MXPA00001719A - Novedosas calpainas especificas de tejido, su preparacion y uso - Google Patents

Abstract

Se preparan calpaínas específicas de tejido novedosas como se describe. También se describe un método para clasificar inhibidores de calpaína novedosos y su uso.

Description

NOVEDOSAS CALPAINAS ESPECIFICAS DE TEJIDO, SU PREPARACIÓN Y USO La invención se refiere a novedosas calpaínas específicas de tejido y a su preparación. La invención además se relaciona a métodos para clasificar novedosos inhibidores de calpaína en su uso. Las calpaínas están entre las enzimas intracelulares, no lisomales del grupo cisteína proteasa. Están involucradas en la transducción de señal dependiente de Ca2+ en células eucarióticas, es decir controlan funciones celulares en una forma dependiente de la concentración de Ca2+. Las calpaínas ocurren en forma oblicua en tejidos y células de animales por ejemplo de humanos, gallinas, conejos o ratas. Las calpaínas también se han encontrado en animales inferiores tales como en Drosophila melanogaster, Schistosoma o Carnorhabditis elegans. Aún no se han detectado calpaínas en levaduras, hongos o bacterias . A la fecha, tres isoformas principales de estas calpaínas oblicuas se conocen y difieren por su capacidad de activación dependiente de calcio in vitro. Calpaína I (= µ calpaína) se activa por concentraciones de ion calcio µ-molares, mientras que calpaína II (= m calpaína) se activa solo por concentraciones mili molares de iones calcio. Ambas calpaínas consistes de dos sub-unidades, una gran sub-unidad de aproximadamente 80 kDa y una pequeña sub-unidad de aproximadamente 30 kDa. Ambas sub-unidades del heterodímero activo tienen sitios de unión para calcio. La gran sub-unidad está compuesta de los siguientes cuatro dominios de proteínas (= I - IV) : un dominio de proteasa (= dominio II) , un dominio de unión de calcio (= dominio IV) y otros dos dominios (= dominios I y III) , cuya función no es clara. La pequeña sub-unidad de 30 K consiste de una sub-unidad de unión de calcio (= IV) y otra sub-unidad ( = V) , cuya función no es clara. Además de estos dos tipos de calpaínas, un tercer tipo (= µ/m 80K) que es intermedio con respecto a activación de calcio, se ha encontrado en gallinas (Wang K.K. . y colaboradores, TiPS, Vol. 15, 1994: 412 419, Suzuki, K y colaboradores, Biol. Chem. Hoppe Seyler, Vol. 376, 1995: 523 - 529 ). Además de estas calpaínas que ocurren en forma ubicua, recientemente dos calpaínas expresadas específicamente de tejido novedosas se han identificado. nCL 1 (= p94) es una calpaína específica de músculo que ocurre en gallinas, ratas y humanos y que, se considera puede ser activa como monómero y solo consiste de la subunidad 80 kd. Además de nCL 1 hay una calpaína específica de estómago que puede ocurrir en dos variantes de pegado nCL 2 y nCL 2' . nCL 2' difiere de nCL 2 por la ausencia de la reacción de unión de calcio (Sorimachi, H.S. y colaboradores, J. Biol. Chem. Vol. 268, no. 26, 1993: 19476 - 19482, Sorimachi, H:S: y colaboradores, FEBS Lett. 343, 1994: 1 - 5) . Una proteína homologa de calpaína (= CalpA) , que interactúa con actina y supuestamente juega un papel importante en desarrollo embriogénico y que tiene dos variantes de SPI diferentes, se ha encontrado en drosophila (Mol. Gell. Biol. Vol. 15, no. 2, 1995: 824 - 834). En este caso también, la variante más corta carece del sitio de unión de calcio. Se supone que la calpaína juega una parte importante en diversos procesos fisiológicos . Una gran cantidad de proteínas citoesqueléticas, ligadas a membrana o regulatorias tales como proteína-cinasa C, fosfolipasa C, espectrina, proteínas citoesqueléticas tales como MAP2 , proteínas musculares, neurofilamentos y neuropéptidos, proteínas de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, receptor NMDA y proteínas involucradas en mitosis y otras proteínas, son substratos de calpaína (Barrett M.J. y colaboradores, Life Sci. 48, 1991: 1659 69, Wang K.K. y colaboradores, Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994: 412 -419) . La función fisiológica normal de las calpaínas, sin embargo aún no se entiende claramente. Están involucradas en una gran cantidad de procesos fisiológicos tales como apoptosis, división celular y diferenciación o en desarrollo embriónico.

Niveles elevados de calpaína se han medido en diversos procesos y desordenes patofisiológicos, por ejemplo en: isquemias del corazón (por ejemplo infarto al miocardio) , del riñon o del sistema nervioso central (por ejemplo ataque), inflamaciones, distrofias musculares, cataratas en los ojos (catarata gris) , lesiones al sistema nervioso central (por ejemplo trauma) , enfermedad de Alzheimer, neuropatía inducida por HIV, enfermedades de Parkinsons y Huntington, etc. (ver Wang K.K. anterior) . Se considera que hay una conexión entre estos desordenes y un nivel de calcio intracelular elevado y sostenido. Esto resulta en procesos dependientes de calcio que son sobre activados y no están más sujetos a control fisiológico. DE manera correspondiente, la sobre activación de calpaínas también puede iniciar procesos patofisiológicos . Esta es la razón por la cual se ha postulado que los inhibidores de enzimas de calpaína pueden ser útiles para tratar estos desordenes. Diversas investigaciones han confirmado esto. De esta manera, De esta manera, Seung-Chyul Hong y colaboradores (Stroke 1994, 25 (31, 663 - 669) y Bartus R.T. y colaboradores (Neurological Res. 1995, 17, 249 258) , han mostrado que los inhibidores de calpaína tienen efecto neuroprotector en perturbaciones neurodegenerativas agudas como ocurre después de un ataque. Igualmente, después de lesiones de cerebro experimentales, los inhibidores de calpaína mejoran la recuperación de los déficits de memoria y perturbaciones neuro motoras que ocurren (Saatman K.E. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Be. USA, 93, 1996: 3428 3433). Edelstein C.L. y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Be. USA, 92, 1995, 7662 -7666) encontró que los inhibidores de calpaína tienen efectos protectores en ríñones dañados por hipoxia. Yoshida K.I. y colaboradores (Jap. Circ. J. 59 (1), 1995, 40 48) fueron capaces de mostrar que los inhibidores de calpaína tienen efectos benéficos después de daño cardíaco provocado por isquemia o reperfusión. Ya que los inhibidores de calpaína inhiben la liberación de la proteína ß-AP4, un uso potencial para la terapia de la enfermedad de Alzheimer se ha propuesto (Higaki J. y colaboradores, Neuron, 14, 1995: 651 - 659) . La liberación de interleucina -la igualmente se impide por el inhibidor de calpaína (Watanabe N. y colaboradores, Cytokine, 6 (61, 1994: 597 - 601). Además se ha encontrado que los inhibidores de calpaína tienen efectos citotóxicos en células de tumores (Shiba E. y colaboradores, 20th Meeting Int. Ate. Breast Cáncer Res., Sendai Jp, 1994, 25. - 28. Sept, Int. J. Onco. 5 (suppl.), 1994, 381) . La capaina también juega un papel importante en restenosis y en artritis, y los inhibidores de calpaína pueden tener un efecto benéfico en la patología (March K:L: y colaboradores, Circ. Res. 72, 1993: 413 423, Suzuki K. , y colaboradores, Biochem J. , 285, 1992: 857 - 862). Adicionales usos posibles de inhibidores de calpaína se encontrarán en K.K Wang (Trends in Pharmacol. Be., 15, 1994: 412 419). El inhibidor de calpaína más potente y selectivo es la proteína intracelular de origen natural calpastatina. Inhibe tanto calpaína I como calpaína II, pero ninguna otras cisteína y tiol proteasas tales como catepsina B, L o papaína. Sin embargo, la calpastatina debido a su tamaño, consiste de aproximadamente 700 aminoácidos y la incapacidad de cruzar la membrana celular. Además de los inhibidores de calpaína de bajo peso molecular, se han identificado una cantidad de inhibidores bio-péptidos . Las desventajas de estos inhibidores son que son inestables, se metabolizan rápidamente y algunos de ellos son tóxicos. Muchos inhibidores de calpaína adicionalmente tienen insuficiente selectividad, es decir no solo inhiben calpaína I y II sino también otras cisteína proteasas tales como papaína, quimiotripsina, elastasa o catepsina B y L. De esta manera, continua habiendo una necesidad por inhibidores de calpaína selectivos y altamente efectivos. Sistemas de prueba altamente específicos se requieren para clasificar estos inhibidores de calpaína selectivos y muy efectivos, para permitir que se identifiquen inhibidores selectivos. Las pruebas de clasificación usualmente se llevan a cabo con la calpaína I y calpaína II que ocurren en forma ubicua. Para encontrar inhibidores selectivos, es necesario y conveniente el proporcionar adicionales calpaínas que se expresan como tejido - específicamente posibles para la prueba, de manera tal que los inhibidores pueden probarse por su selectividad entre calpaínas individuales . Además, se buscan adicionales calpaínas novedosas debido a que son proteínas que muy probablemente se expresan en forma diferente en diversas patologías y desordenes y juegan un papel importante en estos desordenes . Un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para distinguir e identificar inhibidores de calpaína que hacen posible el identificar inhibidores de calpaína, que por otra parte tienen un efecto inhibitorio en solo una calpaína y/o por otra parte tienen un efecto inhibitorio en una pluralidad de calpaínas y proporcionar estas como un objetivo terapéutico. Hemos encontrado que este objeto se logra por un gen de calpaína específico de tejido novedoso que tiene la secuencia ID de SEC No. 1 o ID de SEC No. .3 y el nombre CAPN6, sus variantes alélicas, análogos o derivados, que en el nivel amino ácido derivado, tienen una homología desde 60 a 100% en donde los genes de calpaína, sus variantes, análogos o derivados alélicos contienen las siguientes secuencias : (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína humana I ya que el aminoácido cisteína en la calpaína I humana, que ocupa la posición 115 en calpaína I, se altera en lisina que es la posición 81 en las secuencias ID de SEC. No. 1 e ID SEC. No. 3; (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, en donde, en comparación con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos alanina y treonina en las posiciones 122 y 125 se alteran en serina y alanina y las posiciones 88 y 91 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3; (c) Gly-Tyr-Thr- (His o Tyr) -Thr-X-Thr en donde, comparado con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos, histidina, alanina y serina en