CA2429429A1 - Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode - Google Patents

Abstract

Peptide couplé à au moins une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3. Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.

Description

METHODE DE DETECTION DE L'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 DANS
UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET PEPTIDES POUR LA MISE EN
OUVRE DE LADITE METHODE
L'invention concerne une méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique constitué soit de cellules, soit de lignées cellulaires, soit de tissus. Elle se rapporte également aux peptides destinés à être utilisés dans ladite méthode. L'invention a également pour objet l'utilisation desdits peptides pour le diagnostic in vitro de la dystrophie des ceintures type 2A (LGMD 2A). Elle concerne 1o par ailleurs une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert du gène de la calpaine 3 dans des cellules animales ou humaines in vitro mais également chez l'animal in vivo.
Elle a aussi pour objet une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 constitue enfin un moyen d'étudier la fonction de la calpaine 3.
Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles doivent 2o vraisemblablement réguler des fonctions cellulaires importantes. En particulier, les calpaïnes ubiquitaires ont été impliquées dans l'apoptose [Squier, 1994], la différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires [Yamaguchi, 1994]; [Schollmeyer, 1986]; [Balcerzak, 1995].
La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à
cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique[Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A
[Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse 3o progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose regénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène situé sur le chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3,Skb, lui-même codant pour

2 une protéine de 94kDa. Il a été démontré que la calpaïne 3 pouvait se lier à
la titine, protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région ISZ et qu'elle subissait une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle elle est exprimée dans les cellules Cos7 [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette région comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine peut être localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. Il a par ailleurs été
montré que la calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3 semble aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante 1o atrophique du muscle (cachexie, etc...).
Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des mutations apparaissant sur le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à
une inhibition de la protéolyse de la calpaine 3 présente dans le muscle squelettique. Le diagnostic clinique de la LGMD 2A est très difficile puisque les patients présentent des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies.
Le diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes méthodes.
La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le gëne de la 2o calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où
le gène est relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes et qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.
Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide d'anticorps spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon, cela ne signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la mutation sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations sur un autre gène que celui de la calpaine.

3 En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention n'est pas tant de détecter la présence de la calpaine 3 dans un échantillon biologique mais plutôt celui de détecter son activité.
Guttman et al. décrivent dans le document Methods in molecular biology vol 144, ch 18, une méthode de mesure de l'activité de calpaine ubiquitaire consistant à
mettre une calpaine purifiée au contact d'un peptide non spécifique fluorescent (Succ-LLVY-AMC), puis de mesurer la variation de fluorescence apparaissant lorsque la molécule est clivée. Dans une seconde méthode, on met en contact la calpaine avec la protéine 1o TAU entière, puis on effectue un Western blot. En aucun cas ce document ne concerne spécifiquement la calpaine 3. De plus, les substrats sont, soit non spécifiques (substrat de la m-calpaine et la p-calpaine), soit des protéines entières.
Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un nouveau substrat spécifique de la calpaine 3 qui puisse être utilisé pour détecter l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.
Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un peptide couplé à au moins une molécule rapportrice fluorogénique ou colorogénique, ledit peptide se caractérisant en 2o ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Par "isoforme de la calpaine 3", on désigne toute protéine produite par le gène de la calpaine 3, résultant d'un événement alternatif du type promoteur alternatif ou épissage alternatif.
DariS tlll premier mode de réalisation et compte tenu des propriétés autolytiques de la calpaine 3, le peptide de l'invention contient avantageusement au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre d'acides 3o aminés est inférieur à 10.

