FR2826656A1 - Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode - Google Patents
Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode Download PDFInfo
- Publication number
- FR2826656A1 FR2826656A1 FR0108614A FR0108614A FR2826656A1 FR 2826656 A1 FR2826656 A1 FR 2826656A1 FR 0108614 A FR0108614 A FR 0108614A FR 0108614 A FR0108614 A FR 0108614A FR 2826656 A1 FR2826656 A1 FR 2826656A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- peptide
- calpain
- fluorogenic
- molecule
- fret
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 21
- 108030001375 Calpain-3 Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000046744 Calpain-3 Human genes 0.000 claims abstract 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 36
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 30
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 30
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims description 25
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 25
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- 201000009564 autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy type 2A Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 208000037148 Calpain-3-related limb-girdle muscular dystrophy R1 Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 102100032539 Calpain-3 Human genes 0.000 description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 23
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 12
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 description 2
- 102000004726 Connectin Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OTMNDJSZWCOSAK-UHFFFAOYSA-N 1-n'-naphthalen-1-ylethane-1,1-diamine Chemical group C1=CC=C2C(NC(N)C)=CC=CC2=C1 OTMNDJSZWCOSAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 102000003895 Calpain-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000236 Calpain-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003900 Calpain-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000232 Calpain-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 201000009342 Limb-girdle muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910000020 calcium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 calcium-activated cysteine Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000022 magnesium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014824 magnesium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002370 magnesium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002235 sarcomere Anatomy 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001407 sodium bicarbonate Drugs 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Peptide couplé à au moins une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3.Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
METHODE DE DETECTION DE L'ACTIVISTE DE LA CALPAINE 3 DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET PEPTIDES POUR LA MISE EN OEUVRE DE LADITE METHODE L'invention concerne une méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique constitué soit de cellules, soit de lignées cellulaires, soit de tissus. Elle se rapporte également aux peptides destinés à être utilisés dans ladite méthode. L'invention a également pour objet l'utilisation desdits peptides pour le diagnostic in vitro de la dystrophie des ceintures type 2A. Elle concerne par ailleurs une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert du gène de la calpaine 3 dans des cellules animales ou humaines in vitro mais également chez l'animal in vivo. Elle a aussi pour objet une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 constitue enfin un moyen d'étudier la fonction de la calpaine 3.
Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles doivent vraisemblablement réguler des fonctions cellulaires importantes. En particulier, les calpaïnes ubiquitaires ont été impliquées dans l'apoptose [Squier, 1994], la différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires
[Yamaguchi, 1994] ; [Schollmeyer, 1986] ; [Balcerzak, 1995]. La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique [Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A [Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose régénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène situé sur le chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3,5kb, lui-même codant pour
[Yamaguchi, 1994] ; [Schollmeyer, 1986] ; [Balcerzak, 1995]. La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique [Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A [Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose régénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène situé sur le chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3,5kb, lui-même codant pour
<Desc/Clms Page number 2>
une protéine de 94kDa. Il a été démontré que la calpaïne 3 pouvait se lier à la titine, protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région IS2 et qu'elle subissait une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle elle est exprimée dans les cellules Cos7 [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette région comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine peut être localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. Il a par ailleurs été montré que la calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3 semble aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante trophique du muscle (cachexie, etc...).
Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des mutations apparaissant sur le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à une inhibition de la protéolyse de la calpaine 3 présente dans le muscle squelettique. Le diagnostic clinique de la LGMD 2A est très difficile puisque les patients présentent des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies. Le diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes méthodes.
La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le gène de la calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où le gène est relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes et qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.
Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide d'anticorps spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon, cela ne signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la mutation sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations sur un autre gène que celui de la calpaine.
<Desc/Clms Page number 3>
En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention n'est pas tant de détecter la présence de la calpaine 3 dans un échantillon biologique mais plutôt celui de détecter son activité.
Guttman et al. décrivent dans le document Methods in molecular biology vol 144, ch 18, une méthode de mesure de l'activité de calpaine ubiquitaire consistant à mettre une calpaine purifiée au contact d'un peptide non spécifique fluorescent (Succ-LLVYAMC), puis de mesurer la variation de fluorescence apparaissant lorsque la molécule est clivée. Dans une seconde méthode, on met en contact la calpaine avec la protéine TAU entière, puis on effectue un Western blot. En aucun cas ce document ne concerne spécifiquement la calpaine 3. De plus, les substrats sont, soit non spécifiques (substrat de la m-calpaine et la Il-calpaine), soit des protéines entières.
Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un nouveau substrat spécifique de la calpaine 3 qui puisse être utilisé pour détecter l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.
Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un peptide couplé à au moins une molécule rapportrice fluorogénique ou colorogénique, ledit peptide se caractérisant en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3.
Compte tenu des propriétés autolytiques de la calpaine 3, le peptide de l'invention contient avantageusement au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10.
Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression"site d'autolyse", on désigne une séquence d'acides aminés contenue dans la calpaine 3 susceptible d'être clivée par la calpaine 3 en au moins deux peptides ainsi que toute séquence dérivée.
<Desc/Clms Page number 4>
En pratique, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse est choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS, NMDNSLL, PVQYETR dénommées dans la suite de la description respectivement site 1, site 2 et site 3. Ces sites sont identiques dans toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaine 3 est connue à ce jour (homme, souris, rat,).
Pour permettre de détecter ultérieurement l'activité de la calpaine par colorimétrie ou fluorimétrie, le peptide de l'invention, comme déjà dit, est couplé à une molécule rapportrice colorogénique ou fluorogénique.
