TWI272308B

TWI272308B - Ceramidase gene

Info

Publication number: TWI272308B
Application number: TWCERAMIDASA
Authority: TW
Inventors: Makoto Ito
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2007-02-01
Also published as: US20080050753A1; CN1351659A; DE60034880T2; KR20010108411A; EP1172436B1; DE60034880D1; JP3995420B2; CN101173293A; US7449553B2; ATE362526T1; US20060024809A1; AU3326900A; US6830919B1; EP1172436A1; KR100661784B1; WO2000058448A1; EP1172436A4

Description

A7 B7 12723 (^§089105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（1 ) 技術範圍本發明係有關用為供分析神經醯胺之構造與機能之脂質工業用試藥之具有神經酸胺酶活性之多肽，與其特異性結合之抗體，編碼該多肽之基因，與其特異性雜交之探針及引子。又，本發明係有關前述多肽之基因工程之製造方法，及該多肽或基因之檢測方法及其套組。另外，本發明係有關可應用於起因於神經醯胺量之異常之疾病之調節於細胞内及/或組織内之神經醯胺量之方法。背景技術神經醯胺酶為將鞘脂類之一種之神經醯胺水解成鞘胺基醇鹼與脂肪酸之酵素。藉由神經醯胺酶水解神經醯胺生成之鞘胺基醇鹼具有抑制蛋白激酶C、活化磷脂酶D，抑制調鈣蛋白依賴性之酵素等之種種生理活性。如此，前述鞘胺基醇鹼，藉由與細胞之增殖及細胞内情報傳達之關連，可認為是調節細胞機能之重要物質。神經醯胺酶為擔任調節前述鞘胺基醇鹼量之重要任務之酵素。神經醯胺酶藉由其最適pH，分類成酸性神經醯胺酶、中性、鹼性神經醯胺酶。迄今，具有於酸性範圍之最適 pH之神經酿胺酶之存在，報告於大鼠腦[Biochemistry，第 8卷，第1692〜1898頁（1969)]、土撥鼠上皮細胞[(J· Biol. Chem·)，第 270 卷，第 12677〜12684 頁（1995)]、人類腎臟 [Biochim. Biophys. Acta)，第 398 卷，第 125-131 頁 (1975)]、脾臟[Biochim. Biophys. Acta，第 1〇〇4，頁第 245〜251頁（1989)]，纖維芽細胞[Biochem. J.第205卷，第 63426-950324.DOC - 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 I2723JP&105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（2 ) 419〜425 頁（1982)]，上皮[FEBS Lett.，第 268 卷，第 110〜112 頁（1990)]等之哺乳動物組織，人尿[Journal of Biological Chemistry，第 270 卷，第 11098〜11102 頁（1995)]等。又，已明白假單胞菌屬細菌產生神經醯胺酶，該神經醯胺酶為具有驗性範圍之最適pH之神經驢胺酶。[Journal of Biological Chemistry ，第 273 卷，第 14368 〜14373 頁 (1998)] 〇此等神經醯胺酶之中，決定了自人尿純化之酸性神經醯胺酶之胺基酸序列及編碼該神經醯胺酶之基因之鹼基序列 [Journal of Biological Chemistry，第 271 卷，第 33110〜33115 頁（1996)]。又，利用與來自前述人尿之酸性神經醯胺酶基因之同源性，可得小鼠之酸性神經酸胺酶基因[Genomics，第 50 卷，第 267〜274 頁（1998)]。然而，所報告之來自哺乳類之神經醯胺醯基因，任一者皆為編碼酸性神經醯胺酶，於哺乳類之中性、鹼性神經醯胺酶之胺基酸序列及基因構造完全未知，於高等生物中之中性、鹼性神經醯胺酶之生物學機能亦尚未明之現狀。於神經醯胺於生體内之機能之解明，於其代謝之控制，與神經醯胺有關之疾病之診斷、治療等之研究中，有必要得到與神經醯胺有關之種種酵素，及與該酵素之基因有關之詳細之情報。然而，有關如上述之於哺乳類之中性、驗性神經醯胺酶之胺基酸序列，有關其基因之知識尚不可得為現狀。從而，為關發如上述與神經醯胺有關之技術，有必要得有關中性、鹼性神經醯胺酶，尤其是其基因之知 63426-950324.DOC - 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) I2723 胳 91_ 號

A7 B7 12723 Q谷89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月） 4 五、發明説明（性神經醯胺酶，以致完成本發明。亦即，本發明之要旨之特徵為具有選自下列之核酸之鹼基序列之基因： [1] (A)為具有記載於序列表之序歹u編號·· 14之胺基酸序列或其一邵分所成之多肽，且編碼具神經醯胺酶活性之多肽之核酸； (B)為具有記載於（B)序列表之序列編號：μ之鹼基序列或其一邵分之核酸，編碼具有神經醯胺酶活性之多肽之核酸； (c)由記載於序列表之序列編號·· ι4之胺基酸序列，具有至少1個胺基酸殘基之缺失、附加、插入或置換之胺基酸序列所成’且編碼具有神經醯胺酶活性之多肽之核酸； (D) 由記載於序列表之序列編號：15之鹼基序列，具有至少一個鹼基缺失、附加、插入或置換之鹼基序列所成，且編碼具有神經酸胺酶活性之多肽之核酸；及 (E) 為能與前述（A)〜(D)中任一項記載之核酸之互補鏈於嚴苛條件下雜交之核酸，且編碼具有神經醯胺酶活性之多肽之核酸； (F) 為經由簡併，具有與前述(A)〜(E)中任一項記載之核酸不同之鹼基序列之核酸，且編碼具神經醯胺酶活性之多肽之核酸； [2] 含有前述[1]記載之基因所成之重組Dna ; [3] 含有前述[1]記載之基因或前述[2]記載之重組dna所成之微生物、動物細胞或植物細胞用表現載_·

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A7 B7 12723胳8910549。號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（5 ) [4] 保有前述[3]記載之表現載體所成之轉形體； [5] 於適合表現神經醯胺酶基因，且受該基因編碼之多肽之產生之條件下，培養前述[4]記載之轉形體，自所得之培養物採取具神經醯胺酶活性之多肽作為特徵之具神經醯胺酶活性之多肽之製造方法； [6] 為具記載於序列表之序列編號：14之胺基酸序列或其一部分所成之多肽，且具有神經醯胺酶活性之多肽； [7] 由前述[1]記載之基因編碼所成之具神經醯胺酶活性之多肽； [8] 與前述[1]記載之基因或其一部分互補之反義DNA ; [9] 與前述[1]記載之基因或其一部分互補之反義RNA ; [10] 含前述[8]記載之反義DNA所成之表現載體； [11] 可與前述之[1]記載之基因或其互補鏈特異性地雜交之寡核芸酸探針或引子； [12] 可與前述[6]或[7]記載之多肽特異性結合之抗體或其片段； [13] 使用前述[11]記載之寡核甞酸探針及/或引子，檢測編碼具神經醯胺酶活性之多肽之基因之方法； [14] 含有前述[11]記載之寡核甞酸探針及/或引子所成之供檢測編碼具神經醯胺酶活性之多肽之基因用之套組； [15] 使用前述[12]記載之抗體或其片段，.檢測具有神經醯胺酶活性之多肽之方法； [16] 含有前述[12]記載之抗體或其片段所成之供檢測具有神經醯胺酶活性之多肽用之套組；及 63426-950324.DOC - 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案 A7 中文說明書替換頁(95年3月） B7 五、發明説明（6 ) [Π]將前述[1]記載之基因或其反義核酸導入於細胞及/ 或組織，藉以調節於細胞内及/或組織内之神經酿胺之量作為特徵之於細胞内及/或組織内之神經醯胺量之調節方法。圖之簡單說明圖1為表示神經醯胺酶之最適pH之圖。圖2為含神經醯胺酶基因之DNA片段之限制酵素地圖。供實施本發明之最佳形式由於鹼性神經醯胺酶之固有的序列等之情報未明，本發明者等，分離前述中性、鹼性神經醯胺酶，得胺基酸情報，藉此初次可分離編碼前述神經醯胺酶之基因。藉此，亦可得本發明之來自小鼠肝臟之中性、鹼性神經酸胺酶之胺基酸序列，與來自假單胞菌屬細菌（pseudomonas aeruginosa)之已知之驗性神經醯胺酶[同步之 Journal of Biological Chemistry，第 273 卷，第 14368〜14373 頁（1998)] 之胺基酸序列之同源性低之令人驚訏之知識。本發明之神經醯胺酶為初次明瞭來自哺乳類之中性、鹼性神經醯胺酶。因而，本發明與眾知之來自假單胞菌屬細菌之已知之驗性神經酿胺酶相比，對於生體内之神經si胺之機能之解釋明白，其代謝之控制，與神經醯胺有關之疾病之診斷，治療等之開發，更加有用。以下，說明本發明。 (1)具神經酿胺酶活性之多肽 63426-950324.DOC 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案

中文說明書替換頁(95年[42 五、發明説明（7 於本說明書，「具神經醯胺酶活性之多肽」（於本發明書，有單記成神經醯胺酶之情形），係指如前述具有將神經醯胺水解成鞘胺基醇鹼與脂肪酸之活性之酵素。又「中性、鹼性神經醯胺酶」係指具有比酸性範圍高之pH之最適pH神經醯胺酶。作為其一例，記載於本發明分解之來自小鼠肝臟之中性、鹼性神經醯胺酶之酵素化學上、理化上之性質。 1.作用本發明之神經醯胺酶，將神經醯胺水解生成鞘胺基醇鹼與脂肪酸。又，該神經醯胺酶之活性，可依 Journal of Biological Chemistry，第275卷，第3462-3468頁（2000)記載之方法測定。亦即，將550微微莫耳之C12-NBD-神經醯胺[Anal· Biochem·]，第 263 卷，第 183〜188 頁（1998))、10% (w/v)膽酸鈉及適當量之酵素（神經醯胺酶）溶於20微升之25 mM Tris鹽酸鹽緩衝液（pH 7.5)中之反應混合液，於37 °C培養 30分鐘。反應液於沸騰水浴培養5分而停止反應。所得之反應液再減壓使乾。將乾固物溶於氯仿/甲醇=2/1 (v/v)，以矽膠薄層層析法（展開溶媒：氯仿/甲醇/ 25%氨水=90/20/0.5 (v/W\〇展開。其後，使用CS-9300色層掃描機（夕口 v卜丰十十一）（島津製作所製）於激發波長475 nm，螢光波長525 nm，進行由上述反應生成之C12-NBD-脂肪酸之定量。1 單位之本酵素（神經醯胺酶）定義為上述條件下，.每分鐘自 C12-NBD-神經醯胺水解放出1莫耳C12-NBD-脂肪酸所須 -10

