真菌
といったような真核性宿主が好まれるかもしれない。一
般に、操作が比較的容易であることから、真菌細胞より
も酵母細胞の方が好まれる。しかしながら、一部のタン
パク質は、酵母細胞からほとんど分泌されないか又は、
場合によっては適切に処理されない（例えば酵母中の高
グリコシル化）。これらの場合では、異なる真菌宿主生
体を選択すべきである。

【０１５１】本発明の範囲内での適切な発現宿主の例と
しては、Aspergillus 種（例えばＥＰ−Ａ−０１８４４
３８及びＥＰ−Ａ−０２８４６０３に記述されているも
の）及び Trichoderma種といったような真菌； Bacillu
s 種（例えばＥＰ−Ａ−０１３４０４８ 及びＥＰ−Ａ
−０２５３４５５に記述されているもの）、Streptomyc
es種及び Pseudomonas種といったような細菌；及び Klu
yveromyces種（例えばＥＰ−Ａ−００９６４３０及びＥ
Ｐ−Ａ−０３０１６７０に記述されているもの）及び S
accharomyces種といった酵母がある。一例を挙げると、
標準的な発現宿主は、Aspergillus niger, Aspergillus
niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awa
mori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans,
Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus
subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloli
quefaciens, Kluyveromyces Lactis 及び Saccharomyce
scerevisiae の中から選ぶことができる。

【０１５２】酵母、真菌及び植物宿主細胞といったよう
な適切な宿主細胞の使用は、本発明の組換え型発現産物
に対して最適な生物活性を付与するのに必要となる可能
性があるような翻訳後の修飾（例えばミリストイル化、
グリコシル化、切断化（truncation）、lapidation及び
チロシン、セリン又はトレニオン、リン酸化）を提供す
ることができる。

【０１５３】生体（organism） 本発明との関係における「生体」という語には、生体内
に存在するとき本発明に従ったヌクレオチド配列の発現
をプロモータが可能にする、本発明に従った組換え型タ
ンパク質についてコードするヌクレオチド配列を含み得
るあらゆる生体及び／又はそれから得られた産物が内含
される。

【０１５４】本発明との関係における「トランスジェニ
ック生体」という語には、生体内の本発明に従ったヌク
レオチド配列の発現をプロモータが可能にする、本発明
に従ったタンパク質についてコードするヌクレオチド配
列を含むあらゆる生体及び／又はそれから得られた産物
が内含される。好ましくは、そのヌクレオチド配列は生
体のゲノム内に取り込まれる。

【０１５５】「トランスジェニック生体」という語は、
同様にその天然の環境内にあるその未変性プロモータの
制御下にあるとき、その天然の環境内の本発明に従った
未変性ヌクレオチドコーディング配列を網羅しない。さ
らに、本発明は、それがその天然の環境内にあるとき及
びそれが同じくその天然の環境内にあるその天然ヌクレ
オチドコーディング配列によって発現されたとき及び、
そのヌクレオチド配列が同じくその天然の環境内にある
その天然プロモータの制御下にあるとき、本発明に従っ
た天然タンパク質を網羅しない。

【０１５６】従って、本発明のトランスジェニック生体
には、本発明に従ったアミノ酸配列についてコードする
ヌクレオチド配列，本発明に従った構成体（そして組合
せを含む）、本発明に従ったベクター、本発明に従った
プラスミド、本発明に従った細胞、本発明に従った組織
又はその産物のうちのいずれか１つ又は組合せを含む生
体が内含される。形質転換された細胞又は生体は、その
細胞又は生体から容易に回収可能なものとなる所望の化
合物を受容可能な量だけ調製することができる。

【０１５７】宿主細胞／宿主生体の形質転換 前述のとおり、宿主生体は、原核又は真核生体でありう
る。適切な原核宿主の例としては、E. coli 及び Bacil
lus subtilisが含まれる。原核宿主の形質転換について
の教示は、当該技術分野において充分に証明されてい
る。例えば Sambrook et al（分子クローニング；実験
室マニュアル、第２版、１９８９，Cold Spring Harbor
Laboratory Press)及び Ausubel et al., 分子生物学
における現行プロトコル（１９９５），John Wiley & S
ons, Inc. を参照のこと。

【０１５８】原核宿主が使用される場合には、例えばイ
ントロンの除去によって、形質転換の前にヌクレオチド
配列を適切に修正する必要があるかもしれない。もう１
つの実施形態においては、遺伝子導入生体は酵素であり
うる。この点で、酵素は同じく、非相同な遺伝子の発現
のためのビヒクルとして広く使用することもできた。Sa
ccharomyces cerevisiaeは、異種遺伝子発現のためのそ
の使用を含めて、工業的使用の長い歴史をもっている。
Saccharomyces cerevisiae内での異種遺伝子の発現は、
Goodey et al（１９８７，酵母バイオテクノロジ DR Be
rry et al, eds, pp４０１−４２９，Allen and Unwin,
London）及び King et al（１９８９，酵母の分子及び
細胞生物学，EF Walton and GT Yarronton, eds, pp １
０７−１３３，Blackie, Glasgow)。によって再考され
ている。

【０１５９】いくつかの理由により、Saccharomyces ce
revisiaeは、異種遺伝子発現に充分適している。まず最
初に、それはヒトにとって非病原性であり、或る種の内
毒素を産生する能力をもたない。第２に、それはさまざ
まな目的のための何百年にもわたる商業的開発の後安全
な使用の長い歴史をもつ。こうしてこれは公共に広く受
入れられることになった。第３に、この生体に挙げられ
た広範な商業的使用と研究の結果、Saccharomyces cere
visiaeの大規模な発酵特性ならびに遺伝学及び生理学に
ついての豊富な知識をもたらした。

【０１６０】Saccharomyces cerevisiae内の異種遺伝子
発現及び遺伝子産物の分泌の原理についての再考は、E
Hinchcliffe E Kenny（１９９３，「非相同性遺伝子の
発現のためのビヒクルとしての酵母」，Yeasts, 第５
巻、Anthony H Rose 及び J Stuart Harrison, eds,第
２版．Academic Press Ltd.）により示されている。そ
の維持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とする組込
みベクター及び自律的複製プラスミドベクターを含め、
いくつかのタイプの酵母ベクターが利用可能である。

【０１６１】トランスジェニック Saccharomycesを調製
するため、酵母内での発現のために設計された構成体の
中に本発明のヌクレオチド配列を挿入することによっ
て、発現構成体が調製される。異種発現のために使用さ
れるいくつかのタイプの構成体が開発されてきた。これ
らの構成体は、本発明のヌクレオチド配列に融合された
酵母内で活性なプロモーター、通常はＧＡＬ１プロモー
ターといったような酵母由来のプロモーターを含有す
る。通常、ＳＵＣ２シグナル・ペプチドをコードする配
列といったような酵母由来のシグナル配列が用いられ
る。酵母内で活性なターミネーターが発現系を終結す
る。

【０１６２】酵母の形質転換のためには、いくつかの形
質転換プロトコルが開発されてきた。例えば、本発明に
従ったトランスジェニック Saccharomycesは、Hinnen e
t al（１９７８，米国国立科学アカデミー会報、７５，
１９２９）； Beggs. JD（１９７８，Nature, London,
２７５，１０４）；及び Ito, H et al（１９８３，JBa
cteriology１５３，１６３−１６８）の教示に従って調
製することができる。

【０１６３】形質転換された酵母細胞は、さまざまな選
択的マーカーを用いて選択される。形質転換のために使
用されるマーカーの中には、ＬＥＵ２，ＨＩＳ４及びＴ
ＲＰ１といった一定数の栄養要求性マーカー及びアミノ
グリコシド抗生物質マーカー例えばＧ４１８といったよ
うな優性抗生物質耐性マーカーが存在する。もう１つの
宿主生体は、植物である。遺伝子的に修飾された植物の
構築における基本的原理は、挿入された遺伝物質の安定
した維持を得るように植物ゲノム内に遺伝情報を挿入す
ることにある。

【０１６４】遺伝情報を挿入するためにはいくつかの技
術が存在するが、２つの主要な原理は、遺伝情報の直接
的導入とベクター系の使用による遺伝情報の導入であ
る。一般的技術の再考は、Potrykus (Annu Rev Plant P
hysiol Plant Mol Biol〔１９９１〕４２：２０５−２
２５）及び Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech,１
９９４年３月１４日；１７−２７）による論文の中に見
い出すことができる。植物形質転換に関するさらなる教
示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５中に見い出すことがで
きる。

【０１６５】かくして、本発明は同様に、添付の配列表
中に示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同
体、変異体又はフラグメントを用いて宿主細胞を形質転
換する方法をも提供する。ＰＤＥヌクレオチドコーディ
ング配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からの
コードされたタンパク質の発現及び回収に適した条件の
下で培養することができる。組換え型細胞により産生さ
れたタンパク質は、使用される配列及び／又はベクター
に応じて細胞内に含有されていてもよいし又は分泌され
てもよい。当業者であれば理解できるように、ＰＤＥコ
ーディング配列を含有する発現ベクターは、特定の原核
又は真核細胞膜を通してのＰＤＥコーディング配列の分
泌を導くシグナル配列を伴って設計することができる。
その他の組換え型構成も、可溶性タンパク質の精製を容
易にすることなるポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列に対するＰＤＥコーディング配列の結合を行なう
ことができる（Kroll,DJ et al（１９９３）ＤＮＡ Cel
l Biol １２：４４１−５３，同様に融合タンパク質を
含有するベクターについての以上の論述も参照のこ
と）。

【０１６６】ポリペプチドの産生 本発明に従うと、本発明のポリペプチドの産生は、例え
ば、従来の栄養発酵培地の中で本発明の単数又は複数の
ポリヌクレオチドで形質転換された微生物発現宿主を培
養することによって行なうことができる。適切な培地の
選択は、発現宿主の選択及び／又は発現構成体の調節必
要条件に基づくことができる。かかる培地は、当業者に
とって周知のものである。培地は、望まれる場合には、
その他の潜在的汚染性をもつ微生物に対して形質転換さ
れた発現宿主を有利にする付加的な成分を含有していて
よい。