Lorsque la molécule rapportrice est une molécule colorogénique, le clivage de la séquence d'acides aminés par la calpaine 3 sera détecté au spectrophotomètre par l'apparition d'un composé coloré. En pratique, le composé coloré utilisé est le paranitroanilide. Il peut également s'agir de thioesters.
Lorsque le peptide est couplé à un composé fluorogénique, la coupure est détectée par un changement de l'émission fluorescente. Dans ce cas, et en pratique le composé fluorogénique utilisé est le méthyl 4 coumarilamide 7 (MCA) ou le naphtilamide. Le naphtilamide et l'amino 7 fluorométhylcoumarylamide 3 peuvent être utilisés en tant que substrat colorogénique ou fluorogénique.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide clivable par la calpaine 3 est couplé à ses deux extrémités par deux composés fluorogéniques, la coupure étant détectée par un changement de l'émission fluorescente d'un premier composé (molécule donneuse) dû à l'éloignement, secondairement à la coupure, d'un second composé (molécule accepteuse) situé de l'autre côté du peptide et qui absorbe la fluorescence du premier lorsque ceux-ci sont proches. Cette technique est bien connue sous le nom de FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) (Fôrster, 1948). Plus précisément, le FRET est un phénomène physique qui peut intervenir entre deux molécules fluorescentes dans certaines conditions : les deux molécules doivent être suffisamment proches l'une de l'autre (moins de 100 A) et le spectre d'émission d'une des molécules (la molécule donneuse) doit recouvrir le spectre d'excitation de la
<Desc/Clms Page number 5>
deuxième molécule (la molécule accepteuse). Ainsi, lorsque la molécule donneuse est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie plus élevé.
En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu sous différentes formes (chaleur...). Si la molécule donneuse est dans une orientation optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être transférée à cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon ni nécessité de collision entre les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la lumière à sa propre longueur d'onde d'émission. Lorsque le peptide est clivé, l'énergie n'est plus absorbée et la molécule donneuse émet de la fluorescence. L'augmentation de la fluorescence correspond donc à une activité mesurable de clivage du peptide. La molécule rapporteuse fluorogénique peut être une molécule synthétique obtenue par synthèse chimique ou une protéique permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Dans une première forme de réalisation, le peptide présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
Dans une seconde forme de réalisation, le donneur est l'acide 5- [ (2' aminoéthyl)- amino] naphtalène sulfonique (EDANS) et l'accepteur est l'acide 4- [ [4'- (diméthyl amino] phényl] azo] benzoïque (DABCYL).
Dans tous les cas qui précèdent, le peptide de l'invention couplé à la molécule colorogénique ou fluorogénique est obtenu par synthèse chimique.
Comme déjà dit, la molécule rapporteuse peut être également une protéine permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Dès lors et dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée.
La GFP ( Green Fluorescent Protein ) est une protéine de 27 kDa qui est synthétisée par une méduse du Pacifique (Aequora Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu être purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être clonée en
<Desc/Clms Page number 6>
phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde ses propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une étude aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est liée, comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines mutations de la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999]. En particulier, les protéines CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP, pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène de FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (la molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).
Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie d'activation à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 nm. Les séquences correspondant aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc clonées entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la calpaine 3 en produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP sera reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.
L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code pour les peptides suivants : CFP-sitel-YFP ; CFP-site 2- YFP ; CFP-site 3-YFP L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule
<Desc/Clms Page number 7>
hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le Demandeur, directement dérivé du plasmide décrit dans [Vanderklish 2000]. Elle se rapporte également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide précédemment décrit, dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est effectuée sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un extrait cellulaire, les cellules étant d'origine animale ou humaine, soit d'un tissu.
Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le peptide peut se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est mis directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des propriétés de perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du peptide sera déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second mode de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes transfectées par un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de l'invention, les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le peptide est simplement mis au contact dudit extrait.
La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement sur coupes de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par exemple biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de l'isopentane
<Desc/Clms Page number 8>
refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à-80 C jusqu'à utilisation. Des coupes de 5 ai 5 am sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de verre. Les coupes sont conservées aussi à-80 C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. La détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant directement le peptide sur la lame.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène de FRET se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et le phénomène de FRET est alors diminué.
La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.
L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents.
Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste : - à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'invention, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.
L'échantillon biologique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits cellulaires ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le peptide est ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait cellulaire ou
<Desc/Clms Page number 9>
tissulaire) avec le peptide. En pratique, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste : - à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention, - puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.
Dans ce cas, l'échantillon biologique est constitué de cellules ou de lignées cellulaires transfectées avec un vecteur comprenant la séquence d'ADN codant pour le peptide de l'invention, dans l'hypothèse où la molécule rapporteuse est d'origine protéique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et la méthode consiste à : a/préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide, b/mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, cl mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, d/mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, e/conclure à la présence : d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/est supérieur au taux de FRET mesuré en d/ d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/est égal au taux de FRET mesuré en d/
<Desc/Clms Page number 10>
L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant : - tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec un plasmide codant pour la calpaine 3, - puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention soit in vitro, soit in vivo, - puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les technique de transfection précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas d'avantage détaillés.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées.
Figure 1 : Séquence partielle de la calpaine 3 ; la position des sites d'autolyse est indiquée par les flèches ; les séquences utilisées dans les peptides sont soulignées et sont identiques chez toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaïne 3 est connue à ce jour (homme, souris, singe, rat, boeuf).
Figure 2 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant au site d'autolyse 1,2 et 3 de la calpaïne 3 (courbes A, B et C, respectivement) par les calpaïnes 1 (colonne de gauche) et 2 (colonne de droite) recombinantes Figure 3 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de cellules C2C12 transfectées ou non avec un plasmide codant pour la calpaïne 3.
