DE19650142A1

DE19650142A1 - Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19650142A1
Application number: DE1996150142
Authority: DE
Inventors: Neil Dr Dear; Thomas Prof Dr Boehm
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 1998-06-10
Also published as: ZA9710857B

Description

Die Erfindung betrifft neue Calpaine und ihre Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren und deren Verwendung.

Calpaine gehören zu den intrazellulären, nicht-lysosomalen Enzymen aus der Gruppe der Cystein-Proteasen. Sie sind an der Ca²⁺-abhängigen Signaltransduktion in eukaryontischen Zellen betei ligt, d. h. sie regulieren abhängig von der Ca²⁺ Konzentration zelluläre Funktionen. Calpaine kommen ubiquitär in tierischen Geweben bzw. Zellen von beispielsweise Mensch, Hühnern, Kaninchen oder in der Ratte vor. Auch in niederen Tieren wie beispielsweise in Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans wurden Calpaine gefunden. In Hefen, Pilzen oder Bakterien konnten bisher keine Calpaine nachgewiesen werden.

Bisher sind drei Hauptisoformen dieser ubiquitären Calpaine be kannt, die sich in vitro durch ihre Kalzium-abhängige Aktivier barkeit unterscheiden. Calpain I (= µCalpain) wird durch µ-molare Kalziumion-Konzentrationen aktiviert, während Calpain II (= mCalpain) erst durch millimolare Konzentrationen an Kalzium ionen aktiviert wird. Beide Calpaine bestehen aus zwei Unter einheiten, einer großen Untereinheit mit ca. 80 kDa und einer kleinen Untereinheit von ca. 30 kDa. Beide Untereinheiten des aktiven Heterodimers besitzen Bindungsstellen für Kalzium. Die große Untereinheit wird aus folgenden vier Proteindomänen (= I-IV) aufgebaut: einer Proteasedomäne (= Domäne II), einer Kalzium-bindenden Domäne (= Domäne IV) und zwei weiterer Domänen (= Domäne I und III), deren Funktion unklar ist. Die kleine 30 K-Untereinheit besteht aus einer Kalzium-bindenden Untereinheit (= IV') und einer weiteren Untereinheit (= V), deren Funktion unklar ist. Zusätzlich zu diesen beiden Calpaintypen wurde ein dritter bezüglich der Kalziumaktivierung intermediärer Typ (= µ/m 80K) im Huhn gefunden (Wang K. K. W. et al., TiPS, Vol. 15, 1994: 412-419, Suzuki, K. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995: 523-529).

Neben diesen ubiquitär vorkommenden Calpainen wurden in letzter Zeit zwei neue gewebespezifisch exprimierte Calpaine identifi ziert. nCL-1 (= p94) ist ein in Hühnern, Ratten und Menschen vorkommendes, Muskel-spezifisches Calpain, das vermutlich als Monomer aktiv sein könnte und nur aus der 80 kd Untereinheit besteht. Neben nCL-1 gibt es ein Magen-spezifische Calpain, das in zwei Splicing-Varianten nCL-2 und nCL-2' vorkommen kann. nCL-2' unterscheidet sich gegenüber nCL-2 durch das Fehlen der Kalzium-bindenden Region (Sorimachi, H. S. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993 : 19476-19482, Sorimachi, H. S: et al., FEBS Lett. 343, 1994 : 1-5). Auch in Drosophila wurde ein Calpain-homologes Protein (= CalpA), das mit Actin interagiert und vermutliche eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung spielt, gefunden, daß zwei verschiedene Splicing-Varianten auf weist (Mol. Cell. Biol. Vol. 15, No. 2, 1995 : 824-834). Auch hier fehlt der kürzeren Variante die Kalziumbindestelle.

Man vermutet, daß Calpaine bei verschiedenen physiologischen Pro zessen wichtige Rollen spielen. Eine Vielzahl von cytoskeletalen, membrangebundenden oder regulatorischen Proteinen wie Protein kinase C, Phospholipase C, Spectrin, Cytoskelett-Proteine wie MAP2, Muskelproteine, Neurofilamente und Neuropeptide, Plättchen proteine, -"Epidermal Growth Factor"-, NMDA-Rezeptor und Proteine, die an der Mitose beteiligt sind, sowie weitere Proteine sind Calpainsubstrate (Barrett M. J. et al., Life Sci. 48, 1991 : 1659-69, Wang K. K. et al., Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994 : 412-419). Die normale physiologische Funktion der Calpaine ist bis heute noch nicht klar verstanden.

Bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen und Krankheiten wurden erhöhte Calpain-Spiegel gemessen, zum Beispiel bei: Ischämien des Herzen (z. B. Herzinfarkt), der Niere oder des Zentralnervensystems (z. B. Hirnschlag), Entzündungen, Muskel dystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star), Verletzungen des Zentralnervensystems (z. B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HIV-induzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Huntigtonsche Krankheit usw. (siehe Wang K. K. oben). Man vermutet einen Zusammenhang dieser Krankheiten mit einem erhöhten und anhaltenden intrazellu lären Kalziumspiegel. Dadurch werden Kalzium-abhängige Prozesse überaktiviert und unterliegen nicht mehr der physiologischen Regelung. Dementsprechend kann eine Überaktivierung von Calpainen auch pathophysiologische Prozesse auslösen.