las posiciones 272, 273 y 275 se alteran en tirosina, treonina y treonina en las posiciones 252, 253 y 255 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3 y ID de SEC No. 3 adicionalmente al residuo de tirosina en la posición 274 en calpaína I se altera en histidina en la posición 254 en ID de SEC No. 3 ; d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína I humana, ya que el aminoácido triptofano en calpaína I, que ocupa la posición 298 en calpaína I, se altera a leucina, que está en la posición 286 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3, X en las secuencias es cualquier aminoácido natural. La invención también se relaciona a un método para identificar inhibidores de calpaína, en donde una calpaína, sus variantes alélicas o análogos codificados por una secuencia como se reclama en la reivindicación 1, se aisla de tejidos o células, y la inhibición de la ruptura de un substrato de la enzima CAPN6 y porque al menos en otra prueba, la inhibición de la ruptura de un substrato de las enzimas calpaína I y/o II por substancias de prueba se mide, y las substancias de prueba que inhiben la enzima CAPN6 y al menos otras calpaínas se eligen. La invención además se relaciona a un método para identificar inhibidores de calpaína, en donde se determina la inhibición de la ruptura de un substrato de la enzima CAPN6 o de las calpaínas I y II por substancias de prueba en sistemas celulares, y las substancias de prueba que cruzan la membrana celular e inhiben la actividad intracelular de la enzima CAPN6 y/o de calpaínas I y/o II que no inhiben la enzima CAPN6 pero las enzimas calpaína I y/o II o que inhiben la enzima CAPN6 pero no las enzimas calpaína I y/o II se eligen. Substancias que muestran una actividad in vitro hacia las calpaínas sin su capacidad por entrar a la célula se han probado, también se eligen ventajosamente. Si un ensayo subsecuente muestra que estas substancias son incapaces o solo deficientemente capaces por entrar a la célula, su permeabilidad celular puede mejorarse por derivatización. Las secuencias de gen de proteína µ y m calpaína humana se emplearon para búsqueda de homología en el banco de datos EST del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información Biotecnológica) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando el programa de método BLAST. Una secuencia denominada EST AA050030, que tiene una secuencia típica de calpaínas se encontró. Era posible con el auxilio de esta secuencia el preparar un clon de ratón que codifica para un gen cuyo producto genético novedoso era como la nueva calpaína, denominado CAPNG (= nCL-4) . La secuencia de ácido nucleico del clon nCL 4 se va a encontrar en ID de Sec . No . : 1. La secuencia de amino ácidos derivada de la calpaína CAPN6 se va a encontrar en ID de Sec. No. : 2. La secuencia de amino ácidos, que se deduce tomando en cuenta la presencia de un introns muestra una firma de calpaína típica, aunque la asignación a las sub-familias de calpaínas conocidas de µ-calpaína, m calpaína, nCL-1 o nCL-2 no es posible debido a la baja homología. La calpaína CAPN6 es una calpaína nueva, previamente desconocida. Adicionales investigaciones utilizando esta secuencia a partir de ratones en el Banco de Datos EST proporcionan además 4 secuencias parciales humanas (AA169715, C17331, C16980 y T39424) y una homología con la secuencia CAPN6 de ratón. Estas secuencias parciales pueden ensamblarse en una codificación de secuencia continua para una proteína con una longitud de 374 amino ácidos. Esta secuencia carece tanto del codón de partida típico para metionina como el codón de parada. Esta secuencia por lo tanto probablemente es solo parte de la secuencia del ortólogo a la secuencia de ratón clonado. La homología de las dos secuencias de los 374 amino ácidos es 94.9% (Figura 1) . La secuencia de proteínas derivada de la secuencia de gen ID de Sec. No. :1 muestra 30% de homología, que es la mayor homología, con el gen Caenorhabditis elegans conocido tra-3 sobre toda la secuencia de amino ácidos. La homología con otras calpaínas conocidas es de 20,9% (rata nCL 2) a 25,4% (ratón m calpaína) . En una comparación de secuencia por el método Lipman-Pearson (Ktupl 2, Gap Penalty 4, Gap Length Penalty 12) entre CAPN6 y CAPNl humano (= CAN1_HUMAN, Aoki y colaboradores, FEBS Lett. 205, 1986: 313 - 317), CAPN2 rata (= CAN2_HUMAN, Aoki y colaboradores, Biochemistry 27, 1988: 8122 - 8128), CAPN2 de rata (= CAN2RAT, Deluca y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1216, 1993: 81 - 93), CAPN3 humano (= CAN3_HUMAN, Richard y colaboradores, Cell 81, 27 - 40) CAPN3 de rata (= CAN3_RAT, Sorimachi y colaboradores, J. Biol. Chem. 264, 1989: 20106 - 20111) y calpaína de Drosophila (= DMCLPN0CM_1) sobre secuencias parciales de 230 amino ácidos, se encontraron homologías ligeramente mayores de 32.8 a 39.5%, pero estas en total son menos que las homologías con tra-3 (Figura 1, alineamiento, método de Clustal con tabl . de peso residual PAM 25) . Además, de tra-3, CAPN6 muestra homología pronunciada con la calpaína CAPN5 recientemente descrita (44.2% homología, Archivo No. P 19 718 248.8) . Comparaciones de secuencia entre la secuencia CAPN6 de ratón y humano en una amplia variedad de bancos de datos reveló homologías con CalpA, Tra 3 y secuencias humanas denominadas C16980, T39424, AA16971, R93331 y G17331, respecto a cuyas soluciones no se proporcionó información. Las comparaciones de secuencia se llevaron a cabo utilizando el banco de genes ESTS y los bancos de datos en el National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información Biotecnológica) (http: Hwww.ncbi .nlm.nih.yor [sic]) y el banco de datos Wash-U (Homo Sapiens) . También se encuentran en los bancos de datos una secuencia EST de ratón con el nombre AA050030 y designa como calpaína. No pudo obtenerse de los bancos de datos mayor información. Las secuencias de genes completas de AA16971T, R93331, C17331 y AA050030 se desconocen. Las dos calpaínas (CAPN5 y CAPN6) tienen propiedades en común que las distinguen de otras calpaínas. CAPN5 y CAPN6 en comparación con las otras calpaínas, no solo tienen un dominio truncado I sino también un extremo C-terminal modificado que no tiene homología extensa con el dominio IV de las otras calpaínas. La secuencia de consenso del sitio de unión Ca24" de las calpaínas denominada el sentido EF) se localiza en la región de dominio IV. Este sitio de unión de Ca2+~ está ausente en el caso de CAPN5 y CAP 6 , que significa que posiblemente no se liga Ca2+ al dominio IV y las proteínas se activan de otra forma. De esta manera son las únicas calpaínas de vertebrados que carecen del dominio IV tipo calmodulina. La secuencia de aminoácidos CAPN6 derivada tiene otra peculiaridad en la forma de un centro catalítico modificado. Solo el residuo Asn en la posición 284 se conserva. El residuo de cisteína en la posición 81 y el residuo histidina en la posición 252, han sido reemplazados respectivamente por lisina y tirosina en la secuencia CAPN6 de ratón. Además, amino ácidos reemplazados adicionales se han identificado en la región del centro catalítico en comparación de la secuencia CAPN6 ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3 con calpaína I humana (= CAPNl, Aoki y colaboradores, FEBS Lett. 205, 1986: 313 - 317). De esta manera, los aminoácidos alanina y treonina en las posiciones 122 y 125 en CAPNl se alteran en serina y alanina en las posiciones 88 y 91 en CAPN6. Igualmente hay alteraciones de los amino ácidos histidina, alanina, serina y triptofano en las posiciones 272, 273, 275 y 298 en CAPNl en tirosina, treonina, treonina y leucina en las posiciones 252, 253, 255 y 286 en CAPN6. La asignación de los aminoácidos a las diversas posiciones en las proteínas CAPNl y CAPN6 se lleva a cabo por comparación de las secuencias de asignación de las regiones conservadas de las proteínas entre sí para concordancia máxima entre las proteínas a nivel aminoácidos. De esta manera es posible por ejemplo que las mismas secuencias se ubiquen en sitios o posiciones muy diferentes en diferentes proteínas en una familia de proteínas. La secuencia CAPN6 de humano además del reemplazo del residuo cisteína, tiene un reemplazo de la tirosina en la posición 254 por histidina (Tabla 1) . Una explicación posible podría ser por ejemplo que CAPN6 tiene especificidad de substrato, que es diferente de las otras calpaínas, o el centro activo no es crítico para la función CAPN6, esto es, un inhibidor de otras calpaínas o que CAPN6 es un Pseudo gen. Esta última posibilidad parece ser improbable debido a la gran cantidad de amino ácidos conservados . Es probable que el residuo de cisteína en la posición 89 pueda encargarse de la función del residuo de cisteína faltante en la posición 81 en la reacción catalizada. Incluso si CAPN6 no tiene actividad de proteasa, que es muy poco probable, podría estar involucrado en procesos regulatorios, posiblemente al competir con otras calpaínas para sitios de unión en cofactores o substratos . Tabla 1 : Secuencias genómicas CAPN6 Amino ácidos del centro activo (Arthur y colaboradores FEBS Lett. 368, 1995: 397 400) Baja actividad sin leucina en m calpaína (Arthur y colaboradores, FEBS Lett. 368, 1995: 397 400) Tra-3 está involucrado en determinación de sexo en Caenorhabditis elegans. Una cascada de varios genes y sus productos genéticos que involucran tra-3 decide si se desarrollan Caenorhabditis machos o hermafroditas (Kuwabara P.E. y colaboradores, TIG, Vol. 8, No.5, 1992: 164 - 168). Tra-3 parece estar involucrado en espermatogénesis. La conservación de amino ácidos en los diversos dominios entre CAPN6 de ratón y tra3 [sic] es 39.2%; 42.0%; 30.9% y 22% respectivamente para los dominios I, II, III y T. Partiendo de ADNc derivado de (la) ARNm de embrión de ratón 17 era posible con el auxilio de un método RACE modificado (= rapid amplification of cDNA ends (rápida amplificación de extremos ADNc) ) de Frohman y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998 - 9002) así como Edwards y colaboradores, (Nucí. Acids Res. 19, 1991, 5227 -5232) y utilizando los cebadores anteriormente mencionados (Cal6 y Cal9) y secuencias derivadas de EST AA050030 para clonar la secuencia cubierta del CAPN6 clonados. ID de SEC No. 1 codifica para una proteína con 641 amino ácidos y un peso molecular de 74.6 kDas . El codón de partida metionina está precedido por una secuencia típica para el inicio de la traducción. Lo correcto de la secuencia se confirma por secuenciado de varios clones de ADNs que tiene la secuencia.

