CN1351659A

CN1351659A - 神经酰胺酶基因

Info

Publication number: CN1351659A
Application number: CN00807972A
Authority: CN
Inventors: 伊东信
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-05-29
Also published as: CN101173293A; JP3995420B2; DE60034880D1; US20060024809A1; DE60034880T2; US7449553B2; KR20010108411A; WO2000058448A1; TWI272308B; EP1172436A1; US6830919B1; EP1172436A4; KR100661784B1; EP1172436B1; US20080050753A1; ATE362526T1; AU3326900A

Abstract

本发明涉及哺乳类来源的中性/碱性神经酰胺酶,与之特异性结合的抗体,编码该神经酰胺酶的基因,与该基因特异性杂交的探针和引物,该神经酰胺酶的基因工程学制备方法,该神经酰胺酶或基因的检测方法以及细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法。本发明可提供可用于神经酰胺结构和功能分析的脂质工程学试剂,及可在与神经酰胺代谢相关的疾病中应用。

Description

神经酰胺酶基因

技术领域

本发明涉及可作为神经酰胺结构和功能分析的脂质工程学试剂应用的、且具有神经酰胺酶活性的多肽，与之特异性结合的抗体，编码该多肽的基因，以及与该基因特异性杂交的探针及引物。本发明还涉及上述多肽的基因工程学制备方法，以及该多肽或基因的检测方法及其试剂盒。再者，本发明涉及细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法，该方法有可能应用于因神经酰胺量异常引起的疾病。

背景技术

神经酰胺酶是一种将神经酰胺水解成鞘氨基醇碱和脂肪酸的酶，神经酰胺是神经鞘脂类的一种。神经酰胺被神经酰胺酶水解生成的鞘氨基醇碱具有抑制蛋白激酶C、活化磷脂酶D、抑制钙调蛋白依赖性酶等多种生理活性。因此可认为上述鞘氨基醇碱是通过参与细胞增殖和细胞内信号传导而发挥调节细胞功能作用的重要物质。神经酰胺酶是承担调节上述鞘氨基醇碱量这一重要功能的酶。

根据最适pH可把神经酰胺酶分成酸性神经酰胺酶、中性/碱性神经酰胺酶。到目前为止的在酸性区具有最适pH的神经酰胺酶存在于大鼠脑[生化(Biochemistry)，第8卷，第1692-1698页(1969)]，豚鼠上皮细胞[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第270卷，第12677-12684页(1995)]，人肾脏[生化与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，第398卷，第125-131页(1975)]，脾脏[生化与生物物理学学报，第1004卷，第245-251页(1989)]，成纤维细胞[生化杂志(Biochem.J.)，第205卷，第419-425页(1982)]，上皮细胞[FEBS Lett.，第268卷，第110-112页(1990)]等哺乳动物组织，人尿[生物化学杂志，第270卷，第11098-11102页(1995)]等。

另外，已知假单胞菌属的细菌产生神经酰胺酶，这种神经酰胺酶具有的最适pH在碱性区[生物化学杂志，第273卷，第14368-14373页(1998)]。

在这些神经酰胺酶中，已测定了从人尿纯化出的酸性神经酰胺酶的氨基酸序列和编码该神经酰胺酶的基因的碱基序列[生物化学杂志，第271卷，第33110-33115页(1996)]。而且，利用与上述来源于人尿的酸性神经酰胺酶基因的同源性得到了小鼠的酸性神经酰胺酶基因[基因组(Genomics)，第50卷，第267-274页(1998)]。

但是，目前所报道的来源于哺乳类的神经酰胺酶基因均编码酸性神经酰胺酶，而对于哺乳类中中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列和基因结构完全不了解，对于高等生物中中性/碱性神经酰胺酶的生物学功能也不清楚。

在阐明生物体内神经酰胺的功能、其代谢调控、与神经酰胺相关的疾病的诊断及治疗等研究中，有必要获得与神经酰胺相关的各种酶及与该酶的基因相关的详细信息。但是，如同上述所讲，现状是尚未得到与哺乳类中中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列和其基因相关的信息。因此，为了开发与神经酰胺相关的上述技术，有必要获得与中性/碱性神经酰胺酶相关、尤其是与其基因相关的信息。

如上所述，有几篇报道是关于克隆哺乳类神经酰胺酶基因的，但均是在酸性区显示活性的神经酰胺酶，它们和在中性/碱性区显示活性的神经酰胺酶之间也不可能具有高的同源性。因此，将中性/碱性神经酰胺酶基因作为酸性神经酰胺酶基因碱基序列的同源物来获得是很困难的。

发明内容

本发明以上述以往的技术为鉴，其第1个目的是提供哺乳类的中性/碱性神经酰胺酶基因。本发明的第2个目的是提供高纯度的中性/碱性神经酰胺酶的基因工程学制备方法，它应用的转化体导入了包含上述基因的表达载体。本发明的第3个目的是提供上述基因编码的多肽。本发明的第4个目的是提供与本发明的基因或其一部分互补的反义DNA和反义RNA。本发明的第5个目的是提供与本发明的基因特异性杂交的合成寡核苷酸探针或引物。本发明的第6个目的是提供与上述多肽特异性结合的抗体或其片断。本发明的第7个目的是提供上述神经酰胺酶或其基因的检测方法及检测所用的试剂盒。本发明的第8个目的是提供调节细胞内或组织内神经酰胺量的方法。

本发明者们成功地从哺乳类小鼠的肝脏中分离出了中性/碱性神经酰胺酶及其基因。另外，通过杂交和聚合酶链式反应(PCR)等手段，成功地阐明了包括人在内的哺乳类中性/碱性神经酰胺酶的结构。还应用该基因，通过基因工程学方法成功地简便地制备出高纯度的中性/碱性神经酰胺酶，进而完成了本发明。

也就是说，本发明的要点如下。

[1]一种基团，它具有从下列核酸构成的组中选择的核酸碱基序列：

(A)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且该多肽具有神经酰胺酶活性；

(B)一种核酸，它具有序列表的序列号15中所述的碱基序列或其一部分序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；

(C)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列中至少1个氨基酸残基发生缺失、添加、插入或置换的氨基酸序列，且该多肽具有神经酰胺酶活性；

(D)一种核酸，它具有序列表的序列号15中所述的碱基序列中至少1个碱基发生缺失、添加、插入或置换的碱基序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；以及，

(E)一种核酸，它可在严格条件下与上述(A)-(D)任一项所述的核酸的互补链杂交，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；

(F)一种核酸，通过密码子的简并性与上述(A)-(E)任一项所述的核酸具有不同的碱基序列，并且该核酸编码具有神经酰胺酶活性的多肽。

[2]重组DNA，它含有上述[1]所述的基因；

[3]微生物、动物细胞或植物细胞用的表达载体，它包含上述[1]所述的基因或上述[2]所述的重组DNA；

[4]转化体，它携有上述[3]所述的表达载体；

[5]具有神经酰胺酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，在适于神经酰胺酶基因表达且适于生产该基因编码的多肽的条件下培养上述[4]所述的转化体，从所得培养物中提取具有神经酰胺酶活性的多肽；

[6]一种多肽，具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且具有神经酰胺酶活性；

[7]一种多肽，它由上述[1]所述的基因编码，且具有神经酰胺酶活性；

[8]与上述[1]所述的基因或其一部分互补的反义DNA；

[9]与上述[1]所述的基因或其一部分互补的反义RNA；

[10]含有上述[8]所述的反义DNA的表达载体；

[11]与上述[1]所述的基因或其互补链特异性杂交的寡核苷酸探针或引物；

[12]可与上述[6]或[7]所述的多肽特异性结合的抗体或其片断；

[13]编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的检测方法，该方法中使用了上述[11]所述的寡核苷酸探针和/或引物；

[14]用于检测编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的试剂盒，它含有上述[11]所述的寡核苷酸探针和/或引物；

[15]检测具有神经酰胺酶活性的多肽的方法，它使用了上述[12]所述的抗体或其片断；

[16]用于检测具有神经酰胺酶活性的多肽的试剂盒，它含有上述[12]所述的抗体或其片断；

[17]调节细胞内和/或组织内神经酰胺量的方法，其特征在于，将上述[1]所述的基因或其反义核酸导入细胞和/或组织内，由此来调节细胞内和/或组织内的神经酰胺量。

附图的简单说明

图1是表示神经酰胺酶的最适pH的图。

图2是含有神经酰胺酶基因的DNA片断的限制酶谱图。

实施发明的最佳方案

由于中性/碱性神经酰胺酶的共有序列等信息尚不明了，本发明者们首先分离纯化了上述中性/碱性神经酰胺酶，并得到氨基酸序列的信息，在此基础上，首次分离纯化出编码上述神经酰胺酶的基因。

由此得到一惊人的发现，即本发明的来源于小鼠肝脏的中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列与假单胞菌属细菌(绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))来源的已知碱性神经酰胺酶[生物化学杂志，第273卷，第14368-14373页(1998)]的氨基酸序列的同源性低。

本发明的神经酰胺酶是首次探明的哺乳类来源的中性/碱性神经酰胺酶。因此与众所周知的假单胞菌属细菌来源的已知碱性神经酰胺酶相比，本发明的神经酰胺酶对于阐明生物体内神经酰胺的功能、其代谢的调控、及在诊断和治疗与神经酰胺相关的疾病等开发应用方面更有用。

以下，说明本发明。(1)具有神经酰胺酶活性的多肽

本说明书中“具有神经酰胺酶活性的多肽”(本说明书中，有时可能描述为神经酰胺酶)是具有如前所述的、将神经酰胺水解成鞘氨基醇碱和脂肪酸活性的酶。“中性/碱性神经酰胺酶”是指最适pH处于比酸性区域高的区域的神经酰胺酶。

作为一个例子，本发明中描述了分离纯化出的小鼠肝脏来源的中性/碱性神经酰胺酶的酶化学、物理化学性质。

1.作用

本发明的神经酰胺酶水解神经酰胺生成鞘氨基醇碱和脂肪酸。

该神经酰胺酶的活性可按照生物化学杂志，第275卷，第3462-3468页(2000)中所述的方法进行测定。即，将在20μl 25mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中溶解了550pmol的C12-NBD-神经酰胺[分析生化(Anal.Biochem.)，第263卷，第183-188页(1998)]、1.0％(W/V)胆酸钠及适量酶(神经酰胺酶)的反应混合液在37℃温育30分钟。在沸水浴中将反应液保温5分钟，使反应终止。再将所得反应液减压干燥。将干燥物溶解到氯仿/甲醇＝2/1(V/V)中，用硅胶薄层色谱(展开剂：氯仿/甲醇/25％氨水＝90/20/0.5(V/V/V))展开。其后，用CS-9300色谱扫描仪(岛津)，在激发波长475nm、荧光波长525nm处，对上述反应中生成的C12-NBD-脂肪酸进行定量。该酶(神经酰胺酶)的1单位(U)定义为，在上述条件下每1分钟从C12-NBD-神经酰胺水解释放出1μmol C12-NBD-脂肪酸所需的酶量。

2.底物特异性

脂肪酸部分用¹⁴C放射性同位素标记的100pmol各种神经鞘脂置于含5mU本发明的神经酰胺酶及1％胆酸钠的25mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液20ml中，37℃作用24小时。用硅胶薄层色谱将反应液展开后，用图像分析仪BAS1000(富士胶卷公司制)检测并定量¹⁴C-标记的神经鞘脂与通过酶促反应生成的¹⁴C-标记的脂肪酸，并通过所得数值计算出分解率。本发明的神经酰胺酶的底物特异性如表1所示。

如表1所示，本发明的神经酰胺酶的底物特异性为：①水解各种N-酰基神经鞘氨醇；②对半乳糖基神经酰胺、硫苷脂、GM1a、神经鞘磷脂无作用；③相对于含二氢神经鞘氨醇(d18：0)的神经酰胺，对含神经鞘氨醇(d18：1)的神经酰胺作用更好；④对含植物鞘氨醇(t18：0)的神经酰胺作用较难。

