KR20010108411A

KR20010108411A - 세라미다아제 유전자

Info

Publication number: KR20010108411A
Application number: KR1020017012265A
Authority: KR
Inventors: 이또마꼬또
Original assignee: 오미야 히사시; 다까라 슈조 가부시키가이샤
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2001-12-07
Also published as: US20080050753A1; TWI272308B; CN1351659A; DE60034880T2; EP1172436B1; DE60034880D1; JP3995420B2; CN101173293A; US7449553B2; ATE362526T1; US20060024809A1; AU3326900A; US6830919B1; EP1172436A1; KR100661784B1; WO2000058448A1; EP1172436A4

Abstract

동물에서 발생하는 중성/알칼리 세라미다아제;여기에 특이적으로 결합하는 항체;이 세라미다아제를 코딩하는 유전자; 이와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브 및 프라이머;세라미다아제의 유전공학적 제조방법;세라미다아제 또는 이의 유전자의 검출방법; 및 세포 및/또는 조직내 세라미드 내용물의 제어방법;이들은 세라미드의 구조 및 기능의 분석을 위한 액체조작 시약, 세라미드 신진대사와 관련된 질병등에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

세라미다아제 유전자{CERAMIDASE GENE}

세라미다아제는 스핑고지질의 일종인 세라미드를 스핑고이드와 지방산으로 가수분해하는 효소이다. 세라미드가 세라미다아제에 의해 가수분해되어 생성되는 스핑고이드는 프로테인퀴나아제 C 의 저해, 포스포리파아제 D 의 활성화, 칼모듈린의존성 효소의 저해 등 다양한 생리활성을 갖는다. 이와 같이, 상기 스핑고이드는 세포의 증식이나 세포내 정보전달에 관여함으로써 세포기능의 조절에 작용하고 있는 것으로 여겨지는 주요한 물질이다. 세라미다아제는 상기 스핑고이드의 양 조절이라는 중요한 역할을 담당하는 효소이다.

세라미다아제는 그 최적 pH 에 의해 산성 세라미다아제, 중성·알칼리성 세라미다아제로 분류된다. 지금까지 산성역에 최적 pH 를 갖는 세라미다아제의 존재는 래트 뇌 [바이오케미스트리 (Biochemistry), 제 8 권, 제 1692 ∼ 1698 페이지 (1969)], 모르모트 상피세포 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 (J. Biol. Chem.)], 제 270 권, 제 12677 ∼ 12684 페이지 (1995)], 인체신장 [바이오키미카 에 바이오피지카 액터 (Biochim. Biophys. Acta), 제 398 권, 제 125 ∼ 131 페이지 (1975)], 비장 [바이오키미카 에 바이오피지카 액터, 제 1004 권, 제 245 ∼ 251 페이지 (1989)], 섬유아세포 [바이오케미컬 저널 (Biochem. J.), 제 205 권, 제 419 ∼ 425 페이지 (1982)], 상피 [페브즈 레터즈 (FEBS Lett.), 제 268 권, 제 110 ∼ 112 페이지 (1990)] 등의 포유동물조직, 인체뇨 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리, 제 270 권, 제 11098 ∼ 11102 페이지 (1995)] 등에 보고되어 있다.

또, 슈도모나스속 세균이 세라미다아제를 생산하는 것이 밝혀져 있고, 이 세라미다아제는 알칼리성역에 최적 pH 를 갖는 세라미다아제인 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리, 제 273 권, 제 14368 ∼ 14373 페이지 (1998)].

이들 세라미다아제 중, 인체뇨에서 정제된 산성 세라미다아제의 아미노산서열 및 이 세라미다아제를 코딩하는 유전자의 염기서열이 결정되어 있다 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 제 271 권, 제 33110 ∼ 33115 페이지 (1996)]. 또, 상기 인체뇨 유래의 산성 세라미다아제 유전자와의 상동성(相同性)을 이용하여 마우스의 산성 세라미다아제 유전자가 얻어지고 있다 [제노믹스 (Genomics), 제 50 권, 제 267 ∼ 274 페이지 (1998)].

그러나, 보고되어 있는 포유류유래 세라미다아제 유전자는 모두 산성 세라미다아제를 코딩하는 것으로 포유류에서의 중성·알칼리성 세라미다아제의 아미노산서열이나 유전자구조는 전혀 알려져 있지 않고, 고등생물에서의 중성·알칼리성 세라미다아제의 생물학적 기능도 밝혀져 있지 않은 것이 현상황이다.

생체내에서의 세라미다아제의 기능의 해명, 그 대사의 제어, 세라미드와 관련된 질병의 진단, 치료 등의 연구에는 세라미드와 관련된 다양한 효소 및 이 효소의 유전자와 관련된 상세한 정보를 얻을 필요가 있다. 그러나, 상기와 같이 포유류에서의 중성·알칼리성 세라미다아제의 아미노산서열, 그 유전자에 관한 지견은 얻지 못하고 있는 것이 현상황이다. 따라서, 세라미드와 관련된 상기와 같은 기술을 개발하기 위해서는 중성·알칼리성 세라미다아제, 특히 그 유전자에 관한 지견을 얻을 필요가 있다.

상기와 같이 포유류의 세라미다아제 유전자의 클로닝에 대해 몇가지 보고가 있지만, 이들은 모두 산성 영역에서 활성을 나타내는 세라미다아제로서 중성·알칼리성으로 활성을 나타내는 세라미다아제 사이에는 높은 호몰러지를 기대할 수 없다. 이로 인해, 산성 세라미다아제 유전자의 염기서열의 호몰러그로서 중성·알칼리성 세라미다아제 유전자를 취득하는 것은 곤란하다.

본 발명은 세라미드의 구조나 기능 등을 분석하기 위한 지질공학용 시약으로 유용한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 그에 특이적으로 결합하는 항체, 이 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 그에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브 및 프라이머에 관한 것이다. 또, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 유전자공학적인 제조방법, 및 이 폴리펩티드 또는 유전자의 검출방법 및 그 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세라미드량의 이상에 기인하는 질환에 응용할 수 있는 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법에 관한 것이다.

도 1 은 세라미다아제의 최적 pH 를 나타내는 도면이다.

도 2 는 세라미다아제 유전자를 포함하는 DNA 단편의 제한효소지도이다.

본 발명은 상기 종래기술을 감안하여 이루어진 것으로 제 1 목적은, 포유류의 중성·알칼리성 세라미다아제 유전자를 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 2 목적은, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입한 형질전환체를 사용하는 유전자공학적으로 고순도의 중성·알칼리성 세라미다아제를 제조하는 방법을 제공하는 데있다. 본 발명의 제 3 목적은, 상기 유전자가 코딩하는 폴리펩티드를 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 4 목적은, 본 발명의 유전자 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 DNA 및 안티센스 RNA 를 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 5 목적은, 본 발명의 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈하는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 6 목적은, 이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 7 목적은 상기 세라미다아제 또는 그 유전자의 검출방법 및 그에 사용하는 키트를 제공하는 데 있다. 본 발명의 제 8 목적은, 세포내 또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 포유류인 마우스간장으로부터 중성·알칼리성 세라미다아제를 단리하여 그 유전자를 단리하는 데 성공하였다. 또, 하이브리디제이션이나 폴리머라아제·사슬·반응(PCR) 등의 수법을 사용함으로써, 인체를 포함하는 포유류의 중성·알칼리성 세라미다아제의 구조를 해명하는 데 성공하였다. 또한, 이 유전자를 사용하여 유전자공학적 수법에 의해 고순도의 중성·알칼리성 세라미다아제를 간편하게 제조하는 데도 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 요지는

[1] (A) 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열 또는 그 일부를 갖고 이루어지는 폴리펩티드이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(B) 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 염기서열 또는 그 일부를 갖는 핵산으로서 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(C) 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결여, 부가, 삽입 또는 치환을 갖는 아미노산서열로 이루어지며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(D) 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 염기서열에서 적어도 하나의 염기의 결여, 부가, 삽입 또는 치환을 갖는 염기서열로 이루어지며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산; 및

(E) 상기 (A) ∼ (D) 중 어느 하나에 기재된 핵산의 상보가닥과 엄격한 조건하에 하이브리다이즈할 수 있는 핵산이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산,

(F) 축중(縮重)을 통하여 상기 (A) ∼ (E) 중 어느 하나에 기재된 핵산과는 상이한 염기서열을 갖는 핵산이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산,

으로 이루어지는 군에서 선택된 핵산의 염기서열을 갖는 유전자;

[2] 상기 [1] 기재의 유전자를 함유하여 이루어지는 재조합 DNA;

[3] 상기 [1] 기재의 유전자 또는 상기 [2] 기재의 재조합 DNA 를 함유하여 이루어지는 미생물, 동물세포 또는 식물세포용 발현벡터;

[4] 상기 [3] 기재의 발현벡터를 지지하여 이루어지는 형질전환체;

[5] 세라미다아제 유전자가 발현되고, 또한 이 유전자에 코딩된 폴리펩티드의 생산에 적합한 조건하에 상기 [4] 기재의 형질전환체를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법;

[6] 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열 또는 그 일부를 갖고 이루어지는 폴리펩티드이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드;

[7] 상기 [1] 기재의 유전자에 의해 코딩되어 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드;

[8] 상기 [1] 기재의 유전자 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 DNA;

[9] 상기 [1] 기재의 유전자 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 RNA;

[10] 상기 [8] 기재의 안티센스 DNA 를 함유하여 이루어지는 발현벡터;

[11] 상기 [1] 기재의 유전자 또는 그 상보가닥에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머;

[12] 상기 [6] 또는 [7] 기재의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 단편;

[13] 상기 [11] 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 사용하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 검출방법;

[14] 상기 [11] 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 함유하여 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 검출에 사용하기 위한 키트;

[15] 상기 [12] 기재의 항체 또는 그 단편을 사용하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출방법;

[16] 상기 [12] 기재의 항체 또는 그 단편을 함유하여 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출에 사용하기 위한 키트; 및

[17] 상기 [1] 기재의 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 세포 및/또는 조직에 도입하여, 그로 인해 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법에 관한 것이다

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

중성·알칼리성 세라미다아제의 컨센서스서열 등의 정보가 명확하지 않기 때문에, 본 발명자들은 상기 중성·알칼리성 세라미다아제를 단리하여 아미노산정보를 얻어, 그로 인해 비로소 상기 세라미다아제를 코딩하는 유전자를 단리할 수 있었다.

이로 인해, 본 발명의 마우스간장유래 중성·알칼리성 세라미다아제의 아미노산서열은 슈도모나스속 세포 [슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)] 유래의 이미 알려진 알칼리성 세라미다아제 [앞에 나온 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리, 제 273 권, 제 14368 ∼ 14373 페이지 (1998)] 의 아미노산서열과의 상동성이 낮다는 놀랄만한 지견도 얻을 수 있었다.

