DE60021497T2

DE60021497T2 - Menschliche, für zyklische Nukleotide spezifische Phosphodiesterase

Info

Publication number: DE60021497T2
Application number: DE60021497T
Authority: DE
Inventors: Mark David Sandwich Fidock; Nicola Melanie Sandwich Robas
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2020-09-15
Also published as: EP1085089A2; EP1085089B1; US20040126863A1; GB9922124D0; ES2243208T3; ATE300613T1; EP1085089A3; US7063971B2; JP2001136987A; DE60021497D1

Description

HINTERGRUND DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Nucleotidsequenz, die dieses codiert.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Nucleinsäuresequenz mit Codierung für ein neues hosphodiesteraseenzym.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen zur Bewertung und/oder zum Screening für Mittel, die Phosphodiesteraseaktivität modulieren können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gentechnisch veränderte Wirtszellen, die die neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen umfassen oder exprimieren, zur Bewertung und/oder zum Screening für Mittel, die Phosphodiesteraseaktivität modulieren können.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Cyclische Nucleotide, wie cAMP und cGMP, sind wichtige intrazelluläre Second Messengers. Phosphodiesterasen cyclischer Nucleotide – die sonst als PDEs bekannt sind – sind eine Familie von Enzymen, die den Abbau cyclischer Nucleotide katalysieren und dadurch eine der zellulären Komponenten, die die Konzentration cyclischer Nucleotide regeln, sind.
In den letzten Jahren wurden mindestens 7 PDE-Enzyme (beispielsweise PDEI-PDEVII) sowie viele Subtypen dieser Enzyme auf der Basis von Substrataffinität und Kofaktoranforderungen definiert (Beavo JA und Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11: 150 [1990]; Beavo J, in: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo J und Housley MD (Hrsg.), Wiley: Chichester, S. 3–15 [1990]).
Beispiele für PDEs umfassen: PDEI, das eine Ca²⁺/Calmodulin-abhängige PDE ist; PDEII, das eine cGMP-stimulierte PDE ist; PDEIII, das eine durch cGMP gehemmte PDE ist; PDEIV, das eine cAMP-spezifische PDE hoher Affinität ist; und PDEV, das eine cGMP-spezifische PDE ist.
Jede PDE-Familie kann zwei oder mehrere Isoformen enthalten (d.h. es können zwei oder mehrere PDE-Isoenzyme existieren). Beispielsweise ist von PDEIV bei Säugern, dem Homologon des Dunce-Gens von Drosophila, (Chen CN et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83: 9313 [1986]) bekannt, dass es bei der Ratte vier Isoformen besitzt (Swinnen JV et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86: 5325 [1989]). Von humanen PDEs ist ebenfalls bekannt, dass sie als Isoformen auftreten und Spleißvarianten besitzen. Beispielsweise wurde die Klonierung einer humanen Isoform von PDEIV von Monocyten 1990 berichtet (Livi GP et al., Mol. Cell. Bio., 10: 2678 [1990]). Als weiteres Beispiel klonierten andere Bearbeiter unabhängig voneinander drei Spleißvarianten von PDEIV, die nun als hPDEIV-B1, hPDEIV-B2 und hPDEIV-B3 bezeichnet werden.
Lehren über Phosphodiesterasen cyclischer Nucleotide finden sich auch in US-A-5 932 423 und US-A-5 932 465.
Lehren über eine weitere Phosphodiesterase eines cyclischen Nucleotids – nämlich CN PCDE8 – finden sich in WO-A-97/35989. Gemäß WO-A-97/35989 besitzt CN PCDE8 zwei Isozyme – die als CN PCDE8A und CN PCDE8B bezeichnet werden. Der Ausdruck "Isozym" wird manchmal einschlägig als "Isoform" bezeichnet.
Gemäß WO-A-97/35989 wurden viele Inhibitoren unterschiedlicher PDEs identifiziert und einige wurden bereits einer klinischen Bewertung unterzogen. Beispielsweise wurden PDEIII-Inhibitoren als Antithrombotika, Antihypertonika und Kardiotonika, die bei der Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz verwendbar sind, entwickelt. Rolipram, ein PDEIII-Inhibitor, wird bei der Behandlung von Depression verwendet und andere Inhibitoren von PDEIII werden einer Bewertung als entzündungshemmende Mittel unterzogen. Von Rolipram wurde auch gezeigt, dass es Lipopolysaccharid(LPS)-induzierten TNF-α, von dem gezeigt wurde, dass er die HIV-1-Replikation in vitro verstärkt, hemmt. Daher kann Rolipram die HIV-1-Replikation hemmen (Angel et al., 1995, AIDS 9: 1137–44). Außerdem wurde für Rolipram auf der Basis von dessen Fähigkeit zur Unterdrückung der Produktion von TNF-α und -β und Interferon-γ gezeigt, dass es bei der Behandlung von Enzephalomyelitis, dem experimentellen Tiermodell für Multiple Sklerose, wirksam ist (Sommer et al., 1995, Nat Med 1: 244–248) und bei der Behandlung von Dyskinesia tardive wirksam sein kann (Sasaki et al., 1995, Eur J Pharmacol 282: 71–76).
Gemäß WO-A-97/35989 gibt es auch nichtspezifische PDE-Inhibitoren, wie Theophyllin, das bei der Behandlung von Bronchialasthma und anderen Atemwegserkrankungen verwendet wird, und Pentoxifyllin, das bei der Behandlung von Claudicatio intermittens und diabetesinduzierter peripherer Verschlusskrankheit verwendet wird. von Theophyllin wird angenommen, dass es auf die Funktion der glatten Muskulatur der Luftwege sowie in einer entzündungshemmenden oder immunmodulatorischen Funktion bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen wirkt (Banner et al. 1995 Respir J 8: 096-1000, wobei angenommen wird, dass es durch Hemmen von sowohl der CN-PDE-cAMP- als auch -cGMP-Hydrolyse wirkt (Banner et al., 1995 Monaldi Arch Chest Dis 50: 286–292). Pentoxifyllin, von dem auch bekannt ist, dass es die TNF-α-Produktion blockiert, kann die HIV-1-Replikation hemmen (Angel et al., aaO). Eine Liste von CN PDE-Inhibitoren ist bei Beavo, 1995, aaO, angegeben.
Es wurde vorgeschlagen, dass selektive Inhibitoren von PDEs und auch ihre Isozyme und Subtypen zu einer wirksameren Therapie mit weniger Nebenwirkungen führen. Siehe beispielsweise die Lehren in den Übersichtsartikeln von Wieshaar RE et al. (J. Med. Chem., 28: 537 [1985]), Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43: 2041 [1992]) und Lowe JA und Chen JB (Drugs of the Future, 17: 799–807 [1992]).
Daher ist es für einige Anwendungen günstig, eine selektive Hemmung eines individuellen PDE-Typs zu haben. Daher würde die Klonierung und Expression einer neuen PDE die Ermittlung selektiver Inhibitoren stark unterstützen.
ZUSAMMENFASSENDE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen und im folgenden Kommentar angegeben.
In einem breiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue Aminosäuresequenzen. Im Hinblick darauf identifizierten wir eine neue Aminosäuresequenz, und es ist klar, dass die Erfindung die Sequenz sowie neue Varianten derselben umfasst.
In einem weiteren breiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue Nucleinsäuresequenzen. Im Hinblick darauf identifizierten wir eine spezielle neue Nucleinsäuresequenz, und es ist klar, dass die Erfindung die Sequenz sowie neue Varianten derselben umfasst.
Daher betreffen, kurz gesagt, einige Aspekte der vorliegenden Erfindung:

1. neue Aminosäuresequenzen,
2. neue Nucleotidsequenzen,
3. Tests unter Verwendung der neuen Sequenzen,
4. Expressionssysteme, die die neuen Sequenzen umfassen oder exprimieren.

Andere Aspekte, die die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung und/oder die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung betreffen, umfassen: ein Konstrukt, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; einen Vektor, der die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; ein Plasmid, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; ein Gewebe, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; ein Organ, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; einen transformierten Wirt, der die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann; einen transformierten Organismus, der die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder diese exprimieren kann. Die vorliegende Anmeldung umfasst auch Verfahren zur Expression derselben, wie die Expression in einem Mikroorganismus, einschließlich Verfahren zur Übertragung derselben.
Zur einfachen Bezugnahme werden Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter passenden Abschnittsüberschriften dis kutiert. Jedoch sind die Lehren in jedem Abschnitt nicht zwangsläufig auf jeden speziellen Abschnitt beschränkt.
Im folgenden Kommentar beziehen sich Bezugnahmen auf "Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" und "Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" auf eine oder mehrere der hier präsentierten oder diskutierten Nucleotidsequenzen bzw. eine oder mehrere der hier präsentierten oder diskutierten Aminosäuresequenzen. Auch bezeichnet der hier verwendete Ausdruck "Aminosäuresequenz" Peptid- oder Proteinsequenzen und er kann Teile derselben bezeichnen. Ferner ist der Ausdruck "Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" synonym mit der Phrase "Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung". Ferner ist der Ausdruck "Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" synonym mit der Phrase "Polynucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung".
Detaillierte Aspekte der vorliegenden Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung einer Aminosäuresequenz mit PDEXV-Aktivität (d.h. die den Abbau von cAMP und cGMP katalysieren kann), wobei die Aminosäuresequenz die als SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz oder eine Variante derselben umfasst, die Variante mindestens 95% Homologie mit der als SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz aufweist, und die mindestens 25 fortlaufende Aminosäuren der im folgenden angegebenen N-terminalen Sequenz umfasst:
SEQ ID NO: 1 ist die Aminosäuresequenz von PDEXV (die wir manchmal als PDE11A3 bezeichnen). PDEXV hat 684 Amino säuren. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, sind die mit vermutlichen cGMP-Bindungsmotiven (× 2) in Verbindung stehenden Aminosäuresequenzen unterstrichen. Das Vorhandensein von zwei cGMP-Bindungsmotiven bietet das Potential für eine unterschiedliche Regulation von Spleißvarianten.
Vorzugsweise hat die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung zwei cGMP-Bindungsmotive.
Zum Verständnis geben wir nun eine Tabelle an, die die für die Aminosäuren verwendeten Codes zeigt.
Zweckmäßigerweise wird die PDE der vorliegenden Erfindung manchmal als PDEXV oder PDExv bezeichnet.
Wir nehmen an, dass die PDE der vorliegenden Erfindung eine gestutzte Version von PDE11A1 ist. Die Sequenzen für PDE11A1 sind in den beigefügten Sequenzprotokollen zusammen mit PDE11A2, von dem wir annehmen, dass es eine Variante gemäß der PDE der vorliegenden Erfindung ist, angegeben.
Die PDE der vorliegenden Erfindung kann den Abbau von cAMP und cGMP katalysieren.
Für SEQ ID NO: 1 können eine oder mehrere der Aminosäuren ein Analogon derselben sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Analogon" bedeutet eine Sequenz mit einer zu der von SEQ ID NO: 1 ähnlichen Sequenz, in der jedoch unschädliche (d.h. für die enzymatische Aktivität nicht schädliche) Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen durchgeführt wurden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleotidsequenz mit Codierung für die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Vorzugsweise umfasst die Nucleotidsequenz die als SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz oder eine Variante derselben mit mindestens 95% Homologie zu derselben.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor, der die Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, bereitgestellt.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, in die die Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung eingearbeitet ist.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Testverfahren zur Identifizierung eines Mittels, das die PDEXV-Aktivität (d.h. eine Fähigkeit zur Katalyse des Abbaus von cAMP und cGMP) oder die PDEXV-Expression beeinflussen kann, bereitgestellt, wobei das Testverfahren das Kontaktieren eines Mittels mit einer Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung; und das Ermitteln der PDEXV-Aktivität oder -Expression umfasst, wobei ein Unterschied zwischen (a) der PDEXV-Aktivität oder -Expression in Abwesenheit des Mittels und (b) der PDEXV-Aktivität oder -Expression in Gegenwart des Mittels anzeigt, dass das Mittel die PDEXV-Aktivität oder -Expression beeinflussen kann.
Vorzugsweise dient der Test zum Screening auf Mittel, die bei der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung und/oder Erkrankungen, die sich in einem oder mehreren von Corpus cavernosum, Niere, Leber, Skelettmuskulatur, Hoden, Prostata finden, verwendbar sind.
PDEXV (PDE11A3)
Wie im vorhergehenden erklärt, betrifft die vorliegende Erfindung ein neues PDE-Enzym – das wir PDEXV nannten (das sonst als PDE11A3 ausgedrückt sein kann) – und eine dieses codierende Nucleotidsequenz. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen zur Bewertung und/oder zum Screening für Mittel, die Phosphodiesteraseaktivität modulieren können. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gentechnisch veränderte Wirtszellen, die die neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen umfassen oder exprimieren, zur Bewer tung und/oder zum Screening für Mittel, die Phosphodiesteraseaktivität modulieren können.
Es wird angenommen, dass PDEXV in einer Vielzahl von Quellen vorhanden und aus diesen erhältlich ist.
Beispielsweise findet sich PDEXV im kardiovaskulären System, in Corpus cavernosum, Niere, Leber, Skelettmuskulatur, Hoden, Prostata.
Wir nehmen auch an, dass PDEXV auch in einer Zahl anderer Quellen – beispielsweise bei Rindern, Schafen, Schweinen und Pferden – vorhanden ist.
Vorzugsweise ist die PDEXV Säuger-PDEXV, was die obigen Quellen umfasst, jedoch nicht auf eine derselben beschränkt ist.
Vorzugsweise ist die PDEXV humane PDEXV.
Die PDEXV kann gleich der natürlich vorkommenden Form – für diesen Aspekt ist die PDEXV die nicht-native Aminosäuresequenz (d.h. nicht in deren natürlicher Umgebung vorhanden) – oder eine Variante derselben sein. Außerdem oder alternativ ist die PDEXV isolierte PDEXV und/oder gereinigte PDEXV. Die PDEXV kann aus jeder geeigneten Quelle, ungeachtet dessen, ob sie natürlich ist oder nicht, erhältlich sein oder von dieser produziert werden, oder sie kann synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant sein.
Die PDEXV-Codierungssequenz kann gleich der natürlich vorkommenden Form – für diesen Aspekt ist die PDEXV-Codierungssequenz vorzugsweise die nicht-native Nucleotidsequenz (d.h. nicht in deren natürlicher Umgebung vorhanden) – oder eine Variante derselben sein. Außerdem oder alternativ ist die PDEXV-Codierungssequenz eine isolierte PDEXV-Codierungssequenz und/oder eine gereinigte PDEXV-Codierungssequenz. Die PDEXV-Codierungssequenz kann aus jeder geeigneten Quelle, ungeachtet dessen, ob sie natürlich ist oder nicht, erhältlich sein oder von dieser produziert werden, oder sie kann synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant sein.
Die PDEXV und/oder deren Codierungssequenz und/oder eine Sequenz, die mit dieser hybridisieren kann, sind zum Testen der Selektivität von Arzneimittelkandidaten zwischen unterschiedlichen PDEs verwendbar.
Es wird angenommen, dass PDEXV die Umwandlung von cGMP in GMP und von cAMP in AMP katalysieren kann.
cGMP ist der Botenstoff der männlichen erektilen Reaktion. Daher erhöht ein Hemmen der Aktivität von PDEXV wahrscheinlich die Konzentration des vorhandenen cGMP und kann so die männliche erektile Reaktion verstärken.
Daher können PDEXV und/oder deren Codierungssequenz und/oder eine Sequenz, die damit hybridisieren kann, zum Screening von Arzneimittelkandidaten zur Behandlung von männlicher erektiler Dysfunktion verwendbar sein. Außerdem wird angenommen, dass PDEXV und/oder deren Codierungssequenz und/oder eine Sequenz, die damit hybridisieren kann, zum Screening von Arzneimittelkandidaten zur Behandlung von weiblicher sexueller Dysfunktion verwendbar sind.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein rekombinantes PDEXV-Enzym und eine rekombinante Nucleotidsequenz mit Codierung für ein PDEXV-Enzym.
Vorzugsweise sind das rekombinante PDEXV-Enzym und/oder die rekombinante Nucleotidsequenz ein rekombinantes Säuger-PDEXV-Enzym und/oder eine rekombinante Säuger-Nucleotidsequenz.
Vorzugsweise sind das rekombinante PDEXV-Enzym und/oder die rekombinante Nucleotidsequenz ein rekombinantes humanes PDEXV-Enzym und/oder eine rekombinante humane Nucleotidsequenz.
