CZ9902005A3 - Nové calpainy, jejich výroba a použití - Google Patents

Nové calpainy, jejich výroba a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ9902005A3
CZ9902005A3 CZ992005A CZ200599A CZ9902005A3 CZ 9902005 A3 CZ9902005 A3 CZ 9902005A3 CZ 992005 A CZ992005 A CZ 992005A CZ 200599 A CZ200599 A CZ 200599A CZ 9902005 A3 CZ9902005 A3 CZ 9902005A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ncl
calpain
leu
gene
arg
Prior art date
Application number
CZ992005A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Boehm
Neil T. Dear
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE1996150142 external-priority patent/DE19650142A1/de
Priority claimed from DE1997118248 external-priority patent/DE19718248A1/de
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of CZ9902005A3 publication Critical patent/CZ9902005A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Description

Nové calpainy, jejich výroba a použití (57) Anotace:
Podstatou řešení je gen calpain nCL-3 se sekvencí SEQ ID ě.: 1 a rovněž jeho allelické varianty, které mají na odvozené úrovni aminokyselin homologii 60 až 100 %, a jeho analogy nebo deriváty. Způsob k identifikaci inhibitorů calpainu spočívá v tom, že se calpain kóduje sekvencí z tkání nebo buněk, v nichž se exprimuje enzym nCL-3, izoluje se a měří se inhibice štěpení substrátu enzymu nCL-3 a v alespoň jednom dalším testu se měří inhibice štěpení substrátu enzymu calpainu I a/nebo II testovacími substancemi, které vykazují inhibiční účinek alespoň vzhledem ke calpainu. Způsob výroby enzymu nCL-3 spočívá v tom, že se kopie genové sekvence pro nCL-3 klonuje do vektoru a v hostitelském organismu odpovídajícího vektoru se gen exprimuje pro enzym nCL-3 a následně se enzym z hostitelského organismu izoluje. Inhibitoru calpainu se používá k výrobě medikamentů k ošetřování nemocí, u nichž existuje chybná funkce calpainu.
4 4 9
pl/WT- Τη
44 94 44
4 9 9 4 9 9
4444 4 49 4
44 44 999 444
Nové calpainy, jejich výroba a použití
Oblast......techniky
Vynález se týká nových calpainů a jejich výroby. Dále se vynález týká způsobu screeningu podle nových inhibitorů calpainů a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Calpainy představují intrace1u1ární, ne 1 ys o s o má 1 η í enzymy ze skupiny tak zvaných cysteinových proteas. Účastní se signální transdukce závislé na Ca2+ v eukaryontických buňkách, to znamená regulují buněčné funkce v závislosti na Ca2+ . Calpainy se vyskytují ubiquitarně ve zvířecí tkání, případně buňkách například lidí, slepic, králíků něho v krysách. Také u nižších zvířat jako například v drosophila melanogaster nebo v caenorhabditis elegans byly nalezeny calpainy. V kvasnicích, houbách nebo bakteriích nebyly dosud prokázaný žádné caplainy.
Dosud jsou známé tři hlavní isoformy těchto ubiquitarních calpainů, které se odlišují svojí aktivací závislou na vápníku. Calpain I (- μ calpain) se aktivuje μ-molární koncentrací iontů vápníku, zatímco calpain II ( = m-calpain) se aktivuje teprve milimolární koncentrací iontů vápníku. Oba calpainy sestávají ze dvou podjednotek, velké podjednotky s cca 80 kDa a malé podjednotky s cca 30 kDa. Obě jednotky aktivního heterodimeru obsahují vazební místa pro vápník. Velké podjednotky jsou vytvořeny z následujících čtyř proteinových domén (I až IV): proteásové domény (doména II), domény vázající vápník (doména IV) a dvou dalších domén (doména I a III), jejichž funkce je nejasná. Malá 30 K podjednotka sestává z podjednotky (IV') vázající vápník a další podjednotky • · • · · ··· · · · · • ··· · ···· · ·· · • · ···♦ · · · · · · ··· ··· • φ · φφφφ · φ • Φ · »· ·« ·· ··
- 2 (V) , jejíž funkce je nejasná. Přídavně k těmto oběma typům calpainu byl nalezen třetí typ intermediárηí ve vztahu k aktivaci vápníku ( = μ/m 80k) ve slepici (Wang K.K.W a kolektiv, Trends in Pharmacol. Sci., 1994, 15, 412-419, (K.
Suzuki a kolektiv, Biol. Chem. Hoppe-Seyier, svazek 376, 1995,
523-529).
od
Vedle těchto ubiquitarně se vyskytujících calpainů byly v poslední době identifikovány dva nové tkáňově specificky exprimované calpainy. nCL-1 (= p94) je specificky svalový calpain vyskytující se ve slepicích, krysách a lidech, který by snad mohl být aktivní jako monomer a sestává jen z podjednotky 80 kd. Vedle nCL-1 existuje žaludeční specifický calpain, který se může vyskytovat ve dvou variantách nCL-2 a nCL-2 nCL-2 odlišuje chybějícím regionem nCL-2' se vázajícím vápník (Sorimachi, H.S. a kolektiv, FEBS Lett. 343, 1994: 1 - 5). Také v drosophila byl nalezen protein CalpA), který interaguje s actinem a v embryonálním vývoji, přičemž má
Cell. Biol., svazek 15, č. 2, 1995: 824-834). kratší varianta vazebního místa vápníku.
homologu jící calpain ( ~ snad hraje důležitou roli různé varianty (Mol.
Také zde chybí dvě
Lze se domnívat, že calpainy hrají důležitou roli při nejrůznějšich fysi o 1 ogických procesech. Velké množství cytoske1etá1 ních, membránově vázáných nebo regulačních proteinů jako proteinkinasy C, fosfolipasy C, spectrinu, cytoske 1etových proteinů jako MAP2, svalové proteiny, neurofi 1amenty a neuropeptidy, destičkové proteiny, -epidermal growth factor-, NMDA-receptor a proteiny, které se vyskytují na mitose, a rovněž další proteiny jsou calpainovými substráty (Barrett M.J. a kolektiv, Life Sci., 48, 1991, 1659-69 a Wang K.K. a kolektiv, Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994, 412-419). Normální fysiologická funkci calpainu není dnes ještě jasně vysvět léna.
• · » · · ( • · *·
U různých patοfysi ο 1 οgických procesů a onemocnění byly naměřeny zvýšené hladiny calpainu, například při ischemích srdce (například srdeční infarkt), ledvin, centrálního nerového systému (například mrtvice), zánětech, svalových dystrophiích, kataraktech očí (šedý zákal), poškozeních centrálního nervového systému (například trauma), Alzheimerově nemoci, HIV indukované neuropathy, Parkinsonově nemoci a Huntiatonově nemoci (viz Wang Existuje proto domněnka o souvislosti těchto trvale zvýšenými hladinami intrace1u1árního se procesy závislé na vápníku přeaktivují fyziologické regulaci. V návaznosti na to může
K.K., nahoře) onemocnění s vápníku. Tím a nepodléhají přeaktivace calpainů vyvolat také pathofyzi o 1ocké procesy.
dospělo k závěru, že pro ošetřování těchto potřebné inhibitory calpainových enzymů. To výzkumy. Tak Seung-Chyul Hong a kolektiv 663-669) a R.T.Bartus a kolektiv 17, 249-258) ukázali neuropretektivni inhibitorů v akutních
Proto se nemocí mohou být potvrzují různé (Stroke 1994, 25(3), (Neuro1ogi ca 1 Res. 1995, působení calpainových neurodegenerativních poškozeních nebo ischemiích, jaká vznikají po mrtvici. Po experimentálních mozkových traumatech rovněž zlepšovaly zotavení vznikajících deficitů paměťového vedení a neuromotorických poškození (Saatman K.E. a kolektiv, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93, 1996, 3428-3433). Edelstein C.L. a kolektiv, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 7662 až 7666 nalezli protektivní účinek inhibitorů calpainu na ledviny poškozené hypoxií. Yoshida Κ. I. a kolektiv, Jap. Circ. J., 59 (1), 1995, 40 až 48 vykázali příznivé účinky inhibitorů calpainu po kardiálních poškozeních, která vznikla ischemií nebo reperfusí. Poněvadž inhibitory calpainu brzdí uvolňování B-AP4-protei nu, bylo navrženo potenciální použití jako therapeutikum Alzheimerovy nemoci (Higaki J. a kolektiv. Neuron, 1995, 14 , 651 až 659). Uvolnění inter1euki nu-1 a se rovněž brání inhibitory calpainu (Watanabe J. a kolektiv.
• · • · · • ·
- 4 • · · · · r· • · · · · · • · · · · ···· • ·····»· ·· • · · · · · • * · · · · ·
Cytokine, 6(6), 1994, 597 až 601). Dále bylo zjištěno, že inhibitory výkaz ují cytotoxické účinky na buňkách tumoru (Shiba E. a kolektiv, 20th Meeting Int. Ass.Breast Cancer Res., Sendai až 28. září, Int.J restenose a při
Jp., 1994, 25. 381). Také při důležitou roli a
Oncol. 5 (Suppl.), 1994, arthritis hraje calpain calpainové inhibitory mohou positivně ovlivnit obraz nemoci (March K.L.
kolektiv, Circ. Res. 72, 1993,
413-423, Suzuki K. a kolektiv, Biochem J., 285, 1992, 857-862).
Další možná použití inhibitorů calpainu jsou uvedena v Wangovi K.K.( Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994, 412 až 419).
Potencionální a selektivní inhibitor calpainu je přirozeně se vyskytující intrace1u1ární calpastatin. Inhibuje calpain I jakož také calpain II, nikoliv však jiné cysteinové, respektive thiolové proteásy, jako cathepsin B, L nebo papain. Calpastatin sestávající z cca 700 aminokyselin však má nevýhodu, že nepřichází do úvahy pro therapeutické možnosti na základě velikosti a nepři způsob ite1nosti buněčných membrán. Vedle nízkomo1eku1árních peptidických inhibitorů calpainu byla ještě identifikována řada nepeptidických inhibitorů. Nevýhodou těchto inhibitorů je, že jsou nestabilní, rychle se metabolizují a jsou inhibitorů se vyznačuje znamená neinhibují jen cysteinové proteásy jako cathepsin B a L.
zčásti toxické. Mnoho calpainových kromě toho chybnou selektivitou, to calpain I a II, nýbrž také jiné papain, chymotrypsi η, elastesy nebo
Existuje proto stále potřeba selektivních, vysoce účinných calpainových inhibitorů. Pro screening podle těchto selektivních, dobře účinných calpainových inhibitorů jsou potřebné vysoce specifické testovací systémy, které umožňují identifikovat selektivní inhibitory. Obvykle se screeningový test provádí s ubiquitárně se vys kyt u j í c í mi calpainy calpainern • · ·· • · · · · ··· ··· ···· • · · · · ···· · · · · • · ···· · · 9 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 · 9 9
9 9 9 99 99 99
- 5 I a calpainem II.
Pro nalezení selektivních inhibitorů je potřebné a žádoucí používat k testování další calpainy, které se exprimují co možná tkáňově specificky, takže se inhibitory mohou zkoušet na svojí selektivitu mezi jednotlivými calpainy.
Kromě toho jsou další nové calpainy hledané proteiny, poněvadž se s vysokou pravděpodobností exprimují odlišně při různých onemocněních a hrají u těchto onemocnění důležitou roli.
Podstata vynálezu
Úkolem předloženého vynálezu je vytvořit prostředky k profilování a identifikaci calpainových inhibitorů, které umožňují identifikovat calpainové inhibitory, které jednak mají inhibiční účinek vzhledem k jen jednomu calpainu a jednak mají inhibiční účinek vzhledem k více calpainům, a použít je jako therapeutický ukazatel.
Předmětem vynálezu je nový calpain a
a 1 1 e 1 i cké varianty, ana1ogy nebo deriváty.
Předmětem vynálezu je také způsob k
rovněž jeho identifikaci calpainových inhibitorů, přičemž se calpain nCL-3 kóduje pomocí sekvence SEQ ID č: 1 nebo SEQ ID č: 6 z tkání nebo buněk, v nichž se exprimuje enzym nCL-3, izoluje se a měří se inhibice štěpení substrátu enzymu nCL-3 a v alespoň jednom dalším testu inhibice štěpení substrátu enzymu calpainu I a/nebo II pomocí testovacích substancí a zvolí se testovací substance, které vykazují inhibiční účinek vzhledem alespoň k jednomu z calpainů, nebo se zvolí testovací substance, které neinhibují enzym nCL-3, avšak inhibují enzymy calpain I a/nebo II nebo a · • ·
9 9
- 6 • · · · » · · » 9 9 9·
9 fl fl • 9 enzym nCL-3, neinhibují však enzymy calpain I a/nebo II nebo nCL-3 a calpain I a/nebo II.
Předmětem vynálezu je způsob identifikace inhibitorů calpainu, charakterizovaný tím, že se inhibice štěpení substrátu enzymu nCL-3, případně calpainů I a/nebo II stanoví v buněčném systému pomocí testovacích substancí a zvolí se takové testovací substance, které projdou buněčnou membránou a inhibují intrace1u1ární aktivitu enzymu nCL-3 a/nebo calpainu I a/nebo 11 .
Pomocí calpainově specifického primeru byly vyrobeny tak zvaným doma in-fingerprintingem (Boehm T., Oncogene 8, 1993, 1385-1390) za použití genově smíšené DNA pomocí PCR-techniky calpainově specifické sekvenční signatury, které výhodně obsahují k lepší diferenciaci calpainových sekvencí také introsekvence.
Redudantní PCR primery uvedené ρο'-užity pro klonování genu pro nCL-3.
v tabulce 1 byly
Tabulka 1
Redudantní PCR primery, které byly použity ke klonování nCL-3 (=2930)
Jméno
Sekvence
CAL1 5<- tng gng att gtt ggc tne t - 3«
c c t t
CAL2 5«- ctn gaa aaa gen cat gen aa - 3«
μ u g g c
CAL3 5«e- ttt ngc ata ngc ttt ttc na - 3«
c g c c
CAL4 5 <— gtn aaa ggn cat gen tat ac - 3*
g c c t
CALS 5c- gag tan gca tgn cct ttn ac - 3«
za g c
CALS
5«tzn cgn aat ccn tgg gg - 3« c c a
Jméno
Sekvence
CAL7 5«- ccc can gga g tfca cgn t aan ςτ cg - 3«
CAL-S 5c— gat ggn gaa ttt tgg atg - 3«
c g c
CAL9 5<- gac atc caa aat ten cca tc - 3«
ct g c g
CAL10 5«- nag att aca tat ttc na - 3 <
a g g a c
Pr i měrní m párem g
CAL6
CAL9 tabulka 1) lze Tento klon je (viz znázornit klon s označením 29/30 (=2930).
kódován pro gen, jehož genový produkt jako nový calpain obdrží označení nCL-3. Sekvence kyseliny nukleové klonu 29/30 (=nCL-3, Odvozená sekvence . Sekvence kyseliny intron má typickou malé homologie není calpainu, m calpainu,
respektive 2930) j e SEQ ID č : 1 .
amino kysej iny ca 1 pa i nu nCL-3 j e SEQ ID č:
aminové dedukovaná s e zřetel e m na existují
calpainovou signaturu, přičemž na základe
možné přiřazení calpainových subrodin μ nCL-1 nebo nCL-2 (viz tabulka 2). Z obr. 3 je patrná homologie známých calpainových subrodin dosud neznámý calpain.