La Figura 2 muestra las homologías entre CAPN5 de ratón (= nCL-3) , CAPN5 de humano (= nCL-3) , CAPN6 de ratón (= nCL-4) y CAPN6 de humano (= nCL-4) . La Figura 2 también muestra las secuencias de tra-3 Caenorhabditis, p94 humano, m calpaína de ratón, µ calpaína de humano y nCL-L2 de rata.

Amino ácidos que concuerdan entre las diversas calpaínas y CAPN6 se indican por cajas negras. Puntos indican espacios introducidos para lograr máxima conformidad de las secuencias. Por claridad, dos secuencias se han eliminado de la secuencia p94 humana. Estas regiones se han indicado por signo =. Los amino ácidos conservados en el centro catalítico se han marcado con flechas. Las secuencias de amino ácidos correspondientes a CAL6 y CAL9 se han subrayado. Las designaciones de dominio se han indicado sobre los segmentos de secuencia relevantes. La Figura 3 muestra el pedigrí filogenético de las diversas calpaínas. El análisis filogenético para construir este pedigrí se lleva a cabo utilizando el método de vecino más cercano (Saitou y colaboradores Mol. Biol. Evol. 4, 1987, 406 - 425) excluyendo los espacios. Fue posible con el auxilio de estos análisis filogenéticos el dividir las calpaínas de vertebrados en seis grupos diferentes (figura 3) lado de sentido derecho) . Las calpaínas de invertebrados pueden asignarse como los vecinos más cercanos al grupo CAPN5 (= nCL-3) y CAPNG (= nCL-4) y forman su propio grupo. Los genes CAPN5 y CAPN6 de esta manera forman su propio grupo de calpaínas que tienen mayor similaridad a calpaínas de invertebrados que a las calpaínas de vertebrados. La longitud de las líneas horizontales es proporcional a la distancia filogenética entre las diversas calpaínas. La longitud de las líneas verticales no tiene significado. Las secuencias empleadas para construir el pedigrí filogenético tienen los siguientes números SWISSPROT y EMBL (números de acceso) : m de humano (P17655) , µ (P07384) , p94 (P20807) ; m rata (Q07009) , nCL-2 (D14480) , p94 (P16259) ; p94 de ratón (X92523) ; m de gallina (D38026) , µ (D38027) , µ/m (P00789) , p94 (D38028) ; tra-3 de nemátodo (U12921) ; Calp A de Drosophila (411002) y Dm (X78555) , Schistoso a (P27730) . La secuencia parcial nCL-L2 humano corresponde a la traducción del clon EST AA026030 (Hellier y colaboradores 1995, el proyecto EST Wash U-Merck) . La secuencia de amino ácidos derivada del clon EST AA026030 exhibe una homología mayor que la usual con la secuencia nCL-2 de rata, de acuerdo con este análisis. Ya que solo se emplea una secuencia parcial para este análisis, la impresición del pedigrí filogenético obtenido para nCL-2 es mayor. La secuencia CPL1 de nemátodo es la versión corregida empleada por Barnes y Hodjkin (EMBOJ. , 1996, 15:4477 - 4484).

Los primeros 7 exones se emplearon como pueden obtenerse del banco de datos EMBL y (No de acceso L25598) , mientras que los últimos exones se obtuvieron al conectar los nucleótidos 8028 - 8133, 8182 - 8239, 8729 - 8818, 8865 - 8983 y 9087 hasta el extremo. La secuencia N-terminal derivada es poco usual para calpaínas en consideración de su longitud y sus muchos residuos glisina. La calpaína CAPN6 específica de tejido novedosas se expresan solo en tejido de placenta (Figura 4) . La placenta humana, es un órgano que muestra rápido crecimiento y rápida diferenciación. Por lo tanto se refiere como un "tejido pre-maligno" debido a que es un tejido altamente invasivo similar al de tumores malignos. Las proteasas juegan una parte central en el desarrollo y diferenciación de células y de esta manera también en la placenta. La placenta es rica en proteasas e inhibidores de proteasa, que en un equilibrio balanceado hacen posible que la placenta se desarrolle. CAPN6 parece jugar un papel importante en esto como proteasa y/o está posiblemente involucrada en regulación de otras cisteína proteasas de calpaína. Está posiblemente involucrada en procesos patológicos de la placenta tales como gestosis (= Pre-eclampsia) que ocurre en 5 a 7% de todos los embarazos. La pre-eclampsia (= alta presión sanguínea inducida por el embarazo) es una de las complicaciones más comunes del embarazo y se caracteriza por hipertensión y proteinuria, a menudo combinadas con excesivos edemas y en algunas circunstancias con convulsiones. La pre-eclampsia durante el embarazo es una causa importante de fallecimiento de madres e hijos, de nacimientos prematuros o en casos más ligeros, de malnutrición embriónica o perturbaciones del crecimiento. Es un evento multifactorial en donde hay participación de, por ejemplo, factores genéticos (genes recesivos o dominantes) , la inmunotolerancia de la madre, desequilibrios vasodilatadores/vaso constrictores y supuestamente también CAPN6. Mujeres que sufren de pre-eclampsia tienen niveles alterados de vasopresinasa y angiotensinasa que se influencian posiblemente en una forma regulatoria por CAPN6. Otra función posible de CAPN6 puede ser la regulación de degradación de somatostatina, glucagón y hormona de crecimiento en la placenta y de esta manera influencian el crecimiento del feto. Degradación de las proteínas de suero o maternales que probablemente estimulan el crecimiento del feto también puede estar influenciada por CAPN6. Es posible que CAPN6 esté involucrado en eventos complejos en la mucosa placentaria durante embriogénesis y de esta manera controla la apoptosis inducida por TNFa e IFN? por ejemplo de los trofoblastos al regular otras calpaínas. CPAN6 de esta manera parece estar involucrado en el desarrollo embriogénico. A fin de identificar inhibidores selectivos de calpaína, hay necesidad por métodos que son lo más específicos posibles para identificar los inhibidores. Es importante en este aspecto que los inhibidores selectos solo inhiban la o las calpaínas requeridas pero ninguna otra de las cisteína proteasas y de esta manera intervengan en procesos fisiológicos. Las substancias de prueba a investigar por su actividad inhibitoria, por ejemplo pueden ser substancias químicas, extractos microbianos o de plantas. Además de la prueba por su actividad inhibitoria en CAPN6 , calpaína I y/o II normalmente también se prueban por su actividad hacia catepsina B u otras tiol-proteasas . Idealmente, buenos inhibidores deberán mostrar poca o ninguna actividad hacia captesina B, L, elastasa, papaína, quimio tripsina u otras cisteína proteasas, pero muestran buena actividad hacia calpaínas I y II. Es posible con la calpaína CAPN6 específica de tejido novedosa el utilizar el método de acuerdo con la invención para identificar inhibidores que son capaces de discriminar en su acción inhibitoria entre las diversas calpaínas que comprenden calpaína I, II, nCL-1, nCL-2 y/o nCL-4. Las diversas pruebas de inhibidor se llevaron a cabo como sigue para este propósito: Prueba de catepsina B Se determinó inhibición de catepsina B por un método similar a aquel de S. Hasnain y colaboradores, J. Biol. Chem. 1993, 268, 235 - 240. 2 µl de una solución inhibidora preparada a partir de la substancia química a probarse, un extracto de plantas o microbiano y DMSO (Concentración final: 100 µM a 0.01 µM) se agregan a 88 µL de catepsina B (catepsina B de hígado humano suministrada por Calbiochem, diluida a 5 minutos en 500 µM de amortiguador) . Esta mezcla se pre-encuba a temperatura ambiente (= 25°C) por 60 minutos y luego la reacción se inicia al agregar 10 µL de 10 M Z-Arg-Arg-pNA (en amortiguador con 10% de DMSO) . La reacción se sigue en un lector de placa de microtítulos a 405 nm por 30 minutos. Los valores IC50 luego se determinan de las pendientes máximas. Prueba de calpaína I y II La actividad de los inhibidores de calpaína se investiga en una prueba colorimétrica con caseína Hammarsten (Merck, Darmstadt) como substrato. La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulación de acuerdo con la publicación por Buroker-Kilgore y Wang en Anal. Biochem. 