Die Nucleotidsequenz mit Codierung für PDEXV oder das Enzym PDEXV selbst können einzeln oder beide zusammen zum Screening auf Mittel, die die PDEXV-Aktivität beeinflussen können, verwendet werden. Insbesondere können die Nucleotidsequenz mit Codierung für PDEXV oder PDEXV selbst zum Screening auf Mittel, die PDEXV-Aktivität hemmen können, verwendet werden. Außerdem können die Nucleotidsequenz mit Codierung für PDEXV oder das Enzym PDEXV selbst zum Screening auf Mittel, die PDEXV-Aktivität selektiv beeinflussen, beispielsweise die PDEXV-Aktivität selektiv hemmen, verwendet werden.
Ferner können die Nucleotidsequenz mit Codierung für PDEXV oder eine Sequenz, die hierzu komplementär ist, ebenfalls in Tests zur Detektion des Vorhandenseins von PDEXV-Codierungssequenzen in humanen Zellen verwendet werden. Diese Tests würden eine Information im Hinblick auf die Gewebeverteilung dieses Enzyms und dessen biologische Relevanz im Hinblick auf spezielle Erkrankungszustände ergeben.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Antikörper gegen PDEXV (einschließlich einer Variante desselben). Die Antikörper für PDEXV können in Tests zur Detektion des Vorhandenseins von PDEXV in humanen Zellen verwendet werden. Diese Tests würden eine Information im Hinblick auf die Gewebevertei lung dieses Enzyms und dessen biologische Relevanz im Hinblick auf spezielle Erkrankungszustände ergeben.
Insbesondere können eines oder mehrere der PDEXV-Isozyme, die Nucleotidsequenzen mit Codierung hierfür, die Nucleotidsequenzen, die hierzu komplementär sind, und die auf diese gerichteten Antikörper in Tests zum Screening auf Mittel, die eines der Isozyme selektiv beeinflussen, verwendet werden. Diese Tests würden eine Information im Hinblick auf die Gewebeverteilung der einzelnen Isozyme ergeben und eine Information im Hinblick auf die biologische Relevanz der einzelnen Isozyme in Bezug auf spezielle Erkrankungszustände ergeben. Diese Tests würden auch Bearbeitern die Möglichkeit geben, auf Mittel, die zur Beeinflussung der Expression oder Aktivität von PDEXV – beispielsweise in einem speziellen Gewebe oder bei einem speziellen Erkrankungszustand – verwendbar sind, zu testen und diese zu identifizieren.
POLYPEPTID DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Der Ausdruck "Polypeptid" – der mit dem Ausdruck "Protein" austauschbar ist – umfasst Einzelketten-Polypeptidmoleküle sowie Multipolypeptidkomplexe, wobei einzelne, als Bestandteile vorhandene Polypeptide durch kovalente oder nichtkovalente Mittel verknüpft sind.
Vorzugsweise ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein Einzelkettenpolypeptid.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer im wesentlichen isolierten Form sein. Es ist klar, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, die den geplanten Zweck des Polypeptids nicht stören, gemischt und noch als im wesentlichen isoliert betrachtet werden kann.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch in einer im wesentlichen gereinigten Form sein, wobei dies in diesem Fall allgemein das Polypeptid in einer Zubereitung, in der mehr als 90%, beispielsweise 95%, 98% oder 99% des Polypeptids in der Zubereitung ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist, umfasst. Polypeptide der vorliegenden Erfindung können beispielsweise durch die Zugabe von Histidinresten zur Unterstützung von deren Reinigung oder durch die Zugabe einer Signalsequenz zur Förderung von deren Sekretion aus einer Zelle, wie im folgenden diskutiert, modifiziert sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können mittels Synthese (beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Geysen et al., 1996) oder rekombinant, wie im folgenden beschrieben, hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz per se der vorliegenden Erfindung nicht die native PDEXV gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie in deren natürlicher Umgebung ist und wenn sie durch deren native Nucleotidcodierungssequenz, die ebenfalls in deren natürlicher Umgebung ist, exprimiert wurde und wenn die Nucleotidsequenz unter der Kontrolle von deren nativem Promotor, der ebenfalls in dessen natürlicher Umgebung ist, steht. Als einfachen Bezug nannten wir diese bevorzugte Ausführungsform die "nicht-native Aminosäuresequenz".
Die Ausdrücke "Variante", "Homologon" oder "Fragment" in Bezug auf die Aminosäuresequenz für das Enzym der vorliegenden Erfindung umfassen jede Substitution, Variation, Modifikation, jeden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäuren der oder in der oder an die Sequenz, vorausgesetzt, das gebildete Enzym hat PDEXV-Aktivität und ist vorzugsweise mindestens so biolo gisch aktiv wie das in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene Enzym. Insbesondere umfasst der Ausdruck "Homologon" Homologie in Bezug auf Struktur und/oder Funktion. In Bezug auf Sequenzhomologie besteht mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 98% Homologie zu der als SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz.
Die Variante der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens 25 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 45 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 65 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 85 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 105 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 125 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 145 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 165 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 185 fortlaufende Aminosäuren der im folgenden angegebenen N-terminalen Sequenz:
Typischerweise sollten für die Variante der vorliegenden Erfindung die Arten der Aminosäuresubstitutionen, die durchgeführt werden könnten, die Hydrophobie/Hydropholie der Aminosäuresequenz beibehalten. Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise mit 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen gemacht werden, vorausgesetzt, die modifizierte Sequenz behält die Fähigkeit zur Wirkung als PDE-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung bei. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht natürlich vorkommenden Analoga, beispielsweise zur Erhöhung der Halbwertszeit in Blutplasma, umfassen.
Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann durch Expression einer Nucleotidsequenz mit Codierung für diese in einem geeigneten Expressionssystem produziert werden.
Außerdem oder alternativ könnte das Protein selbst unter Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese einer PDE-Aminosäuresequenz insgesamt oder zum Teil produziert werden. Beispielsweise können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert, vom Harz abgespalten und durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt werden (beispielsweise Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman und Co, New York, NY). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder -sequenzierung (beispielsweise das Edman-Abbauverfahren) festgestellt werden.
Eine direkte Peptidsynthese kann unter Verwendung verschiedener Festphasentechniken durchgeführt werden (Roberge JY et al. (1995) Science 269: 202–204) und eine automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung des ABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anleitungen erreicht werden. Außerdem kann die Aminosäuresequenz von PDE oder einem Teil derselben während einer direkten Synthese geändert und/oder unter Verwendung von chemischen Verfahren mit einer Sequenz von anderen Untereinheiten oder einem Teil derselben kombiniert werden, um ein variantes Polypeptid zu produzieren.
In einer weiteren in der Anmeldung beschriebenen Ausführungsform kann eine natürliche, modifizierte oder rekombinante PDE-Sequenz an eine heterologe Sequenz zur Codierung eines Fusionsproteins ligiert werden. Beispielsweise kann es zum Screening von Peptidbibliotheken auf Inhibitoren von PDE-Aktivität günstig sein, für ein chimäres PDE- Protein, das ein heterologes Epitop exprimiert, das durch einen im Handel erhältlichen Antikörper erkannt wird, zu codieren. Ein Fusionsprotein kann auch technisch so verändert werden, dass es eine zwischen einer PDE-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz positionierte Spaltungsstelle enthält, so dass die PDE von der heterologen Einheit abgespalten und gereinigt werden kann. PDE kann auch als rekombinantes Protein mit einer oder mehreren zusätzlichen Polypeptiddomänen, die zur Erleichterung der Proteinreinigung angefügt sind, exprimiert werden. Derartige die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, metallchelatbildende Peptide, wie Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen erlauben (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3-26328 1), Protein-A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die in dem FLAGS-Extension/Affinitätsreinigungssystem genutzt wird (Immunex Corp, Seattle, WA). Das Einarbeiten einer spaltbaren Linkersequenz, beispielsweise Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen der Reinigungsdomäne und PDE ist zur Erleichterung der Reinigung günstig.
Eine spezifische Aminosäuresequenz von PDEXV ist als SEQ ID NO: 1 angegeben. Jedoch umfasst die vorliegende Erfindung Aminosäuresequenzen mit Codierung für andere Mitglieder der PDEXV-Familie, die Aminosäuresequenzen mit mindestens 95% Identität zu den speziellen Aminosäuresequenzen umfassen.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch so modifiziert werden, dass sie eine oder mehrere (beispielsweise mindestens 2, 3, 5 oder 10) Substitutionen, Deletionen oder Insertionen einschließlich konservierter Substitutionen enthalten. Diese Aspekte werden in einem späteren Abschnitt diskutiert.
NUCLEOTIDSEQUENZ DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Der hier verwendete Ausdruck "Nucleotidsequenz" bezeichnet eine Oligonucleotidsequenz oder Polynucleotidsequenz und Varianten derselben (wie Teile derselben). Die Nucleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, die von genomischer oder synthetischer oder rekombinanter Herkunft sein kann, die dopplsträngig oder einzelsträngig ungeachtet dessen, ob sie den Sense- oder Antisensestrang darstellt, sein kann.
Vorzugsweise bedeutet der Ausdruck "Nucleotidsequenz" DNA.
Noch günstiger bedeutet der Ausdruck "Nucleotidsequenz" DNA, die unter Verwendung von Gentechnik hergestellt wurde (d.h. rekombinante DNA).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleotidsequenz per se der vorliegenden Erfindung nicht die native Nucleotidcodierungssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in deren natürlicher Umgebung, wenn sie unter der Kontrolle von deren nativem Promotor ist, der ebenfalls in dessen nativer Umgebung ist. Als einfachen Bezug nannten wir diese bevorzugte Ausführungsform die "nicht-native Nucleotidsequenz".
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können synthetische oder modifizierte Nucleotide umfassen. Eine Zahl unterschiedlicher Arten einer Modifikation von Oligonucleotiden sind einschlägig bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorothioatgerüste, die Addition von Acridin oder Polylysinketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist klar, dass die hier beschriebenen Nucleotidsequenzen durch jedes einschlägig bekannte Verfahren modifi ziert sein können. Derartige Modifikationen können zur Verstärkung der In-vivo-Aktivität oder Lebensspanne von Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
Der Ausdruck "Variante" umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die mit den hier angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisieren können.
Vorzugsweise umfasst der Ausdruck "Variante" Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die unter stringenten Bedingungen (beispielsweise 65°C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 Na₃-Citrat, pH-Wert 7,0}) mit den hier angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisieren können.
Beispiele für Nucleinsäuren können alternativ als die Nucleotidsequenzen gekennzeichnet werden, die für ein PDEXV-Protein codieren und mit der DNA-Sequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, hybridisieren. Bevorzugt sind die Sequenzen mit Codierung für PDEXV, die unter hochstringenten Bedingungen mit der in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Sequenz oder dem Komplement derselben hybridisieren.
Die Ausdrücke "Variante", "Homologon" oder "Fragment" in Bezug auf die Nucleotidsequenz mit Codierung für das bevorzugte Enzym der vorliegenden Erfindung umfassen jede Substitution, Variation, Modifikation, jeden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Nucleinsäuren der oder in der oder an die Sequenz, vorausgesetzt, die gebildete Nucleotidsequenz codiert für ein Enzym mit PDEXV-Aktivität, das vorzugsweise mindestens so biologisch aktiv wie das durch die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Sequenzen codierte Enzym ist, oder ist zur Codierung dieses Enzyms fähig ist.
Insbesondere umfasst der Ausdruck "Homologon" Homologie in Bezug auf Struktur und/oder Funktion, vorausgesetzt, die gebildete Nucleotidsequenz codiert für ein Enzym mit PDEXV-Aktivität oder kann für dieses Enzym codieren. In Bezug auf Sequenzhomologie besteht mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 98% Homologie zu der als SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz.
Die Variante der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nucleotidsequenz, die für mindestens 25 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 45 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 65 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 85 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 105 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 125 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 145 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 165 fortlaufende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 185 fortlaufende Aminosäuren der folgenden N-terminalen Sequenz codiert:
Ein Beispiel für eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein Beispiel einer derartigen geeigneten N-terminalen Sequenz ist im folgenden angegeben:
Wie angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz (vorzugsweise eine cDNA-Sequenz) mit Codierung für PDEXV. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung cDNA-Sequenzen mit Codierung für PDEXV.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner DNA-Segmente, die die DNA-Sequenz der in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Sequenzen oder Allelvariationen derartiger Sequenzen umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die durch Expression in einer Wirtszelle, in die die im vorhergehenden genannten DNA-Sequenzen oder Allelvariationen derselben eingebaut wurden, produziert wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner DNA, die die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene DNA-Sequenz oder eine Allelvariation derselben umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner nicht-native DNA, die die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene DNA-Sequenz oder eine Allelvariation derselben umfasst.
Ein stark bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante DNA, die eine in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene DNA-Sequenz oder eine Allelvariation derselben umfasst.
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Nucleotidsequenzen mit Codierung für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung. Es ist klar, dass infolge der Entartung des genetischen Codes ein Bereich unterschiedlicher Polynucleotide eine gegebene Aminosäuresequenz codiert.
Bei Kenntnis der hier angegebenen Aminosäuresequenzen ist es möglich, partielle Nucleinsäuresequenzen und Nucleinsäuresequenzen voller Länge, wie cDNA- und/oder genomische Klone, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, anzugeben. Beispielsweise können Polynucleotide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von entarteter PCR, die Primer, die zur Zielrichtung auf Sequenzen mit Codierung für die hier angegebenen Aminosäuresequenzen gestaltet wurden, verwendet, erhalten werden. Die Primer enthalten typischerweise mehrere entartete Positionen. Jedoch werden zur Minimierung der Entartung Sequenzen gewählt, die für Regionen der hier angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, die Aminosäuren, wie Methionin, die nur durch ein einziges Triplett codiert werden, enthalten. Ferner werden Sequenzen unter Berücksichtigung der Codonverwendung in dem Organismus, dessen Nucleinsäure als die Templat-DNA für das PCR-Verfahren verwendet wird, gewählt. PCR wird unter Bedingungen einer niedrigeren Stringenz als sie zur Klonierung von Sequenzen mit Primern einer singulären Sequenz (nichtentarteten Primern) gegenüber bekannten Sequenzen verwendet werden, verwendet.
Nucleinsäuresequenzen, die mittels PCR erhalten wurden, die für Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung codieren, können dann zur Gewinnung größerer Sequenzen unter Verwendung von Hybridisierungs-Bibliotheks-Screening-Techniken verwendet werden. Beispielsweise kann ein PCR-Klon mit radioaktiven Atomen markiert und zum Screening einer cDNA- oder genomischen Bibliothek von anderen Arten, vorzugsweise anderen Säugerarten, verwendet werden. Die Hybridisierungsbedingungen sind typischerweise Bedingungen einer mittleren bis hohen Stringenz (beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C).
Entartete Nucleinsäuresonden mit Codierung für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz können ebenfalls zur Sondierung von cDNA- und/oder genomischen Bibliotheken von anderen Arten, vorzugsweise anderen Säugerarten, verwendet werden. Jedoch ist es günstig, zunächst PCR-Techniken durchzuführen, um eine einzige Sequenz zur Verwendung bei weiteren Sreeningverfahren zu erhalten.
Wie hier beschrieben, können PDEXV-Polynucleotidsequenzen, die für PDEXV codieren, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionale Äquivalente derselben zur Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle, die die Expression von PDEXV in geeigneten Wirtszellen dirigieren, verwendet werden. Aufgrund der inhärenten Entartung des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche oder eine funktional äquivalente Aminosäuresequenz codieren, zur Klonierung und Expression von PDEXV verwendet werden. Wie dem Fachmann klar ist, kann es vorteilhaft sein, PDE codierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die nicht natürlich vorkommende Codons besitzen. Codons, die von einem speziellen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt sind, (Murray E et al. (1989) Nuc Acids Res 17: 477–508) können beispielsweise zur Erhöhung der Rate der PDEXV-Expression oder zur Produktion rekombinanter RNA-Transkripte mit gewünschten Eigenschaften, wie längerer Halbwertszeit als ausgehend von einer natürlich vorkommenden Sequenz produzierte Transkripte, gewählt werden.
Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten wurden, können verwendet werden, um weitere homologe Sequenzen und Varianten unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken zu erhalten. Sie können auch zur Verwendung bei der Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Wirtszellsystemen, beispielsweise zur Optimierung von Codonpräferenzen für eine spezielle Wirtszelle, in der die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden, modifiziert werden. Andere Sequenzänderun gen können gewünscht sein, um Restriktionsenzymerkennungsstellen einzuführen oder die Eigenschaft oder Funktion der durch die Polynucleotide codierten Polypeptide zu ändern.