表1底物(结构) 分解率

(％)N-月桂酰基神经鞘氨醇(C12：0/d18：0) 63N-棕榈酰基神经鞘氨醇(C16：0/d18：0) 93N-硬脂酰基神经鞘氨醇(C18：0/d18：0) 83N-棕榈酰基二氢神经鞘氨醇(C16：0/d18：0) 59N-硬脂酰基二氢神经鞘氨醇(C18：0/d18：0) 40N-棕榈酰基植物鞘氨醇(C16：0/t18：0) 5N-硬脂酰基植物鞘氨醇(C18：0/t18：0) 2NBD-N-十二烷酰基神经鞘氨醇(NBD-C12：0/d18：1) 97NBD-N-己酰基神经鞘氨醇(NBD-C6：0/d18：1) 2半乳糖基神经酰胺(Galb1-1｀Cer) 0硫苷脂(HS03-3Galb1-1｀Cer) 0Gmla(Galb1-3GalNAcb1-4(NeuAca2-3)Galb1-4Glcb1-1｀Cer) 0神经鞘磷脂(磷酸胆碱Cer) 0

3.最适pH

在20ml 3，3-二甲基戊二酸、50mM Tris(羟甲基)氨基甲烷、50mM 2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇中，加入100pmol C12-NBD-神经酰胺和本发明的神经酰胺酶16mU，37℃作用24小时。用硅胶薄层色谱将反应液展开后，用CS-9300色谱扫描仪，在检测波长525nm处，检测并定量NBD-标记的神经酰胺和通过酶促反应生成的NBD-标记的脂肪酸，通过所得数值计算出分解率。图1表示C12-NBD-标记的神经酰胺分解活性与pH的关系。纵轴为分解率(％)，横轴为反应pH。如图1所示，本神经酰胺酶的最适pH为7.0-8.0。

4.温度稳定性

在含有0.1％polidocanol(商品名：Lubrol PX)的20mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，将本发明的神经酰胺酶37℃处理24小时，未见其活性降低；但在60℃处理1小时后，活性降低到处理前的约30％左右。

5.分子量

通过SDS-PAGE(还原条件)测定的本发明的神经酰胺酶分子量约为94kDa。用糖肽酶F消化该酶后，用SDS-PAGE(还原条件)测定的分子量约为73kDa。

作为本说明书中“具有神经酰胺酶活性的多肽”的一个例子，例如具有序列表的序列号14所示的氨基酸序列、来源于小鼠的天然型神经酰胺酶的多肽。另外，除具有该氨基酸序列的多肽之外，用上述方法进行活性测定时能确定具有同样的神经酰胺酶活性、且具有序列表的序列号14所示氨基酸序列中导入了1个以上氨基酸置换、缺失、添加、插入等突变的氨基酸序列的多肽也包括在“具有神经酰胺酶活性的多肽”中。只要所得的多肽具有神经酰胺酶活性，上述突变可以导入2种以上的突变。本说明书中“导入了突变的氨基酸序列”既包括人为诱变的氨基酸序列，也包括具有自发突变的氨基酸序列。

对于获得具有突变的神经酰胺酶，具体地如对后述的神经酰胺酶基因的碱基序列(序列号15)中具有突变的突变基因，按如下步骤筛选出具有神经酰胺酶活性的多肽：

(a)将上述基因的表达产物，在反应混和液(组成：20μl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH6-9，优选6.5-8.5，更优选7-8，特别优选7.5)、550pmol C12-NBD-神经酰胺及1.0％(W/V)胆酸钠)中，37℃温育30分钟，使之反应的步骤；以及，

(b)检测所得反应物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步骤。(2)神经酰胺酶基因

本发明中神经酰胺酶基因是具有编码上述“具有神经酰胺酶活性多肽”的核酸碱基序列的基因，或是含有该基因的碱基序列的核酸。例如，具有编码序列表序列号14所示的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的核酸碱基序列的基因，及具有序列表序列号15所示的碱基序列或其一部分构成的核酸碱基序列的基因，但本发明并不限定于此。如上所述，具有编码序列表序列号14所示氨基酸序列的一部分构成的多肽的核酸碱基序列的基因，或具有序列表序列号15所示碱基序列的一部分构成的核酸碱基序列的基因，只要能编码具有神经酰胺酶活性的多肽，均包含在本发明的范围内。这些基因是小鼠肝脏来源的中性/碱性神经酰胺酶的基因，但本发明的神经酰胺酶基因来源没有特殊限制，只要通过与上述(1)中所述的(a)和(b)同样的步骤检测出基因产物具有神经酰胺酶活性即可。作为来源，如小鼠，大鼠，人，仓鼠，豚鼠等。

本说明书中“(氨基酸序列的)一部分构成的多肽”是指通过上述(1)中所述的步骤(a)和(b)可检测出具有神经酰胺酶活性的多肽。

编码具有同样的神经酰胺酶活性、且具有突变的神经酰胺酶的基因也包含在本发明内。例如，具有编码序列表的序列号15所示氨基酸序列中导入了1个以上的氨基酸残基置换、缺失、添加、插入等突变的氨基酸序列的核酸碱基序列的基因，只要该基因编码的多肽具有神经酰胺酶活性，那么也包含在本发明的基因内。这种具有突变的天然来源的基因及人为制备的基因，只要是编码具有中性/碱性神经酰胺酶活性的多肽的基因，均包含在本发明的范围内。

例如，可使用以下方法制备上述人为导入突变的基因。

导入随机突变的方法有，例如应用亚硫酸氢钠进行化学处理将胞嘧啶碱基置换成尿嘧啶碱基的引起转换突变的方法(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，)第79卷，第1408-1412页(1982))；在含锰的反应液中进行PCR，并降低DNA合成时核苷酸掺入的准确率的方法(分析生化(Anal.Biochem.)，第224卷，第347-353页(1995))等。

位点特异性突变的导入方法有，例如利用琥珀突变的方法(缺口双链体(gapped duplex)法，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第12卷，第9441-9456页(1984))；利用缺失dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因的宿主的方法(Kunkel定位诱变法，美国国家科学院院刊，第82卷，第488-492页(1985))；利用琥珀突变的PCR方法(国际公开第98/02535号小册子)等。用这些方法将位点特异性突变导入目的基因的各种试剂盒已制成商品出售，通过利用这些试剂盒，可轻松地获得导入了所要突变的基因。

另外，在严格条件下与上述核酸的互补链杂交、且具有编码神经酰胺酶活性多肽的核酸碱基序列的基因也包含在本发明的基因内。神经酰胺酶活性，例如可通过上述(1)中所述的步骤(a)和(b)进行检测。

这里，“严格条件”是指以下条件。即在含0.5％SDS、5×Denhardt’s(Denhardt’s：0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400)及100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，50℃温育4小时至一晚。

另外，杂交操作详细描述于，如1989年冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory)发行，T.Maniatis等编著的，分子克隆：实验指南第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual2nd ed.)等。

通过简并基因密码子，与上述核酸具有不同碱基序列的基因也包含在本发明的神经酰胺酶基因内。

由本发明的基因所编码的多肽，若能通过上述(1)所述的步骤(a)和(b)检测出具有神经酰胺酶活性，就包含在本发明内。

由本发明的基因还可提供适于不同使用目的的重组DNA。这里，“重组DNA”指通过基因工程学手段得到的含有本发明基因的DNA。

可将含有本发明神经酰胺酶基因的重组DNA连接到众所周知的载体上，进而构建可表达神经酰胺酶基因的表达载体。该表达载体也包含在本发明内。

本发明中，表达载体是插入了上述基因或重组DNA、且可在所希望的宿主细胞内进行表达的载体。另外，插入了下述反义DNA的载体也包含在本发明的载体内。作为用于构建表达载体的载体，例如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。pUC18、pUC19、pBluescript、pET等市售品适用于作为质粒载体，λgt10、λgt11等λ噬菌体载体市售品适用于作为噬菌体载体，但并不限定于此。可使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、腺伴随病毒载体等作为病毒载体，但并不限定于此。可根据应用的宿主细胞适当的选用载体。这些载体可适宜含有可诱导的启动子、选择性标记基因、终止子等因子。

另外，为了简化分离纯化过程，根据使用目的分别可应用具有His-tag、GST融合蛋白表达序列的载体。此时，可应用具有在宿主细胞内可发挥一定功能的适当的启动子(例如lac，tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白质载体(例如，pGEX4T)，和具有tag序列(例如Myc，HisA等)的载体等。(3)含有神经酰胺酶基因的转化体

用插入了本发明的神经酰胺酶基因的表达载体进行宿主的转化，由此得到本发明的转化体，即得到表达本发明的神经酰胺酶基因的细胞。使用的宿主可根据所希望的神经酰胺酶的使用目的进行适当选择。可应用以大肠杆菌为代表的微生物，之外如酵母、动物细胞、植物细胞、动物个体、植物个体等。具体而言，大肠杆菌可应用大肠杆菌K-12系统的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、DH10B株、XL-1BlueMRF’株、TOP10F株等。酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。动物细胞如L，3T3、FM3A、CHO、COS、Vero、Hela等。植物细胞如烟草BY2等。

作为将表达载体导入宿主的方法，例如可应用分子克隆：实验指南第2版，第249-254页所述的方法。然后，利用表达载体的特性筛选表达目的基因的转化体。例如质粒载体为pBluescript、大肠杆菌作宿主细胞时，在含有氨苄青霉素的平皿上筛选具有氨苄青霉素抗性的菌落，或在含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的平皿上筛选氨苄青霉素抗性且呈现白色的菌落，并以此来筛选导入了外源基因的菌落。

本发明转化体的培养可在通常所用的条件下进行，并生产具有神经酰胺酶活性的多肽。因表达本发明基因的宿主对密码子的使用频率不同，有时可能会出现抑制表达的现象。此时，可将本发明的基因所使用的密码子分别替换成各个宿主惯用的密码子。另外，上述表达载体不只限于来源于质粒的载体，只要不妨碍本发明的目的，可应用来源于噬菌体、粘粒的载体。为了轻松且大量地制备本发明的多肽，优选应用可诱导表达外源基因的载体，以及可与报道基因产物以融合蛋白的形式表达的载体。

可通过测定神经酰胺酶的活性检测神经酰胺酶的表达。活性测定可将转化体的细胞提取液作为样品，并按照生物化学杂志，第275卷，第3462-3468页(2000)中所述的方法，例如进行与上述(1)所述的步骤(a)和(b)同样的操作。另外，通过测定细胞内的神经酰胺量也可检测神经酰胺酶的表达。上述神经酰胺量的测定可按照分析生化(Analytical Biochemistry)，第244卷，第291-300页(1997)中所述的方法进行。另外，也可使用神经酰胺酶抗体。当神经酰胺酶与其它多肽(本发明神经酰胺酶之外的多肽)以融合体形式表达时，可使用针对其多肽(本发明神经酰胺酶之外的多肽)部分的抗体。使用抗体时可这样进行检测，如将转化体的细胞提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在膜上用抗体进行检测。(4)具有神经酰胺酶活性的多肽的制备方法

本发明还提供具有神经酰胺酶活性的多肽的制备方法，该方法是在适于表达本发明的基因、且适于生产该基因编码的多肽的条件下，培养上述转化体，并从所得培养物中提取具有神经酰胺酶活性的多肽。转化体的培养方法无特殊限制，可从适合于所使用宿主的已知的培养方法中适当选择。

本发明的制备方法中，上述转化体为微生物或培养细胞时，通过确定培养基的组成、培养基pH、培养温度、培养时间、诱导剂的使用量、使用时间等神经酰胺酶表达的最佳条件，可有效地生产神经酰胺酶。

可应用常规方法从转化体的培养物中纯化神经酰胺酶。转化体如大肠杆菌那样将神经酰胺酶蓄积在细胞内时，可在培养终止后，通过离心收集转化体细胞，所得细胞用超声波处理等破碎后，通过离心得到无细胞提取液。以此作为原始材料，用盐析法、之外如离子交换、凝胶过滤、疏水性、亲和性等各种色谱方法等一般性的蛋白质纯化方法进行纯化。根据所用的宿主-载体体系，当表达产物分泌在细胞外时，可由培养上清同样进行纯化。