<Desc/Clms Page number 11>
Figure 4 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-).
Figure 5 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage du peptide correspondant au site 3 d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myotubes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 6 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 7 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de quadriceps de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 8 : portion de séquence du plasmide pTOM. Les acides aminés en italique font partie de la séquence de EYFP. Les acides aminés en gras font partie de celle de ECFP. Le codon STOP de EYFP a été éliminé dans le vecteur pTOM. Les bases en italique et en gras montrent les phases des séquences de EYFP et ECFP, respectivement. Les bases en soulignées correspondent au fragment qui a été éliminé pour construire le vecteur pTOMp. Les séquences protéiques A et B correspondent à la traduction du vecteur pTOM à partir de l'ATG de la séquence codante de EYFP, respectivement avant et après élimination du fragment double-brin situé entre les sites de restriction Eco13611 et seal. Dans la séquence A, les séquences codant pour EYFP et ECFP ne sont pas en phase. Elles le sont dans la séquence B.
Figure 9 : A : Migration sur gel d'agarose des produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOMp. Les PCR ont été effectuées avec les
oligonucléotides midEYFP. a et midECFP. m. B : Migration de ces produits de PCR après digestion par ECORI ; Puits n l : échelle lkb ; n 2 : pTOM ; n 3 : pTOM après digestion par EcoRI ; n 4 à n09 : migration des produits de PCR du gel A après digestion par EcoRI ; leur taille est toujours de 800pb.
oligonucléotides midEYFP. a et midECFP. m. B : Migration de ces produits de PCR après digestion par ECORI ; Puits n l : échelle lkb ; n 2 : pTOM ; n 3 : pTOM après digestion par EcoRI ; n 4 à n09 : migration des produits de PCR du gel A après digestion par EcoRI ; leur taille est toujours de 800pb.
Figure 10 : site de clonage sur le vecteur pTOM (lOa) et séquence des oligonucléotides codant pour les sites d'autolyse de la calpaïne 3 (lOb, 10c, lOd). Chaque couple d'oligonucléotides complémentaires est composé d'un oligonucléotide
<Desc/Clms Page number 12>
dont le nom se termine par . a et d'un oligonucléotide dont le nom se termine par . m.
Figure 11 : Migration sur gel d'agarose de produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOM et l'insert codant pour le site 2 d'autolyse ; la PCR a été réalisée avec les oligonucléotides SGp94S2. a et midECFP. m.
Figure 12 : carte de restriction du plasmide pTOM Figure 13 : carte de restriction du plasmide pTOMsl, pTOMs2, TOMs3 I/TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAÏNE 3 À PARTIR D'EXTRAITS PROTÉIQUES : Le clivage de peptides synthétiques correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 (Figure 1) permet la détection de son activité à l'aide d'une technique faisant intervenir le FRET.
A/Matériel et méthode 1/Fluorimètre : SpectraMax Gemini XS Microplate fluorometer (Molecular Devices).
2/Séquence des peptides fluorescents : Mca-NMTYGTS-Dnp (site 1) Mca-NMDNSLL-Dnp (site 2) Mca-PVQYETR-Dnp (site 3) 3/Références des enzymes commerciales et des inhibiteurs utilisés : calpaïne 1 : Human eryhtrocytes (Calbiochem) calpaïne 2 : Rat, recombinant, E. coli (Calbiochem) caspase 3 : Human, recombinant, E. coli (Calbiochem) 4/Conditions de réaction :
Volume final de 200il ; calcium (CaCI2) 10mM final ; peptides fluorescents 1, 9uM final.
Volume final de 200il ; calcium (CaCI2) 10mM final ; peptides fluorescents 1, 9uM final.
5/Détection de la fluorescence : La réaction se fait à 37 C, soit sur une heure (avec dans ce cas une mesure de fluorescence toutes les 50 secondes) ou sur 6 heures (mesure toutes les 2 minutes).
<Desc/Clms Page number 13>
Le milieu est agité entre chaque mesure. Les longueurs d'onde utilisées pour la détection de la fluorescence des peptides sont :
Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325nm.
Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325nm.
- Longueur d'onde d'émission de Dnp : 392nm.
6/Mise au point des tampons Dans un premier temps, les conditions de réaction ont été mises au point, et en particulier la composition du tampon de réaction. Effectivement, la détection de la fluorescence s'est révélée y être très sensible. Les premiers tests ont consisté à faire varier les différents composants du tampon et leur concentration. Différentes concentrations en NaCl ont été testées. L'importance d'une faible concentration en DMSO, dans lequel sont resuspendus les peptides, a été démontrée. Il a également été montré que la présence du CHAPS dans le milieu de réaction, ainsi que de la BSA permettait une détection optimale de la fluorescence. Pour être certain d'activer la calpaïne 3, les réactions se font à 37 C, en présence de 10mM de calcium.
Effectivement, la calpaine 3 est active lorsqu'elle est en présence de concentrations en calcium de l'ordre du nanomolaire.
Composition des tampons : Tampon de resuspension des calpaïnes commerciales : NaCl 100mM, EDT A 5mM, TrisHCI 50mM, Bmercaptoéthanol 5mM, glycérol 40%, pH=7,8. Conservation à température ambiante.
Tampon de resuspension des peptides fluorescents : Les peptides sont resuspendus à Img/ml dans du DMSO 100%. Conservation à 4 C, à l'abri de la lumière.
Tampon de réaction : NaCl 100mM, HEPES 50mM, DIT 1 OmM, EDT A ImM, glycérol 10%, CHAPS 0,1%, BSA lOOng/ul, pH=7,4, filtration. Conservation à température ambiante.