63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723⑽891G549G號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（8 ) 之酵素量。 2.基質相異性相對於以14C放射性同位素標記脂肪酸部分之各種鞘脂類100微微莫耳，使用本發明之神經醯胺酶5 mU於含1% 膽酸鈉之25 mM Tris-HCl，pH 7.5緩衝液20毫升中， 37 °C下作用24小時。反應液以矽膠薄層層析法展開後，藉由顯像分析儀（彳〆一夕 > 夕、’ 7十亏彳寸、一）BAS1000 (富士軟片公司製），檢測定量由14C標記之鞘脂類與酵素反應生成之14C-標記脂肪酸，自所得之值，算出分解率。本發明之神經醯胺酶之基質特異性示於表1。本發明之神經醯胺酶如表1所示，顯示①水解種種之 N-醯基神經鞘胺醇；.②對半乳糖基神經醯胺、硫腦脂、 GMla、鞘磷脂無作用；③對於含鞘胺醇（dl8:l)之神經醯胺，比含二氫鞘胺醇（dl8:0)之神經醯胺作用更佳；④對含植物鞘胺醇（tl8:l)之神經醯胺難以作用等之基質特異性。 63426-950324.DOC -11- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 12723 O^089105490!£#^j t A? 中文說明書替換頁(95年3月） B7 五、發明説明（9 ) 表1 基質（構造）分解率(％) N-十二醯基神經鞘胺醇(C12:0/dl8:l) 63 N-軟脂醯基神經鞘胺醇(C16:0/dl8:l) 93 N-硬脂醯基神經鞘胺醇(C18:0/dl8:l) 83 N-軟脂醯基二氫鞘胺醇(C16:0/dl8:0) 59 N-硬脂醯基二氫鞘胺醇(C18:0/dl8:0) 40 N-軟脂醯植物鞘胺醇(C16:0/tl8:0) 5 N-硬脂醯植物鞘胺醇(C18:0/tl8:0) 2 NBD-N-十二醯基神經鞘胺醇(NBD_C12:0/dl8:l) 97 NBD-N-十六醯基神經鞘胺醇(NBD-C6:0/dl8:l) 2 半乳糖基神經醯胺(Galbl-rCer) 0 硫腦脂(HS03-3Galbl-l’Cer) 0 GMla (Galbl-3GalNAcbl-4(NeuAca2-3)Galbl-4Glcbl-l?Cer) 0 鞘磷脂（膽鹼磷酸酯Cer) 0 3.最適pH 相對於100微微莫耳之C12-NBD-神經醯胺，於3,3-二甲基戊二酸、50 mM Tris (羥甲基）胺基甲烷、50 mM 2-胺基- 2-甲基-1,3-丙二醇）20毫升中，將本發明之神經醯胺酶16 mU於37 °C作用24小時。反應液藉由矽膠薄層層析法展開。接著，使用CS-9300色層掃描機，於525 nm之檢測波長，檢測定量D-標記之神經醯胺與於酵素反應產生之 NBD-標記脂肪酸，自所得之值算出分解率。圖1為表TF 63426-950324.DOC - 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 0^)8910549()號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（1〇 ) C12-NBD-標記神經醯胺分解活性與pH之關係之圖，縱軸表分解率（％)，橫軸表反應之pH。如圖1之結果示出，本神經醯胺酶之最適pH為7.0〜8.0。 4. 溫度穩定性本發明之神經醯胺酶，於含 0.1%聚多加醇 (polidocanol)[商品名··路布洛（Lubrol) PX ]之 20 mM Tris-HCl (pH 7·5)緩衝液中，於37 °C處理24小時時，無見到活性降低，但藉由60 °C下處理1小時，活性降低至處理前之活性之約30%。 5. 分子量本發明之神經醯胺酶之分子量，藉由 SDS-PAGE (還原條件下）約為94 kDa。又，藉由糖肽酶下消化之本酵素，藉由SDS-PAGE (還原條件下）約為73 kDa。又，於本說明書，作為「具有神經醯胺酶活性之多肽」之一例，可舉具序列表之序列編號：14所示之胺基酸序列之來自小鼠之天然型神經醯胺酶之多肽。另外，不只具該胺基酸序列之多肽，只要藉由如上之方法測定活性，可確認同樣之神經醯胺酶活性，具有示於序列表之序列編號： 14之胺基酸序列中導入1個以上之胺基酸之置換、缺失、附加、插入等之變異之胺基酸序列之多肽、亦包含於「具神經醯胺酶活性之多肽」。又，前述之變異，只要所得之多肽得以呈現神經醯胺酶活性之變異，則亦可導入2種以上之變異。又，於本說明書，「導入變異之胺基酸序列」亦包含具有人為地導入變異之胺基酸序列及來自天然之變 63426-950324.DOC - 13 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723胳咖5·號專利申請案 _中文說明書替換頁(95年3月）会；五、發明説明（w ) 異之胺基酸序列之任一者。具此變異之神經醯胺酶，具體言之，例如於後述之神經酸胺酶基因之鹼基序列（序列編號：15 )，對於具有變異之變異基因，藉由下述步驟： 0)將別述基因之表現產物，於反應混合液[組成：微升之25 111]\/1丁1^11(：1緩衝液（1)116〜9，較佳6.5〜8.5，更佳 7〜8 ’特佳7.5)中，550微微莫耳之C12-NBD-神經醯胺，及1.0% (w/v)膽酸鈉]中，於37艽培養％分使反應之步驟，及 (b)對所得之反應物，檢測C12-NBD-脂肪酸之生成之步驟’藉由選擇顯示神經醯胺酶活性之多肽而可得。 (2)神經醯胺酶基因於本發明，神經醯胺酶基因，為具有編碼具神經醯胺酶活性之多肽之核酸之鹼基序列之基因，或含該基因之鹼基序列之核酸。作為其一例，可舉具有編碼由記載於序列表之序列編號：14之胺基酸序列或其一部分所成之多肽之核酸之鹼基序列之基因，具有由記載於序列表之序列編號： 15之鹼基序列或其一部分所成之核酸之鹼基序列之基因，本發明並不限於這些。如此，即使為具有編碼由記载於序列編號：14之胺基酸序列之一部分所成之多肽之核酸之鹼基序列之基因或由記載於序列編號：15之鹼基序列之一# 分所成之核酸之鹼基序列之基因，只要編碼具有神經酿月矣酶活性之多肽者’亦包含於本發明之範圍。此等基因，來自小鼠肝臟之中性、鹼性神經醯胺酶之基因，但本發明 63426-950324.DOC - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 12723 (^8)89105490^:4^ t tf t 中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（12 ) 之神經醯胺酶基因之來源，只要與前述⑴記載之步騾⑷ 及（b)同樣為之，可檢測基因產物之神經醯胺酶活性即可，並無特別限定。作為此來源，可舉例如小鼠、大鼠、人類、倉鼠、土撥鼠等。又’於本說明書，「由（胺基酸序列之）一部分所成之多肽」意即藉由前述⑴記載之步驟⑷及（b)，可檢測神經醯胺酶活性者。另外，編碼可呈現同樣之神經醯胺酶活性之具有變異之神經酿胺酶之基因亦包含於本發明。例如為具有編碼於序列表之序列編號：15中記載之胺基酸序列導入1個以上之胺基酸殘基之缺失、附加、插入或置換等之變異之胺基酸序列之核酸之鹼基序列之基因，亦只要受該基因編碼之多肽具有神經醯胺酶活性，則亦包含於本發明之基因。如此’不只是來自天然之具變異之基因，人為地製作之基因亦只要疋具有編碼具中性、驗性神經酸胺酶活性之多肤之核酸之鹼基序列之基因，則包含於本發明之範圍。作為如上述之人為地導入變異之基因之製作方法，使用例如如下之方法。作為導入隨機變異之方法，可使用藉由使用亞硫酸氫鈉之化學處理，使發生將胞墙淀驗基置換成尿p密淀驗基之轉換變兴之方法[Proceedings of the National Academy of Sciences oftheUSA，第 79 卷，第 1408〜1412 頁（1982)]，於含錳之反應液中進行PCR，使DNA合成時併入核苷酸之正確性減低之方法[Anal· Biochem·第 224 卷，第 347〜353 頁（1995)] 63426-950324.DOC -15· 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐） 12723 0&89105490號專利申請案 A7 中文說明書替換頁(95年3月） B7 五、發明説明（13 ) 等。作為導入部位特異性突變之方法，可使用例如利用琥珀突變之方法[gapped duplex 法，Nucleic Acids Research，第 12 卷，第 9441 〜9456 頁（1984)]，利用缺失 dut(dUTPase)與 ung (尿嘧啶-NDA糖甞酶）基因之宿主之方法[Kunkel法， Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第 82卷，第488〜492頁（1985)]，藉利用琥珀突變之PCR之方法（國際公開第98/02535號小冊子）等。以此等方法，供導入部位特異性之突變於目的之基因用之各種套組有市售，藉利用該套組，可容易地取得導入所希望之突變之基因。又’為與前述核酸之互補鏈於嚴苛之條件下雜交之核酸且具有編碼具神經醯胺酶活性之多肽之核酸之鹼基序列之基因亦包含於本發明之基因。神經酿胺酶活性，例如藉由前述⑴記載之步驟⑷及（b)，亦可檢測。於此’ 「嚴苛之條件」係指例如以下之條件。亦即’指於含 0.5% SDS。5 X Denhardt’s，0.1% 牛血清白蛋白(BSA)， 0.1%聚乙烯基吡咯啶酮，0.1%菲可（7 < 口一小）400]及 1〇〇微克/毫升鮭魚精子DNA之6XSSC (1XSSC為0·15 Μ NaCl ， 0.015 Μ 擰檬酸鈉，pH 7·0)中， 50 °C下進行4小時〜一夜保溫之條件。又，雜交操作之細節，記載於例如1989年，Cold Spring Harbor Laboratory 發行，T. Maniatis 等編輯之 Molecular Cloning ·· A Laboratory Manual (分子選殖：實驗室操作）第2 63426-950324.DOC - 16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 ⑽891G549G號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（14 ) 版。又，經由簡併基因編碼，具有與前述核酸不同之鹼基序列之基因，亦包含於本發明之神經醯胺酶基因。又，藉由本發明之基因編碼之多肽，只要藉由前述（1)中記載之步驟（a)及（b)，可檢測神經醯胺酶活性者，亦含於本發明。藉由本發明之基因，另外提供適宜種種使用目的之重組 DNA。於此，「重組DNA」為藉由基因工程方法所得之含有本發明基因之DNA。將含有本發明之神經醯胺酶基因之重組DNA連結於眾知之載體，可製作神經醯胺酶基因以可表現之狀態插入之表現載體。此表現載體亦包含於本發明。於本發明，作為表現載體，為插入前述基因或重組 DNA，且構築使能於所望之宿主細胞表現之載體。又，插入後述之反義DNA之載體亦含於本發明之表現載體。作為插入之載體，可舉質體載體，噬菌體載體，病毒載體等。作為質體載體，可適宜地使用 pUC18，pUC19， pBluescript，pET等之市售品，作為嗤菌體載體，可適宜地使用XgtlO，Xgtll等之無規噬菌體載體等之市售品，但不限於這些。作為病毒載體可使用倒逆病毒載體、腺病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒截體等，但不限於這些。此等載體依所用之宿主細胞可適宜選擇。此等載體亦可適宜地具有可謗導之啟動子、選擇用標記基因、終止密碼子等之因子。又，依使用目的，使能容易地分離純化，亦可使用具有 63426-950324.DOC - 17 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 12723 0^)891G549G號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（15 ) 作為His標記，GST融合蛋白質，能表現之序列之載體。此情形，可使用具有於宿主細胞内能產生機能之適切之啟動子（例如lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期啟動子等）之GST (谷胱甘肽轉移酶）融合蛋白質載體（例如pGEX4T) 及標記（例如Myc、HisA等）序列之載體等。 (3)含神經醯胺酶基因之轉形體藉由以插入本發明之神經醯胺酶基因之表現載體進行宿主之形質轉換，可得本發明之轉形體，亦即表現本發明之神經醯胺酶基因之細胞。使用之宿主可依所望之神經醯胺酶之使用目的而適宜選擇，可使用以大腸菌為首之微生物、酵母以外，動物細胞、植物細胞、動物個體、植物個體等。具體言之，作為大腸菌，可舉大腸菌K-12系統之 HB101 株，C600 株、JM109 株，DH5oc 株，ϋΗΙΟβ 株，XL-lBlueMRF1株，TOP10F株等。又，作為酵母細胞.，可舉釀酒酵母等。作為動物細胞，可舉L，3T3，FM3A，CHO， COS，Vero，Hela等。作為植物細胞，可舉煙草BY2等。作為導入表現載體於宿主中之方法，可使用 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子選殖：實驗室操作）第2 版，第249〜254頁中記載之方法。其次，為還擇表現目的基因之轉形體，利用表現載體之特性。例如質體載體為 pBluescript，以大腸菌為宿主細胞之情形，藉由於含安匹西林之皿上，選擇具安匹西林耐性之群落，或於含安匹西林、5-〉臭-4-氯-3- 丨嗓基-β-D-半乳糖嘗（X-Gal)及異丙基-β- 63426-950324.DOC -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案 A7 中文說明書替換頁(95年3月） B7 五、發明説明（16 ) D-硫外b喃半乳糖芬（IPTG)之皿上，選擇顯示安匹西林耐 4生，且呈白色之群落，挑選導入外來基因之群落。藉由於通常所用之條件下，進行本發明之轉形體之培養可產生具神經醯胺酶活性之多肽。又，依使本發明之基因素現之宿主，有密碼子使用頻率不同，表現受抑之情形，此種情形，亦可將使用於本發明基因中之密碼子，換成分別與宿主相合之密碼子使用。又，前述表現載體，不只限於來自質體之載體，只要不妨害本發明之目的，則亦可使用來自噬菌體、黏接質體等之載體。自容易且大量地製造本發明之多肽之觀點，可謗導表現外來基因之載體，作為與報道基因產物之融合蛋白質，可使表現之載體為所希望。神經醯胺酶之表現之確認，可藉由測定神經醯胺酶活性而進行。活性測定，例如將轉形體之細胞抽出液作為試樣，藉由，Journal of Biological Chemistry，第 275 卷，第 3462〜3468頁（2000)記載之方法，例如與前述（1)中記載之步驟（a)及（b)同樣之橾作可進行。又，藉由細胞内之神經酸胺量之測定，亦可進行確認神經醯胺酶之表現，上述神經酿胺量之測定可以例如記載於 Analytical Biochemistry第 244卷，第291〜300頁（1997)之方法進行。又，亦可使用對於神經醯胺酶之抗體，使作為神經酿胺酶與其他多肽（除本發明神經醯胺酶以外之多肽）之融合體表現之情形，亦可使用對於其多肽（除本發明之神經醯胺酶外之多肽）部分之抗體。使用抗體之情形，例如將轉形體之細胞抽出液於 63426-950324.DOC - 19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（~「）— SDS_聚丙婦醯胺凝膠電泳後，轉錄於聚亞乙埽基化氟 (PVDF)膜上，此膜上使用抗體可檢測。 ⑷具神經酸胺酶活性之多肽之製造方法本發明亦提供適宜表現本發明之基因，且受該基因編碼之多肽生產之條件下，培養上述轉形體，自所得之培養物，取具神經醯胺酶活性之多肽之製造具神經醯胺酶活性之多肽之方法。轉形體之培養方法無特別限定，自適宜所使用（宿主之眾知之培養方法中，適當選擇即可。於本發明之製造方法，上述之轉形體為微生物或培養細胞之情形，培養基組成，培養基之pH，培養溫度，培養時間以外。對於誘發物之使用量，使用時間等，藉由決定最適宜神經醯胺酶之表現之條件，可更有效率地生產神經醯胺酶。自轉形體之培養物純化神經醯胺酶，可使用通常之方法。如轉形體為大腸菌，神經酿胺酶蓄積於細胞内之情开> ’培養終了後，藉由離心收集轉形體細胞，所得之細胞藉超音波處理等粉碎後，以離心分離等得無細胞抽出液。以此為起始材料，鹽析法以外，可藉由離子交換、凝膠過滤法、疏水性、親和性等之各種層析法等之一般之蛋白質純化法純化。依使用之宿主載體系有表現產物分泌於細胞外之情形，如此之情形，自培養上清液同樣地進行純化即可〇根據本發明之製造方法，於細胞内產生該神經醯胺酶之情形，目的之神經醯胺酶與細胞内諸酵素、蛋白質等之夾 -20-