U calpainu nCL-3 se jedná o nový
Sekvenční analýzy aminokyse1 iny (Cys81, His252 c ys t e i no výc h aminokyseliny, proteas . odvozené ukázaly typické tři zbytky a Asn284) katalytického centra Zbytky 75 - 86 (QGQVGNCWFVAA) z genové sekvence, souhlasí s konzerovováným vzorem typických thio 1proteas.
Tabulka 2
Homologie (¾) na úroveň aminokyseliny mezi myší nCL-3 (=2930) a ostatními calpainy.
• · ·
- 8 Jméno homo1og i e
nematode tra-3 34,5
drosophi1 a CalpA 3 1,5
slepice p94 3 1,2
člověk p94 30,9
myš p94 30,5
krysa p94 30,0
slepice μ/m 28,8
slepice m 27,8
člověk m 27,3
slepice μ 25,4
prase p94 25,4
krysa m 24,4
krysa nCL-2 23,9
nematode CPL1 23,6
člověk μ 23, 1
schi stosoma 2 1,7
králík m 16, 1
prase m 15,8
prase μ 15,6
myš CAP4 13,7
králík μ 12,9
SEO ID č
Intron (nukleotid 109 až 514) byl stanoven srovnáním s cDNA znázorněný v sekvenci
Sekvenčními srovnáními mezi myší 29/30-sekvence (nCL-3) v různých databankách jako genová banka.nr a genová banka.dbest se obdrží homologie k CalpA, Tra-3 a lidskou sekvencí s označením EST01106 homo sapiens cDNA klonované HHCPE79 (viz obr. 2). Sekvence DNA a aminokyseliny byly prověřovány na homologii datovými bankami neredudantní kyseliny nukleové, proteinu a EST v National Center for Biotechno1ogy
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Srovnání sekvencí aminokyseliny bylo provedeno s clustalem W (Thompson a kolektiv, Nucl. Acids Res. 22, 1994 4673-4680).
nCL-3 má ve srovnání s jinými calpainy (obr. 2) vedle zkrácené domény I změněný C-terminá1 ový konec, který nemá vyznačenou homologii k doméně IV jiných calpainů. V oblasti domény IV leží konsenzuální sekvence vazebních míst Ca2+ calpainů (tak zvaný EF-hand). Toto vazební místo Ca2+ chybí v případě nCL-3 a je zřejmě možné, že se na doménu IV neváže žádné Ca2 + a proteiny se aktivují jinou cestou. Tím je jediný verterbratenový calpain, kterému chybí doména IV podobná ca 1 modu 1 inu.
U ca 1pA se jedná o calpainový homolog drosophila Cell. Biol., svazek 15, č.
tkáňově specificky exprimovaný (Theopold V. a kolektiv, Mol.
2, 1995, str. 824-834). Je exprimován v některých neuronech centrálního nervového systému, v rozptýlených buňkách středního střeva a v krevních buňkách drosophila. Od calpA byly nalezeny dvě různé varianty. U kratší varianty chybí místo vazby vápníku, typické pro calpain.
Homologie na úroveň aminokyseliny mezi calpA a nCL-3 činí 31,5 % (viz tabulka 2).
Tra-3 se účastní stanovení rodu caenorhabditis e1egans
V kaskádě více genu jejich genových produktů rozhoduje tra-3 o tom, zda se vyvíjí caenorhabditis mužský nebo hermafroditηí (Kueabara P.E. a kolektiv, TIG, svazek 8, č. 5, 1992, 164-168). Tra-3 se zdá být účastna na spermatogenezi.
Homologie na úroveň aminokyseliny mezi tra-3 a nCL-3 činí 34,5 % (viz tabulka 2). Na stanovení účastní nCL-3.
rodu se snad také
999 999 * · • 9 9 9
- 10 » · · · · » · 9 · «
9 9 9
Další homologie mezi nCL-3 a jinými calpainy jsou patrné z tabulky 2.
Mezi nCL-3 a humánní dílčí sekvencí EST01106 existuje největší homologie. Dílčí sekvence EST01106 byla získána z Hi ppocampusovy knihovny. O funkci není nic známé (Nátuře 355, 6361, 1992, 632-634). Rovněž je neznámá úplná genová sekvence a zda se u sekvence jedná o calpainový gen.
Sekvenční srovnání mezi calpA, tra-3, EST01106 a nCL--3 jsou patrná na obr. 2.
Když se vychází z humánní Hippocampus Marathon-Ready cDNA (clontech) mohla by se pomocí modifikovaně RACE metody (rapid amp1 ificati on (Proč. Nati. Acad.
of cDNA ends) podle Frohmana a kolektivu Sci. USA 85, 1988, 8998-9002), případně
Edwardse a kolektivu (Nuc1. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232) za použití shora uvedeného primeru (CAL6 a CAL9) klonovat celková sekvence klonu EST01106. Přitom region 3' cDNA nejprve nebyl pomocí reversního primeru c1ontech-kit's klonován. Teprve za použití primeru, který byl komplementární k humánní EST sekvenci, a reversního primeru, který byl komplementární k cDNA sekvenci posledních 6 aminokyselin myší nCL-3 sekvence (5'-tcagacagccgtgagagagg-3'), mohl být klonován konec 3'.
Sekvence (SEQ ID č: 7) aminokyseliny odvozená od genové sekvence SEQ ID č: 6 ukazuje homologii 92,2 % k myší nCL-3 sekvenci (viz obr. 4). Tato podobnost odpovídá homologii na úrovni aminokyseliny mezi lidským a myším m calpainem (97 %) a lidským a myším p94 ( 93,5 ϊ) , jak ukazuje naše sekvencováηí.
ESTO1106 sekvence tím je s vyšší pravděpodobností humánním orthologem mys i nCL-3.
ukazuje kromě sekvencí caenorhabditis tra-3, drosophila calpA, myší p94, myší m-calpain, humánní μ-calpain a krysy nCL-3. Aminokyseliny, které jsou mezi • · « ·
-11» · · « · · ···· • · · * · · · · · · · · · « ······« · · · · · · · · · · ·*· · · · · * · • 0 0 · · « · · · · · různými caplainy a nCL-3 souhlasné, jsou vyznačeny body. Cerchy naznačují volná místa v mřížce, která byla zavedena k dosažení maximální shody sekvencí. C~terminální konce alternativních produktů nCL-3 a transkripty calpA, startující se začátkem odlišné sekvence, jsou uvedeny nad a pod celkovou sekvencí. Hvězdice udávají zbytky konzervované mezi všemi calpainy. Obě sekvence amini Ryse 1 in, které odpovídají o 1 igonuk1eoti dům CAL6 a CAL9, byla vyznačeny bloky. Šipkami se označují Splice site korespondující s myší nCL-3-DNA.
Obr. 5 ukazuje calpainů. Fy1ogenetické fylogenetický kmen stromu různých analýzy k sestavování tohoto kmene stromu byly provedeny za použití nejbližší sousední metody za pomocí těchto fylogenetických analýz calpainy rozdělit do šesti různých skupin (obr. 5, pravá strana). Invertebratenové calpainy lze přiřadit jako do nejblíže sousední do nCL-3 skupiny nebo mohou vlastní skupině. nCL-3 geny tím tvoří vhodnou skupinu vyloučení volných míst. S se mohou vertebratenové stát ve calpainů, které mají větší podobnost calpainům než k vertebratenovým calpainům.
k invertebratenovým Délka horizontálních linií je proporcionální k fy1 ogenetickému odstranění různých calpainů. Délka vertikálních linií nemá význam. Sekvence používané k sestavování fy1ogenetického kmene stromu mají následující SWISSPROT- a EMBL-čísla (accession numbers): člověk m (P17655), μ (P07384), p94 (P20807), krysy m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94 (P16259), myš p94 (X92523), slepice m (D38Q26), μ (D38027), μ/m (P00789), p94 (D38028), nematody tra-3 (U12921), drosophila calpA (011002) schistosoma (P27730).
a Dm (X78555),
Genová struktura nCL-3 je uvedena na obr. 6. Exon/intron-sp1 icingové přechody uvnitř kódovaných sekvence genu byly zjišťovány srovnáním DNA sekvencí DNA a cDNA. Bylo zjištěno 11 intronů uvnitř kódované sekvence. Na obr. 4 je
- 12 šipkou označena poloha splicing sites. Poloha fragmentu směsi genů nejprve amp1 ifi kovaného primery CAL6 a CAL9 je označena závorkami.
Obr. 6 ukazuje polohu splicing sítem různých calpainů. Překvapivě neobsazují nCL-3 a tra 3 přes relativně velkou homologii žádné společné splice sites. Shoda v poloze některých splice sites mezi nCL-3 a vertebratenovýrni calpainy poukazuje na společný vznik genu. Dotazník o posledních konservovaných splice site ve slepičím μ/m calpainovém genu naznačuje, že publikovaná sekvence není kolem tohoto průřezového místa ve shodě s původní cDNA sekvencí.
Vedle nCL-3-genu znázorněného v sekvenci SEQ ID č: 1 je znázorněná ami nokyse1 i ny byla identifikována zkrácená forma, které v sekvenci SEQ ID č: 3. Odváděná sekvence zkráceného genu nCL-3 je patrná ze sekvence SEQ ID č: 4. Tento zkrácený gen nCL-3, který nese označení nCL-3', vzniká zřejmě alternativním splicingem. Semikvant itativní RT-PCR analýzy pomocí mRNA, která byla izolována z buněk dE-17, za použití primerů, které pokrývají boční regiony intronu (viz obr. 6), ukazují, že nesp1 icingovaný produkt odebírá 0,5 % n-CL3 mRNA.
Nový calpain nCL-3 podle vynálezu exprimuje s různou intenzitou (obr. 1). analýzách se exprimuje nCL-3 jasně patrná srdci, plících, hrudní žláze a játrech.
se v mnoha tkáních Ve zkoumaných mRNA v kůži, ledvinách.
Také v lidech je gen nCL-3 exprimován různě silně. Ve všech zkoumaných tkáních byla prokázána malá exprese. Ve střevě, ve varlatech, v ledvinách, v játrech a v průdušnici byly nalezeny silné exprese.
Gen nCL-3 byl lokalizován na chromosomu 7 u myší a • · • · · · 9 « • «
9 9 9
99 99 · · chromosomu 11 u lidí. Leží na dlouhém rameni lidského chromozomu při 84 cM (centi Morgen). Tento je 12 - 14 cM oddělen od kartové polohy μ caipainu (11q13). nCL-3 by mohl být velmi blízko na genu c1ycoproteinu A (11g13, 5 - q14).
Gen myší ortholog nCL-3 byl lokalizován mezi 44 a 53 cM na myším chromozomu 7.
Pro identifikaci selektivních calpainových inhibitorů jsou potřebné pokud možno specifické inhibitorů. Přitom je důležité,. že inhibují jen požadovaný calpain nebo způsoby k identifikaci selektivní inhibitory požadované calpainy, nikoliv však jiné cysteinové fyziologických procesů.
proteasy a tím nezasahují do
Testovací substance zkoušené z hlediska své inhibiční aktivity mohou být například chemické substance, mikrobiologické nebo rostlinné extrakty. Vedle testu na jejich inhibiční aktivitu se obvykle testují vzhledem k nCL-3, calpain I a/nebo II na svojí aktivitu vzhledem ke cathepsinu B nebo jiným thio 1proteasam.
Ideálně nesmí mít dobré inhibitory žádnou nebo jen malou aktivitu vzhledem ke cathepsinu B, L, elastase, papainu, chymotrypsi nu nebo jiným cysteinovým proteasám, ale mají dobrou aktivitu vzhledem ke calpainům I a II.
Pomocí nového caipainu nCL-3 podle vynálezu se mohou způsobem podle vynálezu identifikovat inhibitory, které mohou ke svému inhibičnímu účinku diskri mitovat mezi různými calpainy calpain I , II, nCL-1, nCL-2 a/nebo nCL-3.
Různé inhibiční testy přitom byly provedeny následně:
• · • ·
Test cathepsinu B
Inhibice cathepsinu B byla metodou S. Hasnaina a kolektivu, J. Biol - 240 , stanovena analogicky Chem. 1993, 268, 235
K 88 μΐ cathepsinu B (cathepsin B z lidských jater od firmy Calbiochem, zředěné na 5 dílů v 500 μΜ pufru) se přidaly 2 μΐ roztoku inhibitoru vyrobeného z testované chemické substance, mikrobiologického nebo rostlinného extraktu a DSMO až 0,01 μΜ) při teplotě
Tato vsázka se oko 1 í (25 oc) a (koncová koncentrace: 100 μΜ předběžně inkubovala 60 minut následně byla přídavkem 10 μΐ 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (v pufru s 10 % DMSO) nastartována reakce. Reakce se prováděla 30 minut při v mikrotitračním destičkové snímači
405 nm
Z maximálních nárůstů se následně stanoví ICso'.
Test calpainů I a II
Aktivita calpainových inhibitorů byla zkoumána v kalorimetrickém testu s kaseinem Darmstadt) jako substrátem, mikrotitračních
Burokera-KiIgora a
- 392. Jako enzymy destičkách, Wanga v Anal byly použity z erythrozytenu firma c a 1ρ1 a i η II Calbiochem.
podle Test podle
Bi oc he m calpain (0,2 U/test) Testované
Hammerstena (Merck, byl proveden na zveřejnění od
208, 1993, 387 (0,04 U/test) z 1edvi n, obě substance byly z prasete, i nkubovány překročena barvící reagence v easy reader EAR minut při teplotě okolí, přičemž nebyla koncentrace 1 % rozpouštědla DMSO. Po přídavku nastalo meření optické hustoty při 595 nm 400 od firmy SLT. 50 Sní aktivita enzymu se obdrží z optické hustoty, která byla stanovena při maximální aktivitě enzymu bez inhibitorů a aktivita enzymu byla stanovena bez přídavku vápníku.