根据本发明的制备方法，该神经酰胺酶在细胞内生产时，目的物神经酰胺酶与细胞内的各种酶、蛋白质等杂质共存，但这些杂质与表达的神经酰胺酶量相比，其量甚微，所以神经酰胺酶的纯化极其容易，这也是本发明制备方法的优点。另外，应用细胞外分泌型载体作为载体时，神经酰胺酶分泌于细胞外，神经酰胺酶的组分中含有培养基成分。但是，由于其中基本不含有妨碍通常的神经酰胺酶纯化的蛋白质成分，所以有利的一点是没必要进行象从小鼠肝脏中纯化神经酰胺酶那样必要而又复杂的分离纯化操作。

另外，真核生物来源的神经酰胺酶自身可具有糖链，应用无糖链生物合成能力的细胞作宿主细胞时，例如应用大肠杆菌、枯草菌、放线菌等原核生物，或应用酵母、真菌、动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等的失去糖链生物合成能力的突变细胞时，可制备出具有神经酰胺酶活性而没有糖链的多肽。另外，也可生产出具有糖链的酶，此时应用具有糖链生物合成能力的细胞作宿主细胞，例如应用酵母、真菌、动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等可制备出具有神经酰胺酶活性且具有糖链的多肽。

另外，根据由于所用宿主-载体体系不同，有时表达产物可形成不溶性包涵体(inclusion body)。这种情况下，在培养结束后通过离心收集细胞，用超声波处理等破碎细胞后，通过离心等方法收集含有包涵体的不溶性组分。将包涵体洗涤后，应用通常用的蛋白质助溶剂，如尿素和盐酸胍等使之溶解，必要时通过离子交换、凝胶过滤、疏水性、亲和性等各种色谱将之进行纯化，然后应用透析法或稀释法等进行重折叠操作，得到含有保持神经酰胺酶活性的多肽的标准品。必要时将该标准品再通过各种色谱进行纯化，可得到高纯度的且具有神经酰胺酶活性的多肽。(5)杂交用探针及PCR用引物

本发明的寡核苷酸探针或引物可与本发明的基因或其互补链特异性杂交。该寡核苷酸探针或引物是以本发明的神经酰胺酶基因的碱基序列为基础设计的，例如可用常规方法进行化学合成。该寡核苷酸探针的碱基序列无特殊限制，只要在严格条件下能与上述神经酰胺酶基因、或具有该基因互补碱基序列的核酸杂交即可。上述“严格条件”无特殊限制，例如在含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt、100mg/ml鲑鱼精子DNA的溶液中，在(上述探针的Tm-25℃)温度下保温一晚。对上述引物的碱基序列也无特殊限制，只要在通常的PCR反应条件下能与上述神经酰胺酶基因、或具有该基因互补碱基序列的基因退火杂合，并通过DNA聚合酶能起始延伸反应即可。

寡核苷酸探针或引物的Tm值，例如可通过以下式子计算：

Tm＝81.5-16.6(log₁₀〔Na⁺〕)+0.41(％G+C)-(600/N)(式中，N为寡核苷酸探针或引物的链长，％G+C为寡核苷酸探针或引物中的鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量)

另外，当寡核苷酸探针或引物的链长短于18个碱基时，Tm值例如通过A+T(腺嘌呤+胸腺嘧啶)残基的含量与2℃的积与G+C残基的含量与4℃的积的和〔(A+T)×2+(G+C)×4〕进行推算。

上述寡核苷酸探针的链长无特殊限制，但从防止非特异性杂交的观点出发，优选在15个碱基以上，更优选在18个碱基以上。

另外，本发明的引物可以是与上述寡核苷酸探针具有相同碱基序列的核酸。例如，可以本发明基因的碱基序列为基础进行设计，并通过化学合成等方法进行制备。引物的长度无特殊限制，例如可使用15-40个碱基数的引物，特别优选17-30个碱基数的引物。上述引物可用于以PCR为代表的各种基因扩增法，并由此可进行本发明神经酰胺酶基因的检测。

另外，作为上述寡核苷酸探针或引物，也可应用经限制酶处理、核酸外切酶处理等酶处理，超声波等物理处理而使天然来源的编码神经酰胺酶的核酸片断化后，将所得片断通过以琼脂糖为代表的各种核酸分离法进行纯化而得到的核酸。上述所得的核酸最好是来源于具有神经酰胺酶特征性序列的区域。

再者，为了使上述寡核苷酸探针或引物能更容易地检测出检测对象的核酸，可用已知的方法将核酸进行适当标记后，再用于本发明神经酰胺酶基因的检测。标记无特殊限制，除放射性同位素以外，可应用荧光物质、生物素和洋地黄毒苷等配体为代表的各种标记。

应用本发明的杂交用探针，通过筛选小鼠肝脏以外的脏器或小鼠以外生物体来源的基因组DNA或cDNA、或基因组DNA文库或cDNA文库，可克隆出与本发明的神经酰胺酶基因具有高度同源性的DNA。

另外，应用本发明的引物，通过PCR方法，可从小鼠肝脏以外的脏器或小鼠以外生物体来源的基因组DNA或cDNA、或基因组DNA文库或cDNA文库检测出与本发明的神经酰胺酶基因具有高度同源性的DNA片断，并且可得到其全长基因。(6)基因的检测方法

本发明基因的检测方法的一个显著特征是使用上述寡核苷酸探针和/或引物检测待检样品中的基因。

本发明的检测方法中，既可应用上述寡核苷酸探针，通过杂交法等进行基因的检测；也可应用上述引物，通过PCR等DNA扩增方法进行基因的检测。

应用寡核苷酸探针进行杂交时，作为待检测用的样品，如微生物的菌落和培养细胞、组织切片等样品，将这些样品中的DNA和RNA固定到膜上的样品，从这些样品中提取出的DNA和RNA等。

杂交可按照分子克隆：实验指南第2版等中所述的已知方法进行。杂交条件可根据所用探针的Tm值、目的DNA的GC含量等适当选定。例如可应用上述分子克隆：实验指南第2版等所述的条件。

应用引物来检测基因时，作为待检测用的样品，如微生物培养液、微生物菌落、微生物菌体等微生物样品，培养细胞、组织、组织切片等活体来源的样品等。这些样品可直接应用分离的微生物和培养细胞，亦可应用经过适当处置的上述微生物和培养物。另外，象组织这样的固体样品可制成浸出液和悬浊液使用。另外，也可使用这些样品的上清、或经表面活性剂处理等细胞溶解处理的样品及其上清。此外，在不损害作为检测对象的核酸的情况下，可进行除去样品中其它成分的操作。

应用上述引物通过PCR进行检测时，PCR的条件要根据所用引物的Tm值、扩增并检测的检测对象区域的长度等进行适当选择。PCR法可通过确认有无扩增产物来检测目的基因。有无扩增产物的确认无特殊限制，可通过将核酸扩增反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶用适当的核酸染色试剂，如用溴化乙锭、SYBER绿I(SYBER GreenI)等进行染色，后经紫外线照射检测有无条带产生来确认。条带的检测可用肉眼观察，也可用荧光成像分析仪(Fluorescent imageanalyzer)等进行检测。

本发明的基因检测方法中，为了提高检测灵敏度，可联合应用上述探针和引物。例如应用上述引物，通过PCR法扩增样品中微量存在的神经酰胺酶基因，然后用探针与该基因杂交，由此可高灵敏度且正确地进行检测。

应用本发明的基因检测方法进行神经酰胺酶基因的检测，进而确定该基因的量时，可通过对来自杂交探针的信号强度、及应用引物进行扩增的产物产生的条带的荧光强度等的定量来进行。此外，通过以mRNA为测定对象进行定量，可检测目的基因的表达量。

本发明的检测方法中，通过使用本发明基因的检测试剂盒可更为简便地进行。该试剂盒也包括在本发明内。该试剂盒的一个特征是含有上述寡核苷酸探针和/或上述引物。该试剂盒可含有检测操作中所使用的各种成分，例如包含寡核苷酸探针的试剂盒中可含有用于固定核酸的膜和杂交缓冲液等杂交用各种试剂；包含引物的试剂盒中可含有耐热性DNA聚合酶、dNTP混和液、PCR用缓冲液等PCR用试剂。还可含有探针和用于检测扩增出的DNA的试剂和微生物增殖用的培养基，细胞培养用的培养基，用于从样品中抽提核酸的试剂等。(7)与具有神经酰胺酶活性的多肽特异性结合的抗体或其片断

与本发明的多肽特异性结合的抗体或其片断无特别限制，可以是多克隆抗体也可是单克隆抗体，只要具有与该多肽特异性结合的能力即可。还可使用经已知技术修饰过的抗体和抗体衍生物，例如人源化抗体、Fab片断、单链抗体等。本发明抗体的制备很容易，例如参照1992年John Wiely&Sons.Inc公司发行，John E.Coligan编著的现代免疫学技术(Current Protocols in Immunology)中所述的方法，用本发明多肽的全部或一部分免疫兔子、大鼠、小鼠等。将得到的抗体纯化后，经过肽酶等处理得到抗体片断。另外，也可制备基因工程学抗体。再者，为了便于用酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法等进行检测，可对本发明的抗体或其片断进行各种修饰。

上述抗体或其片断中还包括与多肽的某一部分片断特异性结合的抗体或抗体片断。

所得抗体或其片断的用途有，神经酰胺酶生产菌的检测、神经酰胺酶表达细胞株的检测、培养细胞和组织中神经酰胺酶蛋白质的检测、亲和色谱、各种文库(基因组DNA或cDNA)表达产物的筛选、医药、诊断药、研究用试剂等方面的应用。(8)多肽的检测方法

本发明多肽的检测方法的特征为，使用上述抗体或其片断检测出具有神经酰胺酶活性的多肽。

作为本发明中可应用的检测用样品，例如微生物和动物细胞的培养物，组织切片，微生物和动物细胞的细胞破碎物，皮肤等组织的提取液或洗涤液，固定了微生物和动物细胞、组织来源的蛋白质的膜等蛋白质样品。

抗体或其片断与上述多肽特异性结合的检测可用已知的方法，例如酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法等。

本发明多肽的检测方法，可通过应用本发明多肽的检测试剂盒进行更为简便地测定。该试剂盒也包括在本发明内。该试剂盒的特征是含有上述抗体或其片断。另外，该试剂盒还可含有反应用缓冲液、标记的二抗、显色试剂等。(9)反义DNA和反义RNA

本发明中的“反义DNA”和“反义RNA”是指具有与本发明神经酰胺酶基因或其一部分互补的碱基序列，通过与内源性的神经酰胺酶基因(基因组DNA和mRNA)形成双链抑制或调控该基因信号表达(转录、翻译)的DNA或RNA。反义DNA或反义RNA的长度可根据碱基序列的特异性和导入细胞内的方法而改变。反义DNA或反义RNA可用合成仪人工合成，或通过以本发明基因为模板的酶反应，并使之按与通常相反的方向(反义方向)表达基因来制备。想在生物体内表达反义RNA时，将本发明基因按与通常相反的方向连接到表达载体上，并将之导入生物体内即可。

例如，应用tat基因〔核酸研究，第19卷，第3359-3368页(1991)〕、或rev基因〔美国国家科学院院刊，第86卷，第4244-4248页(1989)〕的HIV增殖抑制等反义技术已知有许多，因此通过这些方法，应用本发明的反义DNA和反义RNA，可抑制或调控内源性神经酰胺酶基因的表达。另外，本发明的反义DNA和反义RNA可作为原位杂交等的研究试剂使用。(10)应用神经酰胺酶基因或其反义核酸调节细胞内或组织内的神经酰胺量

应用本发明的基因，还可提供细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法。该调节方法也包括在本发明内。本发明的细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法的一个特征是，将本发明的神经酰胺酶基因导入细胞内和/或组织内，并由此调节细胞内和/或组织内的神经酰胺量。