4 Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression "site d'autolyse", on désigne une séquence d'acides aminés contenue dans la calpaine 3 ou un de ses isoformes susceptible d'être clivée par la calpaine 3 ou un de ses isoformes en au moins deux peptides ainsi que toute séquence dérivée.
En pratique, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL
(SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3) dénommées dans la suite de la description respectivement site 1, site 2 et site 3. Ces sites sont identiques dans toutes les espèces 1o pour lesquelles la séquence de la calpaine 3 est connue à ce jour (homme, souris, rat, ).
La séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 peut être également choisie païllll les séquences humaines suivantes VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ IDS), et les séquences mucines suivantes VAPRTG
AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).
Dans le mode de réalisation selon lequel le peptide de l'invention contient au moins un site d'autolyse d'une isoforme de la calpaine 3, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 présent chez le rongeur, rat, souris et est choisi parmi les séquences d'acides aminés suivantes NPYLLPGFFC (SEQ ID8) et TISVDRPVP (SEQ ID9).
Dans un second mode de réalisation, la séquence d'acides aminés clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat du type par exemple calpastatine, filamine, taline, calpaines ubiquitaires, cristalline, heat shock proteine, etc.
Avantageusement, les protéines substrat ont les séquences suivantes ;o REVTIPPKYRELL (SEQ ID10) (calpastatine humaine) KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11) (calpastatine souris et rat) PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12) (alpha-A-cristalline humaine) PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13) (alpha-A-cristalline souris et rat) KSTVLQQQYNR (SEQ ID 14) (taline humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession XP 045856 (filamine 2 humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 10809 (heat shock proteine 60

5 humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession NP 004355 (c/EBPbeta humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 17655 (m calpaine humaine) Dans un troisième mode de réalisation, le peptide contenant une séquence clivable par 1o la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3, est obtenu par criblage d'une banque de peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Pour permettre de détecter ultérieurement l'activité de la calpaine par colorimétrie ou fluorimétrie, le peptide de l'invention, comme déjà dit, est couplé à une molécule rapportrice colorogénique ou fluorogénique.
Lorsque la molécule rapportrice est une molécule colorogénique, le clivage de la séquence d'acides aminés par la calpaine 3 sera détecté au spectrophotomètre par l'apparition d'un composé coloré. En pratique, le composé coloré utilisé est le 2o paranitroanilide. Il peut également s'agir de thioesters.
Lorsque le peptide est couplé à un composé fluorogénique, la coupure est détectée par un chmgement de l'émission fluorescente. Dans ce cas, et en pratique le composé
fluorogénique utilisé est le méthyl 4 coumarilamide 7 (MCA) ou le naphtilamide. Le naphtilamide et l'amino 7 fluorométhylcoumarylamide 3 peuvent être utilisés en tant que substrat colorogénique ou fluorogénique.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide clivable par la calpaine 3 est couplé à
ses deux extrémités par deux composés fluorogéniques, la coupure étant détectée par 3o un changement de l'émission fluorescente d'un premier composé (molécule donneuse) dü à l'éloignement, secondairement à la coupure, d'un second composé (molécule accepteuse) situé de l'autre côté du peptide et qui absorbe la fluorescence du premier

6 lorsque ceux-ci sont proches. Cette technique est bien connue sous le nom de FRET
(Fluorescence Résonance Energy Transfer) (F~rster, 1948). Plus précisément, le FRET est un phénomène physique qui peut intervenir entre deux molécules fluorescentes dans certaines conditions : les deux molécules doivent être suffisamment proches l'une de l'autre (moins de 100 ~) et le spectre d'émission d'une des molécules (la molécule donneuse) doit recouvrir le spectre d'excitation de la' deuxième molécule (la molécule accepteuse). Ainsi, lorsque la molécule donneuse est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie plus élevé.
En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu sous to différentes formes (chaleur ...). Si la molécule donneuse est dans une orientation optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être transférée à
cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon ni nécessité de collision entre les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la lumière à sa propre longueur d'onde d'émission. Lorsque le peptide est clivé, l'énergie n'est plus absorbéé et la moléculé donneuse émet de la fluorescence. L'augmentation de la fluorescence correspond donc à une activité mesurable de clivage dü peptide.
La molécule rapporteuse fluorogénique peut être une molécule synthétique obtenue par synthèse chimique ou une protéine permettant l'émission d'un signal fluorescent.
2o Dans une première forme de réalisation, le peptide présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
Dans une seconde force de réalisation, le donneur est l'acide 5-[(2' aminoéthyl) amino] naphtalène sulfonique (EDANS) et l'accepteur est l'acide 4-[[4'-(diméthyl amino] phényl] azo] benzoïque (DABCYL).
Dans tous les cas qui précèdent, le peptide de l'invention couplé à la molécule colorogénique ou fluorogénique est obtenu par synthèse chimique.