Geänderte PDEXV-Polynucleotidsequenzen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nucleotidreste, die zu einem Polynucleotid führen, das die gleiche oder eine funktional äquivalente PDE codiert. Das Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stumme Änderung ergeben und zu einer funktional äquivalenten PDE führen. Geplante Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophobie und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, sofern die biologische Aktivität von PDE erhalten bleibt. Beispielsweise umfassen negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst werden Allele von PDE. Der hier verwendete Ausdruck "Allel" oder "Allelsequenz" bedeutet eine alternative Form von PDE. Allele sind Folge einer Mutation, d.h. einer Änderung der Nucleinsäuresequenz, und sie ergeben allgemein geänderte mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur oder Funktion geändert sein kann oder auch nicht. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele Allelformen haben. Häufige Mutationsänderungen, die zu Allelen führen, werden allgemein Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren zugeschrieben. Jede dieser Arten von Veränderungen kann allein oder in einer Kombination mit den anderen einmal oder mehrere Male in einer gegebenen Sequenz auftreten.
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können technisch verändert werden, um eine PDE-Codierungssequenz aus einer Vielzahl von Gründen, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Änderungen, die die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren, umfassen, zu ändern. Beispielsweise können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die einschlägig bekannt sind, beispielsweise positionsspezifische Mutagenese zur Insertion neuer Restriktionsstellen, zur Änderung von Glykosylierungsmustern oder zur Änderung von Codonpräferenz eingeführt werden.
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung eines Primers, beispielsweise eines PCR-Primers, eines Primers für eine alternative Amplifikationsreaktion, einer Sonde, die beispielsweise mit einer Erkennungsmarkierung durch herkömmliche Mittel unter Verwendung von radioaktiven oder nichtradioaktiven Markierungen markiert ist, verwendet werden, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Derartige Primer, Sonden und andere Fragmente besitzen eine Länge von mindestens 25, vorzugsweise mindestens 30 oder 40 Nucleotiden und werden ebenfalls durch den hier verwendeten Ausdruck Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfasst.
Polynucleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung können eine Erkennungsmarkierung tragen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Protenmarkierungen, wie Biotin. Derartige Markierungen können an die Polynucleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung addiert und unter Verwendung von als solchen bekannten Verfahren detektiert werden.
Polynucleotide, wie ein DNA-Polynucleotid, und Primer gemäß der vorliegenden Erfindung können rekombinant, durch Synthese oder jedes dem Fachmann verfügbare Mittel hergestellt werden. Sie können auch durch Standardtechniken kloniert werden.
Allgemein werden Primer mittels Synthese hergestellt, was eine stufenweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz mit jeweils einem Nucleotid umfasst. Techniken zur Durchführung desselben unter Verwendung automatisierter Techniken sind ohne weiteres einschlägig verfügbar.
Längere Polynucleotide werden allgemein unter Verwendung rekombinanter Mittel, beispielsweise unter Verwendung von PCR(Polymerasekettenreaktion)-Klonierungstechniken hergestellt. Dies umfasst die Herstellung eines Primerpaars (von beispielsweise etwa 15–30 Nucleotiden) für eine Region der Nucleotidsequenz, deren Klonierung gewünscht wird, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die von einer Pilz-, Pflanzen- oder prokaryotischen Zelle erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region erbringen, das Isolieren des amplifizierten Fragments (beispielsweise durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und das Gewinnen der amplifizierten DNA. Die Primer können so gestaltet werden, dass sie geeignete Restriktionsenzymerkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
DNA-Moleküle können zur Erhöhung der intrazellulären Stabilität und Lebensdauer modifiziert werden. Mögliche Modifikationen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Addition von flankierenden Sequenzen der 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-O-Methyl statt der Phosphodiesteraseverknüpfungen im Rückgrat des Moleküls.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ferner Nucleotidsequenzen, die mit der gesamten oder einem Teil der Sequenz, die in dem beigefügten Sequenzprotokoll angegeben ist, oder einer Allelvariation derselben hybridisieren können. Diese Nucleotidsequenzen können in Antisense-Verfahren zur Modifizierung der PDEXV-Expression verwendet werden. Alternativ können diese Sequenzen (oder Teile derselben) als Sonde oder zur Amplifikation der gesamten oder eines Teils einer derartigen Sequenz bei Verwendung als Polymerasekettenreaktion-Primer verwendet werden.
Zusätzlich zu den rekombinanten DNA-Sequenzen sind genomische Sequenzen auch im Kontext der Entdeckung von Arzneimitteln von Nutzen. Es kann von Nutzen sein, die mRNA-Transkription einer speziellen Isoform zu hemmen, statt deren translatiertes Protein zu hemmen. Dies kann für PDEXV zutreffen, wenn Spleißvarianten vorhanden sind und wobei diese unterschiedlichen Spleißvarianten von unterschiedlichen Promotoren transkribiert werden können. Es gibt den Präzedenzfall mehrerer Promotoren, die die Transkription einer 2',3'-cyclisches-Nucleotid-3'-Phosphodiesterase von Maushirn dirigieren (Kurihara T et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170: 1074 [1990]).
Eine weitere Nutzbarkeit der Erfindung besteht darin, dass die DNA-Sequenzen, wenn sie bekannt sind, die benötigte Information liefern, um Assays zur spezifischen Detektion von Isoenzymen oder Spleißvarianten zu gestalten. Isozym-spezifische PCR-Primerpaare sind nur ein Beispiel für einen Assay, der vollständig von der Kenntnis der spezifischen DNA-Sequenz des Isozyms oder der Spleißvariante abhängt.
Ein derartiger Assay ermöglicht die Detektion von mRNA für das Isozym unter Zugang zur Gewebeverteilung und biologischen Relevanz jedes Isozyms für einen speziellen Erkrankungszustand. Er ermöglicht auch die Identifizierung von Zelllinien, die von Natur aus nur ein Isozym exprimieren können – eine Entdeckung, die die Notwendigkeit der Expression rekombinanter Gene überflüssig machen kann. Wenn für spezifische PDEXV-Isozyme gezeigt wird, dass sie mit einem speziellen Erkrankungszustand in Verbindung stehen, wäre die Erfindung zur Gestaltung von diagnostischen Tests zur Detektion des Vorhandenseins von Isozym-mRNA nutzbar.
Eine anomale Menge von Nucleotidsequenzen mit Codierung für eine PDEXV in einer biologischen Probe kann eine chromosomale Aberration, wie eine Nucleinsäuredeletion oder -mutation, widerspiegeln. Daher können Nucleotidsequenzen mit Codierung für eine PDEXV die Basis für Sonden liefern, die diagnostisch zur Detektion chromosomaler Aberrationen, wie Deletionen, Mutationen oder chromosomaler Translokationen im Gen mit Codierung für PDE verwendet werden. Die PDEXV-Genexpression kann bei derartigen Erkrankungszständen geändert sein oder es kann in der Region des Gens mit Codierung für eine PDEXV eine chromosomale Aberration vorhanden sein.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die Codierungssequenz von PDE insgesamt oder teilweise unter Verwendung von einschlägig bekannten chemischen Verfahren synthetisiert werden (siehe Caruthers MH et al., (1990) Nuc Acids Res Symp Ser 215–23, Horn T et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225–232).
NATÜRLICH VORKOMMEND
Der hier verwendete Ausdruck "natürlich vorkommend" be zeichnet eine PDEXV mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur gefunden wird.
ISOLIERT/GEREINIGT
sDie hier verwendeten Ausdrücke "isoliert" und "gereinigt" bezeichnen Moleküle, entweder Nuclein- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt und isoliert oder von mindestens einer anderen Komponente, mit der sie natürlicherweise verbunden sind, abgetrennt sind.
BIOLOGISCH AKTIV
Der hier verwendete Ausdruck "biologisch aktiv" bezeichnet eine PDEXV gemäß der vorliegenden Erfindung – beispielsweise eine rekombinante PDEXV – mit einer gegenüber natürlich vorkommender PDEXV ähnlichen strukturellen Funktion (jedoch nicht zwangsläufig im gleichen Grad) und/oder ähnlichen regulatorischen Funktion (jedoch nicht zwangsläufig dem gleichen Grad) und/oder einer ähnlichen biochemischen Funktion (jedoch nicht zwangsläufig dem gleichen Grad) und/oder immunologischer Aktivität (jedoch nicht zwangsläufig dem gleichen Grad). Speziell hat die PDEXV der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit der Hydrolyse eines cyclischen Nucleotids, was eine der charakteristischen Aktivitäten des PDE-Enzmys der vorliegenden Erfindung ist. Noch spezieller kann die PDEXV der vorliegenden Erfindung den Abbau von cAMP und cGMP katalysieren.
IMMUNOLOGISCHE AKTIVITÄT
Der hier verwendete Ausdruck "immunologische Aktivität" ist als die Fähigkeit der natürlichen, rekombinanten oder synthetischen PDEXV oder eines beliebigen Oligopeptids derselben zur Induktion einer spezifischen Immunreaktion bei entsprechenden tierischen Lebewesen oder Zellen und zur Bindung an spezifische Antikörper definiert.
DERIVAT
Der hier in Bezug auf die Aminosäuresequenz verwendete Ausdruck "Derivat" umfasst eine chemische Modifikation einer PDEXV. Beispiele für derartige Modifikationen sind der Ersatz von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe.
DELETION
Der hier verwendete Ausdruck "Deletion" ist als eine Änderung in entweder einer Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, bei der ein oder mehrere Nucleotide bzw. Aminosäurereste nicht vorhanden sind, definiert.
INSERTION/ADDITION
Der hier verwendete Ausdruck "Insertion" oder "Addition" ist eine Änderung in einer Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, die im Vergleich zur natürlich vorkommenden PDE zur Addition von einem oder mehreren Nucleotiden bzw. Aminosäureresten führte.
SUBSTITUTION
Der hier verwendete Ausdruck "Substitution" ergibt sich durch das Ersetzen eines oder mehrerer Nucleotide oder einer oder mehrerer Aminosäuren durch unterschiedliche Nucleotide bzw. Aminosäuren.
HOMOLOGON
Der Ausdruck "Homologon" in Bezug auf die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann mit Allelvariationen der Sequenzen synonym sein.
Insbesondere kann der hier verwendete Ausdruck "Homologie" mit dem Ausdruck "Identität" gleichgesetzt werden. Hierbei kann eine Sequenzhomologie in Bezug auf die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch einen einfachen "Augapfel"-Vergleich (d.h. einen strikten Vergleich) von einer oder mehreren der Sequenzen mit einer anderen Sequenz, um zu sehen, ob die andere Sequenz mindestens 95% Identität mit der Sequenz bzw. den Sequenzen hat, bestimmt werden. Eine relative Sequenzhomologie (d.h. Sequenzidentität) kann auch durch im Handel erhältliche Computerprogramme, die die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen, bestimmt werden. Ein typisches Beispiel für ein derartiges Computerprogramm ist CLUSTAL.
Die prozentuale Homologie kann über fortlaufende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird mit der anderen Sequenz aliniert und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der anderen entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz, jeweils Rest für Rest, verglichen. Dies wird als "lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden derartige lückenlosen Alignments nur über eine relative kurze Zahl von Resten (beispielsweise weniger als 50 fortlaufende Aminosäuren) durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, dass beispielsweise in einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirkt, dass die folgenden Aminosäurereste aus dem Alignment fallen, was daher potentiell zu einer großen Verringerung der prozentualen Homologie führt, wenn ein globales Alignment durchgeführt wird. Infolgedessen sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, dass sie optimale Alignments ergeben, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne die Gesamthomologiepunktezahl unangemessen abzustrafen. Dies wird durch die Insertion von "Lücken" in dem Sequenzalignment in einem Versuch zur Maximierung lokaler Homologie erreicht.
Diese komplexeren Verfahren ordnen jedoch "Lückenstrafpunkte" jeder Lücke, die im Alignment auftritt, derart zu, dass bei der gleichen Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenzalignment mit möglichst wenig Lücken – das einen höheren Verwandschaftsgrad zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – eine höhere Punktezahl als eines mit vielen Lücken erreicht. "Affine Lückenkosten" werden typischerweise verwendet, die relativ hohe Kosten für die Existenz einer Lücke und weniger Strafpunkte für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke anrechnen. Dies ist das am häufigsten verwendete Lückenpunktewertungssystem. Hohe Lückenstrafpunkte ergeben natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken. Die meisten Alignmentprogramme ermöglichen eine Modifizierung von Lückenstrafpunkten. Es ist jedoch günstig, die Fehlwerte zu verwenden, wenn derartige Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Beispielsweise beträgt bei Verwendung des GCG Wisconsin Bestfit-Pakets (siehe im folgenden) der Fehllückenstrafpunkt für Aminosäuresequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Verlängerung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert daher zunächst die Bildung eines optimalen Alignment unter Berücksichtigung von Lückenstrafpunkten. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung eines derartigen Alignment ist das GCG Wisconsin Bestfit-Paket (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibid – Kapitel 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403–410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für Offline- und Online-Recherche verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibid, S. 7–58 bis 7–60). Jedoch wird für einige Anwendungen vorzugsweise das GCG-Bestfit-Programm verwendet.
Obwohl die endgültige prozentuale Homologie in Form der Identität ermittelt werden kann, beruht das Alignment-Verfahren selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine Punktematrix abgestufter Ähnlichkeit verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf der Basis der chemischen Ähnlichkeit oder des evolutionären Abstands Punkte zuordnet. Ein Beispiel für eine derartige üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Mängelmatrix für die BLAST-Programmreihe. GCG Wisconsin-Programme verwenden allgemein entweder die allgemein bekannten Mängelwerte oder eine ggf. eingegebene Kundensymbolvergleichstabelle (siehe Nutzerhandbuch für weitere Einzelheiten). Vorzugsweise werden die allgemein bekannten Mängelwerte für das GCG-Paket oder im Falle anderer Software die Mängelmatrix, wie BLOSUM62, verwendet.
Wenn die Software ein optimales Alignment gebildet hat, ist es möglich, die prozentuale Homologie, vorzugsweise prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs aus und generiert ein numerisches Ergebnis.
Wie angegeben, kann für einige Anwendungen die Sequenzhomologie (oder Identität) unter Verwendung eines geeigneten Homologiealgorithmus unter Verwendung von beispielsweise Mängelparametern bestimmt werden. Zur Diskussion grundlegender Punkte bei einer Ähnlichkeitsrecherche von Sequenzdatenbanken siehe Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6: 119–129. Für einige Anwendungen wird der BLAST-Algorithmus mit für Mängelwerte eingestellten Parametern verwendet. Der BLAST-Algorithmus ist detailliert bei http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html beschrieben. Vorteilhafterweise entspricht "wesentliche Homologie", wenn dies durch BLAST festgestellt wurde, Sequenzen, die mit einem EXPECT-Wert von mindestens etwa 7, vorzugsweise mindestens etwa 9 und noch besser 10 oder mehr übereinstimmen. Der Mängelschwellenwert für EXPECT bei BLAST-Recherche beträgt üblicherweise 10.
Sollten Lückenstrafpunkte bei der Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden, werden vorzugsweise die folgenden Parameter verwendet:
Andere Computerprogrammverfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, das GCG-Programmpaket (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12: 387) und FASTA (Altschul et al. (1990) J Molec Biol 403–410).
POLYPEPTIDVARIANTEN UND DERIVATE
Die Ausdrücke "Variante" oder "Derivat" in Bezug auf die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Substitution, Variation, Modifikation, einen Austausch, eine Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäuren an der oder in der Sequenz, vorausgesetzt, die gebildete Aminosäuresequenz weist PDE-Aktivität auf, wobei sie vorzugsweise mindestens die gleiche Aktivität wie das im Sequenzprotokoll angegebene Polypeptid aufweist.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Typischerweise werden Modifikationen durchgeführt, die die PDE-Aktivität der Sequenz beibehalten. Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen durchgeführt werden, vorausgesetzt, die modifizierte Sequenz behält die PDE-Aktivität bei. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht natürlich vorkommenden Analoga, beispielsweise zur Erhöhung der Halbwertszeit eines therapeutisch verabreichten Polypeptids in Blutplasma, umfassen.
