DE60034880T2 - Ceramidasegen - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, einen Antikörper, der spezifisch daran bindet, ein das Polypeptid codierendes Gen und eine Sonde und einen Primer, welche in der Lage sind, spezifisch daran zu hybridisieren, welche als Reagenz zur Lipidmanipulation zur Analyse einer Struktur, von Funktionen und Ähnlichem eines Ceramids nützlich sind. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend erwähnten Polypeptids durch Mittel der Genmanipulation und ein Verfahren zum Nachweis des Polypeptids oder des Gens und einen Kit dafür. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Kontrolle der Menge eines Ceramids in einer Zelle und/oder in einem Gewebe, das bei einer Krankheit angewendet werden kann, die durch eine Abnormalität in der Menge des Ceramids verursacht wird.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Eine Ceramidase ist ein Enzym, welches ein Ceramid, eine Art von Sphingolipid, in ein Sphingoid und eine Fettsäure hydrolysiert. Das Sphingoid, welches durch Hydrolyse des Ceramids mit der Ceramidase erzeugt wird, besitzt verschiedene physiologische Aktivitäten wie die Hemmung der Proteinkinase C, Aktivierung der Phospholipase D und Hemmung eines Calmodulin-abhängigen Enzyms. Wie vorstehend beschrieben, ist das vorstehend erwähnte Sphingoid eine wichtige Substanz, von der angenommen wird, dass sie auf die Regulation der Zellfunktionen wirkt, da das Sphingoid an der Proliferation von Zellen und der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt ist. Die Ceramidase ist ein Enzym, welches eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Menge des vorstehend erwähnten Sphingoids ist.
  • Ceramidasen werden aufgrund des pH-Optimums in saure Ceramidasen und neutrale/alkalische Ceramidasen klassifiziert. Es wurde bislang berichtet, dass die Anwesenheit einer Ceramidase, die das pH-Optimum in einem sauren Bereich besitzt, in Säugergeweben wie Rattenhirn [Biochemistry, 8, 1692-1698 (1969)], Meerschweinchen-Epithelzellen [J. Biol. Chem., 270, 12677-12684 (1995)], menschlicher Niere [Biochim. Biophys. Acta, 398, 125-131 (1975)], Milz [Biochim. Biophys. Acta, 1004, 245-251 (1989)], Fibroblasten [Biochem. J., 205, 419-425 (1982)] und Epithel [FEBS Lett., 268, 110-112 (1990)] und menschlichem Urin [J. Biol. Chem., 270, 11098-11102 (1995)] und Ähnlichen gefunden wurde.
  • Zusätzlich wurde aufgeklärt, dass ein Bakterium, das zur Gattung Pseudomonas gehört, eine Ceramidase produziert und diese Ceramidase ist eine Ceramidase, die ein pH-Optimum im alkalischen Bereich besitzt [J. Biol. Chem., 273, 14386-14373 (1998)].
  • Unter diesen Ceramidasen wurden die Aminosäuresequenzen der aus menschlichem Urin gereinigten sauren Ceramidase und die Nucleotidsequenzen eines die Ceramidase codierenden Gens bestimmt [J. Biol. Chem., 271, 33110-33115 (1996)]. Zusätzlich wurde ein Gen einer sauren Ceramidase einer Maus durch Verwendung seiner Homologie mit dem vorstehend erwähnten Gen einer sauren Ceramidase aus menschlichem Urin erhalten [Genomics, 50, 267-274 (1998)].
  • Da jedoch alle Ceramidasegene aus Säugern, von denen berichtet wurde, saure Ceramidasen codieren, waren die Aminosäuresequenzen und Genomstrukturen der neutralen/alkalischen Ceramidase in Säugern gänzlich unbekannt, so dass die biologischen Funktionen der neutralen/alkalischen Ceramidase in höheren Organismen derzeit noch nicht aufgeklärt wurden.
  • In diesen Untersuchungen zur Aufklärung der in vivo-Funktionen eines Ceramids, der metabolischen Kontrolle dafür, der Diagnose oder Behandlung einer Erkrankung, die mit dem Ceramid assoziiert ist, oder von Ähnlichem, ist es notwendig, genaue Informationen bezüglich verschiedener Enzyme, die mit dem Ceramidgen assoziiert sind, und das Enzymgen zu erhalten. Wie vorstehend erwähnt, wurden derzeit jedoch noch keine Befunde zur Aminosäuresequenz und den Genen davon der neutralen/alkalischen Ceramidase in Säugern erhalten. Daher ist es notwendig, um das vorstehend beschriebene Verfahren, das ein Ceramid betrifft zu entwickeln, einige Befunde, die mit neutraler/alkalischer Ceramidase assoziiert sind, insbesondere ein Gen davon, zu erhalten.
  • Obwohl die Clonierung von Ceramidasegenen eines Säugers einige Male berichtet wurde, betreffen, wie vorstehend erwähnt, all diese Berichte Ceramidasen, die eine Aktivität in einem sauren Bereich besitzen, von denen nicht erwartet werden kann, dass sie eine Homologie mit einer Ceramidase mit einer Aktivität im neutralen/alkalischen Bereich aufweisen. Daher war es schwierig, ein Gen für eine neutrale/alkalische Ceramidase als Homologes einer Nucleotidsequenz eines Gens der sauren Ceramidase zu erhalten.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wurde angesichts des vorstehend beschriebenen Stands der Technik vollendet und eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gen einer neutralen/alkalischen Ceramidase eines Säugers bereitzustellen. Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zu Herstellung eines Gens einer neutralen/alkalischen Ceramidase in hoher Reinheit durch Mittel der Genmanipulation herzustellen, umfassend die Verwendung einer Transformante, der aus dem Einbau eines Expressionsvektors, der das Gen trägt, resultiert. Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein das vorstehend erwähnte Gen codierendes Polypeptid bereitzustellen. Eine vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Antisense-DNA und eine Antisense-RNA bereitzustellen, welche zu dem erfindungsgemäßen Gen oder einem Teil davon komplementär sind. Eine fünfte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine(n) synthetische(n) Oligonucleotidsonde oder -Primer, welche(r) in der Lage ist, spezifisch an das erfindungsgemäße Gen zu hybridisieren, bereitzustellen. Eine sechste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/s spezifisch an das Polypeptid bindet, bereitzustellen. Eine siebte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis der vorstehend erwähnten Ceramidase oder von einem Gen davon und einen dafür verwendeten Kit bereitzustellen. Eine achte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein in vitro-Verfahren zur Kontrolle der Menge von Ceramid in der Zelle oder in dem Gewebe bereitzustellen.
  • Den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelang es, eine neutrale/alkalische Ceramidase aus der Leber einer Maus, einem Säuger, zu isolieren und die Gene zu isolieren. Zusätzlich gelang es ihnen, die Struktur der neutralen/alkalischen Ceramidase eines Säugers, einschließlich des Menschen, unter Verwendung von Verfahren wie Hybridisierung oder Polymerasekettenreaktion (PCR) aufzuklären. Weiterhin gelang es ihnen auch, eine neutrale/alkalische Ceramidase in hoher Reinheit durch Genmanipulationsverfahren unter Verwendung der Gene einfach herzustellen. Daher wurde die vorliegende Erfindung dadurch vervollkommnet.
  • Spezifisch betrifft der Hauptinhalt der vorliegenden Erfindung:
    • [1] eine Nucleinsäure, umfassend ein Gen mit einer Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (A) einer Nucleinsäure, codierend ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 oder eine Teilsequenz des Polypeptids besitzt, wobei das Polypeptid oder die Teilsequenz davon eine Ceramidaseaktivität aufweist, (B) einer Nucleinsäure, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15 oder eine Teilsequenz davon besitzt und ein Polypeptid codiert, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, (C) einer Nucleinsäure, welche in der Lage ist, an einen komplementären Strang der Nucleinsäure von (A) oder (B), vorstehend, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren und welche ein Polypeptid codiert, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, die ein pH-Optimum von 7,0 bis 8,0 hat; (D) einer Nucleinsäure, welche degeneriert ist hinsichtlich der Nucleinsäure von einer aus (A) bis (C) und ein Polypeptid codiert, welches eine Ceramidaseaktivität besitzt, die ein pH-Optimum von 7,0 bis 8,0 hat;
    • [2] die Nucleinsäure gemäß [1], wobei die Ceramidaseaktivität des Polypeptids durch die folgenden Schritte nachgewiesen werden kann: (a) Inkubation eines Genexpressionsprodukts in einem Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 550 pmol C12-NBD-Ceramid und 1,0% (Gew./Vol.) Natriumcholat in 20 μl eines 25 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,5)] bei 37°C für 30 Minuten, um das Gemisch reagieren zu lassen, und (b) Nachweis der Erzeugung einer C12-NBD-Fettsäure im Reaktionsprodukt;
    • [3] die Nucleinsäure gemäß [1] oder [2], wobei das Polypeptid mindestens die folgenden Charakteristika aufweist: (i) Aktivität: Hydrolyse von Ceramid, so dass Sphingoid und eine Fettsäure erzeugt werden (ii) Substratspezifität: Hydrolyse von N-Acylsphingosin, allerdings keine Wirkung auf Galactosylceramid, Sulfatid, GM1a und Sphingomyelin; (iii) pH-Optimum: von 7,0 bis 8,0 und (iv) eine Senkung der Aktivität wird nicht beobachtet, wenn es in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 0,1% Polidocanol bei 37°C für 24 Stunden behandelt wird, aber eine Aktivitätssenkung bei einer Behandlung bei 60°C für eine Stunde auf etwa 30% der Aktivität vor der Behandlung;
    • [4] eine Antisense-DNA oder eine Antisense-RNA, welche zur Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3] oder einem Teil davon komplementär ist, welche die Expression der Nucleinsäure unterdrückt oder kontrolliert;
    • [5] einen Expressionsvektor für einen Mikroorganismus, eine Tierzelle oder eine Pflanzenzelle, umfassend die Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3], oder die Antisense-DNA von [4], welche eine Antisense-RNA exprimiert;
    • [6] eine(n) Oligonucleotidsonde oder -Primer, welche(r) in der Lage ist, spezifisch an eine Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3] oder einen komplementären Strang davon zu hybridisieren;
    • [7] eine nicht-menschliche Transformante, die mit dem Expressionsvektor aus [5] transformiert ist;
    • [8] ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, codiert durch eine Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3];
    • [9] das Polypeptid gemäß [8], wobei die Ceramidaseaktivität durch die folgenden Schritte nachgewiesen werden kann: (a) Inkubation eines Genexpressionsprodukts in einem Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 550 pmol C12-NBD-Ceramid und 1% (Gew./Vol.) Natriumcholat in 20 μl eines 25 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,5)] bei 37°C für 30 Minuten, um das Gemisch reagieren zu lassen, und (b) Nachweis der Erzeugung einer C12-NBD-Fettsäure im Reaktionsprodukt;
    • [10] einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das in der Lage ist, spezifisch an das Polypeptid aus [8] oder [9] zu binden;
    • [11] einen Kit zur Verwendung zum Nachweis eines Gens, codierend ein Polypeptid mit einer Ceramidaseaktivität, umfassend die/den Oligonucleotidsonde und/oder -Primer aus [6];
    • [12] einen Kit zur Verwendung zum Nachweis eines Polypeptids, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend den Antikörper oder ein Fragment davon aus [10];
    • [13] ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, charakterisiert durch die Züchtung der Transformante aus [7] unter Bedingungen, die zur Expression des Ceramidasegens und Produktion des von dem Gen codierten Polypeptids geeignet sind, und Gewinnung eines Polypeptids mit einer Ceramidaseaktivität aus der entstehenden Kultur;
    • [14] ein Verfahren zum Nachweis eines Gens, codierend ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend die Verwendung der/des Oligonucleotidsonde oder -Primers aus [6];
    • [15] ein Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids mit einer Ceramidaseaktivität, umfassend die Verwendung des Antikörpers oder eines Fragments davon aus [10];
    • [16] ein in vitro-Verfahren zur Kontrolle der Menge des Ceramids in einer Zelle und/oder einem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3] oder eine Antisense-Nucleinsäure davon in die Zelle und/oder das Gewebe eingeführt wird, wodurch die Menge des Ceramids in der Zelle und/oder im Gewebe kontrolliert wird; und
    • [17] eine Verwendung einer Nucleinsäure von einer aus [1] bis [3] oder einer Antisense-Nucleinsäure davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Farber's Krankheit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Grafik, die das pH-Optimum der Ceramidase zeigt.
  • 2 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte eines das Ceramidasegen umfassenden DNA-Fragments.
  • BESTE ART UND WEISE DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Da Informationen wie Konsensus-Sequenzen für eine neutrale/alkalische Ceramidase noch nicht geklärt wurden, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Aminosäureinformation durch Isolierung der vorstehend erwähnten neutralen/alkalischen Ceramidase erhalten, wodurch ein Gen, codierend die vorstehend erwähnte Ceramidase, zum ersten Mal isoliert werden konnte.
  • Aus den vorstehenden Befunden konnte der überraschende Befund erhalten werden, dass die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen neutralen/alkalischen Ceramidase aus der Leber der Maus eine niedrige Homologie mit der Aminosäuresequenz einer bekannten alkalischen Ceramidase [zuvor erwähnt, J. Biol. Chem., 273, 14368-14373 (1998)] aus einem Bakterium, das zur Gattung Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa) gehört, aufweist.