208, 1993, 387 - 392. Las enzimas empleadas fueron calpaína I (0,04 U/prueba) de eritrocitos y calpaína II (0,2 U/prueba) de riñon, ambos de cerdos, suministrados calbioquim. Las substancias a probar se incubaron con la enzima a temperatura ambiente por 60 minutos, la concentración del solvente DMSO no excede 1%. Después de adición del reactivo de color Bio-Rad, la densidad óptica se mide a 595 nm en un aparato SLT Easy Reader EAR 400. La actividad al 50% de la enzima es evidente a partir de las densidades ópticas determinadas en la actividad máxima de la enzima sin inhibidores y la actividad de la enzima sin adhesión de calcio. La actividad de los inhibidores de calpaína además puede determinarse utilizando el substrato Suc-Leu-Tyr-AMC. Este método fluorimétrico se describe por Zhaozhao Li y colaboradores, J. , Med. Chem. 1993, 36, 3472 - 3480. Ya que las calpaínas son cisteína proteasas intracelulares, es necesario que los inhibidores de calpaína crucen la membrana celular a fin de evitar degradación de proteínas intracelulares por calpaína. Algunos inhibidores de calpaína conocidos tales como E 64 y leupeptina, superan las membranas celulares solo deficientemente y de acuerdo con esto, solo muestran un efecto deficiente en células, aunque son buenos inhibidores de calpaína. Por lo tanto es ventajoso llevar a cabo una prueba adicional de la capacidad de inhibidores de calpaína potenciales para cruzar membranas, tal como la prueba de plaquetas humanas . Prueba de plaquetas para determinar la actividad celular de inhibidores de calpaína. La degradación mediada por calpaínas de proteínas en plaquetas se lleva a cabo como se describe por Zhaozhao Li y colaboradores, J. Med. Chem., 36, 1993, 3472 - 3480. Se aislaron plaquetas humanas de sangre - citrato de sodio fresca de donadores y ajusta a 107células/ml en amortiguador (5 mm Hepes, 140 mm NaCl y 1 mg/mls BSA, pH 7,3) . Plaquetas (0.1 ml) se pre-incubaron en 1 µl de diversas concentraciones de inhibidores potencíales (disueltos en DMSO) por 5 minutos. Luego, se agrega ionóforo de calcio AT 23187 (1 µM en la prueba) y calcio (5 mm en la prueba) y se llevó a cabo una incubación adicional a 37°C por 5 minutos. Después de una etapa de centrifugación, las plaquetas se recogieron en amortiguador muestra en SDS-page e hirvieron a 95°C por 5 minutos, y las proteínas se fraccionaron en un gel al 8%. Degradación de las dos proteínas que actúan como proteína de unión (= ABP) y talina fue seguida por densitometría cuantitativa. Después de adición de calcio e ionóforo, estas proteínas desaparecieron y aparecieron nuevas bandas con un peso molecular inferior a 200 Kd. La actividad de enzima máxima media con o, como control sin inhibidor se determina a partir de ahí. Igualmente conveniente para prueba de la capacidad en cruzar membranas están partes de tejidos tales como secciones de cerebro o cultivos celulares . La prueba para inhibición de CAPN6 se lleva a cabo en células que expresan esta proteína y permiten que esta última se detecte utilizando un anticuerpo específico. Si se estimulan células con, por ejemplo calcio y el ionóforo apropiado, esto conduce a activación de CAPN6. Takaomi Saido describe en J. Biochem. 11, 1992, 81 - 86, la transición autolítica de µ calpaína después de activación y detección utilizando anticuerpos. Anticuerpos apropiados para detectar CAPN6 se generan. Los inhibidores de calpaína evitan la transición autolítica y la cuantificación correspondiente es posible utilizando anticuerpos . Además de las pruebas in vitro descritas y la prueba de plaquetas celular, todas las otras pruebas de calpaína conocidas por el trabajador con destreza en la especialidad son convenientes, tal como la prueba de inhibición de muerte celular inducida por glutamato en neuronas corticales (Maulucci-Gedde M.A. y colaboradores, J. Neurosci. 7, 1987: 357 - 368), muerte celular mediada por calcio en células NT2 (Squier M.K.T. y colaboradores, J. Cell. Physiol., 159, 1994: 229 - 237, Patel T., y colaboradores, Faseb Journal 590, 1996: 587 - 597) o análisis de muestras de tejido por productos de degradación de proteínas tales como espectrina, MAP2 o tau (Ami Arai y colaboradores, Brain Research, 1991, 555, 276 - 280, James Brorson y colaboradores, Stroke, 1995, 26, 1259 - 1267) . Para las pruebas in vitro de CAPN6 la calpaína o su homólogo animal o humano, se purifica a partir de tejidos o células en donde la enzima se expresa normal o artificialmente (por ejemplo por expresión recombinante) tal como, ventajosamente, la placenta o a partir de células o microorganismos que contienen cuando menos una copia de gen y/o un vector que tiene al menos una copia del gen CAPN6, sus variantes alélicas o análogos, y emplea como extracto crudo o como enzima pura. Para los métodos de acuerdo con la invención, las diversas pruebas de inhibidor de calpaína se llevan a cabo ventajosamente en combinación con la prueba para inhibir actividad de enzima CAPN6 por inhibidores potenciales . Esto abarca la selección de inhibidores sea solo para la enzima CAPN6 y no las otras calpaínas o por el contrario, solo en las otras calpaínas y no la enzima CAPN6 o la enzima CAPN6 y al menos otra calpaína. Inhibidores de CAPN6 pueden emplearse ventajosamente en el caso de gestosis . Las diversas pruebas inhibidoras aún más se llevan a cabo de manera tal que, además de la prueba para el efecto de inhibición de la substancia de prueba en CAPN6, calpaína I y/o II, como un control, la prueba [sic] se lleva a cabo sin la substancia de prueba. Esta estructura de prueba hace fácil detectar los efectos inhibitorios de las substancias de prueba. Otro método de acuerdo con la invención utiliza CAPN6 o sus variantes alélicas, análogas o derivadas sintéticos ventajosamente para la protección de la acción enzimática de otras calpaínas. Otro método de acuerdo con la invención utiliza la enzima CAPN6 para clasificar los inhibidores de calpaína novedosos, estos inhibidores venta osamente son capaces de inhibir todas las calpaínas en general o calpaínas individuales tales como calpaína I, II, nCL-1, nCL-2 o CAPN6. Las diversas substancias de prueba aún más pueden probarse solas o en paralelo en sistemas de prueba. Las substancias de prueba se clasifican ventajosamente por su acción inhibitoria en sistemas de prueba automatizados paralelos . En general, todas las substancias son adecuadas para las pruebas de inhibidor. De esta manera, las substancias se derivan por ejemplo de síntesis química clásica, de química combinatoria o de extractos microbianos de animales o plantas. Extractos microbianos significan por ejemplo caldos de fermentación, células rotas de microorganismos o substancias después de bio-transformación. Fracciones celulares también son adecuadas para las pruebas. Adecuado para la clonación, el gen CAPN6 o sus homólogos animales o sus homólogos humanos, sus variantes o análogos alélicos, todos son sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos adecuados para aislar un producto de gen enzimáticamente activo. Sistemas de expresión preferidos son aquellos que permiten expresión de las secuencias de gen CAPN6 en células bacterianas, fúngales o animales, muy particularmente de preferencia en células de insectos. Producto de gen enzimáticamente activo significa proteínas CAPN6 que producen, directamente después de aislamiento del organismo de expresión, por ejemplo a partir de una célula procariótica o eucariótica, o después de renaturalización, una proteína activa, que es capaz de escindir al menos un substrato de calpaína conocido como aquellos anteriormente mencionados o así mismo por autocatálisis . Pruebas adecuadas para determinar la actividad enzimática de calpaína son todas aquellas conocidas por el trabajador diestro en la especialidad, tales como pruebas in vitro, las pruebas descritas anteriormente para calapina I y II o pruebas celulares tales como las prueba de plaquetas. Una posibilidad que puede emplearse para detección son pruebas basadas en un ensayo colorimétrico (Buroker Kilgore M. y colaboradores, Anal. Biochem. 208, 1993: 387 - 392) o de un ensayo de fluorescencia. Además, el producto de gen enzimáticamente activo del CAPN6 también significa todas las secuencias parciales que contienen el centro catalítico del gen CAPN6 y/u otras secuencias del gen CAPN6 y/u otras secuencias de gen calpaína y/u otras secuencias y muestran actividad enzimática. Por organismos huésped se entienden todos los organismos procarióticos o eucarióticos adecuados como organismos huésped, por ejemplo baterías tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, hongos tales como Aspergilus niger, células de insectos tales como Spodoptera frugiperda, células de trichoplusia o todas las otras células de insectos adecuadas para expresión viral, o células animales tales como CV1, COS, C127, 3T3 o CHO o células de humanos . Por sistemas de expresión se entiende la combinación de los organismos de expresión anteriormente mencionados a manera de ejemplo y de los vectores adecuados para los organismos tales como plásmidos, virus o fagos, tales como el sistema promotor/T7 ARN Polimerasa o vectores que tienen secuencias regulatorias para el fago ?. El término sistemas de expresión de preferencia significan la combinación de Escherichia coli y sus plásmidos y fagos o el sistema baculovirus y las células de insectos correspondientes tales como Spodoptera frugiperda. Además, adicionales secuencias regulatorias terminales 3 ' y/o 5 ' son adecuadas para la expresión ventajosa de acuerdo con la invención del gen CAPN6. Estas secuencias regulatorias se pretenden para hacer expresión específica del gen CAPN6 posible. Esto puede significar, por ejemplo dependiendo del organismo huésped, que el gen se expresa o sobre expresa solo después de inducción, o que se expresa y/o sobre expresa inmediatamente . Las secuencias regulatorias y factores aún más de preferencia pueden tener efecto benéfico y de esta manera incrementar la expresión de gen CAPN6. De esta manera, los elementos regulatorios pueden mejorarse, ventajosamente al nivel de transcripción, al utilizar fuertes señales de transcripción tales como promotores y/o mejoradores. Sin embargo, también es posible además de esto el mejorar la traducción por ejemplo al mejorar la estabilidad del ARNm.