Konservative Substitutionen können beispielsweise entsprechend der folgenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren im gleichen Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen Zeile in der dritten Spalte können gegeneinander ausgetauscht werden:
Wie oben angegeben, werden Proteine der Erfindung typischerweise durch rekombinante Mittel, beispielsweise wie hier beschrieben, und/oder unter Verwendung von Synthesemitteln unter Verwendung dem Fachmann bekannter Verfahren, wie Festphasensynthese, hergestellt. Varianten und Derivate derartiger Sequenzen umfassen Fusionsproteine, wobei die Fusionsproteine mindestens die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung an eine weitere Aminosäuresequenz (direkt oder indirekt) gebunden umfassen. Diese anderen Aminosäuresequenzen – die manchmal als Fusionsproteinpartner bezeichnet werden – verleihen typischerweise eine günstige Funktionalität – beispielsweise zur Unterstützung der Extraktion und Reinigung der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung. Beispiele für Fusionsproteinpartner umfassen Glutathion-S-Transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomänen) und β-Galactosidase. Es kann auch günstig sein, eine proteolytische Spaltungsstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz der vorliegenden Erfindung einzuarbeiten, um eine Entfernung der letzteren zu ermöglichen. Vorzugsweise hindert der Fusionsproteinpartner die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung nicht.
POLYNUCLEOTIDVARIANTEN UND -DERIVATE
Die Ausdrücke "Variante" oder "Derivat" in Bezug auf die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen eine Substitution, Variation, Modifikation, einen Austausch, eine Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Nucleinsäuren an der oder in der Sequenz, vorausgesetzt, die gebildete Nucleotidsequenz codiert für ein Polypeptid mit PDE-Aktivität, vorzugsweise mit mindestens der gleichen Aktivität wie in dem Sequenzprotokoll angegebene Sequenzen.
Wie oben angegeben, besteht in Bezug auf Sequenzhomologie zweckmäßigerweise mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 98% Homologie mit den hier im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen. Nucleotidhomologievergleiche können wie oben beschrieben durchgeführt werden. Für einige Anwendungen ist ein bevorzugtes Sequenzvergleichsprogramm das oben beschriebene GCG Wisconsin Bestfit-Programm. Die Mängelpunktematrix hat einen Übereinstimmungswert 10 für jedes identische Nucleotid und –9 für jede Nichtübereinstimmung. Der Mängellückenerzeugungsstrafpunkt beträgt –50 und der Mängellückenverlängerungsstrafpunkt beträgt –3 für jedes Nucleotid.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Variante", "Homologon", "Fragment" und "Derivat" umfassen Allelvariationen der Sequenzen.
Der Ausdruck "Variante" umfasst auch Sequenzen, die zu Sequenzen, die mit den hier angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisieren können, komplementär sind.
Hybridisierung
Der hier verwendete Ausdruck "Hybridisierung" soll "den Prozess, durch den sich ein Nucleinsäurestrang mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) sowie den Prozess der Amplifikation, der bei Polymerasekettenreaktionstechniken durchgeführt wird, gemäß der Beschreibung bei Dieffenbach CW und GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) umfassen.
Die Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäurebindungskomplexes gemäß der Lehre in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego CA) und verleihen eine definierte "Stringenz", wie im folgenden erklärt wird.
Die Hybridisierungsstringenz bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen Polynucleinsäurehybride stabil sind. Diese Bedingungen sind dem Fachmann üblicher Erfahrung klar. Wie dem Fachmann bekannt ist, spiegelt sich die Stabilität von Hybriden in der Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids, die um etwa 1 bis 1,5°C mit jeweils einer Abnahme der Sequenzhomologie von 1% abnimmt. Allgemein ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter den Bedingungen höherer Stringenz durchgeführt, worauf Waschvorgänge variierender Stringenz folgen.
Die hier verwendete hohe Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die die Hybridisierung nur der Nucleinsäuresequenzen, die stabile Hybride in 1 M Na⁺ bei 65–68°C bilden, ermöglichen.
Maximale Stringenz tritt typischerweise bei etwa Tm – 5°C (5°C unter dem Tm-Wert der Sonde) auf.
Hohe Stringenz bedeutet bei etwa 5°C bis 10°C unter dem Tm-Wert der Probe. Bedingungen hoher Stringenz können beispielsweise durch Hybridisierung in einer wässrigen Lösung, die 6 × SSC, 5 × Denhardt's, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1 Na⁺-Pyrophosphat und 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA als nichtspezifischen Kompetitor enthält, bereitgestellt werden. Nach der Hybridisierung kann ein Waschen mit hoher Stringenz in mehreren Stufen mit einem letzten Waschen (etwa 30 min) bei der Hybridisierungstemperatur in 0,2–0,1 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt werden.
Moderate oder mittlere Stringenz tritt typischerweise bei etwa 10°C bis 20°C unter dem Tm-Wert der Sonde auf.
Niedrige Stringenz tritt typischerweise bei etwa 20°C bis 25°C unter dem Tm-Wert der Sonde auf.
Wie dem Fachmann klar ist, kann eine Hybridisierung maximaler Stringenz zur Identifizierung oder Detektion identischer Polynucleotidsequenzen verwendet werden, während eine Hybridisierung mittlerer (oder niedriger) Stringenz zur Identifizierung oder Detektion ähnlicher oder verwandter Polynucleotidsequenzen verwendet werden kann.
Moderate Stringenz bezeichnet Bedingungen, die zu einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung äquivalent sind, jedoch bei etwa 60–62°C. In diesem Fall wird das letzte Waschen bei der Hybridisierungstemperatur in 1 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt.
Niedrige Stringenz bezeichnet Bedingungen, die zu einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung äquivalent sind, jedoch bei 50–52°C. In diesem Fall wird das letzte Waschen bei der Hybridisierungstemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt.
Es ist klar, dass diese Bedingungen unter Verwendung einer Vielzahl von Puffern, beispielsweise Puffern auf Formamidbasis, und Temperaturen angepasst und dupliziert werden können. Denhardt-Lösung und SSC sind dem Fachmann bekannt, sowie auch andere geeignete Hybridisierungspuffer (siehe beispielsweise Sambrook et al., Hrsg. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, oder Aushubel et al., Hrsg. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Optimale Hybridisierungsbedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Länge und der GC-Gehalt der Sonde ebenfalls eine Rolle spielen.
Polynucleotide der Erfindung, die mit den hier angegebenen Nucleotidsequenzen oder deren Komplement selektiv hybridisieren können, sind zu mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 98%, homolog zu den hier angegebenen entsprechenden Nucleotidsequenzen über eine Region von mindestens 25, vorzugsweise mindestens 30, beispielsweise mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr fortlaufenden Nucleotiden.
Der Ausdruck "selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass das als Sonde verwendete Polynucleotid unter Bedingungen verwendet wird, von denen ermittelt wurde, dass ein Zielpolynucleotid der Erfindung mit der Sonde in einem signifikant über dem Hintergrund liegenden Niveau hybridisiert. Die Hintergrundhybridisierung kann auftreten, da andere Nucleotide beispielsweise in der cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek, die gescreent wird, vorhanden sind. In diesem Fall impliziert Hintergrund eine Höhe eines Signals, das durch Wechselwirkung zwischen der Sonde und einem nichtspezifischen DNA-Element der Bibliothek erzeugt wurde, das weniger als 10-mal, vorzugsweise weniger als 100-mal, so intensiv wie die mit der Ziel-DNA beobachtete spezifische Wechselwirkung ist. Die Intensität der Wechselwirkung kann beispielsweise durch radioaktive Markierung der Sonde, beispielsweise mit ³²P, ermittelt werden.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch Nucleotidsequenzen, die mit einer oder mehreren der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen (beispielsweise 65°C und 0,1 × SSC) (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-Citrat, pH-Wert 7,0) hybridisieren können.
Wenn das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung doppelsträngig ist, werden beide Stränge der Doppelhelix entweder individuell oder in Kombination von der vorliegenden Erfindung umfasst. Wenn das Polynucleotid einsträngig ist, soll die komplementäre Sequenz des Polynucleotids ebenfalls vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst sein.
Polynucleotide, die nicht zu 100% homolog zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind, jedoch in den Umfang der Erfindung fallen, können auf eine Anzahl von Wegen erhalten werden. Andere Varianten der hier beschriebenen Sequenzen können beispielsweise durch Sondierung von DNA-Bibliotheken, die für einen Bereich von Individuen, beispielsweise Individuen unterschiedlicher Populationen, hergestellt wurden, erhalten werden. Ferner können andere virale/bakterielle oder zelluläre Homologa, insbesondere zelluläre Homologa, die sich in Säugerzellen (beispielsweise Ratten-, Maus-, Rinder- und Primatenzellen) finden, erhalten werden, und derartige Homologa und Fragmente derselben sind allgemein zur selektiven Hybridisierung mit den im Sequenzprotokoll hier angegebenen Sequenzen fähig. Derartige Sequenzen können durch Sondierung von cDNA-Bibliotheken, die aus genomischen DNA-Bibliotheken anderer Tierarten hergestellt wurden, oder Sondierung letzterer und Sondierung derartiger Bibliotheken mit Sonden, die die gesamte oder einen Teil der Sequenz in dem beigefügten Sequenzprotokoll umfassen, unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz erhalten werden. Ähnliche Überlegungen gelten für die Gewinnung von Artenhomologa und Allelvarianten der Polypeptid- oder Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung.
Varianten und Stamm/Artenhomologa können auch unter Verwendung von entarteter PCR, die Primer verwendet, die so gestaltet sind, dass sie auf Sequenzen in den Varianten und Homologa mit Codierung für konservierte Aminosäuresequenzen in den Sequenzen der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, erhalten werden. Konservierte Sequenzen können beispielsweise durch Alinieren der Aminosäuresequenzen von mehreren Varianten/Homologa vorhergesagt werden. Sequenzalignments können unter Verwendung von einschlägig bekannter Computersoftware durchgeführt werden. Beispielsweise wird das GCG Wisconsin PileUP-Programm in weitem Umfang verwendet.
Die bei entarteter PCR verwendeten Primer enthalten eine oder mehrere entartete Positionen und werden unter Bedingungen einer niedrigeren Stringenz als sie zur Klonierung von Sequenzen mit Einzelsequenzprimern für bekannte Sequenzen verwendet werden, verwendet.
Alternativ können derartige Polynucleotide durch positionsspezifische Mutagenese charakterisierter Sequenzen erhalten werden. Dies kann günstig sein, wenn beispielsweise stumme Codonänderungen für Sequenzen zur Optimierung von Codonpräferenzen für eine spezielle Wirtszelle, in der die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden, erforderlich sind. Andere Sequenzänderungen können zur Einführung von Restriktionsenzymerkennungsstellen oder zur Änderung der Eigenschaft oder Funktion der durch die Polynucleotide codierten Polypeptide gewünscht sein.
Polynucleotide der Erfindung können zur Herstellung eines Primers, beispielsweise eines PCR-Primers, eines Primers für eine alternative Amplifikationsreaktion, einer Sonde, die beispielsweise mit einer durch herkömmliche Mittel erkennbaren Markierung unter Verwendung von radioaktiven oder nichtradioaktiven Markierungen markiert ist, verwendet werden, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Derartige Primer, Sonden und andere Fragmente weisen eine Länge von mindestens 25, vorzugsweise mindestens 30 oder 40 Nucleotiden auf und werden ebenfalls von dem hier verwendeten Ausdruck Polynucleotide der Erfindung umfasst.
Polynucleotide wie DNA-Polynucleotide und Sonden gemäß der Erfindung können rekombinant, durch Synthese oder jedes dem Fachmann verfügbare Mittel hergestellt werden. Sie können auch durch Standardtechniken kloniert werden.
Allgemein werden Primer mittels Synthese hergestellt, die eine stufenweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz, jeweils Nucleotid für Nucleotid, umfasst. Techniken hierfür unter Verwendung automatisierter Verfahren sind ohne weiteres einschlägig verfügbar.
Längere Polynucleotide werden allgemein unter Verwendung rekombinanter Mittel, beispielsweise unter Verwendung von PCR(Polymerasekettenreaktion)-Klonierungsverfahren hergestellt. Dies umfasst das Herstellen eines Primerpaars (von beispielsweise etwa 15 bis 30 Nucleotiden), das eine Region der Lipidtargetingsequenz, deren Klonierung gewünscht wird, flankiert, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer Tier- oder humanen Zelle erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region erbringen, das Isolieren des amplifizierten Fragments (wie beispielsweise Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und das Gewinnen der amplifizierten DNA. Die Primer können derart gestaltet werden, dass geeignete Restriktionsenzymerkennungsstellen, die eine Klonierung der amplifizierten DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor ermöglichen, enthalten sind.
REGULATORISCHE SEQUENZEN
Vorzugsweise ist das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung funktional mit einer regulatorischen Sequenz, die die Expression der Codierungssequenz, beispielsweise durch die gewählte Wirtszelle, bereitstellen kann, verknüpft. Beispielsweise umfasst die vorliegende Erfindung einen Vektor, der das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung funktional mit einer derartigen regulatorischen Sequenz verknüpft umfasst, d.h. der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Der Ausdruck "funktional verknüpft" bezeichnet eine Nebeneinanderstellung, bei der die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen ermöglicht, in der geplanten Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die mit einer Codierungssequenz "funktional verknüpft" ist, ist derart ligiert, dass die Expression der Codierungssequenz unter einer mit den Kontrollsequenzen kompatiblen Bedingung erreicht wird.
Der Ausdruck "regulatorische Sequenzen" umfasst Promotoren und Enhancer und andere Expressionsregulationssignale.
Der Ausdruck "Promotor" wird im normalen einschlägigen Sinn verwendet, beispielsweise eine RNA-Polymerasebindungsstelle.
Eine verstärkte Expression des Polynucleotids mit Codierung für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch durch die Selektion heterologer regulatorischer Regionen, beispielsweise Promotor-, Sekretionsleader- und Terminatorregionen, die zur Erhöhung der Expression und, falls gewünscht, Sekretionsmengen des interessierenden Proteins von dem gewählten Expressionswirt und/oder zur Bereitstellung der induzierbaren Kontrolle der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung dienen, erreicht werden.
Vorzugsweise kann die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit mindestens einem Promotor funktional verknüpft sein.
Außer dem für das Gen mit Codierung für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nativen Promotor können andere Promotoren zum Dirigieren der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Promotor kann im Hinblick auf dessen Effizienz zum Dirigieren der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in dem gewünschten Expressionswirt gewählt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor zum Dirigieren der Expression des gewünschten Polypeptids der vorliegenden Erfindung gewählt werden. Ein derartiges Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile bieten, da es die Notwendigkeit einer Kultur der Expressionswirte auf einem ein induzierendes Substrat enthaltenden Medium umgeht.
Beispiele für stark konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die zur Verwendung in Pilzexpressionswirten bevorzugt sind, sind diejenigen, die aus den Pilzgenen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase, Subunit 9 (oliC), Triosephosphatisomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (AdhA), α-Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG – von dem glaA-Gen), Acetamidase (amdS) erhältlich sind, und Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase(gpd)-Promotoren.
Beispiele für starke Hefepromotoren sind diejenigen, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
Beispiele für starke Bakterienpromotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren sowie Promotoren von Genen extrazellulärer Protease.
Hybridpromotoren können ebenfalls zur Verbesserung der induzierbaren Regulation des Expressionskonstrukts verwendet werden.
Der Promotor kann zusätzlich Merkmale zur Sicherstellung oder Erhöhung der Expression in einem geeigneten Wirt umfassen. Beispiele können die Merkmale konservierter Regionen, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box, sein. Der Promotor kann auch andere Sequenzen zur Beeinflussung (beispielsweise Beibehaltung, Erhöhung, Verminderung) der Expressionsgrade der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung enthalten. Beispielsweise umfassen geeignete andere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente – beispielsweise durch Temperatur, auf chemischem Weg, durch Licht oder Stress induzierbare Elemente. Auch können geeignete Elemente zur Verstärkung der Transkription oder Translation vorhanden sein. Ein Beispiel für das letztere Element ist die TMV-5'-Signalsequenz (siehe Sleat Gene 217 [1987] 217–225; und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
SEKRETION
Häufig ist es günstig, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung von dem Expressionswirt in das Kulturmedium sezerniert wird, aus dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung recht leicht gewonnen werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sekretionsleadersequenz auf der Basis des gewünschten Expressionswirts gewählt werden. Hybridsignalsequenzen können ebenfalls im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Typische Beispiele für heterologe Sekretionsleadersequenzen sind diejenigen, die von dem fungalen Amyloglucosidase[AG]-Gen (glaA – sowohl die Version mit 18 als auch mit 24 Aminosäuren von beispielsweise Aspergillus), dem a-Faktorgen (Hefen, beispielsweise Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylasegen (Bacillus) stammen.