63426-950324.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 12723 0系)8910549〇號專利申請案 A7 中文說明書替換頁(95年3月） B7 五、發明説明（ 18 ) 雜物共存，由於此等夾雜物與被表現之神經酿胺酶之量比較不過為微 •，所以其純化極為：容易，此為優越之好處〇又，作為載體，使用細胞外分泌型之載體之情形神經酸胺酶於細胞外分泌 1 含神經醯胺酶之部份，有培養基成分等共存。夕火而，由於此等幾乎不含通常妨礙神經酸胺酶純化之蛋白質成分5 所有沒有必要自小鼠肝臟純化神經酸胺酶所必要之煩雜之分離純化操作· 之優; 越之好處 0 又，來自真核生物之神經醯胺酶之情形，酵素本身有可能具糖鏈，作為宿主細胞，藉由使用不具糖鏈生合成能力之細胞，例如大腸菌、枯草菌、放射菌之原核生物或酵母真菌、動物細胞、昆蟲細胞及植物細胞之糖鏈生合成能力喪失之突變細胞，可製造不具糖鏈之具神經酸胺酶活性之多肽。另外，亦可生產具糖鏈之酵素，此情形作為宿主細胞，藉使用具糖鏈生合成能力之細胞，例如酵母真菌、動物細胞、昆蟲細胞及植物細胞，可製造具糖鏈之具神經醯胺酶活性之多肽〇又，依使用之宿主載體系，表現產物有以不溶性之包含體 (inclusion body)形成〇此 t情形，培養終了後，以離心收集細胞，將此以超音波處理等粉碎後，進行離心而收集含包含體之不溶性部分。洗淨包含體後，以通常使用之蛋白質增溶劑，例如尿素及胍鹽酸鹽等增溶，按須要進行離子交換凝膠過濾疏水性、親和性等之各種層析法純化後 J 藉進行使用透析法或稀釋法等之保持操作，可得含保持神經縫 :胺酶活性之標品〇按須要，將此標品再以各種層 63426-950324.DOC -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（19 ) 析法純化，則可得具高純度之神經醯胺酶活性之多肽。 (5)雜交用探針及PCR用引物本發明之寡核茹酸探針或引子，可特異性地雜交於本發明之基因，或其互補鏈。此寡核：y：酸探針或引子，基於本發明之神經醯胺酶基因之鹼基序列設計，例如可藉由習用之化學合成而製作。該寡核甞酸探針之鹼基序列並無特別限定，只要於嚴苛條件下可雜交於前述神經醯胺酶基因，或具有與該基因互補之鹼基序列之核酸即可。上述「嚴苛之條件」無特別限定，例如係指於含6XSSC，0.5% SDS， 5 X顛哈德（于> /、小卜）、100毫克/毫升鯡精子DNA之溶液中，於[前述探針之Tm-25 °C ]之溫度保溫一夜之條件等。又，上述之引子.之鹼基序列亦無特別限定，於通常之 PCR反應條件，黏接於前述之神經醯胺酶基因，或具有互補於該基因之鹼基序列之基因，可開始藉由DNA聚合酶之伸長反應者即可。寡核甞酸探針或引子之Tm，例如自下式可求： Tm=81.5-16.6 (log10 [Na+]) + 0.41 (%G + C)-(600/N) (式中，N為寡核甞酸探針或引子之鏈長，％G+C為寡核甞酸探針或引子中之烏嘌呤及胞嘧啶殘基之含量），又，寡核茹酸探針或引子之鏈長比18個鹼基短之情形，Tm可由例如A+T (腺嘌呤+胸甞）殘基之含量與2 °C 之積，G+C殘基之含量與4°C之積之和[(A+T)X2+(G+C)X4] 推定。作為上述寡核甞酸探針之鏈長，無特別限定，自防止非 63426-950324.DOC - 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 0^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（2〇 ) 特異性之雜交之觀點，以15個鹼基以上為佳，18個鹼基以上更佳。又，於本發明之引子，亦可舉具與前述寡核甞酸相同之驗基序列之核酸。例如，基於本發明之基因之驗基序列設計，藉化學合成等而可製作。引子之鏈長無特別限定，可使用例如 15〜40個驗基之鏈長者，尤其可較佳地使用 17〜30個鹼基之鏈長者。前述之引子，可使用以PCR法為始之種種基因擴增法，藉此，可進行本發明神經醯胺酶基因之檢測。又，作為前述寡核铝酸探針或引子，將編碼來自天然之神經醯胺酶之核酸，以限制酶處理、外型核酸酶處理等之酵素處理、超音波等之物理處理等使片段化，所得之片段，以由瓊脂糖凝膠等代表之各種核酸分離法分離純化所得之核酸亦可使用，如前述所得之核酸，來自具有神經酿胺酶中特徵之序列之範圍者為所希望。另外，前述寡核甞酸探針或引子，由於使檢測對象之核酸更容易檢測，所以依眾知之方法施以適當標記，可使用於本發明神經醯胺酶基因之檢測。標記無特別限定，除放射性同位素外，亦可進行如由生物素及洋地黃毒芬之配位體等所代表之各種標記。使用本發明之雜交用探針，藉篩選來自小鼠肝臟以外之臟器或小鼠以外之生物體之基因組DNA或cDNA，或基因組DNA基因庫或cDNA基因庫，可選殖與本發明神經醯胺酶基因同源性高之DNA。 63426-950324.DOC - 23 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（21 ) 又，使用本發明之引子，自來自小鼠肝臟以外之臟器或小鼠以外之生物體之基因組DNA或cDNA或基因組DNA 基因庫或cDNA基因庫，藉PCR法檢測與本發明神經醯胺酶基因同源性高之DNA片段，另外亦可得其全長之基因。 (6)基因之檢測方法本發明基因之檢測方法，以使用前述寡核智：酸探針及/ 或引子檢測檢測用試樣中之基因為一大特徵。於本發明之檢測方法，亦可藉由使用前述之寡核茹酸探針之雜交法等，進行基因之檢測，又，使用前述之引子，藉PCR等之DNA擴增方法，亦可進行基因之檢測。使用寡核甞酸探針之雜交之情形，作為檢測用試樣，可舉例如，微生物之群落及培養細胞、組織切片之試樣，此等試樣中之DNA及RNA固定於膜上者，自此等試樣抽出之DNA及RNA等。雜交可依 Molecular Cloning : A Laboratory Manual 第 2 版等記載之眾知方法進行。該雜交條件，可由所用之探針之 Tm值、標的 DNA之 GC含量適宜決定。例如前述 Molecular. Cloning : A Laboratory Manual 第 2 版記載之條件等可適用。使用引子進行基因之檢測之情形，作為檢測用試樣，可舉例如來自微生物培養液、微生物群落、微生物菌體之微生物試樣，培養細胞、組織、組織切片之生體之試樣等。此等試樣亦可以例如分離之微生物及培養細胞以原樣乏狀 63426-950324.DOC - 24 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 I2723C^)8910549〇號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（22 ) 態使用，亦可以施以適當處置之狀態使用。又，如組織之固體試樣，亦可製備浸出液及懸浮液使用。又，對此等試樣之上清液或此等試樣，亦可使用實施如界面活性劑處理之細胞溶解處理之試樣及其上清液。另外，以不損害為檢測對象之核酸之範圍，亦可實施除去試樣中之其他成分之操作。使用前述引子，藉由PCR法進行檢測之情形，PCR條件依使用之引子之Tm值，擴增檢測之對象之範圍之長度等，而可適宜選擇。於PCR法，藉由擴增產物之有無，可檢測目的之基因。擴增之有無之確認法，無特別限定，例如將核酸擴增反應液供瓊脂糖凝膠電泳後，以適當之核酸染色試藥，例如溴乙錠（SYBER Green I)等染色，藉檢測照射紫外線所生之環帶之有無，可確認。環帶之檢測，可以肉眼觀察，使用例如螢光顯像分析儀等亦可檢測。於本發明之基因之檢測方法，由於可提高檢測感度，亦可併用前述探針及引子。例如，使用前述引子，藉由PCR 法，擴增微量存在於試樣中之神經醯胺酶基因，接著，藉使用探針與該基因雜交，可高感度且正確地檢測。藉本發明之檢測方法，進行神經醯胺酶基因之檢測，另外，決定該基因量之情形，藉由來自雜交之探針之信號強度，來自使用引物擴增之產物之環帶之螢光強度等可進行定量。以mRNA為測定對象，進行其定量，可調查目的基因之表現量。又，本發明之檢測方法，藉使用供檢測本發明基因用之 63426-950324.DOC - 25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（23 ) 套組，可更簡便地進行檢測。此套組亦包含於本發明。前述套組以含有上述寡核甞酸探針及/或上述引子為1個特徵。前述套組亦可含有使用於檢測操作之種種組份，例如含寡核苷酸探針之套組之情形，可含供固定核酸用之膜及雜交緩衝液等為代表之雜交用之各種試藥，或含引子之套組之情形，亦可含耐熱性DNA聚合酶、dNTP混合液， PCR用緩衝液等為代表之PCR用試藥。另外，亦可含供檢測探針及擴增之DNA用之試藥及微生物增殖用之培養基，細胞培養用之培養基，供自試樣抽出核酸用之試藥等。 (7)具神經酸胺酶活性之特異性結合於多肽之抗體或其片段特異性結合於本發明之多肽之抗體或其片段，只要具特異性結合於該多肽之能力，並無特別限定，多源抗體、單源抗體之任一者皆可。另外，可使用藉眾知技術修飾之抗體及抗體衍生物，例如人類化抗體，Fab片段、單鏈抗體等。本發明抗體藉由例如1992年，John Wiely & Sons公司發行，John E. Coligan 編輯，Current Protocols in Immunology 中記載之方法，使用本發明之多肽之全部或一部分，將兔及大鼠、小鼠等免疫，可容易地製作。如此所得之抗體純化後，藉由肽酶等處理，可得抗體之片段。又，可以基因工程製作抗體。另外，本發明之抗體或其片段為使藉由酵素免疫測定法、螢光免疫測定法，發光免疫測定法等之檢測容易，亦可作各種修飾。上述之抗體或其片段，含特異性結合於為多肽之部分片 63426-950324.DOC - 26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 0綠89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月、 Α7

