DE19611234C1 - Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein - Google Patents

Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines sol­ chen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins sowie gegen das Protein gerichtete Antikörper.
Tyrosin-Kinase und Tyrosin-Phosphatase sind Enzyme, die entgegengesetzt wirken. Tyrosin-Kinase bewirkt die Phosphorylierung bestimmter Tyrosin-Reste in Proteinen, während Tyrosin-Phosphatase diese Phosphorylierung wieder rückgängig macht. Beide Enzyme spielen eine wichtige Rolle in der Signaltrans­ duktion, der Kontrolle des Zellwachstums und in der Zelldifferenzierung.
Es sind Erkrankungen bekannt, die auf Störungen in der Zelldifferenzierung beruhen. Eine dieser Erkrankungen ist myotubuläre Myopathie. Dies ist eine X- chromosomal-gebundene Erkrankung, bei der veränderte Muskelzellen vorliegen. Die Erkrankung äußert sich in allgemeiner Muskelschwäche, insbesondere sind spontane Bewegungen kaum möglich. Ebenso ist die Atmung bei Neugeborenen stark eingeschränkt. Dies führt vielfach zum frühzeitigen Tod. Die Ursachen für die gestörte Zelldifferenzierung bei myotubulärer Myopathie sind allerdings nicht bekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem Störungen in der Zelldifferenzierung, insbesondere bei myotubu­ lärer Myopathie, in ihrer Ursache untersucht und gegebenenfalls therapiert werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Tyrosin-Phosphatase­ verwandtes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäure­ sequenz, wobei das Protein eine Tyrosin-Phosphatase-Aktivität aufweist und sich von bekannten Tyrosin-Phosphatasen auf dem DNA-Level durch Hybridis­ ierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet oder ohne bzw. mit einge­ schränkter Tyrosin-Phosphatase-Aktivität zu Störungen der Differenzierung von Zellen führt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Tieren, besonders Säugetieren, ganz besonders dem Menschen, ein Protein existiert, das Homologien zu bekannten Tyrosin-Phosphatasen und auch eine Tyrosin-Phosphatase-Aktivität aufweist, sich aber von bekannten Tyrosin- Phosphatasen auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedin­ gungen unterscheidet. Ein solches Protein weist die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz auf. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß das Protein wichtig für die Zelldifferenzierung ist. Er hat gefunden, daß dieses Protein in verkürzter bzw. mutierter Form, d. h. ohne oder nur mit eingeschränkter Tyrosin- Phosphatase-Aktivität, zu Störungen der Differenzierung von Zellen, insbesonde­ re Muskelzellen, und ganz besonders zur Ausbildung von myotubulärer Myopa­ thie, führt.
In der vorliegenden Erfindung wird vorstehendes Protein mit "Tyrosin-verwand­ tes Protein" (TVP) bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für (TVP) kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
  • (a) die DNA von Fig. 1,
  • (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
  • (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.
Die DNA von Fig. i wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis­ men und Zellkulturen) als hp6 unter DSM 10558 am 4. März 1996 hinterlegt.
Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen cDNA ist es günstig, von einer Cos­ mid-Bibliothek auszugehen, welche die Region Xq28 des menschlichen Genoms umfaßt. Eine solche Cosmid-Bibliothek ist z. B. die Xq28 spezifische Cosmidbi­ bliothek (vgl. Kioschis, P. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 58, (1991), 2070) die aus dem Zellhybrid QlZ hergestellt wurde (vgl. Warren, S. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3856-3860). Von dieser werden die Cosmid-Klone Qc8D11, Qc3F12 und Qc12G11 (vgl. Kioschis, P. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 58, (1991), 2070; Kioschis, P. et al., Genomics 33, (1996), im Druck), verwendet und einer cDNA Selektion (vgl. Korn, B. et al., Mol. Genet. 4 (1992), 235-242), unterworfen, wodurch das cDNA-Fragment 79g1P5 erhalten wird. Dieses wird zur Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von humaner Placenta (z. B. STRATAGENE, Kat. Nr. 936203) verwendet. Es wird eine erfindungsgemäße cDNA erhalten.
Eine erfindungsgemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex­ pressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Ex­ pression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressions­ vektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 undSG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fu­ sionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans­ fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen­ des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona­ len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu­ sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo­ nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Störungen der Zelldifferenzierung, insbesondere bei Muskelzellen und ganz besonders bei myotubulärer Myopathie, in ihrer Ursache zu untersuchen. Mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, und hiervon abgeleiteten Primern, kann in Säugetieren, insbesondere dem Menschen festgestellt werden, ob sie ein Gen enthalten und/oder exprimieren, das für ein verkürztes bzw. mutiertes (TVP) in vorstehen­ dem Sinne kodiert. Hierzu wird der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkiption, PCR-Reaktion, Hybridisierung und Sequenzierung, durchführen. Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der eine vorstehende Nu­ kleinsäure, insbesondere DNA, und/oder hiervon abgeleitete Primer sowie Träger und übliche Hilfsstoffe enthält.
Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung, therapeutische Maßnahmen bei Störungen der Zelldifferenzierung, insbesondere bei Muskelzellen und ganz besonders bei myotubulärer Myopathie, zu ergreifen. Ein erfindungsgemäßes (TVP) kann in Säugetiere, insbesondere den Menschen, eingebracht werden. Hierzu kann es günstig sein, (TVP) an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, in Säugetiere, ins­ besondere den Menschen, eingebracht und dort exprimiert werden. Hierzu kann es günstig sein, die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure unter die Kontrolle eines Gewebe-spezifischen Promotors, insbesondere eines Muskel­ spezifischen Promotors, zu stellen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann die Expression von (TVP) kontrolliert und reguliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zur diagnostischen und therapeutischen Erfassung von Störungen der Zelldifferenzierung, insbeson­ dere bei Muskelzellen und ganz besonders bei myotubulärer Myopathie, dar. Die diagnostische Erfassung kann dabei nicht nur post- sondern bereits auch präna­ tal erfolgen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese­ quenz eines erfindungsgemäßen (TVP).
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen (TVP)
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen (TVP) wurde die DNA von Fig. 1 als Template verwendet. Es wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt. Als Primer-Paar wurde verwendet:
MTM-F: 5′-CAGGGATCCGATGGCAGCCGAGCAGCCTGGCAAC-3′ und
MTM-R: 5′-GGGGGATCCTCAGAAGTGAGTTTGCACATGGGG-3′
Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
PCR-Ansatz
Template DNA (Fig. 1):
1 µl = 1 ng
Pfu-Polymerase 10x-Puffer: 10 µl = 1 x
DMSO: 10 µl = 10%
dNTP′s: 1 µL = je 200 µM
Oligonukleotide, je 1,5 µl: 3 µl = je 150 ng
H₂O-bidest: ad 99 µl
PCR-Bedingungen
  • - 92°C - 5 min
  • - Zugabe von 1 µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
  • - Zugabe von Paraffin
PCR
92°C 1 min
58°C 1 min 1 Zyklus
72°C 10 min @ 92°C 1 min @ 58°C 1 min 39 Zyklen
72°C 2 min @ 72°C 10 min 1 Zyklus
Die amplifizierte DNA wurde jeweils mit Bam Hl gespalten und in den mit Bam Hl gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pQ/TVP erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (TVP) von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQ/TVP wurde zur Transformation von E. coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwen­ det. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra­ nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromato­ graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 2 Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 205 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adluvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5′ Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adluvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adluvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adluvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adluvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs­ gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims (10)

1. Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein, umfassend die Aminosäurese­ quenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei das Protein eine Tyrosin- Phosphatase-Aktivität aufweist und sich von bekannten Tyrosin-Phospha­ tasen auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingun­ gen unterscheidet oder ohne bzw. mit eingeschränkter Tyrosin-Phosphata­ se-Aktivität zu Störungen der Differenzierung von Zellen führt.
2. DNA, kodierend für das Protein nach Anspruch 1, wobei die DNA umfaßt:
  • (a) die DNA von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
  • (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
  • (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten geneti­ schen Code verwandte DNA.
3. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 2.
4. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.
5. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 4 unter geeigneten Bedin­ gungen.
6. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 1.
7. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 als Reagens zur Therapie einer gestörten Zelldifferenzierung.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die gestörte Zelldifferenzierung bei myotubulärer Myopathie vorliegt.
9. Verwendung der DNA nach Anspruch 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie einer gestörten Zelldifferenzierung.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die gestörte Zelldifferenzierung bei myotubulärer Myopathie vorliegt.
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