7-Culture des cellules eucaryotes : Lignées cellulaires utilisées : C ; C12 : Myoblastes murins ; Milieux utilisés : DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour C2C12 : DMEM + 10% SVF
<Desc/Clms Page number 14>
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0, 5uM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
8-Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes : Matériel : L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-Cl (Clontech).
Méthodes : 1er jour : Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.
2 jour : Dans un premier tube stérile en polystyrène (Tl), déposer 94 p. l de milieu sans sérum de veau foetal.
Ajouter à chaque tube Tl 6 u. l de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 lug de plasmide EndoFree.
Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl) +milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37 C/7% Cozy Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
<Desc/Clms Page number 15>
9/Protocole de lyse cellulaire : Principe : Les cellules animales, transfectées ou non, sont lysées dans le but de préparer des extraits protéiques les propriétés pourront être étudiées.
Méthode : Éliminer le milieu de culture des puits et laver les puits au PBS (Solution de Dulbecco tamponnée au phosphate (sans calcium, ni magnésium, ni bicarbonate de sodium)Gibco BRL)
Récolter les cellules et les centrifuger à 500g pendant 10 min à 4 C.
Récolter les cellules et les centrifuger à 500g pendant 10 min à 4 C.
Éliminer le surnageant et reprendre les cellules dans le tampon de lyse (50mM HEPES, 1mM DTT, O, lmM EDTA, 0,1% CHAPS, pH=7,4) à raison de 700its de tampon de lyse par puits.
Laisser agir à 4 C pendant 5 minutes. Centrifuger à 10000g/10 minutes/4 C.
Récupérer le surnageant et conserver à-20 C.
10-Protocole de lyse tissulaire : Principe : Les muscles sont broyés dans le but de préparer des extraits protéiques dont on pourra ensuite étudier les propriétés.
Matériel : Quadriceps de souris normales et de souris déficientes en calpaïne 3.
Méthode : Broyer les muscles dans l'azote liquide.
Resuspendre dans le tampon de lyse (cf. composition dans le protocole de lyse cellulaire plus haut) à raison de zu de tampon de lyse par milligramme de tissu broyé.
Centrifuger à 10000g pendant 10 minutes à 4 C.
Récupérer le surnageant et conserver à-20 C B/Test de la spécificité du clivage des peptides "sites d'autolyse" par la calpaïne 3 Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à ses sites d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site 1, site 2, site 3) ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les calpaïnes
<Desc/Clms Page number 16>
ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaïnes 1 et 2 n'ont pas d'activité de clivage sur chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles"peptide sans enzyme"se superposent aux courbes"peptide + enzyme"Des résultats analogues ont été obtenus avec une autre protéase, la caspase 3.
On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules musculaires en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne 3 pouvait cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules C2C12 en transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Une transfection témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le plasmide codant pour la calpaïne 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est inférieure à 10%. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les sites d'autolyse (Figure 3).
Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de fluorescence, ce qui pourrait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne 3 est une protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les extraits de cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut être détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et 2. En revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les cellules transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible pourcentage de cellules transfectées.
On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires déficientes ou non en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la calpaïne 3 pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées [Richard, 2000].
Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3 (cellules-/-) peuvent donc être comparées à des extraits de cultures de cellules musculaires normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des cellules non différenciées (myoblastes) (Figure 4).
<Desc/Clms Page number 17>
Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage pouvait être détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et-/-est cependant très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2. Une activité de clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est visible entre cellules +/+ et cellules-/-.
Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante entre des extraits +/+ et des extraits-/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des extraits de cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est en effet théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes.
Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans les extraits de cellules-/-est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce qui est
étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules-/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.
étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules-/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.
Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre extraits de cellules +/+ et de cellules-/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au lieu de Ih (Figure 6) L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des extraits de cellules +/+ que dans des extraits de cellules-/-. L'augmentation d'activité sur le site 3 est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus importante dans des extraits de cellules-/-que dans des extraits de cellules +/+. Ces expériences permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité de clivage sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et-/-.
Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de souris déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats de quadriceps (Figure 7).
L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus importante
que celle des extraits de tissus-/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus-/-est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont
que celle des extraits de tissus-/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus-/-est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont
<Desc/Clms Page number 18>
similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une plus forte activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente est confirmée.
Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont l'activité est activée en absence de calpaïne 3.
IF TEST D'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 EN CELLULES N Matériel et méthode Clonage ge d'oligonucléotides dans le vecteur d'expression pTOM Principe : Deux oligonucléotides complémentaires sont mis en présence de manière à former des séquences double-brin correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3.
Les oligonucléotides sont choisis de telle façon que leur appariement forme à chaque extrémité des sites de restriction. Ces fragments sont clonés dans le vecteur d'expression pTOM digéré au préalable par des enzymes de restriction.
Matériel : Oligonucléotides : site 1, site 2, site 3 Enzymes de restriction : Hl, BspEl, SmaI (BioLabs) ; Ecl136II (Fermentas).
Souches bactériennes utilisées : SCS110 : bactéries dam-stro (Stratagene) ; XLl-Blue (Stratagene).
Vecteur plasmidique : pTOM (Généthon) (figure 12).
Méthodes : Hybridation des deux oligonucléotides complémentaires : Les oligonucléotides simple-brin complémentaires sont mis en présence l'un de l'autre à raison d'une concentration de 20nglJ. final chacun dans le tampon SYBR Green PCR Buffer (Applied Biosystems). L'hybridation se fait dans l'appareil ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) selon les conditions suivantes : 95 C/lmin- > 90 C/30sec - > 85 C/30sec- > 80 C/30sec- > 75 C/30sec- > 70 C/30sec- > 65 C/30sec- > 60 C/30sec- > 55 C/30sec. L'évolution de l'appariement est suivie au cours du temps grâce au logiciel Séquence Detector 1.6. 3.