• φ φ φ φ φ φ · φφφ φφφφ φ φφφ φ φφφφ φ φφ φ φ φ φφφ· φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ ··· φφφφ φ φ ·· φ ·· · · · · · ·
- 15 Aktivita calpainových inhibitorů se rovněž může stanovit substrátem Suc-Leu Tyr-AMC. Tato f1uorimetrická metoda je popsána Zhaozhao Li a kolektivem, J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480.
Poněvadž calpainy jsou intrace1u1árηí cysteinové proteasy, musí se calpainové inhibitory k zabránění odbourání intrace1u1árních proteinů calpainem protlačit buněčnou membránou. Některé známě inhibitory calpainu, jako například E 64 a leupeptin, překonávají buněčně membrány jen obtížně a vykazují přes to, že představují dobré calpainové inhibitory, jen špatné působení na buňky. Je proto výhodné provést přídavný test pro membránovou průchodnost potenciálními calpainovými inhibitory jako humánní destičkový test.
Destičkový test i nhi b i torů ke stanovení buněčné aktivity calpainových
Calpainem zprostředkované odbourání proteinů v destičkách bylo provedeno, jak je popsáno Zhaozhao Li a kolektivem, J. Med. Chem., 36, 1993, 3472 - 3480. Humánní destičky byly izolovány z čestvé směsi sodíku, citrátu a krve a nastaveny v pufru (5 mM hepesu, 140 mM NaCL a 1 mg/ml BSA, pH 7,3) na 107 buněk/ml.
minut v 1 μ 1 v
předinkubují
Destičky (0,1 ml) se různých koncentrací potenciálních inhibitorů (rozpuštěných DMSO). Potom se provedl přídavek ka1 z iumionoforu A 23187 ( 1μΜ v testu) a vápníku (5 mM v testu) a další inkubace 5 minut při 37 °C. Po odstředění byly destičky umístěny v SDS-Page zkušebním pufru, 5 minut byly při 95 °C vařeny a proteiny odděleny v 8 /Sním gelu. Odbourání obou proteinů, actinu vázajícího proteinu a talinu, bylo provedeno kvantitativní densitometrií. Po přídavku vápníku a ionoforu vzniká nová zóna menší 200 Kd • ·· • · · · · · • · · · · · ··· • ······· · · • · · · · · ·· · ·· ··
- 16 molekulové hmotnosti. Z toho se stanoví polovina enzymové aktivity s nebo jako kontrola bez inhibitoru.
Rovněž vhodné pro tesování průchodnosti membrány jsou části tkáně, jako mozkové výřezy nebo buněčně kultury.
Test na inhibici vzhledem k nCL-3 se provádí na buňkách, které exprimují tento protein a lze je prokázat pomocí specifické protilátky. Jestliže se buňky stimulují například vápníkem a odpovídajícím ionoforem, vede to k aktivaci nCL-3. Takaomi Saido popsal v roce 1992 v J. Biochem., svazek 11, 81 - 86, autolytícký přechod μ calplaínu po aktivaci a prokázání protilátkami. Příslušné protilátky se vyrobí pro prokázání nCL-3. Calplainové inhibitory zabraňují autolytickému přechodu a je možná přílušná kvatifikace protilátkami.
Vedle popsaných testů tak jsou jako celulární destičkový test vhodné všechny další calplainové testy známé odborníkovi z dané indukujícího smrt (Mau1ucci-Gedde M.A -368), vápníkem (Squi er Μ.K.T 237, Patel T. nebo analýza ve proteinů, jako test na inhibici glutamatu corticalních neuronech
J. Neurosci. 7, 1987, 357 v NT2 buňkách oblasti, jako buňky na a kolektiv, zprostředkovaná smrt buňky a kolektiv, J. Cell, Physiol., 159, 1994, 229 a kolektiv, Faseb Journal 590, 1996, 587 - 597) tkáňových zkouškách podle produktů odbourání spectrin, MAP2 nebo tau (Ami Arai a
Brain Research, 1991, 555, 276 - 280, James Brorson a
Stroke, 1995, 26, 1259 -.1267).
kolektiv, kolektiv.
Pro testy nCL-3 se calpain nCL-3 nebo jeho zvířecí nebo jeho humánní homolog z tkáně nebo buněk, v nichž je exprimován enzym, jako ledvin, hrudní žlázy, jater, plic, nebo z buněk nebo mikroorganismů, které obsahují alespoň jednu genovou kopii a/nebo vektor s alespoň jednou genovou kopií • · • « » · · > · · nCL-3 genu, čistí a používá jako surový extrakt nebo jako čistý enzym.
Z hlediska způsobu podle vynálezu se různé testy calpainových inhibitorů provádí výhodně v kombinaci s testem inhibice aktivity enzymu nCL-3 pomocí inhibitorů. Přitom se inhibitory volí tak, že enzym nCL-3 a nikoliv jiné calpainy nebo calpainy a nikoliv enzym nCL-3 nebo enzym nCL-3 a alespoň jeden další calpain.
potencionálních buď inhibují jen naopak jen jiné
Různé testy inhibitorů jsou přitom provedeny tak, že vedle testu na inhibiční účinek testovací substance proti nCL-3, calpainu I a/nebo II jako kontrole se test provádí bez testovací substance. Tímto uspořádáním testu lze snadno zjistit inhibiční účinky testovacích substancí.
Další způsob podle vynálezu používá enzym nCL~3 ke screeningu podle nových calpainových inhibitorů, přičemž tyto inhibitory mohou inhibovat všechny calpainy nebo jednotlivé calpainy, jako calpain I, II, nCL-1, nCl-2 nebo nCL-3. Různé substance přitom mohou testovat jednotlivě nebo paralelně. Výhodně t e s t o va c í systémech substance testují z hlediska v testovacích se testovací inhibičních účinků v paralelních.
automatizovaných testovacích systémech.
Pro inhibiční testy jsou obecně vhodné všechny substance. Tak pochází substance například z klasických syntéz, z kombinatoriky a z mikrobiologických, nebo rostlinných extraktů. Pod mikrobiologickými extrakty se například rozumí fermentační vývary, buněčné rozklady mikroorganismů nebo substance po bi otransformaci . Pro test jsou vhodné také buněčné frakce.
chemi ckých zví řečí c h ·· ··
I · · · • · · ··· ··· ·· ·· • · • · · · •··· · ·
- 18 Pro klonování genu nCL-3 nebo jeho zvířecích homologů nebo jeho humánních homologů jsou vhodné všechny prokaryotické nebo eukaryotické systémy exprese, které jsou vhodné k izolování enzymaticky aktivního genového produktu. Přednostní jsou systémy exprese, které umožňují expresi genových sekvencí nCL-3 v bakteriálních, houbových nebo zvířecích buňkách, zvláště přednostně v buňkách hmyzu. Pod enzymaticky aktivním genovým produktem proteiny, které se obdrží přímo po izolaci z například z prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo po renaturaci aktivního proteinu, který je schopen štěpit alespoň jeden známý calpainový substrát, jaké jsou shora uvedeny, nebo se štěpit autokata1ýzou sám.
se rozumí nCL-3 organismu exprese,
Pro stanovení enzymatické aktivity jsou vhodné všechny odborníkovi známé testy calpainu, jako shora popsané testy pro calpain I a II nebo celulární test jako destičkový test. Přitom se mohou jako dekantační možnosti použít testy, které jsou založeny na bázi co 1ori metr ické zkoušky (Buroker~Ki 1gore M. a kolektiv, Ana 1 . Biochem. fluorescenční zkoušky.
208, 1993, 387
392) nebo na bázi
Kromě toho se produktem nCL-3 rozumí pod enzymatickým aktivním genovým také všechny dílčí sekvence, které vykazují katalytické centrum genu nCL-3 a/nebo další sekvence genu nCL-3 a /nebo jiné sekvence calpainového genu a/nebo jiné sekvence a enzymatickou aktivitu.
Pod hostitelskými organismy se rozumí všechny prokaryotické nebo eukaryotické organismy, které jsou vhodné jako hostitelské organismy, jsou například vhodné bakterie jako escherichia coli, baciilus subtilis, streptomyces lividans, streptococcus carnosus, kvasnice jako saccharomyces cerevisiae, schizosaccharomyces pombe, houby jako aspergillus niger, ·
• 9
9 9 9
9 9 9 •«9 999
9 9
9
9
- 19 buňky hmyzu jako spodoptera frugíperda, buňky trichoplusie nebo všechny jiné buňky expresi, nebo zvířecí nebo lidské buňky.
hmyzu, které jsou vhodné buňky jako CV1, COS, C127, pro v ir a i ni 3T3 nebo CHO
Pod systémy příkladně uvedených exprese se organismů přizpůsobených organismům, jako plasmidy, virů nebo fagů jako systém T7 RNA po 1ymery/promotory nebo vektory s regulovanými sekvencemi pro fagy lambda.
rozumí kombinace pro expresi a ze shora vektorů
Přednostně se pod pojmem systémy exprese rozumí kombinace z escherichia coli a jejich plasmidů a fagů nebo systém baculovirů a odpovídající buňky hmyzu jako spodoptera frugiperda.
Pro výhodnou expresi kromě toho vhodné další 3' sekvencí.
genu a/nebo nCL~3 podle vynálezu jsou 5' terminály regulačních
Tyto regulační sekvence musí umožňovat cílenou expresi genu nCL-3. Toto může například podle hostitelského organismu znamenat, že se gen exprimuje nebo přeexprimuje teprve po indukci, nebo že se exprimuje nebo přeexprimuje ihned.
Regulační sekvence.
pozitivně ovlivňovat respektive faktory mohou přitom zvýšit přednostně expresi genu nCL-3. Tak může zesílení regulačních prvků výhodně nastat na transkripční úrovni tím, že se signály jako promotory a/nebo také možné zesílení translace s t a b i 1 i t a mRNA.
používají silné transkripční enhancer. Vedle toho je ale tím, že se například zlepší
Pod pojmem enhancer rozumí například DNA ·· * 49 94 » · · 4 4 4 > · · · · · 444 » ······· · · I • · · ··
- 20 sekvence, které způsobují pomocí zlepšení výměny mezi RNA-polymr.y a DNA zvýšenou expresi genu nCL-3.
Genu nCL-3 s nebo bez předřazených promotorů, respektive s nebo bez regulátorů mohou být předřazeny a/nebo přiřazeny jeden nebo více DNA sekvencí, takže je gen obsažen v genové struktuře.
Genovou expresi genu nCL-3 lze kromě toho zvýšit také zvýšením počtu kopií. Ke zvýšení počtu kopií genu se gen nCL-3 amplifikuje například v CHO vektoru exprese. Jako vektory jsou vhodné také vektory řady pED - dicistronické vektory, které také obsahují amp 1 ifikovate1ná označení dihydrofo 1atu reduktáze. Detaily se mohou zjistit z Current Protocols in Molecular Biology, svazek 2, 1994.
může docílit vyřazením enzymu a/nebo syntézou
Nárůst aktivity enzymu nCL-3 lze například docílit vzhledem k výchozímu enzymu změnou genu nCL-3 nebo jeho zvířecímu homology pomocí klasické mutace jako UV zářením nebo zpracováním chemickými mutanty a/nebo cílenou mutací jako site directed mutagenesis, deletací ( emi ) , insercí (emi) a/nebo substitucí (emi). Zvýšení aktivity enzymu se může například docílit tím, že se rychle zreaguje štěpený substrát. Také zvýšená aktivita enzymu se vedle popsaných amplifikaci genu faktorů, aktivních nCL-3. Touto cestou se mohou pro test použít zvýšená množství enzymů.
které reprimují biosyntézu místo inaktivních proteinů nCL-3 nebo je ho zvířecí homology lze výhodně klonovat, když se vychází z DNA nebo cDNA za použití například PCR techniky (viz Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch a Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6). Zvláště vhodné jsou například vektory, které se ·· · *· ·· *· • · · ··« · · · · ·<· · «··« · ·· ·
9 ···· · · · · · · ··· ···
9 9 ···· * · ·· · · · ·· · · · ·
-21odvozují od pBR nebo pUC nebo shuttle vektory, zvláště vhodný je pBluescript.
Po isolaci a sekvencování lze geny nCL-3 obdržet s nuk 1eoti dovými sekvencemi, které kódují sekvence amini kyše 1 iny uvedené v SEQ ID č: 2 nebo jejich allelické varianty. Pod allelickými variantami se rozumí varianty nCL-3, které mají 60 až 100 % homologie na úrovni aminokyseliny, přednostně 70 až 100 %, zvláště přednostně 80 až 100 %. Allelické varianty zahrnují zejména funkční varianty, které lze obdržet pomocí deletace, insercs nebo substituce nukleotidů ze sekvence znázorněné v SEQ ID č: 1 nebo SEQ ID č:6, přičemž ale aktivita nCL-3 zůstává zachována.
Pod analogií nCL-3 se rozumí například jeho zvířecí homology, zkrácené sekvence jako nCL-3' (viz SEQ ID č: 3), jednotlivé provazce DNA nebo RNA kódované a nekódované sekvence DNA, zvláště antisensová RNA.
Deriváty nCL-3 jsou například takové deriváty, které jsou enzymaticky neštěpite1 né, nebo jsou štěpitelné jen obtížně, jako fosfonáty nebo fosfothi onáty kyseliny nukleové, u kterých byla fosfátová skupina nukleových kyselin nahrazena fosfonátovou, respektive thioatovou skupinou.
Také promotor, který je předřazen uvedené nukleotidové sekvenci, může být změněn jednou nebo více výměnami nukliotidů, insercí nebo insercemi a/nebo deletací nebo deletacemi, aniž je ovlivněna funkčnost, respektive účinnost promotoru. Dále může promotor také změnou své sekvence zvýšit svoji účinnost nebo se může pomocí účinných promotorů kompletně vyměnit také cizorodé or gan i smy.
Caipainové inhibitory identifikované podle způsobu • Β ·· Β ► BB
Β Β β · · «
Β Β « • Β 4 > ·♦
ΒΒ ΒΒ r β β β » · Β «
ΒΒΒ Β·Β zánět 1 i vých, o ne mo c ně η ί , podle vynálezu jsou vhodné k výrobě medikamentů k ošetřování nemocí ze skupiny kardiovaskulárních, imunologických, alergických, neurologických, nebo onkologických jako například restenosy, arthritis, ischemií srdce, ledvin nebo ústředního nervového systému (například mozkové mrtvice), zánětů, svalových distrophií, kataraktů očí (šedý zákal), poškození centrálního nervového systému (například trauma), Alzheimerovy nemoci, neuropathie indukované HIV, Parkinsonovy a Huntingtonovy nemoci.
vhodné
Genové sekvence nCL-3 také k diagnose nemocí, podle vynálezu jsou výhodně například k diagnose svalové dystrophie nebo ke genové therapii.