KONSTRUKTE
Der Ausdruck "Konstrukt" – der mit Ausdrücken wie "Konjugat", "Kassette" und "Hybrid" synomyn ist, umfasst die Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung direkt oder indirekt an einen Promotor gebunden. Ein Beispiel für eine indirekte Bindung bzw. Befestigung ist die Bereitstellung einer geeigneten Abstandsgruppe, wie einer Intronsequenz, wie das Sh1-Intron oder das ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung. Das gleiche gilt für den, Ausdruck "fusioniert" in Bezug auf die vorliegende Erfindung, was eine direkte oder indirekte Bindung bzw. Befestigung umfasst. In jedem Fall umfassen die Ausdrücke nicht die natürliche Kombination der Nucleotidsequenz mit Codierung für das Protein in üblicher Verbindung mit dem Promotor des Wildtypgens und für den Fall, dass sie beide in ihrer natürlichen Umgebung sind.
Das Konstrukt kann auch einen Marker enthalten oder ex primieren, der eine Selektion des Genkonstrukts in beispielsweise einem Bakterium, vorzugsweise der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis, oder Pflanzen, in die es übertragen wurde, ermöglicht. Es existieren verschiedene Marker, die verwendet werden können, beispielsweise solche mit Codierung für Mannose-6-phosphatisomerase, (insbesondere für Pflanzen) oder solche Marker, die Antibiotikaresistenz – beispielsweise Resistenz gegenüber G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin – ergeben.
Vorzugsweise umfasst das Konstrukt der vorliegenden Erfindung mindestens die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in funktionaler Verknüpfung mit einem Promotor.
VEKTOREN
Der Ausdruck "Vektor" umfasst Expressionsvektoren und Transformationsvektoren und Shuttlevektoren.
Der Ausdruck "Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt der Fähigkeit einer Expression in vivo oder in vitro.
Der Ausdruck "Transformationsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das von einer Einheit auf eine andere Einheit – die von der gleichen Art oder einer anderen Art sein kann – übertragen werden kann. Wenn das Konstrukt von einer Art zu einer anderen – beispielsweise von einem E. coli-Plasmid zu einem Bakterium, beispielsweise der Gattung Bacillus, – übertragen werden kann, wird der Transformationsvektor manchmal als "Shuttlevektor" bezeichnet. Er kann auch ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid zu einem Agrobakterium zu einer Pflanze übertragen werden kann.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können wie im folgenden beschrieben in eine geeignete Wirtszelle trans formiert werden, um die Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Daher beschreibt die vorliegende Anmeldung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, das das Kultivieren einer mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformierten oder transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression einer Codierungssequenz mit Codierung für die Polypeptide durch den Vektor ergeben, und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide, umfasst.
Die Vektoren können beispielsweise ein Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, optional einem Promotor für die Expression des Polynucleotids und optional einem Regulator des Promotors ausgestattet sind.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten. Die geeignetsten Selektionssysteme für großtechnische Mikroorganismen sind solche, die durch die Gruppe von Selektionsmarkern, die keine Mutation in dem Wirtsorganismus erfordern, gebildet werden. Beispiele für Pilzselektionsmarker sind die Gene für Acetamidase- (amd5), ATP-Synthetase-, Subunit-9- (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase- (pvrA), Phleomycin- und Benomylresistenz (benA). Beispiele für nichtfungale Selektionsmarker sind das bakterielle G418-Resistenzgen (dies kann ebenfalls in Hefe, jedoch nicht bei Fadenpilzen verwendet werden), das Ampicillinresistenzgen (E. coli), das Neomycinresistenzgen (Bacillus) und das E. coli uidA-Gen mit Codierung für β-Glucuronidase (GUS).
Vektoren können in vitro, beispielsweise zur Produktion von RNA verwendet werden oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden.
Daher können Polynucleotide der vorliegenden Erfindung in einen rekombinanten Vektor (typischerweise einen replizierbaren Vektor), beispielsweise einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, eingearbeitet werden. Der Vektor kann zur Replikation der Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Daher beschreibt die vorliegende Anmeldung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung durch Einführen eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Replikation des Vektors erbringen. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden im folgenden in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von gentechnisch veränderten Wirtszellen, die eine PDEXV oder eine Varianten, ein Homologon, ein Fragment oder Derivat derselben exprimieren, bei Screeningverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren und Antagonisten der PDEXV, die Phosphodiesteraseaktivität modulieren, wodurch die Konzentrationen cyclischer Nucleotide moduliert werden. Derartige gentechnisch veränderte Wirtszellen können zum Screening von Peptidbibliotheken oder organischen Molekülen mit der Fähigkeit zur Modulierung der PDEXV-Aktivität verwendet werden. Antagonisten und Inhibitoren von PDEXV, wie Antikörper, Peptide oder kleine organische Moleküle, ergeben die Basis für pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen, die mit beispielsweise PDEXV in Verbindung stehen. Derartige Inhibitoren oder Antagonisten können allein oder in Kombination mit anderen Therapeutika zur Behandlung derartiger Erkrankungen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Expressionsvektoren und Wirtszellen, die Polynucleotidsequenzen mit Codierung für PDEXV oder eine Variante derselben umfassen, zur Produktion von PDEXV-Protein in vivo oder in vitro oder zum Screening auf Mittel, die die PDEXV-Expression oder -Aktivität beeinflussen können.
GEWEBE
Der hier verwendete Ausdruck "Gewebe" umfasst Gewebe als solches und ein Organ.
WIRTSZELLEN
Der Ausdruck "Wirtszelle" umfasst in Bezug auf die vorliegende Erfindung jede Zelle, die die Nucleotidsequenz mit Codierung für das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder daraus erhaltene Produkte umfassen kann, wobei ein Promotor die Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie in der Wirtszelle vorhanden ist, ermöglichen kann.
Daher stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Wirtszellen bereit, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert sind. Vorzugsweise wird das Polynucleotid in einem Vektor zur Replikation und Expression der Polynucleotide getragen. Die Zellen werden derart gewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und sie können beispielsweise prokaryotische (beispielsweise Bakterien-), Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
Das gramnegative Bakterium E. coli wird in weitem Umfang als Wirt für heterologe Genexpression verwendet. Jedoch besteht die Tendenz zur Ansammlung großer Mengen von heterologem Protein im Inneren der Zelle. Eine anschließende Reinigung des gewünschten Produkts aus der Masse intrazellulärer Proteine von E. coli kann manchmal schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli sind Bakterien der Gattung Bacillus als heterologe Wirte wegen ihrer Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium sehr günstig. Weitere als Wirte geeignete Bakterien sind die der Gattungen Streptomyces und Pseudomonas.
In Abhängigkeit von der Natur des Polynucleotids mit Codierung für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und/oder dem Wunsch nach einer weiteren Prozessierung des exprimierten Proteins können eukaryotische Wirte, wie Hefen oder Pilze, bevorzugt sein. Allgemein sind Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Jedoch werden einige Proteine entweder von der Hefezelle schlecht sezerniert oder in einigen Fällen nicht passend prozessiert (beispielsweise Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein anderer Pilzwirtsorganismus gewählt werden.
Beispiele für geeignete Expressionswirte innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Arten (beispielsweise gemäß der Beschreibung in EP-A-0184438 und EP-A-0284603) und Trichoderma-Arten; Bakterien, wie Bacillus-Arten (beispielsweise gemäß der Beschreibung in EP-A-0134048 und EP-A-0253455), Streptomyces- und Pseudomonas-Arten; und Hefen, wie Kluyveromyces-Arten (beispielsweise gemäß der Beschreibung in EP-A-0096430 und EP-A-0301670) und Saccharomyces-Arten. Beispielsweise können typische Expressionswirte aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae gewählt werden.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen – wie Hefe-, Pilz- und Pflanzenwirtszellen – kann posttranslationale Modifikationen (beispielsweise Myristoylierung, Glycosylierung, Verkürzung, Lapidation und Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) ergeben, die zum Verleihen optimaler biologischer Aktivität an rekombinante Expressionsprodukte der vorliegenden Erfindung notwendig sein können.
Organismus
Der Ausdruck "Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfasst jeden nichthumanen Organismus, der die Nucleotidsequenz mit Codierung für das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder daraus erhaltene Produkte umfassen kann, wobei ein Promotor die Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn diese im Organismus vorhanden ist, ermöglichen kann. Beispiele für Organismen können ein Pilz, eine Hefe oder eine Pflanze umfassen.
Der Ausdruck "transgener Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfasst jeden nichthumanen Organismus, der die Nucleotidsequenz mit Codierung für das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder daraus erhaltene Produkte umfasst, wobei der Promotor die Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in dem Organismus ermöglichen kann. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz in das Genom des Organismus eingebaut.
Der Ausdruck "transgener Organismus" umfasst nicht die native Nucleotidcodierungssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in deren natürlicher Umgebung, wenn sie unter der Kontrolle von deren nativem Promotor, der ebenfalls in dessen natürlicher Umgebung ist, steht. Ferner umfasst die vorliegende Erfindung nicht das native Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn es in dessen natürlicher Umgebung steht und wenn es durch dessen native Nucleotidcodierungssequenz, die ebenfalls in deren natürlicher Umgebung steht, und wenn die Nucleotidsequenz unter der Kontrolle von deren nativem Promotor, der ebenfalls in dessen natürlicher Umgebung ist, steht, exprimiert wurde.
Daher umfasst der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus, der einen Bestandteil von oder Kombinationen von der Nucleotidsequenz mit Codierung für die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung (einschließlich von Kombinationen derselben), Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung, Plasmiden gemäß der vorliegenden Erfindung, Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung, Geweben gemäß der vorliegenden Erfindung oder Produkten derselben umfasst. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus können akzeptable Mengen der gewünschten Verbindung herstellen, die ohne weiteres aus der Zelle oder dem Organismus gewinnbar ist.
TRANSFORMATION VON WIRTSZELLEN/WIRTSORGANISMEN
Wie früher angegeben, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder eukaryotischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryotische Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation prokaryotischer Wirte sind einschlägig gut dokumentiert, siehe beispielsweise Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Aushubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Wenn ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, muss die Nucleotidsequenz vor der Transformation – beispielsweise durch Entfernen von Introns – in geeigneter Weise modifiziert werden.
In einer anderen Ausführungsform kann der nichthumane transgene Organismus eine Hefe sein. Im Hinblick darauf wurde Hefe auch in weitem Umfang als Vehikel zur Expression heterologer Gene verwendet. Die Art Saccharomyces cerevisiae besitzt eine lange Geschichte der großtechnischen Verwendung einschließlich von deren Verwendung zur Expression heterologer Gene. Die Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae ist im Überblick bei Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., Hrsg., S. 401–429, Allen und Unwin, London) und bei King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton und G T Yarronton, Hrsg., S. 107–133, Blackie, Glasgow) angegeben.
Aus mehreren Gründen eignet sich Saccharomyces cerevisiae gut zur Expression heterologer Gene. Zunächst ist es für Menschen nicht pathogen und nicht zur Produktion bestimmter Endotoxine fähig. Zweitens besitzt es eine lange Geschichte der sicheren Verwendung nach Jahrhunderten gewerblicher Nutzung für verschiedene Zwecke. Dies führte zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz. Drittens führte die intensive kommerzielle Verwendung und Forschung im Hinblick auf den Organismus zu einem reichen Wissen über die Genetik und Physiologie sowie die Eigenschaften einer Fermentation in großem Maßstab von Saccharomyces cerevisiae.
Ein Überblick über die Prinzipien der Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten ist bei E Hinchcliffe, E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H Rose und J Stuart Harrison, Hrsg., 2. Auflage, Academic Press Ltd.) angegeben.
Mehrere Arten von Hefevektoren sind verfügbar, die integrative Vektoren, die die Rekombination mit dem Wirtsgenom zur Beibehaltung erfordern, und autonom replizierende Plasmidvektoren umfassen.
Zur Herstellung der transgenen Saccharomyces werden Expressionskonstrukte durch Insertion der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in ein zur Expression in Hefe gestaltetes Konstrukt hergestellt. Mehrere Arten von Konstrukten, die zur heterologen Expression verwendet werden, wurden entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor an die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung fusioniert, wobei üblicherweise ein Promotor mit Hefeherkunft, wie der GAL1-Promotor, verwendet wird. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeherkunft, wie die Sequenz mit Codierung für das SUC2-Signalpeptid, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator beendet das Expressionssystem.
Zur Transformation von Hefe wurden mehrere Transformationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise können transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß den Lehren von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs J D (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito H et al. (1983, J Bacteriology 153, 163–168) hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen warden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker selektiert. Unter den zur Transformation verwendeten Markern sind eine Anzahl auxotropher Marker, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominante Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosid-Antibiotikummarker, beispielsweise G418.
Ein weiterer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das Grundprinzip bei der Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen ist die Insertion genetischer Information in das Pflanzengenom derart, dass eine stabile Beibehaltung des insertierten Genmaterials erhalten wird.
Mehrere Techniken zur Insertion der Geninformation existieren, wobei die zwei Hauptprinzipien die direkte Einführung der Geninformation und die Einführung der Geninformation unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Ein Überblick über die allgemeinen Techniken findet sich in Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27). Weitere Lehren der Pflanzentransformation finden sich in EP-A-0 449 375.
Daher beschreibt die vorliegende Anmeldung auch ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, oder einer Variante derselben.
Mit einer PDE-Nucleotidcodierungssequenz transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen, die zur Expression und Gewinnung des codierten Proteins aus der Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das durch eine rekombinante Zelle produzierte Protein kann in Abhängigkeit von der Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor sezerniert werden oder intrazellulär enthalten bleiben. Wie dem Fachmann klar ist, können Expressionsvektoren, die PDE-Codierungssequenzen enthalten, mit Signalsequenzen gestaltet werden, die die Sekretion von PDE-Codierungssequenzen durch eine spezielle prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran dirigieren. Andere rekombinante Konstruktionen können eine PDE-Codierungssequenz mit einer Nucleotidsequenz mit Codierung für eine Polypeptiddomäne, die die Reinigung löslicher Proteine erleichtert, verknüpfen (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 12: 441–53, siehe auch die obige Diskussion von Vektoren, die Fusionsproteine enthalten).
PRODUKTION DES POLYPEPTIDS
Gemäß der vorliegenden Anmeldung kann die Produktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch das Kultivieren von beispielsweise Mikroorganismenexpressionswirten, die mit einem oder mehreren Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, in einem herkömmlichen Nährfermentationsmedium bewirkt werden. Die Wahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl von Expressionswirten und/oder auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts beruhen. Derartige Medien sind dem Fachmann bekannt. Das Medium kann, falls gewünscht, zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen potentiell kontaminierenden Mikroorganismen begünstigen.
Daher beschreibt die vorliegende Anmeldung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDEXV-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen der a) Transformation einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, oder einer Variante derselben; und b) des Kultivierens der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids günstig sind, umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDEXV-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen a) der Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einer Nucleotidsequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, oder einer Variante derselben transformiert wurde, unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids günstig sind; und b) der Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur umfasst.
Daher beschreibt die vorliegende Anmeldung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDEXV-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen der a) Transformation einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, oder einer Variante derselben und b) des Kultivierens der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids günstig sind; und c) der Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur umfasst.
RIBOZYME
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle mit der Fähigkeit zur Katalyse der spezifischen Spaltung von RNA. Der Mechanismus der Ribozymwirkung umfasst eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls mit komplementärer Target-RNA und eine anschließende endonukleolytische Spaltung. Technisch veränderte Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle können die endonukleolytische Spaltung von PDE-RNA-Sequenzen spezifisch und effizient katalysieren.
Spezifische Ribozymspaltungsstellen in einem potentiellen RNA-Target werden zunächst durch Scannen des Zielmoleküls auf Ribozymspaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen, GUA, GW und GUC, umfassen, identifiziert. Wenn diese identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der die Spaltungsstelle enthaltenden Region des Zielgens entsprechen, auf sekundäre Strukturmerkmale, die die Oligonucleotidsequenz dysfunktional machen können, bewertet werden. Die Eignung von Zielkandidaten kann auch durch Testen der Zugänglichkeit für eine Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonucleaseschutztests bewertet werden.