【０１６７】かくして、本発明は同様に、ＰＤＥＸＶ活
性をもつポリペプチドを産生するための方法において、
ａ）添付の配列表に示されているヌクレオチド配列又は
その誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで、宿主
細胞を形質転換する段階及びｂ）前記ポリペプチドの発
現に適した条件下で形質転換された宿主細胞を培養する
段階を含む方法をも提供している。

【０１６８】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶ活性をもつポ
リペプチドを産生する方法において、ａ）添付の配列表
に示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、
変異体又はフラグメントで形質転換された宿主細胞を前
記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する段階、
及びｂ）宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する
段階を含んで成る方法を提供する。

【０１６９】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶ活性をもつポ
リペプチドを産生する方法において、ａ）添付の配列表
に示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、
変異体又はフラグメントで宿主細胞を形質転換する段
階、ｂ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、形
質転換された宿主細胞を培養する段階；及び ｃ）宿主
細胞培養から前記ポリペプチドを回収する段階を含んで
成る方法をも提供する。

【０１７０】リボザイム リボザイムは、ＲＮＡの特異的解裂を触媒する能力をも
つ酵素ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズム
には、相補性標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列
特異的ハイブリダイゼーションとそれに続く内ヌクレオ
チド鎖分解性解裂が関与する。本発明の範囲内に入るの
は、ＰＤＥＲＮＡ配列の内ヌクレオチド鎖分解性解裂を
特異的かつ効率良く触媒する、操作されたハンマーヘッ
ドモチーフのリボザイム分子である。

【０１７１】任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザ
イム解裂部位は、最初は、後続する配列ＧＵＡ，ＧＵＵ
及びＧＵＣを内含するリボザイム分割部位のための標的
分子を走査することによって同定される。ひとたび同定
されると、分割部位を含有する標的遺伝子の領域に対応
する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短かいＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチド配列を操作不能にする可
能性のある二次的な構造的特長について評価することが
できる。候補標的の適切性も同様に、リボヌクレアーゼ
防御検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドでのハイブ
リダイゼーションに対するアクセス可能性をテストする
ことによって評価可能である。

【０１７２】本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分
子及びリボザイムは両方共、ＲＮＡ分子の合成のための
当該技術分野において既知のあらゆる方法により調製可
能である。これらには、固相ホスホアミダイト化学合成
といったような、オリゴヌクレオチドを化学的に合成す
るための技術が含まれる。代替的には、アンチセンスＲ
ＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の in vitro 又は in
vivo転写により、ＲＮＡ分子を生成することができる。
かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６といったような適
切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いてさまざまな
ベクター内に取込むことができる。代替的には、アンチ
センスＲＮＡを構成的に又は誘発的に合成するアンチセ
ンスｃＤＮＡ構成体を、細胞系統、細胞又は組織内に導
入することが可能である。

【０１７３】検出 ＰＤＥポリヌクレオチド・コーディング配列の存在は、
添付の配列表内に提示されている配列のプローブ、部分
又はフラグメントを用いたＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリダイゼーション又は増幅により検出でき
る。核酸増幅ベースの検定には、ＰＤＥ ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを含有する形質転換体を検出するためＰＤＥ コー
ディング配列に基づきオリゴヌクレオチド又はオリゴマ
を使用することが関与している。本書で使用される「オ
リゴヌクレオチド」又は「オリゴマ」というのは、プロ
ーブ又は amplimer として使用可能な、１０個以上約６
０個以下、好ましくは約１５〜３０個、より好ましくは
約２０〜２５個のヌクレオチドから成る核酸配列を意味
すると考えられる。好ましくは、オリゴヌクレオチド
は、添付の配列表に示されたヌクレオチド配列の３’領
域から誘導される。

【０１７４】タンパク質に特異的なポリクローナル又は
モノクローナルのいずれかの抗体を使用することといっ
たような、ＰＤＥポリペプチドの発現を検出し測定する
ためのさまざまなプロトコルが当該技術分野において知
られている。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）及び螢光活性
細胞選別法（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＰＤＥ ポリペプ
チド上の２つの非干渉性エピトープに対する反応性をも
つモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナ
ルベースの免疫検定法が好まれるか、競合結合検定法を
利用することもできる。これらの及びその他の検定法
は、なかでも Hampton R et al（１９９０，血清学的方
法、実験室マニュアル APS Press, St Paul MN）及び M
addox DE et al（１９８３，J Exp Med １５８：１２１
１）の中で記述されている。

【０１７５】当業者にはきわめてさまざまな標識及び接
合技術が知られており、さまざまな核酸及びアミノ酸検
定においてこれらを使用することが可能である。ＰＤＥ
ポリヌクレオチド配列を検出するための標識づけされた
ハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブを産生する
ための手段には、標識づけされたヌクレオチドを用いた
オリゴ標識づけ、ニック翻訳、末端標識づけ又はＰＣＲ
増幅が含まれる。代替的には、ＰＤＥ，コーディング配
列又はその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの産生のた
めのベクターへとクローニングすることができる。かか
るベクターは当該技術分野において既知のもので、市販
されており、Ｔ７，Ｔ３又はＳＰ６といったような適切
なＲＮＡポリメラーゼ及び標識づけされたヌクレオチド
を付加することによりＲＮＡプローブを in vitro で合
成するために使用することができる。

【０１７６】Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Pr
omega (Madison, WI), 及び US Biochemical Corp (Cle
veland, OH)といったような数多くの会社が、これらの
手順のための商業用キット及びプロトコルを供給してい
る。適切なリポータ分子又は標識には、これらの放射性
核種、酵素、螢光、化学発光又は色素産生作用物質なら
びに基質、補因子、阻害物質、磁気粒子などが含まれ
る。かかる標識の使用を教示する特許としては、ＵＳ−
Ａ−３８１７８３７；ＵＳ−Ａ−３８５０７５２；ＵＳ
−Ａ−３９３９３５０；ＵＳ−Ａ−３９９６３４５；Ｕ
Ｓ−Ａ−４２７７４３７；ＵＳ−Ａ−４２７５１４９及
びＵＳ−Ａ−４３６６２４１がある。同様に、組換え型
免疫グロブリンを、ＵＳ−Ａ−４８１６５６７に示され
ている通りに産生することもできる。

【０１７７】特定の分子の発現を定量化するための付加
的な方法としては、ヌクレオチドを放射性標識づけする
こと（Melby PC et al １９９３ J Immunol Methods １
５９：２３５−４４）又はビオチニル化すること（Dupl
aa C et al １９９３ Anal Biochem ２２９−３６），
制御核酸の同時増幅及び実験結果を上で補間する標準曲
線が含まれる。多数の標本の定量化は、問題のオリゴマ
がさまざまな希釈度で提示され、分光測光又は熱量計応
答が迅速な定量化を与えるＥＬＩＳＡ形式で検定を行な
うことによりスピードアップすることができる。

【０１７８】マーカー遺伝子発現の存在／不在は、問題
の遺伝子が同様に存在することを示唆しているものの、
その存在及び発現は確認されるべきである。例えば、マ
ーカー遺伝子配列内にＰＤＥコーディング配列が挿入さ
れる場合、ＰＤＥコーディング領域を含む組換え型細胞
を、マーカー遺伝子機能の不在により同定することがで
きる。代替的には、マーカー遺伝子を、単一プロモータ
の制御下でＰＤＥコーディング配列と縦列に置くことが
できる。誘発又は選択に応答したマーカー遺伝子の発現
は、通常、ＰＤＥの発現を表わしている。

【０１７９】あるいは、ＰＤＥのためのコーディング配
列を含みＰＤＥコーディング領域を発現する宿主細胞
は、当業者にとっては既知のさまざまな手順によって同
定することができる。これらの手順には、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び核酸
又はタンパク質の検出及び／又は定量化のための膜ベー
ス、溶液ベース又はチップベースの技術を含むタンパク
質生物検定又は免疫検定技術があるが、これらに制限さ
れるわけではない。

【０１８０】抗体 本発明のアミノ酸配列は同様に（例えば標準的な技術を
使用することなどによって）アミノ酸配列に対する抗体
を生成するために使用することもできる。当該技術分野
において周知の手順を、ＰＤＥＸＶポリペプチドに対す
る抗体の産生のために使用することができる。かかる抗
体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一
本鎖、Fab フラグメント及び Fab発現ライブラリによっ
て産生されたフラグメントが含まれるが、これらに制限
されるわけではない。中和抗体すなわちＰＤＥポリペプ
チドの生物活性を阻害する抗体が、診断及び治療のため
に特に好まれる。

【０１８１】抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラ
ット、マウスなどを内含するさまざまな宿主を、免疫原
特性を保持するオリゴペプチド又は阻害物質又はそのい
ずれかの部分、変異体、相同体、フラグメント又は誘導
体を用いた注射により免疫することができる。宿主の種
に応じて、免疫応答を増大させるべくさまざまなアジュ
バントを使用することができる。かかるアジュバントに
は、水酸化アルミニウムといったようなフロイントのミ
ネラルゲル及び、イソレシチン、pluronicポリオール、
ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホ
ール・リンペット・ヘモシアニン及びジニトロフェノー
ルといったような表面活性物質が含まれるが、これらに
制限されるわけではない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette−
Guerin）及びCorynebacterium parvum が利用すること
のできる潜在的に有用なヒトアジュバンドである。

【０１８２】アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体
は、培養中の連続細胞系統による抗体分子の産生を提供
するどのような技術を用いてでも調製することができ
る。これらには、Kochler 及び Milstein（１９７５ Na
ture ２５６：４９５−４９７）によって当初記述され
たハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術
（Kosbor et al（１９８３）Immunol Today ４：７２；
Cote et al（１９８３）Proc Natl Acad Sci８０：２
０２６−２０３０）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Co
le et al（１９８５）モノクローナル抗体とガン療法 A
lan R Liss Inc,pp７７−９６）が含まれるが、これら
に制限されるわけではない。さらに「キメラ抗体」の産
生のために開発された技術、すなわち適切な抗原特異性
及び生物活性をもつ分子を得るためのヒト抗体遺伝子に
対するマウス抗体遺伝子のスプライシングも使用するこ
とができる（Morrison et al（１９８４）Proc Natl Ac
ad Sci８１：６８５１−６８５５；Neuberger et al
（１９８４）Nature３１２：６０４−６０８；Takeda e
t al（１９８５）Nature３１４：４５２−４５４）。代
替的には、１本鎖抗体の産生のために記述された技術
（ＵＳ−Ａ−４９４６７７９）を、阻害物質特異的１本
鎖抗体を産生するために適合させることもできる。