Příklady provedení_____vynálezu
Příklad 1
Klonování genu nCL-3
Pro klonování genu nCL-3 sekvencí ID č: 1 byla použita genově smíšená DNA z myších buněk ES E14. Pro klonování byly použity sekvence 5'-3' (přední) a 3'-5' (zadní) primeru CAL6 a CAL9 (viz tabulka 1) a rovněž následující PCR. podmínky (viz Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch a Maniatis, Cold Spring Habor, Laboratory Press, Second Edition 1989, kapitola 14, Saiki a kolektiv, Science, 1988,
1 - 35 svazek ISBN 0 293, 487 -87969-309-6 a a následující)
250 ng přední ho primeru
250 ng zadní ho primeru
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs
mM KC1
44 • · 4 ·
4 4 4
444 44·
4
44 »» 44 > 4 · • · ··· • 4 « · • 4 · «4 ·· • 4
4 44 • 4 • · • ·
mM tris pH 9,0 pg genově smíšené DNA díly značkového polymeru
Bylo provedeno 35 PCR cyklů, přičemž byla 45 sekund udržována teplota 94 °C, 45 sekund teplota 48 °C a 2 minuty teplota na 72 °C. Gen nCL-3 byl nakloňován ve vektoru pBluescript ( SK+) enzymem EcoRV (viz Holton a kolektiv, Nucleic Acids Research, svazek 19, č. 5, 1156 a následující). Vektorem pBluescript nakloňovaným genem nCL-3 byla transformována podle Maniatise a kolektivu escherichia coli, kmen DH10B (viz Sambrok, Fritsch a Maniatis, Go1d Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, svazek 1, kapitola 1, 74 - 84, ISBN 0-87969-309-6 a Saiki a kolektiv, Science, 1988, svazek 239, 487 a následující).
Touto cestou lze klonovat také humánní sekvenci genu nCL-3 s SEQ ID č: 6, přičemž se může vyjít z 0,1 ng cDNA nebo 0,5 pg genově smíšené DNA. Klonovací vsázka může kromě výhodně obsahovat 0,1 % tritonu X-100.
Příklad 2
Exprese genu nCL-3 v různých myších tkáních
Pro expresi byla izolována mRNA z embryí a z tkáně kůže, ledvin, srdce, plic, mozku, hrudní žlázy a tenkého střeva myši. Pro extrakci mRNA byly tkáně dispergovány v tekutém dusíku a resuspendovány v 10 ml roztoku z 4 M guanidini umového isothiokyanatanu, 25 mM citranu sodného, 0,5 % sarcosylu a 72 pl 2-merkaptoethano1u. Následně byl za míchání přidán 1 ml octanu sodného (pH 4,0), 10 ml vodou nasyceného fenolu a 2 rnl chloroformu. Zkoušky byly 20 minut odstřeďovány (5000 x g, 4 °C). Usazenina byla vyhozena. Ze zbytku byla isopropano1em při ·· · • · · • · · · • ····· · • · · »
·· ·· • · · • · ··· • · · · · • · · · ♦ · ·· ·· ·· • · · «·· ··· Φ · ·· ·· teplotě - 20 °C a alespoň jedné hodině srážení vysrážena RNA a znovu 30 minut odstřeďována (19000 x g, 4 °C). Usazenina byla resuspendována ve 300 μΐ a znovu srážena v chladu octanem sodným/ethano 1em a 70 %ním ethanolem, odstředěna (19000 x g, 4 °C), prána a rozpuštěna ve 300 μΐ vody. Následně byla stanovena koncentrace mRNA při 250 nm ve fotometru a v agarosovém gelu s 5 μΐ mRNA zkoušky vzhledem k referenci.
Přes RT-PCR, ve kterém byla vycházeje z isolovaného mRNA nejprve stanovena pomocí reversní transkripce kopie cDNA, byla pomocí následujících dvou primerů
a) předního primeru 5'- tagctcgagtggacgtaatcgtcgatgac-3'
b) zadního primeru 5'- tagctcgagtgctgtaggctgtgcatacg-3' stanovena exprese genu nCL-3 v různých myších tkáních (viz obr.
) cDNA byla vyrobena podle protokolu firmy GIBCO, jak je uvedeno v následujícím:
K 5 pg mRNA (izolované podle shora popsané metody) byly přidány 2 μΐ oligo(dT) a 12 μΐ DEPC dfoO. Tato vsázka byla inkubována 10 minut při 70 °C a následně odstavena do ledu. Ke zkoušce byly v udaném pořadí přidány 2 μ 1 10 x pufru, 2 μ 1 25 mM MgCl2, 1 μΐ 1QmM dNTPs, 2 μΐ 0,1 M DTT. Po 5 minutách inkubace pří 23 °C byl přidán 1 μΐ superskriptu reversní transkripce a celé bylo inkubováno 10 minut při 25 °C, 50 minut při 42 0 C a 15 minut při 70 °C. Potom byl přidán 1 μΐ RNAse H a 79 μΐ dH2 0 a 20 minut při 37 0 C a 15 minut při 70 °C byla dále prováděna reakce. 1 μΐ této cDNA byl použit pro RT-PCR reakci.
PCR reakce pro prokázání exprese nCL-3 byla provedena následně:
250 ng předního primeru
250 ng zadního primeru • · · 4 • ·
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs mM KC1 mM tris pH 9,0 pg cDNA díly značkového polymeru
Bylo provedeno 35 PCR cyklů, přičemž byla 45 sekund udržována teplota 94 °C, 45 sekund teplota 58 °C a 1 minutu teplota na 72 °C.
V testovaných tkáních se nCL-3 exprimován v dE12 embryích.
nCL-3 ledvinách, srdci, plících a v hrudní střevě je exprese slabší než není patrné). Jako vnitřní standard (hypoxathin-phospor-ri bosyl-transferase).
ukáza 1 o, že je expr i mován žláze. V mozku a v tenkém v uvedených orgánech (na obr. 1 bylo použito hprt kůži ,
Příklad 3
Klonování humánní sekvence nCL-3
Konec 3' myšího, respektive humánního nCL-3 cDNA byl (rapid amplification of cDNA a kolektivu (Proč.Nati. Acad. 9002), respektive Edwardse 1 9, 1991, 5227 - 5232) . Pro zjištěn tak zvanou RACE metodou ends), jak je popsáno od Frohmana Sc i . USA 85, 1 988, 8998 a kolektivu (nucl. Acids Res.
humánní sekvenci konce 5' a 3' byly použity humánní hippocampus marathon-ready cDNA (clontech). Pro myší sekvenci byly použity cDNA popsané v příkladě 2 z 12 myších embryí. Humánní konec 3' se nemohl izolovat reversním primerem c1ontech-kit's. Klonování pokračuje pomocí předního primeru komplementárního s humánní EST sekvencí a reversního primeru, který odpovídal posledním S aminokyselinám myší nCL-3 sekvence (5'-tcagacagccgtgagagagg• · 4
9
9
4
4 44
3') Příklad 4
Izolace a charakteristika Cosmidových klonů
Cosmidovy klony s nCL-3 genem myši byly izolovány z Cosmidovy knihovny, která byla vyrobena z genově smíšené DNA ES myších buněk do vektoru pSuperCos (stratageny). Knihovna byla rozdělena do 348 pools a 1000 klonů. Positivní pools byly identifikovány pomocí PCR analýzy za použití primerů specifických k nCL-3. Tyto pools“ byly následně vytříděny. Positivní klony byly identifikovány pomocí hybridizace kolonií s cDNA fragmenty nCL-3 myši označeného 32p.
Příklad 5
RNA analýza exprese proverovana pomoci (clontech) humánním
Exprese humánního nCL-3 byla hybridizace humánního RNA Master Blots nCL-3 fragmentu označeného 32p (nucleotid 1 - 928, kódovaný pro aminokyse 1 iny 1 -295). Hybridizace a velmi přísné podmínky praní byly provedeny podle instrukcí výrobce.
Příklad 6
Lokalizace genu nCL-3 na chromosomu
Lokalizace genu v myši byla provedena pomocí PCR analýzy genově smíšené DNA, která byla izolována ze somatických buněčných hybridů myš x křeček, jak bylo popsáno Williamsonem a kolektivem (Mamm. Genome 6, 1995, 429 - 432), za použití sady DNA, jak uvádí Schupp a kolektiv (Immunogenet. 45, 1997, 180 t· · • ·
- 27 187). Jako primerové sekvence byly použity 5 ' -tgcacagcctacagcataag-3 a 5’-tcagacagccgtgagagagg-3' . S pomocí tohoto primeru mohl být amplifikován 2,7 kb velký fragment DNA myši a žádného křečka. PCA reakce byly provedeny pomocí Expand Long Template PCR System” (Boehringer Mannheim) podle instrukci výrobce při teplotě (annealing) 58 °C.
Lokalizace genu v somatického buněčného hybridu Reposi tor i es). Jako priměrní použity následující primery: 5 5'-gctgcatcaaccacaaggacac-3' . teplotou
Výs1edky člověku nastává pomocí NIGMS “mapping panels (Coriell Cell sekvence pro PCR reakci byly
-a c 11 c a t c 11 c t ggc 11 c 11 ga c 11 c-3 ' a PCR amplifikace byla provedena °C (annea1ing“) a vedla k frakmentu 600 bp. byly zkoušeny z hlediska shody mezi prokázáním lidských chromozomů lidském chromosomu (Research 6enetics) servis MIF (http://www-genome.wi.mit.edu).
a PCR. produktu. Přesná lokalizace genu v nastala pomocí Genebridge 4 RH Panels” a předáním PCR výsledků na lokalizační
Center for Genome Research
Příklad 7
Test cathepsinu B s metodou
235-40.
Inhibice cathepsinu B byla stanovena S. Hasnaina a kolektivu, J.Biol. Chem.
analogicky 1993, 268,
K 88 pL cathepsinu B (cathepsin B z lidských jater (ca 1biochem), zředěných na 5 dílů v 500 μΜ pufru) se přidají 2 pL roztoku inhibitoru, vyrobeného z inhibitoru a DMSO (koncové koncentrace: 100 pM až 0,01 pM). Tato vsázka se předinkubova1 a teplotě okolí (25 °C) mi nut př i přídavkem 10 pL a následně se nastartuje mM 2-Arg-Arg-pNA (v pufru s 10 % DMSO) • · · · «· • ·'* ··· ο « · · • 9 9 9 9 ···· · ·· · • ······· 9 9 ·· ··· ··· ··· 9 9 9 9 9 · *· · 9 * · · 99 «9
- 28 reakce. Reakce se provádí 30 minut při 405 nM v mikrotitračním destičkovém snímači. Z maximálních nárůstů se následně stanoví
I Cso .
Příklad 8
Ca 1 pa i nový test
Aktivita calpainových inhibitorů byla zjišťována v kolorimetrickém testu kaseinem podle Hammarstena (Merck, Darmstadt) jako substrátem. Test byl proveden.na mikrotitračηí destičce podle zveřejnění Biochemistry 208, 387-392
Buroker-Ki1gorem a Mangem v Anal. (1993). Jako enzym byl použitý
29/30, který byl exprimován v jednom ze shora popsaných systémů a následně byl čištěn, minut při teplotě okolí 1 % rozpouštědla DMSO. nastalo měření optické 400 firmy SLT. 50 %ní v Easy Reader EA.R.
z optické
Substance byly inkubovány enzymem 60 přičemž nebyla překročena koncentrace
Po přídavku Bio-Rad barevné reagence hustoty při 595 nm aktivita enzymu se zjistí hustoty, při které byla stanovena maximální aktivita enzymu bez inhibitorů a aktivita enzymu bez přídavku vápníku.
Příklad 9
Destičkový test ke stanovení celulární aktivity calpainových inhibitorů
Calpainem zprostředkované odbourání proteinů v destičkách bylo provedeno, jak popisují Zhaozhao Li a kolektiv, J. Med. Chem., 1993, 36, 3472-3480. Humánní destičky byly izolovány z čerstvého směsi citrát sodný, krev a nastaveny v pufru (5 mM Hepes, 140 mM NaCl a 1 mg/ml BSA, pH 7,3) na 10 7 buněk/ml.
»· · • · • · • · · · • · · I • · · I • · · · · 4 • 4 • · « ·
Destičky (0,1 ml) se předinkubova1y 5 minut 1 μΐ na různé koncentrace inhibitorů (rozpuštěné v DMSO). Potom se provedl přídavek ionophoru vápníku A 23187 (1 μΜ v testu a vápník (5 teplotě 37 zkušební ho oddělen v vázajícího mM v testu) a další inkubace po dobu 5 minut při °C. Po odstředění byly destičky umístěny SDS-Page pufru, 5 minut byly vařeny při 95 °C a protein 8 Žním gelu. Odbourání obou proteinů proteinu actin a talinu nastalo pomocí kvantitativní densitometrie, poněvadž po přídavku vápníku a ionophoru tyto proteiny zmizely a vznikla nová zóna v oblasti molekulové hmotnosti 200 Kd. Z toho se stanoví polovina aktivity enzymu.