  • Die erfindungsgemäße Ceramidase wurde zum ersten Mal als neutrale/alkalische Ceramidase aus einem Säuger aufgeklärt. Daher ist die vorliegende Erfindung sogar noch nützlicher bei den Entwicklungen zur Aufklärung der in vivo-Funktionen eines Ceramids, der metabolischen Kontrolle dafür und der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die mit einem Ceramid assoziiert sind, und von Ähnlichem, im Vergleich zur bekannten alkalischen Ceramidase aus dem bekannten Bakterium der Gattung Pseudomonas.
  • Die vorliegende Erfindung wird hier im Folgenden beschrieben.
  • (1) Polypeptid, das Ceramidaseaktivität besitzt
  • In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt" (welches in der vorliegenden Beschreibung einfach als „Ceramidase" bezeichnet werden kann), auf ein Enzym, das eine Aktivität zur Hydrolyse eines Ceramids zur Erzeugung eines Sphingoids und einer Fettsäure besitzt, wie vorstehend erwähnt. Zusätzlich bezieht sich der Begriff „neutrale/alkalische Ceramidase" auf eine Ceramidase, die ein pH-Optimum bei einem höheren pH-Wert als dem sauren Bereich besitzt.
  • Als ein Beispiel dafür werden enzymologisch chemische und physikalisch-chemische Charakteristika der in der vorliegenden Erfindung isolierten und gereinigten neutralen/alkalischen Ceramidase aus der Leber einer Maus beschrieben.
  • 1. Aktivität
  • Die erfindungsgemäße Ceramidase wirkt, indem sie ein Ceramid hydrolysiert, wodurch ein Sphingoid und eine Fettsäure erzeugt werden.
  • Die Aktivität der Ceramidase kann in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das zum Beispiel in J. Biol. Chem., 275, 3462-3468 (2000) beschrieben wird, bestimmt werden. Konkret wird ein Reaktionsgemisch durch Lösen von 550 pmol C12-NBD-Ceramid [Anal. Biochem., 263, 183-188 (1998)], 1,0% (Gew./Vol.) Natriumcholat hergestellt und eine geeignete Menge eines Enzyms (Ceramidase) in 20 μl 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) wird bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird in einem kochenden Wasserbad für 5 Minuten inkubiert, wodurch die Reaktion gestoppt wird. Das entstehende Reaktionsgemisch wird weiter unter verringertem Druck bis zur Trockenheit verdunstet. Die getrocknete Festsubstanz wird in Chloroform/Methanol = 2/1 (Vol./Vol.) gelöst und durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie entwickelt (Entwicklungslösung: Chloroform/Methanol/25% wässriger Ammoniak = 90/20/0,5 (Vol./Vol./Vol.)). Danach wird die C12-NBD-Fettsäure, die durch die vorstehend erwähnte Umsetzung erzeugt wird, unter Verwendung des CS-9300-Chromatoscanners (hergestellt von Shimadzu Corporation) bei einer Anregungswellenlänge von 475 nm und einer Fluoreszenzwellelänge von 525 nm quantifiziert. Eine Einheit (E) dieses Enzyms (Ceramidase) wird als die Menge des Enzyms definiert, die benötigt wird, um ein Micromol der C12-NBD-Fettsäure pro eine Minute unter den vorstehend erwähnten Bedingungen freizusetzen, welche aus der Hydrolyse des C12-NBD-Ceramids entsteht.
  • 2. Substratspezifität
  • Fünf Millieinheiten der erfindungsgemäßen Ceramidase lässt man auf 100 pmol verschiedener Arten von Sphingolipiden, in denen die Fettsäureeinheit mit dem radioaktiven 14C-Isotop markiert ist, in 20 ml 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1% Natriumcholat, bei 37°C für 24 Stunden wirken. Das Reaktionsgemisch wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie entwickelt. Danach werden die 14C-markierten Sphingolipide und die 14C-markierten Fettsäuren, die durch die enzymatische Reaktion erzeugt werden, nachgewiesen und durch den Imaging Analyzer BAS1000 (hergestellt von Fuji Photo Film) quantifiziert. Der Abbauverhältnis wird aus den erhaltenen Werten errechnet. Die Substratspezifitäten der erfindungsgemäßen Ceramidase werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, zeigt die erfindungsgemäße Ceramidase die folgenden Substratspezifitäten: (1) Hydrolyse verschiedener N-Acylsphingosine, (2) nicht auf Galactosylceramid, Sulfatid, GM1a oder Sphingomyelin wirkend, (3) bevorzugt auf ein Ceramid, enthaltend Sphingenin (d18:1), als auf ein Ceramid, enthaltend Sphinganin (d18:0), wirkend, (4) weniger wahrscheinlich auf ein Ceramid, enthaltend Phytosphingosin (t18:0), wirkend und Ähnliches. Tabelle 1
    Substrat (Struktur) Abbauverhältnis (%)
    N-Lauroylsphingosin (C12:0/d18:1) 63
    N-Palmitoylsphingosin (C16:0/d18:1) 93
    N-Stearoylsphingosin (C18:0/d18:1) 83
    N-Palmitoylsphinganin (C16:0/d18:0) 59
    N-Stearoylsphinganin (C18:0/d18:0) 40
    N-Palmitoylphytosphingosin (C16:0/t18:0) 5
    N-Stearoylphytosphingosin (C18:0/t18:0) 2
    NBD-N-Dodecanoylsphingosin (NBD-C12:0/d18:1) 97
    NBD-N-Hexanoylsphingosin (NBD-C6:0/d18:1) 2
    Galactosylceramid (Galb1-1'Cer) 0
    Sulfatid (HS03-3Galb1-1'Cer) 0
    GM1a(Galb1-3GalNAcb1-4(NeuAca2-3)Galb1-4Glcb1-1'Cer) 0
    Sphingomyelin (Cholinphosphat-Cer) 0
  • 3. pH-Optimum
  • Man lässt 16 Millieinheiten der erfindungsgemäßen Ceramidase auf 100 pmol C12-NBD-Ceramid in 20 ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 50 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 50 mM 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol bei 37°C für 24 Stunden wirken. Das entstehende Reaktionsgemisch wird durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie entwickelt. Als nächstes werden das NBD-markierte Ceramid und die NBD-markierte Fettsäure, die durch eine enzymatische Reaktion erzeugt wird, nachgewiesen und bei einer Nachweiswellenlänge von 525 nm unter Verwendung eines CS-9300-Chromatoscanners quantifiziert. Das Abbauverhältnis wird aus den erhaltenen Werten errechnet. 1 ist eine Grafik, welche das Verhältnis zwischen der Abbauaktivität des C12-NBD-markierten Ceramids und dem pH-Wert zeigt, wobei die Ordinate das Abbauverhältnis (%) und die Abszisse den Reaktions-pH-Wert zeigt. Wie in den Ergebnissen von 1 gezeigt wird, liegt das pH-Optimum der vorliegenden Ceramidase bei 7,0 bis 8,0.
  • 4. Temperaturstabilität
  • Die erfindungsgemäße Ceramidase zeigt nicht die verringerte Aktivität, wenn sie mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltend 0,1% Polidocanol [Handelsname: Lubrol PX] bei 37°C für 24 Stunden behandelt wird, zeigt aber die verringerte Aktivität durch eine Behandlung bei 60°C für eine Stunde auf etwa 30% der Aktivität vor der Behandlung.
  • 5. Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Ceramidase ist etwa 94 kDa bei der SDS-PAGE (unter reduzierenden Bedingungen). Zusätzlich ist das vorliegende Enzym, verdaut durch Glycopeptidase F, etwa 73 kDa bei der SDS-PAGE (unter reduzierenden Bedingungen).
  • In der vorliegenden Beschreibung umfasst ein Beispiel des „Polypeptids mit einer Ceramidaseaktivität" ein Polypeptid einer natürlich vorkommenden Ceramidase aus einer Maus mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls. Weiterhin wird das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls im Begriff „Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt" umfasst. Die vorliegende Anwendung beschreibt auch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit einer Mutation wie einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren, welche in die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls eingeführt wurden.
  • Zusätzlich können in der vorstehend erwähnten Mutation zwei oder mehr Arten von Mutationen eingeführt werden, solange sie Mutationen sind, durch die das entstehende Polypeptid eine Ceramidaseaktivität aufweisen kann. In der vorliegenden Beschreibung umfasst der Begriff „Aminosäuresequenz mit einer eingeführten Mutation" eine beliebige der Aminosäuresequenzen, in welche eine Mutation künstlich eingeführt wurde, und Aminosäuresequenzen mit einer natürlich vorkommenden Mutation.
  • Die Ceramidase mit der Mutation kann konkret zum Beispiel durch Selektion eines Polypeptids, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, auf das mutierte Gen mit einer Mutation in der Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 15) des nachstehend beschriebenen Ceramidasegens durch die folgenden Schritte erhalten werden:
    • (a) Inkubation eines Genexpressionsprodukts in einem Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 550 pmol C12-NBD-Ceramid und 1,0% (Gew./Vol.) Natriumcholat in 20 μl 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 8,5, stärker bevorzugt 7 bis 8, besonders bevorzugt 7,5)] bei 37°C für 30 Minuten, um das Gemisch umzusetzen; und
    • (b) Nachweis der Erzeugung einer C12-NBD-Fettsäure im Reaktionsprodukt.
  • (2) Ceramidasegen
  • Das erfindungsgemäße Ceramidasegen trifft ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, welche das vorstehend erwähnte „Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt" codiert, oder einer Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz des Gens. Ein Bespiel dafür umfasst ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, codierend ein Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls oder einer Teilsequenz davon, und ein Gen mit der Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, bestehend aus einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls oder einer Teilsequenz davon, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese beispielhaft dargestellten Sequenzen beschränkt. Wie vorstehend beschrieben, ist sogar ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, codierend ein Polypeptid, bestehend aus einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14, oder ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, bestehend aus einer Teilsequenz der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15, im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten, solange das Gen ein Polypeptid codiert, das eine Ceramidaseaktivität besitzt. Diese Gene sind Gene für neutrale/alkalische Ceramidase aus der Leber der Maus und die Herkunft des erfindungsgemäßen Ceramidasegens ist nicht besonders eingeschränkt, solange die Ceramidaseaktivität des Genprodukts in derselben Art und Weise nachgewiesen werden kann, wie es in den Schritten (a) und (b) des vorstehenden Punkts (1) beschrieben wird. Die Herkunft umfasst zum Beispiel Mäuse, Ratten, Menschen, Hamster, Meerschweinchen und Ähnliche.
  • In der vorliegenden Beschreibung meint der Ausdruck "Polypeptid, das aus einer Teilsequenz (der Aminosäuresequenz) besteht", jene, in welchen die Ceramidaseaktivität durch die Schritte (a) und (b), beschrieben in vorstehendem Punkt (1), nachgewiesen werden kann.
  • Weiterhin wird auch ein Gen, codierend eine Ceramidase mit einer Mutation, welche eine ähnliche Ceramidaseaktivität aufweisen kann, in der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Zum Beispiel wird sogar ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, codierend eine Aminosäuresequenz mit einer Mutation wie einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäurereste, die in die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls eingeführt wurde, im erfindungsgemäßen Gen beschrieben, solange das durch das Gen codierte Polypeptid eine Ceramidaseaktivität besitzt. Sogar ein natürlich vorkommendes Gen mit einer Mutation sowie ein vorstehend beschriebenes künstlich hergestelltes Gen werden in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, solange das Gen ein Gen mit einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, codierend ein Polypeptid, das eine Aktivität für eine neutrale/alkalische Ceramidase besitzt, ist.
  • Als Verfahren zur Herstellung eines Gens, in das eine Mutation künstlich eingeführt wird, zum Beispiel wie vorstehend beschrieben, wird folgendes Verfahren verwendet.
  • Als ein Verfahren zur Einführung einer zufälligen Mutation kann zum Beispiel ein Verfahren zur Erzeugung einer Transitionsmutation, wobei durch eine chemische Behandlung unter Verwendung von Natriumhydrogensulfit die Cytosinbase durch die Uracilbase ersetzt wird [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 79, 1408-1412 (1982)], ein Verfahren zur Verringerung der Genauigkeit des Einbaus von Nucleotiden während der DNA-Synthese durch Durchführung von PCR in einem Reaktionsgemisch, enthaltend Mangan [Anal. Biochem., 224, 347-353 (1995)], und Ähnliches angewendet werden.
  • Als ein Verfahren zur Einführung ortspezifischer Mutagenese kann zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung von Amber-Mutation [Gapped Duplex-Verfahren, Nucleic Acids Research, 12, 9441-9456 (1984)], ein Verfahren unter Verwendung eines dut (dUTPase)-Gen- und ung (Uracil-DNA-Glycosylase)-Gen-defizienten Wirts [Kunkel-Verfahren, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, 488-492(1985)], ein Verfahren mittels PCR unter Verwendung der Amber-Mutation ( WO 98/02535 ) und Ähnliches verwendet werden. Verschiedene Arten von Kits zur Einführung ortspezifischer Mutagenese in ein gewünschtes Gen durch diese Verfahren sind im Handel erhältlich und ein Gen, das aus der Einführung einer gewünschten Mutation entsteht, kann einfach unter Verwendung der Kits erhalten werden.