【０１８３】抗体は、リンパ球個体群内での in vivo産
生を誘発することによってか又は Orlandi et al（１９
８９，Proc Natl Acad Sci８６：３８３３−３８３７）
及びWinter G and Milstein C（１９９１；Nature３４
９：２９３−２９９）の中で開示されているように高い
特異性をもつ結合用試薬をパネル又は組換え型免疫グロ
ブリンライブラリをスクリーニングすることによっても
産生可能である。

【０１８４】ＰＤＥＸＶのための特異的結合部位を含有
する抗体フラグメントも同様に生成可能である。例え
ば、かかるフラグメントとしては、抗体分子のペプシン
消化により産生可能であるＦ(ab')₂フラグメント、及び
Ｆ(ab')₂フラグメントのジスルフィド架橋を減少させる
ことによって生成可能であるＦab フラグメントが含ま
れるが、これらに制限されるわけではない。代替的に
は、望ましい特異性をもつモノクローナルＦab フラグ
メントの迅速かつ容易な同定を可能にするようにFab発
現ライブラリを構築することができる（Huse WD et al
(１９８９）Science２５６：１２７５−１２８１）。

【０１８５】１つの代替的な技術には、例えばファージ
がきわめてさまざまな相補性決定領域（ＣＤＲ）を伴う
その外皮の表面上で scＦ_V フラグメントを発現するよ
うなファージ表示ライブラリをスクリーニングすること
が関与している。この技術は、当該技術分野において周
知のものである。ＰＤＥＸＶ特異的抗体は、ＰＤＥＸＶ
ポリペプチドの発現に付随する健康状態及び疾病の診断
にとって有用である。立証済みの特異性をもつポリクロ
ーナル又はモノクローナルのいずれかの抗体を用いた競
合結合又は免疫ラジオメトリック測定法のためのさまざ
まなプロトコルが当該技術分野において周知である。か
かる免疫検定には標準的にＰＤＥＸＶポリペプチドとそ
の特異的抗体（又は類似のＰＤＥＸＶ結合分子）の間の
複合体形成及び複合体形成の測定が関与する。特異的Ｐ
ＤＥＸＶタンパク質上の２つの非干渉性エピトープに対
する反応性をもつモノクローナル抗体を利用した２部位
でモノクローナルベースの免疫検定が好まれるが、競合
結合検定も同様に利用することができる。これらの検定
は、Maddox DE et al.（１９８３．J Exp Med １５８；
１２１１）の中で記述されている。

【０１８６】抗−ＰＤＥＸＶ抗体は、炎症、造血細胞の
増幅及びＨＩＶ感染に付随する健康状態又はＰＤＥＸＶ
の異常な発現により特徴づけされるその他の障害又は疾
病の診断にとって有用である。ＰＤＥＸＶのための診断
検定には、ヒトの体液、細胞、組織又はかかる組織の切
片又は抽出物内にＰＤＥＸＶポリペプチドを検出するた
めの標識及び抗体を利用する方法が含まれる。本発明の
ポリペプチド及び抗体は、修飾を伴って又は伴わずに利
用することができる。往々にしてこれらのポリペプチド
及び抗体は、リポーター分子とそれらを共有的又は非共
有的に結合させることにより標識づけされることにな
る。当業者には、きわめて多種多様なリポータ分子が知
られている。

【０１８７】（ａ）本発明の抗体を提供する段階；
（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で前
記抗体と共に生体標本をインキュベートする段階及び
（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたか
否かを決定する段階を含む方法によって生体標本の中に
存在する本発明のポリペプチドを検出する方法におい
て、抗体を使用することができる。

【０１８８】状況に応じて、適切な標本には、脳、乳
房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉及び骨と
いったような組織又はかかる組織から誘導された新生物
性成長由来の抽出物が含まれると考えられる。本発明の
抗体は、固体支持体に結合されていてもよいし、かつ／
又は適切な試薬、対照、取扱説明などと共に適切な容器
に入ったキットの形で包装されていてもよい。

【０１８９】検定／同定方法 本発明は同様に、（ａ）添付の配列表の中に示されてい
るＤＮＡ配列又はその対立遺伝子変形形態から決定され
るような、ＰＤＥＸＶに特異的である一対のポリメラー
ゼ連鎖反応プライマを用いてかかる細胞からのＲＮＡ
（例えば完全ＲＮＡ）について逆転写酵素−ポリメラー
ゼ連鎖反応を実施する段階及び（ｂ）例えばアガロース
ゲル電気泳動などによって適切にサイズ決定されたＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの出現を検定
する段階、を含んで成る細胞（例えばヒト細胞）内のＰ
ＤＥＸＶの存在を検出するための検定方法にも関する。

【０１９０】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶの活性及び／
又はその発現に影響を及ぼす（例えば阻害するか又はそ
の他の形で修飾する）作用物質（例えば、化合物、その
他の物質又はそれを含む化合物）を同定する方法におい
て、ＰＤＥＸＶ又はそれについてコードするヌクレオチ
ド配列を該作用物質と接触させる段階そして次にＰＤＥ
ＸＶの活性及び／又はその発現を測定する段階を含んで
成る方法にも関する。

【０１９１】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶの活性及び／
又はその発現に選択的に影響を及ぼす（例えば阻害する
か又はその他の形で修飾する）作用物質（例えば、化合
物、その他の物質又はそれを含む化合物）を同定する方
法において、ＰＤＥＸＶ又はそれについてコードするヌ
クレオチド配列を該作用物質と接触させる段階そして次
にＰＤＥＸＶの活性及び／又はその発現を測定する段階
を含んで成る方法にも関する。

【０１９２】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶの活性及び／
又はその発現に影響を及ぼす（例えば阻害するか又はそ
の他の形で修飾する）作用物質（例えば、化合物、その
他の物質又はそれを含む化合物）を同定する方法におい
て、該作用物質の存在下で、又は（ａ）添付の配列表に
示されたＤＮＡ配列又はその対立遺伝子変形形態を含む
組換えＤＮＡが中に取り込まれた細胞系統又は（ｂ）天
然にＰＤＥＸＶを選択的に発現する細胞系統又は細胞個
体群の中に該作用物質を添加した後、ＰＤＥＸＶの活性
及び／又はその発現を測定する段階を含んで成る方法に
も関する。好ましくは、ＰＤＥＸＶの活性は、上述の検
定方法により決定される。

【０１９３】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶの活性及び／
又はその発現に選択的に影響を及ぼす（例えば阻害する
か又はその他の形で修飾する）作用物質（例えば、化合
物、その他の物質又はそれを含む化合物）を同定する方
法において、該作用物質の存在下で、又は（ａ）添付の
配列表に示されたＤＮＡ配列又はその対立遺伝子変形形
態を含む組換え型ＤＮＡが中に取り込まれた細胞系統又
は（ｂ）天然にＰＤＥＸＶを選択的に発現する細胞系統
又は細胞個体群の中に該作用物質を添加した後、ＰＤＥ
ＸＶの活性及び／又はその発現を測定する段階を含んで
成る方法にも関する。好ましくは、ＰＤＥＸＶの活性
は、上述の検定方法により決定される。

【０１９４】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶ（又はその誘
導体、相同体、変異体又はフラグメント）活性又は（そ
の誘導体、相同体、変異体又はフラグメントを含めた）
これについてコードするヌクレオチド配列の発現の調節
（好ましくは特異的変調）について作用物質をスクリー
ニングする方法において、ａ）候補作用物質を提供する
段階；ｂ）ＰＤＥＸＶ（又はその誘導体、相同体、変異
体又はフラグメント）又はこれ（又はその誘導体、相同
体、変異体又はフラグメント）についてコードするヌク
レオチド配列と候補作用物質を、適切な条件下での調節
を可能にするのに充分な時間組合わせる段階、及びｃ）
候補作用物質がＰＤＥＸＶ（又はその誘導体、相同体、
変異体又はフラグメント）活性又はこれ（又はその誘導
体、相同体、変異体又はフラグメント）についてコード
するヌクレオチド配列の発現を変調するか否かを確認す
るために、ＰＤＥＸＶ（又はその誘導体、相同体、変異
体又はフラグメント）又はこれ（又はその誘導体、相同
体、変異体又はフラグメント）についてコードするヌク
レオチド配列に対する候補作用物質の調節を検出する段
階を含んで成る方法をも提供している。

【０１９５】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶ（又はその誘
導体、相同体、変異体又はフラグメント）又は（その誘
導体、相同体、変異体又はフラグメントを含めた）これ
についてコードするヌクレオチド配列との特異的結合親
和性について作用物質をスクリーニングする方法におい
て、ａ）候補作用物質を提供する段階；ｂ）ＰＤＥＸＶ
（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）
又はこれ（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグ
メント）についてコードするヌクレオチド配列と候補作
用物質を、適切な条件下での結合を可能にするのに充分
な時間、組合わせる段階、及びｃ）候補作用物質がＰＤ
ＥＸＶ（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメ
ント）又はこれ（又はその誘導体、相同体、変異体又は
フラグメント）についてコードするヌクレオチド配列に
対して結合するか否かを確認するために、ＰＤＥＸＶ
（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）
又はこれ（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグ
メント）についてコードするヌクレオチド配列に対する
候補作用物質の結合を検出する段階を含んで成る方法を
も提供している。

【０１９６】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶを調節する能
力をもつ作用物質を同定する方法において、ａ）ＰＤＥ
ＸＶ（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメン
ト）又はこれ（又はその誘導体、相同体、変異体又はフ
ラグメント）についてコードするヌクレオチド配列と作
用物質を接触させる段階、ｂ）段階ａ）の混合物を、環
状ヌクレオチドの加水分解に適した条件下で環状ヌクレ
オチドと共にインキュベートさせる段階、ｃ）環状ヌク
レオチド加水分解の量を測定する段階、及びｄ）段階
ｃ）の環状ヌクレオチド加水分解の量を、化合物無しで
インキュベートされたＰＤＥＸＶ（又はその誘導体、相
同体、変異体又はフラグメント）又はこれ（又はその誘
導体、相同体、変異体又はフラグメント）についてコー
ドするヌクレオチド配列で得られた環状ヌクレオチド加
水分解の量と比較し、かくして該作用物質が環状ヌクレ
オチド加水分解に影響を及ぼす（例えば刺激するか又は
阻害する）か否かを決定する段階、を含んで成る方法を
も提供する。