• · • · • · • · • · · • · · · ·
- 30 SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNE INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: BASF Akt iengese11schaft (B) ULICE: Carl Bosch Strasse (C) MÍSTO: Ludwi cishafen (D) SPOLKOVÁ ZEME: Rhei η 1 and-Pfa 1 z (E) ZEMĚ: Německo (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO: D-67056 (ii) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: Nové calpainy, jejich výroba a použití (iii) POČET SEKVENCÍ: 7 (iv) POČÍTAČOVÁ ČTECÍ FORMA (A) NOSIČ DAT: floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) PRACOVNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, verze 1.25 (EPA) (2) INFORMACE
K SEQ ID č: 1:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 2459 bp (B) TYP: kyselina nukleová (C) PODOBA VĚTVE: samostatná (D) TOPOLOGIE: lineární ( i i) TYP MOLEKULY: cDNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (vi) PŮVODNÍ PŘÍCHOD
(A) ORGANISMUS: mus musculus
( i X) ZNAKY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: 5' UTR
( B) POLOHA: 1..193
( i x) ZNAKY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: 3' UTR
( B) POLOHA: 2 117.. 2459
( i x) ZNAKY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS ( B) POLOHA: 194..2116 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 1:
9
-31CTGAAGCCCG GGGGTCCAAG TTCCAACCCČ CGCCTGCGGG CTGCCGGGGT ATCATCTCCC '60
CGCAGAGTCC CGGCCGTGGC GCGGGCTGGT CTAGCCTCCG CTCCAGTGCC CGCACTGTCC 120
TCTGCATCCC GGGAGTCCAG CTCCAGCTGC GGCGACGCGG CAGGTGCCTC CCCTTCTTGG 180
GGACGTGGTC ACC ATG Met TTC Phe TCC TGC GCG Ala 5 AAG GCC TAT GAG GAC CAG Gin AAC Asn 229
Ser Cys Lys Ala Tyx* Glu Asp 10
1
TAC TCG GCG CTG AAG CGG GCC TGC CTG CGC AAG AAG GTG CTG TTC GAG 277
Tyr Ser Ala Leu Lys Arg Ala Cys Leu Arg Lys Lys Val Leu Phe Glu
15 20 25
GAT CCC CTC TTC CCT GCC ACC GAC GAC TCC CTT TAC TAT AAG GGC ACC 325
Asp Pro Leu Phe Pro Ala Thr Asp Asp Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Thr
30 35 40
CCA GGG CCC ACA GTC AGG TGG AAG CGG CCT AAG GAT ATC TGC GAC GAT 373
Pro Gly Pro Thr Val Arg Trp Lys Arg Pro Lys Asp Ile Cys Asp Asp
45 50 55 60
CCC CGG CTC TTC GTA GAT GGC ATC AGC TCC CAT GAC CTG CAC CAG GGC 421
Pro Arg Leu Phe Val Asp Gly Ile Ser Ser His Asp Leu His Gin Gly
65 70 75
CAG GTG GGC AAC TGC TGG TTT GTG GCT GCC TGC TCA TCA CTG GCC TCC 469
Gin Val Gly Asn Cys Trp Phe Val Ala Ala Cys Ser Ser Leu Ala Ser
80 85 90
CGA GAG TCA CTC TGG CAG AAG GTC ATC CCA GAC TGG AAG GAG CAG GAA 517
Arg Glu Ser Leu Trp Gin Lys Val Ile Pro . Asp Trp Lys Glu Gin Glu'
100 105
TGG AAC CCC GAG AAG CCT GAC AGC TAT GCT GGC ATC TTC CAC TTC AAC 565
Trp Asn Pro Glu Lys Pro Asp Ser Tyr Ala Gly Ile His Phe Asn
110 115 120
TTC TGG CGC TTT GGG GAG TGG GTG GAC GTA ATC GTC GAT GAC CGG CTG 613
Phe Trp Arg Phe Gly Glu Trp Val Asp Val Ile Val Asp Asp Arg Leu
125 130 135 140
CCC ACA GTC AAC AAC CAG CTC ATT TAC TGC CAT TCC AAC TCC AAA AAT 661
Pro Thr Val Asn Asn Gin Leu Ile Tyr Cys His Ser Asn Ser Lys Asn
145 150 155
GAG TTC TGG TGT GCC CTG GTG GAG AAG GCC TAT GCC AAG CTG GCC GGC 709
Glu Phe Trp Cys Ala Leu Val Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ala Gly
160 165 170
TGT TAC CAG GCC CTG GAC GGA GGC AAC ACG GCC GAT GCA TTG GTG GAT 757
Cys Tyr Gin Ala Leu Asp Gly Gly Asn Thr Ala Asp Ala Leu Val Asp
175 180 185 • 4 * · · · a · · · i · · · ► · · • · • · · · • · « * · a > «·
TTC ACA Phe Thr 190 GGT GGT GTT Gly Gly Val TCT Ser GAA Glu 195 CCC Pro ATT. GAC Ile Asp CTG ACC Leu Thr 200 GAG GGG Glu Gly GAC TTG Asp Leu -805
GCC ACT GAC GAG GCT AAG AGG AAT CAG CTC TTT GAG CGA GTG CTG AAG 853
Ala Thr Asp Glu Ala Lys Arg Asn Gin Leu Phe Glu Arg Val Leu Lys
205 210 215 220
GTG CAC AGC AGA GGC GGG CTC ATC AGT GCC TCC ATC AAG GCT GTG ACA 901
Val His Ser Arg Gly Gly Leu Ile Ser Ala Ser Ile Lys Ala Val Thr
225 230 235
GCA GCT GAC ATG GAG GCC CGC CTG GCA TGT GGC CTG GTG AAG GGC CAT 949
Ala Ala Asp Met Glu Ala Arg Leu Ala Cys Gly Leu Val Lys Gly His
240 245 250
GCA TAC GCT GTC ACC GAT GTG CGC AAG GTG CGC CTG GGC CAT GGC CTG 997
Ala Tyr Ala Val Thr Asp Val Arg Lys Val Arg Leu Gly His Gly Leu
255 260 265
CTG GCC TTC TTC AAG TCA GAG AAG CTT GAT ATG ATC CGT CTG AGG AAC 1045
Leu Ala Phe Phe Lys Ser Glu Lys Leu Asp Met Ile Arg Leu Arg Asn
270 275 280
CCC TGG GGC GAG CGG GAG TGG ACG GGG CCC TGG AGT GAC ACG TCA GAG 1093
Pro Trp Gly Glu Arg Glu Trp Thr Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ser Glu
285 290 295 300
GAA TGG CAG AAA GTG AGC AAG AGT GAG . AGG GAG AAG ATG GGC GTG ACC 1141
GlU Trp Gin Lys Val Ser Lys Ser Glu . Arg Glu Lys Met Gly Val Thr
305 310 315
GTG CAG GAT GAT GGG Gly GAA Glu TTC Phe TGG ATG ACC TTT GAG GAC ATG TGC CGG 1189
Val Gin Asp Asp 320 Trp Met 325 Thr Phe Glu Asp Met 330 Cys Arg
TAC TTT ACT GAC ATC ATT AAA TGC CGC CTG ATT AAC ACG TCC TAC CTG 1237
Tyr Phe Thr Asp Ile Ile Lys Cys Arg Leu Ile Asn Thr Ser Tyr Leu
335 340 345
AGC ATC CAT AAG ACA TGG GAG GAG GCC CGG CTG CAT GGT GCC TGG ACG 1285
Ser Ile His Lys Thr Trp Glu Glu Ala Arg Leu His Gly Ala Trp Thr
350 355 360
AGA CAT GAG GAC CCA CAG CAG AAC CGC AGT GGA GGC TGC ATC AAC CAC 1333
Arg His Glu Asp Pro Gin Gin Asn Arg Ser Gly Gly Cys ile Asn His
365 370 J 375 380
AAG GAC ACT TTC TTC CAG AAC CCA CAG TAC GTA TTT GAA GTC AAG AAG 1381
Lys Asp Thr Phe Phe Gin Asn Pro Gin Tyr Val Phe Glu Val Lys Lys
385 390 395
• · • · ·
CCA GAA GAT GAA GTG Glu Val 400 TTG Leu· ATC AGT 'ATC CAG CAG CGG CCG AAG CGC TCA 14~29
Pro Glu Asp Ile Ser Ile 405 Gin Gin Arg Pro Lys 410 Arg Ser
ACT CGC CGG GAG GGC AAA GGC GAG AAT CTG GCC ATT GGC TTC GAC ATC 1477
Thr Arg Arg Glu Gly Lys Gly Glu Asn Leu Ala Ile Gly Phe Asp Ile
415 420 425
TAT AAG GTG GAA GAG AAC CGC CAA TAC CGT ATG CAC AGC CTA CAG CAT 1525
Tyr Lys Val Glu Glu Asn Arg Gin Tyr Arg Met His Ser Leu Gin His
430 435 440
AAG GCC Lys Ala 445 GCC Ala AGC TCC ATC TAC ATC AAT TCC CGC AGC GTT TTT TTG AGG 1573
Ser Ser Ile Tyr 450 Ile Asn Ser Arg 455 Ser Val Phe Leu Arg. 460
ACA GAG CTG CCC GAG GGC CGC TAC GTT ATC ATC CCT ACC ACC TTT GAG 1621
Thr Glu Leu Pro Glu Gly Arg Tyr Val Ile Ile Pro Thr Thr Phe Glu
465 470 475
CCA GGC CAC ACT GGC GAG TTC CTG CTC CGA GTC TTC ACA GAT GTC CCC • 1669
Pro Gly His Thr Gly Glu Phe Leu Leu Arg Val Phe Thr Asp Val Pro
480 485 490
TCC AAC TGC CGG GAA CTA CGC CTG GAT GAG CCC CCT CGG ACC TGT TGG 1717
Ser Asn Cys Arg Glu Leu Arg Leu Asp Glu Pro Pro Arg Thr Cys Trp
495 500 505
AGT TCC CTC TGT GGC TAC CCT CAG CAG GTG GCC CAG GTA CAT GTC CTG 1765
Ser Ser Leu Cys Gly Tyr Pro Gin Gin Val Ala Gin Val His Val Leu
510 515 520
GGG GCT GCT GGC CTC AAG GAC TCC CCA ACA GGA GCA AAC TCA TAT GTG 1813
Gly Ala Ala Gly Leu Lys Asp Ser Pro Thr Gly Ala Asn Ser Tyr Val
525 530 535 540
ATC ATC AAG TGT GAG GGC GAA AAG GTT CGC TCA GCT GTG CAG AGA GGG 1861
ile Ile Lys Cys Glu Gly Glu Lys Val Arg Ser . Ala Val Gin Arg Gly
545 550 555
ACC TCG ACA CCA GAG Glu TAC AAT GTA AAA GGC ATC TTC TAT CGC AAG AAG 1909
Thr Ser Thr Pro 560 Tyr Asn Val Lys 565 Gly Ile Phe Tyr Arg 570 Lys Lys
CTG GCT CAG CCT ATC ACC GTG CAG GTT TGG AAT CAC CGA GTC CTG AAG 1957
Leu Ala Gin Pro Ile Thr Val Gin val Trp Asn His Arg Val Leu Lys
575 580 585
GAT GAA TTC CTG GGC CAG GTG CAC CTG AAG ACT GCC CCG GAT GAC CTG 2005
Asp Glu Phe Leu Gly Gin Val His Leu Lys Thr Ala Pro Asp Asp Leu
590 595 600
• · · • · · · · · • · · ♦ · ·
CAG Gin 605 GAC Asp CTC Leu CAC His ACC Thr CTC CAT CTC Leu CAG Gin GAC Asp CGC Arg 615 AGT Ser AGC Ser CGG Arg CAG Gin CCC Pro 620 2D53
Leu 610 His
AGT GAC CTG CCA GC-C ATT GTA GCT GTG CGA GTC CTC TGC AGT GCC TCT 2101
Ser Asp Leu Pro Gly 625 Ile Val Ala Val Arg 630 Val Leu Cys Ser Ala 635 Ser
CTC ACG GCT GTC TGACCCCAGC CTGCCTGTCC TGCCCCACTA GTCCTCACCA 2153
Leu Thr Ala Val
640
CTACTCGCAT GTCCCCACCT TGCCTGGC-AC CAGCCTGGGA ACCAC-ACACT GGGGCCCTTT 2213
CCTCACTCTT CCACTGACCC ACTGTGTGAC CTGAAGAGAG CCCTGCCCTC TCTGAGCCTC 2273
AGTGTTTGGA GGGCCCCAAA GAATTCCCGT CTTGTGGGGG AGTTTTCTTG CCTAAGATTT 2333
AATGCAGTTC TCTCTACCCA GTGGGCGCTG CTGTTAAGGG GCCATCTGCT GAAAACGTTT 2393
CCCCAGGCCC TGCTGTCTGC CAGGAGTGCC AAGTGTCAAC TGTTTACACA CAAACTGCCA 2453
TGTCCC 2459
/2/ INFORMACE K SEQ ID č.:2;
/i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
/A/ DÉLKA: 640 aminokyseliny /B/ TYP: aminokyseliny /D/ TOPOLOGIE: lineární /ii/ TYP MOLEKULY: protein /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 2:
Met 1 Phe Ser Cys Ala 5 Lys Ala Tyr Glu Asp 10 Gin Asn Tyr Ser Ala 15 Leu
Lys Arg Ala Cys 20 Leu Arg Lys Lys Val 25 Leu Phe Glu Asp Pro 30 Leu Phe
Pro Ala Thr 35 Asp Asp Ser Leu Tyr 40 Tyr Lys Gly Thr Pro 45 Gly Pro Thr
Val Arg 50 Trp Lys Arg Pro Lys 55 Asp Ile Cys Asp Asp 60 Pro Arg Leu Phe
val 65 Asp Gly Ile Ser Ser 70 His Asp Leu His Gin 75 Gly Gin val Gly Asn 80
Cys Trp Phe Val Ala Ala Cys Ser Ser Leu Ala Ser Arg Glu Ser Leu 85 90 95 • · · · ·
- 35 Trp Gin Lys Val Ile Pro Asp Trp Lys Glu Gin Glu Trp Asn Pro Glu
100 105 110
Lys Pro Asp Ser Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Asn Phe Trp Arg Phe 115 120 125
Gly Glu Trp Val Asp Val Ile Val Asp Asp Arg Leu Pro Thr Val Asn 130 135 140
Asn Gin Leu Ile Tyr Cys His Ser Asn Ser Lys Asn Glu Phe Trp Cys
145 150 155 160
Ala Leu Val Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Cys Tyr Gin Ala
165 170 175
Leu Asp Gly Gly Asn Thr Ala Asp Ala Leu Val Asp Phe Thr Gly Gly 180 185 190
Val Ser Glu Pro Ile Asp Leu Thr Glu Gly Asp Leu Ala Thr Asp Glu 195 200 205
Ala Lys Arg Asn Gin Leu Phe Glu Arg Val Leu Lys Val His Ser Arg 210 215 220
Gly Gly Leu Ile Ser Ala Ser Ile Lys Ala Val Thr Ala Ala Asp Met
225 230 235 240
Glu Ala Arg Leu Ala Cys Gly Leu Val Lys Gly His Ala Tyr Ala Val
245 250 255
Thr Asp Val Arg Lys Val Arg Leu Gly His Gly Leu Leu Ala Phe Phe 260 265 270
Lys Ser Glu Lys Leu Asp Met Ile Arg Leu Arg Asn Pro Trp Gly Glu 275 280 285
Arg Glu Trp Thr Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ser Glu Glu Trp Gin Lys 290 295 300
Val Ser Lys Ser Glu Arg Glu Lys Met Gly Val Thr Val Gin Asp Asp
305 310 315 320