본 발명의 세라미다아제는 포유류유래의 중성·알칼리성 세라미다아제로 처음으로 밝혀진 것이다. 따라서, 본 발명은 공지인 슈도모나스속 세균유래의 이미 알려진 알칼리성 세라미다아제에 비해 생체내에서의 세라미드의 기능의 해명, 그 대사의 제어, 세라미드에 관련된 질병의 진단, 치료 등의 개발로 한층 유용하다.

이하, 본 발명을 설명한다.

(1) 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드

본 명세서에서 「세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드」(본 명세서에서는 간단하게 세라미다아제로 기재하는 경우가 있음) 란, 상기한 바와 같이 세라미드를 스핑고이드와 지방산으로 가수분해하는 활성을 갖는 효소를 말한다. 또, 「중성·알칼리성 세라미다아제」란, 산성 영역보다도 높은 pH 로 최적 pH 를 갖는 세라미다아제를 말한다.

그 일례로서 본 발명에서 단리정제된 마우스간장유래의 중성·알칼리성 세라미다아제의 효소화학적, 이화학적 성질을 기재한다.

1. 작용

본 발명의 세라미다아제는 세라미드를 가수분해하여 스핑고이드와 지방산을 생성한다.

또한, 해당 세라미다아제의 활성은 예컨대, 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 제 275 페이지, 제 3462 ∼ 3468 페이지 (2000) 에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다. 즉, 20 ㎕ 의 25 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5) 중에 550 pmol 의 C12-NBD-세라미드 [애날리티컬 바이오케미스트리 (Anal. Biochem), 제 263 권,제 183 ∼ 188 페이지 (1998)], 1.0 % (W/V) 콜산나트륨 및 적당량의 효소 (세라미다아제) 를 용해한 반응혼합액을 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트한다. 반응액을 비등 수욕중에서 5 분 인큐베이트함으로써 반응을 정지시킨다. 얻어진 반응액을 다시 감압 건고한다. 건고물을 클로로포름/메탄올 = 2/1 (V/V) 에 용해하고, 실리카겔 박층크로마토그래피 (전개용매: 클로로포름/메탄올/25 % 암모니아수 = 90/20/0.5 (V/V/V)) 로 전개한다. 그 후, CS-9300 크로마토스캐너 (시마즈제작소 제조) 를 사용하여 여기파장 475 nm, 형광파장 525 nm 에서 상기 반응에 의해 생성된 C12-NBD-지방산의 정량을 실시한다. 본 효소 (세라미다아제) 의 1 유닛 (U) 은 상기 조건하에서 1 분간 당 1 μ몰의 C12-NBD-지방산이 C12-NBD-세라미드로부터 가수분해되어 방출되는 데 필요한 효소량으로 정의한다.

2. 기질특이성

지방산부분을¹⁴C 방사성 동위체로 표식한 각종 스핑고지질 100 pmol 에 대해 본 발명의 세라미다아제 5 mU 를 1 % 콜산나트륨을 함유하는 25 mM 트리스염산, pH 7.5 완충액 20 ㎖ 중에서 37 ℃, 24 시간 작용시킨다. 반응액은 실리카겔 박층크로마토그래피에 의해 전개 후, 이미징 애널라이저 BAS1000 (후지필름사 제조) 에 의해¹⁴C-표식 스핑코지질과, 효소반응에 의해 생긴¹⁴C-표식 지방산을 검출정량하여, 얻어진 값에서 분해율을 산출한다. 본 발명의 세라미다아제의 기질특이성을 표 1 에 나타낸다.

본 발명의 세라미다아제는 표 1 에 나타내는 바와 같이, ① 다양한 N-아실스핑고신을 가수분해한다; ② 갈락토실세라미드, 술파티드, G㎖a, 스핑고미에린에는 작용하지 않는다; ③ 스핑게닌 (d18:1) 을 포함하는 세라미드에 대해 스핑가닌 (d18:0) 을 포함하는 세라미드 보다 잘 작용한다; ④ 피토스핑고신 (t18:0) 을 포함하는 세라미드에는 잘 작용되지 않는 등의 기질특이성을 나타낸다.

기질(구조)	분해율 (%)
N-라우로일스핑고신 (C12:0/d18:1)	63
N-팔미토일스핑고신 (C16:0/d18:1)	93
N-스테아로일스핑고신 (C18:0/d18:1)	83
N-팔미토일스핑가닌 (C16:0/d18:0)	59
N-스테아로일스핑가닌 (C18:0/d18:0)	40
N-팔미토일피토스핑고신 (C16:0/t18:0)	5
N-스테아로일피토스핑고신 (C18:0/t18:0)	2
NBD-N-도데카노일스핑고신 (NBD-C12:0/d18:1)	97
NBD-N-헥사노일스핑고신 (NBD-C6:0/d18:1)	2
갈락토실세라미드 (Galbl-1'Cer)	0
술파티드 (HS03-3Galbl-1'Cer)	0
GM1a (Galbl-3GalNAcbl-4(NeuAca2-3)Galbl-4Glcbl-1'Cer)	0
스핑고미에린 (Choline phosphate Cer)	0

3. 최적 pH

3,3-디메틸글루타민산, 50 mM 트리스 (히드록시메틸)아미노메탄, 50 mM 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올) 20 ㎖ 중, 100 pmol 의 C12-NBD-세라미드에 대해 본 발명의 세라미다아제 16 mU 를 37 ℃, 24 시간 작용시킨다. 반응액은 실리카겔 박층크로마토그래피에 의해 전개한다. 이어서, CS-9300 크로마토스캐너를 사용하여 검출파장 525 nm 에서 NBD-표식 세라미드와 효소반응으로 생긴 NBD-표식 지방산을 검출정량하여, 얻어진 값에서 분해율을 산출한다. 도 1 은 C12-NBD-표식 세라미드분해활성과 pH 의 관계를 나타내는 도면으로 세로축은 분해율 (%), 가로축은 반응 pH 를 나타낸다. 도 1 의 결과에 나타내는 바와 같이 본 세라미다아제의 최적 pH 는 7.0 ∼ 8.0 이다.

4. 온도안정성

본 발명의 세라미다아제는 0.1 % 폴리도칸올 (polidocanol) [상품명: 루브롤 (Lubrol) PX] 을 함유하는 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 완충액중, 37 ℃, 24 시간 처리한 경우에는 활성의 저하는 관찰되지 않지만, 60 ℃, 1 시간 처리에 의해 처리전 활성의 약 30 % 로 활성이 저하된다.

5. 분자량

본 발명의 세라미다아제의 분자량은 SDS-PAGE (환원조건하) 에 의해 약 94 kDa 이다. 또, 글리코펩티다아제 F 에 의해 소화된 본 효소는 SDS-PAGE (환원조건하) 에 의해 약 73 kDa 이다.

또한, 본 명세서에서 「세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드」의 일례로는 서열표의 서열번호: 14 에 표시된 아미노산서열을 갖는 마우스유래의 천연형 세라미다아제의 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 이 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 상기와 같은 방법에서의 활성측정에 의해 동일한 세라미다아제 활성이 관찰되는 것이라면, 서열표의 서열번호: 14 에 표시되는 아미노산서열중에 1 개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 변이가 도입된 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드도 「세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드」에 포함된다. 또, 상기 변이는 얻어진 폴리펩티드가 세라미다아제 활성을 나타낼 수 있는 변이라면 2 종 이상의 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한, 본 명세서에서 「변이가 도입된 아미노산서열」은 인위적으로 변이를 도입한 아미노산서열 및 천연유래의 변이를 갖는 아미노산서열 중 어느 하나를 포함한다.

이러한 변이를 갖는 세라미다아제는 구체적으로는 예컨대, 후술하는 세라미다아제 유전자의 염기서열 (서열번호: 15) 에서 변이를 갖는 변이유전자에 대해 하기 단계:

(a) 상기 유전자의 발현산물을 반응혼합액 [조성: 20 ㎕ 의 25 mM 트리스염산 완충액 (pH 6 ∼ 9, 바람직하게는 6.5 ∼ 8.5, 보다 바람직하게는 7 ∼ 8, 특히 바람직하게는 7.5) 중, 550 pmol 의 C12-NBD-세라미드, 및 1.0 % (W/V) 콜산나트륨] 중, 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 반응시키는 단계, 및

(b) 얻어진 반응물에 대해 C12-NBD-지방산의 생성을 검출하는 단계

에 의해 세라미다아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 선택함으로써 얻을 수 있다.

(2) 세라미다아제 유전자

본 발명에서 세라미다아제 유전자란, 상기의 「세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자, 또는 이 유전자의 염기서열을 함유하는 핵산이다. 그 일례로는 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자, 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 염기서열 또는 그 일부로 이루어지는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자를 들 수 있지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열의 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호: 15 에 기재된 염기서열의 일부로 이루어지는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자라도 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이라면 본 발명의 범위에 포함된다. 이들의 유전자는 마우스간장유래 중성·알칼리성 세라미다아제 유전자이지만, 본 발명의 세라미다아제 유전자의 기원은 상기 (1) 에 기재된 단계 (a) 및 (b) 와 동일하게 하여 유전자산물의 세라미다아제 활성이 검출될 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 기원으로는 예컨대, 마우스, 래트, 인체, 햄스터, 모르모트 등을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에서 「(아미노산서열의) 일부로 이루어지는 폴리펩티드」란, 상기 (1) 에 기재된 단계 (a) 및 (b) 에 의해 세라미다아제 활성을 검출할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 동일한 세라미다아제 활성을 나타낼 수 있는 변이를 갖는 세라미다아제를 코딩하는 유전자도 본 발명에 포함된다. 예컨대, 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 아미노산서열에서 1 개 이상의 아미노산잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환 등의 변이가 도입된 아미노산서열을 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자라도 이 유전자에 코딩되는 폴리펩티드가 세라미다아제 활성을 갖는 것이라면 본 발명의 유전자에 포함된다. 이와 같이 변이를 갖는 천연유래의 유전자뿐만 아니라 인위적으로 제작된 유전자라도 중성·알칼리성 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자이면 본 발명의 범위에 포함된다.

상기와 같은 인위적으로 변이가 도입된 유전자의 제조방법으로는 예컨대, 이하와 같은 방법이 사용된다.

랜덤한 변이를 도입하는 방법으로는 예컨대, 아황산수소나트륨을 사용한 화학적인 처리에 의해 시토신염기를 우라실염기로 치환하는 트랜지션 변이를 일으키는 방법 [프로시딩즈 오브 더 내쇼날 아카데미 오브 사이언시즈 오브 더 USA, 제 79 권, 제 1408 ∼ 1412 페이지 (1982)], 망간을 포함하는 반응액중에서 PCR 을 실시하여 DNA 합성시 뉴클레오티드의 삽입의 정확성을 낮게 하는 방법 [애널리티컬 바이오케미스트리 (Anal. Biochem.), 제 224 권, 제 347 ∼ 353 페이지 (1995)] 등을 사용할 수 있다.