  • Zusätzlich ist die Nucleinsäure, die in der Lage ist, an einen komplementären Strang der vorstehend erwähnten Nucleinsäure unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, wobei das Gen eine Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure, codierend ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, ebenfalls im erfindungsgemäßen Gen eingeschlossen. Die Ceramidaseaktivität kann zum Beispiel durch die Schritte (a) und (b), beschrieben im vorstehenden Punkt (1), nachgewiesen werden.
  • Hier bezieht sich der Begriff „stringente Bedingungen" zum Beispiel auf die folgenden Bedingungen. Konkret bezieht sich der Begriff auf Bedingungen zur Ausführung der Inkubation bei 50°C für 4 Stunden bis über Nacht in 6 × SSC (wobei 1 × SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0 ist), enthaltend 0,5% SDS, 5 × Denhardt [0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficol 400] und 100 μg/ml Lachssperma-DNA.
  • Es werden auch die Details der Hybridisierungsmanipulationen beschrieben, zum Beispiel in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage, veröffentlicht bei Cold Spring Harbor Laboratory in 1989, herausgegeben von T. Maniatis et al..
  • Das Gen mit der Nucleotidsequenz, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes der vorstehend erwähnten Nucleinsäure verschieden ist, wird ebenfalls durch das erfindungsgemäße Ceramidasegen umfasst.
  • Das Polypeptid, das durch das erfindungsgemäße Gen codiert wird, wird durch die vorliegende Erfindung umfasst, solange seine Ceramidaseaktivität durch die Schritte (a) und (b) im vorstehend beschriebenen Punkt (1) nachgewiesen werden kann.
  • Gemäß dem anmeldungsgemäßen Gen wird weiterhin eine rekombinante DNA beschrieben, die für verschiedene verwendete Zwecke geeignet ist. Hier bezieht sich der Begriff „rekombinante DNA" auf eine DNA, welche das erfindungsgemäße Gen trägt, das durch genetische Manipulationsverfahren erhalten wird.
  • Die das erfindungsgemäße Ceramidasegen tragende, rekombinante DNA wird mit einem bekannten Vektor oder Ähnlichem ligiert, wobei ein Expressionsvektor, dem ein Ceramidasegen in einem exprimierbaren Zustand inseriert wurde, hergestellt werden kann. Ein solcher Expressionsvektor wird auch durch die vorliegende Erfindung umfasst.
  • In der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein Expressionsvektor auf einen Vektor, welcher so konstruiert ist, dass das/die vorstehend erwähnte Gen oder rekombinante DNA inseriert und in den gewünschten Wirtszellen exprimiert wird. Zusätzlich wird ein Vektor, in den eine Antisense-DNA, wie sie nachstehend beschrieben wird, inseriert ist, auch vom erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfasst. Der zu inserierende Vektor beinhaltet Plasmidvektoren, Phagenvektoren, virale Vektoren und Ähnliche. Als Plasmidvektor können im Handel erhältliche Produkte wie pUC18, pUC19, pBluescript und pET geeignet verwendet werden und als Phagenvektoren können im Handel erhältliche Produkte von lambda-Phagenvektoren wie λgt10 und λgt11 geeignet verwendet werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Als virale Vektoren können retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, viraler Vakzinia-Vektor, viraler Adeno-assoziierter Vektor und Ähnliche verwendet werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese Vektoren werden in Übereinstimmung mit den verwendeten Wirtszellen in geeigneter Weise ausgewählt. Jeder dieser Vektoren kann in geeigneter Weise einen Faktor wie einen induzierbaren Promotor, ein selektierbares Markergen oder einen Terminator tragen.
  • Zusätzlich kann ein Vektor, der eine Sequenz trägt, die in der Lage ist, als His-Marker oder GST-Fusionsprotein exprimiert zu werden, abhängig von seiner Verwendung verwendet werden, um die Isolierung und Reinigung zu erleichtern. In diesem Fall kann ein GST (Glutathion-S-Transferase)-Fusionsprotein-Vektor, der einen geeigneten Promoter trägt (zum Beispiel lac, tac, trc, trp, CMV, früher SV40-Promotor oder Ähnliche), welcher in einer Wirtszelle funktioniert (zum Beispiel pGEX4T), ein Vektor, der eine Markierungssequenz trägt (zum Beispiel Myc, HisA oder Ähnliche), oder Ähnliches verwendet werden.
  • (3) Das Ceramidasegen tragende Transformante
  • Die erfindungsgemäßen Transformanten, nämlich die Zellen, die in der Lage sind, das erfindungsgemäße Ceramidasegen zu exprimieren, können durch Transformation eines nicht-menschlichen Wirtes mit einem Expressionsvektor, in welchem das erfindungsgemäße Ceramidasegen inseriert ist, erhalten werden. Der nicht-menschliche Wirt kann in geeigneter Weise, abhängig von den Zwecken, für die die gewünschte Ceramidase verwendet wird, und den Mikroorganismen wie Escherichia coli, Hefen, tierischen Zellen, Pflanzenzellen, Tieren und Pflanzen und Ähnlichen, ausgewählt werden. Konkret umfasst Escherichia coli den Stamm HB101, den Stamm C600, den Stamm JM109, den Stamm DH5α, den Stamm DH10B, den Stamm XL-1BlueMRF', den Stamm TOP10F und Ähnliche vom Escherischia coli-Derivat K-12. Außerdem umfassen die Hefezellen Saccharomyces cerevisiae und Ähnliche. Die tierischen Zellen umfassen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa und Ähnliche. Die Pflanzenzellen umfassen Tabak-BY2 und Ähnliche.
  • Als ein Verfahren zur Transduktion eines Expressionsvektors in einen Wirt kann ein Verfahren, zum Beispiel einschließlich des in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage, 249-254 beschriebenen, angewendet werden. Als nächstes werden die Charakteristika des Expressionsvektors genutzt, um eine Transformante auszuwählen, die das gewünschte Gen exprimiert. Zum Beispiel wird in dem Fall, in dem ein Plasmidvektor pBluescript ist und eine Wirtszelle Escherichia coli, eine Kolonie mit Ampicillinresistenz auf einer Ampicillin-enthaltenden Platte oder eine Kolonie, die Ampicillinresistenz aufweist und auf einer Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthaltenden Platte eine weiße Farbe zeigt, ausgewählt, wodurch eine Kolonie ausgewählt wird, in welche ein fremdes Gen transduziert wurde.
  • Das Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, kann durch Züchtung der erfindungsgemäßen Transformanten unter allgemein angewendeten Bedingungen hergestellt werden. In einigen Fällen unterscheidet sich die Codon-Verwendung je nach Wirt, in dem das erfindungsgemäße Gen exprimiert wird, so dass die Expression unterdrückt wird. In diesem Fall kann das im erfindungsgemäßen Gen verwendete Codon in ein Codon geändert werden, das für jeden Wirt geeignet ist. Zusätzlich ist der vorstehend erwähnte Expressionsvektor nicht nur auf solche Vektoren beschränkt, die von Plasmiden abgeleitet sind, sondern Vektoren, die von Phagen, Cosmiden und Ähnlichen abgeleitet sind, können ebenfalls verwendet werden, solange das Ziel der vorliegenden Erfindung nicht eingeschränkt wird. Ein Vektor, der in der Lage ist, ein fremdes Gen zu induzieren und zu exprimieren, ein Vektor, der in der Lage ist, als Fusionsprotein mit einem Reportergenprodukt exprimiert zu werden, und Ähnliche sind vom Gesichtspunkt der einfachen und massenhaften Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids wünschenswert
  • Die Expression der Ceramidase kann durch Bestimmung der Ceramidaseaktivität bestätigt werden. Die Aktivität kann zum Beispiel durch das in J. Biol. Chem., 275, 3462-3468 (2000) beschriebene Verfahren unter Verwendung eines Zellextraktes einer Transformante als Probe bestimmt werden, zum Beispiel Verfahren, die den in vorstehendem Punkt (1) in den Schritten (a) und (b) beschriebenen ähnlich sind. Zusätzlich kann die Expression der Ceramidase durch die Bestimmung der Menge eines Ceramids in der Zelle bestätigt werden. Die vorstehend erwähnte Menge des Ceramids kann zum Beispiel durch das in Analytical Biochemistry, 244, 291-300 (1997) beschriebene Verfahren bestimmt werden. Es kann auch ein Antikörper gegen die Ceramidase verwendet werden. In einem Fall, in dem die Ceramidase als ein Fusionskörper mit einem anderen Polypeptid (wobei das Polypeptid die erfindungsgemäße Ceramidase ausschließt) exprimiert wird, kann ein Antikörper gegen diese Polypeptideinheit verwendet werden, wobei das Polypeptid die erfindungsgemäße Ceramidase ausschließt. In einem Fall, in dem ein Antikörper verwendet wird, kann die Ceramidase zum Beispiel dadurch nachgewiesen werden, dass ein Zellextrakt der Transformante der Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterzogen wird und anschließend das Gel nach der Elektrophorese auf eine Polyvinyliden-Fluorid (PVDF)-Membran übertragen und mit dem Antikörper auf dieser Membran nachgewiesen wird.
  • (4) Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das Ceramidaseaktivität besitzt
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das Ceramidaseaktivität besitzt, bereit, umfassend die Schritte der Züchtung der vorstehend erwähnten Transformante unter Bedingungen, die zur Expression des erfindungsgemäßen Ceramidasegens geeignet sind, und Herstellung des durch das Gen codierten Polypeptids und Gewinnung eines Polypeptids, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, aus der entstehenden Kultur. Das Verfahren zur Züchtung der Transformante ist nicht besonders eingeschränkt und ein geeignetes Verfahren kann aus einem bekannten Züchtungsverfahren, das für den verwendeten Wirt geeignet ist, ausgewählt werden.
  • Im erfindungsgemäßen Produktionsverfahren kann in einem Fall, in dem die vorstehend erwähnte Transformante ein Mikroorganismus oder eine gezüchtete Zelle ist, die Ceramidase effizient durch Bestimmung der optimalen Bedingungen zur Expression der Ceramidase in einer Mediumzusammensetzung, eines pH-Werts eines Mediums, einer Züchtungstemperatur und einer Zeitspanne der Züchtung sowie der Menge eines verwendeten Induktors und der Zeitspanne der Verwendung und Ähnliches hergestellt werden.
  • Das allgemeine Verfahren wird in der Reinigung der Ceramidase aus der Kultur der Transformante angewendet. In einem Fall, in dem die Transformante die Ceramidase intrazellulär akkumuliert, wie im Fall von Escherichia coli, werden die Transformantenzellen nach der Beendigung der Züchtung durch Zentrifugation geerntet und die erhaltenen Zellen werden durch Ultraschallbehandlung oder Ähnliches aufgebrochen und danach zentrifugiert oder dergleichen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Der als Ausgangsmaterial verwendete zellfreie Extrakt kann durch Aussalzen sowie durch ein allgemeines Proteinreinigungsverfahren wie verschiedene Arten von Chromatographien wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie und Affinitätschromatographie gereinigt werden. Das Expressionsprodukt kann abhängig vom verwendeten Wirt-Vektor-System in einigen Fällen extrazellulär sekretiert werden. In einem solchen Fall kann die Reinigung in ähnlicher Weise aus dem Kulturüberstand durchgeführt werden.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in einem Fall, in dem die Ceramidase intrazellulär produziert wird, eine gewünschte Ceramidase intrazellulär mit Verunreinigungen wie verschiedenen Arten von Enzymen und Proteinen koexistieren. Da die Verunreinigungen in Spurenmengen im Vergleich zur Menge der exprimierten Ceramidase vorhanden sind, gibt es den ausgezeichneten Vorteil, dass seine Reinigung stark vereinfacht wird. Zusätzlich wird in einem Fall, in dem ein Vektor vom extrazellulären Sekretionstyp als Vektor verwendet wird, die Ceramidase extrazellulär sekretiert, so dass die Mediumkomponente oder Ähnliches in der die Ceramidase enthaltenden Fraktion koexistiert. Da die Fraktion jedoch üblicherweise beinahe keine Proteinkomponente enthält, welche die Reinigung der Ceramidase behindern würde, gibt es einen ausgezeichneten Vorteil dahingehend, dass zum Beispiel komplizierte Trennungs- und Reinigungsverfahren, welche für die Reinigung der Ceramidase aus der Leber der Maus benötigt wurden, nicht notwendig sind.
  • Zusätzlich gibt es in einem Fall einer Ceramidase aus einem Pilz die Möglichkeit, dass das Enzym selbst eine Zuckerkette hat. Ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt und keine Zuckerkette hat, kann unter Verwendung einer Zelle, die keine Fähigkeit zur Zuckerkettensynthese besitzt, zum Beispiel einer mutierten Zelle, welche die Fähigkeit zur Synthese von Zuckerketten verloren hat, eines Prokaryonten wie Escherichia coli, Bacillus subtilis oder Actinomyes oder eine Hefe, ein Pilz, eine tierische Zelle, eine Insektenzelle und eine Pflanzenzelle, als Wirtszelle hergestellt werden. Weiterhin kann ein Enzym mit einer Zuckerkette hergstellt werden. In diesem Fall kann ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität und eine Zuckerkette besitzt, durch Verwendung einer Zelle, welche die Fähigkeit zur Synthese von Zuckerketten besitzt, wie zum Beispiel eine Hefe, ein Pilz, eine tierische Zelle, eine Insektenzelle und eine Pflanzenzelle, als Wirtszelle hergestellt werden.