也就是说，本发明的调节方法中将本发明的神经酰胺酶基因导入细胞或组织内，通过该基因表达产生的神经酰胺酶，分解细胞或组织内的神经酰胺；另一方面，通过将本发明的神经酰胺酶基因导入细胞或组织内，促使该基因的反义核酸、如反义RNA的生成，并由此降低该细胞或组织内的神经酰胺酶活性及抑制神经酰胺的分解。另外，抑制神经酰胺的量时，可将本发明的神经酰胺酶基因的反义核酸、即本发明的反义DNA或反义RNA直接导入细胞或组织内。

可使用已知的方法将本发明的神经酰胺酶基因或其反义核酸导入细胞或组织内，如可利用电穿孔法、基因枪法等物理的基因导入方法，及应用病毒载体的基因导入方法。本发明的方法中使用的病毒载体无特殊限制，例如可应用逆转录病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、腺伴随病毒载体等。

根据本发明的调节方法，将本发明的神经酰胺酶基因或其反义核酸导入细胞和/或组织内，通过调节细胞内和/或组织内的神经酰胺量，可有效地进行因神经酰胺量异常引起的疾病的治疗，另外可制作神经酰胺代谢异常疾病的动物模型。“因神经酰胺量异常引起的疾病”无特殊限制，例如法贝尔病(Farber’s disease)等。

以下，对小鼠肝脏来源的神经酰胺酶基因的获得方法进行说明。

1)首先，由小鼠肝脏匀浆中制备出膜组分，将之悬浮到蔗糖-EDTA溶液中，冻融后，离心得到上清(粗酶提取液)。应用已知的蛋白质纯化方法，例如组合应用各种色谱方法，由粗酶提取液得到单一状态的纯化的神经酰胺酶标准品。上述纯化中可使用的色谱方法有阴离子交换色谱、疏水色谱、螯合色谱、凝胶过滤色谱等。

2)然后，检测神经酰胺酶的部分氨基酸序列，作为制备克隆神经酰胺酶基因时的探针的信息。将上述纯化的神经酰胺酶标准品直接用埃德曼(Edman)降解法〔生物化学杂志，第256卷，第7990-7997页(1981)〕进行的氨基酸序列分析，由此得知神经酰胺酶N末端的氨基酸序列。另外，用底物特异性高的蛋白酶，例如赖氨酰内肽酶(lysyl endopeptidase)和N-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)-胰蛋白酶等消化纯化的酶标准品，从得到的肽混合物中纯化适当的肽片断，对该片断进行氨基酸序列分析，从而得到神经酰胺酶内部的部分氨基酸序列。

3)以这样得到的氨基酸序列信息为基础，设计杂交用的探针或作为PCR引物用的寡核苷酸，并克隆本发明的神经酰胺酶基因。此时，可应用一般的PCR或杂交方法。PCR方法可按照1989年Stockton Press公司发行，Erlich，H.A.编著的PCR技术(PCR Technology)中所述的方法进行。杂交方法可按照分子克隆：实验指南，第2版中所述的方法进行。

4)对上述杂交或PCR所得DNA片断，解读其碱基序列，得到其编码的氨基酸序列。将该序列与上述2)中得到的神经酰胺酶的部分氨基酸序列相比较，确定上述DNA片断是否为神经酰胺酶基因的片断。

5)当3)中杂交或PCR所得DNA片断为神经酰胺酶基因的一部分时，重复3)的操作，或者以3)中得到的DNA片断的碱基序列为基础制备新的探针和引物，并使用它们进行杂交或进行PCR，得到包含编码完整神经酰胺酶的基因的DNA片断。

6)将得到的编码完整神经酰胺酶的基因连接到适当的载体，构建表达载体，并制备导入了该表达载体的转化体。培养该转化体，检测培养物中的神经酰胺酶活性，以确认所得基因编码神经酰胺酶。

但是，在本发明神经酰胺酶基因的克隆中，由本发明中得到的部分氨基酸序列信息不能设计出适用于杂交法文库筛选的探针DNA。另外，基于部分氨基酸序列以及制备文库所用的各种载体的碱基序列设计了多种PCR引物，并用其各种组合进行了PCR，但未见特异性扩增，唯有以部分氨基酸序列C-53(序列表的序列号3中所示的C-53氨基酸序列)为基础设计的2种引物对组合进行PCR时见到扩增。但扩增的DNA片断P-1(序列表的序列号6中所示的P-1碱基序列)为68bp的短片断，不能直接用作于杂交法文库筛选的探针。于是由P-1序列再设计PCR引物，同时由制备文库所使用的载体的碱基序列设计引物，二者组合进行PCR，由此首次得到了适于作为杂交法文库筛选用探针的335bp的基因片断。

以上述335bp的DNA片断为探针，筛选小鼠肝脏来源的cDNA文库，从而可克隆出编码完整神经酰胺酶的基因。另外，通过筛选小鼠肝脏来源的基因组DNA文库，可得到本发明的神经酰胺酶的基因组DNA。

上述所得小鼠肝脏产生的神经酰胺酶基因的全长碱基序列描述于序列表的序列号12中，它所编码的多肽的氨基酸序列描述于序列表的序列号13中。由该氨基酸序列与该酶的N末端氨基酸序列可以判断，生物体内该酶被加工成去除了N末端部分肽段的成熟型酶。该成熟型酶的氨基酸序列以及编码该序列的碱基序列分别显示于序列表的序列号14和15中。上述氨基酸序列、碱基序列与已知的哺乳类来源的神经酰胺酶的氨基酸序列、碱基序列彼此之间无同源性。也就是说，本发明所提供的神经酰胺酶基因与已知的神经酰胺酶基因之间无关系，是全新的序列。

如此，本发明提供小鼠肝脏来源的神经酰胺酶的一级结构和基因结构。另外，还可提供具有神经酰胺酶活性的多肽的廉价、高纯度的基因工程学制备方法。

另外，与本发明的神经酰胺酶基因特异性杂交的寡核苷酸探针或引物可用于本发明的神经酰胺酶基因的检索、检测和扩增等。与本发明的多肽特异性结合的抗体或其片断可用于神经酰胺酶的检测、鉴定和纯化等。

再者，根据本发明的细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法，将本发明的神经酰胺酶基因或其反义核酸导入细胞和/或组织内，可调节细胞和/或组织内的神经酰胺量，所以该调节方法可用于因神经酰胺量异常引起的疾病的治疗，如法贝尔病等疾病的治疗，然而对适合用该调节方法治疗的疾病并无特殊限制。

以下通过实施例，再对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于实施例的范围。实施例1神经酰胺酶的纯化

从105只Sea/ddY小鼠(成和实验动物研究所制)中摘出的肝脏181g，在300ml含1mM EDTA的0.25M蔗糖溶液(蔗糖-EDTA溶液)中匀浆。将该匀浆600×g离心10分钟，回收上清。将所得上清再2700×g离心30分钟，回收沉淀。

将沉淀组分悬浮于480ml蔗糖-EDTA溶液中，得到悬浮液。将所得悬浮液-80℃冷冻后，置于循环水中融化。反复冻融处理2次。然后将处理的悬浮液105000×g离心90分钟，分别回收上清及沉淀。沉淀部分再进行上述冷冻、融化-离心处理。将回收的上清与先前回收的上清合并，得到520ml的粗酶提取液。

将260ml粗提取液上样到预先用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡过的100ml DEAE-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制)柱，洗去非吸附物质。接着用含1M NaCl的同一种缓冲液进行洗脱，回收神经酰胺酶活性组分160ml。将该组分随后上样到预先用含1M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的100ml苯基-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制)柱，然后用2M-0M NaCl浓度梯度进行洗脱，再用0％-1％的Polidocanol(商品名：LubrolPX，Nakalai Tesque公司制)浓度梯度进行洗脱。由该层析过程回收到310ml神经酰胺酶活性组分。

将所得活性组分上样到预先用含0.5M NaCl和0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的25ml螯合型-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制，Cu²⁺结合型)柱。用同一种缓冲液和含0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗柱，然后用含2M NH₄Cl、0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将酶洗脱出。通过超滤浓缩洗脱出的活性组分，得到浓缩物。然后将浓缩物中的缓冲液替换成含0.1％Lubrol PX的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)，得到酶溶液。再将所得酶溶液30ml上样到用含0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的porous HQ柱(φ4.6×100mm，Perceptive Biosystems公司制)，然后用0M-0.5M NaCl浓度梯度进行洗脱，得到活性组分。将该活性组分上样到用含0.2M NaCl、0.1％Lubrol PX的1mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡过的羟基磷灰石(φ7.5×100mm，PENTAX公司制)柱。神经酰胺酶不吸附到该柱上，因此从不保留的洗脱组分中回收。然后将该组分上样到用含0.2M NaCl、0.3％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的Superose 200HR柱(φ10×300mm，AmershamPharmacia公司制)，进行凝胶过滤色谱，得到纯化的神经酰胺酶。以上操作的结果，得到58mg纯化的神经酰胺酶标准品。

对所得纯化神经酰胺酶标准品的各种性质，按照本说明书中所述的那样进行检测的结果，其性质如下。

作用：水解神经酰胺生成鞘氨基醇碱和脂肪酸。

底物特异性：具有上述表1所示的底物特异性。

最适pH：结果如图1所示，该酶的最适pH为7.0-8.0。

温度稳定性：含0.1％Polidocanol(商品名：Lubrol PX)的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中，37℃处理24小时时，未见活性下降；但60℃处理1小时时，活性降低到处理前的约30％左右。

分子量：SDS-PAGE(还原条件下)测定约94kDa。用糖肽酶F消化后，SDS-PAGE(还原条件下)测定约73kDa。实施例2神经酰胺酶的部分氨基酸序列分析

向含50pmol神经酰胺酶的样品溶液11ml中加入含0.3％LubrolPX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)。所得样品溶液上样到Mono QPCl 6/5(100μl，Amersham Pharmacia公司制)柱。然后用含0.4MNaCl的同一种缓冲液洗脱吸附到柱上的神经酰胺酶组分。通过该操作，将含神经酰胺酶的组分浓缩到50μl。将所得浓缩液进行SDS-PAGE凝胶电泳，用GelCode Blue染色剂(Pirece公司制)对电泳后的胶进行染色。然后切出神经酰胺酶的条带。用含0.1％SDS的300μl 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，于37℃将切出的胶带的1/4部分抽提16小时。将所得抽提液作为样品，用G1005A蛋白质测序系统(Hewlett-Packard公司制)进行神经酰胺酶N末端氨基酸序列分析，确定氨基酸序列的N末端。序列表的序列号1中显示了N末端的氨基酸序列。

另外，将切出的胶带的剩余3/4部分在1ml 0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.2)/50％乙腈中，30℃洗涤45分钟。用氮气及离心浓缩机(Centrifugal Concentrator)将胶完全干燥后，加入含0.5μg蛋白酶Lys-C(和光纯药社制)的10μl 0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.2)，再加入0.1M Tris-HCl缓冲液(pH9.2)直到胶带完全胀润，37℃保温16小时，进行神经酰胺酶的蛋白酶消化。反应结束后，用150μl 0.1％三氟乙酸/60％乙腈室温抽提1小时，该操作进行2次，回收抽提液。将该抽提液上样给反相色谱，进行肽片断的纯化。通过G1005A蛋白质测序系统的埃德曼降解法，对所得肽片断进行分析，确定部分氨基酸序列C-46、C-53。序列表的序列号2、3中分别显示了C-46、C-53的氨基酸序列。实施例3用PCR法扩增含神经酰胺酶基因的DNA片断

以实施例2中确定的神经酰胺酶的部分氨基酸序列C-53为基础，设计正向引物53-S1、反向引物53-A3，并用DNA合成仪进行合成。序列表的序列号4、5中分别显示了引物53-S1、53-A3的碱基序列。用这些引物进行PCR。PCR以小鼠肝脏cDNA质粒文库(宝酒造社制)为模板进行。PCR反应条件是94℃9分钟后，以94℃0.5分钟、51℃0.5分钟、72℃1分钟为一个循环，进行40个循环，再于72℃保温7分钟。通过该PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测出大约70bp的特异性扩增DNA片断。