【０１９７】かくして、本発明のいくつかの実施形態に
おいては、ＰＤＥＸＶ又はその変異体、相同体、フラグ
メント又は誘導体及び／又は、ＰＤＥＸＶ又はその変異
体、相同体、フラグメント又は誘導体を発現する細胞系
統を用いて、ホスホジエステラーゼ活性の又はその発現
についてのモジュレータとして作用する有機又は無機分
子といったような抗体、ペプチド、その他の作用物質に
ついてスクリーニングし、かくして環状ヌクレオチドレ
ベルを調節する能力をもつ治療用作用物質を同定するこ
とが可能である。例えば、環状ヌクレオチドのＰＤＥＸ
Ｖ加水分解を阻害し、かくしてそのレベルを増大させる
ために、ＰＤＥＸＶの活性を中和する能力をもつ抗ＰＤ
ＥＸＶ抗体を使用することができる。代替的には、組換
えにより発現されたＰＤＥＸＶ又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体又はＰＤＥＸＶ又はその変
異体、相同体、フラグメント又は誘導体を発現する細胞
系統とのコンビナトリアル・ケミストリーによって作ら
れたペプチドライブラリ又は有機ライブラリのスクリー
ニングが、環状ヌクレオチドのＰＤＥＸＶ加水分解を調
節することにより機能する治療用作用物質の同定のため
に有用である。合成化合物、天然産物及び潜在的に生物
学的に活性である材料のその他の供給源を、当業者には
お決まりのものであると思われる数多くの方法でスクリ
ーニングすることが可能である。例えば、ＰＤＥＸＶの
Ｎ末端領域をコードするヌクレオチド配列を、ＰＤＥＸ
Ｖ活性のアゴニスト又はアンタゴニストであるアロステ
リック・モジュレータのスクリーニングのために使用す
ることができる細胞系統内で発現させることができる。
代替的には、ＰＤＥＸＶの保持された触媒ドメインをコ
ードするヌクレオチド配列を細胞系統内で発現させ、環
状ヌクレオチド加水分解の阻害物質についてスクリーニ
ングするために使用することが可能である。

【０１９８】ＰＤＥＸＶ活性又は環状ヌクレオチド加水
分解と干渉するテスト作用物質の能力を、ＰＤＥＸＶレ
ベル又は環状ヌクレオチドレベルの測定によって決定す
ることができる（Smith et al、１９９３ Appl. Bioche
m. Biotechnol. ４１：１８９−２１８で開示されてい
る通り）。又ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ測定用の市販の免疫
検定キットも存在する（例えばAmersham Internationa
l, Arlington Heights,Il及びDuPont, Boston, MA）。
ＰＤＥＸＶの活性は同様に、専用に開発された従来の技
術を用いてその他のタンパク質のリン酸化又は脱リンと
いったようなその他の応答を測定することによっても監
視可能である。

【０１９９】従って、本発明は、ＰＤＥＸＶ又はその変
異体、相同体、フラグメント又は誘導体の環状ヌクレオ
チドホスホジエステラーゼ活性を変調させる能力を持つ
化合物を同定する方法において、ａ）化合物をＰＤＥＸ
Ｖ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体と
接触させる段階；ｂ）環状ヌクレオチドの加水分解に適
した条件下で環状ヌクレオチドと共に段階ａ）の混合物
をインキュベートする段階；ｃ）環状ヌクレオチド加水
分解の量を測定する段階；及びｄ）段階ｃ）の環状ヌク
レオチド加水分解の量を、化合物無しでインキュベート
されたＰＤＥＸＶ又はその変異体、相同体、フラグメン
ト又は誘導体で得られた環状ヌクレオチド加水分解量と
比較し、かくしてこの化合物が環状ヌクレオチド加水分
解を刺激するか又は阻害するかを決定する段階、を含ん
で成る方法を提供する。該方法の１実施形態において
は、フラグメントは、ＰＤＥＸＶのＮ末端領域からのも
のであってよく、ＰＤＥＸＶのアロステリック・モジュ
レータを同定するための方法を提供する。本発明のもう
１つの実施形態においては、フラグメントはＰＤＥＸＶ
のカルボキシ末端領域からのものであってよく、環状ヌ
クレオチド加水分解の阻害物質を同定するための方法を
提供する。

【０２００】ＰＤＥＸＶポリペプチド、その免疫原性フ
ラグメント又はオリゴペプチドは、様々な医薬品スクリ
ーニング技術のいずれかの中で治療用化合物をスクリー
ニングするために使用可能である。かかる試験において
利用されるポリペプチドは、溶液内に遊離していても、
固体支持体上に添付されていても、細胞表面上に支持さ
れていても、又細胞内に位置設定されていてもよい。活
性の完全破壊又はＰＤＥＸＶポリペプチドとテスト対象
の作用物質の間の結合複合体の形成を測定することがで
きる。

【０２０１】従って、本発明は、ＰＤＥＸＶの調節（好
ましくは特異的結合親和力といった特異的調節）又はそ
の発現のための単数又は複数の化合物、又はその一部分
またはその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を
スクリーニングするための方法において、単数又は複数
の化合物を提供する段階；ＰＤＥＸＶ又はこれをコード
するヌクレオチド配列又はその１部分又はその変異体、
相同体、フラグメント又は誘導体を、適切な条件下で調
節を可能にするのに十分な時間複数の化合物又はその各
々と組合せる段階及びＰＤＥＸＶ又はその一部分又はそ
の変異体、相同体、フラグメント又は誘導体の、複数の
化合物の各々に対する結合を検出しかくして、該化合物
ＰＤＥＸＶ又はそれについてコードするヌクレオチド配
列を変調する化合物を同定する段階を含んで成る方法を
も提供する。かかる検定においては、当業者にとって既
知の組合せ化学技術により複数の化合物を産生すること
ができる。

【０２０２】もう１つの薬物スクリーニング技術がＰＤ
ＥＸＶポリペプチドに対する適切な結合親和力をもつ化
合物の高流量スクリーニングを提供しており、これは、
１９８４年９月１３日付けで公示されたGeysenの欧州特
許出願８４／０３５６４中に詳述された方法に基づいて
いる。要約すると、プラスチック・ピン又はその他の一
部の表面といったような固体基板上で、異なる小さなペ
プチドテスト化合物が多数合成される。ペプチド・テス
ト化合物は、ＰＤＥＸＶフラグメントと反応させられ洗
浄される。その後、当該技術分野において周知の方法を
適切に適合されることなどによって、結合したＰＤＥＸ
Ｖを検出する。上述の医薬品スクリーニング技術におい
て使用するため、精製されたＰＤＥＸＶを直接平板上に
コーティングすることもできる。

【０２０３】本発明は同様に、ＰＤＥＸＶを特異的に結
合する能力をもつ中和抗体がＰＤＥＸＶを結合するため
のテスト化合物と競合するような競合医薬品スクリーニ
ング検定の使用も考慮している。この要領で、ＰＤＥＸ
Ｖと単数又は複数の抗原決定基を共有するあらゆるペプ
チドの存在を検出するために該抗体を使用することがで
きる。

【０２０４】本発明の検定方法は、高流量スクリーン
（ＨＴＳ）でありうる。この点において、ＷＯ８４／０
３５６４の教示を、本発明のＰＤＥに適合させることが
できる。ＵＳ−Ａ−５７３８９８５の教示は、本発明の
検定方法のために適合することができる。

【０２０５】作用物質本発明は同様、本発明の検定方法
及び同定方法によって同定された単数又は複数の作用物
質を提供する。本発明の作用物質は、例えば、有機化合
物又は無機化合物でありうる。作用物質は、例えば、添
付の配列表中に示された配列の全て又は一部分に対しア
ンチセンスであるヌクレオチド配列でありうる。

【０２０６】本発明はさらに、薬剤として使用するため
の、本発明の作用物質（又はその薬学的に受容可能な塩
又はその薬学的に受容可能な溶媒和物）又はこれらのい
ずれかを含有する薬学組成物を提供する。本発明は同様
に、心臓血管系、海綿体、腎臓、肝臓、骨格筋、精巣、
前立腺のいずれか１つ又は複数のものの中でのＰＤＥＸ
Ｖ活性に影響を及ぼす（例えば阻害、変調又はアゴニス
ト作用）ための作用物質の使用をも提供する。

【０２０７】診断 本発明は同様に、ＰＤＥＸＶポリヌクレオチド配列の検
出のための診断組成物をも提供する。診断組成物は、添
付の配列表の中に示された配列又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体，又は添付の配列表の中に
示されたヌクレオチドのいずれか１つの全体又は一部分
にハイブリダイズすることができる配列又はその対立遺
伝子変形形態のうちのいずれか１つを含むことができ
る。

【０２０８】疾病診断を目的とする基準を提供するた
め、ＰＤＥＸＶポリペプチド発現からの正常値又は標準
値を設定すべきである。このことは、動物又はヒトのい
ずれかである正常な被験体からとった体液又は細胞抽出
物を、当該技術分野において周知のものである複合体形
成に適した条件下で、ＰＤＥＸＶポリペプチドに対する
抗体と組合わせることによって達成される。標準的複合
体形成の量は、既知の量の抗体が既知の濃度の精製ＰＤ
ＥＸＶポリペプチドと組合わされる正の対照の希釈度系
列とそれを比較することによって定量化することができ
る。このとき、正常な標本から得られた標準値を、ＰＤ
ＥＸＶポリペプチド発現に関連した障害又は疾病を潜在
的に患っている被験体からの標本から得た値と比較する
ことができる。標準値と被験体値の間の偏差が、疾病状
態の存在を立証する。