  • Das Expressionsprodukt kann auch, abhängig vom verwendeten Wirt-Vektor-System, einen unlöslichen Einschlusskörper bilden. In diesem Fall werden die Transformantenzellen nach Beendigung der Züchtung durch Zentrifugation geerntet und die entstehenden Zellen werden durch Ultraschall oder Ähnliches aufgebrochen und danach zentrifugiert oder Ähnliches, wodurch die unlösliche, den Einschlusskörper enthaltende Fraktion geerntet wird. Nach dem Waschen der Einschlusskörper werden die Einschlusskörper mit einem allgemein verwendeten Protein-Solubilisierungmittel zum Beispiel Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid oder Ähnlichem solubilisiert und durch verschiedene Arten von Chromatographien wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie und Affinitätschromatographie je nach Erfordernis gereinigt. Danach werden Rückfaltungsverfahren unter Verwendung von Dialyse oder Verdünnungsverfahren durchgeführt, wodurch eine Zubereitung, umfassend ein Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, erhalten werden kann. Wenn diese Zubereitung durch verschiedene Arten von Chromatographien je nach Erfordernis weiter gereinigt wird, kann ein Polypeptid mit einer Ceramidaseaktivität in einer hohen Reinheit erhalten werden.
  • (5) Sonde für die Hybridisierung und Primer für die PCR
  • Die/der erfindungsgemäße Oligonucleotidsonde oder -Primer ist in der Lage, spezifisch an das erfindungsgemäße Gen oder einen komplementären Strang davon zu hybridisieren. Die/der Oligonucleotidsonde oder -Primer wird auf Basis der Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Ceramidasegens entworfen. Zum Beispiel kann die/der Oligonucleotidsonde oder -Primer durch chemische Synthese durch ein allgemeines Verfahren hergestellt werden. Die Nucleotidsequenz für die Oilgonucleotidsonde ist nicht besonders eingeschränkt. Die Nucleotidsequenz ist jene, die in der Lage ist, an das vorstehend erwähnte Ceramidasegen oder an eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die zu dem Gen komplementär ist, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Der vorstehend erwähnte Begriff „stringente Bedingungen" ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel bezieht sich der Begriff „stringente Bedingungen" auf Bedingungen der Inkubation über Nacht bei einer Temperatur von [(Tm der vorstehend erwähnten Sonde) –25°C] in einer Lösung, enthaltend 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt und 100 mg/ml Lachs-Sperma-DNA und Ähnliches. Außerdem ist die Nucleotidsequenz des vorstehend erwähnten Primers nicht besonders eingeschränkt, solange sich der Primer an das vorstehend erwähnte Ceramidasegen oder das Gen mit der zum Gen komplementären Nucleotidsequenz unter den üblichen Reaktionsbedingungen für die PCR anlagert, so dass die Verlängerungsreaktion durch die DNA-Polymerase initiiert werden kann.
  • Die Tm der/des Oligonucleotidsonde oder -Primers kann zum Beispiel durch die folgende Gleichung berechnet werden: Tm = 81,5 – 16,6 (log10[Na+]) + 0,41 (%G + C) – (600/N),worin N eine Kettenlänge der/des Oligonucleotidsonde oder -Primers und % G + C ein Gehalt an Guanin- und Cytosinresten in der/dem Oligonucleotidsonde oder -Primer ist.
  • Zusätzlich kann die Tm von einem Produkt des Gehalts von A + T (Adenin + Thymin)-Resten multipliziert mit 2°C mit einer Summe eines Produkts des Gehalts von G + C-Resten multipliziert mit 4°C [(A + T)] × 2 + (G + C) × 4)] abgeleitet werden, wenn die Kettenlänge der/des Oligonucleotidsonde oder -Primers kürzer als 18 Basen ist.
  • Die Kettenlänge der vorstehend erwähnten Oligonucleotidsonde ist nicht besonders eingeschränkt. Es wird vom Gesichtspunkt der Verhinderung unspezifischer Hybridisierung bevorzugt, dass die Kettenlänge 15 Basen oder mehr, stärker bevorzugt 18 Basen oder mehr beträgt.
  • Zusätzlich können als erfindungemäße Primer die Nucleinsäuren genannt werden, welche dieselben Nucleotidsequenzen haben, wie die für die vorstehend erwähnte Oligonucleotidsonde. Zum Beispiel kann der Primer durch Entwurf auf Basis der Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens und chemische Synthese und Ähnliches hergestellt werden. Die Kettenlänge des Primers ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel kann der Primer mit einer Kettenlänge von 15 bis 40 Basen verwendet werden, insbesondere kann einer mit einer Kettenlänge von 17 bis 30 Basen in geeigneter Weise verwendet werden. Der vorstehend erwähnte Primer kann für verschiedene Genamplifizierungsverfahren wie PCR-Verfahren verwendet werden, wodurch das erfindungsgemäße Ceramidase-Gen nachgewiesen werden kann.
  • Außerdem kann als vorstehend erwähnter) Oligonucleotidsonde oder -Primer eine Nucleinsäure verwendet werden, die durch Fragmentierung einer Nucleinsäure, codierend eine natürlich vorkommende Ceramidase, durch eine enzymatische Behandlung wie eine Endonucleasebehandlung oder Exonucleasebehandlung, eine physikalische Behandlung wie Ultraschallbehandlung oder Ähnliches und Unterziehen der entstehenden Fragmente einer Trennung und Reinigung durch verschiedene Arten von Nucleinsäure-Trennungsverfahren, repräsentiert durch Agarosegel oder Ähnliches, erhalten wurde. Es ist wünschenswert, dass die, wie vorstehend beschrieben, erhaltene Nucleinsäure aus einer Region abgeleitet ist, die eine Sequenzeigenschaft der Ceramidase hat.
  • Weiterhin kann die/der vorstehend erwähnte Oligonucleotidsonde oder -Primer einer geeigneten Markierung in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren zur Verwendung beim Nachweis des erfindungsgemäßen Ceramidasegens unterzogen werden, um die nachzuweisende Nucleinsäure einfacher nachzuweisen. Die Markierung ist nicht besonders eingeschränkt. Die/der Oligonucleotidsonde oder -Primer kann mit Radioisotopen sowie mit verschiedenen Markierungen, repräsentiert durch fluoreszierende Substanzen, und Liganden wie Biotin und Digoxigenin markiert werden.
  • Eine DNA mit einer hohen Homologie zu dem erfindungsgemäßen Ceramidasegen kann durch Durchmusterung einer genomischen DNA oder cDNA aus einem anderen Organ als der Leber einer Maus oder aus einem anderen Organismus als der Maus oder einer genomischen DNA-Genbank oder einer cDNA-Genbank unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonde zur Hybridisierung cloniert werden.
  • Zusätzlich kann ein DNA-Fragment mit einer hohen Homologie zum erfindungsgemäßen Ceramidasegen durch PCR-Verfahren aus einer genomischen DNA oder cDNA aus einem anderen Organ als der Leber der Maus oder aus einem anderen Organismus als Maus oder einer genomischen DNA-Genbank oder einer cDNA-Genbank unter Verwendung des erfindungsgemäßen Primers nachgewiesen werden und weiterhin kann auch sein Gen in voller Länge erhalten werden.
  • (6) Verfahren zum Nachweis des Gens
  • Eines der besonderen Merkmale des Verfahrens zum Nachweis des erfindungsgemäßen Gens liegt darin, dass das Gen in der nachzuweisenden Probe unter Verwendung der/des vorstehend erwähnten Oligonucleotidsonde und/oder -Primers nachgewiesen wird.
  • Im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren kann das Gen durch ein Hybridisierungsverfahren oder Ähnliches unter Verwendung der vorstehend erwähnten Oligonucleotidsonde nachgewiesen werden oder das Gen kann durch ein DNA-Amplifizierungsverfahren wie ein PCR-Verfahren unter Verwendung des vorstehend erwähnten Primers nachgewiesen werden.
  • Im Fall einer Hybridisierung unter Verwendung der Oligonucleotidsonde umfassen die nachzuweisenden Proben zum Beispiel Proben wie Kolonien und gezüchtete Zellen von Mikroorganismen und Gewebefragmente, Proben, welche durch Immobilisierung von DNA oder RNA in diesen Proben auf einer Membran erhalten wurden, aus diesen Proben extrahierte DNA oder RNA und Ähnliches.
  • Die Hybridisierung kann in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren, das in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage beschrieben ist, und Ähnlichem durchgeführt werden. Die Hybridisierungsbedingungen können in geeigneter Weise durch den Tm-Wert der verwendeten Sonde, den GC-Gehalt der Ziel-DNA und Ähnliches bestimmt werden. Zum Beispiel können die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage beschriebenen Bedingungen, wie vorstehend erwähnt, oder Ähnliche angewendet werden.
  • In einem Fall, in dem das Gen unter Verwendung des Primers nachgewiesen wird, umfassen die nachzuweisenden Proben zum Beispiel Proben von Mikroorganismen wie eine Kultur von Mikroorganismen, Kolonien von Mikroorganismen und Bakterienzellen von Mikroorganismen, Proben aus einem lebenden Körper wie gezüchtete Zellen, Gewebe und Gewebsfragmente und Ähnliches. Als diese Proben können zum Beispiel isolierte Mikroorganismen und gezüchtete Zellen, im ursprünglichen Zustand oder nachdem sie einer geeigneten Behandlung unterworfen wurden, verwendet werden. Zusätzlich können feste Proben wie Gewebe durch Herstellung eines Exsudats oder einer Suspension verwendet werden. Überstände dieser Proben oder jene Proben, welche dadurch hergestellt werden, dass diese Proben einer cytolytischen Behandlung wie einer Behandlung mit einer grenzflächenaktiven Substanz, unterzogen werden, oder der Überstand davon können verwendet werden. Weiterhin kann die Probe innerhalb eines bestimmten Bereichs einem Verfahren des Entfernens anderer Komponenten in der Probe unterzogen werden, so dass die nachzuweisende Nucleinsäure nicht beeinträchtigt wird.
  • In einem Fall, in dem der Nachweis durch das PCR-Verfahren unter Verwendung des vorstehend erwähnten Primers ausgeführt wird, können die PCR-Bedingungen in geeigneter Weise, abgestimmt auf den Tm-Wert des verwendeten Primers, der Länge der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Region und Ähnliches, ausgewählt werden. In der PCR kann das gewünschte Gen durch Bestätigung des Vorhandenseins oder des Fehlens des amplifizierten Produkts nachgewiesen werden. Das Verfahren zur Bestätigung des Vorhandenseins oder des Fehlens der Amplifizierung ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel kann die Bestätigung durch Unterziehen eines Reaktionsgemischs zur Amplifizierung einer Nucleinsäure einer Agarose-Gelelektrophorese, Färbung des Gels mit einem geeigneten Färbereagenz für Nucleinsäuren wie Ethidiumbromid oder SYRER Green I, Unterziehen des Gels einer Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen und Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Bande durchgeführt werden. Der Nachweis der Bande kann mit bloßem Auge beobachtet werden oder der Nachweis kann zum Beispiel unter Verwendung eines Fluoreszenz-Bildanalysegeräts oder Ähnlichem erfolgen.
  • Im Verfahren zum Nachweis des erfindungsgemäßen Gens können die vorstehend erwähnte Sonde und der Primer zusammen verwendet werden, um die Sensitivität des Nachweises zu erhöhen. Zum Beispiel kann das Gen in hoher Sensitivität und Genauigkeit durch Amplifizierung des in Spurenmengen in der Probe existierenden Ceramidasegens durch ein PCR-Verfahren mit dem vorstehend erwähnten Primer und anschließender Hybridisierung des Gens mit der Sonde nachgewiesen werden.
  • In einem Fall, in dem das Ceramidasegen durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen und die Menge des Gens weiter bestimmt wird, kann die Menge des Gens durch Quantifizierung einer Intensität des Signals, das der hybridisierten Sonde zugeschrieben wird, einer Fluoreszenzintensität der Bande, die einem mit dem Primer amplifizierten Produkt zugeschrieben wird, oder Ähnlichem bestimmt werden. Die Expressionsmenge des gewünschten Gens kann durch Quantifizierung der Menge unter Verwendung von mRNA als Bestimmungsobjekt untersucht werden.
  • Zusätzlich kann im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren der Nachweis unter Verwendung eines Kits zur Verwendung beim Nachweis des erfindungsgemäßen Gens einfacher durchgeführt werden. Ein solcher Kit wird auch durch die vorliegende Erfindung umfasst. Eine der Eigenschaften des vorstehend erwähnten Kits liegt darin, dass der Kit die/den vorstehend erwähnte Oligonucleotidsonde und/oder -Primer umfasst. Der vorstehend erwähnte Kit kann verschiedene, in den Nachweisverfahren verwendete Komponenten enthalten. Zum Beispiel können im Fall eines Kits, umfassend eine Oligonucleotidsonde, verschiedene Arten von Reagenzien zur Hybridisierung, die beispielhaft durch eine Membran zur Immobilisierung einer Nucleinsäure, einen Hybridisierungspuffer und Ähnliches repräsentiert werden, enthalten sein. Außerdem können im Fall eines Kits, umfassend einen Primer, Reagenzien zur PCR, die beispielhaft durch thermostabile DNA-Polymerasen, gemischte dNTP-Lösungen, Puffer für die PCR und Ähnliches repräsentiert werden, enthalten sein. Weiterhin können Reagenzien zum Nachweis einer Sonde oder einer amplifizierten DNA, Medien zur Vermehrung von Mikroorganismen, Medien zur Züchtung von Zellen, Reagenzien zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe und Ähnliches enthalten sein.