Sowohl Antisense-RNA- als auch DNA-Moleküle und Ribozyme gemäß der Erfindung können nach jedem einschlägig bekannten Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen hergestellt werden. Diese umfassen Techniken zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden, wie die chemische Festphasenphosphoramiditsynthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch Transkription von DNA-Sequenzen mit Codierung für das Antisense-RNA-Molekül in vitro oder in vivo erzeugt werden. Derartige DNA-Sequenzen können in eine breite Vielzahl von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerasepromotoren, wie T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingeführt werden.
DETEKTION
Das Vorhandensein der PDE-Polynucleotidcodierungssequenz kann mittels DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Teilen oder Fragmenten der in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Sequenz detektiert werden. Tests auf der Basis von Nucleinsäureamplifikation umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden oder Oligomeren auf der Basis der PDE-Codierungssequenz zur Detektion von Transformanten, die PDE-DNA oder -RNA enthalten. Die hier verwendeten Ausdrücke "Oligonucleotide" oder "Oligomere" können eine Nucleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nucleotiden und bis zu etwa 60 Nucleotiden, vorzugsweise etwa 15 bis 30 Nucleotiden und noch besser etwa 20–25 Nucleotiden bezeichnen, die als Sonde oder Amplimer verwendet werden kann. Vorzugsweise stammen Oligonucleotide von der 3'-Region der in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Nucleotidsequenz.
Eine Vielzahl von Protokollen zur Detektion und Ermittlung der Expression eines PDE-Polypeptids, beispielsweise unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen, für das Protein spezifischen Antikörpern, sind einschlägig bekannt. Beispiele umfassen enzymgekoppelten Immunsorptionstest (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS). Ein Zwei-Stellen-Immunoassay auf monoklonaler Basis unter Verwendung von mit zwei sich nicht störenden Epitopen auf PDE-Polypeptiden reaktiven monoklonalen Antikörpern ist bevorzugt, jedoch kann ein kompetitiver Bindungstest verwendet werden. Diese und andere Tests sind unter anderen Stellen in Hampton R et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddox DE et al. (1983) J Exp Med 15 8: 1211) beschrieben.
Eine breite Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken sind dem Fachmann bekannt und können in verschiedenen Nuclein- und Aminosäuretests verwendet werden. Mittel zur Herstellung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Detektion von PDE-Polynucleotidsequenzen umfassen Oligolabelling, Nicktranslation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ kann die PDE-Codierungssequenz oder ein Teil derselben in einen Vektor zur Produktion einer mRNA- Sonde kloniert werden. Derartige Vektoren sind einschlägig bekannt, im Handel erhältlich und können zur Synthese von RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer passenden RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und markierter Nucleotide verwendet werden.
Eine Zahl von Firmen, wie Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen solche Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Mittel, chemilumineszierende Mittel oder chromogene Mittel sowie Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dgl. Patente, die die Verwendung derartiger Markierungen lehren, umfassen US-A-3 817 837, US-A-3 850 752, US-A-3 939 350, US-A-3 996 345, US-A-4 277 437, US-A-4 275 149 und US-A-4 366 241. Auch können rekombinante Immunglobuline wie in US-A-4 816 567 angegeben hergestellt werden.
Weitere Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Expression eines speziellen Moleküls umfassen die Radiomarkierung (Melby PC et al. 1993 J Immunol Methods 159: 235–44) oder die Biotinylierung (Duplaa C et al. 1993 Anal Biochem 229–36) von Nucleotiden, die Koamplifikation einer Kontrollnucleinsäure und Standardkurven, auf die die Versuchsergebnisse interpoliert werden. Die quantitative Bestimmung mehrfacher Proben kann dadurch beschleunigt werden, dass der Test in einem ELISA-Format durchgeführt wird, wobei das interessierende Oligomer in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und eine spektrophotometrische oder kalorimetrische Reaktion eine rasche Quantifizierung ergibt.
Obwohl das Vorhandensein/Nichtvorhandensein der Expression eines Markergens nahelegt, dass das interessierende Gen ebenfalls vorhanden ist, sollte dessen Vorhandensein und Expression bestätigt werden. Beispielsweise können, wenn die PDE-Codierungssequenz in einer Markergensequenz insertiert ist, rekombinante Zellen, die PDE-Codierungsregionen enthalten, durch Nichtvorhandensein der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen als Tandem mit einer PDE-Codierungssequenz unter die Kontrolle eines einzigen Promotors gestellt werden. Die Expression des Markergens als Reaktion auf eine Induktion oder Selektion gibt üblicherweise auch die Expression von PDE an.
Alternativ können Wirtszellen, die die Codierungssequenz für PDE enthalten und PDE-Codierungsregionen exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Proteinbioassay- oder Immunoassaytechniken, die Technologien auf Membranbasis, Lösungsbasis oder Chipbasis zur Detektion und/oder Quantifizierung der Nucleinsäure oder des Proteins umfassen.
ANTIKÖRPER
Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auch zur Erzeugung von Antikörpern – beispielsweise unter Verwendung von Standardtechniken – gegen die Aminosäuresequenz verwendet werden.
Einschlägig bekannte Verfahren können zur Produktion von Antikörpern gegen PDEXV-Polypeptide verwendet werden. Derartige Antikörper umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und durch eine Fab-Expressionsbibliothek produzierte Fragmente. Neutralisierende Antikörper, d.h. solche, die die biologische Aktivität von PDE-Polypeptiden hemmen, sind für Diagnostika und Therapeutika besonders bevorzugt.
Zur Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirte, die Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse und dgl. umfassen, durch Injektion des Inhibitors oder eines Teils, einer Variante, eines Homologon, Fragments oder Derivats desselben oder eines Oligopeptids, das immunogene Eigenschaften beibehält, immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtsart können verschiedene Adjuvantien zur Erhöhung der immunologischen Reaktion verwendet werden. Derartige Adjuvantien umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Freudsches Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potentiell verwendbare humane Adjuvantien, die verwendet werden können.
Monoklonale Antikörper für die Aminosäuresequenz können unter Verwendung jedes Verfahrens, das die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ergibt, hergestellt werden. Diese umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Koehler und Milstein beschrieben wurde (1975 Nature 256: 495–497), die humane B-Zellenhybridomtechnik (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72; Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, S. 77–96). Ferner können Techniken, die zur Produktion von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörpergenen zu humanen Antikörpergenen zur Gewinnung eines Moleküls mit passender Antigenspezifität und biologischer Aktivität, verwendet werden (Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6851–6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604–608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452–454). Alternativ können Techniken, die zur Produktion von Einzelkettenantikörpern verwendet wurden (US-A-4 946 779) zur Produktion von inhibitorspezifischen Einzelkettenantikörpern angepasst werden.
Antikörper können auch durch Induktion einer In-vivo-Produktion in der Lymphocytenpopulation oder durch Screening von rekombinanten Immunglobulinbibliotheken oder Panels von hochspezifisch bindenden Reagentien gemäß der Offenbarung in Orlandi et al. (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833–3837) und Winter G und Milstein C (1991, Nature 349: 293–299) hergestellt werden.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen für PDEXV enthalten, können ebenfalls erzeugt werden. Beispielsweise umfassen derartige Fragmente, ohne hierauf beschränkt zu sein, die F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken derart konstruiert werden, dass eine rasche und leichte Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität möglich ist (Huse WD et al. (1989) Science 256: 1275–1281).
Eine alternative Technik umfasst das Screening von Phagendisplaybibliotheken, wobei die Phagen beispielsweise scFv-Fragmente auf der Oberfläche ihrer Hülle mit einer großen Vielzahl von komplementaritätsbestimmenden Abschnitten (CDRs) exprimieren. Diese Technik ist einschlägig bekannt.
PDEXV-spezifische Antikörper sind zur Diagnose von Zuständen und Erkrankungen, die mit der Expression eines PDEXV-Polypeptids in Verbindung stehen, verwendbar. Eine Vielzahl von Protokollen zur kompetitiven Bindung oder immunradiometrische Tests unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit bekannten Spezifitäten sind einschlägig bekannt. Derartige Immunoassays umfassen typischerweise die Bildung von Komplexen zwischen PDEXV-Polypeptiden und deren spezifischem Antikörper (oder einem ähnlichen PDEXV bindenden Molekül) und die Ermittlung der Komplexbildung. Ein Zwei-Stellen-Immunoassay auf monoklonaler Basis unter Verwendung von monoklonalen, mit zwei sich nicht störenden Epitopen auf einem spezifischen PDEXV-Protein reaktiven Antikörpern ist bevorzugt, doch kann ein kompetitiver Bindungstest ebenfalls verwendet werden. Diese Tests sind in Maddox DE et al. (1983, J Exp Med 185: 121 1) beschrieben.
Anti-PDEXV-Antikörper sind zur Diagnose einer Entzündung, von Zuständen, die mit der Proliferation von hämopoetischen Zellen in Verbindung stehen, und einer HIV-Infektion oder anderen Störungen oder Erkrankungen, die durch eine anomale Expression von PDEXV gekennzeichnet sind, verwendbar. Diagnostische Tests für eine PDEXV umfassen Verfahren unter Verwendung des Antikörpers und einer Markierung zur Detektion eines PDEXV-Polypeptids in humanen Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder Sektionen oder Extrakten derartiger Gewebe. Derartige Polypeptide und Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch entweder kovalente oder nichtkovalente Verknüpfung derselben mit einem Reportermoleküle markiert. Eine breite Vielzahl von Reportermolekülen ist dem Fachmann bekannt.
Antikörper können in einem Verfahren zur Detektion von Polypeptiden der Erfindung, die in biologischen Proben vorhanden sind, mittels eines Verfahrens, das (a) das Bereitstellen eines Antikörpers der Erfindung, (b) die Inkubation einer biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ermöglichen, und (c) das Bestimmen, ob der den Antikörper umfassende Antikörper-Antigen-Komplex gebildet wird, umfasst, verwendet werden.
In Abhängigkeit von den Umständen können geeignete Proben Extrakte von Geweben, wie Hirn, Brust, Eierstock, Lunge, Kolon, Pankreas, Hoden, Leber, Muskel- und Knochengewebe oder von derartigen Geweben stammende neoplastische Wucherungen umfassen.
Antikörper können an einen festen Träger gebunden und/oder in Kits in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagentien, Kontrollen, Anleitungen und dgl. gepackt sein.
ASSAYS/IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ferner ein Testverfahren zur Detektion des Vorhandenseins von PDEXV in Zellen (wie humanen Zellen), das umfasst: (a) das Durchführen einer reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion an RNA (beispielsweise Gesamt-RNA) von derartigen Zellen unter Verwendung eines Paars von Polymerasekettenreaktionsprimern, die für PDEXV spezifisch sind, die aus der DNA-Sequenz, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben ist, oder einer Allelvariation derselben bestimmt werden; und (b) das Testen des Auftretens eines PCR(Polymerasekettenreaktion)-Fragments einer geeigneten Größe – beispielsweise durch Agarosegelelektrophorese.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln (beispielsweise Verbindungen, andere Substanzen oder diese umfassende Zusammensetzungen), die die Aktivität von PDEXV und/oder die Expression derselben beeinflussen (beispielsweise hemmen oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren das Kontaktieren von PDEXV oder der diese codierenden Nucleotidsequenz mit dem Mittel und das anschließende Ermitteln der Aktivität von PDEXV und/oder der Expression derselben umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln (beispielsweise Verbindungen, andere Substanzen oder diese umfassende Zusammensetzungen), die die Aktivität von PDEXV und/oder die Expression derselben selektiv beeinflussen (beispielsweise hemmen oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren das Kontaktieren von PDEXV oder der diese codierenden Nucleotidsequenz mit dem Mittel und das anschließende Ermitteln der Aktivität von PDEXV und/oder der Expression derselben umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln (beispielsweise Verbindungen, andere Substanzen oder diese umfassende Zusammensetzungen), die die Aktivität von PDEXV und/oder die Expression derselben beeinflussen (beispielsweise hemmen oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren das Ermitteln der Aktivität von PDEXV und/oder der Expression derselben in Gegenwart des Mittels oder nach der Zugabe des Mittels in (a) einer Zelllinie, in die rekombinante DNA, die die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene DNA-Sequenz oder eine Allelvariation derselben umfasst, eingearbeitet wurde, oder (b) einer Zellpopulation oder Zelllinie, die PDEXV von Natur aus selektiv exprimiert, umfasst. Vorzugsweise wird die Aktivität von PDEXV durch das oben beschrie bene Testverfahren bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln (beispielsweise Verbindungen, andere Substanzen oder diese umfassende Zusammensetzungen), die die Aktivität von PDEXV und/oder die Expression derselben selektiv beeinflussen (beispielsweise hemmen oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren das Ermitteln der Aktivität von PDEXV und/oder der Expression derselben in Gegenwart des Mittels oder nach der Zugabe des Mittels in (a) einer Zelllinie, in die rekombinante DNA, die die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebene DNA-Sequenz oder eine Allelvariation derselben umfasst, eingearbeitet wurde, oder (b) einer Zellpopulation oder Zelllinie, die PDEXV von Natur aus selektiv exprimiert, umfasst. Vorzugsweise wird die Aktivität von PDEXV durch das oben beschriebene Testverfahren bestimmt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Screening auf ein Mittel zur Modulation (vorzugsweise zur spezifischen Modulation) der PDEXV(oder einer Variante derselben)-Aktivität oder der Expression der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (einschließlich einer Variante derselben) bereit, wobei das Verfahren die Stufen a) des Bereitstellens eines Kandidatenmittels, b) der Kombination von PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder der Variante derselben) mit dem Kandidatenmittel während eines zum Ermöglichen einer Modulation ausreichenden Zeitraums unter geeigneten Bedingungen, und c) der Detektion der Modulation des Kandidatenmittels gegenüber PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung derselben (oder der Variante derselben) zur Feststellung, ob das Kandidatenmittel die PDEXV(oder die Variante derselben)-Aktivität oder die Expression der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante derselben) moduliert, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Screening auf ein Mittel für spezifische Bindungsaffinität mit PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (einschließlich einer Variante derselben) bereit, wobei das Verfahren die Stufen a) des Bereitstellens eines Kandidatenmittels, b) der Kombination von PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante derselben) mit dem Kandidatenmittel während eines zum Ermöglichen einer Bindung ausreichenden Zeitraums unter geeigneten Bedingungen, und c) der Detektion einer Bindung des Kandidatenmittels an PDEXV (oder die Variante derselben) oder die Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante derselben) zur Feststellung, ob das Kandidatenmittel an PDEXV (oder die Variante derselben) oder die Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante derselben) bindet, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das PDEXV modulieren kann, bereit, wobei das Verfahren die Stufen a) des Inkontaktbringens des Mittels mit PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante derselben), b) des Inkubierens des Gemischs von Stufe a) mit einem cyclischen Nucleotid unter Bedingungen, die für die Hydrolyse des cyclischen Nucleotids geeignet sind, c) des Ermittelns der Menge der Hydrolyse des cyclischen Nucleotids, und d) des Vergleichens der Menge der Hydrolyse des cyclischen Nucleotids von Stufe c) mit der Menge der Hydrolyse des cyclischen Nucleotids, die mit PDEXV (oder der Variante derselben) oder der Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe (oder die Variante der selben), die mit der Verbindung inkubiert wurde, erhalten wurde, wodurch bestimmt wird, ob das Mittel die Hydrolyse eines cyclischen Nucleotids beeinflusst (beispielsweise stimuliert oder hemmt), umfasst.
Daher können in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung PDEXV oder eine Variante derselben und/oder eine Zelllinie, die die PDEXV oder eine Variante derselben exprimiert, zum Screening für Antikörper, Peptide oder ein anderes Mittel, wie organische oder anorganische Moleküle, die als Modulatoren der Phosphodiesteraseaktivität oder der Expression derselben wirken, verwendet werden, wodurch ein therapeutisches Mittel mit der Fähigkeit zur Modulierung der Konzentrationen cyclischer Nucleotide identifiziert wird. Beispielsweise können Anti-PDEXV-Antikörper, die die Aktivität von PDEXV neutralisieren können, zur Hemmung einer PDEXV-Hydrolyse cyclischer Nucleotide verwendet werden, wodurch deren Konzentrationen erhöht werden. Alternativ kann ein Screening von Peptidbibliotheken oder organischen Bibliotheken, die durch kombinatorische Chemie mit rekombinant exprimierter PDEXV oder einer Variante derselben oder Zelllinien, die PDEXV oder eine Variante derselben exprimieren, hergestellt wurden, zur Identifizierung therapeutischer Mittel, die durch Modulation der PDEXV-Hydrolyse von cyclischen Nucleotiden wirken, verwendbar sein. Synthetische Verbindungen, Naturprodukte und andere Quellen potentiell biologisch aktiver Materialien können auf eine Zahl von Wegen, die für den Fachmann Routine sind, gescreent werden. Beispielsweise können Nucleotidsequenzen mit Codierung für die N-terminale Region von PDEXV in einer Zelllinie, die zum Screening von allosterischen Modulatoren, entweder Agonisten oder Antagonisten, der PDEXV-Aktivität verwendet werden kann, exprimiert werden. Alternativ können Nucleotidsequenzen mit Codierung für die konservierte katalytische Domäne von PDEXV in Zelllinien exprimiert und zum Screening auf Inhibitoren der Hydrolyse cyclischer Nucleotide verwendet werden.