【０２０９】ＰＤＥＸＶポリヌクレオチド又はそのいず
れかの部分は、診断及び／又は治療用化合物のためのベ
ースを提供することができる。診断を目的として、ＰＤ
ＥＸＶ活性が関与する可能性のある健康状態、障害又は
疾病の遺伝子発現を検出及び定量化するべくＰＤＥＸＶ
ポリヌクレオチド配列を使用することができる。ＰＤＥ
ＸＶの発現の結果もたらされる疾病の診断のために、Ｐ
ＤＥＸＶをコードするポリヌクレオチド配列を使用する
ことが可能である。例えば、ＰＤＥＸＶをコードするポ
リヌクレオチド配列を、ＰＤＥＸＶ発現における異常を
検出するべく、血清、滑液といった生物学的流体の生検
又は剖検又は腫瘍生検からの組織のＰＣＲ検定又はハイ
ブリダイゼーションにおいて使用することができる。か
かる定性的又は定量的方法の形態には、サザン又はノー
ザン分析、ドット・ブロット又はその他の膜ベースの技
術；ＰＣＲ技術；ディップ・スティック、ピン又はチッ
プ技術；及びＥＬＩＳＡ又はその他の多重標本の正式な
技術が含まれていてよい。これらの技術は全て当該技術
分野において周知のものであり、事実数多くの市販の診
断キットの基準となっている。

【０２１０】かかる検定は、特定の治療用処置様式の効
能を評価するように調整でき、又動物の研究、臨床試験
又は個々の患者の治療の監視において使用することがで
きる。疾病の診断のための基準を提供するために、ＰＤ
Ｅ発現についての正規のつまり標準的プロフィールを設
定すべきである。これは、ハイブリダイゼーション又は
増幅に適した条件下で、動物又はヒトのいずれかの正常
な被験体からとった体液又は細胞抽出物をＰＤＥＸＶ又
はその一部分と組合わせることによって達成される。標
準的ハイブリダイゼーションは、既知の量の精製された
ＰＤＥＸＶが使用される同じ実験の中で行なわれた正の
対照の希釈系列と、正常な被験体について得られた値を
比較することによって定量化することができる。正常な
標本から得られた標準値を、ＰＤＥコーディング配列の
発現に関連する障害又は疾病を潜在的に患う被験体から
の標本から得た値と比較することが可能である。標準値
と被験体値の間の偏差が、疾病状態の存在を立証する。
疾病が立証されたならば、既存の治療用作用物質が投与
され、治療プロフィール又は値を生成できる。最終的
に、正規のつまり標準的なパターンに向かって値が進展
するか又はこのパターンへと戻るかを評価するために規
則的に検定を反復することができる。数日間又は数カ月
間にわたる治療の効能を示すため、連続した治療プロフ
ィールを使用することができる。

【０２１１】かくして、本発明は例えば、疾病状態にお
けるＰＤＥＸＶレベルを検出し定量化するため診断上使
用可能な抗ＰＤＥＸＶ抗体を産生することを目的とす
る、ＰＤＥＸＶポリペプチド又はその変異体、相同体、
フラグメント又は誘導体の使用にも関する。本発明はさ
らに、正の対照として使用可能である精製済みＰＤＥＸ
Ｖ及び抗ＰＤＥＸＶ抗体を含む細胞及び組織中のＰＤＥ
ＸＶの検出のためのキット及び診断用検定をも提供して
いる。かかる抗体は、ＰＤＥＸＶタンパク質の発現又は
欠失又はそのその変異体、相同体、フラグメント又は誘
導体の発現に関係するあらゆる疾病状態又は条件を検出
するため、溶液ベース、膜ベース又は組織ベースの技術
において使用可能である。 プローブ 本発明の別の観点は、PDEコーディング領域又は対立遺
伝子の様なそれと密接に関連した分子をコードするゲノ
ム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することがで
きる、核酸ハイブリダイゼーション又はPCRプローブの
提供である。プローブの特異性、即ちプローブが高度に
保存された、あるいは保存された又は保存されていない
領域又はドメインの何れに由来するのか、そしてハイブ
リダイゼーション又は増幅のストリンジェンシー（高、
中又は低）が、プローブが天然PDEコーディング配列ま
たは関連配列のみを同定するか決めるであろう。関連核
酸配列の検出に適したプローブは、3'領域の様な環状ヌ
クレオチドPDEファミリーのメンバーの保存されたまた
は高度に保存されたヌクレオチド領域から選択され、そ
してこれらプローブは縮重プローブのプールの中で利用
できるだろう。同一核酸配列の検出には又は最大の特異
性が望まれる場合には、核酸プローブはPDEポリヌクレ
オチドの非保存的ヌクレオチド領域又はユニーク領域よ
り選択される。ここで用いる”非保存的ヌクレオチド領
域”とは、例えば環状ヌクレオチドPDEsとして知られる
様な、ここに開示されたPDEコーディング配列にユニー
クであり、そして関連ファミリーメンバーには生じない
ヌクレオチド領域をいう。

【０２１２】US-A-4683195号、US-A-4800195号及びUS-A
-4965188号に記載されるPCRは、PDEXV配列に基づくオリ
ゴヌクレオチドのための追加の用途を提供する。この様
なオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素的
に作製され、又は組換え源から産生されることもでき
る。一般的にオリゴマーは、特異遺伝子又は条件を同定
する為の最適化条件下に利用されれるセンス方向（5'→
3'）及びアンチセンス（3'←5'）である２種類のヌクレ
オチドを含む。密接に関連したDNA又はRNAの配列の検出
及び／又は定義のためには、同じ２つのオリゴマー、オ
リゴマーのネステッド・セット、又はオリゴマーの縮重
プールが、ストリンジェンシーが低い条件で利用でき
る。

【０２１３】PDEXVのための核酸配列は、内因性のゲノ
ム配列のマッピングについて既述されている様なハイブ
リダイゼーションプローブを作製するためにも利用され
る。配列はよく知られている技術を使用して、特定染色
体又は染色体の特定領域にマップされることができる。
これらは染色体スプレッドへのin situハイブリダイゼ
ーション（Vermaら、(1988）ヒト染色体：基礎技術マニ
ュアル（Human Chromosomes:A Manual of Basic Techni
ques)、Pergamon Press, New York City）、フロー−ソ
ートされた染色体調製、またはYACs、細菌人工染色体
（BACs）、細菌PI構築体又は単一染色体cDNAライブラリ
ーの様な人工染色体構成体を含む。

【０２１４】染色体調製物のIn situハイブリダイゼー
ション及び確立した染色体マーカーを用いたリンケージ
分析の様な物理地図作製技術は、遺伝子地図の伸張には
有効ではない。遺伝子地図の例はScience（1995; 270:4
10f及び1994；265：1981f）に見ることができる。特定
のヒト染色体の番号又は腕が不明な場合でさえ、他の哺
乳動物種の染色体上の遺伝子の配置はしばしば関連マー
カーを表すことができる。物理地図作製により新規配列
は染色体腕又はその部分に割り当てられる。これは、位
置クローニング又は他の遺伝子発見技術を使用し疾患遺
伝子を探索している研究者に有益な情報を提供する。例
えばATが11q22-23（Gattiら、（1988）Nature336：577-
580）に位置づけられた様に、例えば毛細血管拡張性運
動失調症(AT)の様な病気又は症候群が遺伝子リンケージ
によって特定の遺伝子領域に位置づけられれば、その領
域にマッピングされる配列は詳細な研究のための関連遺
伝子又は調節遺伝子となることができる。本発明のヌク
レオチド配列は、正常者、キャリアー又は患者との間に
ある、転座、逆位等による染色体位置の差の検出にも利
用されることができる。

【０２１５】医薬品 本発明はPDEXV活性に拠るものと同一のものを必要とす
る個体を治療する為の医薬組成物であって、該活性に影
響を及ぼす（例えば阻害する）作用物質の治療的有効量
及び医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤または
アジュバントを含むものをも提供する。

【０２１６】従って、本発明は本発明の作用物質（本発
明のヌクレオチド配列の発現パターン、又はその発現産
物の活性を調節することができる作用物質、及び／又は
本発明に従うアッセイにより同定される作用物質）を含
む医薬組成物をも包含する。この点に関し、そして特に
ヒトの治療に関しては、本発明の作用物質が単独で投与
されることができる場合でさえそれらは、一般には意図
された投与経路及び標準的な医薬実務に照らし選択され
た医薬担体、賦形剤または希釈剤と混合されて投与され
るだろう。

【０２１７】本発明の医薬組成物の例としては、本発明
の作用物質は好適な結合剤、滑剤、懸濁剤、コーティン
グ剤、または可溶化剤と混合されるだろう。一般に、本
発明の作用物質の治療的有効日用経口又は静脈内投与量
は、0.01〜50mg/kg治療対象被験体体重の範囲と考えら
れ、好ましくは0.1〜20mg/kgである。本発明の作用物質
は、0,001-10mg/kg/時間の範囲にある投与量にて静脈注
射により投与されることもできる。

【０２１８】作用物質の錠剤、又はカプセルは必要に応
じて１度に１又は２以上投与されることができる。本発
明の作用物質は徐放性製剤の形で投与されることもでき
る。従って、本発明はPDEXV活性によるものと同一活性
を必要とする個体に対し本発明の医薬組成物の有効量を
投与することを含む、該個体を治療する方法をも提供す
る。

【０２１９】典型的には、医師は個々の患者に最も好適
であろう実投薬量を決定し、そしてそれはその特定の患
者の年齢、体重及び応答により変わるであろう。上記投
与量は平均的な場合の例示である。もちろんより高い又
はより低い投薬量が有益である患者例もあるだろうが、
それらも本発明の範囲内である。適当であれば、医薬組
成物は吸入により、座薬又はペッサリーの形状で、ロー
ション、溶液、クリーム、軟膏又はダスティング・パウ
ダーの形状にて局所的に、皮膚用発布剤の使用により、
澱粉あるいはラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形で、
又は単独又は賦形剤と混合されたカプセルあるいオビュ
レン中で、又は芳香剤又は着色剤を含むエリキシル剤、
溶液又は懸濁液の形状にて、経口的に、投与されること
ができ、あるいはそれらは例えば海綿組織内、静脈内、
筋肉中又は皮下に非経口的に注射されることができる。
非経口的投与のためには、組成物は他の物質、例えば溶
液を血液と等張にするために十分な塩または単糖を含む
ことができる滅菌水溶液の形状にて最良に使用されるこ
とができる。口腔内（buccal）又は舌下投与のために
は、組成物は慣用のやり方で配合されることができる錠
剤又はトローチ剤（lozenges）の形状にて投与されるこ
とができる。