Daher wurde postuliert, daß Inhibitoren der Calpain-Enzyme für die Behandlung dieser Krankheiten nützlich sein können. Verschie dene Untersuchungen bestätigten dies. So haben Seung-Chyul Hong et al. (Stroke 1994, 25 (3), 663-669) und Bartus R. T. et al. (Neurological Res. 1995, 17, 249-258) eine neuroprotektive Wirkung von Calpaininhibitoren in akuten neurodegenerativen Störungen, wie sie nach Hirnschlag auftreten, gezeigt. Ebenso verbesserten nach experimentellen Gehirntraumata Calpaininhibi toren die Erholung der auftretenden Gedächtnisleistungsdefizite und neuromotorischen Störungen (Saatman K. E. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 93, 1996 : 3428-3433). Edelstein C. L. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 7662-7666) fand eine protektive Wirkung von Calpaininhibitoren auf durch Hypoxie geschädigten Nieren. Yoshida K. I. et al. (Jap. Circ. J. 59 (1), 1995, 40-48) konnten günstige Effekte von Calpaininhibitoren nach cardialen Schädigungen aufzeigen, die durch Ischämie oder Reperfusion erzeugt wurden. Da Calpaininhibitoren die Freisetzung von β-AP4-Protein hemmen, wurde eine potentielle Anwendung als Therapeutikum der Alzheimer Krankheit vorgeschlagen (Higaki J. et al., Neuron, 14, 1995 : 651-659). Die Freisetzung von Interleukin-1α wird ebenfalls durch Calpaininhibitoren gehemmt (Watanabe N. et al., Cytokine, 6 (6), 1994 : 597-601). Weiterhin wurde gefunden, daß Calpaininhibitoren cytotoxische Effekte an Tumorzellen zeigen (Shiba E. et al., 20th Meeting Int. Ass. Breast Cancer Res., Sendai Jp, 1994, 25. - 28. Sept., Int. J. Onco. 5 (Suppl.), 1994, 381). Auch bei der Restenose und bei Arthritis spielt Calpain eine wichtige Rolle und Calpaininhibito ren können das Krankheitsbild positiv beeinflussen (March K. L. et al. Circ. Res. 72, 1993 : 413-423, Suzuki K. et al., Biochem. J., 285, 1992 : 857-862).

Weitere mögliche Anwendungen von Calpaininhibitoren sind Wang K. K. (Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994 : 412-419) zu entnehmen.

Der potenteste und selektivste Calpaininhibitor ist das natürlich vorkommende intrazelluläre Protein Calpastatin. Es hemmt sowohl Calpain I als auch Calpain II, nicht jedoch andere Cystein- bzw. Thiolproteasen wie Cathepsin B, L oder Papain. Das aus ca. 700 Aminosäuren bestehende Calpastatin hat jedoch den Nachteil, daß es für therapeutische Möglichkeiten aufgrund der Größe und der Unpassierbarkeit der Zellmembran nicht in Frage kommt. Neben niedermolekularen peptidischen Calpaininhibitoren wurden eine Reihe nicht-peptidischer Inhibitoren identifiziert. Nachteil die ser Inhibitoren ist, daß sie instabil sind, rasch metabolisiert werden und zum Teil toxisch sind. Viele Calpaininhibitoren zeich nen sich außerdem durch eine mangelnde Selektivität aus, d. h. sie hemmen nicht nur Calpain I und II sondern auch andere Cystein proteasen wie Papain, Chymotrypsin, Elastase oder Cathepsin B und L.

Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf nach selektiven, hoch wirksamen Calpaininhibitoren. Für das Screening nach diesen selektiven, gut wirksamen Calpaininhibitoren sind hochspezifische Testsysteme erforderlich, die es ermöglichen selektive Inhibi toren zu identifizieren. Üblicherweise werden die Screeningtests mit den ubiquitär vorkommenden Calpainen Calpain I und Calpain II durchgeführt.

Für das Auffinden selektiver Inhibitoren ist es notwendig und wünschenswert weitere Calpaine zur Testung zur Verfügung zu stellen, die möglichst gewebespezifisch exprimiert werden, so daß die Inhibitoren auf ihre Selektivität zwischen den einzelnen Calpainen geprüft werden können.

Darüber hinaus sind weitere neue Calpaine gesuchte Proteine, da sie mit hoher Wahrscheinlichkeit bei den verschiedenen Krank heitsbildern bzw. Krankheiten unterschiedlich exprimiert werden und eine wichtige Rolle bei diesen Krankheiten spielen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel zur Profilie rung und Identifizierung von Calpaininhibitoren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen Calpaininhibitoren zu identifizieren, die einerseits nur gegenüber einem Calpain inhibierende Wirkung aufweisen, und anderseits gegenüber mehreren Calpainen inhibie rende Wirkung aufweisen und diese als therapeutisches Target zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Calpain sowie seine allelischen Varianten, Analoge oder Derivate.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizie rung von Calpaininhibitoren, wobei man das Calpain nCL-3 codiert durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 aus Geweben oder Zellen, in denen das Enzym nCL-3 exprimiert wird, isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Substrats des Enzyms nCL-3 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Testsubstanzen mißt und die Testsubstanzen auswählt, die mindestens gegen eines der Calpaine eine inhibierende Wirkung zeigen oder die Testsubstanzen aus wählt, die das Enzym nCL-3 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Cal pain I und/oder II oder die das Enzym nCL-3 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II oder die nCL-3 und die Enzyme Calpain I und/oder II hemmen.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Identi fizierung von Calpaininhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inhibierung der Spaltung eines Substrates des Enzyms nCL-3 bzw. der Calpaine I und/oder II durch Testsubstanzen in zellu lären Systemen bestimmt und solche Testsubstanzen auswählt, die die Zellmembran passieren und die intrazelluläre Aktivität des Enzyms nCL-3 und/oder der Calpaine I und/oder II hemmen.