Los mejoradores significan por ejemplo secuencias de ADN que logran expresión de gen CAPN6 incrementada mediante una interacción mejorada entre ARN polimerasa y ADN. Una o más secuencias de ADN pueden estar presentes enfrente de y / o tras el gen CAPN6 con o sin promotor enfrente y con o sin gen regulatorio, de manera tal que el gen está presente en una estructura de gen. La expresión del gen CAPN6 aún más puede incrementarse al aumentar el número de copias del gen CAPN6. El número cte copias del gen CAPN6 se incrementa por ejemplo al amplificar en un vector de expresión CHO. Vectores convenientes también son vectores de la serie pED-vectores dicistronic - que también contienen el gen marcador amplificable de dihidrofolato reductasa. Pueden encontrarse detalles en Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) Vol. 2, 1994. Un incremento en la actividad de enzima CAPN6 por comparación con la enzima de partida, pueden lograrse por ejemplo en modificar el gen CAPN6 o sus homólogos animales por mutagénesis clásica tal como irradiación con UV o tratamiento con mutágenos químicos y/o por mutagénesis específica tal como la mutagénesis dirigida por sitio, eliminación (es) inserción (es) y/o substitución (es) . Puede incrementarse la actividad de enzima, por ejemplo en modificar el centro catalítico de manera tal que hay más rápida conversión del substrato a escindir. Una actividad de enzima incrementada también puede lograrse, además de la amplificación de gen descrita, al eliminar factores que reprimen la biosíntesis de enzima y/o al sintetizar activo en sitio de proteínas CAPN6 inactivas. Es posible de esta manera el proporcionar cantidades incrementadas de enzimas para las pruebas in vitro. CAPN6 o sus homólogos animales o su homólogo humano puede clonarse ventajosamente partiendo de ADN genómico o ADNc utilizando por ejemplo la técnica PCR (ver Molekular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Segunda Edición 1989, capitulo 14, 1 - 35, ISBN 0-87969-309-6 y Saiki y colaboradores, Science, 1988, Vol. 239, 487 y siguientes), y CAPN6 de preferencia puede clonarse utilizando ADN genómico, y particularmente de preferencia utilizando ADN genómico a partir de células de ratón o células de humano. Convenientes como organismo huésped para la clonación, por ejemplo son las cepas de Escherichia coli de preferencia la cepa de Escherichia coli DH10B. Vectores convenientes para la clonación son todos los vectores adecuados para la expresión en Escherichia coli (ver Molecular Cloning (Clonación Molecular) , Sambrok [sic] , Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Segunda Edición 1989, ISBN 0-87969-309-6) . Ejemplos particularmente convenientes son vectores derivados de pBR o pUC o vectores lanzadera y pBluescript es particularmente conveniente . Después de aislamiento y secuenciado se obtienen genes CAPN6 que tienen secuencias nucleótido que codifican para la secuencia de aminoácido indicada en ID de Sec. No. : 2 o sus variantes alélicas. Por variantes alélicas se entienden variantes CAPN6 que tienen de 60 a 100% de homología a nivel de amino ácido, de preferencia 70 a 100%, muy particularmente de preferencia 80 a 100%. Variantes alélicas comprenden en particular variantes funcionales que se obtienen de la secuencia ilustrada en ID de Sec. No. : 1 o ID de Sec. No. : 3 por eliminación, inserción o substitución de nucleótidos, pero en donde la actividad CPN6 se retiene y las secuencias (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, (c) Gly-Tyr-Thr- (His o Tyr) -Thr- X-Thr y (d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly están presentes como también en los genes CAPN6 análogos o derivados. Por análogos de CAPN6 se entienden por ejemplo sus homólogos animales, secuencias truncadas, ADN o ARN de hebra sencilla de la secuencia de ADN de codificación o no codificación, en particular ARN anti-sentido.

Ejemplos de derivados CAPN6 son aquellos derivados que pueden ser escindidos enzimáticamente solo con dificultad, si de hecho se puede, tal como los fosfonatos o fostotioatos de ácido nucleico, en donde el grupo fosfato de los ácidos nucleicos se ha reemplazado por un grupo fosfonato o tioato. El promotor que está presente frente a la secuencia de nucleótido establecida también puede modificarse por uno o más intercambios de nucleótido, por inserción (es) y/o eliminación (es) , pero sin deteriorar la funcionalidad o actividad del promotor. El promotor además puede tener su actividad incrementada por modificación de su secuencia, o al reemplazar completamente por promotores más activos aún a partir de organismos heterólogos o de origen sintético. Los inhibidores de calpaína identificados por el método de acuerdo con la invención son adecuados para producir medicinas para tratar desordenes asociados con dichas funciones de calpaína, por ejemplo desordenes seleccionados del grupo de enfermedades cardio vasculares, inmunológicas, inflamatorias, alérgicas, neurológicas, de neuro-degenerativas u oncológicas tales como restenosis, artritis, isquemias del corazón, de riñon o del sistema nervioso central (por ejemplo ataque), inflamaciones, distrofias musculares, cataratas en los ojos (por ejemplo catarata gris) lesiones al sistema nervioso central (por ejemplo trauma) , enfermedad de Alzheimer, neuropatía inducida por HIV, enfermedades de Parkinson y Huntington, de preferencia para producir medicinas para tratar desordenes de la placenta, tales como gestosis o de embriogénesis . Las secuencias de CAPN6 de acuerdo con la invención también son ventajosamente convenientes para diagnosticar desordenes o para terapia de genes. Ejemplos Ejemplo 1: Clonación del gen CAPN6 La secuencia CAPN6 de ratón (número de acceso EMBL Y12583) se clonó por el método RACE utilizando 17 embriones de ratón TAG y secuencias cebadoras derivadas de la secuencia EST AA050030. Un clon plásmido que contiene las secuencias EST correspondientes, se obtiene del consorcio I. M.A. G.E (Research Genetics Inc.). El homólogo CAPN6 humano se obtiene por una investigación por homología en el banco de datos EST utilizando la secuencia de proteínas de ratón y el algoritmo tblastn. Fue posible el combinar las secuencias parciales que se encontraron para dar una secuencia incompleta del CAPN6 humano con una longitud de 1083 nucleótidos (ID de Sec. No.: 3) . Ejemplo 2: Expresión del gen CAPN6 y diversos tejidos.