Die Fähigkeit eines Testmittels zum Eingreifen in PDEXV-Aktivität oder Hydrolyse cyclischer Nucleotide kann durch Ermitteln der Konzentrationen von PDEXV oder der Konzentrationen cyclischer Nucleotide bestimmt werden (wie in Smith et al. 1993 Appl. Biochem. Biotechnol. 41: 189–218 offenbart). Es gibt auch im Handel erhältliche Immunoassaykits zur Ermittlung von cAMP und cGMP (beispielsweise Amersham International, Arlington Heights, IL und DuPont, Boston, MA). Die Aktivität von PDEXV kann auch durch die Ermittlung anderer Reaktionen, wie Phosphorylierung oder Dephosphorylierung anderer Proteine unter Verwendung herkömmlicher Techniken, die für diesen Zweck entwickelt wurden, überwacht werden.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die die Phosphodiesteraseaktivität für cyclische Nucleotide einer PDEXV oder einer Variante derselben modulieren kann, das die Stufen a) des Kontaktierens der Verbindung mit einer PDEXV oder einer Variante derselben, b) der Inkubation des Gemischs von Stufe a) mit einem cyclischen Nucleotid unter für die Hydrolyse des cyclischen Nucleotids geeigneten Bedingungen, c) des Ermittelns der Menge der Hydrolyse des cyclischen Nucleotids, und d) des Vergleichs der Menge der Hydrolyse des cyclischen Nucleotids von Stufe c) mit der Menge der Hydrolyse eines cyclischen Nucleotids, die mit der PDEXV oder einer Variante derselben, die mit der Verbindung inkubiert wurde, erhalten wurde, wodurch bestimmt wird, ob die Verbindung die Hydrolyse eines cyclischen Nucleotids stimuliert oder hemmt, umfasst. In einer Ausführungsform des Verfahrens kann das Fragment von der N- terminalen Region der PDEXV sein, und es stellt ein Verfahren zur Identifizierung allosterischer Modulatoren der PDEXV bereit. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Fragment von der carboxyterminalen Region der PDEXV sein und es stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Hydrolyse cyclischer Nucleotide bereit.
Ein PDEXV-Polypeptid, dessen immunogene Fragmente oder Oligopeptide desselben können zum Screening therapeutischer Verbindungen in einer einer Vielzahl von Wirkstoffscreeningtechniken verwendet werden. Das in einem derartigen Test verwendete Polypeptid kann frei in Lösung sein, an einen festen Träger gebunden sein, auf einer Zelloberfläche entstanden sein oder intrazellulär vorhanden sein. Die Beseitigung der Aktivität oder die Bildung von Bindungskomplexen zwischen einem PDEXV-Polypeptid und dem getesteten Mittel können ermittelt werden.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening von einer oder einer Mehrzahl von Verbindungen zur Modulation (vorzugsweise spezifischen Modulation, beispielsweise spezifischen Bindungsaffinität) von PDEXV oder der Expression derselben oder einer Variante derselben bereit, das das Bereitstellen von einer oder einer Mehrzahl von Verbindungen, die Kombination einer PDEXV oder einer Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe oder eine Variante derselben mit der oder jeder einer Mehrzahl von Verbindungen während eines zum Ermöglichen einer Modulation ausreichenden Zeitraums unter geeigneten Bedingungen, und die Detektion der Bindung einer PDEXV oder einer Variante derselben an jede der Mehrzahl von Verbindungen, wodurch die Verbindung oder Verbindungen, die eine PDEXV oder eine Nucleotidsequenz mit Codierung für dieselbe modulieren, identifiziert werden, umfasst. Bei einem derartigen Test kann die Mehrzahl von Verbindungen durch dem Fachmann bekannte Verfahren der kombinatorischen Chemie produziert werden.
Ein weiteres Verfahren zum Wirkstoffscreening stellt ein Hochdurchsatzscreening von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität für die PDEXV-Polypeptide bereit und es beruht auf dem detailliert bei Geysen, europäische Patentanmeldung 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, beschriebenen Verfahren. Zusammengefasst werden große Zahlen verschiedener kleiner Peptidtestverbindungen an einem festen Substrat, wie Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Die Peptidtestverbindungen werden mit PDEXV-Fragmenten umgesetzt und gewaschen. Eine gebundene PDEXV wird dann beispielsweise durch eine geeignete Anpassung von einschlägig bekannten Verfahren detektiert. Eine gereinigte PDEXV kann auch direkt auf Platten zur Verwendung bei den im vorhergehenden genannten Wirkstoffscreeningverfahren aufgetragen werden. Alternativ können nicht-neutralisierende Antikörper zum Einfangen des Peptids und Immobilisieren desselben auf einem festen Träger verwendet werden.
Diese Anmeldung betrachtet ferner die Verwendung von kompetitiven Wirkstoffscreeningtests, wobei neutralisierende Antikörper, die eine PDEXV spezifisch binden können, mit einer Testverbindung um die Bindung an eine PDEXV konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper zur Detektion des Vorhandenseins eines beliebigen Peptids, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit einer PDEXV gemeinsam hat, verwendet werden.
Das Testverfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Hochdurchsatzscreening (HTS) sein. Im Hinblick darauf können die Lehren der WO 84/03564 für die PDE der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Die Lehren der US-A-5 738 985 können für das Testverfahren der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Das durch die Tests der vorliegenden Erfindung identifizierte Mittel kann beispielsweise eine organische Verbindung oder eine anorganische Verbindung sein. Das Mittel kann beispielsweise eine Nucleotidsequenz sein, die Antisense zu den gesamten oder einem Teil der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben sind, ist.
Die vorliegende Anmeldung betrachtet ferner die Verwendung eines Mittels zur Beeinflussung (beispielsweise Hemmung, Modulierung oder agonistischen Beeinflussung) der PDEXV-Aktivität in einem oder mehreren Elementen von dem kardiovaskulären System, Corpus cavernosum, Niere, Leber, Skelettmuskulatur, Hoden, Prostata.
DIAGNOSTIKA
Die vorliegende Anmeldung betrachtet ferner eine diagnostische Zusammensetzung zur Detektion von PDEXV-Polynucleotidsequenzen. Die diagnostische Zusammensetzung kann eine beliebige der in den beigefügten Sequenzprotokollen angegebenen Sequenzen oder eine Variante derselben umfassen.
Zur Bereitstellung einer Basis für die Diagnose einer Erkrankung sollten Normal- oder Standardwerte einer PDEXV-Polypeptidexpression festgestellt werden. Dies wird durch Kombination von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die normalen Subjekten, entweder ein Tier oder Mensch, entnommen wurden, mit einem Antikörper für ein PDEXV-Polypeptid unter zur Komplexbildung geeigneten Bedingungen, die einschlägig bekannt sind, erreicht. Die Menge der Standard komplexbildung kann durch Vergleich derselben mit einer Verdünnungsreihe positiver Kontrollen, wobei eine bekannte Menge Antikörper mit bekannten Konzentrationen eines gereinigten PDEXV-Polypeptids kombiniert wird, quantitativ bestimmt werden. Dann können von normalen Proben erhaltene Standardwerte mit Werten, die von Proben von Subjekten, die potentiell durch eine mit einer PDEXV-Polypeptidexpression in Verbindung stehenden Störung oder Erkrankung betroffen sind, erhalten wurden, verglichen werden. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten stellt das Vorhandensein des Erkrankungszustands fest.
Ein PDEXV-Polynucleotid oder ein Teil desselben kann die Basis für eine diagnostische und/oder therapeutische Verbindung liefern. Für diagnostische Zwecke können PDEXV-Polynucleotidsequenzen zur Detektion und Quantifizierung der Genexpression bei Zuständen, Störungen oder Erkrankungen, bei denen die PDEXV-Aktivität impliziert sein kann, verwendet werden.
Eine PDEXV codierende Polynucleotidsequenz kann zur Diagnose von Erkrankungen, die von der Expression von PDEXV herrühren, verwendet werden. Beispielsweise können Polynucleotidsequenzen mit Codierung für PDEXV bei der Hybridisierung oder PCR-Tests von Geweben von Biopsien oder Autopsien oder biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Synovialflüssigkeit oder einer Tumorbiopsie, zur Detektion von Anomalitäten der PDEXV-Expression verwendet werden. Die Form derartiger qualitativer oder quantitativer Verfahren kann Southern- oder Northern-Analyse, Dot Blot- oder andere Technolgien auf Membranbasis, PCR-Technologien, Tupferstäbchen-, Stift- oder Chiptechnologien, und ELISA- oder andere Mehrfachprobenformaltechnologien umfassen. Alle diese Techniken sind einschlägig bekannt und tatsächlich die Basis vieler im Handel erhältlicher Diagnosekits.
Derartige Tests können zur Bewertung der Wirksamkeit eines speziellen therapeutischen Behandlungsprotokolls maßgeschneidert werden und bei Tierversuchen, in klinischen versuchen oder bei der Überwachung der Behandlung eines individuellen Patienten verwendet werden. Zur Bereitstellung einer Basis für die Diagnose einer Erkrankung sollte ein Normal- oder Standardprofil für die PDE-Expression festgestellt werden. Dies wird durch die Kombination von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die normalen Subjekten, entweder einem Tier oder Menschen, entnommen wurden, mit PDEXV oder einem Teil derselben unter zur Hybridisierung oder Amplifikation geeigneten Bedingungen durchgeführt. Die Standardhybridisierung kann durch Vergleich der von normalen Subjekten erhaltenen Werte mit einer Verdünnungsreihe positiver Kontrollen, die bei dem gleichen Experiment durchgeführt wurden, wobei eine bekannte Menge gereinigter PDEXV verwendet wird, quantitativ bestimmt werden. Standardwerte, die von normalen Proben erhalten wurden, können mit Werten, die von Proben von Subjekten, die potentiell von einer mit der Expression der PDE-Codierungssequenz in Verbindung stehenden Störung oder Erkrankung betroffen sind, erhalten wurden, verglichen werden. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten stellt das Vorhandensein des Erkrankungszustands fest. Wenn eine Erkrankung festgestellt wurde, wird ein vorhandenes therapeutisches Mittel verabreicht und ein Behandlungsprofil oder Behandlungswerte können erzeugt werden. Schließlich kann der Test auf einer regelmäßigen Basis wiederholt werden, um zu bewerten, ob die Werte zum normalen oder Standardmuster vorschreiten oder zurückkehren. Folgende Behandlungsprofile können dazu verwendet werden, die Wirksamkeit einer Behandlung über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
Daher betrachtet die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines PDEXV-Polypeptids oder einer Variante, eines Homologons, eines Fragments oder eines Derivats desselben zur Herstellung von Anti-PDEXV-Antikörpern, die beispielsweise diagnostisch zur Detektion und quantitativen Bestimmung der PDEXV-Spiegel bei Erkrankungszuständen verwendet werden können.
Die vorliegende Anmeldung betrachtet ferner diagnostische Tests und Kits zur Detektion von PDEXV in Zellen und Geweben, die eine gereinigte PDEXV, die als positive Kontrolle verwendet werden kann, und Anti-PDEXV-Antikörper umfassen. Derartige Antikörper können in Verfahren auf Lösungsbasis, Membranbasis oder Gewebebasis zur Detektion eines Erkrankungszustands oder eines Zustands, die mit der Expression eines PDEXV-Proteins oder der Expression von Deletionen oder einer Variante, eines Homologons, eines Fragments oder Derivats desselben in Verbindung stehen, verwendet werden.
SONDEN
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung ist die Beschreibung von Nucleinsäurehybridisierungs- oder PCR-Sonden, die zur Detektion von Polynucleotidsequenzen einschließlich von Genomsequenzen mit Codierung der PDE-Codierungsregion oder eng verwandten Molekülen, wie Allelen, fähig sind. Die Spezifität der Sonde, d.h. das Merkmal, ob sie von einer hochkonservierten, konservierten oder nicht-konservierten Region oder Domäne stammt, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (hoch, mittel oder niedrig) bestimmt, ob die Sonde nur eine natürlich vorkommende PDE-Codierungssequenz oder verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden zur Detektion verwandter Nucleinsäuresequenzen sind aus konservierten oder hochkonservierten Nucleotidregionen von Mitgliedern der Familie von PDEs cyclischer Nucleotide, beispielsweise der 3'-Region, ausgewählt, und derartige Sonden können in einem Pool entarteter Sonden verwendet werden. Zur Detektion identischer Nucleinsäuresequenzen oder wenn eine maximale Spezifität gewünscht wird, werden Nucleinsäuresonden aus den nicht-konservierten Nucleotidregionen oder singulären Regionen von PDE-Nucleotiden ausgewählt. Der hier verwendete Ausdruck "nicht-konservierte" Nucleotidregion bezeichnet eine Nucleotidregion, die für die hier offenbarte PDE-Codierungssequenz singulär ist und in verwandten Familienmitgliedern, wie bekannten PDEs cyclischer Nucleotide, nicht auftritt.
PCR gemäß der Beschreibung in US-A-4 683 195, US-A-4 800 195 und US-A-4 965 188 ergibt weitere Verwendungsmöglichkeiten für Oligonucleotide auf der Basis der PDEXV-Sequenz. Derartige Oligomere werden allgemein chemisch synthetisiert, doch können sie enzymatisch erzeugt oder durch eine rekombinante Quelle produziert werden. Oligomere umfassen allgemein zwei Nucleotidsequenzen, eine mit Sense-Orientierung (5' → 3') und eine mit Antisense-Orientierung (3' ← 5'), die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung eines spezifischen Gens oder Zustands verwendet werden. Die gleichen zwei Oligomere, verknäuelte Oligomerensätze oder auch ein entarteter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zur Detektion und/oder Quantifizierung eng verwandter DNA- oder RNA-Sequenzen verwendet werden.
Die Nucleinsäuresequenz für PDEXV kann auch zur Erzeugung von Hybridisierungssonden, wie früher beschrieben, zur Kartierung der endogenen Genomsequenz verwendet werden. Die Sequenz kann für ein spezielles Chromosom oder für eine spezifische Region des Chromosoms unter Verwendung bekannter Techniken kartiert werden. Diese umfassen eine In-situ- Hybridisierung mit chromosomalen Strecken (Verma et al. (1998) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), durchflusssortierten Chromosompräparaten oder künstlichen Chromosomkonstruktionen, wie YACs, künstlichen Bakterienchromosomen (BACs), Bakterien-PI-Konstruktionen oder Einzelchromosom-cDNA-Bibliotheken.
Die In-situ-Hybridisierung von Chromosompräparaten und physikalische Kartierungstechniken, wie Verknüpfungsanalyse unter Verwendung bekannter Chromosomenmarker, sind zur Verlängerung von Genkarten unverzichtbar. Beispiele für Genkarten finden sich in Science (1995; 270: 410f und 1994; 265: 1981f). Häufig kann die Platzierung eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Säugerart assoziierte Marker enthüllen, auch wenn die Zahl oder der Zweig eines speziellen humanen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können Chromosomenzweigen oder Teilen desselben durch physikalische Kartierung zugeordnet werden. Dies ergibt eine wertvolle Information für Forscher, die nach Krankheitsgenen unter Verwendung von positioneller Klonierung oder anderen Genentdeckungstechniken suchen. Sobald eine Krankheit oder ein Syndrom, wie Ataxia telangiectasia (AT) durch genetische Verknüpfung mit einer speziellen Genomregion grob lokalisiert ist, beispielsweise AT bei 11g22-23 (Gatti et al. (1988) Nature 336: 577–580), können Sequenzen, die in diesem Bereich kartiert sind, assoziierte oder regulatorische Gene zur weiteren Untersuchung darstellen. Die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann auch zur Detektion von Unterschieden des Chromosomorts aufgrund von Translokation, Inversion und dgl. zwischen normalen, Träger- oder betroffenen Individuen verwendet werden.