Digestion du vecteur pTOM : Le vecteur pTOM est digéré par les deux enzymes BamHlet BspEl à 37 C pendant 2h pour chaque enzyme.
<Desc/Clms Page number 19>
Ligation des oligonucléotides dans pTOM : Dans le mélange de ligation, le rapport entre la quantité d'insert et la quantité de vecteur est de 3 (en moles). La réaction de ligation se fait en présence de la T4 DNA ligase (BioLabs) sur la nuit à 16 C.
Protocole de préparation des bactéries électrocompétentes : Ensemencer 15ml de LB+agent de sélection avec 10 l de bactéries conservées à- 80 C dans 20% de glycérol. Incuber 8 heures à 37 C sous agitation (300tpm environ) Ensemencer avec 2ml de préculture 200ml de LB+agent de sélection éventuel. Laisser pousser jusqu'à DO (600nm) =0, 5.
Tout le matériel à utiliser doit avoir été refroidi à 4 C au préalable.
Laisser reposer la culture dans la glace pendant 15 minutes puis la répartir à raison de 25ml par tube (8 tubes)
Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4 C.
Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4 C.
Éliminer les surnageant et reprendre doucement les culots dans 200 ml d'eau glacée (25ml par tube-8 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants et reprendre les culots dans 100 ml d'eau glacée (en regroupant les tubes 2 à 2 ; 4 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml de glycérol 10% (autoclave et conservé à-20 C) et regrouper les 4 volumes dans un seul tube ; centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 u. 1 de glycérol 10%, Aliquoter par 40 III en eppendorf, congeler à-80 C.
Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide témoin selon le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 108 colonies par microgramme de vecteur transformé.
Protocole de transformation : Ajouter 1/11 d'ADN ligué (== 0, 1 ng) à 40 ut de bactéries électrocompétentes, laisser en contact pendant 4 min. dans la glace.
Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gene pulser cuvette ; 0,2 cm) Conditions d'électroporation : 2500 V, 200 ohm, 25 uF.
Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure à 37 C pour permettre l'expression du gène de résistance à l'antibiotique.
<Desc/Clms Page number 20>
Étaler 20 l et 2001. li sur des boîtes de Pétri LB + kanamycine 1 Og/ml final Laisser pousser sur la nuit à 37 C.
Analyse des colonies : Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans lOOul LB + kanamycine à 1 Og/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les colonies, une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP. a et midECFP. m, soit le couple formé par un des oligos forward suivants :
Chaque oligonucléotide est SGp94S1. a CCGGAAGTGGCACGAACATG pour le sIte 1 spécifique d'un fragment SGp94S2. a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pourlesite2 double-brin cloné. Ils sont centres au niveau du site de SGp94S3. a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pourlesite- restriction BspEI.
Chaque oligonucléotide est SGp94S1. a CCGGAAGTGGCACGAACATG pour le sIte 1 spécifique d'un fragment SGp94S2. a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pourlesite2 double-brin cloné. Ils sont centres au niveau du site de SGp94S3. a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pourlesite- restriction BspEI.
... et Foligonucléotide reverse midECFP. m.
Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0, 8% + Bromure d'éthidium 0, 5ug/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un certain nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquencés avec Foligonucléotide midECFP. m.
2-Culture des cellules eucaryotes : Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins Milieux utilisés : DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10% SVF + 1% MEM Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10% SVF Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0, 5uM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
3-Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes : Matériel : L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-N1 (Clontech) ; pEYFP-Cl (Clontech).
<Desc/Clms Page number 21>
Méthodes : 1er jour : Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.
2èmejour : Dans un premier tube stérile en polystyrène (Tl), déposer 94 al de milieu sans sérum de veau foetal.
Ajouter à chaque tube Tl 6 ul de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 ug de plasmide EndoFree.
Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl) +milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37 C/7% CO2.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
B/Résultats Pour détecter l'activité protéolytique de la calpaïne 3 en cellules vivantes, on étudie le clivage de ses trois sites d'autolyse3 par phénomène de FRET.
Dans le but d'avoir un témoin FRET positifs, c'est-à-dire un plasmide codant pour une protéine chimère ECFP-EYFP ne pouvant pas être clivée par les calpaïnes et au sein de laquelle peut se produire un phénomène de FRET, on a dans un premier temps modifié le vecteur pTOM de façon à ce que les séquences codantes pour les deux protéines fluorescentes Enhanced-CFP (ECFP) et Enhanced-YFP (EYFP) qui se
<Desc/Clms Page number 22>
trouvent sur ce vecteur soient en phase. On a ensuite inséré entre ces séquences des fragments d'ADN codant pour les trois sites d'autolyse de la calpaïne 3. Nous avons ensuite vérifié que la protéine chimère produite pouvait réellement être clivée in vitro par les calpaines ubiquitaires. Enfin, ce clivage a été étudié en cellules par l'analyse d'images de fluorescence. Trois méthodes distinctes ont été utilisées pour cette analyse et, en particulier, pour celle du FRET.
1-Clonage d'un vecteur témoin et des vecteurs portant les fragments d'ADN codant pour les sites de clivage :
Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase : La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour ECFP et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à bouts francs, Ecl136II et SmaI (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une réaction de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et repiquage de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence du plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies repiquées ont pu ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion de ces produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec l'élimination du fragment Ecl136II-SmaI, a permis de confirmer que les colonies repiquées contenaient bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des produits de PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une avec l'autre.
Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase : La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour ECFP et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à bouts francs, Ecl136II et SmaI (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une réaction de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et repiquage de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence du plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies repiquées ont pu ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion de ces produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec l'élimination du fragment Ecl136II-SmaI, a permis de confirmer que les colonies repiquées contenaient bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des produits de PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une avec l'autre.
2 Clonage d'oligonucléotides codant pour des sites de clivage par la calpaïne 3 dans le vecteur d'expression pTOM : Pour faciliter le phénomène de FRET entre les deux protéines EYFP et ECFP, des acides aminés glycine et sérine ont été ajoutés de part et d'autre du site de clivage de façon à faciliter le rapprochement des deux protéines, les glycines facilitant la souplesse de la protéine chimère et les sérines augmentant sa solublité dans un milieu aqueux (Figure 10). La séquence des oligonucléotides est telle qu'ils forment des sites de restriction pour BspEl et BamHI à chaque extrémité lorsqu'ils sont appariés.
<Desc/Clms Page number 23>
Les bases marquées en gras souligné dans les séquences des oligonucléotides sont des bases qui ne modifient pas la séquence protéique mais qui sont différentes de la séquence génomique. Ces bases ont été modifiées de façon à limiter la formation de duplex de primers homologues, qui pourrait entraver la formation d'oligonucléotides double-brin. La modification des bases a également été faite en fonction de la fréquence d'utilisation des codons chez la souris.
Les sites de restriction utilisés pour le clonage sont des sites uniques. L'enzyme BspEl est inactive si le site de clonage est méthylé. Le clonage du vecteur pTOM destiné à recevoir les oligonucléotides double-brin a donc été fait dans des bactéries dont le gène codant pour la méthylase Dam est muté. Après digestion du vecteur par les enzymes BspEl et BamHI, ligation des oligonucléotides et électroporation, certaines colonies résistantes sont prélevées. La présence du plasmide est vérifiée par PCR avec midECFP. m et un oligonucléotide spécifique du site de restriction (figure 11).
Le séquençage sur certains clones positifs obtenus en PCR a permis de vérifier la présence des inserts dans pTOM, que ces inserts étaient bien en phase avec les séquences codant pour les protéines ECFP et EYFP et qu'il ne comportaient pas de mutations. Trois colonies contenant les trois plasmides clonés sont conservées. Les trois plasmides correspondent aux trois fragments d'ADN insérés : les trois sites de clivage de la calpaïne 3 (plasmides pTOMsl, pTOMs2 et pTOMs3) (figure13).
<Desc/Clms Page number 24>
BIBLIOGRAPHIE Sorimachi, H., Ishiura, S., Suzuki, K. (1997)."Structure and physiological function of calpains."Biochemistry Journal 328 : 721-732.
Squier, M. K. T., Miller, A. K. C., Malkinson, A. M., Cohen, J. J. (1994)."Calpain activation in apoptosis."J. Cell. Physiol. 159 : 229-237.
Kwak, K. B., Chung, S. S., Kim, O. M., Kang, M. S., Ha, D. B., Chung, C. H. (1993).
"Increase in the level of m-calpain correlates with the elevated cleavage of filamin during myogenic differentiation of embryonic muscle cell."Biochim. Biophys. Acta 1175 : 243-249.
Yamaguchi, R., Maki, M., Hatanaka, M., Sabe, H. (1994)."Unphosphorylated and tyrosine-phosphorylated forms of a focal adhesion protein, paxillin, are substrates for calpain II in vitro : Implications for the possible involvement of calpain II in mitosisspecific degradation of paxillin."FEBS lett. 356 : 114-116.
Schollmeyer, J. E. (1986)."Role of Ca2+ and Ca2±activated protease in myoblast fusion."Exp. Cell. Res. 162 : 411-422.
Balcerzak, D., Poussard, S., Brutis, J. J., Elamrani, N., Soriano, M., Cottin, P., Ducastaing, A. (1995)."An antisense oligodeoxyribonucleotide to m-calpain inhibits myoblast fusion."J. Cell. Scien. 108 : 2077-2082.
Sorimachi, H., Imajoh-Ohmi, S., Emori, Y., Kawasaki, H., Ohno, S., Minami, Y., Suzuki, K. (1989)."Molecular cloning of a novel mammalian calcium-dependent protease distinct from both m-and mu-type. Specific expression of the mRNA in skeletal muscle."J. Biol. Chem. 264 : 20106-20111.
Richard, I., Broux, O., Allamand, V., Fougerousse, F., Chiannilkulchai, N., Bourg, N., Brenguier, L., Devaud, C., Pasturaud, P., Roudaut, C., Hillaire, D., Passos-Bueno, M.-
<Desc/Clms Page number 25>
R., Zatz, M., Tischfield, J. A., Fardeau, M., Jackson, C. E., Cohen, D., Beckmann, J. S. (1995)."Mutations in the proteolytic enzyme, calpain 3, cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A."Cell 81 : 27-40.
Fardeau, M., Hillaire, D., Mignard, C., Feingold, N., Mignard, D., de Ubeda, B.,
Collin, H., Tomé, F. M. S., Richard, I., Beckmann, J. S. (1996). "Juvenile limb-girdle muscular dystrophy : clinical, histopathological, and genetic data from a small community living in the Reunion Island."Brain 119 : 295-308.
Collin, H., Tomé, F. M. S., Richard, I., Beckmann, J. S. (1996). "Juvenile limb-girdle muscular dystrophy : clinical, histopathological, and genetic data from a small community living in the Reunion Island."Brain 119 : 295-308.
Sorimachi, H., Toyama-Sorimachi, N., Saido, T. C., Kawasaki, H., Sugita, H., Miyasaka, M., Arahata, K., Ishiura, S., Suzuki, K. (1993)."Muscle-specific calpain, p94, is degraded by autolysis immediately after translation, resulting in disappearance from muscle."J. Biol. Chem. 268 : 10593-10605.
Sorimachi, H., Kimbara, K., Kimura, S., Takahashi, M., Ishiura, S., Sasagawa, N., Sorimachi, N., Shimada, H., Tagawa, K., Maruyama, K., Suzuki, K. (1995)."Muscle- specific calpain, p94, responsible for limb-girdle muscular dystrophy type 2A, associates with connectin through IS2, a p94-specific sequence."J. Biol. Chem. 270 : 31158-31162.
Guttman et al. Methods in molecular biology vol 144, ch 18 Fôrster, T. (1948)."Intermolecular energy migration and fluorescence. " Ann. Phys.
(Leipzig) 2 : 55-75.
Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. (1992)."Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein."Gene 111 : 229-33.
Ellenberg J, Lippincott-Schwartz J, Presley JF. (1999)."Dual-colour imaging with GFP variants."Trends Cell Biol. 2 : 52-6.
<Desc/Clms Page number 26>
Pollock, B., Heim, R. (1999)."Using GFP as FRET-based applications."Trends Cell Biol. 2 : 57-60 Richard, I., Roudaut, C., Marchand, S., Baghdiguian, S., Herasse, M., Stockholm, D., Ono, Y., Suel, L., Bourg, N., Sorimachi, H., Lefranc, G., Fardeau, M., Sébille, A., Beckmann, J. S. (2000)."Loss of calpain 3 proteolytic activity leads to muscular dystrophy and to perturbation ofthe IkBa/NF-kB pathway in mice."J Cell. Biol. 151 : 1583-1590.
Vanderklish, P. W., Krushel, L. A., Holst, B. H., Gally, J. A., Crossin, K. L., Edelman, G. M. (2000). Marking synaptic activity in dendritic spines with a calpain substrate exhibiting fluorescence resonance energy transfer. Proc Natl Acad Sci USA. ; 5 : 2253-8
Claims (19)
- 2/Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins un site d'autolyse de la calpaine 3, dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10.
- 3/Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce la séquence d'acides aminés des sites d'autolyse est choisie parmi les séquences suivantes : NMTYGTS, NMDNSLL, PVQYETR.
- 4/Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
- 5/Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la molécule rapporteuse est une protéine.
- 6/Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée 7/Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les GFP mutées sont respectivement la CFP et la YFP.
- 8/Séquence d'ADN codant pour le peptide objet de l'une des revendication 5 à 7.
- 9/Vecteur contenant la séquence d'ADN objet de la revendication 8 et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte.
- 10/Cellule hôte transformée par le vecteur objet de la revendication 9.<Desc/Clms Page number 28>
- 11/Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : - dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide objet de l'une des revendications 1 à 7, - dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
- 12/Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce la première étape consiste à transfecter des cellules hôtes avec le vecteur objet de la revendication 9.
- 13/Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que la première étape consiste à mettre le peptide objet de l'une des revendications 1 à 4 au contact d'un extrait cellulaire ou d'une coupe de tissu.
- 14/Méthode selon la revendication 11, caractérisé en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
- 15/Utilisation de la méthode objet de l'une des revendications 11 à 14, pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A.
- 16/Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3, ladite méthode consistant : - à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'une des revendications 1 à 7, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.<Desc/Clms Page number 29>
- 17/Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
- 18/Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3, ladite méthode consistant : - à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention, - puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.
- 19/Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et consiste à : a/à préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide, b/à mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, c/à mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, d/à mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3, e/à conclure à la présence : d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/est supérieur au taux de FRET mesuré en d/ d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/est égal au taux de FRET mesuré en d/<Desc/Clms Page number 30>
- 20/Méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant : tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec le gène de la calpaine 3, puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention in vitro, puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
- 21/Méthode selon la revendication 20, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0108614A FR2826656B1 (fr) | 2001-06-29 | 2001-06-29 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode |
US10/432,688 US20040180395A1 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | Method for detecting calpain3 activity in a biological sample and peptides for implementing said method |
PCT/FR2002/002178 WO2003002730A2 (fr) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode |
CA002429429A CA2429429A1 (fr) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode |
CNA028057309A CN1514878A (zh) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | 在生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法和实施该方法所用的肽 |
EP02755089A EP1399545A2 (fr) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite mehtode |
JP2003509092A JP2004520850A (ja) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | 生体試料のカルパイン3活性を検出する方法、および前記方法を実施するためのペプチド |
AU2002321389A AU2002321389B2 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-24 | Method for detecting calpain 3 activity in a biological sample and peptides for implementing said method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0108614A FR2826656B1 (fr) | 2001-06-29 | 2001-06-29 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2826656A1 true FR2826656A1 (fr) | 2003-01-03 |
FR2826656B1 FR2826656B1 (fr) | 2003-09-12 |
Family
ID=8864926
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR0108614A Expired - Fee Related FR2826656B1 (fr) | 2001-06-29 | 2001-06-29 | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040180395A1 (fr) |
EP (1) | EP1399545A2 (fr) |
JP (1) | JP2004520850A (fr) |
CN (1) | CN1514878A (fr) |
AU (1) | AU2002321389B2 (fr) |
CA (1) | CA2429429A1 (fr) |
FR (1) | FR2826656B1 (fr) |
WO (1) | WO2003002730A2 (fr) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4803976B2 (ja) * | 2003-07-09 | 2011-10-26 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 細胞内ip3測定用分子センサー |
FR2858177A1 (fr) * | 2003-07-28 | 2005-02-04 | Genethon | Utilisation du phenomeme fret, detecte par mplsm, pour le suivi in vivo d'evenements biologiques |
JP2007049943A (ja) * | 2005-08-18 | 2007-03-01 | Kyoto Univ | 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド |
FR2891544A1 (fr) * | 2005-09-30 | 2007-04-06 | Genethon Ass Loi De 1901 | Substrat proteique pour la detection de l'activite calpaine 3 |
FR2962041B1 (fr) | 2010-07-01 | 2012-07-27 | Genethon | Inhibiteurs de la calpaine 3 pour le traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies |
CN102154288B (zh) * | 2010-12-21 | 2012-12-19 | 山东农业大学 | 一种骨骼肌特异性capn3启动子及其应用 |
US20160102336A1 (en) * | 2013-03-04 | 2016-04-14 | The University Of Tokyo | Fluorescent probe for detecting activity of calpain |
CN104655596A (zh) * | 2013-11-18 | 2015-05-27 | 李捷 | 一种含红细胞血液样品的质量检测方法及检测试剂盒 |
MX2021016095A (es) * | 2019-06-24 | 2022-02-03 | Urteste S A | Nuevo marcador de diagnostico para cancer pancreatico. |
WO2022270607A1 (fr) * | 2021-06-24 | 2022-12-29 | 株式会社 東北テクノアーチ | Sondes fluorescentes |
CN115356314A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-11-18 | 暨南大学 | 基于荧光传感器的钙蛋白酶活性检测方法及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19650142A1 (de) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Basf Ag | Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung |
-
2001
- 2001-06-29 FR FR0108614A patent/FR2826656B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-06-24 AU AU2002321389A patent/AU2002321389B2/en not_active Ceased
- 2002-06-24 WO PCT/FR2002/002178 patent/WO2003002730A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2002-06-24 CN CNA028057309A patent/CN1514878A/zh active Pending
- 2002-06-24 EP EP02755089A patent/EP1399545A2/fr not_active Withdrawn
- 2002-06-24 US US10/432,688 patent/US20040180395A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-24 JP JP2003509092A patent/JP2004520850A/ja active Pending
- 2002-06-24 CA CA002429429A patent/CA2429429A1/fr not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19650142A1 (de) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Basf Ag | Neue Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
VANDERKLISH PETER W ET AL: "Marking synaptic activity in dendritic spines with a calpain substrate exhibiting fluorescence resonance energy transfer.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 97, no. 5, 29 February 2000 (2000-02-29), Feb. 29, 2000, pages 2253 - 2258, XP002194684, ISSN: 0027-8424 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2826656B1 (fr) | 2003-09-12 |
EP1399545A2 (fr) | 2004-03-24 |
WO2003002730A2 (fr) | 2003-01-09 |
CA2429429A1 (fr) | 2003-01-09 |
CN1514878A (zh) | 2004-07-21 |
WO2003002730A3 (fr) | 2003-12-11 |
AU2002321389B2 (en) | 2005-03-24 |
JP2004520850A (ja) | 2004-07-15 |
US20040180395A1 (en) | 2004-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Suzuki et al. | Calpain: novel family members, activation, and physiological function | |
Düsterhöft et al. | Extracellular juxtamembrane segment of ADAM17 interacts with membranes and is essential for its shedding activity | |
Molinari et al. | Calpain: a cytosolic proteinase active at the membranes | |
Dargelos et al. | Calcium-dependent proteolytic system and muscle dysfunctions: a possible role of calpains in sarcopenia | |
CA2208515C (fr) | Technique de production d'enzymes proteolytiques specifiques a l'encontre d'une sequence peptidique selectionnee | |
FR2826656A1 (fr) | Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode | |
Ma et al. | Mechanism of dephosphorylation of the SR protein ASF/SF2 by protein phosphatase 1 | |
Hoskins et al. | Clp ATPases and their role in protein unfolding and degradation | |
Brickner et al. | The Tlg SNARE complex is required for TGN homotypic fusion | |
Averna et al. | Changes in calpastatin localization and expression during calpain activation: a new mechanism for the regulation of intracellular Ca 2+-dependent proteolysis | |
Elgert et al. | A novel soluble guanylyl cyclase activator, BR 11257, acts as a non-stabilising partial agonist of sGC | |
Denault et al. | Ectodomain shedding of furin: kinetics and role of the cysteine-rich region | |
JP4920675B2 (ja) | ニューロトリプシン阻害剤とその判定 | |
Baba et al. | Effects of neutral salts and pH on the activity and stability of human RNase H2 | |
Urbani et al. | Multiple determinants influence complex formation of the hepatitis C virus NS3 protease domain with its NS4A cofactor peptide | |
McCartney et al. | An easy-to-use FRET protein substrate to detect calpain cleavage in vitro and in vivo | |
WO2007039699A2 (fr) | Substrat proteique pour la detection de l'activite calpaine 3 | |
US20040253728A1 (en) | New method | |
Thompson et al. | A conserved tyrosine residue of Saccharomyces cerevisiae leukotriene A4 hydrolase stabilizes the transition state of the peptidase activity | |
Xiao et al. | Roles of μ-calpain in cultured L8 muscle cells: application of a skeletal muscle-specific gene expression system | |
Hart et al. | Analysis of the NF-κB p50 dimer interface by diversity screening | |
Meyer et al. | The disintegrin and metalloprotease Meltrin from Drosophila forms oligomers via its protein binding domain and is regulated by the homeobox protein VND during embryonic development | |
Gerber et al. | Structural adaptation of the glycophorin A transmembrane homodimer to D-amino acid modifications | |
JP3095787B2 (ja) | IXa因子の触媒活性の測定方法 | |
Kumar et al. | Bile salt hydrolase, the member of Ntn‐hydrolase family: differential modes of structural and functional transitions during denaturation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TQ | Partial transmission of property | ||
CD | Change of name or company name | ||
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20070228 |