  • (7) Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/s spezifisch an Polypeptide bindet, die Ceramidaseaktivität besitzen
  • Der Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/s spezifisch an das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, ist nicht besonders eingeschränkt, solange der Antikörper oder ein Fragment davon eine Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Polypeptid besitzt. Der Antikörper kann ein beliebiger aus polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern sein. Weiterhin können durch bekannte Verfahren modifizierte Antikörper oder Antikörperderivate, zum Beispiel humanisierte Antikörper, Fab-Fragmente, Einzelketten-Antikörper und Ähnliche ebenfalls verwendet werden. Der erfindungsgemäße Antikörper kann durch geeignete Immunisierung eines Kaninchens, einer Ratte oder einer Maus unter Verwendung des ganzen erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines Teils davon in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das zum Beispiel in Current Protocols in Immunology, herausgegeben von John E. Coligan, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc., 1992, beschrieben wird, leicht hergestellt werden. Der so erhaltene Antikörper wird gereinigt und danach mit einer Peptidase oder Ähnlichem behandelt, um ein Antikörperfragment zu erhalten. Zusätzlich kann der Antikörper durch Verfahren der Genmanipulation hergestellt werden. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper oder ein Fragment davon verschiedenen Modifizierungen unterzogen werden, um den Nachweis durch einen Enzym-Immuntest, Fluoreszenz-Immuntest, Lumineszenz-Immuntest oder Ähnliches zu ermöglichen.
  • Der vorstehend erwähnte Antikörper oder ein Fragment davon umfasst solche, die in der Lage sind, spezifisch ein bestimmtes Teilfragment des Polypeptids zu binden.
  • Die Verwendung des entstehenden Antikörpers oder eines Fragments davon umfasst Anwendungen zum Nachweis von Ceramidase-produzierenden Bakterien, den Nachweis von Ceramidase-exprimierenden Zelllinien, den Nachweis von Ceramidaseproteinen in den gezüchteten Zellen oder im Gewebe, Affinitätschromatographie, Durchmustern eines Expressionsprodukts von verschiedenen Arten von Genbanken (genomische DNA oder cDNA), Pharmazeutika, diagnostische Mittel, Reagenzien für die Forschung und Ähnliche.
  • (8) Verfahren zum Nachweis des Polypeptids
  • Eine Eigenschaft des Verfahrens zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids liegt darin, dass das Polypeptid, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, durch den vorstehend erwähnten Antikörper oder ein Fragment davon nachgewiesen wird.
  • In der vorliegenden Erfindung können als nachzuweisende Proben zum Beispiel Kulturen von Mikroorganismen und tierischen Zellen, Gewebefragmente, aufgebrochene Mikroorganismenzellen und tierische Zellen, Extrakte oder Auswaschungen von Geweben wie Häute und Proteinproben wie auf Membranen immobilisierte Proteine aus Mikroorganismen, tierischen Zellen und Geweben verwendet werden.
  • Hinsichtlich des Nachweises der spezifischen Bindung des Antikörpers oder eines Fragments davon an das vorstehend erwähnte Polypeptid kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden und ein solches Verfahren umfasst zum Beispiel einen Enzym-Immuntest, Fluoreszenz-Immuntest, Lumineszenz-Immuntest und Ähnliches.
  • Im Verfahren zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids kann der Nachweis unter Verwendung des Kits zur Verwendung zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids einfacher ausgeführt werden. Ein solcher Kit wird durch die vorliegende Erfindung ebenfalls umfasst. Ein Kennzeichen des vorstehend erwähnten Kits liegt darin, dass der Kit den vorstehend erwähnten Antikörper oder ein Fragment davon umfasst. Zusätzlich kann der Kit einen Reaktionspuffer, einen markierten Sekundärantikörper, ein Entwicklungsreagenz und Ähnliches enthalten.
  • (9) Antisense-DNA und Antisense-RNA
  • In der vorliegenden Erfindung bezieht sich jeder der Begriffe „Antisense-DNA" und „Antisense-RNA" auf diejenigen, welche eine Nucleotidsequenz haben, die zum erfindungsgemäßen Ceramidasegen oder einem Teil davon komplementär ist, und welche die Expression (Transkription, Translation) der genetischen Information des Gens durch Bildung eines Doppelstrangs mit einem endogenen Ceramidasegen (genomische DNA oder mRNA) unterdrücken oder kontrollieren. Die Länge der Antisense-DNA oder der Antisense-RNA kann abhängig von der Spezifität der Nucleotidsequenz und dem Verfahren zur Transduktion der Nucleotidsequenz in eine Zelle verändert werden. Die Antisense-DNA oder Antisense-RNA kann durch künstliche Synthese mit einem Synthesegerät, Expression eines Gens in einer zu der üblichen Richtung entgegengesetzten Richtung (Antisense-Richtung) durch eine enzymatische Umsetzung mit dem erfindungsgemäßen Gen als Matrize oder Ähnliches hergestellt werden. In einem Fall, in dem die Expression der Antisense-DNA in einem lebenden Körper gewünscht wird, wird ein Expressionsvektor, der in einer zu der üblichen Richtung entgegengesetzten Richtung an das erfindungsgemäße Gen ligiert ist, konstruiert und der entstehende Expressionsvektor kann in einen lebenden Körper transduziert werden.
  • Zum Beispiel ist eine Vielzahl von Antisense-Verfahren wie die Unterdrückung der Proliferation von HIV unter Nutzung des tat-Gens [Nucleic Acids Research, 19, 3359-3368 (1991)] oder des rev-Gens [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86, 4244-4248 (1989)] bekannt. Daher kann gemäß diesen Verfahren die Expression des endogenen Ceramidasegens durch Verwendung der erfindungsgemäßen Antisense-DNA oder Antisense-RNA unterdrückt oder kontrolliert werden. Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Antisense-DNA oder Antisense-RNA als Forschungsreagenz für in situ-Hybridisierung oder Ähnliches verwendet werden.
  • (10) Kontrolle der Menge des Ceramids in Zellen oder Geweben unter Verwendung des Ceramidasegens oder einer Antisense-Nucleinsäure davon
  • Durch das erfindungsgemäße Gen kann weiterhin ein in vitro-Verfahren zur Kontrolle einer Menge von Ceramid in einer Zelle und/oder in einem Gewebe bereitgestellt werden. Ein solches Kontrollverfahren wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst. Ein Kennzeichen des erfindungsgemäßen in vitro-Verfahrens der Kontrolle einer Menge eines Ceramids in einer Zelle und/oder einem Gewebe liegt darin, dass das erfindungsgemäße Ceramidasegen in die Zelle und/oder in das Gewebe eingeführt wird, wodurch die Menge des Ceramids in der Zelle und/oder in dem Gewebe kontrolliert wird.
  • Konkret wird im erfindungsgemäßen in vitro-Verfahren der Kontrolle das erfindungsgemäße Ceramidasegen in die Zelle und/oder in das Gewebe eingeführt und das Ceramid wird in einer Zelle oder in einem Gewebe durch eine Wirkung der durch das Gen exprimierten Ceramidase abgebaut. Auf der anderen Seite wird das erfindungsgemäße Ceramidasegen in die Zelle oder in das Gewebe eingeführt, so dass eine Antisense-Nucleinsäure des Gens, zum Beispiel eine Antisense-RNA, erzeugt wird, wodurch die Ceramidaseaktivität in der Zelle oder in dem Gewebe erniedrigt wird, so dass der Abbau des Ceramids unterdrückt werden kann. Zusätzlich kann in einem Fall, in dem die Menge des Ceramids unterdrückt wird, die Antisense-Nucleinsäure des erfindungsgemäßen Ceramidasegens, nämlich die erfindungsgemäße Antisense-DNA oder Antisense-RNA, in intakter Form in eine Zelle oder in ein Gewebe eingeführt werden.
  • Als Verfahren zur Einführung des Ceramidasegens oder einer Antisense-Nucleinsäure davon, vorstehend erwähnt, in eine Zelle oder ein Gewebe kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden und Verfahren zur physikalischen Einführung eines Gens, wie das Elektroporationsverfahren und das Verfahren mithilfe der Partikelkanone oder ein Verfahren zur Einführung eine Gens unter Verwendung eines viralen Vektors können verwendet werden. Der virale Vektor, welcher im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel kann das Gen unter Verwendung eines retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors, viralen Vakzinia-Vektors, viralen Adeno-assoziierten Vektors oder Ähnlichen eingeführt werden.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen in vitro-Verfahren der Kontrolle wird das erfindungsgemäße Ceramidasegen oder eine Antisense-Nucleinsäure davon in eine Zelle oder in ein Gewebe eingeführt, um die Menge eines Ceramids in der Zelle und/oder in dem Gewebe zu kontrollieren, wodurch ausgezeichnete Wirkungen gezeigt werden, so dass eine Krankheit, die durch abnormale Mengen eines Ceramids verursacht wird, behandelt werden kann und ein Versuchstier, das an einer Erkrankung mit abnormalem Ceramid-Metabolismus leidet, geschaffen werden kann. Die „Krankheit, die durch eine abnormale Menge eines Ceramids verursacht wird" ist nicht besonders eingeschränkt und umfasst zum Beispiel Farber's Krankheit und Ähnliche.
  • Das Verfahren zum Erhalten eines Ceramidasegens aus der Leber einer Maus wird hier im Nachstehenden erklärt.
    • 1) Zuerst wird eine Membranfraktion aus einem Homogenat einer Leber einer Maus hergestellt und in einer Lösung aus Saccharose-EDTA suspendiert und die Suspension wird eingefroren und aufgetaut und danach zentrifugiert, so dass ein Überstand erhalten wird (Enzym-Rohextrakt). Eine zur Homogenität gereinigte Ceramidasezubereitung kann aus dem entstehenden Enzym-Rohextrakt durch Kombination der bekannten Protein-Reinigungsverfahren, zum Beispiel verschiedene Arten von Chromatographien, erhalten werden. Als Chromatographien, welche in der vorstehend erwähnten Reinigung verwendet werden können, können Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Chelatchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Ähnliche verwendet werden.
    • 2) Als nächstes werden als Information zur Herstellung einer Sonde zur Clonierung des Ceramidasegens die Aminosäure-Teilsequenzen der Ceramidase untersucht. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Ceramidase kann durch Unterziehen der vorstehend erwähnten Ceramidase-Reinigungszubereitung selbst einer Aminosäuresequenzierung durch das Edman-Abbauverfahren herausgefunden werden [J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981)]. Zusätzlich kann die Aminosäure-Teilsequenz der internen Ceramidase durch Reinigung eines geeigneten Peptidfragments aus einem Peptidgemisch, das aus der Spaltung der gereinigten Enzymzubereitung mit einer Protease mit einer hohen Substratspezifität, zum Beispiel Lysylendopeptidase, N-Tosyl-L-Phenylalanyl-Chlormethylketon (TPCK)-Trypsin und Ähnlichen, entsteht, und Unterziehen des entstehenden Fragments einer Aminosäuresequenzierung erhalten werden.
    • 3) Auf Basis der Information der so aufgeklärten Aminosäuresequenz wird ein Oligonucleotid zur Verwendung als Sonde zur Hybridisierung oder zur Verwendung als Primer zur PCR entworfen, um das erfindungsgemäße Ceramidasegen zu clonieren. Um die Clonierung auszuführen, wird ein allgemein angewendetes PCR- oder Hybridisierungsverfahren genutzt. Das PCR-Verfahren kann in Übereinstimmung mit dem in PCR Technology, herausgegeben von Ehrlich, H. A., veröffentlicht durch Stockton Press, 1989, ausgeführt werden. Das Hybridisierungsverfahren kann zum Beispiel in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren, beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage, durchgeführt werden.
    • 4) Bezüglich des DNA-Fragments, das durch die vorstehend erwähnte Hybridisierung oder PCR erhalten wurde, kann die Aminosäuresequenz, welche darin codiert sein kann, durch Decodieren seiner Nucleotidsequenz bekannt werden. Ob das vorstehend erwähnte DNA-Fragment ein Fragment des Ceramidasegens ist oder ob nicht, kann durch Vergleich der Sequenz mit der Aminosäure-Teilsequenz der Ceramidase, welche im vorstehenden Punkt 2) erhalten wird, bestätigt werden.
    • 5) In einem Fall, in dem das DNA-Fragment, das durch Hybridisierung oder PCR in Punkt 3) erhalten wurde, ein Teil des Ceramidasegens ist, kann ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, welches eine Ceramidase in voller Länge codiert, durch Wiederholung der Verfahren in Punkt 3) oder alternativ durch Herstellung einer/s neuen Sonde oder Primers auf Basis der Nucleotidsequenz des DNA-Fragments, das in Punkt 3) erhalten wurde, und Durchführung der Hybridisierung oder PCR unter Verwendung der Sonde oder des Primers erhalten werden.