7 Comme déjà dit, la molécule rapporteuse peut être également une protéine permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Dès lors et dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée.
La GFP (« Green Fluorescent Protein ») est une protéine de 27 kDa qui est synthétisée par une méduse du Pacifique (Aeqzcora Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu être purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être clonée en phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde ses 1o propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une éhide aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est liée, comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines mutations de la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999). En particulier, les protéines CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP, pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été
isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène de 2o FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (la molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).
Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP
est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie d'activation à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 tun. Les séquences correspondant aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc clonées entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la calpaine 3 en produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP
sera reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.
L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins une

8 séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isofonne de la calpaine 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code pour les peptides suivants CFP-site 1- YFP ;
CFP-site 2- YFP ;
CFP-site 3- YFP
L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule 1o hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le Demandeur, directement dérivé du plasmide décrit dans [Vanderklish 2000].Elle se rapporte également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité
de la calpaine 3 ou d'une isofonne de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide précédemment décrit, dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide 2o par la calpaine 3 ou une isofonne de la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est effectuée sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un extrait cellulaire, les cellules étant d'origine animale bu humaine, soit d'un tissu.
Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le peptide peut se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est mis directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des propriétés de 3o perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du peptide sera déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second mode de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes transfectées par

9 un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de l'invention, les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le peptide est simplement mis au contact dudit extrait.
La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement sar coupes de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par exemple l0 biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à -80°C jusqu'à
utilisation. Des coupes de 5 à15 pm sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de verre. Les coupes sont conservées aussi à -80°C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. La détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant directement le peptide sur la lame.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène de FRET
se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et le phénomène de FRET est alors diminué.
La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.
L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3 ou d'une isofonne de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents.

Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'invention, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou 5 fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
L'échantillon biolôgique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits cellulaires ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le peptide est 1o ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait cellulaire ou tissulaire) avec le peptide. En pratique, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste - à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention, - puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance 2o activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
Dans ce cas, l'échantillon biologique est constitué de cellules ou de lignées cellulaires transfectées avec un vecteur comprenant la séquence d'ADN codant pour le peptide de l'invention, dans l'hypothèse où la molécule rapporteuse est d'origine protéique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et la méthode consiste à
a/ préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide , 3o b/ mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, c/ mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, d/ mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou iWibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, e/ conclure à la présence d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/ est supérieur au taux de FRET mesuré en d/
d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/ est égal au taux de FRET
1 o mesuré en d/
L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant - tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec un plasmide codant pour la calpaine 3, - puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention soit in vitro, soit in vivo, - puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
2o Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités ,respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les techniques de transfection précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas d'avantage détaillés.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées.