Mit Hilfe der Calpain-spezifischen Primer wurden über das sogenannte Domain-Fingerprinting (Boehm T., Oncogene 8, 1993: 1385-1390) unter Verwendung von genomischer DNA Calpain spezifische Sequenzsignaturen mittels PCR-Technik hergestellt, die vorteilhafterweise auch zur besseren Differenzierung der Calpainsequenzen Intronsequenzen enthalten.

Die in Tabelle 1 genannten redundanten PCR-Primer wurden bei der Klonierung des Gens für nCL-3 verwendet.

Redundante PCR Primer, die zur Klonierung von nCL-3 (=2930) verwendet wurden

Mit dem Primerpaar Ca16 und Ca19 (siehe Tab. 1) ließ sich ein Klon mit der Bezeichnung 29/30 (=2930) darstellen. Dieser Klon entstammt einem Gen, dessen Genprodukt als neues Calpain die Be zeichnung nCL-3 erhielt. Die Nucleinsäuresequenz der cDNA für nCL-3 ist Sequenz SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Die abgeleitete Ami nosäuresequenz des Calpains nCL-3 ist der Sequenz SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Die unter Berücksichtigung eines vorhandenen Introns deduzierte Aminosäuresequenz der initial erhaltenen Sequenz 29/30 weist eine typische Calpainsignatur auf, wobei eine Zuordnung zu den bekannten Calpain-Subfamilien µCalpain, mCalpain, nCL-1 oder nCL-2 aufgrund der geringen Homologie nicht eindeutig möglich ist (siehe Fig. 3 und Tab. 2). Fig. 2 ist die Homologie zu bekann ten Calpain-Subfamilien zu entnehmen, wobei hier die vollständige cDNA-Sequenz zugrunde gelegt wurde. Es handelt sich bei dem Cal pain nCL-3 um ein neues bisher unbekanntes Calpain.

Tabelle 2 Homologie (%) auf Aminosäureebene zwischen nCL-3 und anderen Cal painen

Name
% Homologie
Nematode tra-3	34,5
Drosophila CalpA	31,5
Huhn p94	31,2
Mensch p94	30,9
Maus p94	30,5
Ratte p94	30,0
Huhn µ/m	28,8
Huhn m	27,8
Mensch m	27,3
Huhn µ	25,4
Schwein p94	25,4
Ratte m	24,4
Ratte nCL-2	23,9
Nematode CPL1	23,6
Mensch µ	23,1
Schistosoma	21,7
Kaninchen m	16,1
Schwein m	15,8
Schwein µ	15,6
Maus CAP4	13,7
Kaninchen µ	12,9

Das in der Sequenz SEQ ID NO: 5 gezeigte Intron (von Nukleotid 34 bis 440) wurde durch Vergleich mit der cDNA festgelegt.

Sequenzvergleiche zwischen der nCL-3-Sequenz in verschiedensten Datenbanken wie Genbank.nr und Genbank.dbest ergaben Homologien zu CalpA, Tra-3 und einer humanen Sequenz mit der Bezeichnung EST01106 Homo sapiens cDNA clone HHCPE79 (siehe Fig. 2).

Bei CalpA handelt es sich um ein gewebsspezifisches exprimiertes Calpainhomologes von Drosophila (Theopold V. et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 15, No. 2, 1995: 824-834). Es wird in einigen Neuronen des Zentralen Nervensystems, in verstreuten Zellen des Mitteldarms und in Blutzellen von Drosophila exprimiert. Von CalpA wurden zwei verschiedene Splicing-Varianten gefunden. Der kürzeren Variante fehlt die Calpain-typische Kalziumbindungs stelle.

Die Homologie auf Aminosäureebene zwischen CalpA und nCL-3 beträgt 31,5% (siehe Tab. 2).

Tra-3 ist an der Geschlechtsbestimmung von Caenorhabditis elegans beteiligt. In einer Kaskade von mehreren Genen und deren Gen produkten entscheidet tra-3 mit darüber, ob sich Caenorhabditis Männchen oder Hermaphroditen entwickeln (Kuwabara P. E. et al., TIG, Vol. 8, No. 5, 1992 : 164-168). Tra-3 scheint an der Sperma togenese beteiligt zu sein.

Die Homologie auf Aminosäureebene zwischen tra-3 und nCL-3 be trägt 34,5% (s. Tab. 2). Möglicherweise ist auch nCL-3 an der Geschlechtsbestimmung beteiligt.

Weitere Homologien zwischen nCL-3 und anderen Calpainen sind Tabelle 2 zu entnehmen.

Zwischen nCL-3 und der humanen Teilsequenz EST01106 besteht die größte Homologie. Die Teilsequenz EST01106 wurde aus einer Hippo campusbibliothek gewonnen. Über die Funktion ist nichts bekannt (Nature 355, 6361, 1992 : 632-634). Ebenfalls unbekannt ist die vollständige Gensequenz und ob es sich bei der Sequenz um ein Calpaingen handelt.