Gly Glu Phe Trp Met Thr Phe Glu Asp Met Cys Arg Tyr Phe Thr Asp
325 330 335
Ile Ile Lys Cys Arg Leu Ile Asn Thr Ser Tyr Leu Ser Ile His Lys 340 345 350
Thr Trp Glu Glu Ala Arg Leu His Gly Ala Trp Thr Arg His Glu Asp 355 360 365
Pro Gin Gin Asn Arg Ser Gly Gly Cys Ile Asn His Lys Asp Thr Phe
370 375 380
4 · · 4 4 ·· • · · · · · · • · 4 · 4 4944 4 94 4
4444444 99 44 944 494 • 49 4944 4 9 •4 4 49 44 94 44
Phe 385 Gin Asn Pro Gin Tyr 390 val Phe Glu Val Lys 395 Lys Pro Glu Asp Glu 400
Val Leu Ile Ser Ile 405 Gin Gin Arg Pro Lys 410 Arg Ser Thr Arg Arg 415 Glu
Gly Lys Gly Glu 420 Asn Leu Ala Ile Gly 425 Phe Asp Ile Tyr Lys 430 Val Glu
Glu Asn Arg 435 Gin Tyr Arg Met His 440 Ser Leu Gin His Lys 445 Ala Ala Ser
Ser Ile 450 Tyr Ile Asn Ser Arg 455 Ser Val Phe Leu Arg 460 Thr Glu Leu Pro
Glu 465 Gly Arg Tyr Val Ile 470 Ile Pro Thr Thr Phe 475 Glu Pro Gly His Thr 480
Gly Glu Phe Leu Leu 485 Arg Val Phe Thr Asp 490 Val Pro Ser Asn Cys 495 Arg
Glu Leu Arg Leu Asp Glu Pro Pro Arg Thr Cys Trp Ser Ser Leu Cys
500 505 510
Gly Tyr Pro Gin Gin Val Ala Gin Val His Val Leu Gly Ala Ala Gly 515 520 525
Leu Lys 530 Asp Ser Pro Thr Gly 535 Ala Asn Ser Tyr Val 540 Ile Ile Lys Cys
Glu 545 Gly Glu Lys Val Arg 550 Ser Ala Val Gin Arg 555 Gly Thr Ser Thr Pro 560
Glu Tyr Asn Val Lys 565 Gly Ile Phe Tyr Arg 570 Lys Lys Leu Ala Gin 575 Pro
Ile Thr Val Gin 580 Val Trp Asn His Arg 585 Val Leu Lys Asp Glu 590 Phe Leu
Gly Gin Val 595 His Leu Lys Thr Ala 600 Pro Asp Asp Leu Gin 605 Asp Leu His
Thr Leu 610 His Leu Gin Asp Arg 615 Ser Ser Arg Gin Pro 620 Ser Asp Leu Pro
Gly Ile Val Ala Val Arg Val Leu Cys Ser Ala Ser Leu Thr Ala Val
625 630 635 640 /2/ INFORMACE K SEQ ID č.: 3:
/i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
/A/ DÉLKA: 1743 bp /B/ TYP: KYSELINA NUKLEOVÁ • · · Β Β · · Β · ·· • Β β ΒΒΒ BBBB • ··· · ···· · Β Β · • ΒΒΒΒΒΒΒ · · ·· ΒΒΒ ΒΒΒ • · · BBBB · · • · · Β · BB BB Β Β
- 37 /0/ PODOBA VĚTVE: samostatná /D/ TOPOLOGIE: lineární /ii/ TYP MOLEKULY: cDNS /iii/ HYPOTETICKY: ne /iii/ ANTISENSE: ne /vi/ POVODNÍ PŘÍCHOD:
/A/ ORGANISMUS: raus musculus /B/ KMEN: balb/c /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: 5' UTR /B/ DÉLKA: 1. .193 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: 3' UTR /B/ DÉLKA: 1736..1743 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: CDS /B/ DÉLKA: 194..1735 /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 3
CTGAAGCCCG GGGGTCCAAG TTCCAACCCC CGCCTGCGGG CTGCCGGGGT ATCATCTCCC 60
CGCAGAGTCC CGGCCGTGGC GCGGGCTGGT CTAGCCTCCG CTCCAGTGCC CGCACTGTGC 120 ‘TCTGCATCCC GGGAGTCCAG CTCCAGCTGC GGCGACGCGG CAGGTGCCTC CCCTTCTTGG 180
GGACGTGGTC ACC ATG TTC TCC TGC GCG AAG GCC TAT GAG GAC CAG AAC 229
Met Phe Ser Cys Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Gin Asn
1 5 10
TAC TCG GCG CTG AAG CGG GCC TGC CTG CGC AAG AAG GTG CTG TTC GAG 277
Tyr Ser Ala Leu Lys Arg Ala Cys Leu Arg Lys Lys Val Leu Phe Glu
15 20 25
GAT CCC CTC TTC CCT GCC ACC GAC GAC TCC prprn TAC TAT AAG GGC ACC 325
Asp Pro Leu Phe Pro Ala Thr Asp Asp Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Thr
30 35 40
CCA GGG CCC ACA GTC AGG TGG AAG CGG CCT AAG GAT ATC TGC GAC GAT 373
Pro Gly Pro Thr Val Arg Tzp Lys Arg Pro Lys Asp lle Cys Asp Asp
45 50 55 60
CCC CGG GTA GAT GGC ATC AGC TCC CAT GAC CTG CAC CAG GGC 421
Pro Arg Leu Phe Val Asp Gly lle Ser Ser His Asp Leu His Gin Gly
70 75
• • • • ·· * • · • · • «4 • • · • »· · · • • • · • · • · • · « · • · • • · · • · · • · • · ·· ·· • · · · • · · · • · · · · · • · ·· · ·
- 38 -
CAG GTG GGC AAC TGC TGG TTT GTG GCT GCC TGC TCA TCA CTG GCC TCC 469
Gin Val Gly Asn Cys Trp Phe Val Ala Ala Cys Ser Ser Leu Ala Ser
80 85 90
CGA GAG TCA CTC TGG CAG AAG GTC ATC CCA GAC TGG AAG GAG CAG GAA 517
Arg Glu Ser Leu Trp Gin Lys Val Ile Pro Asp Trp Lys Glu Gin Glu
95 100 105
TGG AAC CCC GAG AAG CCT GAC AGC TAT GCT GGC ATC TTC CAC TTC AAC 565
Trp Asn Pro Glu Lys Pro Asp Ser Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Asn
110 115 120
TTC TGG CGC TTT GGG GAG TGG GTG GAC GTA ATC GTC GAT GAC CGG CTG 613
Phe Trp Arg Phe Gly Glu Trp Val Asp Val Ile Val Asp Asp Arg Leu
125 130 135 140
CCC ACA GTC AAC AAC CAG CTC ATT TAC TGC CAT TCC AAC TCC AAA AAT 661
Pro Thr Val Asn Asn Gin Leu Ile Tyr Cys His Ser Asn Ser Lys Asn
145 150 155
GAG TTC TGG TGT GCC CTG GTG GAG AAG GCC TAT GCC AAG CTG GCC GGC 709
Glu Phe Trp Cys Ala Leu Val Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ala Gly
160 165 170
TGT TAC CAG GCC CTG GAC GGA GGC AAC ACG GCC GAT GCA TTG GTG GAT 757
Cys Tyr Gin Ala Leu Asp Gly Gly Asn Thr Ala Asp Ala Leu Val Asp
175 180 185
TTC ACA GGT GGT GTT TCT GAA CCC ATT GAC CTG ACC GAG GGG GAC TTG 805
Phe Thr Gly Gly Val Ser Glu Pro Ile Asp Leu Thr Glu Gly Asp Leu
190 195 200
GCC ACT GAC GAG GCT AAG AGG AAT CAG CTC TTT GAG CGA GTG CTG AAG 853
Ala Thr Asp Glu Ala Lys Arg Asn Gin Leu Phe Glu Arg Val Leu Lys
205 210 215 220
GTG CAC AGC AGA GGC GGG CTC ATC AGT GCC TCC ATC AAG GCT GTG ACA 901
Val His Ser Arg Gly Gly Leu Ile Ser Ala Ser Ile Lys Ala Val Thr
225 230 235
GCA GCT GAC ATG GAG GCC CGC CTG GCA TGT GGC CTG GTG AAG GGC CAT 949
Ala Ala Asp Met Glu Ala Arg Leu Ala Cys Gly Leu Val Lys Gly His
240 245 250
GCA TAC GCT GTC ACC GAT GTG CGC AAG GTG CGC CTG GGC CAT GGC CTG 997
Ala Tyr Ala Val Thr Asp Val Arg Lys Val Arg Leu Gly His Gly Leu
255 260 265
CTG GCC TTC TTC AAG TCA GAG AAG CTT GAT ATG ATC CGT CTG AGG AAC Leu Ala Phe Phe Lys Ser Glu Lys Leu Asp Met Ile Arg Leu Arg Asn
270 275 280
1045 ·· • · ·
1093
·· *·
ccc TGG GGC GAG CGG GAG TGG ACG' GGG CCC TGG AGT GAC ACG TCA GAG
Pro Trp Gly Glu Arg Glu Trp Thr Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ser Glu
285 290 295 300
GAA TGG CAG AAA GTG AGC AAG AGT GAG AGG GAG AAG ATG GGC GTG ACC
Glu Trp Gin Lys Val Ser Lys Ser Glu Arg Glu Lys Met Gly Val Thr
305 310 315
1141
GTG CAG GAT GAT GGG Gly GAA Glu TTC Phe TGG Trp ATG ACC TTT GAG GAC ATG TGC CGG Arg
Val Gin Asp Asp 320 Met 325 Thr Phe Glu Asp Met 330 Cys
TAC TTT ACT GAC ATC ATT AAA TGC CGC CTG ATT AAC ACG TCC TAC CTG
Tyr Phe Thr Asp Ile Ile Lys Cys Arg Leu Ile Asn Thr Ser Tyr Leu
335 340 345
AGC ATC CAT AAG ACA TGG GAG GAG GCC CGG CTG CAT GGT GCC TGG ACG
Ser Ile His Lys Thr Trp Glu Glu Ala Arg Leu His Gly Ala Trp Thr
350 355 360
AGA CAT GAG GAC CCA CAG CAG AAC CGC AGT GGA GGC TGC ATC AAC CAC
Arg His Glu Asp Pro Gin Gin Asn Arg Ser Gly Gly Cys Ile Asn His
365 370 375 380
AAG GAC ACT TTC TTC CAG AAC CCA CAG TAC GTA TTT GAA GTC AAG AAG
Lys Asp Thr Phe Phe Gin Asn Pro Gin Tyr Val Phe Glu Val Lys Lys
385 390 395
CCA GAA GAT GAA GTG TTG ATC AGT ATC CAG CAG CGG CCG AAG CGC TCA
Pro Glu Asp Glu Val Leu Ile Ser Ile Gin Gin Arg Pro Lys Arg Ser
400 405 410
1189
1237
1285
1333
1381
1429
ACT CGC CGG GAG GGC AAA GGC GAG AAT CTG GCC ATT GGC TTC GAC ATC
Thr Arg Arg Glu Gly Lys Gly Glu Asn Leu Ala Ile Gly Phe Asp Ile
415 420 425
1477
TAT AAG Tyr Lys GTG Val GAA Glu GAG Glu AAC CGC CAA TAC CGT ATG CAC AGC CTA Leu CAG Gin CAT His
Asn Arg 435 Gin Tyr Arg Met His 440 Ser
430
AAG GCC GCC AGC TCC ATC TAC ATC AAT TCC CGC AGC GTT TTT TTG AGG
Lys Ala Ala Ser Ser Ile Tyr Ile Asn Ser Arg Ser Val Phe Leu Arg
445 450 455 460
ACA GAG CTG CCC GAG GGC CGC TAC GTT ATC ATC CCT ACC ACC TTT GAG
Thr Glu Leu Pro Glu Gly Arg Tyr val Ile Ile Pro Thr Thr Phe Glu
465 470 475
CCA GGC CAC ACT GGC GAG TTC CTG CTC CGA GTC TTC ACA GAT GTC CCC
Pro Gly His Thr Gly Glu Phe Leu Leu Arg Val Phe Thr Asp Val Pro
480 485 490
1525
1573
1621
1669 • ·
TCC AAC TGC CGG TGT GTG GGG GCT' AGG GCT AGT GAC CGC ATG CAT ATA
Ser Asn Cys Arg Cys val Gly Ala Arg Ala Ser Asp Arg Met His Ile
495 500 505
TAC CCC ATG CTG GGC TAGATTTTAA C
Tyr Pro Met Leu Gly
510
/2/ INFORMACE K SEQ ID č.: 4 :
1717
1743 /i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA ' /A/ DÉLKA: 513 aminokyseliny /B/ TYP: aminokyselina /C/ TOPOLOGIE: lineární /ii/ TYP MOLEKULY: protein /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č. : 4 :
Met Phe Ser Cys Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Gin Asn Tyr Ser Ala Leu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Cys Leu Arg Lys Lys Val Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe
20 25 30
Pro Ala Thr Asp Asp Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Thr Pro Gly Pro Thr
40 45
Val Arg 50 Trp Lys Arg Pro Lys 55 Asp Ile Cys Asp Asp 60 Pro Arg Leu Phe
val 65 Asp Gly ile Ser Ser 70 His Asp Leu His Gin 75 Gly Gin Val Gly Asn 80
Cys Trp Phe val Ala 85 Ala Cys Ser Ser Leu 90 Ala Ser Arg Glu Ser 95 Leu
Trp Gin Lys Val 100 Ile Pro Asp Trp Lys 105 Glu Gin Glu Trp Asn 110 Pro Glu
Lys Pro Asp 115 Ser Tyr Ala Glv Ile 12 0 Phe His Phe Asn Phe 125 Trp Arg Phe
Gly Glu 130 Trp val Asp Val Ile 135 Val Asp Asp Arg Leu 140 Pro Thr Val Asn
Asn 145 Gin Leu Ile Tyr Cys 150 His Ser Asn Ser Lys 155 Asn Glu Phe Trp Cys 160
Ala Leu Val Glu Lys Al a Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Cys Tyr Gin Ala
165 170 175
Leu Asp Gly Gly Asn Thr Ala Asp Ala Leu Val Asp Phe Thr Gly Gly 180 185 190
·· ·
Gly Glu Phe Leu Leu Arg 485 Val Phe Thr Asp 490 Val Pro Ser Asn Cys 495 Arg
Cys Val Gly Ala 500 Arg Ala Ser Asp Arg 505 Met HiS Ile Tyr Pro 510 Met Leu
Gly /2/ INFORMACE K SEQ ID č.: 5:
/i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
/A/ DÉLKA: 504 bp /B/ TYP: kyselina nukleová /c/ PODOBA VĚTVE: samostatná /D/ TOPOLOGIE: lineární /ii/ TYP MOLEKULY: DNS /genově smíšená/ /iii/ HYPOTETICKY: ne /iii/ ANTISENSE: ne /vi/ P0VODNÍ PŘÍCHOD:
/A/ ORGANISMUS: mus musculus /B/ KMEN: ES E14 /vii/ BEZPROSTŘEDNÍ PŘÍCHOD:
/B/ KLON: 29/30 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: exon /B/ DÉLKA: 1..33 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: intron /B/ DÉLKA: 34..440 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: exon /B/ DÉLKA: 441..504 /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 5:
CGAGCGGGAG TGGACGGGCC CCTGGAGTGA CACGTGAGGC TCACCAGGGT TGGGGCTGGG 60 TATGGGCACA GAGGCAAGGA CAAGCGGTGA CACTGGACTG GGCCTTGCAG GGTCTGGGAG 120 AGATGCTCTG AGGAAAAAAT GGGAGACTTA CTTTCCAGTG TAAGTGTGGT GCTTGGGGGG 180 TAGGTTCATC AAGGACAGTG GCCAGAAGTG TGGCATGCTT TGTACGTGGA CAATGGCGCC 240 TCACCAGCTT TATTCCCTGA CTTCATAGCC TTAGCATAAA GGAAGATCAC AGTTCCTAGT 300 • φ
Φ ·
GC-GAGAGAAC AGAGGCTTCT TAGCAGGC-CT GGGCATGGCC TCCAGGTCTC TACCCACAGT 360
GCTCTGCAGG CGGCTTGGTC CAGAGCTCTC CCTTGGGCCA CTCCTCTTAT CCCGTTCCCT 420
CCCTGATACT CACTCCCCAG GTCAGAGGAA TGGCAGAAAG TGAGCAAGAG TGAC-AGGGAG 4S0
AAGATGGGCG TGACCGTGCA GGAT 504
/2/.INFORMACE Κ SEQ ID Č.: 6:
/i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
/A/ DÉLKA: 1975 bp /B/ TYP: kyselina nukleová /C/ PODOBA VĚTVE: samostatná /D/ TOPOLOGIE: lineární /ii/ TYP MOLEKULY: cDNS /iii/ HYPOTETICKY: ne /iii/ ANTISENSE: ne /vi/ P0VODNÍ PŘÍCHOD:
/A/ ORGANISMUS: homo sapiens /vii/ BEZPROSTŘEDNÍ PŘÍCHOD:
/B/ KLON: nCL-3 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: 5' UTR /B/ DÉLKA: 1964..1975 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: 3UTR /B/ DÉLKA: 1964..1975 /ix/ ZNAKY:
/A/ JMÉNO/KLÍČ: CDS /B/ DÉLKA: 44 . . 1963 /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 6:
ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGCCGCCCGG GCAGGTAGCC ACC ATG TTC TCG TGT 55
Met Phe Ser Cys
GTG AAG CCC TAT GAG GAC CAG AAC TAC TCA GCC CTG AGG CGG GAC TGC 103
Val Lys Pro Tvr Glu Asp Gin Asn Tyr Ser Ala Leu Arg Arg Asp Cys
5 10 15 20
CGG Lu1- AGG AAG GTG .ΤΊΓΠ£ GAG GAC CCC C^C • - CCC GCC ACT GAC 151
Arg Arg Arg Lys Val Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe Pro Ala Asp
30 35 * Λ ··«·
99 •·9 · • » Μ» · • 9 9 9 9 • · · · ·· ·· >·
GAC TCA CTC TAC TAT AAG GGC ACG CCG GGG CCC GCC GTC AGG CGG AAG
Asp Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Thr Pro Gly Pro Ala Val Arg Arg Lys
40 45 50
CGA CCC AAG GGC Gly ATC lle TGC Cys GAG Glu GAC CCC CGC CTC Leu TTT GTG Phe Val 65 GAT GGC Asp Gly ATC lle 247
Arg Pro Lys 55 Asp 60 Pro Arg
AGC TCC CAC GAC CTG CAC CAG GGC CAG GTG GGC AAC TGC TGG TTT GTG 295
Ser Ser His Asp Leu His Gin Gly Gin Val Gly Asn. Cys Trp Phe Val
70 75 80
GCA GCC TGC TCG TCA CTT GCC TCC CGG GAG TCG CTG TGG CAA AAG GTC 343
Ala 85 Ala Cys Ser Ser Leu Ala 90 Ser Arg Glu Ser 95 Leu Trp Gin Lys Val 100
ATC CCA GAC TGG AAG GAG CAG GAA TGG GAC CCC GAA AAG CCC AAC GCC 391
lle Pro Asp Trp Lys Glu Gin Glu Trp Asp Pro Glu Lys Pro Asn Ala
105 110 115
TAC GCG GGC ATC TTC CAC TTC CAC TTC TGG CGC TTC GGG GAA TGG GTG 439
Tyr Ala Gly lle Phe His Phe His Phe Trp Arg Phe Gly Glu Trp Val
120 125 130
GAC GTG Asp Val GTC Val 135 ATC lle GAT GAC Asp Asp CGG Arg CTG CCC ACA GTC AAC AAC CAG CTC ATC 487
Leu 140 Pro Thr Val Asn Asn 145 Gin Leu lle
TAC TGC CAC TCC AAC TCC CGC AAT GAG TTT TGG TGC GCC CTA GTG GAG 535
• Tyr Cys His Ser Asn Ser Arg Asn Glu Phe Trp Cys Ala Leu Val Glu
•s 150 155 160
AAG GCC TAT GCC AAA CTG GCA GGC TGT TAC CAG GCC CTG GAT GGA GGC 583
Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Cys Tyr Gin Ala Leu Asp Gly Gly
165 170 175 180
AAC ACA GCA GAC GCA CTG GTG GAC TTC ACG GGT GGT GTT TCT GAG CCC 631
Asn Thr Ala ASp Ala Leu Val Asp Phe Thr Gly Gly val Ser Glu Pro
185 190 195
ATC GAC CTG ACC GAG GGT GAC TTT GCC AAC GAT GAG ACT AAG AGG AAC 679
lle Asp Leu Thr Glu Gly Asp Phe Ala Asn Asp Glu Thr Lys Arg Asn
200 205 210
CAG CTC TTT GAG CGC ATG TTA AAG GTG CAC AGC CGG GGC GGC CTC ATC 727
Gin Leu Phe Glu Arg Met Leu Lys Val His Ser Arg Gly Gly Leu lle
215 220 225
AGT GCC TCC ATC AAG GCA GTG ACA GCA GCT GAC ATG GAG GCC CGC CTG 775
Ser Alh 230 Ser lle Lys Ala Val 235 Thr Ala Ala Asp Met 240 Glu Ala Arg Leu
9 • · «·· ·· · • 4 · • · · 9 • ····· • · ·
9 ·· ·· • · · • · ··· • · · · · • 9 9 ·
99 «
• · ···
GCG TGC Ala Cys 245 GGC Gly CTG GTA Leu Val AAG GGC Lys Gly 250 CAC GCA TAC His Ala Tyr GCC Ala 255 GTC Val ACT GAT GTG CGC 823
Thr Asp Val Arg 260
AAG GTG CGC CTG GGC CAC GGC CTA CTG GCC TTC TTC AAG TCA GAG AAG 871
Lys Val Arg Leu Gly His Gly Leu Leu Ala Phe Phe Lys Ser Glu Lys
265 270 275
TTG GAC ATG ATC CGC CTG CGC AAC CCC TGG GGC GAG CGG GAG TGG AAC 919
Leu Asp Met Ile Arg Leu Arg Asn Pro Trp Gly Glu Arg Glu Trp Asn
280 285 290
GGG CCC TGG AGT GAC ACC TCG GAG GAG TGG CAG AAA GTG AGC AAG AGT 967
Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ser Glu Glu Trp Gin Lys Val Ser Lys Ser
295 300 305
GAG CGG GAG AAG ATG GGT GTG ACC GTG CAG GAC GAC GGT GAG TTC TGG 1015
Glu Arg Glu Lys Met Gly Val Thr Val Gin Asp Asp Gly Glu Phe Trp
310 315 320
ATG ACC TTC GAG GAC GTG TGC CGG TAC TTC ACG GAC ATC ATC AAG TGC 1063
Met Thr Phe Glu Asp Val Cys Arg Tyr Phe Thr Asp Ile Ile Lys Cys
325 330 335 340
CGC GTG ATC AAC ACA TCC CAC CTG AGC ATC CAC AAG ACG TGG GAG GAG 1111
Arg Val Ile Asn Thr Ser His Leu Ser Ile His Lys Thr Trp Glu Glu
345 350 355
GCC CGG CTG ! Ala Arg Leu CAT His 360 GGC GCC TGG ACG CTG CAT GAG GAC CCG CGA CAG AAC 1159
Gly Ala Trp Thr Leu 365 His Glu Asp Pro Arg 370 Gin Asn
CGC GGT GGC GGC TGC ATC AAC CAC AAG GAC ACC TTC TTC CAG AAC CCA 1207
Arg Gly Gly Gly Cys Ile Asn His Lys Asp Thr Phe Phe Gin Asn Pro
375 380 385
CAG TAC ATC TTC GAA GTC AAG AAG CCA GAA GAT GAA GTC CTG ATC TGT 1255
Gin Tyr Ile Phe Glu val Lys Lys Pro Glu Asp Glu Val Leu Ile Cys
390 395 400
ATC CAG CAG CGG CCA AAG CGG TCT ACG CGC CGG GAG GGC AAG GGT GAG 1303
Ile Gin Gin Arg Pro Lys Arg Ser Thr Arg Arg Glu Gly Lys Gly Glu
405 410 415 420
AAC CTG GCC ATT GGC TTT GAC ATC TAC AAG GTG GAG GAG AAC CGC CAG 1351
Asn Leu Ala Ile Gly Phe Asp Ile Tyr Lys Val Glu Glu Asn Arg Gin
425 430 435
TAC CGC ATG CAC AGC CTG CAG CAC AAG GCC GCC AGC TCC ATC TAC ATC 1399
Tyr Arg Met His Ser Leu Gin His Lys Ala Ala Ser Ser Ile Tyr Ile
440 445 450
• · ·
- 46 - • • · • · • • • • · · • · · • · 9 9 9 9
AAC TCA CGC AGC GTC TTC CTG CGC ACC GAC CAG CCC GAG GGC CGC TAT 14-47
Asn Ser Arg Ser Val Phe Leu Arg Thr Asp Gin Pro Glu Gly Arg Tyr
455 460 465
GTC ATC ATC CCC ACA ACC TTC GAG CCA GGC CAC ACT GGC GAG TTC CTG 1495
Val Ile Ile Pro Thr Thr Phe Glu Pro Gly His Thr Gly Glu Phe Leu
470 475 480
CTC CGA GTC TTC ACT GAT GTG CCC TCC AAC TGC CGG GAG CTG CGC CTG 1543
Leu Arg Val Phe Thr Asp Val Pro Ser Asn Cys Arg Glu Leu Arg Leu
485 490 495 500
GAT GAG CCC CCA CAC ACC TGC TGG AGC TCC CTC TGT GGC TAC CCC CAG 1591
Asp Glu Pro Pro His Thr Cys Trp Ser Ser Leu Cys Gly Tyr Pro Gin
505 510 515
CTG GTG ACC CAG GTA CAT GTC CTG GGA GCT GCT GGC CTC AAG GAC TCC 1639
Leu Val Thr Gin Val His Val Leu Gly Ala Ala Gly Leu Lys Asp Ser
520 525 530
CCA ACA GGG GCT AAC TCT TAT GTG ATC ATC AAG TGT GAG GGA GAC AAA 1687
Pro Thr Gly Ala Asn Ser Tyr Val Ile Ile Lys Cys Glu Gly Asp Lys
535 540 545
GTC CGC TCG GCT GTG CAG AAG GGC ACC TCC ACA CCA GAG TAC AAT GTG 1735
Val Arg Ser Ala Val Gin Lys Gly Thr Ser Thr Pro Glu Tyr . Asn Val
550 555 560
AAA GGC ATC TTC Phe TAC Tyr CGC AAG AAG CTG AGC CAG CCC ATC ACT GTA CAG 1783
iLys 565 Gly Ile Arg 570 Lys Lys Leu Ser Gin 575 Pro Ile Thr Val Gin 580
GTC TGG AAC CAC CGA GTG CTG AAG GAT GAA TTT CTG GGC CAG GTG CAC 1831
Val Trp Asn His Arg Val Leu Lys Asp Glu Phe Leu Gly Gin Val His
585 590 595
CTA AAG GCT GAC CCG GAC AAC CTC CAG GCC CTG CAT ACC CTC CAC CTC 1879
Leu Lys Ala Asp Pro Asp Asn Leu Gin Ala Leu His Thr Leu His Leu
600 605 610
CGG GAC CGA AAT AGC CGG CAG CCC AGC AAC CTG CCA GGC ACT GTG GCC 1927
Arg Asp Arg Asn Ser Arg Gin Pro Ser Asn Leu Pro Gly Thr Val Ala
615 620 625
GTG CAC ATT CTC AGC AGC ACC TCT CTC ACG GCT GTC TGACTCGAGC 1973
Val His Ile Leu Ser Ser Thr Ser Leu Thr Ala Val
630 635 640
TA
1975 /2/ INFORMACE K SEQ ID č β · • · 4 • «4 444 4444 • 444 4 4444 4 44 4
4444444 44 44 444 444
444 4444 * ·
4 44 4« 4 4 44
- 47 /i/ SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA /A/ DÉLKA: 640 aminokyseliny /B/ TYP: aminokyselina /ii/ TYP MOLEKULY: protein /xi/ POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 7:
Met X Phe Ser Cys Val Lys 5 i Pro Ty* • Glu Asp 10 Gin Asr l Tyr Ser Ala 15 Leu
Arg Arg ASP Cys 20 Arg Arg Arg Lys Val 25 Leu Phe Glu Asp Pro 30 Leu Phe
Pro Ala Thr 35 Asp Asp Ser Leu Ty* 40 Tyr Lys Gly Thr Pro 45 Gly Pro Ala
Val .Arg 50 Arg Lys Arg Pro Lys 55 Gly Ile Cys Glu Asp 60 Pro Arg Leu Phe
Val 65 Asp Gly Ile Ser Ser 70 His Asp Leu His Gin Gly 75 Gin Val Gly Asn 80
Cys Trp Phe Val Ala Ala 85 Cys Ser Ser Leu 90 Ala Ser Arg Glu Ser 95 Leu
Trp Gin Lys Val 100 Ile Pro Asp Trp Lys 105 Glu Gin Glu Trp Asp 110 Pro Glu
Lys ' Pro , Asn , Ala Tyr Ala Gly Ile Phe His . Phe His Phe Trp . Arg Phe
115 120 125
Gly Glu Trp Val Asp Val Val Ile Asp Asp Arg Leu Pro Thr Val Asn 130 135 140
Asn Gin Leu Ile Tyr Cys His Ser Asn Ser Arg Asn Glu Phe Trp Cys
145 150 155 160
Ala Leu Val Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Cys Tyr Gin Ala
165 170 175
Leu Asp Gly Gly Asn Thr Ala Asp Ala Leu Val Asp Phe Thr Gly Gly 180 185 190
Val Ser Glu Pro Ile Asp Leu Thr Glu Gly Asp Phe Ala Asn Asp Glu 195 200 205
Thr Lys Arg Asn Gin Leu Phe Glu Arg Met Leu Lys Val His Ser Arg 210 215 220
Gly Gly Leu Ile Ser Ala Ser Ile Lys Ala Val Thr Ala Ala Asp Met 225 230 235 240 • · · · · 4 4 ·· 4 9 • · Μ · · · 9 4 9 4 • ··· · ···· · ·· · • 4 4444 · · 4 4 «4 ··· 444 • 4 · 4 4 4 4 4 4
- 48 —
Glu Ala Arg Leu Ala Cys Gly Leu Val Lys Gly His Ala Tyr Ala Val
245 250 255
Thr Asp Val Arg Lys Val Arg Leu Gly His Gly Leu Leu Ala Phe Phe
260 265 270
Lys Ser Glu Lys Leu Asp Met Ile Arg Leu Arg Asn Pro Trp Gly Glu
275 280 285
Arg Glu Trp Asn Gly Pro Trp Ser Asp Thr Ser Glu Glu Trp Gin Lys
290 295 300
Val Ser Lys Ser Glu Arg Glu Lys Met Gly Val Thr Val Gin Asp Asp
305 310 315 320
Gly Glu Phe Trp Met Thr Phe Glu Asp Val Cys Arg Tyr Phe Thr Asp
325 330 335
Ile Ile Lys Cys Arg Val Ile Asn Thr Ser His Leu Ser Ile His Lys
340 345 350
Thr Trp Glu Glu Ala Arg Leu His Gly Ala Trp Thr Leu His Glu Asp
355 360 365
Pro Arg Gin Asn Arg Gly Gly Gly Cys Ile Asn His Lys Asp Thr Phe
370 375 380
Phe Gin Asn Pro Gin Tyr Ile Phe Glu Val Lys Lys Pro Glu . Asp Glu
385 390 395 400 •Val Leu Ile Cys Ile Gin Gin Arg Pro Lys Arg Ser Thr Arg Arg Glu 405 410 415
Gly Lys Gly Glu Asn Leu Ala Ile Gly Phe Asp Ile Tyr Lys Val Glu 420 425 430