【０２２０】幾つかの適用のためには、好ましくは、組
成物は澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形
で、又は単独あるいは賦形剤と混合されたカプセル又は
オビュレン内で、あるいは芳香剤又は着色剤を含むエリ
キシル剤、溶液、あるいは懸濁液の形状で経口投与され
る。非経口投与のためには、組成物は他の物質、例えば
溶液を血液と等張にするために十分な塩又は単糖を含む
ことができる滅菌水溶液の形状で最良に使用されること
がでできる。

【０２２１】口腔内または舌下投与のためには、組成物
は慣用のやり方で配合されることができる錠剤、又はト
ローチ剤の形で投与されることができる。被験体（例え
ば、患者）への経口、非経口、口腔内及び舌下投与のた
めには、本発明の作用物質の日用投与量レベルは典型的
には10〜500mg（１回又は分割投与量）であることがで
きる。従って、例えば錠剤またはカプセルは、適宜、１
度に１回または２回以上の回数の投与のための活性作用
物質５〜100mgを含むことができる。上記の如く、医師
は個々の患者に最適であろう実投与量を決定し、そして
それはその特定の患者の年齢、体重及び応答により変わ
るであろう。上述の投与量は平均例の例示であるので、
もちろんより高い又は低い投与量範囲に有益である個体
例もあり、そしてこの様な投与範囲も本発明の範囲内で
ある。

【０２２２】一般に幾つかのヒトでの応用では、本発明
の作用物質の経口投与が好ましい経路であり、最も便利
であり、そして幾つかの例では他の投与経路に伴う不利
益−例えば海綿体内（i.c.）投与に伴う不利益を回避で
きる。レシピエントが嚥下障害を罹っている場合または
経口投与後の薬物吸収に障害がある場合には、薬物は非
経口的、例えば舌下あるいは口腔内的で投与されること
ができる。

【０２２３】獣医分野での使用のためには、本発明の作
用物質は典型的には標準的な獣医実務に従って適当に受
け入れられる製剤として投与され、そして獣医師は特定
の動物に最も適した投与処方及び投与経路を決定するで
あろう。しかしながら、ヒトの治療と同様に動物治療の
ために、作用物質を単独投与することもできる。典型的
には、医薬組成物−ヒト又は動物に利用される−は１以
上の医薬品として許容される希釈剤、担体、賦形剤また
はアジュバントを含むであろう。医薬担体、賦形剤又は
希釈剤の選択は、目的とする投与経路及び標準的医薬実
務に照らし選ばれることができる。上記の如く、医薬組
成物は担体、賦形剤又は希釈剤として−又はそれらに加
え−好適な結合剤、滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、
可溶化剤を含むことができる。

【０２２４】本発明の幾つかの実施態様では、医薬組成
物は本発明のアッセイによりスクリーニングされた作用
物質；その誘導体、断片、相同体又はその変異体を含む
添付の配列表に示された配列又は添付の配列表に示され
たヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる
配列の何れかと相互作用可能な作用物質、を１またはそ
れ以上含むであろう。

【０２２５】本発明の範囲にはPDEXV mRNAを不安定化し
又はPDEXVの翻訳を阻害するように働くオリゴヌクレオ
チド配列、アンチセンスRNA及びDNA分子、及びリボザイ
ムが含まれる。これらヌクレオチド配列は、炎症の様な
環状ヌクレオチド・レベルが増加することが好ましいで
あろう症状において使用されることができる。PDEXVア
ンチセンス分子は、例えばPDEXV活性の増加に関連する
各種の異常な症状の治療の基礎を提供することができ
る。

【０２２６】PDEXV核酸アンチセンス分子は、環状ヌク
レオチドレベルが上昇することが好ましいであろう症状
においてPDEXVの活性を遮断するために使用されること
ができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス
又はワクシニア・ウイルス、あるいは各種バクテリア・
プラスミドに由来する発現ベクターは、標的化された細
胞集団に組換えPDEXVセンス又はアンチセンス分子をデ
リバリーするために使用されることができる。当業者に
周知の方法がPDEXVを含む組換えベクターの構築のため
に使用されることができる。あるいは、組換えPDEXVは
リポソーム内の標的細胞にデリバリーされることができ
る。

【０２２７】完全長cDNA及び／又はその調節要素は、研
究者がPDEXVを遺伝子機能のセンス（Youssoufian HとHF
Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）またはアンチ
センス（Eguchiら、(1991) Annu Rev Biochem 60:631-6
52)研究におけるツールとして使用することを可能にす
る。cDNAまたはゲノムDNAから得た制御配列から設計さ
れたオリゴヌクレオチドは、in vitro又はin vivoにお
いて発現を阻害するために使用されることができる。こ
の様な技術は今日当業者に周知であり、そしてコーディ
ングまたは制御領域に沿ったさまざまな位置から、セン
スまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはより
大きな断片が設計されることができる。20ヌクレオチド
長であることができる適当なオリゴヌクレオチドは、ヒ
ト・ライブラリーからのPDEXV配列又は密接に関係した
分子を単離するために、使用されることができる。

【０２２８】さらに、フォスホジエステラーゼ活性を、
遮断しそしてそれにより環状ヌクレオチドのレベルを高
めることが好ましい症状においては、PDEXV断片の高レ
ベルを発現する発現ベクターで細胞又は組織をトランス
フェクトすることによりPDEXVの発現を調節することが
できる。この様な構成体は細胞を翻訳不能なセンス又は
アンチセンス配列で満たすことができる。DNAへの組み
込みが無くとも、この様なベクターはベクターの全コピ
ーが内因性のヌクレアーゼにより不能になるまで、RNA
分子を転写し続けることができる。この様な一過性の発
現は非複製性ベクターにより１ヶ月以上続き、適当な複
製要素がベクター系の一部である場合には更に長く続く
ことができる。

【０２２９】遺伝子発現の調節は、プロモーター、エン
ハンサー及びイントロンの様なPDE遺伝子の制御領域に
対するアンチセンス配列を設計することにより得られる
ことができる。転写開始部位に由来するオリゴヌクレオ
チド、例えばそのリーダー配列の−10〜＋10領域が好ま
しい。アンチセンスRNA及びDNA分子は、転写物がリボソ
ームに結合することを防止することによりmRNAの翻訳を
阻止する様に設計されることもできる。同様に、“トリ
プル・ヘリックス”塩基対合としても知られるHogeboom
の塩基対合法を使用して、阻害を達成することができ
る。トリプル・ヘリックス対合は、ポリメラーゼ、転写
因子または制御分子の結合のために関し十分に開く二重
螺旋の能力を減じる。

【０２３０】従って、本発明は医薬として許容される希
釈剤、賦形剤又は担体と共に本発明の作用物質（又は医
薬として許容されるその塩又は医薬として許容されるそ
の溶媒化合物）を含む医薬組成物を提供する。医薬組成
物は獣医分野（即ち動物）への利用又はヒトへの利用で
あることができるであろう。

【０２３１】従って、本発明は、それゆえ医薬として許
容される希釈剤、担体、賦形剤又はアジュバント（その
組合せを含む）と混合されてPDEXVタンパク質の阻害剤
又は拮抗剤（アンチセンス核酸配列を含む）の有効量を
含む医薬組成物にも関する。本発明は、PDEXVポリヌク
レオチド配列、PDEXVアンチセンス分子、PDEXVポリペプ
チド、タンパク質、ペプチド、又は阻害剤、拮抗剤（抗
体を含む）又はアゴニストの様なPDEXV生物活性の有機
調節物質の全て又は一部を単独にまたは安定化化合物の
様な他の作用物質の少なくとも１種類との組合せにおい
て含み、更にこれに限定されるものではないが生理食塩
水、緩衝液化生理食塩水、デキストロース及び水の様な
滅菌された生体適合性医薬担体中で投与されることがで
きる医薬組成物に関する。

【０２３２】一般的方法の参考文献 ここに記した技術は一般に本分野において周知である
が、特にSambrookら、Molecular Cloning, A Laborator
y Manual(1989)及びAusubelら、Short Protocolsin Mol
ecular Biology (1999)4^th Ed, John Wiley & Sons, In
c.が参考になるであろう。PCRはUS-A-4683195号、US-A-
4800195号及びUS-A-4965188号に述べられている。

【０２３３】寄託 以下のサンプルはブダペスト条約に従い、公認寄託機関
であるAB2 1RY英国、スコットランド、アバーディン（A
berdeen）、マーシャルドライブ（Machar Drive) 23 S
t.にあるThe National Collections of Industrial and
Marine Bacteria Limited(NCIMB)に、1999年９月９日
に寄託された。

【０２３４】NCIMB番号NCIMB41025はEscherichia coli
(pHSPDExv.)である。寄託者はファイザー中央研究所（P
fizer Central Reseach)、ファイザー社(Pfizer Limite
d)、英国、CT139NJ、ケント（Kent）、サンドイッチ（S
andwich）、ラムスゲート通り（Ramsgate Road)であ
る。本発明は、上記寄託物及びそれを含む実施態様から
誘導可能な／又は発現可能な配列をも包含する。本発明
は、上記寄託物及びその部分配列が活性酵素部位をコー
ドしている上記寄託物を含む実施態様から誘導可能な及
び／又は発現可能な部分配列をも包含する。本発明は更
に上記寄託物及びそれを含む実施態様から誘導可能な及
び／又は発現可能な配列を含むタンパク質をも包含す
る。本発明は更に上記寄託物及びそれを含む実施態様よ
り誘導可能な及び／又は発現可能な部分配列を含むタン
パク質にあって、その部分配列が活性酵素部位をコード
するものをも包含する。

【０２３５】本発明は更に寄託物及びそれを含む実施態
様より誘導可能な及び／又は発現可能な配列をも包含す
る。以下本発明を例示のみを目的として説明する。PDExv cDNAの単離 材料と方法 5'RACE:反応緩衝液及び酵素をLife Technologiesからの
キット形式中に得た。プロトコールを、第１鎖cDNAをdA
テーリング修飾を使用して、取扱説明書に従って実施し
た（cDNA末端迅速増幅用[Life technologies]5'RACEシ
ステム、version2.Cat No.18374-058)。