Die Sequenzvergleiche zwischen CalpA, Tra-3, EST01106 und nCL-3 werden in Fig. 2 wiedergegeben.

Neben dem in Sequenz SEQ ID NO: 1 dargestellten nCL-3-Gen wurde eine verkürzte Form, die in Sequenz SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, identifiziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des ver kürzten nCL-3-Gens ist der Sequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen. Dieses verkürzte nCL-3-Gen, das die Bezeichnung nCL-3' trägt, entsteht vermutlich durch alternatives Splicing.

Das erfindungsgemäße neue Calpain nCL-3 wird in vielen Geweben mit unterschiedlicher Intensität exprimiert (Fig. 1). In den un tersuchten mRNA-Proben wird nCL-3 klar ersichtlich in der Haut, der Niere, dem Herz, der Lunge, dem Thymus und in der Leber exprimiert.

Für die Identifizierung von selektiven Calpaininhibitoren sind möglichst spezifische Verfahren zur Identifizierung der Inhibi toren erforderlich. Wichtig dabei ist, daß die selektierten Inhibitoren nur das gewünschte oder die gewünschten Calpaine hemmen, nicht jedoch andere Cystein-Proteasen und damit in physiologische Prozesse eingreifen.

Die auf ihre inhibitorische Aktivität hin zu prüfenden Test substanzen können beispielsweise chemische Substanzen, mikro bielle oder pflanzliche Extrakte sein. Sie werden üblicherweise neben den Test auf ihre Inhibitoraktivität gegenüber nCL-3, Calpain I und/oder II auf ihre Aktivität gegenüber Cathepsin B oder andere Thiolproteasen getestet.

Idealerweise sollten gute Inhibitoren keine oder nur geringe Aktivität gegenüber Cathepsin B, L, Elastase, Papain, Chymo trypsin oder andere Cystein-Proteasen aufweisen, aber eine gute Aktivität gegenüber den Calpainen I und II aufweisen.

Durch das erfindungsgemäße neue Calpain nCL-3 können mit den erfindungsgemäßen Verfahren Inhibitoren identifiziert werden, die zu ihrer inhibitorischen Wirkung zwischen den verschiedenen Calpainen Calpain I, II, nCL-1 nCL-2 und/oder nCL-3 diskrimi nieren können.

Die verschiedenen Inhibitortests wurden dabei wie folgt durch geführt:

Cathepsin B-Test

Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-240 bestimmt.

Zu 88 µl Cathepsin B (Cathepsin B aus menschlicher Leber von der Firma Calbiochem, verdünnt auf 5 Units in 500 µM Puffer) werden 2 µl einer Inhibitorlösung, hergestellt aus der zu testenden chemischen Substanz, einem mikrobiellen oder pflanzlichen Extrakt und DSMO (Endkonzentration: 100 µM bis 0,01 µM) zugegeben. Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (= 25°C) vor inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10% DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nm im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC₅₀'s bestimmt.

Calpain I und II-Test

Die Aktivität der Calpaininhibitoren wurde in einem colori metrischen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Substrat untersucht. Der Test wurde in Mikrotiterplatten, entsprechend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392, durchgeführt. Als Enzyme wurde Calpain I (0,04 U/Test) aus Erythrozyten und Calpain II (0,2 U/Test) aus Nieren, beide vom Schwein, der Firma Calbiochem, benutzt. Die zu testenden Substanzen wurden mit dem Enzym für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1% des Lösungsmittels DMSO nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farbreagenz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50%ige Aktivität des Enzyms ergibt sich aus den optischen Dich ten, die bei der maximalen Aktivität des Enzyms ohne Inhibitoren und der Aktivität des Enzyms ohne Zugabe von Kalzium bestimmt wurden.

Die Aktivität von Calpaininhibitoren kann ferner mit dem Substrat Suc-Leu Tyr-AMC bestimmt werden. Diese fluorimetrische Methode ist bei Zhaozhao Li et al, J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480 beschrieben.

Da Calpaine intrazelluläre Cysteinproteasen sind, müssen Calpain inhibitoren die Zellmembran passieren, um den Abbau von intra zellulären Proteinen durch Calpain zu verhindern. Einige bekannte Calpaininhibitoren, wie zum Beispiel E 64 und Leupeptin, über winden die Zellmembranen nur schlecht und zeigen dementsprechend, obwohl sie gute Calpaininhibitoren darstellen nur schlechte Wirkung an Zellen. Es ist deshalb vorteilhaft einen zusätzlichen Test für die Membrangängigkeit von potentiellen Calpaininhibi toren wie den humanen Plättchentest durchzuführen.

Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivität von Calpaininhibitoren

Der Calpainvermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von Zhaozhaoli et al., J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480 beschrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 10⁷ Zellen/ml eingestellt.

Plättchen (0,1 ml) werden für 5 Minuten in 1 µl an verschiedenen Konzentrationen an potentiellen Inhibitoren (gelöst in DMSO) vor inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 µM im Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inkubation von 5 Minuten bei 37°C. Nach einem Zentrifugations schritt wurden die Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenom men, 5 Minuten bei 95°C gekocht und die Proteine in einem 8%igen Gel aufgetrennt. Der Abbau der beiden Proteine Actin bindendes Protein (= ABP) und Tal in wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt. Nach der- Zugabe von Kalzium und Ionophor verschwanden diese Proteine und es entstanden neue Banden von kleiner 200 Kd Molekulargewicht. Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität mit oder als Kontrolle ohne Inhibitor bestimmt.