从胶中回收该扩增DNA，将它整合到pGEM-Teasy载体(Promega公司制)中，构建重组质粒。分析该质粒中插入的DNA片断的碱基序列，确定出该片断的部分碱基序列P-1。序列表的序列号6中显示了P-1的碱基序列。该序列是与实施例2中确定的神经酰胺酶的部分氨基酸序列C-53相对应的序列，由此确认获得了目的基因神经酰胺酶基因的一部分。

以P-1的碱基序列为基础设计反向引物MA1和MA2，并进行合成。序列表的序列号7、8中分别显示了引物MA1和MA2的碱基序列。另外，以用于构建小鼠肝脏cDNA质粒文库的载体pAP3neo的碱基序列为基础设计正向引物T7in和T7out，并进行合成。序列表的序列号9、10中分别显示了引物T7in和T7out的碱基序列。用这些引物，以小鼠肝脏cDNA文库为模板，进行巢式PCR。第一次PCR首先使用正向引物T7out和反向引物MA2，反应条件是94℃ 9分钟后，以94℃0.5分钟、51℃0.5分钟、72℃2分钟为一个循环，进行40个循环，再于72℃保温7分钟。第二次PCR以第一次PCR的反应液为模板，除使用正向引物T7in和反向引物MA1之外，其余与第一次PCR反应条件相同。结果得到335bp的DNA扩增片断。将之作为以下所示菌落杂交的探针。实施例4神经酰胺酶基因的克隆

将导入了小鼠肝脏cDNA质粒文库的转化体涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上的尼龙膜(商品名：Hybond-N⁺，Amersham Pharmacia公司制)上，制备每一块9.5×13.5cm的平皿形成约3万个菌落的主滤膜(master filter)。制备该滤膜的复制品，将所得复制滤膜分别在浸泡过10％SDS溶液的滤纸上处理5分钟，在浸泡过0.5M NaOH、1.5M NaCl溶液的滤纸上处理5分钟(变性)，在浸泡过含3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)缓冲液的滤纸上处理5分钟(中和)，在浸泡过2×SSC溶液的滤纸上处理5分钟，然后用2×SSC溶液漂洗膜。将膜风干后，用紫外线照射将DNA固定到膜上，成为菌落杂交用的膜。

用实施例3中得到的扩增DNA片断作杂交探针，取其0.1μg用DNA标记试剂盒(Ready To Go，Pharmacia公司制)，按照该试剂盒的说明书，用³²P进行标记。将上述滤膜放入杂交袋中，在杂交液(组成：7％PEG6000，10％SDS溶液)中，60℃预杂交1小时，然后加入上述标记的探针并使其终浓度为0.006pmol/ml，60℃杂交一晚。然后，在加温到60℃的洗涤液(2×SSC，0.1％SDS)中，60℃每次15分钟、共3次，将膜洗净。除去膜上的多余水分，然后在富士胶卷公司制成像板中感光20分钟，在BAS1000成像分析仪(富士胶卷公司制)上测定信号。然后收集本次操作中得到的与阳性信号相对应的主滤膜上的菌落(第一次筛选)。

将收集的菌落悬浮到含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，然后涂布到含100μg/ml氨苄青霉素的9.5×13.5cm LB琼脂培养皿上的尼龙膜上，制备每一块平皿形成约200-1000个菌落的主滤膜。用与第一次筛选同样的方法从该滤膜上筛选出阳性克隆，用同样的操作再进行3次筛选。3次筛选的结果，分离出含有神经酰胺酶基因的阳性克隆。

由该阳性克隆制备质粒，将之命名为质粒pLCDase。用多种限制酶或组合应用多种限制酶酶切该质粒，将生成的DNA片断进行亚克隆，分析其碱基序列。由此，确定插入到质粒pLCDase中的DNA片断的全部碱基序列。该序列示于序列表的序列号11中。另外，该序列中出现的开放阅读框架(Open reading frame，ORF)的碱基序列以及其编码的多肽的氨基酸序列分别示于序列表的序列号12和13中。上述DNA片断的限制酶谱图和该DNA片断中所含的开放阅读框架的位置如图2所示。

分析上述ORF的碱基序列时发现，它包含编码实施例2中确定的神经酰胺酶的部分氨基酸序列的碱基序列，这表明该ORF编码神经酰胺酶。另外，将该ORF编码的神经酰胺酶的氨基酸序列与序列表的序列号1所示的神经酰胺酶的氨基酸序列相比较时发现，从小鼠肝脏纯化的神经酰胺酶缺失了上述ORF编码的多肽中N末端部分的肽段。也就是说，神经酰胺酶翻译后，经过去除其N末端部分的加工过程转变为成熟型酶。序列表的序列号14中显示的是成熟型神经酰胺酶的氨基酸序列，序列表的序列号15中显示的是编码成熟型神经酰胺酶的碱基序列。实施例5神经酰胺酶基因的表达

通过将实施例4中得到的质粒pLCDase 1μg与脂转染胺试剂(LipofectAMINE，Life Technologies公司制)5μl加入到在直径35mm的含10％FCS的α-MEM培养基中培养的CHO细胞(3×10⁵细胞/平皿)中，把神经酰胺酶基因导入CHO细胞。将该细胞于37℃培养24小时后，悬浮到含0.1％Triton X-100的100μl 10mM Tris-HCl(pH7.5)中，并破碎细胞。以上述C12-NBD-神经酰胺为底物，测定所得细胞破碎液的神经酰胺酶活性。此时发现，与未导入pLCDase的对照细胞相比，该细胞中神经酰胺酶的表达增强约1000倍。

再按照分析生化(Analytical Biochemistry)，第244卷，第291-300页(1997)中所述的方法，测定细胞内的神经酰胺量。此时发现，导入了pLCDase的细胞与未导入的对照细胞相比，神经酰胺量显著性降低。实施例6从小鼠脑中克隆神经酰胺酶基因

将硝酸纤维素膜(Schleicher&Schuell公司，PROTRAN BA850.45mm，直径82mm)覆盖到含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上，并按每块平皿约20万个菌落将小鼠脑cDNA文库(LIFETECHNOLOGIES公司，SUPERSCRIPT Mouse Brain cDNA Library)涂布于10块平皿中，37℃培养10小时。将生长在硝酸纤维素膜上的大肠杆菌转移印迹到尼龙膜(PALL Gelman Laboratory公司，biodyneA，直径82mm(1.2mm))上，并分别铺到氨苄青霉素平皿上后，37℃培养3小时。将硝酸纤维素膜作为主滤膜于4℃保存，将尼龙膜铺到氯霉素平皿上，37℃培养16小时。将菌落从尼龙膜转移印迹到新的尼龙膜上，各组重叠的尼龙膜直接用1ml变性液(0.5M NaOH/1.5MNaCl)将表、里分别处理5分钟。同样在1ml中和液(0.5M Tris-HCl(pH7.4)/1.5M NaCl)中处理5分钟。分开尼龙膜，风干后，于80℃烤2小时。其后，在200ml预洗液(5×SSC/0.5％SDS/1mlEDTA(pH8.0))中振荡10分钟，拭去大肠杆菌的碎片，并用2×SSC洗涤。在40ml的杂交液(0.5M Church磷酸/7％SDS/1mM EDTA)中，65℃预杂交2小时后，在含有变性后的探针的40ml杂交液中，65℃杂交16小时。作为探针，使用含小鼠神经酰胺酶基因的质粒pAPLCD的2.7Kbp EcoR I-EcoR I片断。杂交结束后，用100ml洗涤液(40mMChurch磷酸/1％SDS)65℃洗涤2次，每次15分钟。再用100ml的High stringent洗涤液(0.2×SSC/0.1％SDS)65℃洗涤15分钟。将膜风干后，暴露到IP板1小时，随后用BAS1500进行分析。将阳性部分的硝酸纤维素膜切成直径约6mm，悬浮到1ml的LB培养基中，将4000倍稀释的样品200ml涂布到加入氨苄青霉素的LB培养皿上，进行第二次筛选。

同样，将阳性部分进行10000倍稀释的样品200ml涂布到加入氨苄青霉素的LB培养皿上，制备文库，并用该文库进行第三次筛选。将分离的克隆(pSBCD)进行亚克隆后，按常规方法测定碱基序列。其序列如序列号16所示。

可以看到上述序列中与实施例4中所述的小鼠肝脏来源的神经酰胺酶基因具有相同的序列的ORF，但5′非翻译区域和3′非翻译区域的序列与小鼠肝脏来源的有所不同。另外，将分离的质粒pSBCD与实施例5同样导入CHO细胞时，可以确认该细胞中有神经酰胺酶的表达。实施例7人神经酰胺酶基因的基因组克隆

以实施例4确定的小鼠肝脏来源的神经酰胺酶基因的序列为基础，合成具有序列表的序列号17所示碱基序列的正向引物U1107和具有序列表的序列号18所示碱基序列的反向引物L1311。U1107引物的序列相当于序列表的序列号12中碱基序号1107-1130的序列，L1311引物的序列相当于与序列号12中碱基序号1311-1334的序列相互补的碱基序列。

用常规方法从人肝癌细胞Huh7纯化基因组DNA。以所得625ng基因组DNA为模板，用U1107引物和L1311引物进行PCR。PCR反应条件是在94℃9分钟后，以94℃0.5分钟、55℃0.5分钟、72℃3分钟为一个循环，进行40个循环，再于72℃保温7分钟。所得反应物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明，通过PCR可扩增出大约2Kbp的DNA片断。

用Sephaglas(Pharmacia公司制)从胶中回收该DNA片断，将所得DNA片断整合到pGEM-T easy载体(Promega公司制)中，构建重组质粒。然后，确定所得质粒中插入DNA片断的碱基序列。上述序列相当于GenBank数据库中登录的Accession NO.AC012131 Complement的96289-98478序列。另外，对该序列编码的氨基酸序列进行分析时发现，该序列中具有编码与序列表的序列号4中所示小鼠肝脏来源的神经酰胺酶氨基酸序列中氨基酸序号370-444区域具有同源性的氨基酸序列的区域。

另外，AC012131与实施例4中确定的小鼠肝脏来源的神经酰胺酶基因也有同源性。

序列表说明

序列号1中所示的序列中氨基酸序号7、9和13的Xaa表示未知的氨基酸。

序列号4是用作引物的合成寡核苷酸序列。其中，碱基序号6、9和15的n表示G、A、T或C。

序列号5是用作引物的合成寡核苷酸序列。其中，碱基序号3、6和15的n表示G、A、T或C。

序列号7是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号8是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号9是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号10是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号11是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号17是用作引物的合成寡核苷酸序列。

序列号18是用作引物的合成寡核苷酸序列。产业上的实用性

本发明提供编码哺乳类来源的中性/碱性神经酰胺酶的基因，另外还提供应用该基因的神经酰胺酶基因工程学制备方法。本发明的寡核苷酸探针和引物可用于检测上述基因，也可应用于生物体内神经酰胺代谢研究等方面。再者，本发明提供本发明基因的反义核酸(DNA、RNA)。该基因及其反义核酸可用于调控生物体内的神经酰胺酶活性，及可用于神经酰胺代谢系统的调节，还提供可用于因神经酰胺量异常引起的疾病的治疗等的神经酰胺量的调节方法。

序列表<110>宝酒造株式会社<120>神经酰胺酶基因<130>00-011-PCT<140>JP 11/84743<141>1999-3-26<160>18<210>1<211>21<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>7，9，13<223>Xaa为未知的氨基酸<400>1Phe Ser Gly Tyr Tyr Ile Xaa Val Xaa Arg Ala Asp Xaa Thr Gly1 5 10 15Lys Val Asn Asp Ile Asn

20<210>2<211>10<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>9<223>Xaa为未知的氨基酸<400>2Ala Ile Ala Thr Asp Thr Val Ala Xaa Met1 5 10<210>3<211>35<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>29，30<223>Xaa为未知的氨基酸<400>3Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Gly Pro Phe Val Asn Gly Phe Ala Ser1 5 10 15Ser Asn Leu Gly Asp Val Ser Pro Asn Ile Leu Gly Pro Xaa Xaa