Expresión del gen CAPN6 en diversos tejidos se detecta utilizando un fragmento ADNC humano etiquetado32P con un manchado maestro de ARN humano suministrado por Clontech, que contiene ARN de 50 tejidos diferentes. La hibridización y las condiciones de lavado altamente astringentes, se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento ADNc CAPN6 empleado para los experimentos de expresión fue un fragmento 2.2 kb EcoRl/Xhol que comprende EST AA050030. CAPN6 se expresa solo en tejido placentario (ver Figura 4) . Como control, el manchado se lleva a cabo con una muestra ADN de ubiquitina humana, a fin de determinar la carga de ARN. Ejemplo 3: ubicación del gen CAPN6 en el cromosoma. El gen humano se localizó utilizando el "panel de mapeo" híbrido de células somáticas de humano/roedor NIGMS (Coriell Cell Repositories) . Las secuencias cebadoras empleadas para el PCR fueron como sigue: 5'-gttgaaactgattggggtctg-3 ' y 5 ' -ctgtcttcccaaggggtttctc-3 ' . La amplificación PCR se lleva a cabo con una temperatura de recocido de 58 °C y resultó en un fragmento de 200 b . Los resultados se examinaron para concordancia entre la presencia de cromosomas humanos y el producto PCR. La ubicación exacta del gen en el cromosoma humano se encuentra utilizando el panel Stanford G3 RH (Research Genetics) y transmisión de los resultados PCR al servicio de localización de Stanford Human Genom Center (http://www-shgc.stanford.edu) . El gen CAPN6 humano se encontró en el cromosoma X acoplado al marcador DXS7356. Ejemplo 4: Prueba de captesina B La inhibición de captesina B se determina por un método similar a aquel de S. Hasnain y colaboradores, J. Biol. Chem. 1993, 268, 235 - 240. 2 µL de una solución inhibidora preparada a partir del inhibidor DMSO (concentración final: 100 µM a 0.01 µM) se agregan a 88 µL de catepsina B (catepsina B de hígado humano suministrada por Calbiochem diluido a 5 Unidades in 500 µM de amortiguador) . Esta mezcla se pre-incuba a temperatura ambiente (250°C) por 60 minutos y luego la reacción se inicia al agregar 10 PLS lOmM de Z-Arg-Arg-pNA (en amortiguador con 10% DMSO) . La reacción se sigue en lector de placa de microtitulación a 405 nm por 30 minutos. Los valores IC50 luego se determinan a partir de las pendientes máximas . Ejemplo 5: Prueba de calpaína La actividad de los inhibidores de calpaína se investiga en una prueba colorimétrica con caseína Hammarsten (Merck, Darmstadt) como substrato. La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulación de acuerdo con la publicación por Buroker-Kilgore y Wang Anal. Biochem. 208, 387 - 392 (1993) . La enzima empleada fue CAPN6 que se expresa en uno de los sistemas descritos anteriormente y luego purifica. Las substancias se incubaron con la enzima a temperatura ambiente por 60 minutos, la concentración del solvente DMSO no excedió 1%. Después de agregar el reactivo de color Bio-Rad, la densidad óptica se mide al 595 nm el SLT Easy Reader EAR 400. La actividad al 50% de la enzima es evidente de las densidades ópticas determinadas en la actividad máxima de la enzima sin inhibidores y la actividad de la enzima sin adición de calcio. Ejemplo 6: Prueba de plaquetas para determinar la actividad celular de inhibidores de calpaína. La degradación medida por calpaína de proteínas en plaquetas, se lleva a cabo como se describe por Zhaozhao Li y colaboradores, J. Med. Chem., 36, 1993, 3472 - 3480. Se aislaron plaquetas humanas a partir de sangre -citrato de sodio fresca de donadores y ajustada a 107 células/mm en amortiguador (5 mm Hepes, 140 mm NaCl and 1 mg/mls BSA, pH 7,3). Plaquetas (0.1 ml) son [sic] preincubadas en 1 µl de diversas concentraciones de inhibidores (disueltas en DMSO) por 5 minutos. Luego se agregaron ionóforo calcio A 23187 (1 FMS en la prueba) y calcio (5 mm en la prueba) y se llevó a cabo una incubación adicional a 37°C por 5 minutos. Después de una etapa de centrifugación, las plaquetas se recogieron en el amortiguador muestra page-SDS e hirvieron a 95°C por 5 minutos, y las proteínas se fraccionaron en un gel al 8%. Degradación de las dos proteínas, proteína de unión-actina (ABP) y talina, fue seguida por densitometría cuantitativa después de adición de calcio y ionófero, estas proteínas desaparecieron y una nueva banda en la región de peso molecular de 200 Kd apareció. La actividad de enzima de vida máxima media se determina a partir de esto.

LISTADO DE SECUENCIA : (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: BASF Aktiengesellschaft (B) CALLE: Cari Bosch Strasse (C) CIUDAD: Ludwigshafen (D) ESTADO: Rhineland-Pfalz (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: D-67056 (ii) TÍTULO DE SOLICITUD: Calpaínas específicas de tejido novedosas, su preparación y uso. (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC DOS/MS DOS (D) SOPORTE LÓGICO (SOFTWARE) : Edición #1.0, versión #1.25 (EPA) (2) INFORMACIÓN PARA ID de Sec. No.: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2069 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iii) [sic] ANTI-SENTIDO: NO (vi) PUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMOS: Mus músculos (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: CAPN6 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : 5 ' UTR (B) UBICACIÓN: 1.. 129 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE /CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 130.. 2055 WO99/10480 23 (ix) CARACTERÍSTICAS: : (A) NOMBRE / CLAVE : : 3 ' UTR (B) UBICACIÓN: 2056.. 2069 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID de Sec. No. : 1: GGGGTTACCT GGCTAAGAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGT AGCAGCAGCA 60 GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGGGTTCC TGAGCTAACT CAGACCTAGT 120 TTGATAGCA ATG GGT CCT CCT CTG AAG CTC TTC AAA AAC CAG AAG TAC 168 Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gln Lys Tyr 1 5 10 CAÁ GAA CTG AAG CAG GAG TGC ATG AAG GAT GGC CGC CTT TTC TGT GAC 216 Gln Glu Leu Lys Gln Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp 15 20 25 CCA ACC TTC CTA CCG GAG AAT GAT TCT CTG TTT TTC AAC CGG CTG CTT 264 Pro Thr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu 30 35 40 45 CCT GGG AAG GTG GTG TGG AAG CGT CCA CAG GAC ATT TCT GAT GAC CCC 312 Pro Gly Lys Val Val Trp Lys Arg Pro Gln Asp He Ser Asp Asp Pro 50 55 60 CAC CTG ATT GTG GGC AAC ATC AGC AAC CAC CAG CTG ATC CAG GGC AGA 360 His Leu He Val Gly Asn He Ser Asn His Gln Leu He Gln Gly Arg 65 70 75 TTG GGG AAC AAG GCA ATG ATC TCT GCA TTT TCC TGT TTG GCT GTT CAG 408 Leu Gly Asn Lys Ala Met He Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gln 80 85 90 GAG TCA CAC TGG ACA AAG GCA ATT CCC AAC CAC AAG GAT CAG GAA TGG 456 Glu Ser His Trp Thr Lys Ala lie Pro Asn His Lys Asp Gln Glu Trp 95 ' 100 105 GAT CCT CGA AAG CCA GAG AAA TAC GCT GGA ATC TTT CAC TTC CGC TTC 504 Asp Pro Arg Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly He Phe His Phe Arg Phe 110 115 120 125 TGG CAT TTT GGA GAA TGG ACC GAG GTG GTG ATT GAT GAC TTG CTT CCC 552 Trp His Phe Gly Glu Trp Thr Glu Val Val He Asp Asp Leu Leu Pro 130 135 140 ACC ATC AAC GGA GAT CTG GTC TTC TCA TTC TCC ACC TCC ATG AAT GAG 600 Thr He Asn Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu 145 150 155 TTT TGG AAT GCT CTA CTG GAA AAA GCG TAT GCA AAG CTG CTG GGC TGT 648 Phe Trp Asn Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys 160 165 170 TAT GAG GCT TTG GAT GGT CTG ACC ATC ACT GAT ATC ATC ATG GAC TTC 696 Tyr Glu Ala Leu Asp Gly Leu Thr He Thr Asp He He Met Asp Phe 175 180 185 ACT GGC ACA CTG GCT GAA ATC ATT GAC ATG CAG AAA GGA CGA TAC ACT 744 Thr Gly Thr Leu Ala Glu He He Asp Met Gln Lys Gly Arg Tyr Thr 190 195 200 205 GAT CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTG TTT GGA GAA CTG TAC AAA ACG 792 Asp Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr 210 215 220 TTC ACC AAA GGA GGT CTA ATT TGC TGC TCC ATT GAG TCT CCC AGC CAG 840 Phe Thr Lys Gly Gly Leu He Cys Cys Ser He Glu Ser Pro Ser Gln 225 230 235 GAG GAA CA GAA GTT GAA ACA GAC TGG GGA CTA CTG AAG GGT TAT ACC 888 Glu Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr 240 245 250 TAC ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAG CTC CGT CTC GGA GAA AGA CTT GTG 936 Tyr Thr Met Thr Asp He Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val 255 260 265 GAA GTC TTC AGT ACT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTA AGG AAC CCA 984 Glu Val Phe Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro 270 275 280 285 TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCA GAG GAG 1032 Leu Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu He Ser Glu Glu 290 295 300 TGG CAG CA CTG ACT GTA ACA GAT CGC AAG AAC CTA GGA CTT GTT ATG 1080 Trp Gln Gln Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met 305 310 315 TCT GAT GAT GGA GAA TTT TGG ATG AGT CTG GAA GAT TTT TGC CAC AAC 1128 Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn 320 325 330 TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAT AAT CCT GTT TTT GGC 1176 Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly 335 340 345 CGC AAG GAG CTG GAA TCA GTG GTG GGA TGT TGG ACT GTG GAT GAT GAC 1224 Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp 350 355 360 365 CCT CTG ATG AAC CGA TCA GGA GGT TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 1272 Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe 370 375 380 TTG CAG AAT CCT CAG TAC ATT TTC ACT GTG CCC GAG GAT GGC CAT AAA 1320 Leu Gln Asn Pro Gln Tyr He Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys 385 390 395 1320 GTC ATC ATG TCA CTG CAÁ CAG AAG GAC CTA CGC ACT TAC CGC CGA ATG 1368 Val He Met Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met 400 405 410 GGA AGA CCT GAT AAT TAC ATC ATT GGT TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 1416 Gly Arg Pro Asp Asn Tyr He He Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu 415 420 425 ATG AAC CGA AGG TTC CGT CTT CAC CAT CTG TAT ATT CAG GAG CGT GCT 1464 Met Asn Arg Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr He Gln Glu Arg Ala 430 435 440 445 GGG ACT TCC ACT TAT ATC GAC ACC CGT ACT GTG TTT CTG AGC AAG TAT 1512 Gly Thr Ser Thr Tyr He Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr 450 455 460 CTG AAG AAG GGC AGC TAC GTG CTT GTT CCA ACC ATG TTC CAÁ CAT GGC 1560 Leu Lys Lys Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly 465 470 475 CGT ACC AGT GAA TTT CTG CTG AGG ATC TTC TCT GAA GTG CCC GTC CAG 1608 Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg He Phe Ser Glu Val Pro Val Gln 480 485 490 CTC AGG GAA CTG ACC TTG GAC ATG CCC AAG ATG TCT TGC TGG AAC CTG 1656 Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu 495 500 505 GCA CGT GGC TAC CCA AAG GTG GTT ACC CAG ATC ACT GTC CAC AGT GCT 1704 Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln He Thr Val His Ser Ala 510 515 520 525 GAG GGC CTG GAG AAG AAG TAT GCC UT GAA ACT GTC AAT CCA TAT CTG 1752 Glu Gly Leu Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu 530 535 540 ATC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCC CCT GTC CAG AAG AAT 1800 He He Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn 545 550 555 ACT GTG CAT GCC ATT TTT GAC ACG CAG GCC GTT TTC TAC AGA AGG ACC 1848 Thr Val His Ala He Phe Asp Thr Gln Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr 560 565 570 ACT GAC ATT CCT ATT ATC ATC CAG GTG TGG AAC AGC AGA AAA TTC TGT 1896 Thr Asp He Pro He He He Gln Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys 575 580 585 GAT CAG TTC CTG GGG CAG GTT ACT CTC GAT GCT GAC CCC AGC GAC TGC 1944 Asp Gln Phe Leu Gly Gln Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys 590 595 600 605 CGT GAT CTG AAA TCT CTG TAC CTG CGT AAG AAG GGT GGT CCT ACT GCC 1992 Arg Asp Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala 610 615 620 AAA GTC AAG CAÁ GGT CAC ATC AGC TTC AAA GTT ATC TCT AGC GAT GAT 2040 Lys Val Lys Gln Gly His He Ser Phe Lys Val He Ser Ser Asp Asp 625 630 635 CTC ACT GAG CTC TAAGTAGTCA TCATCAG 2069 Leu Thr Glu Leu 640 (2) INFORMACIÓN PARA: ID de Sec. No.: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 641 Amino ácidos (B) TIPOS: Amino ácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPOS DE MOLÉCULAS: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID de Sec. No . : 2: Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gln Lys Tyr Gln Glu Leu 1 5 10 15 Lys Gln Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp Pro Thr Phe 20 25 30 Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu Pro Gly Lys 35 40 45 Val Val Trp Lys Arg Pro Gln Asp He Ser Asp Asp Pro His Leu He 50 55 60 Val Gly Asn He Ser Asn His Gln Leu He Gln Gly Arg Leu Gly Asn 65 70 75 80 Lys Ala Met He Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gln Glu Ser His 85 90 95 Trp Thr Lys Ala He Pro Asn His Lys Asp Gln Glu Trp Asp Pro Arg 100 105 110 Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly He Phe His Phe Arg Phe Trp His Phe 115 120 125 Gly Glu Trp Thr Glu Val Val He Asp Asp Leu Leu Pro Thr He Asn 130 135 140 Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu Phe Trp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys Tyr Glu Ala 165 170 175 Leu Asp Gly Leu Thr He Thr Asp He He Met Asp Phe Thr Gly Thr 180 185 190 Leu Ala Glu He He Asp Met Gln Lys Gly Arg Tyr Thr Asp Leu Val 195 200 205 Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe Thr Lys 210 215 220 Gly Gly Leu He Cys Cys Ser He Glu Ser Pro Ser Gln Glu Glu Gln 225 230 235 240 Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr Tyr Thr Met 245 250 255 Thr Asp He Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu Val Phe 260 265 270 Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu Gly Arg 275 280 285 Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu He Ser Glu Glu Trp Gln Gln 290 295 300 Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser Asp Asp 305 310 315 320 Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn Phe His Lys 325 330 335 Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly Arg Lys Glu 340 345 350 Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro Leu Met 355 360 365 Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu Gln Asn 370 375 380 Pro Gln Tyr He Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val He Met 385 390 395 400 Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly Arg Pro 405 410 415 Asp Asn Tyr He He Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met Asn Arg 420 425 430 Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr He Gln Glu Arg Ala Gly Thr Ser 435 440 445 Thr Tyr He Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu Lys Lys 450 455 460 Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly Arg Thr Ser 465 470 475 480 Glu Phe Leu Leu Arg He Phe Ser Glu Val Pro Val Gln Leu Arg Glu 485 490 495 Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala Arg Gly 500 505 510 Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln He Thr Val His Ser Ala Glu Gly Leu 515 520 525 Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu He He Lys 530 535 540 Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn Thr Val His 545 550 . 555 560 Ala He Phe Asp Thr Gln Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr Thr Asp He 565 570 575 Pro He He He Gln Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys Asp Gln Phe 580 585 590 Leu Gly Gln Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys Arg Asp Leu 595 600 605 Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala Lys Val Lys 610 615 620 Gln Gly His He Ser Phe Lys Val He Ser Ser Asp Asp Leu Thr Glu 625 630 635 640 Leu (2) INFORMACIÓN PARA: ID de Sec. No. : 3: (i) CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1125 pares base (B) TIPOS: ácidos nucleicos (C) TIPO DE HEBRA: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (iii) HIPOTÉTICOS: NO (iii) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: CAPN6 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CARACTERÍSTICAS NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 2..1125 (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID de Sec. No.: 3: G CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTA TTC GGA GAA CTG TAC AAA ACA 46 Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr 1 5 10 15 TTT ACC AAA GGT GGT CTG ATC TGC TGT TCC ATT GAG TCT CCC AAT CAG 94 Phe Thr Lys Gly Gly Leu He Cys Cys Ser He Glu Ser Pro Asn Gln 20 25 30 GAG GAG CAÁ GAA GTT GAA ACT GAT TGG GGT CTG CTG AAG GGC CAT ACC 142 Glu Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr 35 40 45 TAT ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAA ATT CGT CTT GGA GAG AGA CTT GTG 190 Tyr Thr Met Thr Asp He Arg Lys He Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val 50 55 60 GAA GTC TTC AGT GCT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTG AGA MC CCC 238 Glu Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro 65 70 75 TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCT GAA GAG 286 Leu Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu He Ser Glu Glu 80 85 90 95 TGG CAG CA CTG ACT GCA TCA GAT CGC AAG AAC CTG GGG CTT GTT ATG 334 Trp Gln Gln Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met 100 105 110 TCT GAT GAT GGA GAG TTT TGG ATG AGC TTG GAG GAC TTT TGC CGC AAC 382 Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn 115 120 125 TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAC AAC CCT ATT TTT GGC 430 Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro He Phe Gly 130 135 140 CGA AAG GAG CTG GAA TCG GTG TTG GGA TGC TGG ACT GTG GAT GAT GAT 478 Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp 145 150 155 CCC CTG ATG AAC CGC TCA GGA GGC TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 526 Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe 160 165 170 175 CTG CAG AAT CCC CAG TAC ATC TTC ACT GTG CCT GAG GAT GGG CAC AAG 574 Leu Gln Asn Pro Gln Tyr lie Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys 180 185 190 GTC ATT ATG TCA CTG CAG CAG AAG GAC CTG CGC ACT TAC CGC CGA ATG 622 Val He Met Ser Leu Gin Gin Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met 195 200 205 GGA AGA CCT GAC AAT TAC ATC ATT GGC TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 670 Gly Arg Pro Asp Asn Tyr He He Gly Phe Giu Leu Phe Lys Val Glu 210 215 220 ATG AAC CGC AAA TTC CGC CTC CAC CAC CTC TAC ATC CAG GAG CGT GCT 718 Met Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr He Gin Glu Arg Ala 225 230 235 GGG ACT TCC ACC TAT ATT GAC ACC CGC ACA GTG TTT CTG AGC AAG TAC 766 Gly Thr 5cr Thr Tyr He Asp Thr Ary Thr Val Phe leu Ser Lys Tyr 240 245 250 255 CTG AAG AAG GGC AAC TAT GTG CTT GTC CCA ACC ATG TTC CAG CAT GGT 814 Leu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gin His Gly 260 265 270 CGC ACC AGC GAG TTT CTC CTG AGA ATC TTC TCT GAA GTG CCT GTC CAG 862 Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Aro He Phe Ser Glu Val Pro Val Gln 275 280 285 CTC AGG GAA CTG ACT CTG GAC ATG CCC AAA ATG TCC TGC TGG AAC CTG 910 Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu 290 295 300 GCT CGT GGC TAC CCG AAA GTA GTT ACT CAG ATC ACT GTT CAC AGT GCT 958 Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gin He Thr Val His Ser Ala 305 310 315 GAG GAC CTG GAG AGG AGG TAT GCC AAT GGA ACT GTA AAC CCA TAT TTG 1006 Glu Asp Leu Giu Arg Arq Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu 320 325 330 335 GTC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCT CCT GTC CAG AAA AAT 1054 Val He Lys Cys Gly Lys Gin Gin Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn 340 345 350 ACA GTT CAT ATT TTT GAC ACC CAT GCC ATT TTC TAC AGA AGG ACC 1102 Thr Val His Ala He Phe Asp Thr His Ala He Phe Tyr Arg Arg Th 355 360 365 ACG GAC ATT CCT ATT ATA GTA CA 1125 Thr Asp He Pro He He Val 370 (2) INFORMACIÓN PARA: ID de Sec. No. : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 374 Amino ácido (B) TIPO: Amino ácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID de Sec. No. : 4 Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe 1 5 10 15 Thr Lys Gly Gly Leu He Cys Cys Ser He Glu Ser Pro Asn Gln Glu 20 25 30 Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr Tyr 35 40 45 Thr Met Thr Asp He Arg Lys He Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu 50 55 60 Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu 65 70 75 80 Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu He Ser Glu Glu Trp 85 90 95 Gln Gln Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser 100 105 110 ACG GAC ATT CCT ATT ATA GTA CA Thr Asp He Pro He He Val 370 (2) INFORMACIÓN PARA: ID de Sec. No. : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 374 Amino ácido (B) TIPO: Amino ácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID de Sec. No. : 4 Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe 1 5 10 15 Thr Lys Gly Gly Leu He Cys Cys Ser He Glu Ser Pro Asn Gln Glu 20 25 30 Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr Tyr 40 45 Thr Met Thr Asp He Arg Lys He Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu 50 55 60 Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu 65 70 75 80 Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu He Ser Glu Glu Trp 85 90 95 Gln Gln Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser 100 105 110 Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn Phe 115 120 125 His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro He Phe Gly Arg 130 135 140 Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro 145 150 155 160 Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu 165 170 175 Gln Asn Pro Gln Tyr He Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val 180 185 190 He Met Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly 195 200 205 Arg Pro Asp Asn Tyr He He Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met 210 . 215 220 Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr He Gln Glu Arg Ala Gly 225 230 235 240 Thr Ser Thr Tyr He Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu 245 250 255 Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly Arg 260 265 270 Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg He Phe Ser Glu Val Pro Val Gln Leu 275 280 285 Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala 290 295 300 Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln He Thr Val His Ser Ala Glu 305 310 315 320 Asp Leu Glu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu Val 325 330 335 He Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn Thr 340 345 350 Val His Ala He Phe Asp Thr His Ala He Phe Tyr Arg Arg Thr Thr 355 360 365 Asp He Pro He He Val 370