段者。 ^為所得抗體或其片段之用途，可考慮應料神經醯胺囷（檢測’神經醯胺酶表現細胞株之檢測，培養細胞及組織巾之神經醯胺酶蛋自質之檢測，親和性層析法，錢基因庫（基因組DNA或cDNA)之表現產物之篩選，醫藥、診斷藥，研究試藥等。 ⑻多肽之檢測方法本發明之多肽之檢測方法，以使用前述抗體或其片段，檢測具神經醯胺酶活性之多肽為特徵。於本發明，作為檢測用試樣，可使用例如微生物及動物細胞之培養物、組織切片、微生物及動物細胞之細胞粉碎物’皮膚等（組織抽出液或洗淨液，$自微生物及動物細胞，組織之蛋白質被固定之膜等之蛋白質試樣。對抗體或其片段之前述多肽之特異性結合之檢測，可利用眾知之方法，可舉例如酵素免疫測定法，螢光免疫測定法，發光免疫測定法等。本發明之多肽之檢測方法，藉由使用供用於本發明之多肽之檢測之套組，可更簡便地進行檢測。此套組亦含於本發明。前述套組，以含有上述抗體或其片段為特徵。又，該套組亦可含反應用緩衝液、標記二次抗體、發色試藥等。

⑼反義DNA及反義RNA 於本發明「反義DNA」及「反義RNA」，係指具有與本發明神經醯胺酶基因或其一部分互補之驗基序列，藉由 -27-

63426-950324.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 0^)89105490¾^^ t 中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（25 ) 與内因性之神經醯胺酶基因（基因組DNA及mRNA )形成雙鏈，抑制或控制自該基因之基因情報之表現（轉錄，轉譯）。反義DNA或反義RNA之長度，可按照驗基序列之特異性及導入細胞内之方法而改變。反義DNA或反義 RNA，使用合成機人工地合成，可藉由以本發明基因為模板之酵素反應，使基因與通常相反之方向（反義之方向）表現等而製作。於生體内，希望反義RNA表現之情形，構築與通常相反之方向接續本發明基因之表現載體，將此導入生體内即可。例如，利用 tat 基因[Nucleic Acids Research，第 19 卷，第 3359〜3368 頁（1991)]或 rev 基因[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第 86 卷，第 4244〜4248頁（1989)]之HIV之增殖抑制等，已知許多反義技術，因而，藉此等方法，使用本發明之反義DNA或反義RNA，可抑制或控制内因性之神經醯胺酶基因之表現。又，本發明之反義DNA或反義RNA，可利用為原位雜交等之研究試藥。 (10)使用神經醯胺酶基因或其之反義核酸調節於細胞内或組織内之神經醯胺量藉本發明之基因，另外可提供調節於細胞内及/或組織内之神經醯胺量之方法。此調節方法亦包含於本發明内。本發明之於細胞内及/或組織内神經醯胺量之調節方法，之1個特徵為將本發明之神經醯胺酶基因導入細胞及/或組織内，藉其調節於細胞内及/或組織内之神經醯胺量。 63426-950324.DOC - 28 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 12723 C^)891G549G號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月) 五、發明説明 (26 ) 亦即於本發明之調節方法，將本發明之神經醯胺酶基因導入細胞或組織中，藉由該基因表現之神經醯胺酶分解細胞或組織中之神經醯胺，一方面，將本發明之神經酸胺酶基因以該基因之反義核酸，例如反義RNA可生成之形態，導入組織，減低於該細胞，組織中之神經酿胺酶活性，可抑制神經酸胺之分解。又，抑制神經酿胺量之情形，亦可將本發明之神經醯胺酶基因之反義核酸，亦即本發明之反義RNA或反義RNA以其原來之形態導入細胞或組織。將前述神經醯胺酶基因或其反義核酸導入細胞或組織之方法，可使用眾知之方法，利用電孔法（electroporation) 代替克耳岡（六一于4夕小力' > )法等之物理性基因導入方法，及使用病毒載體之基因導入方法。可使用於本發明之方法之病毒載體並無特別限定，可使用例如倒逆病毒載體、腺病毒載體、疫苗病毒載體，腺伴隨病毒載體等導入 0 根據本發明之調節方法，將本發明之神經醯胺酶基因或其反義核酸導入細胞及/或組織，調節於細胞内及/ 或組織内之神經酿胺量，可進行起因於神經ai胺量之異常之疾病，又有製作神經酿胺代謝異常之疾病模式動物之優越效果。作為「起因於神經醯胺量異常之疾病」並無特別限定，可舉例如法巴（7 7 — A —)病等。以下就取得來自小鼠肝臟之神經醯胺酶基因之方法加 63426-950324.E )0C -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）会? _ 五、發明説明（27 ) 以說明。 1) 首先，自小鼠肝臟之勻漿製備膜部分，將此懸浮於蔗糖 EDTA液，冷滚融解後，進行離心仔上清液（粗酵素抽出液）。自此酵素抽出液，組合眾知之蛋白質純化法，例如各種層析法，可得純化成單一狀態之神經醯胺酶標品。可使用於上述純化之層析法可使用陰離子交換層析法，疏水性層析法、螯合層析法、凝膠過濾層析法等。 2) 其次，作為供製作選殖神經醯胺酶基因用之探針之情報，調查神經醯胺酶之部分胺基酸序列。上述之純化神經醯胺酶標品如此供藉由衛德曼（工卜’ Y >)分解法[Journal of Biological Chemistry，第 256 卷，第 7990〜7997 頁（1981)]之胺基酸序列分析，可知神經醯胺酶之N末端胺基酸序列。又，自以基質特異性高之蛋白酶例如離胺基末端肽酶及N-甲續酸基-L_苯基丙胺醯基氯甲基酮（TPCK)-胰蛋白酶等消化純化酵素標品所得之肽混合，純化適當之肽片段，對該片段進行胺基酸序列分析，可得神經醯胺酶内部之部分胺基酸序列。 3) 基於如此而明白之胺基酸序列之情報，設計作為雜交用之探針，或PCR用之引子使用之寡核菩酸，選殖本發明之神經醯胺酶基因。因此，利用一般使用之PCR或雜交法。 PCR 法可按照 1989 年，Stockton Press 公司發行，Erlich， Η·Α·編輯，PCR Technology (技術學）中記載之方法進行。雜父法可按照例如 Molecular Cloning : A Laboratory Manual 第2版中記載之方法進行。 -30-