20 25 30Val Asn Thr Gly Glu

35<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<220><222>6，9，15<223>”n”为G、A、T或C<400>4carggnccnt tygtngc 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<220><222>3，6，15<223>“n”为G、A、T或C<400>5ggnccnagda trttngg 17<210>6<211>38<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>6gcaggctttg cttcatcaaa tctcggagac gtgtcacc 38<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>7ttgatgaagc aaagcctgc 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>8ggtgacacgt ctccgagat 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>9taatacgact cactataggg 20<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>10tctgctctaa aagctgc 17<210>11<211>3108<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>11cctgcgccac ttctctctcc cggctcaatc gcggagcctt ttctctcccc cgtctcgccg 60ctgccgccat ctccacccct gcctgcccca ggggtctgtg gacgcccggg cagagagcaa 120gcaccgagct gggcctgctg gagaccggag accagcggcc cgcccgcccg cccgctgcga 180gcctcctgag cagctccgga acagcttact ttctgtttcc atctctttcg gaccgggttg 240gcctctccaa aagccacttc tcctaactct tatcaaggtt caaaggctaa aggtctgtac 300acatgagtgc tggtgtgctt agaggcatcg ggtccctttc agctggagtt gcagtacttg 360tgagtgccat ggaatccaaa ttcggcaaga gatacaatct aaactctcaa ctactccaga 420ttcaaggttc acctcacttt ctggttacca aaggagcttt gcggggccgc tctgacatcc 480agtagatttg gaaacacatt gagaaatcag cctgagcaac ctgcaaggca caaggcacaa 540gattctgcat ggttatttgc tctcccagga ggtgaacact tgttttgatt cacagagtca 600gggttgagat gcccagttgt tcctcatctt ggctcagaag aagcacctag gaataaaagc 660tctaagctgg tattaagtag aatgggctta aagtccacta caggaaacaa cagctagtga 720cagaaatggc aaagcgaacc ttctccacct tggaggcatt cctcattttc cttctggtaa 780taatgacagt catcacagtg gcccttctca ccctcttgtt tgttaccagt gggaccattg 840aaaaccacaa agattcagga aatcactggt tttcaaccac tctgggctcc acgacaaccc 900agccccctcc aattacacag actccaaact tcccttcatt tcggaacttc agtggctact 960acattggcgt tgggagagcg gattgcacag gacaagtgtc agatatcaat ttgatgggct 1020atggcaaaaa tggccagaat gcacggggtc tcctcaccag gctgttcagc cgtgctttta 1080tcttggcgga tccagatggg tcaaatcgaa tggcatttgt gagcgtggaa ctatgtatga 1140tttcccaacg actgaggttg gaggtcctga agagactaga gagtaaatat ggctctctgt 1200atcgaagaga caatgttatc ctgagtgcca ttcacacaca ctctggccca gcagggtttt 1260tccaatatac actctatata ctcgccagcg agggattcag caaccggacc tttcagtaca 1320tagtctctgg gatcatgaag agcattgata tagctcacac aaatcttaaa ccaggcaaaa 1380tctttatcaa caaaggaaat gttgctaatg tgcagatcaa ccgaagcccc tcctcttacc 1440ttctgaatcc acagtcagag agagcaaggt attcttcaaa cacagacaag gaaatgctgg 1500tcttgaaact ggtggatttg aatggagaag acttgggtct tatcagctgg tttgccatcc 1620accccgtgag catgaacaat agcaaccact ttgtgaatag tgacaatatg ggctatgcgg 1620cttacctttt tgagcaagaa aagaacaaag gctatctgcc tggacaggga ccgtttgtag 1680caggctttgc ttcatcaaat ctcggagacg tgtcacccaa cattcttggc ccgcattgtg 1740tcaacacagg ggagtcttgt gacaacgaca agagcacctg tcccaacggt gggcctagca 1800tgtgcatggc cagcggacct ggacaagaca tgtttgagag cacacacatt ataggacgga 1860tcatctatca gaaggccaag gagctgtatg cctctgcctc ccaggaggtg accggcccag 1920tgcttgcagc tcaccagtgg gtgaacatga cagatgtgag cgtccagctc aatgccacac 1980acacagtgaa gacgtgtaaa cctgccctgg gctacagttt tgccgcaggc acaattgatg 2040gagtttcggg cctcaatatt acacagggaa ctacggaagg ggatccattc tgggacactc 2100ttcgggacca gctcttggga aaaccatctg aagagattgt agagtgtcag aaacccaaac 2160caatcctgct tcacagtgga gagctgacga taccacatcc ttggcaacca gatattgttg 2220atgttcagat tgttaccgtt gggtccttgg ccatagctgc tatccctggg gaattaacaa 2280ccatgtcggg acgaagattt cgtgaggcaa ttaaaaaaga atttgcactt tatgggatga 2340aggatatgac cgttgttatc gcaggtctaa gcaatgttta tacacattac attaccacat 2400atgaagaata ccaggctcag cggtacgagg cagcatctac aatctatgga ccacacaccc 2460tgtctgcata catccaactc ttcagagacc ttgctaaggc aattgctacg gacacagtag 2520ccaacatgag cagtggtccc gagcctccat tcttcaaaaa tctaatagct tcacttattc 2580ctaatattgc ggatagagca ccaattggca aacattttgg ggatgtcttg cagccagcaa 2640aacctgaata cagagtggga gaagtggttg aagttatatt tgtaggcgct aacccaaaga 2700attcagcaga gaaccagacc catcaaacct tcctcactgt ggagaaatac gaggactctg 2760tagctgactg gcagataatg tataacgatg cctcctggga gacgaggttt tattggcaca 2820aaggaatact gggtctgagc aatgcaacaa tatactggca tattccagat actgcctacc 2880ctggaatcta cagaataaga tattttggac acaatcggaa gcaggaactt ctgaaacccg 2940ctgtcatact agcatttgaa ggaatttctt ctccttttga agttgtcact acttagtgaa 3000aagttgacag atattgaaga aaagcttttc tctgtgcaca ttatagagtg aattcacaaa 3060aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3108<210>12<211>2271<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>12atggcaaagc gaaccttctc caccttggag gcattcctca ttttccttct ggtaataatg 60acagtcatca cagtggccct tctcaccctc ttgtttgtta ccagtgggac cattgaaaac 120cacaaagatt caggaaatca ctggttttca accactctgg gctccacgac aacccagccc 180cctccaatta cacagactcc aaacttccct tcatttcgga acttcagtgg ctactacatt 240ggcgttggga gagcggattg cacaggacaa gtgtcagata tcaatttgat gggctatggc 300aaaaatggcc agaatgcacg gggtctcctc accaggctgt tcagccgtgc ttttatcttg 360gcggatccag atgggtcaaa tcgaatggca tttgtgagcg tggaactatg tatgatttcc 420caacgactga ggttggaggt cctgaagaga ctagagagta aatatggctc tctgtatcga 480agagacaatg ttatcctgag tgccattcac acacactctg gcccagcagg gtttttccaa 540tatacactct atatactcgc cagcgaggga ttcagcaacc ggacctttca gtacatagtc 600tctgggatca tgaagagcat tgatatagct cacacaaatc ttaaaccagg caaaatcttt 660atcaacaaag gaaatgttgc taatgtgcag atcaaccgaa gcccctcctc ttaccttctg 720aatccacagt cagagagagc aaggtattct tcaaacacag acaaggaaat gctggtcttg 780aaactggtgg atttgaatgg agaagacttg ggtcttatca gctggtttgc catccacccc 840gtgagcatga acaatagcaa ccactttgtg aatagtgaca atatgggcta tgcggcttac 900ctttttgagc aagaaaagaa caaaggctat ctgcctggac agggaccgtt tgtagcaggc 960tttgcttcat caaatctcgg agacgtgtca cccaacattc ttggcccgca ttgtgtcaac 1020acaggggagt cttgtgacaa cgacaagagc acctgtccca acggtgggcc tagcatgtgc 1080atggccagcg gacctggaca agacatgttt gagagcacac acattatagg acggatcatc 1140tatcagaagg ccaaggagct gtatgcctct gcctcccagg aggtgaccgg cccagtgctt 1200gcagctcacc agtgggtgaa catgacagat gtgagcgtcc agctcaatgc cacacacaca 1260gtgaagacgt gtaaacctgc cctgggctac agttttgccg caggcacaat tgatggagtt 1320tcgggcctca atattacaca gggaactacg gaaggggatc cattctggga cactcttcgg 1380gaccagctct tgggaaaacc atctgaagag attgtagagt gtcagaaacc caaaccaatc 1440ctgcttcaca gtggagagct gacgatacca catccttggc aaccagatat tgttgatgtt 1500cagattgtta ccgttgggtc cttggccata gctgctatcc ctggggaatt aacaaccatg 1620tcgggacgaa gatttcgtga ggcaattaaa aaagaatttg cactttatgg gatgaaggat 1620atgaccgttg ttatcgcagg tctaagcaat gtttatacac attacattac cacatatgaa 1680gaataccagg ctcagcggta cgaggcagca tctacaatct atggaccaca caccctgtct 1740gcatacatcc aactcttcag agaccttgct aaggcaattg ctacggacac agtagccaac 1800atgagcagtg gtcccgagcc tccattcttc aaaaatctaa tagcttcact tattcctaat 1860attgcggata gagcaccaat tggcaaacat tttggggatg tcttgcagcc agcaaaacct 1920gaatacagag tgggagaagt ggttgaagtt atatttgtag gcgctaaccc aaagaattca 1980gcagagaacc agacccatca aaccttcctc actgtggaga aatacgagga ctctgtagct 2040gactggcaga taatgtataa cgatgcctcc tgggagacga ggttttattg gcacaaagga 2100atactgggtc tgagcaatgc aacaatatac tggcatattc cagatactgc ctaccctgga 2160atctacagaa taagatattt tggacacaat cggaagcagg aacttctgaa acccgctgtc 2220atactagcat ttgaaggaat ttcttctcct tttgaagttg tcactactta g 2271<210>13<211>756<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<400>13Met Ala Lys Arg Thr Phe Ser Thr Leu Glu Ala Phe Leu Ile Phe1 5 10 15Leu Leu Val Ile Met Thr Val Ile Thr Val Ala Leu Leu Thr Leu

20 25 30Leu Phe Val Thr Ser Gly Thr Ile Glu Asn His Lys Asp Ser Gly

35 40 45Asn His Trp Phe Ser Thr Thr Leu Gly Ser Thr Thr Thr Gln Pro

50 55 60Pro Pro Ile Thr Gln Thr Pro Asn Phe Pro Ser Phe Arg Asn Phe

65 70 75Ser Gly Tyr Tyr Ile Gly Val Gly Arg Ala Asp Cys Thr Gly Gln

80 85 90Val Ser Asp Ile Asn Leu Met Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Gln Asn

95 100 105Ala Arg Gly Leu Leu Thr Arg Leu Phe Ser Arg Ala Phe Ile Leu

110 115 120Ala Asp Pro Asp Gly Ser Asn Arg Met Ala Phe Val Ser Val Glu

125 130 135Leu Cys Met Ile Ser Gln Arg Leu Arg Leu Glu Val Leu Lys Arg

140 145 150Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Arg Arg Asp Asn Val Ile

155 160 165Leu Ser Ala Ile His Thr His Ser Gly Pro Ala Gly Phe Phe Gln

170 175 180Tyr Thr Leu Tyr Ile Leu Ala Ser Glu Gly Phe Ser Asn Arg Thr

185 190 195Phe Gln Tyr Ile Val Ser Gly Ile Met Lys Ser Ile Asp Ile Ala

200 205 210His Thr Asn Leu Lys Pro Gly Lys Ile Phe Ile Asn Lys Gly Asn

215 220 225Val Ala Asn Val Gln Ile Asn Arg Ser Pro Ser Ser Tyr Leu Leu

230 235 240Asn Pro Gln Ser Glu Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Asp Lys