PHARMAZEUTIKA
Die vorliegende Anmeldung betrachtet ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines diese benötigenden Individuums aufgrund von PDEXV-Aktivität, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, das die Aktivität beeinflusst (beispielsweise hemmt), und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, Streckmittel oder Adjuvans umfasst.
Daher umfasst die vorliegende Anmeldung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die die oben beschriebenen Mittel (d.h. ein Mittel mit der Fähigkeit zur Modulation des Expressionsmusters der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder der Aktivität des Expressionsprodukts derselben und/oder ein Mittel, das durch einen Test gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde) umfassen. Im Hinblick darauf und insbesondere für eine humane Therapie werden die Mittel, auch wenn sie allein verabreicht werden können, allgemein im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger, Streckmittel oder Verdünnungsmittel, das im Hinblick auf den geplanten Verabreichungsweg und die pharmazeutische Standardpraxis gewählt ist, verabreicht.
Vom Umfang des Mittels umfasst werden Oligonucleotidsequenzen, Antisense-RNA- und DNA-Moleküle und Ribozyme, die eine Destabilisierung von PDEXV-mRNA oder Hemmung der Translation einer PDEXV bewirken. Derartige Nucleotidsequenzen können bei Zuständen, bei denen eine Erhöhung der Konzentrationen cyclischer Nucleotide günstig ist, beispielsweise einer Entzündung, verwendet werden.
Ein PDEXV-Antisense-Molekül kann die Basis zur Behandlung von verschiedenen anormalen Zuständen, die beispielsweise mit einer erhöhten PDEXV-Aktivität in Verbindung stehen, bilden.
Ein PDEXV-Nucleinsäure-Antisense-Molekül kann zur Blockierung der Aktivität der PDEXV bei Zuständen, bei denen eine Erhöhung der Konzentrationen cyclischer Nucleotide günstig ist, verwendet werden.
Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenoviren, Herpes- oder Vacciniaviren oder von verschiedenen Bakterienplasmiden abgeleitet sind, können zur Abgabe von rekombinanten PDEXV-Sense- oder -Antisense-Molekülen an die Ziel-Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter Vektoren, die PDEXV enthalten, verwendet werden. Alternativ kann rekombinante PDEXV Zielzellen in Liposomen zugeführt werden.
Die cDNA-Sequenz voller Länge und/oder deren regulatorische Elemente ermöglichen Forschern die Verwendung von PDEXV als Werkzeug bei Sense-Untersuchungen der Genfunktion (Youssoufian H und HF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13: 98–104) oder Antisense-Untersuchungen der Genfunktion (Eguchi et al. (1991) Annu Rev Biochem 60: 631–652). Oligonucleotide, die nach der cDNA oder Kontrollsequenzen, die von der Genom-DNA erhalten wurden, gestaltet sind, können in vitro oder in vivo zur Hemmung einer Expression verwendet werden. Diese Technologie ist nun einschlägig bekannt, und Sense- oder Antisense-Oligonucleotide oder größere Fragmente können nach verschiedenen Orten längs der Codierungs- oder Kontrollregionen gestaltet werden. Passende Nucleotide, die eine Länge von 20 Nucleotiden aufweisen können, können zur Isolierung von PDEXV-Sequenzen oder eng verwandten Molekülen von humanen Bibliotheken verwendet werden.
Ferner kann die PDEXV-Expression durch Transfektion einer Zelle oder eines Gewebes mit Expressionsvektoren, die hohe Mengen eines PDEXV-Fragments unter Bedingungen, in denen eine Blockade der Phosphodiesteraseaktivität günstig ist, exprimieren, moduliert werden, wodurch die Konzentrationen cyclischer Nucleotide erhöht werden. Derartige Konstrukte können Zellen mit nicht-translatierbaren Sense- oder Antisense-Sequenzen überschwemmen. Auch bei Fehlen einer Integration in die DNA können derartige Vektoren die Transkription von RNA-Molekülen fortsetzen, bis alle Kopien des Vektors durch endogene Nucleasen ausgeschaltet sind. Eine derartige transiente Expression kann bei einem nichtreplizierenden Vektor einen Monat oder länger und, wenn passende Replikationselemente Teil des Vektorsystems sind, noch länger anhalten.
Modifikationen der Genexpression können durch Gestalten von Antisense-Sequenzen zu den Kontrollregionen des PDE-Gens, wie den Promotoren, Enhancern und Introns, erhalten werden.
Oligonucleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle, beispielsweise von Regionen der Leadersequenz zwischen –10 und +10, stammen, sind bevorzugt. Antisense-RNA- und DNA-Moleküle können auch zur Blockade der Translation von mRNA durch Verhindern einer Bindung des Transkripts an Ribosomen gestaltet werden. In ähnlicher Weise kann eine Hemmung unter Verwendung der Hogeboom-Basenpaarungsmethodik, die auch als "Dreifachhelix"-Basenpaarung bekannt ist, erreicht werden. Die Dreifachhelixpaarung umfasst die Fähigkeit der Doppelhelix zu einer ausreichenden Öffnung zur Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen.
Daher betrachtet die vorliegende Anmeldung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen von Inhibitoren oder Antagonisten des PDEXV-Proteins (einschließlich von Antisense-Nucleinsäuresequenzen) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger, Streckmittel oder Adjuvans (einschließlich Kombinationen derselben) umfassen.
Die vorliegende Anmeldung betrachtet pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Gesamtheit oder Teile von PDEXV-Polynucleotidsequenzen, PDEXV-Antisense-Molekülen, PDEXV-Polypeptiden, ein Protein, Peptid oder organische Modulatoren der PDEXV-Bioaktivität, wie Inhibitoren, Antagonisten (einschließlich von Antikörpern) oder Agonisten, allein oder in einer Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie einer stabilisierenden Verbindung, umfassen können und in einem sterilen, biologisch kompatiblen pharmazeutischen Träger, der, ohne hierauf beschränkt zu sein, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser umfasst, verabreicht werden können.
ALLGEMEINE VERFAHRENSVERWEISE
Obwohl die hier genannten Techniken allgemein einschlägig bekannt sind, sei insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4. Auflage, John Wiley & Sons, Inc., verwiesen. PCR ist in US-A-4 683 195, US-A-4 800 195 und US-A-4 965 188 beschrieben.
HINTERLEGUNGEN
Die folgende Probe wurde gemäß dem Budapest Treaty bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) in 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RY, am 9. September 1999 hinterlegt.
Die NCIMB-Nummer NCIMB 41025 ist Escherichia coli (pHSPDExv).
Der Hinterleger war Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, United Kingdom.
Die vorliegende Anmeldung umfasst auch Sequenzen, die aufgrund dieser Hinterlegung ableitbar und/oder exprimierbar sind und diese umfassende Ausführungsformen. Die vorliegende Anmeldung umfasst ferner Teilsequenzen, die von dieser Hinterlegung ableitbar und/oder exprimierbar sind und diese umfassende Ausführungsformen, wobei die Teilsequenzen für aktive und enzymatische Zentren codieren. Die vorliegende Anmeldung umfasst ferner Proteine, die Sequenzen umfassen, die von dieser Hinterlegung ableitbar und/oder exprimierbar sind, und diese umfassende Ausführungsformen. Die vorliegende Anmeldung umfasst ferner Proteine, die Teilsequenzen umfassen, die von dieser Hinterlegung ableitbar und/oder exprimierbar sind, und diese umfassende Ausführungsformen, wobei die Teilsequenzen für aktive enzymatische Zentren codieren.
Die vorliegende Erfindung wird nun, lediglich als Beispiel, beschrieben.
Isolierung von cDNA von PDEXV
Materialien und Verfahren
5'RACE: Reaktionspuffer und Enzyme wurden in Kitformat von Life Technologies erhalten. Das Protokoll wurde nach dem Instruction Manual ([Life Technologies] 5'RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Version 2. Katalognr. 18374-058) unter Verwendung des dA-Schwanzes der cDNA des ersten Strangs durchgeführt.
Expression: PDEXV wurde unter Verwendung des Baculovirussystems exprimiert, was später detailliert angegeben ist.
Ergebnisse

Identifizierung der Originalsequenz in der IMAGE EST-Datenbank durch Schlüsselwortrecherche (IMAGE-Klon Nr. 1639772 – isoliert aus humaner Hodenbibliothek)

Zur Gewinnung der vollständigen 5'-Sequenz der Spleißvariante wurde eine 5'-Schnellamplifikation der cDNA-Enden (RACE) an Hoden-poly A⁺RNA (Clontech) durchgeführt.
cDNA wurde aus der Hoden-poly A⁺RNA unter Verwendung von GSP1 als Syntheseprimer erzeugt. Die erste Runde PCR an dieser cDNA wurde unter Verwendung von GSP2 als dem 3'-Primer und dem Ankerprimer, der mit dem Kit geliefert wurde, durchgeführt. Knäuel-PCR an den Produkten der ersten Runde wurde unter Verwendung von GSP3 als dem 3'-Primer und dem 5'-Adapterprimer, der mit dem Kit geliefert wurde, durchgeführt. Die geknäuelten RACE-Produkte wurden zur Erzeugung einer Minibibliothek von 1500 Klonen in dem TOPOTA-Klonierungsvektor (PCR2.1-TOPO, Invitrogen) verwendet. Diese Minibibliothek wurde durch Hybridisierung mit einer Oligonucleotidsonde GSP4 gescreent.
Acht Klone wurden identifiziert, die bei der Sequenzierung ergaben, dass sie die bekannte PDE11-Sequenz verlängerten. Unter Verwendung dieser verlängerten Sequenz wurde ein 5'-Primer (GSP5) derart gestaltet, dass er die Klonierung der neuen Sequenz in den Expressionvektor pFASTBAC-FLAG ermöglichte. Dieser Primer enthält eine technisch veränderte RsrII-Stelle.
PCR unter Verwendung von GSP5 (5'-Primer) und GSP6 (3'-Primer) erzeugte ein 780-bp-Fragment, das eine 5'-gen-technisch-veränderte RsrII-Stelle und eine natürliche StuI-Stelle enthielt.
Das urprüngliche PDE11A1(PDE10-Incyte)-Expressionskonstrukt in pFASTBAC und das obige 780-bp-Fragment wurden mit den Restriktionsendonucleasen RsrII und StuI verdaut. Das 780-bp-Fragment wurde mit dem 3'-Ende von PDE11A1 ligiert, wobei die verlängerte Spleißvariante PDExv (PDE11A3) erzeugt wurde. Das gesamte PDExv-Konstrukt wurde dann in pFASTBAC-FLAG kloniert.
Expression
Das rekombinante Enzym hydrolysiert sowohl cGMP als auch CAMP.
Baculovirusexpression
Die folgenden Untersuchungen belegen, dass das PDE-Enzym der vorliegenden Erfindung – hier kurz als PDE bezeichnet – unter Verwendung eines Baculovirusexpressionssystems erzeugt werden kann.
Die folgenden Untersuchungen belegen ferner, dass die PDE hydrolytische Aktivität für cyclische Nucleotide zeigt, wenn es in dem Baculovirussystem exprimiert wurde.
Das PDE-Enzym wurde unter Verwendung des Baculovirusexpressionssystems auf der Basis einer Infektion von Spodoptera frugiperda-Insektenzellen (Sf9-Zellen) mit dem Autographa californica Nuclear Polyhydrosis Virus (AcNPV) erzeugt.
Bei diesen Untersuchungen wurde cDNA mit Codierung für PDE in das Donorplasmid pFASTBAC-FLAG, das ein Mini-Tn7-Transpositionselement enthält, kloniert. Das rekombinante Plasmid wurde in für DH1OBAC kompetente Zellen, die das Stammbacmid bMON14272 (AcNPV-infektiöse DNA) und ein Helferplasmid enthalten, transformiert. Das Mini-Tn7-Element auf dem pFASTBAC-Donor kann eine Transposition zu der attTn7-Bindungsstelle an dem Bacmid durchführen, wodurch das PDE-Gen in das Virusgenom eingeführt wird. Kolonien, die rekombinante Bacmide enthalten, werden durch die Zertrennung des lacZ-Gens identifiziert. Das PDE/Bacmid-Konstrukt kann dann isoliert und in Insektenzellen (Sf9-Zellen) infiziert werden, was zur Produktion infektiöser rekombinanter Baculoviruspartikel und zur Expression von rekombinantem PDE-FLAG-Fusionsprotein führt.
Die Phosphodiesteraseaktivität der rohen Zellextrakte wurde ermittelt.
Zellen wurden geerntet und Extrakte wurden 24, 48 und 72 h nach der Transfektion hergestellt.
Die Ergebnisse bestätigen, dass PDE-cDNA für eine Phospho diesterase codiert, die cAMP und cGMP hydrolysieren kann.
Das rohe Lysatmaterial wurde mittels FPLC unter Verwendung einer Säule, die Agaroseperlen (M2-Affinitätsgel) enthielt, an die ein gereinigter monoklonaler IgG₁-Anti-FLAG-Antikörper durch Hydrazidverknüpfung konjugiert worden war (Eastman Kodak), gereinigt. Dies ermöglicht die spezifische Retention des rekombinanten Materials (da dieses an das FLAG-Epitop fusioniert ist) an der Säule, während die endogenen Insektenproteine in dem Eluat weggewaschen werden. Das rekombinante Material wird dann unter Bedingungen eines niedrigen pH-Werts abgewaschen. Dieses gereinigte Material war für detaillierte enzymatische und Inhibitoruntersuchungen günstig. Die Reinheit des Materials wird durch Coomassie-Färbung nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran einer nicht gefärbten SDS-PAGE (die rekombinante PDE enthält) und Analyse mit dem monoklonalen IgG₁-Anti-FLAG-Epitop-Antikörper festgestellt. Das PDE-FLAG-Fusionsprotein wird aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Anti-FLAG-Antikörper und dem FLAG-Epitop, das an das PDE-Protein fusioniert ist, detektiert.
Die Phosphodiesteraseaktivität des gereinigten PDE-FLAG-Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen SPA(Scintillation Proximity Assay)-Kit (Amersham – Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA UK) auf hydrolytische Aktivität entweder gegenüber cAMP und/oder cGMP getestet. Dies kann zur Bestimmung des Km-Werts für PDE gegenüber cAMP und/oder cGMP durch Bestimmen der Enzymaktivität mit einem Bereich von Substratkonzentrationen verwendet werden, wodurch die Berechnung eines näherungsweisen Vmax-Werts für das Enzym möglich ist.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die PDE-cDNA eine Phosphodiesterase codiert, die cAMP und cGMP hydrolysieren kann.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung bereit:

1. Neue Aminosäuresequenzen
2. Neue Nucleotidsequenzen
3. Tests unter Verwendung der neuen Sequenzen
4. Expressionssysteme, die die neuen Sequenzen umfassen oder exprimieren.

SEQUENZPROTOKOLLE

Claims

Aminosäuresequenz mit PDEXV-Aktivität, die den Abbau von cAMP und cGMP katalysieren kann, wobei die Aminosäuresequenz die als SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz oder eine Variante derselben umfasst, die Variante mindestens 95% Homologie mit der als SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz aufweist, und die mindestens 25 fortlaufende Aminosäuren der im folgenden angegebenen N-terminalen Sequenz umfasst:
Nucleotidsequenz mit Codierung für die Aminosäuresequenz gemäß der Definition in Anspruch 1.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 2, die die als SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz oder eine Variante derselben mit mindestens 95% Homologie zu dieser umfasst.
Vektor, der die Nucleotidsequenz nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 umfasst.
Isolierte Wirtszelle, in die die Nucleotidsequenz nach Anspruch 2 oder 3 eingebaut ist.
Testverfahren zur Identifizierung eines Mittels, das eine PDEXV-Aktivität (d.h. eine Fähigkeit zur Katalyse des Abbaus von cAMP und cGMP) oder die PDEXV-Expression beeinflussen kann, wobei das Testverfahren das Kontaktieren eines Mittels mit einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 oder einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 2 oder 3; und das Ermitteln der PDEXV-Aktivität oder -Expression umfasst, wobei ein Unterschied zwischen (a) der PDEXV-Aktivität oder -Expression in Abwesenheit des Mittels und (b) der PDEXV-Aktivität oder -Expression in Gegenwart des Mittels anzeigt, dass das Mittel die PDEXV-Aktivität oder -Expression beeinflussen kann.