Glu Asn Arg Gin Tyr Arg Met His Ser Leu Gin His Lys Ala Ala Ser 435 440 445
Ser Ile Tyr Ile Asn Ser Arg Ser Val Phe Leu Arg Thr Asp Gin Pro 450 455 460
Glu Gly Arg Tyr Val Ile Ile Pro Thr Thr Phe Glu Pro Gly His Thr
465 470 475 480
Gly Glu Phe Leu Leu Arg Val Phe Thr Asp Val Pro Ser Asn Cys Arg
485 490 495
Glu Leu Arg Leu Asp Glu Pro Pro His Thr Cys Trp Ser Ser Leu Cys 500 505 510
Gly Tyr Pro Gin Leu Val Thr Gin Val His Val Leu Gly Ala Ala Gly 515 520 525 • · • · · · · · · · · « • · · · · ···· · ·· · • ······· ·· · · ··· · · ·
49 - e · • · • • • · • · • *
Leu Lys 530 Asp Ser Pro Thr Gly 535 Ala Asn Ser Tyr Val 540 Ile Ile Lys Cys
Glu 545 Gly Asp Lys Val Arg 550 Ser Ala Val Gin Lys 555 Gly Thr Ser Thr Pro 560
Glu Tyr Asn Val Lys 565 Gly Ile Phe Tyr Arg 570 Lys Lys Leu Ser Gin 575 Pro
Ile Thr Val Gin 580 Val Trp Asn His Arg 585 Val Leu Lys Asp Glu 590 Phe Leu
Gly Gin Val 595 His Leu Lys Ala Asp 600 Pro Asp Asn Leu Gin 605 Ala Leu His
Thr Leu 610 His Leu Arg Asp Arg 615 Asn Ser Arg Gin Pro 620 Ser Asn Leu Pro
Gly 625 Thr Val Ala Val His 630 Ile Leu Ser Ser Thr 635 Ser Leu Thr Ala Val 640
3PHUCNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETfČKA ZELfcNY ŠVORČÍK KALENSKÝ A PARTNEŘI
180 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika
PATENTOVÉ
1. 6en calpain nCL-3 se allelické varianty,
NÁROKY

Claims (10)

  1. sekvencí SEQ ID č které mají na
    1 a rovněž jeho odvozené úrovni aminokyseliny homologii 60 až 100 %, analogy nebo deriváty.
  2. 2. Gen calpain nCL-3 podle nároku 1, vyznačující se tím, že se u analogů jedná o zkrácenou sekvenci genu.
  3. 3. Gen calpain nCL-3 podle nároku 1 kódovaný pomocí sekvence SEQ ID č.: 6.
  4. 4. Genový konstrukt obsahující gen calpain nCL-3 podle nároků 1 až 3, který je funkčně spojen s jedním nebo více regulačními signály ke zvýšení exprese genu.
  5. 5. Sekvence aminokyseliny, kódovaná genem nCL-3 podle nároku 1.
    calpainů, přičemž se 1 z tkání nebo buněk.
    Způsob k identifikaci inhibitorů calpain kóduje sekvencí podle nároku v nichž se exprimuje enzym nCL-3, izoluje se a měří se inhibice štěpení substrátu enzymu nCL-3 a v alespoň jednom dalším testu se měří inhibice štěpení substrátu enzymu calpainů I a/nebo II testovacími substancemi, které vykazují inhibiční účinek alespoň vzhledem ke calpainů.
    Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, testovací substance, které neinhibují inhibují enzymy calpain I a/nebo II.
    ze se pouzívaji enzym nCL-3 a
    Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, testovací substance, které inhibují neinhibují enzymy calpain I a/nebo II.
    ze se používají enzym nCL-3 a • · • · • · • · · ftftft · · · · • ftftft · · · · * · · · · • · ♦··· · « · · · · ·· ··· • « · · · · · · · «· ft ·· ftft ftft · ·
    -51 9. Způsob podle nároků 6 až 8, vyznačující se tím, že testovací substance prochází v celulárních systémech buněčnou membránou.
  6. 10. Způsob výroby enzymu nCL-3, vyznačující se tím, že se kopie genové sekvence pro nCL-3 podle nároku 1 klonuje do vektoru a v hostitelském organismu odpovídajícího vektoru se gen exprimuje pro enzym nCL-3 a následně se enzym z hostitelského organismu izoluje.
  7. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se používá
    vektor, buňkách který umožňu; v prokaryontických nebo eukaryont i ckých j e expres i genu pro nCL-3. 1 2 . Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se jako hostitel ský organ i smus používají bakteri e, houbové nebo zví řečí buňky. 1 3 . Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se jako
    vektor používají baculoviry a jako hostitelský organismus buňky hmyzu.
  8. 14. Použití inhibitoru calpainu identifikovatelného podle nároků 6 až 9 k výrobě medikamentů k ošetřování nemocí, u nichž existuje chybná funkce calpainu.
  9. 15 Použití inhibitoru calpainu podle nároku 14 k výrobě medikamentů k ošetřování nemocí ze skupiny kardiovaskulárních, imunologických, zánětlivých, alergických, neurologických, nebo onkologických onemocnění.
  10. 16. Použití calpainu nCL-3 podle nároku 5 v testovacích systémech.
    «·· «· · * ·» ··· ··· · · · · • ··· · · · · · · · · · • ·····«· ·· · « · · · · · · • » · » · · · · · «· 4 4 4 4 4 44 4 4
    - 52 1 7 .
    1 8 .
    1 9 .
    20 .
    Použití calpainu nCL-3 podle nároku 5 k výrobě protilátek.
    Použití genové sekvence podle nároku 1 k výrobě antisenční mRNA.
    Použití antisenční mRNA podle nároku 18 k výrobě medikamentů k ošetřování nemocí, u nichž e‘xistuje chybná f unkce calpainu.
    Použití genu calpainu podle nároku 1 k diagnóze nemocí nebo v genové therapii.
    SPnteČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZEUivV ČVO^ČÍK KALENSKÝ A PARTNEŘI ί 20 oo Braha 2, Hálkova 2
    Česká republika
    Τΐ/ΐονΓ.^ • A · « · « » · · « · J ··· fc·· · · · · * · · · · · · · · · ·« ·
    Obr. 1 adult dEl2 embryo o
    >N >1
    C •d •b >
CZ992005A 1996-12-04 1997-11-28 Nové calpainy, jejich výroba a použití CZ9902005A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1996150142 DE19650142A1 (de) 1996-12-04 1996-12-04 Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung
DE1997118248 DE19718248A1 (de) 1997-04-30 1997-04-30 Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ9902005A3 true CZ9902005A3 (cs) 1999-09-15

Family

ID=26031846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ992005A CZ9902005A3 (cs) 1996-12-04 1997-11-28 Nové calpainy, jejich výroba a použití

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6569665B1 (cs)
EP (1) EP0942995A1 (cs)
JP (1) JP2001506846A (cs)
KR (1) KR20000057365A (cs)
CN (1) CN1245536A (cs)
AU (1) AU737504B2 (cs)
BR (1) BR9713849A (cs)
CA (1) CA2274304A1 (cs)
CZ (1) CZ9902005A3 (cs)
HU (1) HUP0000498A3 (cs)
IL (1) IL129909A0 (cs)
NO (1) NO992690L (cs)
WO (1) WO1998024916A1 (cs)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPQ656500A0 (en) * 2000-03-28 2000-04-20 Autogen Pty Ltd A method of treatment and agents for same
WO2005082860A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 National Research Council Of Canada Tetracyclines and their use as calpain inhibitors
CA2631071A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-09 Tong-Jun Lin Inhibition of calpain reduces allergic inflammation
CN104458709A (zh) * 2013-09-12 2015-03-25 中国药科大学 一种筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法
CN105334329B (zh) * 2015-12-10 2017-07-28 中国农业科学院农产品加工研究所 钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法
WO2018071216A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating genetic eye diseases
US20220364142A1 (en) * 2019-10-11 2022-11-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for measuring and inhibiting calpain-5 activity

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE268816T1 (de) * 1994-07-15 2004-06-15 Cephalon Inc In baculovirus exprimiertes aktives calpain
EP0717110A1 (en) * 1994-11-22 1996-06-19 Association Francaise Contre Les Myopathies LGMD gene

Also Published As

Publication number Publication date
CN1245536A (zh) 2000-02-23
NO992690L (no) 1999-08-03
AU737504B2 (en) 2001-08-23
IL129909A0 (en) 2000-02-29
BR9713849A (pt) 2000-02-29
KR20000057365A (ko) 2000-09-15
NO992690D0 (no) 1999-06-03
EP0942995A1 (de) 1999-09-22
US6569665B1 (en) 2003-05-27
HUP0000498A3 (en) 2003-08-28
JP2001506846A (ja) 2001-05-29
CA2274304A1 (en) 1998-06-11
AU5557698A (en) 1998-06-29
WO1998024916A1 (de) 1998-06-11
HUP0000498A2 (hu) 2000-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Haugwitz et al. Dictyostelium amoebae that lack G-actin-sequestering profilins show defects in F-actin content, cytokinesis, and development
Valentin et al. Cloning and recombinant expression of human group IIF-secreted phospholipase A2
US5759811A (en) Mutant human hedgehog gene
Heinlein et al. Male Germ Cell‐Expressed Mouse Gene TAZ83 Encodes a Putative, Cysteine‐rich Transmembrane Protein (cyritestin) Sharing Homologies with Snake Toxins and Sperm‐Egg Fusion Proteins: (testis/spermatogenesis/protein family/disintegrins)
CN101117644A (zh) 青光眼的诊断和治疗药物
US5834283A (en) Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT)
US5686598A (en) Genes associated with retinal dystrophies
Therond et al. Molecular organisation and expression pattern of the segment polarity gene fused of Drosophila melanogaster
CZ9902005A3 (cs) Nové calpainy, jejich výroba a použití
Zinyk et al. Drosophila awd K–pn, a homologue of the metastasis suppressor gene nm23, suppresses the Tum–I haematopoietic oncogene
JP2003501026A (ja) 脂質代謝転写因子
US6797816B2 (en) Identification and cloning of a new subfamily of sulfatases and functional embryonic techniques for characterization of such proteins
US6812017B2 (en) Mammalian secreted group IIF phospholipase A2
KR20010023282A (ko) 신규 조직 특이적 칼파인, 그의 제조 방법 및 용도
JP2003517821A (ja) ２７８６、ヒトアミノペプチダーゼ
EP1972687A1 (en) Polynucleotides and polypeptides of human factor VII gene, SNPs
MXPA00001719A (es) Novedosas calpainas especificas de tejido, su preparacion y uso
JP4412734B2 (ja) 脊椎動物の初期発生における中胚葉形成を支配する新規遺伝子ＢｒａｃｈｙｕｒｙＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＮｕｃｌｅａｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＢＥＮＩ
NL1022252C2 (nl) Nieuwe metallo-proteasen met trombospondine domeinen en daarvoor coderende nucle´nezuur samenstellingen.
US20060168668A1 (en) Phosphodiesterase 2a and methods of use
CZ2000680A3 (cs) Nové tkáňově-specifické kalpainy, jejich příprava a použití
DE19718248A1 (de) Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung
US20060177828A1 (en) Alternatively spliced isoform of mitotic centromere-associated kinesin (MCAK)
Natarajan Characterization of the Ga5 G protein signal transduction pathway and its specificity in the development of Dictyostelium discoideum
WO2003033689A1 (en) Cloning and recombinant expression of mammalian secreted group iif phopholipase a2

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic