DE19611234C1 - Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein - Google Patents
Tyrosin-Phosphatase-verwandtes ProteinInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein,
eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines sol
chen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins
sowie gegen das Protein gerichtete Antikörper.
Tyrosin-Kinase und Tyrosin-Phosphatase sind Enzyme, die entgegengesetzt
wirken. Tyrosin-Kinase bewirkt die Phosphorylierung bestimmter Tyrosin-Reste
in Proteinen, während Tyrosin-Phosphatase diese Phosphorylierung wieder
rückgängig macht. Beide Enzyme spielen eine wichtige Rolle in der Signaltrans
duktion, der Kontrolle des Zellwachstums und in der Zelldifferenzierung.
Es sind Erkrankungen bekannt, die auf Störungen in der Zelldifferenzierung
beruhen. Eine dieser Erkrankungen ist myotubuläre Myopathie. Dies ist eine X-
chromosomal-gebundene Erkrankung, bei der veränderte Muskelzellen vorliegen.
Die Erkrankung äußert sich in allgemeiner Muskelschwäche, insbesondere sind
spontane Bewegungen kaum möglich. Ebenso ist die Atmung bei Neugeborenen
stark eingeschränkt. Dies führt vielfach zum frühzeitigen Tod. Die Ursachen für
die gestörte Zelldifferenzierung bei myotubulärer Myopathie sind allerdings nicht
bekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem Störungen in der Zelldifferenzierung, insbesondere bei myotubu
lärer Myopathie, in ihrer Ursache untersucht und gegebenenfalls therapiert
werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Tyrosin-Phosphatase
verwandtes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine
hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäure
sequenz, wobei das Protein eine Tyrosin-Phosphatase-Aktivität aufweist und
sich von bekannten Tyrosin-Phosphatasen auf dem DNA-Level durch Hybridis
ierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet oder ohne bzw. mit einge
schränkter Tyrosin-Phosphatase-Aktivität zu Störungen der Differenzierung von
Zellen führt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in
Tieren, besonders Säugetieren, ganz besonders dem Menschen, ein Protein
existiert, das Homologien zu bekannten Tyrosin-Phosphatasen und auch eine
Tyrosin-Phosphatase-Aktivität aufweist, sich aber von bekannten Tyrosin-
Phosphatasen auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedin
gungen unterscheidet. Ein solches Protein weist die Aminosäuresequenz von Fig.
1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche
Aminosäuresequenz auf. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß das Protein
wichtig für die Zelldifferenzierung ist. Er hat gefunden, daß dieses Protein in
verkürzter bzw. mutierter Form, d. h. ohne oder nur mit eingeschränkter Tyrosin-
Phosphatase-Aktivität, zu Störungen der Differenzierung von Zellen, insbesonde
re Muskelzellen, und ganz besonders zur Ausbildung von myotubulärer Myopa
thie, führt.
In der vorliegenden Erfindung wird vorstehendes Protein mit "Tyrosin-verwand
tes Protein" (TVP) bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für (TVP) kodierende
Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine
genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes
umfaßt:
- (a) die DNA von Fig. 1,
- (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
- (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen
Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit
einer DNA von (a) hybridisiert.
Die DNA von Fig. i wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis
men und Zellkulturen) als hp6 unter DSM 10558 am 4. März 1996 hinterlegt.
Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben.
Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen cDNA ist es günstig, von einer Cos
mid-Bibliothek auszugehen, welche die Region Xq28 des menschlichen Genoms
umfaßt. Eine solche Cosmid-Bibliothek ist z. B. die Xq28 spezifische Cosmidbi
bliothek (vgl. Kioschis, P. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 58, (1991), 2070) die
aus dem Zellhybrid QlZ hergestellt wurde (vgl. Warren, S. T. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87 (1990), 3856-3860). Von dieser werden die Cosmid-Klone
Qc8D11, Qc3F12 und Qc12G11 (vgl. Kioschis, P. et al., Cytogenet. Cell.
Genet. 58, (1991), 2070; Kioschis, P. et al., Genomics 33, (1996), im Druck),
verwendet und einer cDNA Selektion (vgl. Korn, B. et al., Mol. Genet. 4 (1992),
235-242), unterworfen, wodurch das cDNA-Fragment 79g1P5 erhalten wird.
Dieses wird zur Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von humaner Placenta (z. B.
STRATAGENE, Kat. Nr. 936203) verwendet. Es wird eine erfindungsgemäße
cDNA erhalten.
Eine erfindungsgemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor
vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex
pressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T,
pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind
z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen
Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Ex
pression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressions
vektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem
Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen
umfassen die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 undSG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces
cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa
sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen
Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA
in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA
inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fu
sionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans
fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die
erfindungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein
solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen
des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper
kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw.
monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere
Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona
len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon
zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu
sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann
dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo
nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Störungen der Zelldifferenzierung,
insbesondere bei Muskelzellen und ganz besonders bei myotubulärer Myopathie,
in ihrer Ursache zu untersuchen. Mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure,
insbesondere einer DNA, und hiervon abgeleiteten Primern, kann in Säugetieren,
insbesondere dem Menschen festgestellt werden, ob sie ein Gen enthalten
und/oder exprimieren, das für ein verkürztes bzw. mutiertes (TVP) in vorstehen
dem Sinne kodiert. Hierzu wird der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse
Transkiption, PCR-Reaktion, Hybridisierung und Sequenzierung, durchführen.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der eine vorstehende Nu
kleinsäure, insbesondere DNA, und/oder hiervon abgeleitete Primer sowie Träger
und übliche Hilfsstoffe enthält.
Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung, therapeutische Maßnahmen bei
Störungen der Zelldifferenzierung, insbesondere bei Muskelzellen und ganz
besonders bei myotubulärer Myopathie, zu ergreifen. Ein erfindungsgemäßes
(TVP) kann in Säugetiere, insbesondere den Menschen, eingebracht werden.
Hierzu kann es günstig sein, (TVP) an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd
angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, zu koppeln. Auch kann eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, in Säugetiere, ins
besondere den Menschen, eingebracht und dort exprimiert werden. Hierzu kann
es günstig sein, die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure unter die
Kontrolle eines Gewebe-spezifischen Promotors, insbesondere eines Muskel
spezifischen Promotors, zu stellen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper
kann die Expression von (TVP) kontrolliert und reguliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zur diagnostischen
und therapeutischen Erfassung von Störungen der Zelldifferenzierung, insbeson
dere bei Muskelzellen und ganz besonders bei myotubulärer Myopathie, dar. Die
diagnostische Erfassung kann dabei nicht nur post- sondern bereits auch präna
tal erfolgen.
Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese
quenz eines erfindungsgemäßen (TVP).
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen (TVP) wurde die DNA von Fig. 1 als
Template verwendet. Es wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt. Als Primer-Paar
wurde verwendet:
MTM-F: 5′-CAGGGATCCGATGGCAGCCGAGCAGCCTGGCAAC-3′ und
MTM-R: 5′-GGGGGATCCTCAGAAGTGAGTTTGCACATGGGG-3′
MTM-R: 5′-GGGGGATCCTCAGAAGTGAGTTTGCACATGGGG-3′
Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
| PCR-Ansatz | |
| Template DNA (Fig. 1): | |
| 1 µl = 1 ng | |
| Pfu-Polymerase 10x-Puffer: | 10 µl = 1 x |
| DMSO: | 10 µl = 10% |
| dNTP′s: | 1 µL = je 200 µM |
| Oligonukleotide, je 1,5 µl: | 3 µl = je 150 ng |
| H₂O-bidest: | ad 99 µl |
- - 92°C - 5 min
- - Zugabe von 1 µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
- - Zugabe von Paraffin
| PCR | |||
| 92°C 1 min | |||
| 58°C 1 min | 1 Zyklus | ||
| 72°C 10 min @ | 92°C 1 min @ | 58°C 1 min | 39 Zyklen |
| 72°C 2 min @ | 72°C 10 min | 1 Zyklus |
Die amplifizierte DNA wurde jeweils mit Bam Hl gespalten und in den mit Bam
Hl gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wurde das
Expressionsplasmid pQ/TVP erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein
aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (TVP)
von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQ/TVP wurde zur Transformation von E. coli SG
13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwen
det. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und
25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra
nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine
Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromato
graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der
Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt.
Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach
seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas,
J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form
hergestellt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 18% SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M
Natriumacetat wurde eine ca. 205 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten
und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden
sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte,
bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt
immunisiert:
Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS
und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adluvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein
erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl.
Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die
Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994),
215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine
Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war
das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten
mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert.
Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler
Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-
minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und
anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung
(36 µM 5′ Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium,
100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis
Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden
können.
Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS
und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es
wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS
und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adluvans eingesetzt; bei
der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adluvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adluvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adluvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adluvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs
gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.
Claims (10)
1. Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein, umfassend die Aminosäurese
quenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren
unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei das Protein eine Tyrosin-
Phosphatase-Aktivität aufweist und sich von bekannten Tyrosin-Phospha
tasen auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingun
gen unterscheidet oder ohne bzw. mit eingeschränkter Tyrosin-Phosphata
se-Aktivität zu Störungen der Differenzierung von Zellen führt.
2. DNA, kodierend für das Protein nach Anspruch 1, wobei die DNA umfaßt:
- (a) die DNA von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
- (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
- (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten geneti schen Code verwandte DNA.
3. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 2.
4. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.
5. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die
Kultivierung der Transformante nach Anspruch 4 unter geeigneten Bedin
gungen.
6. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 1.
7. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 als Reagens zur Therapie einer
gestörten Zelldifferenzierung.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die gestörte Zelldifferenzierung bei
myotubulärer Myopathie vorliegt.
9. Verwendung der DNA nach Anspruch 2 als Reagens zur Diagnose und/oder
Therapie einer gestörten Zelldifferenzierung.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die gestörte Zelldifferenzierung bei
myotubulärer Myopathie vorliegt.
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