Ebenfalls geeignet für die Testung der Membrangängigkeit sind Gewebsteile wie Gehirnschnitte oder Zellkulturen.

Test auf Hemmung gegenüber nCL-3 wird in Zellen durchgeführt, die dieses Protein exprimieren und sich dieses mit einem spezifischen Antikörper nachweisen läßt. Werden Zellen mit z. B.: Kalzium und dem entsprechenden Ionophor stimuliert, führt dies zu einer Akti vierung von nCL-3. Takaomi Saido beschrieb 1992 im J. Biochem. Vol. 11, 81-86 die autolytische Transition von µ-Calpain nach Aktivierung und der Nachweis mit Antikörpern. Entsprechende Antikörper werden für den Nachweis von nCL-3 erzeugt. Calpain-Inhi bitoren verhindern die autolytische Transition und eine entsprechende Quantifizierung ist mit Antikörpern möglich.

Neben den beschriebenen in vitro Tests so wie dem zellulären Plättchentest eignen sich alle weiteren dem Fachmann bekannten Calpaintests wie der Test auf Hemmung des Glutamat induzierten Zelltods an corticalen Neuronen (Maulucci-Gedde M. A. et al., J. Neurosci. 7, 1987 : 357-368), der Kalzium-vermittelte Zelltod in NT2-Zellen (Squier M. K. T. et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994 : 229-237, Patel T. et al., Faseb Journal 590, 1996: 587-597) oder die Analyse in Gewebsproben nach Abbauprodukten von Proteinen wie Spectrin, MAP2 oder Tau (Ami Arai et al., Brain Re search, 1991, 555, 276-280, James Brorson et al., Stroke, 1995, 26, 1259-1267).

Für die in vitro-Tests von nCL-3 wird das Calpain nCL-3 oder seine tierischen oder sein humanes Homologes aus Geweben oder Zellen in denen das Enzym exprimiert wird wie beispielsweise der Niere, dem Thymus, der Leber, der Lunge, oder aus Zellen ?der Mikroorganismen, die mindestens eine Genkopie und/oder einen Vektor mit mindestens einer Genkopie des nCL-3-Gens enthalten, aufgereinigt und als Rohextrakt oder als reines Enzym verwendet.

Für die erfindungsgemäßen Verfahren werden die verschiedenen Calpaininhibitortests vorteilhafterweise in Kombination mit dem Test auf Hemmung der nCL-3-Enzymaktivität durch potentielle Inhibitoren durchgeführt. Dabei werden die Inhibitoren so aus gewählt, daß sie entweder nur das Enzym nCL-3 hemmen und nicht die anderen Calpaine oder umgedreht nur die anderen Calpaine und nicht das Enzym nCL-3.

Die verschiedenen Inhibitortests werden dabei so ausgeführt, das neben dem Test auf die inhibierende Wirkung der Testsubstanz gegenüber nCL-3, Calpain I und/oder II als Kontrolle die Tests ohne die Testsubstanz durchgeführt wird. Durch diese Testanord nung lassen sich einfach die inhibitorischen Wirkungen der Test substanzen erkennen.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren verwendet das Enzym nCL-3 zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren, wobei diese Inhibitoren vorteilhafterweise generell alle Calpaine oder ein zelne Calpaine wie Calpain I, II, nCL-1, nCl-2 oder nCL-3 hemmen können.

Für die Inhibitortests sind generell alle Substanzen geeignet. So stammen die Substanzen beispielsweise aus der klassischen chemi schen Synthese, aus der Kombinatorik, aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Extrakten. Unter mikrobiellen Extrakten sind beispielsweise Fermentationsbrühen, Zellaufschlüsse von Mikroorganismen oder Substanzen nach Biotransformation zu ver stehen. Auch Zellfraktionen sind für die Tests geeignet.

Für die Klonierung des nCL-3 Gens oder seiner tierischen Homo logen oder seines humanen Homologen eignen sich alle Expressions systeme, die zur Isolierung eines enzymatisch aktiven Genprodukts geeignet sind. Unter enzymatisch aktivem Genprodukt sind nCL-3-Proteine zu verstehen, die direkt nach Isolierung aus dem Expres sionsorganismus wie beispielsweise aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder nach Renaturierung ein aktives Protein ergeben, das in der Lage ist mindestens ein bekanntes Calpain substrat wie die oben genannten oder über Autokatalyse sich selbst zu spalten.

Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität sind alle dem Fachmann bekannten Calpaintests wie in vitro-Tests wie die oben beschriebenen Tests für Calpain I und II oder zelluläre Tests wie der Plättchentest geeignet. Dabei können als Detektionsmöglich keit Tests verwendet werden, die auf Basis eines colorimetrischen Assays (Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993: 387-392) oder auf Basis eines Fluoreszenz-Assays beruhen.

Außerdem sind auch alle Teilsequenzen, die das katalytische Zentrum des nCL-3 Gens und/oder weitere Sequenzen des nCL-3 Gens und/oder andere Calpaingensequenzen und/oder andere Sequenzen enthalten und enzymatische Aktivität zeigen, unter enzymatische aktivem Genprodukt von nCL-3 zu verstehen.

Unter Wirtsorganismen sind alle prokaryotischen oder eukaryonti schen Organismen, die als Wirtsorganismen geeignet sind, sind beispielsweise Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, Hefen wie Saccha romyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pilze wie Aspergillus niger, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, Trichoplusia-Zellen oder alle anderen Insektenzellen, die für eine virale Expression geeignet sind, oder tierische Zellen wie CV1, COS, C127, 3T3 oder CHO oder humane Zellen zu verstehen.

Unter Expressionssysteme sind die Kombination aus den oben beispielhaft genannten Expressionsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie das T7 RNA Polymerase/Promoter System oder Vektoren mit regulatorischen Sequenzen für den Phagen X zu verstehen.

Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme die Kombi nation aus Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen oder das Baculovirus-System und die entsprechenden Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda zu verstehen.

Für die vorteilhafte erfindungsgemäße Expression des nCL-3-Gens sind außerdem weitere 3' und/oder 5, Terminale regulatorische Sequenzen geeignet.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression des nCL-3 Gens ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die nCL-3 Genexpression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte nCL-3-Genexpression bewirken.

Dem nCL-3-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.

Die Genexpression des nCL-3-Gens läßt sich darüber hinaus auch durch Erhöhen der nCL-3-Genkopienzahl erhöhen. Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das nCL-3-Gen beispielsweise in einem CHO-Expressionsvektor amplifiziert. Als Vektoren eignen sich auch Vektoren der pED-Reihe - dicistronische Vektoren -, die auch das amplifizierbare Markergen Dihydrofolat Reduktase enthalten. Details können den Current Protocols in Molecular Biology Vol 2, 1994 entnommen werden.

Eine Steigerung der nCL-3-Enzymaktivität läßt sich zum Beispiel gegenüber dem Ausgangsenzym durch Veränderung des nCL-3-Gens oder seiner tierischen Homologen durch klassische Mutagenese wie UV-Bestrahlung oder Behandlung mit chemischen Mutagentien und/oder durch gezielte Mutagenese wie site directed mutagenesis, Dele tion(en), Insertion(en) und/oder Substitution(en) erzielen. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem das katalytische Zentrum so verändert wird, daß das zu spaltende Substrat rascher umgesetzt wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität neben der beschriebenen Genamplifikation durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbiosynthese reprimieren und/oder durch Synthese aktiver statt inaktiver nCL-3-Proteine erreicht werden. Auf diesem Weg können erhöhte Enzymmengen für die in vitro-Tests zur Verfügung gestellt werden.

nCL-3 oder seine tierischen Homologen lassen sich vorteilhafter weise ausgehend von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung beispielsweise der PCR-Technik (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Kapitel 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff) klonieren, bevor zugt läßt sich nCL-3 unter Verwendung von genomischer DNA und besonders bevorzugt unter Verwendung von genomischer DNA aus Mauszellen klonieren.

Als Wirtsorganismus für die Klonierung eignen sich beispielsweise alle Escherichia coli-Stämme, bevorzugt der Escherichia coli Stamm DH10B. Als Vektoren für die Klonierung sind alle Vektoren geeignet, die für die Expression in Escherichia coli geeignet sind (siehe Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6). Besonders geeignet sind beispielsweise Vektoren, die sich von pBR oder pUC ableiten oder shuttle-Vektoren, ganz besonders geeignet ist pBluescript.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind nCL-3-Gene mit Nukleotid sequenzen erhältlich, die für die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder deren Allelvariantionen kodieren. Unter Allelvarianten sind nCL-3-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 80 bis 100% aufweisen. Alle Varianten um fassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die nCL-3-Aktivität aber erhalten bleibt.

Unter Analoge von nCL-3 sind beispielsweise seine tierischen Homologen, verkürzte Sequenzen wie nCL-3' (siehe SEQ ID NO: 3), Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz besonders antisense RNA zu verstehen.

Derivate von nCL-3 sind beispielsweise solche Derivate, die enzymatisch nicht oder nur schwer spaltbar sind wie die Nuclein säurephosphonate oder -phosphothioate, bei denen die Phospat gruppe der Nucleinsäuren gegen eine Phosphonat- bzw Thioatgruppe ersetzt wurde.

Auch der Promotor, der der angegebenen Nukleotidsequenz vor geschalten ist, kann durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt ist. Des weiteren kann der Promotor auch durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Calpain inhibitoren eignen sich zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe der kardio vaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neuro logischen, neurodegenerativen, oder onkologischen Erkrankungen wie beispielsweise Restenose, Arthritis, Ischämien des Herzen, der Niere oder des Zentralnervensystems (z. B. Hirnschlag), Ent zündungen, Muskeldystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star), Verletzungen des Zentralnervensystems (z. B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HIV-induzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Huntigtonsche Krankheit.

Beispiele Beispiel 1: Klonierung eines Teils des nCL-3-Gens

Für die Klonierung eines Teils des nCL-3-Gen wurde genomische DNA aus Mauszellen ES E14 verwendet. Die Sequenz dieses Teils wird in SEQ ID NO 5 (Position 102 der ermittelten Sequenz kann anstelle des G auch ein C sein) wiedergegeben. Es wurden die 5'-3' (= Vor wärts) und 3'-5' (= Rückwärts)-Sequenzen der Primer CAL6 und CAL9 (siehe Tabelle 1) sowie folgende PCR-Bedingungen (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Kapitel 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff) für die Klonierung verwendet, wobei das Reaktionsvolumen des An satzes 50µl betrug:

250 ng Vorwärts-Primer
250 ng Rückwärts-Primer
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9,0
1 µl genomische DNA
2 Units Taq Polymerase.