【０２３６】アンカープライマー：5'-GGCCACGCGTCGACT
AGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' アダプタープライマー：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 発現：PDExvを詳細に後述するバキュロウイルス系を使
用して発現させた。 結果 オリジナルの配列をIMAGE ESTデータベースにおいてキ
ーワード検索により同定した（IMAGEクローン#1639772
−ヒト精巣ライブラリーから単離）。

【０２３７】スプライス変異体の完全な5'配列を得るた
めに、精巣のポリA＋RNA（Clontech）についてcDNA末端
の5'迅速増幅（RACE）を行った。 GSP1:5'-CAGAACAGCGTTCACATTTCAGC-3' GSP2:5'-AGGTCAGTCTGTTCTTCAAAGAGG-3' CSP3:5'-CAGTAAATGGAGCTCCTTCAGG-3' CDNAを合成プライマーとしてGSP1を使用して精巣ポリA
＋RNAから作製した。

【０２３８】3'プライマーとしてCSP2を、そしてキット
により供給されたアンカー・プライマーを使用して上記
cDNAに対し第１ラウンドのPCRを実施した。3'プライマ
ーとしてGSP3を、そしてキットにより供給された5'アダ
プター・プライマーを使用して上記第１ラウンド産物に
対しネステッドPCRを実施した。このネステッドPCR産物
を、TOPO-TAクローニングベクター（PCR2.1-TOPO、Invi
trogen）中に1500クローンのミニライブラリーを作製す
るために使用した。このミニライブラリーを、オリゴヌ
クレオチド・プローブGSP4とのハイブリダイゼーション
によりスクリーニングした。 GSP4:5'-TTGTGCATGCCTATCCGAAGCAGTTATGGT-3' 配列決定より、８クローンが既知PDE11配列を延長した
配列であると判定された。この延長配列を用いて、新規
配列が発現ベクターpFASTBAC-FLAGにクローニングする
ことを許容するように5'プライマー（GSP5)を設計し
た。このプライマーは、操作されたRsrII部位を含んで
いる。 GSP5:5'-GCACGGTCCGAGATGCTGAAGCAGG-3' GSP6:5'-AGATATCTGGTCTGCCTCTGC-3' GSP5(5'プライマー）及びGSP6（3'プライマー）を使用
したPCRは、5'に操作されたRsrII部位と天然のStulI部
位を含む780bpの断片を生成した。

【０２３９】pFASTBAC中のオリジナルのPDE11A1（PDE10
-Incyte）発現構成体及び上記780bp断片を制限エンドヌ
クレアーゼRsrII及びStuIで消化した。上記780bp断片を
PDE11A1の3'末端に繋ぎ、延長されたスプライス変異体P
DExv（PDE11A3）を作製した。次に全PDExv構成体をpFAS
TBAC-FLAG内にクローン化した。 発現 組換え酵素はcGMP及びcAMPを共に加水分解する。

【０２４０】バキュロウイルス発現 以下の研究は、本発明のPDE酵素−略してここではPDEと
呼ぶ−はバキュロウイルス発現システムを使用して作ら
れることができることを示す。以下の研究は、PDEがバ
キュロウイルスシステム内に発現された場合に環状ヌク
レオチド加水分解活性を示すことをも示す。

【０２４１】PDE酵素は、Spodoptera frugiperdoa昆虫
細胞（Sf9細胞）のAutographa californica核多角体病
ウイルス（AcNPV）感染に基づくバキュロウイルス発現
システムを使用して作られた。これら研究においては、
PDEをコードするcDNAをミニ-Tn7トランスポジション要
素を含むドナー・プラスミドpFASTBAC-FLAG内にクロー
ン化した。組換え体プラスミドを、親のbacmid bMON14
272（AcNPV感染性DNA）及びヘルパー・プラスミドを含
むDH10BACコンピテント細胞内に形質転換した。pFASTBA
Cドナー上のミニ-Tn7要素はbacmid上のattTn7接着部位
にトランスポーズすることができ、こうしてそのウイル
ス・ゲノム上に上記PDE遺伝子が導入される。組換えbac
midsを含むコロニーはlacZ遺伝子の破壊により同定され
る。次にPDE/bacmid構成体を単離し、そして昆虫細胞
（Sf9細胞）に感染させ、感染性の組換えバキュロウイ
ルス粒子を産生し、そして組換えPDE-FLAG融合タンパク
質を発現させることができる。

【０２４２】粗細胞抽出物のホスホジエステラーゼ活性
を測定した。トランスフェクションから24、48及び72時
間後に細胞を収獲し、そして、抽出物を調製した。これ
らの結果は、PDE cDNAが、cAMP及び／又はcGMPを加水分
解することができるフォスホジエステラーゼをコードし
ていることを確信させた。

【０２４３】粗溶解物質を、ヒドラジン・リンケージ
（Estaman Kodak）によりそれに精製IgG₁モノクローナ
ル抗-FLAG抗体が結合されていたところのアガロース・
ビーズ（M2アフィニティー・ゲル）を含むカラムを用い
てFPLCにより精製した。これにより内因性の昆虫蛋白質
を溶出液中に洗い流しながら、組換え物質（これがFLAG
エピトープに融合されるため）をカラム上に特異的に保
持することが可能となる。次に組換え物質が低pH条件下
で洗い出される。この精製物質は詳細な酵素的及びイン
ヒビターの研究のためにより好適である。上記物質の精
製はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）後のクマシー染色、又は非染色
SDS-PAGEのニトロセルロース膜（組換え体PDEを含む）
上でのウエスタン・ブロット及びIgG1モノクローナル抗
−FLAGエピトープ抗体による分析により評価される。PD
E-FLAG融合タンパク質は、抗-FLAG抗体とPDEタンパク質
に融合したFLAGエピトープとの間の相互作用により検出
される。

【０２４４】精製PDE-FLAG融合タンパク質のホスホジエ
ステラーゼ活性を、市販のcAMP及び／又はcGMP加水分解
活性用SPA（シンチレーション・プロキシミティー・ア
ッセイ）キット（Amersham-Amersham place, Little Ch
alfont, Bucks, HP7 9NA UK)を使用してアッセイした。
このキットを使用し、酵素に関する適当なVmax値の計算
が可能な基質濃度域に酵素活性を決定することにより、
cAMP及び／又はcGMPに対するPDEについてのKm値を決定
することができる。

【０２４５】これらの実験の結果は、PDE cDNAがcAMP及
び／又はcGMPを加水分解することができるホスホジエス
テラーゼをコードしていることを示す。 要約 要約すると、本発明は以下を提供する： １．新規アミノ酸。 ２．新規ヌクレオチド。 ３．当該新規配列を使用するアッセイ。 ４．当該アッセイの使用により同定された化合物／組成
物。 ５．当該新規配列を含む又は発現する発現系。 ６．当該新規配列に基づく治療方法。 ７．当該新規配列に基づく医薬組成物。

【０２４６】上記明細書に記述された全ての刊行物を本
明細書中に援用する。本発明の記述した方法及びシステ
ムの様々な修飾及び変更は、本発明の範囲及び本質から
逸脱することなく当業者に明らかになるだろう。本発明
は特定の好ましい実施態様に関して記述されているが、
クレームされる発明はこれら特定の実施態様に限定され
るものではないことを理解しなければならない。事実、
生化学及びバイオテクノロジー分野又は関連分野におけ
る当業者にとって明らかである発明の実施に関し記述さ
れたモードの各種変更は、もちろん、以下の請求項の範
囲内にあると考えられる。