245 250 255Glu Met Leu Val Leu Lys Leu Val Asp Leu Asn Gly Glu Asp Leu

260 265 270Gly Leu Ile Ser Trp Phe Ala Ile His Pro Val Ser Met Asn Asn

275 280 285Ser Asn His Phe Val Asn Ser Asp Asn Met Gly Tyr Ala Ala Tyr

290 295 300Leu Phe Glu Gln Glu Lys Asn Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Gly

305 310 315Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala Ser Ser Asn Leu Gly Asp Val Ser

320 325 330Pro Asn Ile Leu Gly Pro His Cys Val Asn Thr Gly Glu Ser Cys

335 340 345Asp Asn Asp Lys Ser Thr Cys Pro Asn Gly Gly Pro Ser Met Cys

350 355 360Met Ala Ser Gly Pro Gly Gln Asp Met Phe Glu Ser Thr His Ile

365 370 375Ile Gly Arg Ile Ile Tyr Gln Lys Ala Lys Glu Leu Tyr Ala Ser

380 385 390Ala Ser Gln Glu Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Ala His Gln Trp

395 400 405Val Asn Met Thr Asp Val Ser Val Gln Leu Asn Ala Thr His Thr

410 415 420Val Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Phe Ala Ala Gly

425 430 435Thr Ile Asp Gly Val Ser Gly Leu Asn Ile Thr Gln Gly Thr Thr

440 445 450Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gln Leu Leu Gly

455 460 465Lys Pro Ser Glu Glu Ile Val Glu Cys Gln Lys Pro Lys Pro Ile

470 475 480Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr Ile Pro His Pro Trp Gln Pro

485 490 495Asp Ile Val Asp Val Gln Ile Val Thr Val Gly Ser Leu Ala Ile

500 505 510Ala Ala Ile Pro Gly Glu Leu Thr Thr Met Ser Gly Arg Arg Phe

515 520 525Arg Glu Ala Ile Lys Lys Glu Phe Ala Leu Tyr Gly Met Lys Asp

530 535 540Met Thr Val Val Ile Ala Gly Leu Ser Asn Val Tyr Thr His Tyr

545 550 555Ile Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Gln Ala Gln Arg Tyr Glu Ala Ala

560 565 570Ser Thr Ile Tyr Gly Pro His Thr Leu Ser Ala Tyr Ile Gln Leu

575 580 585Phe Arg Asp Leu Ala Lys Ala Ile Ala Thr Asp Thr Val Ala Asn

590 595 600Met Ser Ser Gly Pro Glu Pro Pro Phe Phe Lys Asn Leu Ile Ala

605 610 615Ser Leu Ile Pro Asn Ile Ala Asp Arg Ala Pro Ile Gly Lys His

620 625 630Phe Gly Asp Val Leu Gln Pro Ala Lys Pro Glu Tyr Arg Val Gly

635 640 645Glu Val Val Glu Val Ile Phe Val Gly Ala Asn Pro Lys Asn Ser

650 655 660Ala Glu Asn Gln Thr His Gln Thr Phe Leu Thr Val Glu Lys Tyr

665 670 675Glu Asp Ser Val Ala Asp Trp Gln Ile Met Tyr Asn Asp Ala Ser

680 685 690Trp Glu Thr Arg Phe Tyr Trp His Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser

695 700 705ASn Ala Thr Ile Tyr Trp His Ile Pro Asp Thr Ala Tyr Pro Gly

710 715 720Ile Tyr Arg Ile Arg Tyr Phe Gly His Asn Arg Lys Gln Glu Leu

725 730 735Leu Lys Pro Ala Val Ile Leu Ala Phe Glu Gly Ile Ser Ser Pro

740 745 750Phe Glu Val Val Thr Thr

755<210>14<211>682<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<400>14Phe Ser Gly Tyr Tyr Ile Gly Val Gly Arg Ala Asp Cys Thr Gly1 5 10 15Gln Val Ser Asp Ile Asn Leu Met Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Gln

20 25 30Asn Ala Arg Gly Leu Leu Thr Arg Leu Phe Ser Arg Ala Phe Ile

35 40 45Leu Ala Asp Pro Asp Gly Ser Asn Arg Met Ala Phe Val Ser Val

50 55 60Glu Leu Cys Met Ile Ser Gln Arg Leu Arg Leu Glu Val Leu Lys

65 70 75Arg Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Arg Arg Asp Asn Val

80 85 90Ile Leu Ser Ala Ile His Thr His Ser Gly Pro Ala Gly Phe Phe

95 100 105Gln Tyr Thr Leu Tyr Ile Leu Ala Ser Glu Gly Phe Ser Asn Arg

110 115 120Thr Phe Gln Tyr Ile Val Ser Gly Ile Met Lys Ser Ile Asp Ile

125 130 135Ala His Thr Asn Leu Lys Pro Gly Lys Ile Phe Ile Asn Lys Gly

140 145 150Asn Val Ala Asn Val Gln Ile Asn Arg Ser Pro Ser Ser Tyr Leu

155 160 165Leu Asn Pro Gln Ser Glu Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Asp

170 175 180Lys Glu Met Leu Val Leu Lys Leu Val Asp Leu Asn Gly Glu Asp

185 190 195Leu Gly Leu Ile Ser Trp Phe Ala Ile His Pro Val Ser Met Asn

200 205 210Asn Ser Asn His Phe Val Asn Ser Asp Asn Met Gly Tyr Ala Ala

215 220 225Tyr Leu Phe Glu Gln Glu Lys Asn Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gln

230 235 240Gly Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala Ser Ser Asn Leu Gly Asp Val

245 250 255Ser Pro Asn Ile Leu Gly Pro His Cys Val Asn Thr Gly Glu Ser

260 265 270Cys Asp Asn Asp Lys Ser Thr Cys Pro Asn Gly Gly Pro Ser Met

275 280 285Cys Met Ala Ser Gly Pro Gly Gln Asp Met Phe Glu Ser Thr His

290 295 300Ile Ile Gly Arg Ile Ile Tyr Gln Lys Ala Lys Glu Leu Tyr Ala

305 310 315Ser Ala Ser Gln Glu Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Ala His Gln

320 325 330Trp Val Asn Met Thr Asp Val Ser Val Gln Leu Asn Ala Thr His

335 340 345Thr Val Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Phe Ala Ala

350 355 360Gly Thr Ile Asp Gly Val Ser Gly Leu Asn Ile Thr Gln Gly Thr

365 370 375Thr Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gln Leu Leu

380 385 390Gly Lys Pro Ser Glu Glu Ile Val Glu Cys Gln Lys Pro Lys Pro

395 400 405Ile Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr Ile Pro His Pro Trp Gln

410 415 420Pro Asp Ile Val Asp Val Gln Ile Val Thr Val Gly Ser Leu Ala

425 430 435Ile Ala Ala Ile Pro Gly Glu Leu Thr Thr Met Ser Gly Arg Arg

440 445 450Phe Arg Glu Ala Ile Lys Lys Glu Phe Ala Leu Tyr Gly Met Lys

455 460 465Asp Met Thr Val Val Ile Ala Gly Leu Ser Asn Val Tyr Thr His

470 475 480Tyr Ile Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Gln Ala Gln Arg Tyr Glu Ala