    • 6) Ein Expressionsvektor wird durch Ligierung des Gens, codierend eine Ceramidase in voller Länge, welche so mit einem geeigneten Vektor erhalten wird, konstruiert und dann wird die Transformante, in welche der Expressionsvektor transduziert wird, hergestellt. Die Transformante wird gezüchtet und die Ceramidase-Aktivität in der entstehenden Kultur wird untersucht, wodurch eine Bestätigung darüber erfolgen kann, dass das entstehende Gen eines ist, das Ceramidase codiert.
  • Beim Clonieren des erfindungsgemäßen Ceramidasegens konnte jedoch eine zur Durchmusterung der Genbank durch das Hybridisierungsverfahren geeignete Sonden-DNA nicht auf Basis der Aminosäure-Teilsequenzinformation, die in der vorliegenden Erfindung erhalten wird, entworfen werden. Außerdem wurde, obwohl verschiedene PCR-Primer durch Entwurf aus jeder der Aminosäure-Teilsequenzen und der Nucleotidsequenzen des Vektors zur Verwendung bei der Herstellung der Genbank entworfen wurden und die resultierenden Primer in verschiedenen Kombinationen zur Ausführung der PCR verwendet wurden, eine spezifische Amplifizierung nicht gefunden, wobei eine einzige Amplifizierung allein in der Kombination von zwei Arten von Primern, die auf Basis der Aminosäure-Teilsequenz C-53 (gezeigt in der Aminosäuresequenz von C-53 in SEQ ID NO: 3 des Sequenzprotokolls) entworfen wurden, gefunden wurde. Das amplifizierte DNA-Fragment P-1 (gezeigt in der Nucleotidsequenz von P-1 in SEQ ID NO: 6 des Sequenzprotokolls) war jedoch nur 68 Bp kurz, so dass das amplifizierte Fragment selbst nicht als Sonde für das Durchmustern der Genbank mit dem Hybridisierungsverfahren verwendet werden konnte. Daher wurde ein Genfragment mit einer Größe von 335 Bp, von welchen zum ersten Mal angenommen wurde, dass es als Sonde für das Durchmustern der Genbank mit dem Hybridisierungsverfahren geeignet ist, zum ersten Mal erfolgreich durch weiteren Entwurf eines Primers für die PCR auf Basis der Sequenz von P-1 und gleichzeitiges Ausführen einer PCR unter Verwendung einer Kombination des Primers und eines Primers, der auf Basis der Nucleotidsequenz eines Vektors entworfen wurde, der bei der Herstellung der Genbank verwendet wurde, erhalten.
  • Weiterhin kann ein Gen, codierend eine Ceramidase in voller Länge, durch Durchmustern einer cDNA-Genbank, abgeleitet aus der Leber einer Maus, mit dem vorstehend erwähnten Fragment einer Größe von 335 Bp als Sonde cloniert werden. Die genomische DNA einer erfindungsgemäßen Ceramidase kann auch durch Durchmustern einer genomischen DNA-Bank aus der Leber einer Maus erhalten werden.
  • Die gesamte Nucleotidsequenz des so erhaltenen, aus der Leber einer Maus hergestellten Ceramidasegens wird in SEQ ID NO: 12 des Sequenzprotokolls gezeigt und die Aminosäuresequenz des dadurch codierten Polypeptids wird in SEQ ID NO: 13 des Sequenzprotokolls gezeigt. Es wurde herausgefunden, dass dieses Enzym zu einem reifen Enzym prozessiert wird, in welchem der N-terminale Teil des Peptids des Gens in vivo auf Basis dieser Aminosäuresequenz und der N-terminalen Aminosäuresequenz des Gens entfernt wird. Die Aminosäuresequenz dieser reifen Ceramidase und der Nucleotidsequenz, codiert durch die Sequenz, werden in SEQ ID NO: 14 beziehungsweise 15 des Sequenzprotokolls gezeigt. Keine der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen und Nucleotidsequenzen hat eine Homologie mit jeder bekannten Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz einer Ceramidase aus einem Säuger. In anderen Worten besteht das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Ceramidasegen aus einer vollständig neuen Sequenz, welche für das bekannte Ceramidasegen irrelevant ist.
  • Wie vorstehend beschrieben, werden gemäß der vorliegenden Erfindung eine Primärstruktur und eine genetische Struktur der Ceramidase aus der Leber einer Maus bereitgestellt. Weiterhin kann ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, durch Genmanipulationsverfahren kostengünstig und in hoher Reinheit durchgeführt werden.
  • Zusätzlich ist die/der Oligonucleotidsonde oder -Primer, welche(r) in der Lage ist, spezifisch an das erfindungsgemäße Ceramidasegen zu binden, nützlich bei der Suche, dem Nachweis, der Amplifizierung und Ähnlichen des erfindungsgemäßen Ceramidasegens. Der Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/s spezifisch an das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, ist beim Nachweis, bei der Identifizierung, Reinigung und Ähnlichem einer Ceramidase nützlich.
  • Zusätzlich kann gemäß dem erfindungsgemäßen in vitro-Verfahren zur Kontrolle einer Menge eines Ceramids in einer Zelle und/oder einem Gewebe die Menge eines Ceramids in der Zelle und/oder dem Gewebe durch Einführung des erfindungsgemäßen Ceramidasegens oder seiner Antisense-Nucleinsäure in die Zelle und/oder in das Gewebe kontrolliert werden. Daher ist ein solches Kontrollverfahren bei der Behandlung einer Krankheit, die durch eine abnormale Ceramidmenge verursacht wird, nützlich, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, eine Behandlung einer Krankheit wie Farber's Krankheit.
  • Die vorliegende Erfindung wird konkret durch die Beispiele erklärt, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise auf diese Beispiele beschränken zu wollen.
  • Beispiel 1 Reinigung der Ceramidase
  • In 300 ml einer 0,25 M Saccharoselösung, enthaltend 1 mM EDTA (Saccharose-EDTA-Lösung), wurden 181 g Leber, die 105 Sea/ddY-Mäusen (hergestellt von Seiwa Experimental Animals) entnommen wurden, homogenisiert. Das entstehende Homogenat wurde bei 600 × g für 10 Minuten zentrifugiert und danach wurde der Überstand gesammelt. Der entstehende Überstand wurde weiter bei 2700 × g für 30 Minuten zentrifugiert und die Niederschläge wurden gesammelt.
  • Die präzipitierte Fraktion wurde in 480 ml der Saccharose-EDTA-Lösung suspendiert, um eine Suspension zu erhalten. Die entstehende Suspension wurde bei –80°C eingefroren und danach unter fließendem Wasser aufgetaut. Diese Einfrier-Auftau-Behandlung wurde zweimal wiederholt. Danach wurde die behandelte Suspension bei 105000 × g für 90 Minuten zentrifugiert und der Überstand und die Niederschläge wurden jeweils gesammelt. Die Niederschläge wurden den Behandlungen des Einfrierens-Auftauens und der Zentrifugation in derselben Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Der Überstand wurde gesammelt und mit dem vorher erhaltenen Überstand kombiniert, so dass 520 ml eines Enzym-Rohextrakts erhalten wurden.
  • 260 Milliliter des Rohextrakts wurden auf eine 100 ml-DEAE-Sepharose-FF-Säule (hergestellt durch Amersham Pharmacia), äquilibriert mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), aufgetragen und dann wurden nicht absorbierte Substanzen durch Waschen entfernt. Danach wurde die Flution mit demselben Puffer, enthaltend 1 M NaCl, ausgeführt, um 160 ml einer für Ceramidase aktiven Fraktion zu sammeln. Die Fraktion wurde anschließend auf eine 100 ml-Phenyl-Sepharose-FF-Säule (hergestellt von Amersham Pharmacia), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 M NaCl, aufgetragen. Danach wurde die Flution auf einem Konzentrationsgradienten von 2 bis 0 M NaCl ausgeführt und die Flution wurde weiterhin auf einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1% Polidocanol (Handelsname: Lubrol PX, hergestellt von Nacalai Tesque Inc.) ausgeführt. Durch diese Chromatographie wurden 310 ml einer für Ceramidase aktiven Fraktion gesammelt.
  • Die entstehende aktive Fraktion wurde auf eine 25 ml-Chelating-Sepharose-FF-Säule (hergestellt von Amersham Pharmacia, Cu2+-gebundener Typ), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% Lubrol PX, aufgetragen. Die Säule wurde mit demselben Puffer und dann mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,1% Lubrol PX, gewaschen. Danach wurde die Flution des Enzyms mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 2 M NH4Cl und 0,1% Lubrol PX, durchgeführt. Die eluierte aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert, so dass ein Konzentrat erhalten wurde. Als nächstes wurde der Puffer in dem Konzentrat durch 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,1% Lubrol PX, ersetzt, so dass eine Enzymlösung erhalten wurde. 30 Milliliter der entstehenden Enzymlösung wurden weiterhin auf eine poröse HQ-Säule (Φ 4,6 × 100 mm, hergestellt durch Perceptive Biosystems), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,1% Lubrol PX, aufgetragen. Anschließend wurde die Flution auf einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl ausgeführt, so dass eine aktive Fraktion erhalten wurde. Diese aktive Fraktion wurde auf eine Hydroxyapatit-Säule (Φ 7,5 × 100 mm, hergestellt von PENTAX), äquilibriert mit 1 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,2 M NaCl und 0,1% Lubrol PX, aufgetragen. Die Ceramidase adsorbierte nicht an diese Säule und wurde auf einer Auslaufsäule gesammelt. Danach wurde die Fraktion einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Superose 200HR-Säule (Φ 10 × 300 mm, hergestellt von Amersham Pharmacia), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,2 M NaCl und 0,3% Lubrol PX, unterzogen, so dass eine gereinigte Ceramidase erhalten wurde. Als Ergebnis der vorstehenden Reinigungsverfahren wurden 58 mg der gereinigten Ceramidasezubereitung erhalten.
  • Verschiedene Eigenschaften der entstehenden gereinigten Ceramidasezubereitung wurden untersucht, wie es in der vorliegenden Beschreibung beschrieben wird. Es wurde herausgefunden, dass sie wie folgt waren:
    Aktivität: das Hydrolysieren von Ceramid, so dass ein Sphingoid und eine Fettsäure erzeugt werden;
    Substratspezifität: der Besitz einer Substratspezifität, wie in der vorstehend aufgeführten Tabelle 1 gezeigt;
    pH-Optimum: wie in 1 gezeigt wird, ist das pH-Optimum dieser Ceramidase von 7,0 bis 8,0;
    Temperaturstabilität: die verringerte Aktivität wird nicht beobachtet, wenn sie in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,1% Polidocanol (Handelsname: Lubrol PX), bei 37°C für 24 Stunden behandelt wurde, die Aktivität wurde jedoch auf etwa 30% derjenigen vor der Behandlung verringert, wenn sie für 1 Stunde bei 60°C behandelt wurde und
    Molekulargewicht: etwa 94 kDa bei SDS-PAGE (unter reduzierenden Bedingungen und etwa 73 kDa bei SDS-PAGE (unter reduzierenden Bedingungen), wenn dieses Enzym durch Glycopeptidase F gespalten wurde.
  • Beispiel 2 Sequenzierung der Aminosäure-Teilsequenz der Ceramidase
  • Zu 11 ml einer Probenlösung, umfassend 50 pMol Ceramidase, wurden 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,3% Lubrol PX, gegeben. Die entstehende Probenlösung wurde auf eine MonoQ-PCI 6/5-Säule (100 μl, hergestellt von Amersham Pharmacia) aufgetragen. Anschließend wurde die an die Säule adsorbierte Ceramidasefraktion mit demselben Puffer, enthaltend 0,4 M NaCl, eluiert. Durch diese Verfahren wurde die Ceramidase-enthaltende Fraktion auf ein Volumen von 50 μl konzentriert. Das entstehende Konzentrat wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und das Gel wurde nach der Elektrophorese mit GelCode Blue Stain-Reagenz (hergestellt von Pierce) gefärbt. Als nächstes wurde die der Ceramidase entsprechende Bande ausgeschnitten. Ein Viertel des ausgeschnittenen Gelfragments wurde einer Extraktion mit 300 μl eines 0,1 M Tris-HCl-Puffers (pH 9,0), enthaltend 0,1% SDS, bei 37°C für 16 Stunden unterzogen. Unter Verwendung des Extrakts als Probe wurde die N-terminale Aminosäuresequenzierung der Ceramidase unter Verwendung des G1005A-Protein Sequencing System (hergestellt durch Hewlett-Packard) durchgeführt, um eine N-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen. SEQ ID NO: 1 des Sequenzprotokolls zeigt eine N-terminale Aminosäuresequenz.
  • Zusätzlich wurden die verbleibenden drei Viertel des ausgeschnittenen Gelfragments mit 1 ml eines 0,5 M Tris-HCl-Puffers (pH 9,2)/50% Acetonitril bei 30°C für 45 Minuten gewaschen. Das Gel wurde unter Verwendung von Stickstoffgas und einem Zentrifugalkonzentrator vollständig getrocknet und danach wurden 10 μl eines 0,5 M Tris-HCl-Puffers (pH 9,2), enthaltend 0,5 μg Protease Lys-C (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dazugegeben. Weiterhin wurden 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,2) zugegeben, bis das Gel vollständig aufgequollen war und das Gemisch wurde für 16 Stunden bei 37°C gehalten, um die Spaltung der Ceramidase mit Protease durchzuführen. Nach der Beendigung der Umsetzung wurden die Verfahren der Extraktion mit 150 μl 0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril bei Raumtemperatur für 1 Stunde zweimal wiederholt und ein Extrakt wurde gesammelt. Dieser Extrakt wurde einer Umkehrphasenchromatographie unterzogen, um das Peptidfragment zu reinigen. Das entstehende Peptidfragment wurde durch das Edman-Abbauverfahren unter Verwendung des G1005A-Protein Sequencing System analysiert, um die Aminosäure-Teilsequenzen C-46 und C-53 zu bestimmen. Die SEQ ID NOs: 2 und 3 des Sequenzprotokolls zeigen je eine Aminosäuresequenz für C-46 und C-53.
  • Beispiel 3 Amplifizierung eines das Ceramidasegen umfassenden DNA-Fragments mittels PCR-Verfahren
  • Gemische aus Sense-Primern 53-S1 und aus Antisense-Primern 53-A3 wurden auf Basis der Aminosäure-Teilsequenz C53 der in Beispiel 2 bestimmten Ceramidase entworfen und mit einem DNA-Synthesegerät synthetisiert. Die SEQ ID NOs: 4 und 5 des Sequenzprotokolls zeigen jeweils die Nucleotidsequenzen der Primer 53-S1 und 53-A3. Die PCR wurde unter Verwendung dieser Primer durchgeführt. Die PCR wurde mit einer cDNA-Plasmidbank aus Leber der Maus (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde durch eine Reaktion bei 94°C, 9 Minuten, danach 40 Reaktionszyklen, wobei ein Zyklus einen Prozess, bestehend aus 94°C, 0,5 Minuten –51°C, 0,5 Minuten –72°C, 1 Minute, umfasste, und weiterhin eine Inkubation bei 72°C für 7 Minuten durchgeführt. Durch diese PCR wurde ein spezifisch amplifiziertes DNA-Fragment in einer Größe von etwa 70 Bp durch Agarose-Elektrophorese nachgewiesen.
  • Diese amplifizierte DNA wurde aus dem Gel gesammelt und diese DNA wurde in den pGEM-T-easy-Vektor (hergestellt durch Promega) eingebaut, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren. Eine DNA-Fragment-Insertion des Plasmids wurde einer Nucleotidsequenzierung unterzogen. Als Ergebnis wurde eine Nucleotid-Teilsequenz P-1 dieses Fragments bestimmt. SEQ ID NO: 6 des Sequenzprotokolls zeigt die Nucleotidsequenz von P-1. Die Sequenz ist eine Sequenz, welche der Aminosäure-Teilsequenz C-53 der in Beispiel 2 bestimmten Ceramidase entspricht. Es wurde bestätigt, dass ein Teil des gewünschten Ceramidasegens erhalten werden konnte.
  • Die Antisense-Primer MA1 und MA2 wurden auf Basis der Nucleotidsequenz von P-1 entworfen und synthetisiert. Die SEQ ID NOs: 7 und 8 des Sequenzprotokolls zeigen jeweils die Nucleotidsequenzen der Primer MA1 und MA2. Zusätzlich wurden die Senseprimer T7in und T7out auf Basis der Nucleotidsequenz des Vektors pAP3neo, der bei der Konstruktion der cDNA-Plasmidbank aus Mausleber verwendet wurde, entworfen und synthetisiert. Die SEQ ID NOs: 9 und 10 des Sequenzprotokolls zeigen jeweils die Nucleotidsequenzen der Primer T7in und T7out. Die verschachtelte PCR wurde unter Verwendung dieser Primer bei der cDNA-Plasmidbank aus Leber der Maus als Matrize durchgeführt. Eine erste PCR wurde unter Verwendung des Senseprimers T7out und des Antisenseprimers MA2 durch eine Reaktion bei 94°C, 9 Minuten, danach 40 Reaktionszyklen, wobei ein Zyklus einen Prozess, bestehend aus 94°C, 0,5 Minuten –51°C, 0,5 Minuten –72°C, 1 Minute, umfasst und weiterhin eine Inkubation bei 72°C für 7 Minuten durchgeführt. Eine zweite PCR wurde unter denselben Bedingungen wie in der ersten PCR durchgeführt, außer dass der Senseprimer T7in und der Antisenseprimer MA1 mit einem Reaktionsgemisch der ersten PCR als Matrize verwendet wurde. In der Folge wurde ein amplifiziertes DNA-Fragment einer Größe von 335 Bp erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde als eine Sonde zur nachstehend beschriebenen Koloniehybridsierung verwendet.
  • Beispiel 4 Clonierung des Ceramidasegens
  • Eine Transformante, die aus der Einführung der cDNA-Plasmidbank aus Mausleber entstand, wurde auf einen Nylonfilter (Handelsname Hybond-N+, hergestellt durch Amersham Pharmacia) auf einer LB-Agarmediumplatte, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, geimpft und etwa 30000 Kolonien pro Platte von 9,5 × 13,5 cm wurden gebildet, so dass ein Masterfilter hergestellt werden konnte. Eine Replik dieses Filters wurde hergestellt und der entstehende Replikafilter wurde jeweils für 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in eine 10% SDS-Lösung eingetaucht war, 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in eine Lösung eingetaucht war, die 0,5 M Na OH und 1,5 M NaCl enthielt, (Denaturierung), 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 3 M NaCl (Neutralisierung), eingetaucht war und 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in eine 2 × SSC-Lösung eingetaucht war, behandelt. Danach wurde der Filter mit 2 × SSC-Lösung abgespült. Dieser Filter wurde luftgetrocknet und danach wurde die DNA durch ultraviolette Bestrahlung auf einem Filter immobilisiert, so dass er als Filter für eine Koloniehybridisierung verwendet werden konnte.
  • Als Sonde für die Hybridisierung wurden durch 32-P-Markierung 0,1 μg Äquivalent des in Beispiel 3 erhaltenen, amplifizierten DNA-Fragments unter Verwendung des DNA-Markierungskits, Ready To Go (hergestellt von Pharmacia), in Übereinstimmung mit der dem Kit beigefügten Arbeitsanleitung hergestellt. Der vorstehend erwähnte Filter wurde in einen Hybri-Bag platziert. Die Vorhybridisierung wurde bei 60°C für 1 Stunde in einer Hybridisierungslösung (Zusammensetzung: 7% PEG6000, 10% SDS-Lösung) durchgeführt und danach wurde die vorstehend erwähnte, markierte Sonde zu dem Gemisch gegeben, so dass man eine Konzentration von 0,006 pMol/ml erhielt, und die Hybridisierung wurde über Nacht bei 60°C ausgeführt. Als nächstes wurde der Filter dreimal für jeweils 15 Minuten bei 60°C in der Waschlösung (2 × SSC, 0,1% SDS), die zuvor auf 60°C erwärmt wurde, gewaschen. Nachdem überschüssiges Wasser vom Filter entfernt worden war, wurde der Filter danach für 20 Minuten auf einer Bildplatte, hergestellt durch Fuji Photo Film, photo-sensibilisiert. Danach wurde das Signal mit dem Bildanalysegerät BAS1000 (hergestellt von Fuji Photo Film) nachgewiesen. Anschließend wurden die Kolonien auf einem Masterfilter gesammelt, die einem positiven Signal, das durch diese Verfahren erhalten wurde, entsprechen (erste Durchmusterung).
  • Die gesammelten Kolonien wurden in einem LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, suspendiert und danach wurde die Suspension auf dem Nylonfilter auf einer LB-Agarmedium-Platte von 9,5 × 13,5 cm, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, ausplattiert und etwa 200 bis etwa 1000 Kolonien wurden pro einem Blatt gebildet, um einen Masterfilter herzustellen. Dieser Filter wurde der Durchmusterung auf einen positiven Clon in derselben Art und Weise wie bei der ersten Durchmusterung unterzogen und eine dritte Durchmusterung wurde weiterhin mit denselben Verfahren durchgeführt. Als Ergebnis der dritten Durchmusterung konnte der positive Clon, von welchem geschlossen wurde, dass er das Ceramidasegen enthält, isoliert werden.
  • Ein Plasmid wurde von diesem positiven Clon hergestellt und dieses Plasmid wurde Plasmid pLCDase genannt. Das Plasmid wurde mit verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen oder einer Kombination mehrerer Restriktionsenzyme gespalten. Danach wurde jedes der gebildeten DNA-Fragmente subcloniert und seine Nucleotidsequenz wurde analysiert. Durch die vorstehenden Verfahren wurde die gesamte Nucleotidsequenz des in das Plasmid pLCDase inserierten DNA-Fragments bestimmt. Die Sequenz wird in SEQ ID NO: 11 des Sequenzprotokolls gezeigt. Zusätzlich werden die Nucleotidsequenz des in der Sequenz gefundenen offenen Leserahmens (ORF) und die Aminosäuresequenz des dadurch codierten Polypeptids in den SEQ ID NOs: 12 bzw. 13 des Sequenzprotokolls gezeigt. Weiterhin wird die Restriktionsenzymkarte des vorstehend erwähnten DNA-Fragments und die Position des im DNA-Fragment enthaltenen offenen Leserahmens in 2 gezeigt.
  • Als Ergebnis der Analyse der Nucleotidsequenz des vorstehend erwähnten ORF wurde bestätigt, dass die Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, welche eine Aminosäure-Teilsequenz der in Beispiel 2 aufgeklärten Ceramidase umfasst, und dass dieser ORF Ceramidase codiert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass, wenn die Aminosäuresequenz der durch den ORF codierten Ceramidase mit der in SEQ ID NO: 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz der Ceramidase verglichen wurde, der aus der Leber der Maus gereinigten Ceramidase das Peptid des N-terminalen Anteils der Polypeptide, die von dem vorstehend erwähnten ORF codiert werden, fehlte. Mit anderen Worten wurde gezeigt, dass die Ceramidase durch die Prozessierung, bei der ihr N-terminaler Anteil nach der Translation entfernt wurde, in ein reifes Enzym umgewandelt wurde. SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls zeigt eine Aminosäuresequenz der reifen Ceramidase beziehungsweise SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls zeigt eine Nucleotidsequenz der reifen Ceramidase.
  • Beispiel 5 Expression des Ceramidasegens
  • Zu CHO-Zellen, die in einem α-MEM-Medium, enthaltend 10% FCS, in einer Schale mit einem Durchmesser von 35 mm (3 × 105 Zellen/Schale) gezüchtet wurden, wurde 1 μg des Plasmid pLCDase, das in Beispiel 4 erhalten wurde, und 5 μl Lipofectamin (hergestellt von Life Technologies) gegeben, wodurch ein Ceramidasegen in CHO-Zellen transduziert wurde. Die Zellen wurden bei 37°C für 24 Stunden gezüchtet und danach in 100 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,1% Triton X-100 suspendiert und die Zellen wurden aufgebrochen. Die Bestimmung der Aktivität der Ceramidase, deren Substrat das vorstehend erwähnte C12-NBD-Ceramid war, wurde für die entstehende, aufgebrochene Zellen enthaltende Lösung durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Ceramidase in den Zellen etwa 1000-fach intensiver exprimiert wurde als die der Kontrollzellen, in welche pLCDase nicht transduziert wurde.
  • Weiterhin wurde die Menge des Ceramids in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in Analytical Biochemistry, 244, 291-300 (1997) beschrieben wurde, bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass jene mit pLCDase transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen, in die pLCDase nicht transduziert wurde, eine signifikant verringerte Menge des Ceramids aufwiesen.