63426-950324.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723礙891。549。號專利申請案 A 7 中文說明書替換頁(95年3月） ^ 五、發明説明（28 ) 4) 由上述雜交或PCR所得之DNA片段，藉由解讀其鹼基序列，可知可受其編碼之胺基酸序列。將該序列與上述2) 所得之神經醯胺酶之部分胺基酸序列比較，可確認上述 DNA片段為神經醯胺酶基因之片段。 5) 由3)之雜交或PCR所得之DNA片段為神經醯胺酶基因之一部分之情形，將3)之操作反覆，或基於3)所得之 DNA片段之鹼基序列製作新的探針、引子，使用此，實施雜交或PCR而可得含編碼神經醯胺酶全長之基因之DNA 片段。 6) 將如此所得之編碼神經醯胺酶全長之基因接續於適當載體，構築表現載體，製作導入該表現載體之轉形體。培養此轉形體，藉調查培養物中之神經醯胺酶活性，可確認所得之基因編碼神經醯胺酶。然而，於本發明之神經醯胺酶基因之選殖，於本發明所得之部分胺基酸序列情報，無法設計適宜藉由雜交法之基因庫之篩選之探針DNA。又，分別自使用於部分胺基酸序列及基因庫之製作之載體之鹼基序列，設計種種PCR引子，以各種組合進行PCR，無以見到特異性之擴增，唯一只見到基於部分胺基酸序列C-53 (序列表之序列編號：3 顯示C-53之胺基酸序列）設計之2種引子此間之組合。但擴增之DNA片段Ρ-1 (序列表之序列編號：6顯示Ρ-1之驗基序列）為68 bp之短片段，如此無法作為藉由雜交法之篩選基因庫用探針使用。因此，自P-1之序列再設計PCR 引子，同時藉由將此與自使用於基因庫之製作之載體之鹼 63426-950324.DOC - 31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95^^^} 11 •丨 > ’ 五、發明説明（基序列设汁之引子組合，逸 , 、、、、、進仃PCR，初次成功地得到首次被彡忍為適宜藉由雜交法餘、人忐《師選基因庫用芡探針之335 之基因片段。另外，將前述335 bP之DNA片段作為探針，筛選來自小鼠肝臟之撕|因庫，可選殖編碼神經醯胺酶全長之基因。又’藉篩選來自小鼠肝臟之基因組DNA基因庫，亦可得本發明之神經醯胺酶之基因組DNA。所得之d机肝臟產生之神經醯胺酶基因之全鹼基序列’記載於序列表之序列編號：12，於此編碼之多肤之胺基酸序列記載於序列表之序列編號：13。又，自此胺基酸序列與該酵素之N末端胺基酸序列，明白該酵素被加工成除去N末端部分之肷之成熟型酵素。此成熟型神經醯胺酶之胺基酸序列及編碼該序列之鹼基序列，分別示於序列表之序列編號：14及別與來自眾知之哺乳 15。上述之胺基酸序列、鹼基序列分類之各別神經醯胺酶之胺基酸序列，驗基序列之間無同源性。亦即，由本發明提供之神經酸胺酶基因為由與眾知之神㈣胺酶基因無關，完全新的序列所成。如此藉由本發明，提供來自小鼠肝臟之神經醯胺酶之一次構造及基因構造。另外，具神經醯胺酶活性之多肽可以便宜且高純度之基因工程方法製備。又，特異性地雜叉於本發明之神經醯胺酶基因之寡核铝酸探針或引子，有用於本發明之神經醯胺酶基因之檢索、檢測及擴增等。特異性地結合於本發明之多肽之抗體或其 -32-

63426-950324.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 08)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（3〇 ) 片段’有用於神經酸胺酶之檢測、鐘定及純化等。又，根據本發明之細胞内及/或組織内神經醯胺量之調節方法，將本發明之神經醯胺酶基因或其反義核酸導入細胞及/或組胺，由於，可調節細胞及/或組織内之神經酸胺量，此調節方法不特別限定於起因於異常之神經醯胺量之疾病，例如可用於巴病等之疾病。以下而實施例更詳細說明本發明，本發明並不限於實施例之範圍。實施例1神經酸胺酶之純化自105隻Sea/ddY小鼠（成和實驗動.物研究所製）摘出之肝臟181克於含1 mM EDTA之0.25 Μ蔗糖（蔗糖-EDTA液） 300毫升中使均一化。此勻漿以600 Xg離心10分分離後，回收上清液。所得上清液，再以2700 X g離心30分，回收沈澱。將沈澱部分懸浮於480毫升之蔗糖_EDTA液，得懸浮液。所得懸浮液於-80 °C冷凍後，於流水下融解。反覆此冷凍、融解處理2次。接著，處理懸浮液以105000Xg離心90分，分別回收上清液及沈澱。沈澱提供與上述同樣之冷凍、融解〜離心分離之處理。回收上清液，合併先前之上清液，得520毫升之粗酵素抽出液。將粗抽出液260毫升施於以20 mM磷酸緩衝液（pH 7.0) 平衡之100毫升DEAE-瓊脂糖FF (阿瑪歇母·法馬西亞公司製）管柱，洗除非吸著物質。接著，進行藉由含1 M NaCl 之該緩衝液之溶離，回收神經醯胺酶活性部分160毫升。 63426-950324.DOC - 33 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 12723 C^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（31 ) 該部分接著施於以含lMNaCl之20mMTris-HCl緩衝液 (pH 7.5)平衡之1〇〇毫升之苯基-瓊脂糖FF (阿瑪歇母·法馬西亞公司製）管柱後，以2 Μ至0 Μ之NaCl濃度之梯度溶離，再以〇%至1%之聚多卡醇（Polidocanol)(商品名：魯布洛口一 A) PX，拿卡來鐵斯克（十力今彳于只夕）公司製）之濃度之梯度溶離。藉此層析法，回收310毫升神經醯胺酶活性部分。將所得活性部分，施於以含〇·5 M NaCl及0.1%魯布洛 PX之20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)平衡之25毫升之螯合瓊脂糖FF (阿瑪歇母.法馬西亞公司.製，〇112+結合型）管柱。以含該緩衝液及01。/。之魯布洛PX之2〇 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5)洗淨管柱後，以含2 M NH4C1、0.1%之魯布洛PX之20 mM Tds-HCl緩衝液（pH 7·5)進行酵素之溶離。溶離之活性部分以超濾過濾，濃縮得濃縮物。接著，將濃縮物中之緩衝液換成含0.1%之魯布洛ΡΧ之20mMTris-HC1緩衝液（pH 7.5)，得酵素液。所得之酵素液30毫升再施於以含0.1%之魯布洛PX之20mMTris-HCl緩衝液（pH 7.5)平衡之波洛斯（求口只）HQ管柱（φ4·6 X 100毫米， Parceptive Bi〇SyStems 公司製）。接著，以〇 Μ 至 0.5 Μ 之 NaCl濃度梯度溶離，得活性部分。此活性部分施於以含 0.2 M NaCl，〇·ι%之魯布洛ρχ之i mM磷酸緩衝液（pH 7.0) 平衡之羥基阿巴肽（，、4卜'口丰シ了 A夕4卜）管柱（φ7·5 X 100毫米，Pentax公司製）。神經醯胺酶回收於不吸著於本管柱而通過之部分。接著，將該部分提供以含0.2 Μ 63426-950324.DOC - 34 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 12723 C^D89105490l£4^J t 中文說明書替換頁(95年3月） g 五、發明説明（32 )

NaCl，0.3% 之魯布洛 PX 之 20 mM Tds-HCl 緩衝液（pH 7.5) 平衡之速巴洛斯（只一八一口一只）200 HR管柱（（φ 10 X 300 毫米，阿瑪歇母·法馬西亞公司製）之凝膠過濾層析法，得純化之神經醯胺酶。以上之純化操作結果，得58毫克之純化之神經醯胺酶標品。又，對所得之純化之神經醯胺酶標品之種種性質，如本說明書所記載地檢討時，如下述。作用：水解神經醯胺，生成鞘胺基醇鹼與脂肪酸。基質特異性：具如前述表1所示之基質特異性。最適pH :如圖1結果所示，本神經醯胺酶之最適pH為 7.0〜8·0溫度穩定性：於含0.1%聚多卡醇（Polidocanol)[商品名：魯布洛（Lubrol) PX]之 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液中，37 °C下處理24小時之情形無見到活性降低，但於 60 °C處理1小時比處理前之活性，降低約30%。分子量：藉由SDS-PAGE (還原條件下）為約94 kDa。又，由糖肽酶下消化之本酵素藉由SDS-PAGE (還原條件下）為約 73 kDa。實施例2神經醯胺酶之部分胺基酸序列分析於含50微微莫耳之試樣液11毫升中，加含0.3%魯布洛 PX之20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)。所得試樣液施於 Mono Q PC1 6/5管柱（100微升，阿瑪歇母·法馬西亞公司製）。接著，以含0.4 M NaCl之該緩衝液溶離吸著於管柱之神經醯胺酶部分。藉此操作，將含神經醯胺酶之部分，濃縮成50微升。所得濃縮液提供SDS-聚丙晞醯胺凝膠電 63426-950324.DOC - 35 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 0^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（33 ) 泳，電泳後之凝膠以 GelCode Blue Stain reagent (染色試劑），（皮亞士（匕° 7只）公司製）染色。接著，切出神經醯胺酶之環帶。切出之凝膠片段之1/4以含0.1% SDS之300 微升之〇·1 M Tds-HCl緩衝液（pH 9.0)，於37°c抽出16小時。所得之抽出液作為試樣，使用G1005A蛋白質排序系統（修雷特·巴卡德（匕二一k 7卜·八7力一卜、）公司製）進行神經醯胺酶之N末端胺基酸序列解析，決定胺基酸序歹ij N-term。序列表之序列編號：1顯示N-term之胺基酸序列。又，切出之凝膠片段之剩下之3/4，於1毫升之0·5 Μ Tris_HCl緩衝液（pH 9.2) / 50%乙腈中，於30 °C洗45分。使用N2及離心濃縮機，.將凝膠完全乾燥後，加含0.5微克蛋白酶Lys-C (和光純藥社製）之10微升之0.5 M Tris-HCl緩衝液（卩119.2)，再加〇.1%丁1^-11(：1緩衝液（？119.2)於37°〇保溫16小時至凝膠完全膨脹為止，進行神經醯胺酶之蛋白酶消化。反應終了後，使用150微升之0.1%三氟乙酸 / 60%乙腈，於室溫抽出1小時之操作進行2次，回收抽出液。此抽出液提供逆相層析法，進行肽片段之純化。所得肽片段以使用G1005A蛋白排序系統之衛德曼分離法分析，決定部分胺基酸序列 C-46，C-53。序列表之序列編號：2，3分別顯示C-46，C-53之胺基酸序列。實施例3含神經醯胺酶基因之DNA片段藉由PCR之擴增基於實施例2決定之神經醯胺酶之部分胺基酸序列C-53，設計意義混合引子_53_S1，反義混合引子53-A3，以 63426-950324.DOC - 36 - 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723⑽89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（34 ) DNA合成機合成。序列表之序列編號：4，5中分別顯示引子53_S1，53-A3之鹼基序列。用此等引子進行PCR。PCR 以小鼠肝臟cDNA質體基因庫（寶酒造社製）為模板進行。 PCR 於 94°C，9 分後，以 94°C，0.5 〜51°C，0.5 分〜72 °C ，1 分為 1 次循環，進行 40 次循環，再於 72 °C保溫7分而進行。藉此PCR，以瓊脂糖電泳檢測約70 bp之特異性擴增之DNA片段。以凝膠回收此擴增DNA，將此併入pGEM-T easy載體 (普洛美加（7 口〆力')公司製），構築重組質體·進行解析該質體之插入DNA片段之鹼基序列之結果，決定此片段之部分鹼基序列P-1。序列表之序列編號：6中顯示P-1之驗基序列。該序列為對應於實施例2決定之神經酸胺酶之部分胺基酸序列C-53之序列，確認可取得作為目的之神經醯胺酶之基因之一部分。基於此P-1之鹼基序列，設計反義引子MA1及MA2而合成。序列表之序列編號：7，8中分別顯示引子MA1， MA2之鹼基序列。又基於小鼠肝臟cDNA質體基因庫之構築中所用之載體pAP3neo之鹼基序列，設計意義引子T7in 及T7out並合成。序列表之序列編號·· 9，10分別顯示引子T7in及T7out之鹼基序列。用此等引子，進行以小鼠肝臟cDNA基因庫為模板之尼斯替德（才、只于< 7卜' )PCR。作為第1次PCR，首先使用意義引子7out及反義引子 MA2，於 94°C，9 分後，以 94°C，0.5 分〜51°C，0.5 分〜72 °C，2分為1次循環，進行40次循環之反應，再於 63426-950324.DOC - 37 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 12723⑽891G549G號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（35 ) 72 °C保溫7分。另外，第2次PCR，以第1次PCR之反應液之模板，使用意義引子T7in及反義引子及MA1，以外與第1次PCR相同條件下進行。此結果可得335 bp之擴增DNA片段。將此作為以下所示之群落雜交之探針。實施例4神經醯胺酶基因之選殖將導入小鼠肝臟cDNA質體基因庫之轉形體，播種於含 100微克/毫升之安匹西林之LB瓊脂培養皿上之尼龍濾膜 (商品名：害孟德（/、彳水 > 卜' )-N+，阿瑪歇母·法馬西亞公司製），製作每1個9.5X13.5公分之培養孤形成約3萬個之群落之原始濾膜。製作此濾膜之複製品，所得之複製濾膜分別於浸於10% SDS溶液之濾紙上處理5分；浸於 0·5 M NaOH、1.5 M N.aCl溶液之濾紙上處理5分（變性）；浸於含3 M NaCl之0.5 M Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)之濾紙處理5分（中和）；浸於2 X SSC溶液之遽紙上處理5分。接著以2 X SSC溶液洗濾膜。將此濾膜風乾後，以紫外線照射，將DNA固定於濾膜上，作為群落雜交用濾膜。作為雜交之探針，使用相當於0.1微克之實施例3所得之擴增DNA片段之DNA標記套組，Ready To Go (法馬西亞公司製），依照該套組之實驗計劃書，使用以32P標記者。將上述濾膜放入雜交袋，於雜交溶液（組成：7% PEG6000，10% SDS溶液）中，於60 °C進行預雜交後，加上述之標記探針使成0.006微微莫耳/毫升，於60 °C進行一夜之雜交。其次，於先加溫至60°C之洗液（2XSSC，0.1% SDS)中，於60 °C各15分3次地洗濾膜。自濾器除去多餘 63426-950324.DOC - 38 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) Α7 Β7 12723 0^0891054901^ # M t if ^ 中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（36 ) 之水分後，於富士軟片公司製顯像皿中感光20分後，以 BAS1000顯像分析儀（富士軟片公司製）檢測信號。接著採取對應於藉由本操作所得之陽性信號之原始濾膜上之群落 (1次篩選）。將採集之群落懸浮於含有100微克/毫升安匹西林之LB 培養基後，播種於含有100微克/毫升安匹西林之9.5 X 13.5公分之LB瓊脂培養m上之尼龍遽膜，使每個形成 200〜1000個群落，製作原始濾膜。對此此濾膜，藉與1次篩選同樣之方法，進行陽性克隆之篩選，再以同樣操作實施3次篩選。3次篩選結果，可分離認為含神經醯胺酶基因之陽性克隆。自以陽性克隆製備.質體，將此命名為質體pLCDase，該質體以種種限制酶或複數之限制酶之組合消化後，將生成之各DNA亞選殖解析其鹼基序列。藉此決定插入質體 pLCDase之DNA片段之全驗基序歹J 。該序歹J示於序列表之序列編號：11。又，於該序列中發現之開放讀碼（ORF)之鹼基序列及於此處編碼之多肽之胺基酸序列分別示於序列表之序列編號：12及13。另外，上述之DNA片段之限制酶地圖及含於該DNA片段中之開放讀碼之位置示於圖2。解析上述之ORF之鹼基序列時，於此中含有編碼實施例 2明白之神經醯胺酶之部分胺基酸序列之鹼基序列，確認此ORF編碼神經酿胺酶。又，受該ORF編碼之神經酿胺酶之胺基酸序列與序列表之序列編號·· 1中所示之神經醯胺酶之胺基酸序列比較，則自小鼠肝臟純化之神經醯胺酶 63426-950324.DOC - 39 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 12 73 0^)8910549()號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（37 ) 顯示缺少受上述ORF編碼之多肽中之N末端部分之肽。亦即，神經醯胺酶顯示轉譯後受到除去其N末端部分之處理轉換成成熟型酵素。序列表之序列編號：14表示成熟型神經醯胺酶之胺基酸序列，又，序列之序列編號：15表示編碼成熟型神經醯胺酶之驗基序列。實施例5神經醯胺酶基因之表現於直徑35毫米之培養亚中，以含10% FCS 養基培養之CHO細胞（3X155細胞/皿），加實施例4所得之質體pLCDase 1微克與脂肥克托胺（寸水7二夕卜7 S > )(生命技術（今彳7 ·于夕/ 口 ^ X )公司製）5微升，而將神經醯胺酶基因導入CHO細胞。此細胞於37 °C 培養24小時後，懸浮於含0.1% TritonX-100之100微升之 10 mM Tds-HCl (pH 7.5)，將細胞粉碎。對所得之細胞粉碎液，進行以上述之C12_NBD-神經醯胺為基質之神經醯胺酶活性測定時，於此細胞與神經醯胺酶無導入pLCDase之對照細胞比較，確認約1000倍強之表現。另外，依 Analytical Biochemistry 第 244 卷，第 291 〜300 頁（1997)記載之方法，測定細胞内之神經醯胺量時，於導入pLCDase之細胞與無導入之對照細胞比較，確認神經醯胺量有意義地減少。實施例6自小鼠腦選殖神經醯胺酶基因將硝基纖維素膜（使用 Schleicher & Schuell公司， PROTRAN BA85 0.45毫米，直徑82毫米）置於含安匹西林 100微克/毫升之LB瓊脂培養m上，將小鼠cDNA基因庫 63426-950324.DOC - 40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 12723 (^189105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（38 ) (LIFE TECHNOLOGIES 公司，SUPERSCRIPT Mouse Brain cDNA Library )播種於其10個培養皿，使每個亚約20萬個群落，於37 °C培養1小時。將硝基纖維素膜上產生之大腸菌謄取於尼龍膜[PALL Gelman Laboratory公司，拜歐代恩彳才夕W > )A直徑82毫米（1·2毫米）]，分別置於安匹西林皿上後，於37 °C培養3小時。硝基纖維膜作為原始濾膜，保存於4 °C，尼龍膜置於氯黴素狐上，於37 °C 培養16小時。將群落自尼龍膜謄取於新的尼龍膜，將各組尼龍重疊地，以 1 毫升之變性液（0.5 Μ NaOH/Ι·5 Μ NaCl)，表與裏分另J處理5分。同樣地以1毫升中和液[0.5 M Tris-HCl (pH 7.4)/1.5 M NaCl]處理 5 分。分離尼龍膜，於 80 °C培養2小時。其後，以 200毫升之預洗液[5 X SSC/0.5% SDS/1 毫升 EDTA (pH 8.0)]振盪 10 分，拭去大腸菌碎片，以2 X SSC洗淨。以40毫升之雜交液[0.5 Μ邱氏磷酸/ 7% SDS/1 mM EDTA ]於65 °C進行2小時預雜交後，於含變性後之探針之40毫升之雜交液中，於65 t進行16 小時之雜交。作為探針使用含小鼠神經醯胺酶基因之質體 pAPLCD 之 EcoRI_EcoRI 片段 2·7 kbp。雜交終了後，以 100 毫升之洗液（40 mM邱氏磷酸/ 1% SDS)於65 °C進行15分之洗淨2次。再以100毫升之嚴苛洗液（0.2XSSC/0.1% SDS) 於65 °C洗15分。風乾膜後，暴露於IP- m 1小時，以 BAS 1500進行解析。將陽性部分之硝基纖維素膜切出直徑約6毫米懸浮於1毫升之LB培養基後，將稀釋4000倍之試樣200毫升播種於加入安匹西林之LB m，進行第2次 63426-950324.DOC - 41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723 0^)89105490¾ 4 M t If t 中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（39 ) 篩選。同樣地將陽性部分稀釋10000倍之試樣200毫升播種於加入安匹西林之LB皿，製作基因庫，使用此基因庫進行第3次篩選。分離之克隆（pSBCD)亞選殖後，依一定方法決定鹼基序列。其序列示於序列編號：16。前述序列中，發現具有與實施例4中記載之來自小鼠肝臟之神經醯胺酶基因同一序列之ORF。又，5’非轉譯區及 3’非轉譯區之序列，與來自小鼠肝臟者不同。又，分離之質體pSBCD與實施例5同樣地導入CHO細胞時，於溶細胞確認神經醯胺酶之表現。實施例7人類神經醯胺酶基因之基因組選殖基於實施例4決定之來自肝臟之神經醯胺酶基因之序列，合成具有序列表之序列編號：17所示之序列之意義引子U1107及序列表之序列編號：18所示之序列之反義引子 L1311。U1107引子之序列相當於序列表之序列編號：12 之鹼基編號：1107〜1130之序列，L1311引子之序列相當於序列編號：12之鹼基編號：1311〜1334之序列之互補之鹼基序列。自人類肝臟癌細胞Huh7，依習用法純化基因組DNA。將所得之基因組DNA 625毫微克為模板，使用U1107引子及L1311引子進行PCR。PCR於94°C，9分後，以94°C ，0.5分〜55 °C，0.5分〜72 °C，3分為1次循環，進行40 次循環，再於72 °C進行7分之保溫反應。接著，將所得反應物提供瓊脂凝膠電泳之結果，藉此PCR確認擴增約2 63426-950324.DOC - 42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 12723(^)89105490¾^^ 中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（4〇 ) kbp之DNA片段。使用Sephaglas (法馬西亞公司製），自凝膠回收此DNA 片段，將所得片段併入pGEM-T easy載體（普洛美加公司製），構築重組質體。接著，決定所得質體之插入DNA片段之鹼基序列。前述序列為相當於GenBank之資料庫登記之 Accession No. AC012131 Complement 之 96289〜98478 之序列。又，前述序列所編碼之胺基酸序列進行解析時，發現編碼與序列表之序列編號：4所示之來自小鼠肝臟之神經醯胺酶胺基酸序列之胺基酸編號：370〜444之區域顯示同源性之胺基酸序列之區域。又，AC012131亦與實施例4所決定之來自小鼠肝臟之神經醯胺酶基因具同源性。無序列表正文於序列編號：1所示之序列，胺基酸編號：7，9及13 之Xaa表不明之胺基酸。序列編號：4為引子用之合成寡核棼酸序列。前述序列中，鹼基編號：6，9及15之η表G、A、T或C。序列編號：5為引子用之合成寡核铝酸序列。前述序列中，鹼基編號：3，6及15之η表G、A、T或C。序列編號：7為引子用之合成寡核甞酸序列。序列編號：8為引子用之合成寡核苷酸序列。序列編號：9為引子用之合成寡核嘗酸序列。序列編號：10為引子用之合成寡核苷酸序列。序列編號：11為引子用之合成寡核苷酸序列。 63426-950324.DOC - 43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 12723 (^)89105490號專利申請案中文說明書替換頁(95年3月）五、發明説明（41 ) 序列編號：17為引子用之合成寡核甞酸序列。序列編號：18為引子用之合成寡核甞酸序列。產業上之利用可能性根據本發明，提供編碼來自哺乳類之中性、鹼性神經醯胺酶之基因，又，提供使用該基因之神經醯胺酶之基因工程製造方法，又，本發明之寡核甞酸探針及引子，有用於前述基因之檢測，得以應用於生體内之神經si胺代謝研究等。另外，根據本發明，提供本發明基因之反義核酸 (DNA，RNA )。此基因及其反義核酸有用於生體内神經醯胺酶活性之控制，神經醯胺代謝系之調節，提供可應用於起因於神經酸胺量之異常之疾病之治療等之神經酸胺量之調節方法。序列表 <110〉Takara Shuzo 公司 <120>編碼神經醯胺酶之基因