【０２４７】

【表４】

【０２４８】

【表５】

【０２４９】

【表６】

【０２５０】

【表７】

【０２５１】

【表８】

【０２５２】

【表９】

【０２５３】

【配列表】 <110> Pfizer Limited (EP (GB) only), Pfizer Inc. (EP except GB / US / JP ) <120> Phosphodiesterase Enzymes <130> File reference: B006660 (PCS10349APME) <140> <141> 2000-9-14 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 684 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Lys Gln Ala Arg Arg Pro Leu Phe Arg Asn Val Leu Ser Ala 1 5 10 15 Thr Gln Trp Lys Lys Val Lys Ile Thr Arg Leu Val Gln Ile Ser Gly 20 25 30 Ala Ser Leu Ala Glu Lys Gln Glu Lys His Gln Asp Phe Leu Ile Gln 35 40 45 Arg Gln Thr Lys Thr Lys Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys 50 55 60 Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser 65 70 75 80 Ser Asp Gly Glu Ile Ile Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro 85 90 95 Glu Gly Ala Pro Phe Thr Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr 100 105 110 Leu Pro Phe Cys Gly Ile Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala 115 120 125 Ser Arg Lys Glu Tyr Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn 130 135 140 Asp Leu Phe Glu Glu Gln Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys Ile 145 150 155 160 Met His Arg Ala Gln Thr Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val Leu 165 170 175 Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser Phe 180 185 190 Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe Lys 195 200 205 Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn Ser 210 215 220 Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser Asp 225 230 235 240 Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser Gly 245 250 255 Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn His 260 265 270 Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys Pro 275 280 285 Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe Cys 290 295 300 Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys Lys Ser 305 310 315 320 Trp Ala Lys Gln Ser Val Ala Leu Asp Val Leu Ser Tyr His Ala Thr 325 330 335 Cys Ser Lys Ala Glu Val Asp Lys Phe Lys Ala Ala Asn Ile Pro Leu 340 345 350 Val Ser Glu Leu Ala Ile Asp Asp Ile His Phe Asp Asp Phe Ser Leu 355 360 365 Asp Val Asp Ala Met Ile Thr Ala Ala Leu Arg Met Phe Met Glu Leu 370 375 380 Gly Met Val Gln Lys Phe Lys Ile Asp Tyr Glu Thr Leu Cys Arg Trp 385 390 395 400 Leu Leu Thr Val Arg Lys Asn Tyr Arg Met Val Leu Tyr His Asn Trp 405 410 415 Arg His Ala Phe Asn Val Cys Gln Leu Met Phe Ala Met Leu Thr Thr 420 425 430 Ala Gly Phe Gln Asp Ile Leu Thr Glu Val Glu Ile Leu Ala Val Ile 435 440 445 Val Gly Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His Arg Gly Thr Asn Asn Ala 450 455 460 Phe Gln Ala Lys Ser Gly Ser Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Gly Thr Ser 465 470 475 480 Ala Thr Leu Glu His His His Phe Asn His Ala Val Met Ile Leu Gln 485 490 495 Ser Glu Gly His Asn Ile Phe Ala Asn Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ser 500 505 510 Asp Leu Met Gln Leu Leu Lys Gln Ser Ile Leu Ala Thr Asp Leu Thr 515 520 525 Leu Tyr Phe Glu Arg Arg Thr Glu Phe Phe Glu Leu Val Ser Lys Gly 530 535 540 Glu Tyr Asp Trp Asn Ile Lys Asn His Arg Asp Ile Phe Arg Ser Met 545 550 555 560 Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Gly Ala Val Thr Lys Pro Trp Glu Ile 565 570 575 Ser Arg Gln Val Ala Glu Leu Val Thr Ser Glu Phe Phe Glu Gln Gly 580 585 590 Asp Arg Glu Arg Leu Glu Leu Lys Leu Thr Pro Ser Ala Ile Phe Asp 595 600 605 Arg Asn Arg Lys Asp Glu Leu Pro Arg Leu Gln Leu Glu Trp Ile Asp 610 615 620 Ser Ile Cys Met Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Val Lys Val Asn Val Lys 625 630 635 640 Leu Lys Pro Met Leu Asp Ser Val Ala Thr Asn Arg Ser Lys Trp Glu 645 650 655 Glu Leu His Gln Lys Arg Leu Leu Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser Ser 660 665 670 Pro Ala Ser Val Met Val Ala Lys Glu Asp Arg Asn 675 680 <210> 2 <211> 2078 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggtccgagat gctgaagcag gcaagaagac ctttattcag aaatgtgctc agtgccacac 60 agtggaaaaa ggtgaaaatc acaagactgg tccaaatctc tggggcctct ttggctgaaa 120 aacaggaaaa gcaccaggat tttcttatac agaggcaaac aaaaacaaag gatcgacgat 180 tcaatgatga aatcgacaag ctgactggat acaagacaaa atcattattg tgcatgccta 240 tccgaagcag tgatggtgag attattggtg tggcccaagc gataaataag attcctgaag 300 gagctccatt tactgaagat gatgaaaaag ttatgcagat gtatcttcca ttttgtggaa 360 tcgccatatc taacgctcag ctctttgctg cctcaaggaa agaatatgaa agaagcagag 420 ctttgctaga ggtggttaat gacctctttg aagaacagac tgacctggag aaaattgtca 480 agaaaataat gcatcgggcc caaactctgc tgaaatgtga gcgctgttct gttttactcc 540 tagaggacat cgaatcacca gtggtgaaat ttaccaaatc ctttgaattg atgtccccaa 600 agtgcagtgc tgatgctgag aacagtttca aagaaagcat ggagaaatca tcatactccg 660 actggctaat aaataacagc attgctgagc tggttgcttc aacaggcctt ccagtgaaca 720 tcagtgatgc ctaccaggat ccgcgctttg atgcagaggc agaccagata tctggttttc 780 acataagatc tgttctttgt gtccctattt ggaatagcaa ccaccaaata attggagtgg 840 ctcaagtgtt aaacagactt gatgggaaac cttttgatga tgcagatcaa cgactttttg 900 aggcttttgt catcttttgt ggacttggca tcaacaacac aattatgtat gatcaagtga 960 agaagtcctg ggccaagcag tctgtggctc ttgatgtgct atcataccat gcaacatgtt 1020 caaaagctga agttgacaag tttaaggcag ccaacatccc tctggtgtca gaacttgcca 1080 tcgatgacat tcattttgat gacttttctc tcgacgttga tgccatgatc acagctgctc 1140 tccggatgtt catggagctg gggatggtac agaaatttaa aattgactat gagacactgt 1200 gtaggtggct tttgacagtg aggaaaaact atcggatggt tctataccac aactggagac 1260 atgccttcaa cgtgtgtcag ctgatgttcg cgatgttaac cactgctggg tttcaagaca 1320 ttctgaccga ggtggaaatt ttagcggtga ttgtgggatg cctgtgtcat gacctcgacc 1380 acaggggaac caacaatgcc ttccaagcta agagtggctc tgccctggcc caactctatg 1440 gaacctctgc taccttggag catcaccatt tcaaccacgc cgtgatgatc cttcaaagtg 1500 agggtcacaa tatctttgct aacctgtcct ccaaggaata tagtgacctt atgcagcttt 1560 tgaagcagtc aatattggca acagacctca cgctgtactt tgagaggaga actgaattct 1620 ttgaacttgt cagtaaagga gaatacgatt ggaacatcaa aaaccatcgt gatatatttc 1680 gatcaatgtt aatgacagcc tgtgaccttg gagccgtgac caaaccgtgg gagatctcca 1740 gacaggtggc agaacttgta accagtgagt tcttcgaaca aggagatcgg gagagattag 1800 agctcaaact cactccttca gcaatttttg atcggaaccg gaaggatgaa ctgcctcggt 1860 tgcaactgga gtggattgat agcatctgca tgcctttgta tcaggcactg gtgaaggtca 1920 acgtgaaact gaagccgatg ctagattcag tagctacaaa cagaagtaag tgggaagagc 1980 tacaccaaaa acgactgctg gcctcaactg cctcatcctc ctcccctgcc agtgttatgg 2040 tagccaagga agacaggaac taataactcg aggcatgc 2078

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 1/16 15/00 9/00 21/00 13/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/00 1/19 21/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/16 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/44 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ 9/16 33/573 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｇ０１Ｎ 33/15 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 37/54 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ニコラ メラニー ロバス イギリス国，ケント シーティー13 ９エ ヌジェイ，サンドウィッチ，ラムスゲイト ロード，ファイザー セントラル リサ ーチ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示す配列あるいはその変異
   種、相同体、断片又は誘導体を含むアミノ酸配列。
2. 【請求項２】 請求項１に規定するアミノ酸配列をコー
   ドするヌクレオチド配列。
3. 【請求項３】 配列番号２に示す配列あるいはその変異
   種、相同体、断片又は誘導体を含むヌクレオチド酸配
   列。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のヌクレオチド配列にハ
   イブリダイズすることができるヌクレオチド配列。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のヌクレオチド配列にハ
   イブリダイズすることができるヌクレオチド配列。
6. 【請求項６】 請求項２〜５のいずれか１項に記載のヌ
   クレオチド配列を含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項２〜６のいずれか１項に記載のヌ
   クレオチド配列を取り込んでいる宿主細胞。
8. 【請求項８】 PDEXV活性又は発現に影響を及ぼすこと
   ができる作用物質を同定するアッセイ方法であって：請
   求項１に記載のアミノ酸、又は請求項２〜７のいずれか
   １項に記載のヌクレオチド配列と作用物質を接触させ、 PDEXVの活性又は発現を計測することを含み； ａ）上記作用物質の非存在下でのPDE活性又は発現と、
   ｂ）上記作用物質の存在下でのPDE活性又は発現の間の
   差異が、上記作用物質がPDEXV活性又は発現に影響を及
   ぼすことができるということの指標である、前記アッセ
   イ方法。
9. 【請求項９】 前記アッセイが心臓血管障害及び／又は
   海綿体、腎臓、肝臓、骨格筋、精巣、前立腺の１以上に
   見られる障害の治療に有用である作用物質についてスク
   リーニングするためのものである、請求項８に記載のア
   ッセイ方法。
10. 【請求項１０】 以下の工程： （ａ）請求項８又は請求項９に記載のアッセイを実施
    し； （ｂ）PDEXV活性又は発現に影響を及ぼす１以上の作用
    物質を同定し；そして （ｃ）上記１以上の同定された作用物質を一定量調製す
    る、を含む方法。
11. 【請求項１１】 作用物質による、in vivoにおけるPDE
    XV活性又は発現に影響を及ぼす方法であって：上記作用
    物質がin vitroアッセイ方法においてPDEXV活性又は発
    現に影響を及ぼすことができ；ここで上記in vitroアッ
    セイ方法が請求項８又は９に記載のアッセイ方法であ
    る、前記方法。
12. 【請求項１２】 請求項８又は請求項９に記載のアッセ
    イ方法によりin vitroにおいてアッセイされる時、PDE
    の活性又は発現に対して影響力をもつことができる作用
    物質を含む、PDEXVに関連した疾病又は症状の治療のた
    めの医薬組成物。
13. 【請求項１３】 PDEXVに対して生じた抗体との免疫学
    的反応を有することができる酵素。
14. 【請求項１４】 前記ヌクレオチド配列がNCIMB41025か
    ら入手可能である、PDEをコードするヌクレオチド配
    列。
15. 【請求項１５】 前記PDEがNCIMB41025より入手可能な
    ヌクレオチド配列から発現されることができるPDE。
16. 【請求項１６】 PDEXVに関連した疾患又は症状の治療
    のための医薬組成物であって、PDEXVの活性又はその発
    現に対して影響力をもつ作用物質を含むもの。
17. 【請求項１７】 PDEXVの不平衡または障害に関連した
    障害の治療及び／又は調節のための医薬品であって、PD
    EXV遺伝子及び／又はその発現産物を含むもの。
18. 【請求項１８】 前記PDEXV及び／又はその発現産物
    が、そのPDEXV及び／又はその発現産物の活性を調節す
    ることができる作用物質についてスクリーニングために
    使用される、請求項１７に記載の医薬品。
19. 【請求項１９】 前記PDEXVが請求項１に記載されたも
    のであり又はそれをコードするヌクレオチド配列である
    PDEXVアゴニスト。
20. 【請求項２０】 前記PDEXVが請求項１に記載されたも
    のであり又はそれをコードするヌクレオチド配列である
    PDEXVアンタゴニスト。
21. 【請求項２１】 組換えPDEXV酵素。
22. 【請求項２２】 PDEXV酵素をコードする組換えヌクレ
    オチド配列。
23. 【請求項２３】 実質的に本願明細書中に記載されたPD
    EXV酵素。