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un método para identificar inhibidores de calpaína, en donde la calpaína, CAPN6 codificada por la secuencia ID de SEC No. 1 o 5 ID de SEC No. 3, sus variantes o análogos alélicos que, en el nivel amino ácido derivado, tienen una homología desde 60 a 100% y en donde los genes de calpaína, sus variantes o análogos alélicos contienen las siguientes secuencias: (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína humana I ya que el aminoácido cisteína en la calpaína I humana, que ocupa la posición 115 en calpaína I, se altera en lisina que es la posición 81 en las secuencias ID de SEC. No. 1 e ID de SEC. No. 3; (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, en donde en comparación con la secuencia correspondiente en calpaína humana I , los amino ácidos alanina y treonina en las posiciones 122 y 125 se alteran en serina y alanina y las posiciones 88 y 91 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3; (c) Gly-Tyr-Thr- (His o Tyr) -Thr-X-Thr, en donde comparado con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos, histidina, alanina y serina en las posiciones 272, 273 y 275 se alteran en tirosina, treonina y treonina en las posiciones 252, 253 y 255 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3 y ID de SEC No. 3 adicionalmente al residuo de tirosina en la posición 274 en calpaína I se altera en histidina en la posición 254 en ID de SEC No. 3 ; d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína I humana, ya que el aminoácido triptofano en calpaína I, que ocupa la posición 298 en calpaína I, se altera a leucina, que está en la posición 286 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3, X en las secuencias es cualquier aminoácido natural, se aisla de tejidos o células, y la inhibición de escición de un substrato de la enzima CAPN6 y al menos en otra prueba, la inhibición de escición de un substrato en la enzima calpaína I y/o II por substancias de prueba se miden, y las substancias de prueba que inhiben la enzima CAPN6 y al menos otra calpaína, se eligen. 2. - Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las substancias de prueba que no inhiben la enzima CAPN6 excepto las enzimas calpaína I y/o II, se eligen. 3. - Método de conformidad con la reivindicación
2. I, caracterizado porque las substancias de prueba que inhiben la enzima CAPN6 pero no las enzimas calpaína I y/o
3. II, se eligen.
4. 4. - Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las substancias de prueba que cruzan la membrana celular en sistemas celulares, se eligen.
5. 5.- Procedimiento para preparar la enzima CAPN6 y sus variantes o análogos alélicos que comprenden al menos una copia de la secuencias de gen para CAPN6 , sus variantes o análogos alélicos, como se describe en la reivindicación 1, clonada en un vector, y el gen para la enzima CAPN6, sus variantes o análogos alélicos se expresan en un organismo huésped apropiado para el vector, y subsecuentemente la enzima se aisla del organismo huésped.
6. 6.- Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque un vector que hace posible que los genes, las variantes alélicas o análogos se expresen en células procarióticas o eucarióticas, se empleen.
7. 7.- Método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque células de baterías, fúngales o animales se emplean como el organismo huésped.
8. 8. - Método de conformidad con la reivindicación 5 o 7, caracterizado porque se emplean baculovirus como vector y células de insectos se emplean como organismo huésped.
9. 9.- Una construcción de gen que comprende un gen de calpaína CANP6 codificado por la secuencia ID de Sec. No.: 1 o ID de Sec. No.: 3, sus variantes o análogos alélicos, que están enlazados funcionalmente con una o más señales regulatorias para incrementar la expresión del gen, en donde las variantes o análogos alélicos tienen, al nivel de amino ácidos derivados, una homología desde 60 a 100% y en donde los genes de calpaína, sus variantes o análogos alélicos contienen las siguientes secuencias: (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína humana I ya que el aminoácido cisteína en la calpaína I humana, que ocupa la posición 115 en calpaína I, se altera en lisina que es la posición 81 en las secuencias ID de SEC. No. 1 e ID de SEC. No. 3; (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, en donde en comparación con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos alanina y treonina en las posiciones 122 y 125 se alteran en serina y alanina y las posiciones 88 y 91 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3; (c) Gly-Tyr-Thr- (His o Tyr) -Thr-X-Thr, en donde comparado con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos, histidina, alanina y serina en las posiciones 272, 273 y 275 se alteran en tirosina, treonina y treonina en las posiciones 252, 253 y 255 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3 y ID de SEC No. 3 adicionalmente al residuo de tirosina en la posición 274 en calpaína I se altera en histidina en la posición 254 en ID de SEC No. 3; d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína I humana, ya que el aminoácido triptofano en calpaína I, que ocupa la posición 298 en calpaína I, se altera a leucina, que está en la posición 286 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3, X en las secuencias es cualquier aminoácido natural .
10. 10.- Un organismo huésped recombinante que comprende una construcción de gen de conformidad con la reivindicación .
11. 11.- Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un organismo huésped procariótico o eucariótico.
12. 12. - Un organismo huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el organismo huésped es una bacteria, una levadura, un hongo o una célula animal .
13. 13. - El uso de un inhibidor de calpaína que puede identificarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para producir medicinas para tratar desordenes en donde está presente disfunción de calpaína.
14. 14. - El uso de un inhibidor de calpaína de conformidad con la reivindicación 13 , para producir medicinas para tratar desordenes seleccionados del grupo de enfermedades cardiovasculares, inmunológicas , inflamatorias, alérgicas, neurológicas, neurodegenerativas u oncológicas .
15. 15. - El uso de la secuencia de aminoácidos por la secuencia ID de Sec. No. : 1 o ID de Sec. No. : 3, sus variantes o análogos alélicos en el sistema de prueba, en donde las variantes o análogos alélicos tienen al nivel aminoácido derivado, una homología de 60 a 100% y en donde los genes de calpaína, sus variantes o análogos alélicos contienen las siguientes secuencias: (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína humana I ya que el aminoácido cisteína en la calpaína I humana, que ocupa la posición 115 en calpaína I, se altera en lisina que es la posición 81 en las secuencias ID de SEC. No. 1 e ID de SEC. No. 3; (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, en donde en comparación con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos alanina y treonina en las posiciones 122 y 125 se alteran en serina y alanina y las posiciones 88 y 91 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3; (c) Gly-Tyr-Thr- (His o Tyr) -Thr-X-Thr, en donde comparado con la secuencia correspondiente en calpaína humana I, los amino ácidos, histidina, alanina y serina en las posiciones 272, 273 y 275 se alteran en tirosina, treonina y treonina en las posiciones 252, 253 y 255 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3 y ID de SEC No. 3 adicionalmente al residuo de tirosina en la posición 274 en calpaína I se altera en histidina en la posición 254 en ID de SEC No. 3 ; (d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly en donde esta secuencia difiere de la secuencia correspondiente en calpaína I humana, ya que el aminoácido triptofano en calpaína I, que ocupa la posición 298 en calpaína I, se altera a leucina, que está en la posición 286 en las secuencias ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 3, X en las secuencias es cualquier aminoácido natural .
16. 16.- El uso de la secuencia de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 15, para producir anticuerpos .
17. 17.- El uso de una secuencia de genes que contiene un gen de calpaína CAPN6 codificado por la secuencia ID de Sec. No. : 1 o ID de Sec. No. : 3, sus variantes o análogos alélicos de conformidad con la reivindicación 9, o la secuencia ID de Sec. No.: 1 o ID de Sec. No.: 3, sus variantes o análogos alélicos para producir ARNn antisentido.
18. 18.- El uso del ARNn antisentido de conformidad con la reivindicación 17, para producir medicinas para tratar desordenes en donde está presente la disfunción de calpaína.
19. 19.- El uso de una secuencia de gen que contiene un gen de calpaína CAPN6 codificado por la secuencia ID de Sec. No.: 1 o ID de Sec. No.: 3, sus variantes o análogos alélicos de conformidad con la reivindicación 9, o la secuencia ID de Sec. No. : 1 o ID de Sec. No. : 3, sus variantes o análogos alélicos, para diagnosticar desordenes o en terapia de genes .