<130> 00-011-PCT <140> JP 11/84743 <141〉199-3-26 63426-950324.DOC - 44 - 本紙痕尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

Claims

I272I8105490號專利申請案中文申請專利範圍替換本(95年8月） A8 B8 C8 D8

曰修(#正本 k一—具-这自、列核酸之驗基序列之基因： (A)為編碼具序列表之序列編號：14記載之胺基酸序列或其一部分之多肽之核酸，且該多肽具神經醯胺酶活性： Phe Ser Gly Tyr Tyr He Gly Val Gly Arg Ala Asp Cys Thr Gly 15 10 15 Gin Val Ser Asp lie Asn Leu Met Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Gin 20 25 30 Asn Ala Arg Gly Leu Leu Thr Arg Leu Phe Ser Arg Ala Phe lie 35 40 45 Leu Ala Asp Pro Asp Gly Ser Asn Arg Met Ala Phe Val Ser Val 50 55 60 Glu Leu Cys Met lie Ser Gin Arg Leu Arg Leu Glu Val Leu Lys 65 70 75 Arg Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Arg Arg Asp Asn Val 80 85 90 lie Leu Ser Ala lie His Thr His Ser Gly Pro Ala Gly Phe Phe 95 100 105 Gin Tyr Thr Leu Tyr Me Leu Ala Ser Glu Gly Phe Ser Asn Arg 110 115 120 Thr Phe Gin Tyr He Val Ser Gly He Met Lys Ser lie Asp He 125 130 135 Ala His Thr Asn Leu Lys Pro Gly Lys He Phe lie Asn Lys Gly 140 145 150 Asn Val Ala Asn Val Gin lie Asn Arg Ser Pro Ser Ser Tyr Leu 63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）. 1272308 Ss C8 D8 六、申請專利範圍 Leu Asn Pro Gin Ser Glu Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Asp 170 175 180 Lys Glu Met Leu Val Leu Lys Leu Val Asp Leu Asn Gly Glu Asp 185 190 195 Leu Gly Leu He Ser Trp Phe Ala lie His Pro Val Ser Met Asn 200 205 210 Asn Ser Asn His Phe Val Asn Ser Asp Asn Met Gly Tyr Ala Ala 215 220 225 Tyr Leu Phe Glu Gin Glu Lys Asn Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gin 230 235 240 Gly Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala Ser Ser Asn Leu Gly Asp Val 245 250 255 Ser Pro Asn He Leu Gly Pro His Cys Val Asn Thr Gly Glu Ser 260 265 270 Cys Asp Asn Asp Lys Ser Thr Cys Pro Asn Gly Gly Pro Ser Met 275 280 285 Cys Met Ala Ser Gly Pro Gly Gin Asp Met Phe Glu Ser Thr His 290 295 300 lie lie Gly Arg lie lie Tyr Gin Lys Ala Lys Glu Leu Tyr Ala 305 310 315 Ser Ala Ser Gin Glu Vai Thr Gly Pro Val Leu Ala Ala His Gin 320 325 330 Trp Val Asn Met Thr Asp Val Ser Val Gin Leu Asn Ala Thr His 335 340 345 Thr Val Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Phe Ala Ala 350 355 360 Gly Thr lie Asp Giy Val Ser Gly Leu Asn lie Thr Gin Giy Thr 365 370 375 63426-950825.DOC -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）· A B c D 1272308 六、申請專利範圍 Thr Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gin Leu Leu 380 385 390 Gly Lys Pro Ser Glu Glu He Val Glu Cys Gin Lys Pro Lys Pro 395 400 405 [le Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr lie Pro His Pro Trp Gin 410 415 420 Pro Asp He Val Asp Val Gin lie Val Thr Val Gly Ser Leu Ala 425 430 435 lie Ala Ala lie Pro Gly Glu Leu Thr Vnr Met Ser Gly Arg Arg 440 445 450 Phe Arg Glu Ala lie Lys Lys Glu Phe Ala Leu Tyr Gly Nfet Lys 455 460 465 Asp Met Thr Val Val lie Ala Gly Leu Ser Asn Val Tyr Thr His 470 475 480 Tyr lie Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Gin Ala Gin Arg Tyr Glu Ala 485 490 495 Ala Ser Thr lie Tyr Gly Pro His Thr Leu Ser Ala Tyr lie Gin 500 505 510 Leu Phe Arg Asp Leu Ala Lys Ala lie Ala Thr Asp Thr Val Ala 515 520 525 Asn Met Ser Ser Gly Pro Glu Pro Pro Phe Phe Lys Asn Leu He 530 535 540 Ala Ser Leu lie Pro Asn He Ala Asp Arg Ala Pro He Gly Lys 545 550 555 His Phe Gly Asp Val Leu Gin Pro Ala Lys Pro Glu Tyr Arg Val 560 565 570 63426-950825.DOC - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）. A8 B8 C8 D8 1272308 申請專利紅圍 Gly Glu Val Val Glu Val He Phe Val Gly Ala Asn Pro Lys Asn 575 580 585 Ser Ala Glu Asn Gin Thr His Gin Thr Phe Leu Thr Val Glu Lys 590 595 600 Tyr Glu Asp Ser Val Ala Asp Trp Gin lie Met Tyr Asn Asp Ala 605 610 615 Ser Trp Glu Thr Arg Phe Tyr Trp His Lys Gly lie Leu Gly Leu 620 625 630 Ser Asn Ala Thr He Tyr Trp His lie Pro Asp Thr Ala Tyr Pro 635 640 645 Gly lie Tyr Arg He Arg Tyr Phe Gly His Asn Arg Lys Gin Ciu 650 655 660 Leu Leu Lys Pro Ala Val He Leu Ala Phe Glu Gly lie Ser Ser 665 670 675 Pro Phe Glu Val Val Thr Thr 680 (B)為具序列表之序列編號：15記載之鹼基序列或其部分之核酸，其係編碼具神經醯胺酶活性之多肽： ttcagtggct actacattgg cgttgggaga gcggattgca caggacaagt gtcagatatc 60 aatttgatgg gctatggcaa aaatggccag aatgcacggg gtctcctcac caggctgttc 120 agccgtgctt ttatcttggc ggatccagat gggtcaaatc gaatggcatt tgtgagcgtg 180 gaactatgta tgatttccca acgactgagg ttggaggtcc tgaagagact agagagtaaa 240 tatggctctc tgtatcgaag agacaatgtt atcctgagtg ccattcacac acactctggc 300 ccagcagggt ttttccaata tacactctat atactcgcca gcgagggatt cagcaaccgg 360 acctttcagt acatagtctc tgggatcatg aagagcattg atatagctca cacaaatctt 420 aaaccaggca aaatctttat caacaaagga aatgttgcta atgtgcagat caaccgaagc 480 63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A BCD 1272308 申請專利範圍 ccctcctctt accttctgaa tccacagtca gagagagcaa ggtattcttc aaacacagac 540 aaggaaatgc tggtcttgaa actggtggat ttgaatggag aagacttggg tcttatcagc 600 tggtttgcca tccaccccgt gagcatgaac aatagcaacc actttgtgaa tagtgacaat 660 atgggctatg cggcttacct ttttgagcaa gaaaagaaca aaggctatct gcctggacag 720 ggaccgtttg tagcaggctt tgcttcatca aatctcggag acgtgtcacc caacattctt 780 ggcccgcatt gtgtcaacac aggggagtct tgtgacaacg acaagagcac ctgtcccaac 840 ggtgggccta gcatgtgcat ggccagcgga cctggacaag acatgtttga gagcacacac 900 attataggac ggatcatcta tcagaaggcc aaggagctgt atgcctctgc ctcccaggag 960 gtgaccggcc cagtgcttgc agctcaccag tgggtgaaca tgacagatgt gagcgtccag 1020 ctcaatgcca cacacacagt gaagacgtgt aaacctgccc tgggctacag ttttgccgca 1080 ggcacaattg atggagtttc gggcctcaat attacacagg gaactacgga aggggatcca 1140 ttctgggaca ctcttcggga ccagctcttg ggaaaaccat ctgaagagat tgtagagtgt 1200 cagaaaccca aaccaatcct gcttcacagt ggagagctga cgataccaca tccttggcaa 1260 ccagatattg ttgatgttca gattgttacc gttgggtcct tggccatagc tgctatccct 1320 ggggaattaa caaccatgtc gggacgaaga tttcgtgagg caattaaaaa agaatttgca 1380 ctttatggga tgaaggatat gaccgttgtt atcgcaggtc taagcaatgt ttatacacat 1440 tacattacca catatgaaga ataccaggct cagcggtacg aggcagcatc tacaatctat 1500 ggaccacaca ccctgtctgc atacatccaa ctcttcagag accttgctaa ggcaattgct 1620 acggacacag tagccaacat gagcagtggt cccgagcctc cattcttcaa aaatctaata 16¾) gcttcactta ttcctaatat tgcggataga gcaccaattg gcaaacattt tggggatgtc 1680 ttgcagccag caaaacctga atacagagtg ggagaagtgg ttgaagttat atttgtaggc 1740 gctaacccaa agaattcagc agagaaccag acccatcaaa ccttcctcac tgtggagaaa 1800 tacgaggact ctgtagctga ctggcagata atgtataacg atgcctcctg ggagacgagg I860 ttttattggc acaaaggaat actgggtctg agcaatgcaa caatatactg gcatattcca 1920 gatactgcct accctggaat ctacagaata agatattttg gacacaatcg gaagcaggaa 1980 cttctgaaac ccgctgtcat actagcattt gaaggaattt cttctccttt tgaagttgtc 2040 actact tag 2049 63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A8 B8 C8