부위특이적 변이를 도입하는 방법으로는 예컨대, 앰버변이를 이용하는 방법 [갭프드 듀플렉스 (gapped duplex) 법, 뉴클레익 애시드 리서치 (Nucleic Acids Research), 제 12 권, 제 9441 ∼ 9456 페이지 (1984)], dut (dUTPase) 와 ung (우라실-DNA 글리코시라아제) 유전자를 결손시킨 숙주를 이용하는 방법 [쿤켈 (Kunkel) 법, 프로시딩즈 오브 더 내쇼날 아카데미 오브 사이언시즈 오브 더 USA, 제 82 권, 제 488 ∼ 492 페이지 (1985)], 앰버변이를 이용한 PCR 에 의한 방법 (국제공개 제 98/02535 호 팜플렛) 등을 사용할 수 있다. 이들 방법으로 목적 유전자에 부위특이적인 변이를 도입하기 위한 각종 키트가 시판되고 있고, 이 키트를 이용함으로써 원하는 변이가 도입된 유전자를 용이하게 취득할 수 있다.

또, 상기 핵산의 상보가닥과 엄격한 조건하에 하이브리다이즈하는 핵산이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 염기서열을 갖는 유전자도 본 발명의 유전자에 포함된다. 세라미다아제 활성은 예컨대, 상기 (1) 에 기재된 단계 (a) 및 (b) 에 의해 검출할 수 있다.

여기서, 「엄격한 조건」이란 예컨대, 이하의 조건을 말한다. 즉, 0.5 % SDS, 5 ×덴할츠 [Denhardt's, 0.1 % 소혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 폴리비닐피롤리돈, 0.1 % 피콜 400] 및 100 ㎍/㎖ 연어정자 DNA 를 함유하는 6 ×SSC (1 ×SSC 는 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0) 중에서, 50 ℃ 에서 4 시간 내지 하룻밤동안 보온을 실시하는 조건을 말한다.

또, 하이브리디제이션조작의 상세는 예컨대, 1989 년, 콜드 스프링 하버 래버러토리 (Cold Spring Harbor Laboratory) 발행, T. 마니아티스 (T. Maniatis) 외 편집, 모레큘러 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제 2 판 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd ed.) 에 기재되어 있다.

또한, 축중 유전자 코딩을 통하여 상기 핵산과는 상이한 염기서열을 갖는 유전자도 본 발명의 세라미다아제 유전자에 포함된다.

또한, 본 발명의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 상기 (1) 에 기재된 단계 (a) 및 (b) 에 의해 세라미다아제 활성이 검출되는 것이라면 본 발명에 포함된다.

본 발명의 유전자에 의하면, 보다 다양한 사용목적에 적합한 재조합 DNA 가 제공된다. 여기서, 「재조합 DNA」란, 유전자공학적 수법에 의해 얻어진 본 발명의 유전자를 함유한 DNA 이다.

본 발명의 세라미다아제 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 공지인 벡터 등에 연결하여 세라미다아제 유전자가 발현가능한 상태로 삽입된 발현벡터를 제작할 수 있다. 이러한 발현벡터도 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 발현벡터란, 상기 유전자 또는 재조합 DNA 가 삽입되고, 또한 원하는 숙주세포로 발현하도록 구축된 벡터이다. 또, 후술하는 안티센스 DNA 를 삽입한 벡터도 본 발명의 발현벡터에 포함된다. 삽입되는 벡터로는, 플라스미드벡터, 파지벡터, 바이러스벡터 등을 들 수 있다. 플라스미드벡터로는 pUC18, pUC19, pBluescript, pET 등의 바람직하게 사용할 수 있고, 파지벡터로는 λgt10, λgt11 등의 람다 파지벡터 등의 시판품을 바람직하게 사용할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바이러스벡터로는, 레트로 바이러스벡터, 아데노 바이러스벡터, 백시니어 바이러스벡터, 아데노수반 바이러스벡터 등을 사용할 수 있는데 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 벡터는 사용하는 숙주세포에 따라 적당하게 선택된다. 이러한 벡터에는 유도가능한 프로모터, 선택용 마커유전자, 터미네이터 등의 인자를 적당하게 가지고 있어도 된다.

또, 사용목적에 따라서는 단리정제가 용이해지도록 His 태그, GST 융합단백질로서 발현할 수 있는 서열을 갖는 벡터를 사용해도 된다. 이 경우, 숙주세포내에서 기능하는 적절한 프로모터 (예컨대, lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 초기프로모터 등) 를 갖는 GST (글루타티온 S-트랜스퍼라아제) 융합단백질벡터 (예컨대, pGEX4T) 나 태그 (예컨대, Myc, HisA 등) 서열을 갖는 벡터 등을 사용할 수 있다.

(3) 세라미다아제 유전자를 함유한 형질전환체

본 발명의 세라미다아제 유전자가 삽입된 발현벡터로 숙주의 형질전환을 실시함으로써 본 발명의 형질전환체 즉, 본 발명의 세라미다아제 유전자를 발현하는 세포를 얻을 수 있다. 사용되는 숙주는 원하는 세라미다아제의 사용목적에 따라 적당하게 선택할 수 있고, 대장균을 비롯한 미생물, 효모 외, 동물세포, 식물세포, 동물개체, 식물개체 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 대장균으로는 Escherichia coli K-12 계통의 HB101 주, C600 주, JM109 주, DH5 α주, DH10B 주, XL-1BlueMRF' 주, TOP10F 주 등을 들 수 있다. 또, 효모세포로는, 사카로미세스 세르비제 등을 들 수 있다. 동물세포로는, L, 3T3, FM3A, CHO, COS Vero, Hela 등을 들 수 있다. 식물세포로는 타바코 BY2 등을 들 수 있다.

발현벡터를 숙주에 도입하는 방법으로는 예컨대, 모레큘러 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제 2 판, 제 249 ∼ 254 페이지에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 이어서, 목적 유전자를 발현하는 형질전환체를 선택하기 위해서는 발현벡터의 특성을 이용한다. 예컨대, 플라스미드벡터가 pB luescript 이며 대장균을 숙주세포로 할 경우, 암피실린을 함유하는 플레이트상에서 암피실린내성을 갖는 콜로니를, 또는 암피실린, 5-브로모-4-클로로-3-인돌린-β-D-갈락토시드 (X-Gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 함유하는 플레이트상에서 암피실린내성을 나타내고, 또한 백색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써 외래 유전자가 도입된 콜로니를 선별한다.

본 발명의 형질전환체의 배양을 통상적으로 사용되는 조건하에서 실시함으로써 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자를 발현시키는 숙주에 따라 코돈사용빈도가 상이하여 발현이 억제되는 경우가 있는데, 이 경우 본 발명의 유전자에 사용되는 코돈을 각각의 숙주에 맞는 코돈으로 바꾸어 사용해도 된다. 또, 상기 발현벡터는 플라스미드유래의 벡터에만 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 지장을 주지 않는 것이라면 파지, 코스미드 등 유래의 벡터를 사용해도 된다. 본 발명의 폴리펩티드를 용이하게 또한 대량으로 제조하는 관점에서 외래 유전자를 유도발현시키는 것이 가능한 벡터, 리포터유전자산물과의 융합단백질로 발현시키는 것이 가능한 벡터 등이 바람직하다.

세라미다아제의 발현의 확인은 세라미다아제 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다. 활성측정은 예컨대, 형질전환체의 세포추출액을 시료로 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리, 제 275 권, 제 3462 ∼ 3468 페이지 (2000) 에 기재된 방법 예컨대, 상기 (1) 에 기재된 단계 (a) 및 (b) 와 동일한 조작에 의해 실시할 수 있다. 또, 세포내의 세라미드량의 측정에 의해서도 세라미다아제의 발현의 확인을 실시할 수 있다. 상기 세라미드량의 측정은 예컨대, 애널리티컬 바이오케미스트리 (Analytical Biochemistry), 제 244 권, 제 291 ∼ 300 페이지 (1997) 에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 또, 세라미다아제에 대한 항체를 사용할 수도 있지만, 세라미다아제를 다른 폴리펩티드 (본 발명의 세라미다아제를 제외한 폴리펩티드) 와의 융합체로 발현시키는 경우에는 그 폴리펩티드 (본 발명의 세라미다아제를 제외하는 폴리펩티드) 부분에 대한 항체를 사용해도 된다. 항체를 사용할 경우에는 예컨대, 형질전환체의 세포추출액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동한 후, 폴리비닐리덴플루오라이드 (PVDF) 막상으로 전사하고, 이 막상에서 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

(4) 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법

본 발명은 본 발명의 유전자가 발현되고, 또한 이 유전자에 코딩된 폴리펩티드의 생산에 적합한 조건하에 상기 형질전환체를 배양하고 얻어진 배양물로부터 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취한다. 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조방법도 제공한다. 형질전환체의 배양방법에는 특별히 한정은 없고 사용된 숙주에 적합한 공지된 배양방법에서 적당한 것을 선택하면 된다.

본 발명의 제조방법에서 상기의 형질전환체가 미생물 또는 배양세포인 경우에는 배지조성, 배지의 pH, 배양온도, 배양시간 이외, 인듀서의 사용량, 사용시간 등에 대해 세라미다아제의 발현에 최적인 조건을 결정함으로써 효율적으로 세라미다아제를 생산시킬 수 있다.

형질전환체의 배양물에서 세라미다아제를 정제하기 위해서는 통상적인 방법이 사용된다. 형질전환체가 대장균과 같이 세포내에 세라미다아제가 축적되는 경우에는 배양종료 후, 원심분리에 의해 형질전환체 세포를 모아 얻어진 세포를 초음파처리 등에 의해 파쇄한 후, 원심분리 등에 의해 무세포추출액을 얻는다. 이것을 출발재료로 하여 염석법 이외, 이온교환, 겔여과, 소수(疎水), 어피니티 등의 각종 크로마토그래피 등의 일반적인 단백질 정제법에 의해 정제할 수 있다. 사용되는 숙주벡터계에 따라서는 발현산물이 세포밖으로 분비되는 경우가 있는데, 이와 같은 경우는 배양상청에서 동일하게 정제를 실시하면 된다.

본 발명의 제조방법에 의하면 이 세라미다아제가 세포내에 생산될 경우, 목적의 세라미다아제와 세포내의 여러 효소, 단백질 등과 같은 불순물이 공존하는데, 이들 불순물은 발현되는 세라미다아제량에 비해 미량에 지나지 않기 때문에, 그 정제는 매우 용이하다는 우수한 이점이 있다. 또, 벡터로 세포외 분비형의 벡터를 사용한 경우, 세라미다아제가 세포밖으로 분비되어 세라미다아제를 포함하는 분획에는 배지성분 등이 공존한다. 그러나, 이들은 통상적으로 세라미다아제의 정제에 방해가 되는 단백질 성분을 거의 포함하지 않기 때문에 예컨대, 마우스간장에서의 세라미다아제의 정제에 필요했던 번잡한 분리정제조작을 필요로 하지 않는다는 우수한 이점이 있다.

또, 진핵생물유래의 세라미다아제의 경우, 효소자체에 당쇄를 갖고 있을 가능성이 있고, 숙주세포로 당쇄 생합성능력을 갖지 않은 세포 예컨대, 대장균, 고초균, 방선균과 같은 원핵생물, 또는 효모, 진균, 동물세포, 곤충세포 및 식물세포의 당쇄 생합성능력을 상실한 변이세포를 사용함으로써, 당쇄를 갖지 않은 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 당쇄를 갖는 효소를 생산하는 것도 가능하며, 이 경우는 숙주세포로 당쇄 생합성능력을 갖는 세포 예컨대, 효모, 진균, 동물세포, 곤충세포 및 식물세포를 사용함으로써 당쇄를 지닌 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

또, 사용하는 숙주벡터계에 따라서는 발현산물이 불용성의 봉입체 (inclusion body) 로 형성되는 경우가 있다. 이 경우, 배양종료 후에 원심분리에 의해 세포를 모아 이것을 초음파처리 등에 의해 파쇄한 후, 원심분리 등을 실시함으로써 봉입체를 포함하는 불용성 분획을 모은다. 봉입체를 세정한 후, 통상 사용되는 단백질가용화제 예컨대, 요소나 구아니딘염산염 등으로 가용화하여, 필요에 따라 이것을 이온교환, 겔여과, 소수, 어피니티 등의 각종 크로마토그래피를 실시함으로써 정제한 후, 투석법 또는 희석법 등을 사용한 리폴딩조작을 실시함으로써 세라미다아제 활성을 지지한 폴리펩티드를 포함하는 제제를 얻을 수 있다. 필요에 따라 이 제제를 다시 각종 크로마토그래피에 의해 정제하면 고순도의 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

(5) 하이브리디제이션용 프로브 및 PCR 용 프라이머

본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 본 발명의 유전자, 또는 그 상보가닥에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 본 발명의 세라미다아제 유전자의 염기서열을 기초로 설계하고 예컨대, 통상적인 방법에 의해 화학적으로 합성함으로써 제작될 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드 프로브의 염기서열에는 특별히 한정은 없지만, 상기 세라미다아제 유전자, 또는 이 유전자에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산에 엄격한 조건하에 하이브리다이즈하는 것이면 된다. 상기 「엄격한 조건」이란, 특별히 한정되지 않지만 예컨대, 6 ×SSC, 0.5 % SDS, 5 ×덴할트, 100 mg/㎖ 청어정자 DNA 를 포함하는 용액중, [상기 프로브의 Tm-25 ℃] 의 온도에서 하룻밤동안 보온하는 조건 등을 말한다. 또, 상기 프라이머의 염기서열에도 특별히 한정은 없고, 통상적인 PCR 의 반응조건에서 상기 세라미다아제 유전자, 또는 이 유전자와 상보적인 염기서열을 갖는 유전자에 어닐링하고, DNA 폴리머라아제에 의한 신장반응을 개시할 수 있는 것이면 된다.

올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머의 Tm 은 예컨대, 하기 식:

Tm = 81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(%G+C)-(600/N)

(식중, N 은 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머의 사슬길이이며, % G+C 는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머중의 구아닌 및 시토신잔기의 함유량임)

에 의해 구해진다.

또, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머의 사슬길이가 18 염기보다 짧은 경우, Tm 은 예컨대, A+T (아데닌+티민) 잔기의 함유량과 2 ℃ 의 곱과, G+C 잔기의 함유량과 4 ℃ 의 곱의 합 [(A+T) ×2 + (G+C) ×4] 에 의해 추정할 수 있다.

상기의 올리고뉴클레오티드 프로브의 사슬길이로는 특별히 한정은 없지만, 비특이적인 하이브리디제이션을 방지하는 관점에서 15 염기 이상인 것이 바람직하고, 18 염기 이상인 것이 보다 바람직하다.

또, 본 발명의 프라이머에서도 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 동일한 염기서열을 갖는 핵산을 들 수 있다. 예컨대, 본 발명의 유전자의 염기서열을 기초로 설계하여 화학적으로 합성하는 것 등에 의해 제작할 수 있다. 프라이머의 사슬길이에는 특별히 한정은 없지만 예컨대, 15 ∼ 40 염기의 사슬길이인 것을 사용할 수 있고, 특히 17 ∼ 30 염기의 사슬길이인 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 프라이머는 PCR 법을 비롯한 다양한 유전자증폭법에 사용할 수 있고 이로 인해, 본 발명의 세라미다아제 유전자의 검출을 실시할 수 있다.

또, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서 천연유래의 세라미다아제를 코딩하는 핵산을 제한효소처리, 엑소형 뉴클레아제처리 등의 효소적처리, 초음파 등의 물리적처리 등에 의해 단편화하고, 얻어진 단편을 아가로오스겔 등으로 대표되는 각종 핵산분리법에 의해 분리정제함으로써 얻어진 핵산을 사용해도 된다. 상기와 같이 하여 얻어진 핵산은 세라미다아제에 특징적인 서열을 갖는 영역유래인 것이 바람직하다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 검출대상의 핵산을 보다 용이하게 검출을 실시하기 위해, 공지된 방법에 따라 적당한 표식을 실시하여 본 발명의 세라미다아제 유전자의 검출에 사용할 수 있다. 표식에는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 반사성 동위원소 이외, 형광물질, 비오틴이나 디곡시게닌(digoxigenin)과 같은 리간드 등으로 대표되는 각종 표식을 실시해도 된다.

본 발명의 하이브리디제이션용 프로브를 사용하여 마우스간장 이외의 장기 또는 마우스 이외의 생물체유래의 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 본 발명의 세라미다아제 유전자와 상동성이 높은 DNA 를 클로닝할 수 있다.

또, 본 발명의 프라이머를 사용하여 마우스간장 이외의 장기 또는 마우스 이외의 생물체유래의 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 PCR 법에 의해 본 발명의 세라미다아제 유전자와 상동성이 높은 DNA 단편을 검출하거나 또는 그 전체 길이의 유전자를 얻을 수도 있다.

(6) 유전자의 검출방법

본 발명의 유전자의 검출방법은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 사용하여 검출용 시료중의 유전자를 검출하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다.

본 발명의 검출방법에서는 상기 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 하이브리디제이션법 등에 의해 유전자의 검출을 실시해도 되고, 또 상기 프라이머를 사용하여 PCR 법 등의 DNA 증폭방법에 의해 유전자의 검출을 실시해도 된다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 하이브리디제이션의 경우, 검출용 시료로는 예컨대, 미생물의 콜로니나 배양세포, 조직절편과 같은 시료, 이들 시료중의 DNA 나 RNA 를 막상에 고정한 것, 이들 시료로부터 추출된 DNA 나 RNA 등을 들 수 있다.

하이브리디제이션은 모레큘러 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제 2 판 등에 기재된 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 해당 하이브리디제이션의 조건은 사용하는 프로브의 Tm 치, 표적 DNA 의 GC 함량 등에 의해 적당하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 모레큘러 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제 2 판에 기재된 조건 등을 적용할 수 있다.

프라이머를 사용하여 유전자의 검출을 실시할 경우, 검출용 시료로는 예컨대, 미생물배양액, 미생물콜로니, 미생물균체와 같은 미생물시료, 배양세포, 조직, 조직절편과 같은 생체유래시료 등을 들 수 있다. 이들 시료는 예컨대, 단리된 미생물이나 배양세포를 그 상태 그대로 사용해도 되고, 적절한 처치를 실시한 상태로 사용해도 된다. 또, 조직과 같은 고체시료는 침출액이나 현탁액을 조제하여사용할 수 있다. 또, 이들 시료의 상청 또는 이들 시료에 대해 계면활성제처리와 같은 세포용해처리가 실시된 시료나 그 상청도 사용할 수 있다. 또한, 검출대상인 핵산을 손상시키지 않는 범위에서 시료중의 다른 성분을 제거하는 조작이 실시되어도 된다.

상기 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 검출을 실시할 경우, PCR 조건은 사용하는 프라이머의 Tm 치, 증폭하여 검출하는 대상의 영역 길이 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. PCR 법에서는 증폭산물의 유무를 확인함으로써 목적 유전자를 검출할 수 있다. 증폭 유무의 확인법에는 특별히 한정은 없지만 예컨대, 핵산증폭반응액을 아가로오스겔 전기영동에 이용한 후, 겔을 적당한 핵산염색시약 예컨대, 에티듐브로마이드, 사이버 그린Ⅰ (SYBER Green Ⅰ) 등으로 염색하고 자외선을 조사하여 생기는 밴드의 유무를 검출함으로써 확인할 수 있다. 밴드의 검출은 육안으로 관찰해도 되지만 예컨대, 형광 이미지 애널라이저 등을 사용하여 검출할 수도 있다.

본 발명의 유전자의 검출방법에서는 검출감도를 상승시키기 위해 상기 프로브 및 프라이머를 병용해도 된다. 예컨대, 상기 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 시료중에 미량으로 존재하는 세라미다아제 유전자를 증폭하고 이어서, 프로브를 사용하여 이 유전자와 하이브리다이즈시킴으로써 고감도로 또한 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 검출방법에 의해 세라미다아제 유전자의 검출을 실시하고, 또한 이 유전자의 양을 결정하는 경우에는 하이브리다이즈한 프로브에 유래하는 시그널의 강도, 프라이머를 사용하여 증폭된 산물에 유래하는 밴드의 형광강도 등을 정량함으로써 실시할 수 있다. mRNA 를 측정대상으로 그 정량을 실시함으로써 목적 유전자의 발현량을 조사할 수 있다.

또, 본 발명의 검출방법에는 본 발명의 유전자의 검출에 사용하기 위한 키트를 사용함으로써 보다 간편하게 검출을 실시할 수 있다. 이러한 키트도 본 발명에 포함된다. 상기 키트는 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 상기의 프라이머를 함유하여 이루어지는 것을 하나의 특징으로 한다. 상기 키트는 검출조작에 사용되는 다양한 컴포넌트를 포함해도 되고 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 키트의 경우에는 핵산을 고정하기 위한 막이나 하이브리디제이션 완충액 등으로 대표되는 하이브리디제이션용 각종 시약, 또는 프라이머를 포함하는 키트의 경우에는 내열성 DNA 폴리머라아제, dNTP 혼합액, PCR 용 완충액 등으로 대표되는 PCR 용 시약을 포함하고 있어도 된다. 또한, 프로브나 증폭된 DNA 를 검출하기 위한 시약이나 미생물증식용 배지, 세포배양용 배지, 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 시약 등을 함유해도 된다.

(7) 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 항체 또는 그 단편

본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 항체 또는 그 단편은 이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것이면 특별히 한정은 없고, 폴리크로날항체, 모노크로날항체 중 어느 것이어도 되다. 또한, 공지기술에 의해 수식된 항체나 항체의 유도체 예컨대, 인체화항체, Fab 플라그멘트, 단쇄항체 등을 사용할 수도 있다. 본 발명의 항체는 예컨대, 1992 년, 죤 와일리 & 선즈사 (John Wiely & Sons, Inc) 발행, 죤 E 콜리간 (John E. Coligan) 편집, 커런트 프로트콜즈 인 이뮤놀로지 (Current Protocols in Immunology) 에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 사용하여 토끼나 래트, 마우스 등을 면역함으로써 용이하게 제작될 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 항체를 정제 후, 펩티다아제 등에 의해 처리함으로써 항체의 단편을 얻을 수 있다. 또, 유전자공학적으로 항체를 제작할 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소면역 측정법, 형광면역 측정법, 발광면역 측정법 등에 의한 검출을 용이하게 하기 위해 각종 수식을 해도 된다.

상기 항체 또는 그 단편에는 폴리펩티드의 어느 부분단편에 특이적으로 결합할 수 있는 것도 포함된다.

얻어진 항체 또는 그 단편의 용도로는 세라미다아제 생산균의 검출, 세라미다아제 발현세포주의 검출, 배양세포나 조직중의 세라미다아제 단백질의 검출, 어피니티크로마토그래피, 각종 라이브러리 (게놈 DNA 또는 cDNA) 의 발현산물의 스크리닝, 의약, 진단약, 연구용 시약 등으로의 응용을 생각할 수 있다.

(8) 폴리펩티드의 검출방법

본 발명의 폴리펩티드의 검출방법은 상기 항체 또는 그 단편을 사용하여 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 검출용 시료로 예컨대, 미생물이나 동물세포의 배양물, 조직절편, 미생물이나 동물세포의 세포파쇄물, 피부 등의 조직의 추출액 또는 세정액,미생물이나 동물세포, 조직유래의 단백질이 고정된 막 등의 단백질시료를 사용할 수 있다.

항체 또는 그 단편의 상기 폴리펩티드로의 특이적인 결합의 검출은 공지된 방법을 이용할 수 있는데 예컨대, 효소면역 측정법, 형광면역 측정법, 발광면역 측정법 등을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 검출방법에는 본 발명의 폴리펩티드의 검출에 사용하기 위한 키트를 사용함으로써 보다 간편하게 검출을 실시할 수 있다. 이러한 키트도 본 발명에 포함된다. 상기 키트는 상기 항체 또는 그 단편을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 또, 이 키트는 반응용 완충액, 표식 이차항체, 발색시료 등을 함유해도 된다.

(9) 안티센스 DNA 및 안티센스 RNA

본 발명에서 「안티센스 DNA」및 「안티센스 RNA」란, 본 발명의 세라미다아제 유전자 또는 그 일부와 상보적인 염기서열을 갖고, 내인성(內因性)의 세라미다아제 유전자 (게놈 DNA 및 mRNA) 와 2 개 사슬을 형성함으로써 이 유전자로부터의 유전자정보의 발현 (전사, 번역) 을 억제 또는 제어하는 것을 말한다. 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 의 길이는 염기서열의 특이성이나 세포내로 도입하는 방법에 따라 변경하는 것이 가능하다. 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 는 합성기를 사용하여 인공적으로 합성하거나, 본 발명의 유전자를 주형으로 한 효소반응에 따라 보통과 반대 방향 (안티센스의 방향) 으로 유전자를 발현시키는 것 등으로 제작하는 것이 가능하다. 생체내에서 안티센스 RNA 의 발현이 요망되는 경우에는 본 발명의 유전자를 보통과는 반대 방향으로 접속한 발현벡터를 구축하여 이것을 생체내로 도입하면 된다.

예컨대, tat 유전자 [뉴클레익 애시드즈 리서치 (Nucleic Acids Research), 제 19 권, 제 3359 ∼ 3368 페이지 (1991)], 또는 rev 유전자 [프로시딩즈 오브 더 내쇼날 아카데미 오브 사이언시즈 오브 더 USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA), 제 86 권, 제 4244 ∼ 4248 페이지 (1989)] 를 이용한 HIV 의 증식억제 등, 안티센스기술은 많이 알려져 있고, 따라서 이들의 방법에 의해 본 발명의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 를 이용하여 내인성의 세라미다아제 유전자의 발현을 억제 또는 제어하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 는 in situ 하이브리디제이션 등의 연구시약으로 이용가능하다.

(10) 세라미다아제 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 사용한 세포내 또는 조직내에서의 세라미드량의 조절

본 발명의 유전자에 의해 보다 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법을 제공할 수 있다. 이러한 조절방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법은 본 발명의 세라미다아제 유전자를 세포 및/또는 조직으로 도입하고, 그로 인해 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량을 조절하는 데 하나의 특징이 있다.

즉, 본 발명의 조절방법에서는 본 발명의 세라미다아제 유전자를 세포 또는 조직중으로 도입하고, 이 유전자에 의해 발현된 세라미다아제에 의해 세포 또는 조직중의 세라미드가 분해되고, 또한 본 발명의 세라미다아제 유전자를 이 유전자의 안티센스 핵산 예컨대, 안티센스 RNA 가 생성되는 형태로 세포, 조직으로 도입함으로써, 해당 세포, 조직중에서의 세라미다아제 활성을 저감하여 세라미드의 분해를 억제할 수 있다. 또, 세라미드량을 억제하는 경우에는 본 발명의 세라미다아제 유전자의 안티센스 핵산, 즉 본 발명의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 를 그 자체의 형태로 세포 또는 조직으로 도입해도 된다.

상기 세라미다아제 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 세포 또는 조직으로 도입하는 방법으로는 공지된 방법을 사용할 수 있고, 일렉트로포레이션법, 퍼티클건법 등의 물리적 유전자도입방법이나, 바이러스벡터를 사용한 유전자도입방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 바이러스벡터에 특별히 한정한 없지만 예컨대, 레트로 바이러스벡터, 아데노 바이러스벡터, 백시니어 바이러스벡터, 아데노수반 바이러스벡터 등을 사용하여 도입할 수 있다.

본 발명의 조절방법에 의하면 본 발명의 세라미다아제 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 세포 및/또는 조직으로 도입하여 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량을 조절함으로써 세라미드량의 이상에 기인하는 질환의 치료를 실시할 수 있고, 또 세라미드 대사이상의 질병모델동물을 제작할 수 있다는 우수한 효과를 나타낸다. 「세라미드량의 이상에 기인하는 질환」으로는 특별히 한정되지 않지만 예컨대, 파이버병 등을 들 수 있다.

이하에, 마우스간장유래 세라미다아제 유전자를 취득하는 방법에 대해 설명한다.

1) 우선 마우스간장의 호모지네이트에서 막분획을 조제하고, 이것을 자당-EDTA 액에 현탁하여 동결융해한 후, 원심분리를 실시하여 상청 (조효소(粗酵素) 추출액) 을 얻는다. 이 조효소 추출액으로부터 공지된 단백질 정제방법 예컨대, 각종 크로마토그래피를 조합하여 단일한 상태로 정제된 세라미다아제 제제를 얻을 수 있다. 상기 정제에 사용할 수 있는 크로마토그래피로는 음이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 큐레이팅 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 등을 사용할 수 있다.

2) 다음, 세라미다아제 유전자를 클로닝하기 위한 프로브를 제작하기 위한 정보로 세라미다아제의 부분 아미노산서열을 조사한다. 상기 정제세라미다아제 제제를 그대로 에드먼분해법 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리, 제 256 권, 제 7990 ∼ 7997 페이지 (1981)] 에 의한 아미노산서열분석에 이용함으로써 세라미다아제의 N 말단 아미노산서열을 알 수 있다. 또, 정제효소 제제를 기질특이성이 높은 프로테아제 예컨대, 리지엘엔드폴리펩티드나 N-토실-L-페닐알라닐클로로메틸케톤 (TPCK)-트립신 등으로 소화하여 얻어지는 펩티드혼합물로부터 적당한 펩티드단편을 정제하고, 이 단편에 대해 아미노산서열분석을 실시함으로써 세라미다아제내부의 부분 아미노산서열을 얻을 수 있다.

3) 이렇게 하여 분명해진 아미노산서열의 정보를 기초로 하이브리디제이션용 프로브 또는 PCR 용 프라이머로 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 설계하여 본 발명의 세라미다아제 유전자를 클로닝한다. 그러기 위해서는, 일반적으로 사용되는 PCR 또는 하이브리디제이션법을 이용한다. PCR 법은 1989 년, 스톡톤 프레스 (Stockton Press) 사 발행, 엘리히 H.A. (Erlich, H.A.) 편집, PCR 테크놀로지 (PCR Technology) 에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다. 하이브리디제이션법은 예컨대, 모레큘러 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제 2 판에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다.

4) 상기 하이브리디제이션 또는 PCR 에 의해 얻어진 DNA 단편은 그 염기서열을 해독함으로써 여기에 코딩될 수 있는 아미노산서열을 알 수 있다. 이 서열을 상기 2) 에서 얻어진 세라미다아제의 부분 아미노산서열과 비교하여 상기 DNA 단편이 세라미다아제 유전자의 단편인지의 여부를 확인할 수 있다.

5) 3) 의 하이브리디제이션 또는 PCR 에 의해 얻어진 DNA 단편이 세라미다아제 유전자의 일부인 경우, 3) 의 조작을 반복하거나 또는 3) 에서 얻어진 DNA 단편의 염기서열을 기초로 새로운 프로브, 프라이머를 제작하고, 이것을 사용하여 하이브리디제이션 또는 PCR 을 실시함으로써 세라미다아제 전체 길이를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻을 수 있다.

6) 이렇게 하여 얻어진 세라미다아제 전체 길이를 코딩하는 유전자를 적당한 벡터에 접속하여 발현벡터를 구축하고, 이 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제작한다. 이 형질전환체를 배양하여 배양물중의 세라미다아제 활성을 조사함으로써 얻어진 유전자가 세라미다아제를 코딩하는 것임을 확인할 수 있다.

그러나, 본 발명의 세라미다아제 유전자의 클로닝에서, 본 발명에서 얻어진 부분 아미노산서열 정보에서는 하이브리디제이션법에 의한 라이브러리의 스크리닝에 적합한 프로브 DNA 를 설계할 수는 없었다. 또, 부분 아미노산서열 및 라이브러리제작에 사용한 벡터의 염기서열 각각으로부터 다양한 PCR 프라이머를 설계하여, 각종 조합으로 PCR을 얻었지만 특이적인 증폭은 관찰되지 않고, 유일하게 부분 아미노산서열 C-53 (서열표의 서열번호: 3 에 C-53 의 아미노산서열을 나타냄) 을 기초로 설계한 2 종의 프라이머끼리의 조합에만 증폭이 관찰되었다. 단, 증폭된 DNA 단편 P-1 (서열표의 서열번호: 6 에 P-1 의 염기서열을 나타냄) 은 68 bp 로 짧은 것으로 그대로 하이브리디제이션법에 의한 라이브러리의 스크리닝용 프로브로 사용할 수는 없었다. 그래서, P-1 의 서열에서 다시 PCR 프라이머를 설계함과 동시에, 이것을 라이브러리제작에 사용된 벡터의 염기서열에서 설계된 프라이머와 조합하여 PCR 을 실시함으로써, 하이브리디제이션법에 의한 라이브러리의 스크리닝용 프로브에 적합하다고 생각되는 335 bp 의 유전자단편을 얻는 데 비로소 성공하였다.

또한, 상기 335 bp 의 DNA 단편을 프로브로 하여 마우스간장유래의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 세라미다아제 전체 길이를 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있다. 또, 마우스간장유래의 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 세라미다아제의 게놈 DNA 를 얻을 수도 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 마우스간장이 생산하는 세라미다아제 유전자의 전염기서열은 서열표의 서열번호: 12 에 기재되어 있고, 여기에 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산서열은 서열표의 서열번호: 13 에 기재되어 있다. 또한, 이 아미노산서열과 해당 효소의 N 말단 아미노산서열로부터 생체내에서 해당 효소는 N 말단부분의 펩티드가 제거된 성숙형 효소에 프로세싱됨이 판명되었다. 이 성숙형세라미다아제의 아미노산서열 및 이 서열을 코딩하는 염기서열을 각각 서열표의 서열번호: 14 및 15 에 나타낸다. 상기 아미노산서열, 염기서열은 각각 공지된 포유류유래 세라미다아제의 아미노산서열, 염기서열 각각의 사이에는 상동성은 없다. 즉, 본 발명에 의해 제공되는 세라미다아제 유전자는 공지된 세라미다아제 유전자와는 관계가 없는 전혀 새로운 서열로 이루어지는 것이다.

이와 같이, 본 발명에 의해 마우스간장유래의 세라미다아제의 일차구조 및 유전자구조가 제공된다. 또한, 세라미다아제 활성을 갖는 저렴하고 고순도인 폴리펩티드의 유전자공학적인 제조방법이 가능해진다.

또, 본 발명의 세라미다아제 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머는 본 발명의 세라미다아제 유전자의 검색, 검출이나 증폭 등에 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 세라미다아제의 검출, 동정이나 정제 등에서 유용하다.

또, 본 발명의 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법에 의하면, 본 발명의 세라미다아제 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 세포 및/또는 조직에 도입하여 세포 및/또는 조직내의 세라미드량을 조절할 수 있기 때문에, 이러한 조절방법은 세라미드량의 이상에 기인하는 질환, 특별히 한정되지 않지만 예컨대, 파이버병 등과 같은 질환의 치료에 유용하다.

이하에 실시예를 들어 보다 상세하게 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 실시예의 범위에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 세라미다아제의 정제

105 마리의 Sea/ddY 의 마우스 (세이와실험동물연구소 제조) 에서 적출한 간장 181 g 을 1 mM EDTA 를 포함하는 0.25 M 자당액 (자당-EDTA 액) 300 ㎖ 중에서 호모지나이즈하였다. 이 호모지네이트를 600 ×g 으로 10 분간 원심분리한 후, 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 다시 2700 ×g 으로 30 분간 원심분리하여 침전을 회수하였다.

침전분획을 480 ㎖ 의 자당-EDTA 액에 현탁하여 현탁액을 얻었다. 얻어진 연탁액을 -80 ℃ 에서 동결한 후, 흐르는 물에서 용해하였다. 이 동결, 융해처리를 2 회 반복하였다. 이어서, 처리현탁액을 105000 ×g 으로 90 분간 원심분리하여 상청 및 침전 각각을 회수하였다. 침전은 상기와 동일한 동결, 융해 ∼ 원심분리의 처리에 이용하였다. 상청을 회수하여 앞의 상청과 합하여 520 ㎖ 의 조효소 추출액을 얻었다.

조추출액 260 ㎖ 을 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 100 ㎖ 의 DEAE-세파로스 FF (아마샴 팔마시아사 제조) 칼럼에 적용하여 비흡착물질을 세정 제거하였다. 이어서, 1 M NaCl 를 포함하는 동일 완충액에 의한 용출을 실시하여 세라미다아제 활성 분획 160 ㎖ 을 회수하였다. 이 분획은 계속하여 1 M NaCl 을 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 평형화한 100 ㎖ 의 페닐-세파로스 FF (아마샴 팔마시아사 제조) 칼럼에 적용한 후, 2 M 에서 0 M 으로의 NaCl 의 농도구배로 용출하고, 다시 0 % 에서 1 % 로의 폴리도칸올 (Polidocanol) (상품명: 루브롤 PX, 메칼라이테스크사 제조) 의 농도구배로 용출하였다. 이 크로마토그래피에 의해 310 ㎖ 의 세라미다아제 활성 분획을 회수하였다.

얻어진 활성분획을 0.5 M NaCl 및 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 평형화한 25 ㎖ 의 큐레이팅-세파로스 FF (아마샴 팔마시아사 제조, Cu²⁺결합형) 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 동일 완충액 및 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 세정한 후, 2 M NH₄Cl, 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 효소의 용출을 실시하였다. 용출된 활성분획을 한외 여과에 의해 농축하여 농축물을 얻었다. 이어서, 농축물중의 완충액을 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 치환하여 효소액을 얻었다. 얻어진 효소액 30 ㎖ 는 다시 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 평형화한 포로스 HQ 칼럼 (Φ4.6 ×100 mm, 퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조) 에 적용하였다. 이어서, 0 M 에서 0.5 M 으로의 NaCl 의 농도구배로 용출하여 활성분획을 얻었다. 이 활성분획을 0.2 M NaCl, 0.1 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 1 mM 인산완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 하이드록시 아파타이트 칼럼 (Φ7.5 ×100 mm, 팬탁스사 제조) 에 적용하였다. 세라미다아제는 본 칼럼에 흡착되지 않고 통과분획으로 회수되었다. 이어서, 이 분획을 0.2 M NaCl, 0.3 % 의 루브롤 PX 를 포함하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 평형화한 슈퍼로스 200 HR 칼럼 (Φ10 ×300 mm, 아마샴 팔마시아사 제조) 을 사용한 겔여과 크로마토그래피에 이용하여 정제세라미다아제를 얻었다. 이상의 정제조작 결과, 58 mg 의 정제세라미다아제 제제를 얻었다.

또한, 얻어진 정제세라미다아제 제제의 다양한 성질에 대해 본 명세서에 기재한 바와 같이 검토한 결과, 하기한 바와 같다.

작용: 세라미드를 가수분해하여 스핑고이드와 지방산을 생성하였다.

기질특이성: 상기 표 1 에 나타내는 바와 같은 기질특이성을 가졌다.

최적 pH: 도 1 의 결과에 나타내는 바와 같이, 본 세라미다아제의 최적 pH 는 7.0 ∼ 8.0 이였다.

온도안정성: 0.1 % 폴리도칸올 (Polidocanol) [상품명: 루브롤 (Lubrol) PX] 을 함유하는 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 완충액중, 37 ℃, 24 시간 처리한 경우에는 활성의 저하는 관찰되지 않지만, 60 ℃, 1 시간의 처리에 의해 처리전 활성의 약 30 % 로 활성이 저하하였다.

분자량: SDS-PAGE (환원조건하) 에 의해 약 94 kDa 였다. 또, 글리코펩티다아제 F 에 의해 소화된 본 효소는 SDS-PAGE (환원조건하) 에 의해 약 73 kDa 였다.

실시예 2 세라미다아제의 부분 아미노산서열분석

50 pmol 의 세라미다아제를 함유하는 시료액 11 ㎖ 에 0.3 % 의 루브롤 PX 를 함유하는 20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 을 첨가하였다. 얻어진 시료액을 MonoQ PCl 6/5 칼럼 (100 ㎕, 아마샴 팔마시아사 제조) 에 적용하였다. 계속하여 0.4 M NaCl 를 포함하는 동일 완충액으로 칼럼에 흡착된 세라미다아제 분획을 용출하였다. 이 조작에 의해 세라미다아제를 포함하는 분획은 50 ㎕ 로 농축되었다. 얻어진 농축액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 이용하여,영동 후의 겔을 겔코딩 블루 스테인 리젠트 (GelCode Blue Stain reagent, 피어스사 제조) 로 염색하였다. 이어서, 세라미다아제의 밴드를 잘라냈다. 잘라내어진 겔단편의 1/4 를 0.1 % SDS 를 포함하는 300 ㎕ 의 0.1 M 트리스-염산 완충액 (pH 9.0) 으로 37 ℃, 16 시간 추출하였다. 얻어진 추출액을 시료로 G1005A 프로테인 시퀀싱 시스템 (휴렛 팩커드사 제조) 을 사용하여 세라미다아제의 N 말단 아미노산서열분석을 실시하여 아미노산서열 N-term 을 결정하였다. 서열표의 서열번호: 1 에 N-term 의 아미노산서열을 나타낸다.

또, 잘라내어진 겔단편의 나머지 3/4 을 1 ㎖ 의 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 9.2)/50 % 아세트니트릴중에서 30 ℃, 45 분 세정하였다. 질소가스 및 원심농축기를 사용하여 겔을 완전히 건조시킨 후, 0.5 ㎍ 의 프로테아제 Lys-C (와코쥰야쿠사 제조) 를 포함하는 10 ㎕ 의 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 9.2) 을 첨가하고, 다시 겔이 완전히 팽윤할 때까지 0.1 M 트리스-염산 완충액 (pH 9.2) 을 첨가하여 37 ℃ 에서 16 시간 보온하고, 세라미다아제의 프로테아제소화를 실시하였다. 반응종료 후, 150 ㎕ 의 0.1 % 트리풀루오로아세트산/60 % 아세트니트릴을 사용하여 실온에서 1 시간 추출하는 조작을 2 회 실시하여 추출액을 회수하였다. 이 추출액을 역상 크로마토그래피에 이용하여 펩티드단편의 정제를 실시하였다. 얻어진 펩티드단편을 G1005A 프로테인 시퀀싱 시스템을 사용한 에드먼분석법에 의해 분석하여 부분 아미노산서열 C-46, C-53 을 결정하였다. 서열표의 서열번호: 2, 3 에 각각 C-40, C-53 의 아미노산서열을 나타낸다.

실시예 3 세라미다아제 유전자를 포함하는 DNA 단편의 PCR 법에 의한 증폭

실시예 2 에서 결정한 세라미다아제의 부분 아미노산서열 C-53 을 기초로 센스 믹스프라이머 53-S1, 안티센스 믹스프라이머 53-A3 을 디자인하여 DNA 합성기로 합성하였다. 서열표의 서열번호: 4,5 에 각각 프라이머 53-S1, 53-A3 의 염기서열을 나타낸다. 이들 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 은 마우스간장 cDNA 플라스미드라이브러리 (타카라슈조사 제조) 를 주형으로 실시하였다. PCR 은 94 ℃, 9 분 후, 94 ℃, 0.5 분 ∼ 51 ℃, 0.5 분 ∼ 72 ℃, 1 분을 1 사이클로 하는 40 사이클을 실시하고, 다시 72 ℃, 7 분 보온함으로써 실시하였다. 이 PCR 에 의해 약 70 bp 의 특이적인 증폭 DNA 단편이 아가로오스 전기영동으로 검출되었다.

이 증폭 DNA 를 겔로부터 회수하고, 이것을 pGEM-T easy 벡터 (프로메가사 제조) 에 삽입하여 재조합 플라스미스를 구축하였다. 이 플라스미드의 삽입 DNA 단편의 염기서열해석을 실시한 결과, 이 단편의 부분염기서열 P-1 이 결정되었다. 서열표의 서열번호: 6 에 P-1 의 염기서열을 나타낸다. 이 서열은 실시예 2 에서 결정된 세라미다아제의 부분 아미노산서열 C-53 에 대응하는 서열로 목적으로 하는 세라미다아제 유전자의 일부를 취득할 수 있음이 확인되었다.

이 P-1 의 염기서열을 기초로 안티센스 프라이머 MA1 및 MA2 를 디자인하여 합성하였다. 서열표의 서열번호: 7, 8 에 각각 프라이머 MA1, MA2 의 염기서열을 나타낸다. 또, 마우스간장 cDNA 플라스미드라이브러리의 구축에 사용된 벡터 pAP3neo 의 염기서열을 기초로 센스 프라이머 T7in 및 T7out 를 디자인하여 합성하였다. 서열표의 서열번호: 9, 10 에 각각 프라이머 T7in 및 T7out 의 염기서열을 나타낸다. 이들 프라이머를 사용하여 마우스간장 cDNA 라이브러리를 주형으로 한 네스티드 PCR 을 실시하였다. 1st PCR 로서 우선 센스 프라이머 T7out 및 안티센스 프라이머 MA2 를 사용하여 94 ℃, 9 분 후, 94 ℃, 0.5 분 ∼ 51 ℃, 0.5 분 ∼ 72 ℃, 2 분을 1 사이클로 하는 40 사이클의 반응을 실시하고 다시 72 ℃, 7 분간 보온하였다. 또한, 2nd PCR 은 1st PCR 의 반응액을 주형으로 하고, 센스 프라이머 T7in 및 안티센스 프라이머 MA1 을 사용하는 것 이외는 1st PCR 과 동일한 조건으로 실시하였다. 이 결과, 335 bp 의 증폭 DNA 단편이 얻어졌다. 이것을 이하에 나타내는 콜로니 하이브리디제이션의 프로브로 하였다.

실시예 4 세라미다아제 유전자의 클로닝

마우스간장 cDNA 플라스미드 라이브러리가 도입된 형질전환체를 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지 플레이트상의 나이론 필터 (상품명: 하이본드-N⁺, 아마샴 팔마시아사 제조) 에 파종하고, 9.5 ×13.5 cm 의 플레이트 1 장 당 약 3 만개의 콜로니를 형성시켜 마스터 필터를 제작하였다. 이 필터의 레플리카를 제작하여 얻어진 레플리카 필터를 10 % SDS 용액에 담근 여과지상에서 5 분간; 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl 용액에 담근 여과지상에서 5 분간 (변성) ; 3 M NaCl 을 포함하는 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 에 담근 여과지상에서 5 분간 (중화) ; 2 ×SSC 용액에 담근 여과지위에서 5 분간, 각각 처리하였다. 이어서, 2 ×SSC 용액으로 필터를 세정하였다. 이 필터를 풍건(風乾)한 후, 자외선조사에 의해 DNA 를 필터에 고정하여 콜로니 하이브리디제이션용 필터로 하였다.

하이브리디제이션의 프로브로는 실시예 3 에서 얻은 증폭 DNA 단편 0.1 ㎍ 상당을 DNA 레이벌링 키트, 레디 투 고 (Ready To Go, 팔마시아사 제조) 를 사용하여 동일 키트의 프로트콜에 따라³²P 로 표식한 것을 사용하였다. 상기 필터를 하이브리백에 넣어 하이브리디제이션용액 (조성: 7 %, PEG6000, 10 %, SDS 용액) 중, 60 ℃ 에서 1 시간 프리하이브리디제이션을 실시한 후, 상기 표식 프로브를 0.006 pmol/㎖ 이 되도록 첨가하여 60 ℃ 에서 하룻밤동안 하이브리디제이션을 실시하였다. 이어서, 60 ℃ 로 가온해 둔 세정액 (2 ×SSC, 0.1 %, SDS) 중, 60 ℃ 에서 15 분간씩 3 회, 필터를 세정하였다. 필터로부터 여분인 수분을 제거한 후, 후지필름사 제조의 이미징 플레이트에 20 분간 감광한 후, BAS1000 이미징 애널라이저 (후지필름사 제조) 로 시그널을 검출하였다. 이어서, 본 조작에 의해 얻어진 양성시그널에 대응하는 마스터 필트상의 콜로니를 채취하였다 (1 차 스크리닝).

채집한 콜로니를 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 포함하는 LB 배지에 현탁한 후 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 포함하는 9.5 ×13.5 cm LB 한정배지 플레이트상의 나이론필터에 파종하여 1 장 당 200 ∼ 1000 개의 콜로니를 형성시켜 마스터 필터를 제작하였다. 이 필터에 대해 1 차 스크리닝과 동일한 방법에 의해 양성클론의 스크리닝을 실시하고, 다시 동일한 조작으로 3 차 스크리닝을 실시하였다. 3 차 스크리닝의 결과, 세라미다아제 유전자를 포함하는 것으로 생각되는 양성클론을 단리할 수 있었다.

이 양성클론으로부터 플라스미드를 조제하고 이것을 플라스미드 pLCDase 라 고 명명하였다. 이 플라스미드를 다양한 제한효소 또는 복수의 제한효소의 조합으로 소화한 후, 생성된 각 DNA 단편을 서브클로닝하여 그 염기서열을 해석하였다. 이로 인해, 플라스미드 pLCDase 에 삽입된 DNA 단편의 전염기서열을 결정하였다. 이 서열을 서열표의 서열번호: 11 에 나타낸다. 또, 이 서열중에 발견된 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 염기서열, 및 여기에 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산서열을 각각 서열표의 서열번호: 12 및 13 에 나타낸다. 또한, 상기 DNA 단편의 제한효소지도와, 이 DNA 단편에 함유되는 오픈 리딩 프레임의 위치를 도 1 에 나타낸다.

상기 ORF 의 염기서열을 분석한 결과, 여기에는 실시예 2 에서 밝혀진 세라미다아제의 부분 아미노산서열을 코딩하는 염기서열이 포함되어 있고, 이 ORF 가 세라미다아제를 코딩하는 것임이 확인되었다. 또, 이 ORF 에 코딩되는 세라미다아제의 아미노산서열과, 서열표의 서열번호: 1 에 나타내어지는 세라미다아제의 아미노산서열을 비교하면 마우스간장으로부터 정제된 세라미다아제는 상기의 ORF 에 코딩되는 폴리펩티드 중 N 말단부분의 펩티드가 결여됨이 나타났다. 즉, 세라미다아제는 번역후에 그 N 말단부분을 제거하는 프로세싱을 받아 성숙형 효소로 변환됨이 나타났다. 서열표의 서열번호: 14 에 성숙형 세라미다아제의 아미노산서열을, 또 서열표의 서열번호: 15 에 성숙형 세라미다아제를 코딩하는 염기서열을 각각 나타낸다.

실시예 5 세라미다아제 유전자의 발현

직경 35 mm 의 접시에 10 % FCS 함유 α-MEM 배지에서 배양된 CHO 세포 (3 ×10⁵세포/접시) 에 실시예 4 에서 얻어진 플라스미드 pLCDase 1 ㎍ 와, 리포펙트아민 (라이프 테크놀로지즈사 제조) 5 ㎕ 을 첨가함으로써 세라미다아제 유전자를 CHO 세포로 도입하였다. 이 세포를 37 ℃ 에서 24 시간 배양 후, 0.1 % TritonX-100 을 포함하는 100 ㎕ 의 10 mM Tris 염산 (pH 7.5) 에 현탁하여 세포를 파쇄하였다. 얻어진 세포파쇄액에 대해 상기 C12-NBD-세라미드를 기질로 하는 세라미다아제 활성측정을 실시한 결과, 이 세포에서 세라미다아제가 pLCDase 를 도입하고 있지 않은 콘트롤세포에 비해 약 1000 배 강하게 발현되고 있음이 확인되었다.

또한, 애널리티컬 바이오케미스트리 (Analytical Biochemistry) 제 24 권, 제 291 ∼ 300 페이지 (1997) 에 기재된 방법에 따라 세포내의 세라미드량을 측정한 결과, pLCDase 를 도입한 세포에서는 도입하고 있지 않은 콘트롤세포에 비해 세라미드량이 유의하게 감소하고 있음이 확인되었다.