Es wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 48°C und 2 Minuten die Temperatur auf 72°C gehalten wurde. Das endstandene Fragment wurde in den Vektor pBluescript (SK+), linearisiert mit dem Enzym EcoRV, einkloniert (siehe Hol ton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19., No. 5, 1156ff.). Mit dem pBluescript-Vektor mit dem einklonierten Fragment wurde der Escherichia coli Stamm DH10B entsprechend Maniatis et al. transformiert (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Ma niatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Band 1, Kapitel 1, 74-84, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff).

Beispiel 2: Klonierung des nCL-3-Gens

Für die Klonierung und Sequenzierung der vollständigen cDNA-Se quenzen des nCL-3 und nCL-3'-Gens (siehe SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3) wurde Doppelstrang cDNA, die aus Maus Balb/c Tag 12 Embryonen mRNA hergestellt worden war (Synthese wie unter Beispiel 3 be schrieben) mit einem spezifischen Adapter-Molekül versehen, das blunt-end an die cDNA legiert wurde. Dieses Adapter-Molekül diente als Primer-Bindungsstelle. Das Adapter-Molekül hat fol gende Sequenz 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' und enthält eine T7-Promoter-Sequenz sowie Schnittstellen für NotI, SrfI und XmaI. Als Primer für die Adaptorsequenz wurden die beiden Primer 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 und 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' verwendet.

Die cDNA wurde mit Hilfe des folgenden Primers 5'-TTCTAGAATTCAGCGGCCGC(T)₃₀N₁N-3' (N1=G, A oder C; N=G, A, C oder T, degenerativer Nucleotidanker am Ende des Poly-A-Schwan zes, Adapter enthält Schnittstellen für EcoRI und NotI) syntheti siert.

Mit Hilfe der aus der ursprünglich erhaltenen 29/30-Sequenz (siehe Beispiel 1) wurden genspezifische, in den Exons gelegene Oligonukleotide abgeleitet und als weitere Primer wie in Bei spiel 1 beschrieben zur PCR-Reaktion verwendet. Die Klonierung der Gene erfolgte schließlich nach einem Protokoll von der Firma Clontech (siehe Clontech, Marathon-Ready^TM cDNA, User Manual PT1156-1, Version # PR64097, Seite 4, 5, 44 und 45).

Beispiel 3: Expression des nCL-3-Gens in verschiedenen Mausgewe ben

Für die Expression wurde mRNA aus dE12 Embryonen und aus Haut-, Niere-, Herz-, Lunge-, Gehirn-, Thymus- und Dünndarmgewebe der Maus isoliert. Für die Extraktion der mRNA wurden die Gewebe in flüssigem Stickstoff dispergiert und in 10 ml einer Lösung aus 4 M Guanidinium-Isothiocyanat, 25 mM NaCitrat, 0,5% Sarcosyl und 72 µl 2-Mercaptoethanol resuspendiert. Anschließend wurden 1 ml NaAcetat (pH 4,0), 10 ml wassergesättigtes Phenol und 2 ml Chlo roform unter Mischen zugegeben. Die Proben wurden 20 Minuten in zentrifugiert (5000 × g, 4°C). Der Niederschlag wurde verworfen. Aus dem Überstand wurde die RNA mit einem Volumen Isopropanol bei -20°C (mindestens eine Stunde Fällung) ausgefällt und erneut für 30 Minuten (19000 × g, 4°C) zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 300 µl resuspendiert und erneut mit NaAcetat/Ethanol in der Kälte gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen und in 160 µl Wasser gelöst. Anschließend wurde die mRNA-Konzentration bei 250 nm im Photometer und in einem Agarosegel mit einer 5 µl mRNA-Probe ge gen eine Referenz bestimmt.

Über RT-PCR, in dem ausgehend von der isolierten mRNA zunächst eine cDNA-Kopie mit Hilfe der Reversen Transcriptase erstellt wurde, wurde mit Hilfe der folgenden zwei Primer

a) Vorwärtsprimer 5'-tagctcgagtggacgtaatcgtcgatgac-3'
b) Rückwärtsprimer 5'-tagctcgagtgctgtaggctgtgcatacg-3'

die Expression des nCL-3-Gens in den verschiedenen Mausgeweben bestimmt (siehe

Fig.

1).

Die cDNA wurde nach einem Protokoll von der Firma GIBCO wie folgt hergestellt:
Zu 5 µg mRNA (isoliert nach der oben beschriebenen Methode) wur den 2 µl oligo(dT) und 12 µl DEPC dH₂O gegeben. Dieser Ansatz wurde 10 Minuten bei 70°C inkubiert und anschließend auf Eis ge stellt. Zur Probe wurden in der angegebenen Reihenfolge 2 µl 10 × Puffer, 2 µl 25 mM MgCl₂, 1 µl 10 mM dNTPs, 2 µl 0,1 M DTT gegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei 23°C wurde 1 µl Super script Reverse Transcriptase hinzugegeben und das ganze 10 Min. bei 25°C, 50 Min. bei 42°C und 15 Min. bei 70°C weiter inku biert. Danach wurde 1 µl RNAse H zugegeben und 20 Min. bei 37°C inkubiert, danach wurden 79 µl H₂O zugegeben. Die Reaktion wurde für weitere 15 Min. bei 70°C durchgeführt. 1 µl dieser cDNA 5 wurde für die RT-PCR-Reaktion verwendet.

Die PCR-Reaktion für den Nachweis der Expression von nCL-3 wurde wie folgt durchgeführt, wobei das Reaktionsvolumen 50 µl betrug:

250 ng Vorwärts-Primer
250 ng Rückwärts-Primer
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9,0
1 µl cDNA
2 Units Tag Polymerase.

Es wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 58°C und 1 Minute die Temperatur auf 72°C gehalten wurde.

In den getesteten Geweben zeigte sich, daß nCL-3 in den dE12-Em bryonen exprimiert wird. nCL-3 wird auch in der Haut, der Niere, dem Herz, der Lunge und im Thymus exprimiert. Im Gehirn und im Dünndarm ist die Expression schwächer als in den vorgenannten Or ganen (in Abb. 1 nicht zu sehen). Als interner Standard wurde hprt (= Hypoxanthin-phosphor-ribosyl-transferase) verwendet.

4. Beispiel: Cathepsin B-Test

Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-40 bestimmt.

Zu 88 µl Cathepsin B ( Cathepsin B aus menschlicher Leber (Calbio chem), verdünnt auf 5 Units in 500 µM Puffer) werden 2µL einer Inhibitor-Lösung, hergestellt aus Inhibitor und DM50 (Endkonzen trationen: 100 µM bis 0,01 µM). Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) vorinkubiert und anschließend die Reak tion durch Zugabe von 10 µL 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10% DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nM im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC₅₀ bestimmt.

5. Beispiel: Calpain-Test

Die Aktivität der Calpain Inhibitoren wurde in einem colori metrischen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Substrat untersucht. Der Test wurde in der Mikrotiterplatte, ent sprechend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochemistry 208, 387-392 (1993), durchgeführt. Als Enzym wurde 29/30, welches in einem der oben beschriebenen Systemen exprimiert und anschließend gereinigt wurde, verwendet. Die Sub stanzen wurden mit dem Enzym für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1% des Lösungsmittels DM50 nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farb reagenz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50%ige Aktivität des Enzyms ergibt sich aus den optischen Dichten, die bei der maxi malen Aktivität des Enzyms ohne Inhibitoren und der Aktivität des Enzyms ohne Zugabe von Kalzium bestimmt wurden.

6. Beispiel: Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivität von Calpain-Inhibitoren

Der Calpain-vermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von Zhaozhaoli et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 3472-3480 beschrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 10⁷ Zellen/ ml eingestellt.

Plättchen (0,1 ml) werden für 5 Minuten mit 1 µl an verschiedenen Konzentrationen an Inhibitoren (gelöst in DM50) vorinkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 µM im Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inkubation von 5 Minuten bei 37°C. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C gekocht und die Proteine in einem 8%igen Gel aufgetrennt. Der Abbau der beiden Proteine Act in bindendes Protein (ABP) und Talin wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt, da nach der Zugabe von Kalzium und Ionophor diese Proteine verschwanden und eine neue Bande im Bereich von 200 Kd Molekulargewicht ent stand. Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität bestimmt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. nCL-3-Calpaingen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sowie seine al lelischen Varianten, Analoge oder Derivate.

2. nCL-3-Calpaingen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analogen um eine verkürzte Gensequenz handelt.

3. Genkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen funktionell mit einem oder mehreren Regulations signalen zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft ist.

4. Aminosäuresequenz codiert durch das nCL-3-Gen gemäß Anspruch 1.

5. Verfahren zur Identifizierung von Calpaininhibitoren, wobei man ein Calpain codiert durch eine Sequenz gemäß Anspruch 1 aus Geweben oder Zellen, in denen das Enzym nCL-3 exprimiert wird, isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Sub strats des Enzyms nCL-3 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Testsubstanzen mißt und die Test substanzen auswählt, die mindestens gegen eines der Calpaine eine inhibierende Wirkung zeigen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym nCL-3 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym nCL-3 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß man die Testsubstanzen auswählt, die in zellulären Systemen die Zellmembran passieren.

9. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nCL-3, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Kopie der Gensequenz für nCL-3 in einen Vektor kloniert und in einem dem Vektor entsprechenden Wirtsorganismus das Gen für das Enzym nCL-3 exprimiert und anschließend das Enzym aus dem Wirtsorganismus isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vektor verwendet der in Bakterienzellen, pilzlichen und/oder tierischen Zellen die Expression des Gens für nCL-3 ermöglicht.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtsorganismus Bakterien, pilzliche oder tierische Zellen verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 9 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektor Baculoviren und als Wirtsorganismus Insektenzellen verwendet.

13. Verwendung eines Calpaininhibitors identifizierbar gemäß den Ansprüchen 5 bis 8 zur Herstellung von Medikamenten zur Be handlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.

14. Verwendung eines Calpaininhibitors nach Anspruch 13 zur Her stellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten aus gewählt aus der Gruppe der kardiovaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neurologischen, neurodegenera tiven, oder onkologischen Erkrankungen.

15. Verwendung des Calpains nCL-3 gemäß Anspruch 4 in Screening-Testsystemen.

16. Verwendung des Calpains nCL-3 gemäß Anspruch 4 zur Her stellung von Antikörpern.

17. Verwendung einer Gensequenz gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von antisense mRNA.

18. Verwendung der antisense mRNA nach Anspruch 17 zur Her stellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.