  • Beispiel 6 Clonierung des Ceramidasegens aus dem Hirn der Maus
  • Eine Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell, PROTRAN BA85 0,45 mm mit einem Durchmesser von 82 mm verwendet) wurde auf eine Platte mit LB-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, gelegt und die cDNA-Bank aus dem Hirn der Maus (LIFE TECHNOLGIES, SUPERSCRIPT Mouse Brain cDNA Library) wurde auf jede von 10 Platten ausplattiert, so dass etwa 200000 Kolonien auf einer Platte waren, und bei 37°C für 10 Stunden gezüchtet. Auf einer Nitrocellulosemembran gezüchtete E. coli wurden auf eine Nylonmembran [PALL Gelman Laboratory, Biodyne A, Durchmesser 82 mm (1,2 mm)] übertragen und jede Nylonmembran wurde auf eine Ampicillinplatte gelegt und danach erfolgte die Züchtung bei 37°C für 3 Stunden. Die Nitrocellulosemembran wurde bei 4°C als Musterfilter gelagert und die Nylonmembran wurde auf eine Chloramphenicolplatte gelegt und es erfolgte eine Züchtung bei 37°C für 16 Stunden. Die Kolonien wurden von der Nylonmembran auf eine frische Nylonmembran überführt und die Vorder- und Rückseiten der Membran wurden jeweils für 5 Minuten mit 1 ml einer Denaturierungslösung (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl) in einem Zustand behandelt, in dem jedes Paar der Nylonmembranen übereinander gelegt wurde. In ähnlicher Weise wurden die Nylonmembranen mit 1 ml einer Neutralisierungslösung [0,5 M Tris-HCl (pH 7,4)/1,5 M NaCl] für 5 Minuten behandelt. Die Nylonmembran wurde abgelöst und die behandelte Membran wurde an der Luft getrocknet und danach bei 80°C für 2 Stunden gebacken. Danach wurde die gebackene Membran mit 200 ml einer Vorspülflüssigkeit [5 × SSC/0,5% SDS/1 ml EDTA (pH 8,0)] geschüttelt und aufgebrochene E. coli-Reste wurden abgewischt und mit 2 × SSC gewaschen. Die Hybridisierung wurde mit 40 ml einer Hybridisierungslösung [0,5 M Church-Phosphatpuffer/7% SDS/1 mM EDTA] bei 65°C für 2 Stunden durchgeführt und danach wurde die Hybridisierung bei 65°C für 16 Stunden in 40 ml der Hybridisierungslösung, enthaltend die denaturierte Sonde, durchgeführt. Als Sonde wurde ein EcoRI-EcoRI-Fragment von einer Größe von 2,7 kBp des Plasmids pAPLCD, welches Maus-Ceramidasegen trägt, verwendet. Nach der Beendigung der Hybridisierung wurde ein Waschschritt mit 100 ml einer Waschlösung (40 mM Church-Phosphatpuffer/1% SDS) bei 65°C für 15 Minuten zweimal ausgeführt. Weiterhin wurde mit 100 ml einer hochstringenten Waschlösung (0,2 × SSC/0,1% SDS) bei 65°C für 15 Minuten gewaschen. Die Membran wurde an der Luft getrocknet und danach auf einer IP-Platte für 1 Stunde exponiert und mit dem BAS 1500 analysiert. Der positive Teil der Nitrocellulosemembran wurde in einem Durchmesser von etwa 6 mm ausgeschnitten und in 1 ml des LB-Mediums suspendiert. Danach wurde eine Probe von 200 ml durch 4000-fache Verdünnung des positiven Teils auf einer Ampicillin enthaltenden LB-Platte ausplattiert und eine zweite Durchmusterung wurde durchgeführt.
  • In ähnlicher Weise wurde eine Probe von 200 ml durch eine 10000-fache Verdünnung des positiven Teils auf einer Ampicillin-enthaltenden LB-Platte ausplattiert, um eine Genbank anzulegen. Eine dritte Durchmusterung wurde unter Verwendung dieser Genbank durchgeführt. Der isolierte Clon (pSBCD) wurde subcloniert und danach wurde die Nucleotidsequenz mit einem konventionellen Verfahren bestimmt. Diese Sequenz wird in SEQ ID NO: 16 gezeigt.
  • In der vorstehend erwähnten Sequenz wurde ein ORF mit einer identischen Sequenz wie das in Beispiel 4 beschriebene Ceramidasegen aus der Leber der Maus gefunden. Zufällig waren die Sequenzen der nicht-translatierten 5'-Region und der nicht-translatierten 3'-Region zu denen aus der Leber der Maus unterschiedlich. Zusätzlich wurde das isolierte Plasmid pSBCD in derselben Art und Weise wie in Beispiel 5 in CHO-Zellen transduziert. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Ceramidase in den Zellen exprimiert wurde.
  • Beispiel 7 Genomische Clonierung des menschlichen Ceramidasegens
  • Der Sense-Primer U1107 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls und der Antisense-Primer L1311 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 18 des Sequenzprotokolls wurden auf Basis der Sequenz des in Beispiel 4 bestimmten Ceramidasegens aus der Leber der Maus synthetisiert. Die Sequenz des Primers U1107 entspricht einer Sequenz, die aus den Basen Nr.: 1107-1130 von SEQ ID NO: 12 des Sequenzprotokolls besteht und die Sequenz des Primers L1311 entspricht einer Nucleotidsequenz, die zu einer Sequenz komplementär ist, die aus den Basen Nr.: 1311-1334 von SEQ ID NO: 12 des Sequenzprotokolls besteht.
  • Die genomische DNA wurde mit einem konventionellen Verfahren aus der menschlichen Hepatomzelle Huh7 gereinigt. PCR wurde unter Verwendung des Primers U1107 und des Primers L1311 mit 625 ng der entstehenden genomischen DNA als Matrize durchgeführt. PCR wurde durch eine Reaktion bei 94°C, 9 Minuten, danach 40 Reaktionszyklen, wobei ein Zyklus einen Prozess, bestehend aus 94°C, 0,5 Minuten –55°C, 0,5 Minuten –72°C, 3 Minuten, umfasst und weiterhin eine Inkubation bei 72°C für 7 Minuten durchgeführt. Danach wurde das entstehende Reaktionsprodukt einer Agarose-Elektrophorese unterzogen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass ein DNA-Fragment einer Größe von 2 kBp durch die PCR amplifiziert wurde.
  • Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Sephaglas (hergestellt von Pharmacia) aus dem Gel gewonnen und das entstehende Fragment wurde in den pGEM-T-easy-Vektor (hergestellt von Promega) eingebaut, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren. Als Nächstes wurde die Nucleotidsequenz der DNA-Fragment-Insertion des entstehenden Plasmids bestimmt. Die vorstehend erwähnte Sequenz war eine Sequenz, die 96289-98478 der Zugangsnummer AC012131 Complement, registriert in der GenBank-Datenbank, entspricht. Zusätzlich wurde die Aminosäuresequenz, die durch die vorstehend erwähnte Sequenz codiert wird, analysiert. Als Ergebnis wurden eine Region, die eine Aminosäuresequenz mit Homologie zu einer Region der Aminosäuren Nr.: 370-444 der Aminosäuresequenz der Ceramidase aus der Leber der Maus aus SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls codiert, und eine Region, welche eine Aminosäuresequenz mit Homologie codiert, gefunden.
  • Zufällig weist AC012131 auch eine Homologie mit dem in Beispiel 4 bestimmten Ceramidasegen aus der Leber der Maus auf.
  • SEQUENZPROTOKOLL, FREIER TEXT
  • In der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 steht jedes Xaa in den Aminosäurenummern: 7, 9 und 13 für eine unbekannte Aminosäure.
  • SEQ ID NO: 4 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers. In der vorstehend erwähnten Sequenz steht jedes n in den Basen Nummer 6, 9 und 15 für G, A, T oder C.
  • SEQ ID NO: 5 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers. In der vorstehend erwähnten Sequenz steht jedes n in den Basen Nummer 3, 6 und 15 für G, A, T oder C.
  • SEQ ID NO: 7 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 8 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 9 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 10 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 11 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 17 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • SEQ ID NO: 18 ist eine Sequenz eines synthetischen Oligonucleotidprimers.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Gen, das eine neutrale/alkalische Ceramidase aus einem Säuger codiert, und ein Verfahren zur genetischen Manipulation zur Herstellung einer Ceramidase unter Verwendung des Gens bereitgestellt. Ebenso sind die/der erfindungsgemäße Oligonucleotidsonde und -Primer für den Nachweis des vorstehend erwähnten Gens nützlich und können für Untersuchungen zum Ceramid-Metabolismus in vivo angewendet werden. Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Antisense-Nucleinsäure (DNA oder RNA) des erfindungsgemäßen Gens bereitgestellt. Das Gen und seine Antisense-Nucleinsäure sind bei der Kontrolle der Ceramidaseaktivität und bei der Regulation des Ceramid-Metabolismus in vivo nützlich. Daher wird ein in vitro-Verfahren zur Regulation der Menge des Ceramids bereitgestellt, welches zur Behandlung von Erkrankungen, die durch eine abnormale Menge von Ceramid verursacht werden, angewendet werden kann.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (17)

  1. Nucleinsäure, umfassend ein Gen, welches eine Nucleotidsequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure, welche ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 14 oder eine Teilsequenz dieses Polypeptids besitzt, wobei das Polypeptid oder die Teilsequenz davon eine Ceramidaseaktivität besitzt; (b) einer Nucleinsäure, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 15, oder eine Teilsequenz davon besitzt und ein Polypeptid codiert, welches Ceramidaseaktivität besitzt; (c) einer Nucleinsäure, welche in der Lage ist, mit einem komplementären Strang einer Nucleinsäure nach (a) oder (b), vorstehend, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren und welche ein Polypeptid codiert, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, die ein pH-Optimum von 7,0 bis 8,0 hat; und (d) einer Nucleinsäure, welche im Vergleich zu den Nucleinsäuren von (a) bis (c), vorstehend, degeneriert ist und ein Polypeptid codiert, welches eine Ceramidaseaktivität besitzt, die ein pH-Optimum von 7,0 bis 8,0 hat.
  2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Ceramidaseaktivität des Polypeptids durch die folgenden Schritte nachgewiesen werden kann: (a) Inkubieren eines Genexpressionsproduktes in einem Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 550 pmol C12-NBD-Ceramid und 1,0% (Gew./Vol.) Natriumcholat in 20 μl 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)] bei 37°C für 30 Minuten, um das Gemisch reagieren zu lassen; und (b) Nachweis der Erzeugung einer C12-NBD-Fettsäure im Reaktionsprodukt.
  3. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polypeptid wenigstens die folgenden Eigenschaften zeigt: (i) Aktivität: Hydrolysieren von Ceramid, um ein Sphingoid und eine Fettsäure zu erzeugen; (ii) Substratspezifität: Hydrolysieren von N-Acylsphingosin; allerdings keine Wirkung auf Galactosylceramid, Sulfatid, GM1a und Sphingomyelin; (iii) pH-Optimum: von 7,0 bis 8,0; und (iv) Senkung der Aktivität ist nicht erkennbar, wenn es in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), welche 0,1% Polidocanol enthält, bei 37°C für 24 Stunden behandelt wird, aber eine Aktivitätssenkung bei einer Behandlung bei 60°C für eine Stunde auf etwa 30% der Aktivität vor der Behandlung.
  4. Antisense-DNA oder Antisense-RNA, welche komplementär zur Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Teil davon ist, welche die Expression der Nucleinsäure unterdrückt oder kontrolliert.
  5. Expressionsvektor für einen Mikroorganismus, eine Tierzelle oder eine Pflanzenzelle, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder die Antisense-DNA nach Anspruch 4, welche eine Antisense-RNA exprimiert.
  6. Oligonucleotid-Sonde oder -Primer, welche(r) in der Lage ist, spezifisch mit der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem komplementären Strang davon zu hybridisieren.
  7. Nicht-menschliche Transformante, welche mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
  8. Polypeptid, welches eine Ceramidaseaktivität besitzt, das von der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
  9. Polypeptid nach Anspruch 8, wobei die Ceramidaseaktivität durch die folgenden Schritte nachgewiesen werden kann: (a) Inkubieren eines Genexpressionsproduktes in einem Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 550 pmol C12-NBD-Ceramid und 1,0% (Gew./Vol.) Natriumcholat in 20 μl 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)] bei 37°C für 30 Minuten, um das Gemisch reagieren zu lassen; und (b) Nachweis der Erzeugung einer C12-NBD-Fettsäure im Reaktionsprodukt.
  10. Antikörper oder Fragment davon, welcher/s spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 binden kann.
  11. Kit zur Verwendung beim Nachweis eines Genes, welches ein Polypeptid codiert, das eine Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend die Oligonucleotid-Sonde und/oder den -Primer nach Anspruch 6.
  12. Kit zur Verwendung beim Nachweis eines Polypeptids, welches Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend den Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 10.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches eine Ceramidaseaktivität besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformanten nach Anspruch 7 unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Expression des Ceramidasegens und die Produktion des Polypeptids, das von dem Gen codiert wird, geeignet sind, und ein Polypeptid, welches Ceramidaseaktivität besitzt, aus der erhaltenen Kultur gewonnen wird.
  14. Verfahren zum Nachweis eines Genes, welches ein Polypeptid codiert, das Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend die Verwendung der Oligonucleotid-Sonde oder des -Primers nach Anspruch 6.
  15. Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids, welches Ceramidaseaktivität besitzt, umfassend die Verwendung des Antikörpers oder eines Fragments davon nach Anspruch 10.
  16. In vitro-Verfahren zur Kontrolle der Menge von Ceramid in einer Zelle und/oder in einem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Antisense-Nucleinsäure davon in die Zelle und/oder das Gewebe eingeführt wird, wodurch die Menge des Ceramides in der Zelle und/oder im Gewebe kontrolliert wird.
  17. Verwendung der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Antisense-Nucleinsäure davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Farber's Krankheit.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001233086A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Ceramidase compositions and methods based thereon
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US8871202B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate
US20110045468A1 (en) * 2009-03-02 2011-02-24 Richard Robison Polynucleotides for the identification and quantification of group a streptococcus nucleic acids
KR101719265B1 (ko) * 2010-10-26 2017-04-04 삼성전자주식회사 서버, 사용자 단말 장치, 그 서비스 제공 방법 및 그 제어 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0515370A (ja) 1991-07-10 1993-01-26 Kao Corp 新規セラミダーゼ
JPH0515371A (ja) 1991-07-10 1993-01-26 Kao Corp 新規セラミダーゼ
JP3868052B2 (ja) 1997-03-18 2007-01-17 タカラバイオ株式会社 スフィンゴ脂質セラミドｎ−デアシラーゼ
US6258581B1 (en) * 1998-08-20 2001-07-10 Takara Shuzo Co., Ltd. Ceramidase gene

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