실시예 6 마우스뇌로부터의 세라미다아제 유전자의 클로닝

암피실린 100 ㎍/㎖ 을 포함하는 LB 한천배지 플레이트에 니트로셀룰로오스막 (Schleicher & Schuell 사, PROTRAN BA85 0.45 mm 를 직경 82 mm 로 사용) 을 얹고, 그 플레이트 1 장 당 약 20 만 콜로니가 되도록 10 장의 플레이트에 마우스뇌 cDNA 라이브러리 (LIFE TECHNOLOGIES 사, SUPERSCRIPT Mouse Brain cDNALibrary) 를 파종하여 37 ℃ 에서 10 분간 배양하였다. 니트로셀룰로오스 멤브렌상에 생긴 대장균을 나이론막 [PALL Gelman Laboratory 사, 바이오다인 A 직경 82 mm (1.2 mm)] 에 모사하여 각각 암피실린 플레이트에 얹은 후, 37 ℃ 에서 3 시간 배양하였다. 니트로셀룰로오스 멤브렌은 마스터 필터로서 4 ℃ 에서 보존하고, 나이론막은 클로르암페니콜 플레이트에 얹여 37 ℃ 에서 16 시간 배양하였다. 나이론막으로부터 새로운 나이론막으로 콜로니를 모사하여 각 조의 나이론을 겹친 상태에서 1 ㎖ 의 변성액 (0.5 M NaOH/1.5 M NaCl) 으로 앞과 뒤에 각각 5 분간 처리하였다. 마찬가지로 1 ㎖ 의 중화액 [0.5 M Tris-HCl (pH 7.4)/1.5 M NaCl] 으로 5 분간 처리하였다. 나이론막을 떼어 풍건 후 80 ℃ 에서 2 시간 베이킹하였다. 그 후, 200 ㎖ 의 예비 세정액 [5 ×SSC/0.5 % SDS/1 ㎖ EDTA (pH 8.0)] 으로 진탕하여 대장균의 파손된 곳을 닦아 내고 2 ×SSC 로 세정하였다. 40 ㎖ 의 하이브리디제이션액 [0.5 M 차티린산/ 7 % SDS/ 1 ㎖ EDTA] 으로 65 ℃ 에서 2 시간 프리하이브리디제이션을 실시한 후, 변성 후의 프로브를 포함하는 40 ㎖ 의 하이브리디제이션액중에서 65 ℃ 에서 16 시간 하이브리디제이션을 실시하였다. 프로브로서 마우스 세라미다아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pAPLCD 의 EcoRI-EcoRI 단편 2.7 kbp 를 사용하였다. 하이브리디제이션종료 후, 100 ㎖ 의 세정액 (40 mM 차티린산/1 % SDS) 으로 65 ℃, 15 분간의 세정을 2 회 실시하였다. 또한, 100 ㎖ 의 하이 스티린전트 (High stringent)세정액 (0.2 ×SSC/0.1 % SDS) 으로 65 ℃, 15 분간 세정하였다. 막을 풍건 후, 1 시간 IP-plate 에 노출하여 BAS 1500 으로 해석을 실시하였다. 포지티브부분의 니트로셀룰로오스멤브렌을 직경 약 6 mm 로 잘라내어 1 ㎖ 의 LB 배지에 현탁 후, 4000 배로 희석한 샘플 200 ㎖ 를 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 뿌리고 두번째 스크리닝을 실시하였다.

마찬가지로 포지티브부분을 10000 배로 희석한 샘플 200 ㎖ 을 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 뿌려 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리를 사용하여 세번재 스크리닝을 실시하였다. 단리된 클론 (pSBCD) 은 서브클로닝한 정법에 따라 염기서열을 결정하였다. 그 서열을 서열번호: 16 에 나타낸다.

상기 서열중에는 실시예 4 에 기재된 마우스간장유래의 세라미다아제 유전자와 동일한 서열을 갖는 ORF 가 발견되었다. 또한, 5' 비번역영역 및 3' 비번역영역의 서열은 마우스간장유래의 것과 상이하였다. 또, 단리된 플라스미드 pSBCD 를 실시예 5 와 동일하게 CHO 세포에 도입한 결과, 이 세포에서 세라미다아제가 발현되고 있음이 확인되었다.

실시예 7 인체의 세라미다아제 유전자의 게놈클로닝

실시예 4 에서 결정된 마우스간장유래 세라미다아제 유전자의 서열에 기초하여 서열표의 서열번호: 17 에 나타내는 서열을 갖는 센스 프라이머 U1107 및 서열표의 서열번호: 18 에 나타내는 서열을 갖는 안티센스 프라이머 L1311 을 합성하였다. U1107 프라이머의 서열은 서열표의 서열번호: 12 의 염기번호: 1107 ∼ 1130 의 서열에 상당하고, L1311 프라이머의 서열은 서열번호: 12 의 염기번호: 1311 ∼ 1334 의 서열에 상보적인 염기서열에 상당한다.

인체간장 암세포 Huh 7 로부터 게놈 DNA 를 통상적인 방법에 의해 정제하였다. 얻어진 게놈 DNA 625 ng 를 주형에 U1107 프라이머 및 L1311 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 은 94 ℃, 9 분 후, 94 ℃, 0.5 분 ∼ 55 ℃, 0.5 분 ∼ 72 ℃, 3 분을 1 사이클로 하는 40 사이클을 실시하고, 다시 72 ℃ 에서 7 분 보온하는 반응을 실시하였다. 이어서, 얻어진 반응물을 아가로오스겔 전기영동에 이용한 결과, 이 PCR 에 의해 약 2 kbp 의 DNA 단편이 증폭됨이 확인되었다.

이 DNA 단편을 Sephaglas (팔마시아사 제조) 를 사용하여 겔로부터 회수하고 얻어진 단편을 pGEM-T easy 벡터 (프로메가사 제조) 에 삽입, 재조합 플라스미드를 구축하였다. 이어서, 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 상기 서열은 GenBank 의 데이터베이스가 등록되어 있는 Accession NO.AC012131 Complement 의 96289 ∼ 98478 에 상당하는 서열이었다. 또, 상기 서열에 코딩되는 아미노산서열의 해석을 실시한 결과, 서열표의 서열번호: 4 로 나타내어지는 마우스간장유래 세라미다아제 아미노산서열의 아미노산번호: 370 ∼ 444 의 영역과의 상동성을 나타내는 아미노산서열을 코딩하는 영역이 발견되었다.

또한, AC012131 은 실시예 4 에서 결정된 마우스간장유래 세라미다아제 유전자와도 상동성을 갖는다.

서열표 프리텍스트

서열번호: 1 에 나타내는 서열에서 아미노산번호; 7, 9 및 13 의 Xaa 는 불명확한 아미노산을 나타낸다.

서열번호: 4 는 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다. 상기서열중, 염기번호: 6, 9 및 15 의 n 은 G, A, T 또는 C 를 나타낸다.

서열번호: 5 는 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다. 상기 서열중, 염기번호: 3, 6 및 15 의 n 은 G, A, T 또는 C 를 나타낸다.

서열번호: 7 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 8 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 9 는 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 10 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 11 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 17 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호: 18 은 프라이머용 합성 올리고뉴클레오티드의 서열이다.

본 발명에 의해 포유류유래의 중성·알칼리성 세라미다아제를 코딩하는 유전자가 제공되고, 또한 이 유전자를 사용하는 세라미다아제의 유전자공학적인 제조방법이 제공된다. 또, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 상기 유전자의 검출에 유용하며 생체내에서의 세라미드대사연구 등에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의해, 본 발명의 유전자의 안티센스 핵산 (DNA, RNA) 이 제공된다. 이러한 유전자 및 그 안티센스 핵산은 생체내에서의 세라미다아제 활성의 제어, 세라미드대사계의 조절에 유용하며, 세라미드량의 이상에 기인하는 질환의 치료 등으로의 응용이 가능한 세라미드량의 조절방법이 제공된다.

Claims

(A) 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열 또는 그 일부를 갖고 이루어지는 폴리펩티드이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(B) 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 염기서열 또는 그 일부를 갖는 핵산으로서, 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(C) 서열표의 서열번호: 14 에 기재된 아미노산서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환을 갖는 아미노산서열로 이루어지며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산;

(D) 서열표의 서열번호: 15 에 기재된 염기서열에서 적어도 하나의 염기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환을 갖는 염기서열로 이루어지며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산; 및

(E) 상기 (A) ∼ (D) 중 어느 하나에 기재된 핵산의 상보가닥과 엄격한 조건하에 하이브리다이즈할 수 있는 핵산이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산,

(F) 축중을 통하여 상기 (A) ∼ (E) 중 어느 하나에 기재된 핵산과는 상이한 염기서열을 갖는 핵산이며, 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하여 이루어지는 핵산,

으로 이루어지는 군에서 선택된 핵산의 염기서열을 갖는 유전자.
제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 세라미다아제 활성이 하기 단계에 의해 검출될 수 있는 유전자:

(a) 유전자의 발현산물을 반응혼합액 [조성: 20 ㎕ 의 25 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5) 중, 550 pmol 의 C12-NBD-세라미드, 및 1.0 % (W/V) 콜산나트륨] 중, 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 반응시키는 단계, 및

(b) 얻어진 반응물에 대해 C12-NBD-지방산의 생성을 검출하는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 하기 성질을 나타내는 유전자:

(ⅰ) 작용: 세라미드를 가수분해하여 스핑고이드와 지방산을 생성한다;

(ⅱ) 기질특이성: N-아실스핑고신을 가수분해한다; 갈락토실세라미드, 술파티드, GM1a, 스핑고미에린은 작용하지 않는다;

(ⅲ) 최적 pH: 7.0 ∼ 8.0 이다;

(ⅳ) 0.1 % 폴리도칸올 (polidocanol) 을 함유하는 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 완충액중, 37 ℃, 24 시간 처리한 경우에는 활성의 저하는 관찰되지 않지만, 60 ℃, 1 시간 처리에 의해 처리전 활성의 약 30 % 로 활성이 저하한다.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 함유하여 이루어지는 재조합 DNA.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 제 4 항의 재조합 DNA 를 함유하여 이루어지는 미생물, 동물세포 또는 식물세포용 발현벡터.
제 5 항에 기재된 발현벡터를 지지하여 이루어지는 형질전환체.
세라미다아제 유전자가 발현되고, 또한 이 유전자에 코딩된 폴리펩티드의 생산에 적합한 조건하에, 제 6 항에 기재된 형질전환체를 배양하여 얻어진 배양물로부터 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법.
서열표의 서열번호; 14 에 기재된 아미노산서열 또는 그 일부를 갖고 이루어지는 폴리펩티드이며 또한 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자에 의해 코딩되어 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 세라미다아제 활성이 하기 단계:

(a) 유전자의 발현산물을 반응혼합액 [조성: 20 ㎕ 의 25 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5) 중, 550 pmol 의 C12-NBD-세라미드, 및 1.0 % (W/V) 콜산나트륨]중, 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 반응시키는 단계, 및

(b) 얻어진 반응물에 대해 C12-NBD-지방산의 생성을 검출하는 단계

에 의해 검출될 수 있는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 DNA.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 RNA.
제 11 항에 기재된 안티센스 DNA 를 함유하여 이루어지는 발현벡터.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 그 상보가닥에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 그 단편.
제 14 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 사용하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 검출방법.
제 14 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머를 함유하여 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 검출에 사용하기 위한 키트.
제 15 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 사용하는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출방법.
제 15 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 함유하여 이루어지는 세라미다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검출에 사용하기 위한 키트.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 그 안티센스 핵산을 세포 및/또는 조직에 도입하고, 그로 인해 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포내 및/또는 조직내에서의 세라미드량의 조절방법.