485 490 495Ala Ser Thr Ile Tyr Gly Pro His Thr Leu Ser Ala Tyr Ile Gln

500 505 510Leu Phe Arg Asp Leu Ala Lys Ala Ile Ala Thr Asp Thr Val Ala

515 520 525Asn Met Ser Ser Gly Pro Glu Pro Pro Phe Phe Lys Asn Leu Ile

530 535 540Ala Ser Leu Ile Pro Asn Ile Ala Asp Arg Ala Pro Ile Gly Lys

545 550 555His Phe Gly Asp Val Leu Gln Pro Ala Lys Pro Glu Tyr Arg Val

560 565 570Gly Glu Val Val Glu Val Ile Phe Val Gly Ala Asn Pro Lys Asn

575 580 585Ser Ala Glu Asn Gln Thr His Gln Thr Phe Leu Thr Val Glu Lys

590 595 600Tyr Glu Asp Ser Val Ala Asp Trp Gln Ile Met Tyr Asn Asp Ala

605 610 615Ser Trp Glu Thr Arg Phe Tyr Trp His Lys Gly Ile Leu Gly Leu

620 625 630Ser Asn Ala Thr Ile Tyr Trp His Ile Pro Asp Thr Ala Tyr Pro

635 640 645Gly Ile Tyr Arg Ile Arg Tyr Phe Gly His Asn Arg Lys Gln Glu

650 655 660Leu Leu Lys Pro Ala Val Ile Leu Ala Phe Glu Gly Ile Ser Ser

665 670 675Pro Phe Glu Val Val Thr Thr

680<210>15<211>2049<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400> 15ttcagtggct actacattgg cgttgggaga gcggattgca caggacaagt gtcagatatc 60aatttgatgg gctatggcaa aaatggccag aatgcacggg gtctcctcac caggctgttc 120agccgtgctt ttatcttggc ggatccagat gggtcaaatc gaatggcatt tgtgagcgtg 180gaactatgta tgatttccca acgactgagg ttggaggtcc tgaagagact agagagtaaa 240tatggctctc tgtatcgaag agacaatgtt atcctgagtg ccattcacac acactctggc 300ccagcagggt ttttccaata tacactctat atactcgcca gcgagggatt cagcaaccgg 360acctttcagt acatagtctc tgggatcatg aagagcattg atatagctca cacaaatctt 420aaaccaggca aaatctttat caacaaagga aatgttgcta atgtgcagat caaccgaagc 480ccctcctctt accttctgaa tccacagtca gagagagcaa ggtattcttc aaacacagac 540aaggaaatgc tggtcttgaa actggtggat ttgaatggag aagacttggg tcttatcagc 600tggtttgcca tccaccccgt gagcatgaac aatagcaacc actttgtgaa tagtgacaat 660atgggctatg cggcttacct ttttgagcaa gaaaagaaca aaggctatct gcctggacag 720ggaccgtttg tagcaggctt tgcttcatca aatctcggag acgtgtcacc caacattctt 780ggcccgcatt gtgtcaacac aggggagtct tgtgacaacg acaagagcac ctgtcccaac 840ggtgggccta gcatgtgcat ggccagcgga cctggacaag acatgtttga gagcacacac 900attataggac ggatcatcta tcagaaggcc aaggagctgt atgcctctgc ctcccaggag 960gtgaccggcc cagtgcttgc agctcaccag tgggtgaaca tgacagatgt gagcgtccag 1020ctcaatgcca cacacacagt gaagacgtgt aaacctgccc tgggctacag ttttgccgca 1080ggcacaattg atggagtttc gggcctcaat attacacagg gaactacgga aggggatcca 1140ttctgggaca ctcttcggga ccagctcttg ggaaaaccat ctgaagagat tgtagagtgt 1200cagaaaccca aaccaatcct gcttcacagt ggagagctga cgataccaca tccttggcaa 1260ccagatattg ttgatgttca gattgttacc gttgggtcct tggccatagc tgctatccct 1320ggggaattaa caaccatgtc gggacgaaga tttcgtgagg caattaaaaa agaatttgca 1380ctttatggga tgaaggatat gaccgttgtt atcgcaggtc taagcaatgt ttatacacat 1440tacattacca catatgaaga ataccaggct cagcggtacg aggcagcatc tacaatctat 1500ggaccacaca ccctgtctgc atacatccaa ctcttcagag accttgctaa ggcaattgct 1620acggacacag tagccaacat gagcagtggt cccgagcctc cattcttcaa aaatctaata 1620gcttcactta ttcctaatat tgcggataga gcaccaattg gcaaacattt tggggatgtc 1680ttgcagccag caaaacctga atacagagtg ggagaagtgg ttgaagttat atttgtaggc 1740gctaacccaa agaattcagc agagaaccag acccatcaaa ccttcctcac tgtggagaaa 1800tacgaggact ctgtagctga ctggcagata atgtataacg atgcctcctg ggagacgagg 1860ttttattggc acaaaggaat actgggtctg agcaatgcaa caatatactg gcatattcca 1920gatactgcct accctggaat ctacagaata agatattttg gacacaatcg gaagcaggaa 1980cttctgaaac ccgctgtcat actagcattt gaaggaattt cttctccttt tgaagttgtc 2040actacttag 2049<210>16<211>4835<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>16cctgcagcgg tgttctgaag agccgggcag aggatacaca agcatcccag caggcactct 60ggtttgcccg tgaacgatag atatgcgggg gtttgaatga gcagctgcag cagcgggttt 120gggtctgtac acatgagtgc tggtgtgctt agaggcatcg ggtccctttc agctggagtt 180gcagtacttg tgagtgccat atttggaaac acattgagaa atcagcctga gcaacctgca 240aggcacaagg cacaagattc tgcatggtta tttgctctcc caggaggtga acacttgttt 300tgattaacag agtcagggtt gagatgccca gttgttcctc atcttggctc agaagaagca 360cctaggaata aaagctctaa gctggtatta agtagaatgg gcttaaagtc cactacagga 420aacaacagct agtgacagaa atggcaaagc gaaccttctc caccttggag gcattcctca 480ttttccttct ggtaataatg acagtcatca cagtggccct tctcaccctc ttgtttgtta 540ccagtgggac cattgaaaac cacaaagatt caggaaatca ctggttttca accactctgg 600gctccacgac aacccagccc cctccaatta cacagactcc aaacttccct tcatttcgga 660acttcagtgg ctactacatt ggcgttggga gagcagattg cacaggacaa gtgtcagata 720tcaatttgat gggctatggc aaaaatggcc agaatgcacg gggtctcctc accaggctgt 780tcagccgtgc ttttatcttg gcggatccag atgggtcaaa tcgaatggca tttgtgagcg 840tggaactatg tatgatttcc caacgactga ggttggaggt cctgaagaga ctagagagta 900aatatggctc tctgtatcga agagacaatg ttatcctgag tgccattcac acacactctg 960gcccagcagg gtttttccaa tatacactct atatactcgc cagcgaggga ttcagcaacc 1020ggacctttca gtacatagtc tctgggatca tgaagagcat tgatatagct cacacaaatc 1080ttaaaccagg caaaatcttt atcaacaaag gaaatgttgc taatgtgcag atcaaccgaa 1140gcccctcctc ttaccttctg aatccacagt cagagagagc aaggtattct tcaaacacag 1200acaaggaaat gctggtcttg aaactggtgg atttgaatgg agaagacttg ggtcttatca 1260gctggtttgc catccacccc gtgagcatga acaatagcaa ccactttgtg aatagtgaca 1320atatgggcta tgcggcttac ctttttgagc aagaaaagaa caaaggctat ctgcctggac 1380agggaccgtt tgtagcaggc tttgcttcat caaatctcgg agacgtgtca cccaacattc 1440ttggcccgca ttgtgtcaac acaggggagt cttgtgacaa cgacaagagc acctgtccca 1500acggtgggcc tagcatgtgc atggccagcg gacctggaca agacatgttt gagagcacac 1560acattatagg acggatcatc tatcagaagg ccaaggagct gtatgcctct gcctcccagg 1620aggtgaccgg cccagtgctt gcagctcacc agtgggtgaa catgacagat gtgagcgtcc 1680agctcaatgc cacacacaca gtgaagacgt gtaaacctgc cctgggctac agttttgccg 1740caggcacaat tgatggagtt tcgggcctca atattacaca gggaactacg gaaggggatc 1800cattctggga cactcttcgg gaccagctct tgggaaaacc atctgaagag attgtagagt 1860gtcagaaacc caaaccaatc ctgcttcaca gtggagagct gacgatacca catccttggc 1920aaccagatat tgttgatgtt cagattgtta ccgttgggtc cttggccata gctgctatcc 1980ctggggaatt aacaaccatg tcgggacgaa gatttcgtga ggcaattaaa aaagaatttg 2040cactttatgg gatgaaggat atgaccgttg ttatcgcagg tctaagcaat gtttatacac 2100attacattac cacatatgaa gaataccagg ctcagcggta cgaggcagca tctacaatct 2160atggaccaca caccctgtct gcatacatcc aactcttcag agaccttgct aaggcaattg 2220ctacggacac agtagccaac atgagcagtg gtcccgagcc tccattcttc aaaaatctaa 2280tagcttcact tattcctaat attgcggata gagcaccaat tggcaaacat tttggggatg 2340tcttgcagcc agcaaaacct gaatacagag tgggagaagt ggttgaagtt atatttgtag 2400gcgctaaccc aaagaattca gcagagaacc agacccatca aaccttcctc actgtggaga 2460aatacgagga ctctgtagct gactggcaga taatgtataa cgatgcctcc tgggagacga 2520ggttttattg gcacaaagga atactgggtc tgagcaatgc aacaatatac tggcatattc 2580cagatactgc ctaccctgga atctacagaa taagatattt tggacacaat cggaagcagg 2640aacttctgaa acccgctgtc atactagcat ttgaaggaat ttcttctcct tttgaagttg 2700tcactactta gtgaaaagtt gacagatatt gaagaaaagc ttttctctgt gcacattata 2760gagtgaattc acacaaatgt gaactgccag tttaatttct gtaattgtct ctgtttgggg 2820gacaggtcat ttattgctaa tgggacagag gtatgtgttt gtgttgttgt atgattatga 2880gtatgcatgc taacaggaag agagagggag gagggaggga ggagggggag ggagggaaga 2940aaggagggag agagagagtg agagaataga agagagagtg agagagaaag agttattagt 3000gagcaagaga atatgagaga agggccactg acaaccaaat accttgtgat ctttatccta 3060aagcatgatt ttccttgaag ctctgtggtt gtttaagaga taattccctc taatatgaaa 3120tccctgaaat ataatgacag tatttgaaga tatgtgaata atgtttatcc tatttattta 3180tagacttact aaatgagaac actagagaac tttctagaag tcctctagaa tgatacttga 3240ttttacagag aggaaaagga gctttgattc tctttaggtt agaataaggt tagtatattt 3300ttccctagtc atatttacaa aataccatgt aactttacta caaatatttg agcccagcta 3360aaatataccc agaaaattag cataccagtt ttgttttgtt ttattttgtt tttgcatcca 3420aacaagcata gtccttctga taagtcactt tagaatggat ctgcctggct cagggttatt 3480gttcatgctc agatcatttc cgcaattacc tccagagtcc aactatgcga atgtcacttg 3540cagtgctttg atttatgcct tgtattcctc aaagtgtcct tatcctgcta agtcacacct 3600cttcctccca gcatttactc taaatgattt ttaatgtttt cgccaatcaa atgtacctca 3660cattacaaag ctttgccttg aatgtagatt tttaaaacaa aagtgttaag gctggaaatg 3720tagttatcaa agaggaagtt ttaaatgtat ctgttctttt atcagctact ccctccctca 3780tggctccctt gaatcactga atagttattt aaacccacat atccaatatg gtactcattc 3840ctgggtcttc acaattacag acatcatatc gaaatgattg ggctgacaat tcctttgaag 3900gacaaagtaa atatttaatg agaaatatag attctggaga ggcatttgaa aatcacaaat 3960gttacgcctc catttcctgt tttccaggct gggtgttctg atttgggagg aaagcagccc 4020caaataattt ttaaatatga atctgaaaat aatgttttag aaattatgat ctcgacagtc 4080taattaatga gaattgtctg aaagtcctag ctgcatttaa aattatgtaa gttaactaaa 4140gccaattttt gaaccccagt cataattgtg taggtaggta aaaagagcat tttaggagga 4200aaccgaactt catttcaaga ctgaatctgt tttaaaagaa caatagtggt aaggtaaatc 4260ttcatttatt tccctatggt ttacctattt aaacatcgaa gattgaatca aaaggcacct 4320ggagcatatt ttggtaactc catttcccac ttggtagttc tatggatgct aactgctgaa 4380gaataaactg atcgggattt tcaagggttg tgaacatgtc tcctgatggg aataccgtat 4440taagtataaa ggttcaaaat agttgatctc aaaactatac acacacacac aatatatata 4500tatatacaca cacacacatg tacacacaca cacacatgca catacacatg gtattgttta 4560aaatttattt ctcatgactt agaacaatat aaggattata caaggattca tttcccacca 4620tcattcctcc cagtgaagct tttctcaaag tctgagtagg agtttctcct ttctcactgg 4680taactatccc acagtggcca ttacatcact agtaatcggt gtgcccagcc ctgcatggaa 4740ataaatcaca gaaacataat ttcccagtag acttagtctc ttcaagcctg tgtgcttcta 4800gtgtataaaa tctgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4835<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>17gtttgagagc acacacatta tagg 24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>18atattgaggc ccgaaactcc atca 24

Claims

1.一种基因，其核酸的碱基序列选自下列核酸构成的组：

(A)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列、且具有神经酰胺酶活性；

(B)一种核酸，它具有序列表的序列号15中所述的碱基序列或其一部分序列、且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；

(C)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14所述的氨基酸序列中至少1个氨基酸残基发生缺失、添加、插入或置换的氨基酸序列、且具有神经酰胺酶活性；

(D)一种核酸，它具有序列表的序列号15所述的碱基序列中至少1个碱基发生缺失、添加、插入或置换的碱基序列、且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；以及，

(F)一种核酸，通过密码子的简并性与上述(A)-(E)任一项所述的核酸具有不同的碱基序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的基因，其编码的多肽的神经酰胺酶活性可通过以下步骤进行检测：

(a)将基因的表达产物在反应混和液中，37℃温育30分钟，使之反应的步骤；以及，

(b)检测所得反应物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步骤；

上述反应混合液的组成为，在20μl 25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，含有550pmol的C12-NBD-神经酰胺及1.0％(W/V)胆酸钠。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其编码的多肽至少具有以下性质：

(i)作用：水解神经酰胺生成鞘氨基醇碱和脂肪酸；

(ii)底物特异性：水解N-酰基神经鞘氨醇，对半乳糖基神经酰胺、硫苷脂、GM1a、神经鞘磷脂无作用；

(iii)最适pH：7.0-8.0；

(iv)在含0.1％Polidocanol的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，37℃处理24小时时，未见活性下降；但60℃处理1小时时，活性降低到处理前的约30％左右。

4.一种重组DNA，它含有权利要求1-3任一项中所述的基因。

5.一种微生物、动物细胞或植物细胞用表达载体，它含有权利要求1-3任一项中所述的基因或权利要求4中所述的重组DNA。

6.一种转化体，它携有权利要求5中所述的表达载体。

7.一种具有神经酰胺酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，在适于神经酰胺酶基因表达、且适于生产该基因编码的多肽的条件下培养权利要求6中所述的转化体，从所得培养物中提取具有神经酰胺酶活性的多肽。

8.一种多肽，它具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且具有神经酰胺酶活性。

9.一种多肽，它由权利要求1-3任一项中所述的基因编码，且具有神经酰胺酶活性。

10.根据权利要求8或9所述的多肽，其神经酰胺酶活性可通过以下步骤进行检测：

(b)检测所得反应物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步骤；

11.一种反义DNA，它与权利要求1-3任一项中所述的基因或其一部分互补。

12.一种反义RNA，它与权利要求1-3任一项中所述的基因或其一部分互补。

13.一种表达载体，它含有权利要求11中所述的反义DNA。

14.一种寡核苷酸探针或引物，它可与权利要求1-3任一项中所述的基因或其互补链特异性杂交。

15.一种抗体或其片断，它可与权利要求8-10任一项中所述的多肽特异性结合。

16.一种编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的检测方法，它使用了权利要求14中所述的寡核苷酸探针和/或引物。

17.一种用于检测编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的试剂盒，它含有权利要求14中所述的寡核苷酸探针和/或引物。

18.一种具有神经酰胺酶活性的多肽的检测方法，它使用了权利要求15中所述的抗体或其片断。

19.一种用于检测具有神经酰胺酶活性的多肽的试剂盒，它含有权利要求15中所述的抗体或其片断。

20.一种细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项中所述的基因或其反义核酸导入细胞和/或组织内，并由此来调节细胞内和/或组织内神经酰胺量。