1272308 =為可於嚴苛料下，與序列表之序列編號：15 :載之驗基序列之互補鏈雜交之核酸，且該核酸係編 ’〜、可水解選自由⑴N_ +二醯基神經鞠胺醇、（ϋ)Ν_ 軟脂醯基神經鞘胺醇、⑴i)N硬脂酿基神經鞍胺醇、 (1V)N-軟脂酿基二氯勒㈣、⑺N-硬脂酿基二氫靭 2酵：（W)C12-NBD神經醯胺所組成之群中任一物質之活性之多肽，其中該嚴苛條件係指於含有】〇% SDS溶液之7% PEG6〇〇〇雜交溶液於㈣進行，並以含有〇.1% SDS之2xSSC清洗液，於⑽各 1 5分3次清洗濾膜。 2.根據中請專利範圍第丨項之基因，其中之多肽之神經醯胺酶活性可藉由下列步驟檢測： (a)將基因之表現產物於反應混合液[組成：2〇 # 1之 25福丁比-此1緩衝液（1)117.5)中，55〇13111〇1之〇2· NBD神經醯胺，及i ·〇% (w/v)膽酸鈉]中，於37 t下谇養30分使其反應之步驟，及 (b)對所得之反應物’檢測C12_NBD<^t肪酸之生成之步驟。 3·根據申請專利範圍第1或2項之基因，其中之多肤呈現至少下列性質： ⑴作用··將神經醯胺水解，生成鞘胺基醇鹼與脂肪酸； (ii)基質特異性：將N-醯基神經鞘胺醇水解；對半乳糖基神經醯胺、硫腦脂、GMla、鞘磷脂無作用； 63426-950825.DOC _ 6 - A BCD 1272308 六、申請專利範圍 (iii) 最適 pH 為 7.0〜8.0 ; (iv) 於含 0.1% 聚多卡醇（polidocanol)之 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液中，37 °C下處理24小時下來未見活性降低，但60 °C下處理1小時則活性降低為處理前活性之約30%。 4. 一種申請專利範圍第1〜3項之基因所編碼的具神經醯胺酶活性之多肽之製造方法，其特徵為在適於神經醯胺酶基因表現且生產該基因所編碼之多肽之條件下，培養轉形體，自所得之培養物採取具神經醯胺酶活性之多肽。 5. —種多肽，其係具有序列表之序列編號：14記載之胺基酸序列或其一部分，且具有神經醯胺酶活性： 63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1272308 έβ8 C8 D8 六、申請專利範圍 Phe Ser Gly Tyr Tyr lie Gly Val Gly Arg Ala Asp Cys Thr Gly 15 10 15 Gin Val Ser Asp lie Asn Leu Met Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Gin 20 25 30 Asn Ala Arg Gly Leu Leu Thr Arg Leu Phe Ser Arg Ala Phe He 35 40 45 Leu Ala Asp Pro Asp Gly Ser Asn Arg Met Ala Phe Val Ser Val 50 55 60 Glu Leu Cys Met He Ser Gin Arg Leu Arg Leu Clu Val Leu Lys 65 70 75 Arg Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Arg Arg Asp Asn Val 80 85 90 He Leu Ser Ala He His Thr His Ser Gly Pro Ala Gly Phe Phe 95 100 105 Gin Tyr Thr Leu Tyr lie Leu Ala Ser Giu Gly Phe Ser Asn Arg 110 115 120 Thr Phe Gin Tyr He Val Ser Gly lie Met Lys Ser He Asp He 125 130 135 63426-950825.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1272308 έβ C8 D8 六、申請專利範圍 Ala His Thr Asn Leu Lys Pro Ciy Lys lie Phe He Asn Lys Cly 140 145 150 Asn Val Ala Asn Val Gin Ue Asn Arg Ser Pro Ser Ser Tyr Leu 155 160 165 Leu Asn Pro Gin Ser Glu Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Asp 170 175 180 Lys Giu Met Leu Val Leu Lys Leu Val Asp Leu Asn Giy Glu Asp 185 190 195 Leu Gly Leu He Ser Trp Phe Ala [le His Pro Val Ser Met Asn 200 205 210 Asn Ser Asn His Phe Val Asn Ser Asp Asn Met Gly Tyr Ala Ala 215 220 225 Tyr Leu Phe Glu Gin Glu Lys Asn Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gin 230 235 240 Gly Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala Ser Ser Asn Leu Gly Asp Val 245 250 255 Ser Pro Asn He Leu Gly Pro His Cys Val Asn Thr Gly Glu Ser 260 265 270 Cys Asp Asn Asp Lys Ser Thr Cys Pro Asn Gly Gly Pro Ser Met 275 280 285 Cys Met Ala Ser Gly Pro Gly Gin Asp Met Phe Glu Ser Thr His 290 295 300 He lie Gly Arg lie lie Tyr Gin Lys Ala Lys Glu Leu Tyr Ala 305 310 315 Ser Ala Ser Gin Glu Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Ala His Cln 320 325 330 63426-950825.DOC -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A B c D 1272308 六、申請專利範圍 Trp Val Asn Met Thr Asp Val Ser Vai Gin Leu Asn Ala Thr His 335 340 345 Thr Val Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Phe Ala Ala 350 355 '360 Gly Thr lie Asp Gly Val Ser Gly Leu Asn [le Ήίγ Gin Gly Thr 365 370 375 Thr Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gin Leu Leu 380 385 390 Gly Lys Pro Ser Glu Clu He Val Glu Cys Gin Lys Pro Lys Pro 395 400 405 lie Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr He Pro His Pro Trp Cln 410 415 420 Pro Asp He Val Asp Val Gin He Val Thr Val Gly Ser Leu Ala 425 430 435 lie Ala Ala lie Pro Gly Glu Leu Thr Thr Met Ser Gly Arg Arg 440 445 450 Phe Arg Glu Ala lie Lys Lys Glu Phe Ala Leu Tyr Gly Met Lys 455 460 465 Asp Met Thr Val Val He Ala Gly Leu Ser Asn Val Tyr Thr His 470 475 480 Tyr lie Thr Thr Tyr Glu Giu Tyr Gin Ala Gin Arg Tyr Glu Ala 485 490 495 Ala Ser Thr lie Tyr Gly Pro His Ihr Leu Ser Ala Tyr lie Gin 500 505 510 Leu Phe Arg Asp Leu Ala Lys Ala lie Ala Thr Asp Thr Val Ala 515 520 525 Asn Met Ser Ser Gly Pro Glu Pro Pro Phe Phe Lys Asn Leu He 530 535 540 Ala Ser Leu He Pro Asn He Ala Asp Arg Ala Pro He Gly Lys 63426-950825.DOC - 10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）. 1272308 έβ8 C8 D8 六、申請專利範圍 545 550 555 His Phe Gly Asp Val Leu Gin Pro Aia Lys Pro Glu Tyr Arg Val 560 565 570 Gly Glu Val Val Glu Val He Phe Val Gly Ala Asn Pro Lys Asn 575 580 585 Ser Ala Glu Asn Gin Thr His Gin Thr Phe Leu Thr Val Giu Lys 590 595 600 Tyr Glu Asp Ser Val Ala Asp Trp Gin He Met Tyr Asn Asp Ala 605 610 615 Ser Trp Glu Thr Arg Phe Tyr Trp His Lys Gly He Leu Gly Leu 620 625 630 Ser Asn Ala Thr lie Tyr Trp His lie Pro Asp Thr Ala Tyr Pro 635 640 645 Gly He Tyr Arg lie Arg Tyr Phe Gly His Asn Arg Lys Gin Glu 650 655 660 Leu Leu Lys Pro Ala Val lie Leu Ala Phe Glu Gly He Ser Ser 665 670 675 Pro Phe Glu Val Val Thr Thr 680 〇 6. —種具有神經醯胺酶活性之多肽，其係由申請專利範圍第1〜3項中任一項之基因所編碼。 7. 根據申請專利範圍第5或6項之多肽，其神經醯胺酶活性係可藉由下列步驟檢測： (a)將基因之表現產物，於反應混合液[組成：20 # 1 之 25 mM Tds-HCl 緩衝液（pH 7.5)中，550 p m ο 1 之 C12-NBD-神經醯胺，及1.0% (w/v)膽酸鈉]中，於37 °C下培 63426-950825.DOC - 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 12723〇8 申請專利範園養30分使其反應之步驟，及 (b)對所得之反應物，檢測⑴胃NBD-脂肪酸生成之步驟。 8·—種反義DNA，其係互補於中請專利範圍帛η項中任—項之基因。種反義RNA ’其係互補於申請專利範圍第υ項中任—項之基因。、 10.—種18〜40驗基之募核誓酸探針或引子，其係在嚴苛條件下得以與申請專利範圍第卜3項中任一項之基因或其互補鏈特異性雜交。 U· 一種抗體或以肽酶處理該抗體而得之片⑨，其係得以與申凊專利範圍第5〜7項中任一項之多肽特異性結合。 12 •一種編碼具神經醯胺酶活性之多肽之基因檢測方法，其係使用申請專利範圍第1〇項之寡核甞酸探針及/引子。 13·種供檢測編碼具神經醯胺酶活性之多肽之基因之· 組，其係含申請專利範圍第1〇項之寡核甞酸探針及或引子。认一種具神經醯胺酶活性之多肽檢測方法，其係使用明專利範圍第1丨項之抗體或以肽酶處理該抗體而得片段。 15·種供檢測具神經酿胺酶活性之多肽之套組，其係有申清專利範圍第11項之抗體或以肽酶處理該抗體 63426-950825.DOC 或套中之含而 .12· 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X297公董） 1272308 六、申請專利祀圍得之片段。 16· —種於活體外調節細胞内及/或組織内之神經醯胺量之方法，其特徵為將申請專利範圍第1〜3項中任一項之基因導入細胞及/或組織’籍其調節細胞内及/或組織内之神經醯胺量。 17. —種重組D N A，其係含有如申請專利範圍第1〜3項中任一項之基因。 18_ —種微生物、動物細胞或植物細胞用表現載體，其係含有如申請專利範圍第1〜3項中任一項之基因或申诖專利範圍第4項之重組D N A。一 ^ 19. 一種轉形體，其係保有如申請專利範圍第^ 載體。項之表現 20. —種表現載體，其係含有如申請專利範義DN A。貝之反 63426-950825.DOC -13 -

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