Figure 1 : Séquence partielle de la calpaïne 3; la position des sites d'autolyse est indiquée par les flèches ; les séquences utilisées dans les peptides sont soulignées et sont identiques chez toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaïne 3 est connue à ce jour (homme, souris, singe, rat, bbuf).
Figure 2 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant au site d'autolyse 1, 2 et 3 de la .calpaïne 3 (courbes A, B et C, respectivement) par les calpaïnes 1 (colonne de gauche) et 2 (colonne de droite) recombinantes Figure 3 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides 1o correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de cellules C2C12 transfectées ou non avec un plasmide codant pour la calpaïne 3.
Figure 4 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-).
Figure 5 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage du peptide correspondant au site 3 d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myotubes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 6 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 7 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de quadriceps de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 8 : portion de séquence du plasmide pTOM. Les acides aminés en italique font partie de la séquence de EYFP. Les acides aminés en gras font partie de celle de ECFP. Le codon STOP de EYFP a été éliminé dans le vecteur pTOM. Les bases en italique et en gras montrent les phases des séquences de EYFP et ECFP, respectivement. Les bases en soulignées correspondent au fragment qui a été
éliminé
pour construire le vecteur pTOMp. Les séquences protéiques A et B
correspondent à
la traduction du vecteur pTOM à partir de l'ATG de la séquence codante de EYFP, respectivement avant et après élimination du fragment double-brin situé entre les sites de restriction Ec1136II et SmaI. Dans la séquence A, les séquences codant pour EYFP
et ECFP ne sont pas en phase. Elles le sont dans la séquence B.
Figure 9 : A : Migration sur gel d'agarose des produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOMp. Les PCR ont été effectuées avec les oligonucléotides midEYFP.a et midECFP.m. B : Migration de ces produits de PCR
après digestion par EcoRI ; Puits n°1 : échelle lkb ; n°2 : pTOM
; n°3 : pTOM après digestion par EcoRI ; n°4 à n°9 : migration des produits de PCR
du gel A après digestion par EcoRI ; leur taille est toujours de 800pb.
Figure 10: site de clonage sur le vecteur pTOM (10a) et séquence des 1o oligonucléotides codant pour les sites d'autolyse de la calpaïne 3 (10b, 10c, 10d).
Chaque couple d'oligonucléotides complémentaires est composé d'un oligonucléotide dont le nom se termine par « .a » et d'un oligonucléotide dont le nom se termine par « .m ».
Figure 11 : Migration sur gel d'agarose de produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOM et l'insert codant pour le site 2 d'autolyse ;
la PCR a été réalisée avec les oligonucléotides SGp94S2.a et midECFP.m.
Figure 12 : carte de restriction du plasmide pTOM
Figure 13 : carte de restriction du plasmide pTOMsl, pTOMs2, TOMs3 2o I/ TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAòNE 3 Ä PARTIR D'EXTRAITS
PROTEIQUES
Le clivage de peptides synthétiques correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 (Figure 1) permet la détection de son activité à l'aide d'une technique faisant intervenir le FRET.
A/ Matériel et méthode 1/ Fluorimètre : SpectraMax Gemini XS Microplate fluorometer (Molecular Devices).
2/ Séquence des peptides fluorescents Mca-NMTYGTS-Dnp (site 1) Mca-NMDNSLL-Dnp (site 2) 3o Mca-PVQYETR-Dnp (site 3) 3/ Références des enzymes commerciales ét des inhibiteurs utilisés calpaïne 1: Human eryhtrocytes (Calbiochem) calpaïne 2: Rat, recombinant, E.coli (Calbiochem) caspase 3 : Hunan, recombinant, E.coli (Calbiochem) 4/ Conditions de réaction Volume final de 200p1 ; calcium (CaCl2) lOmM final ; peptides fluorescents l,9pM
final.
l0 S/ Détection de la fluorescence:
La réaction se fait à 37°C, soit sur une heure (avec dans ce cas une mesure de fluorescence toutes les 50 secondes) ou sur 6 heures (mesure toutes les 2 minutes).
Le milieu est agité entre chaque mesure. Les longueurs d'onde utilisées pour la détection de la fluorescence des peptides sont - Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325run.
- Longueur d'onde d'émission de Dnp : 392nm.
G/ Mise au point des tampons Dans un premier temps, les conditions de réaction ont été mises au pôint, et en particulier la composition du tampon de réaction. Effectivement, la détection de la fluorescence s'est révélée y être très sensible. Les premiers tests ont consisté à faire varier les différents composants du tampon et leur concentration. Différentes concentrations en NaCI ont été testées. L'importance d'une faible concentration en DMSO, dans lequel sont resuspendus les peptides, a été démontrée. Il a également été
montré que la présence du CHAPS dans le milieu de réaction, ainsi que de la BSA
permettait une détection optimale de la fluorescence. Pour être certain d'activer la calpaïne 3, les réactions se font à 37°C, en présence de lOmM de calcium.
Effectivement, la calpaine 3 est active lorsqu'elle est en présence de concentrations en calcium de l'ordre du nanomolaire.

Composition des tampons Tampon de resuspension des calpaïnes commerciales : NaCI 100mM, EDTA SmM, TrisHCl 50mM, Bmercaptoéthanol SmM, glycérol 40%, pH=7,8. Conservation à
température ambiante.
5 Tampon de resuspension des peptides fluorescents : Les peptides sont resuspendus à
lmg/ml dans du DMSO 100%. Conservation à 4°C, à l'abri de la lumière.
Tampon de réaction : NaCI 100mM, HEPES SOmM, DTT IOmM, EDTA lmM, glycérol 10%, CHAPS 0,1%, BSA 100ng/pl, pH=7,4, filtration. Conservation à
tempéraW re ambiante.
7/ Culture des cellules eucaryotes:
Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes marins;
Milieux utilisés DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à O,SpM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
8/ Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes:
Matériel L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).
Méthodes ler jOllr Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain. .
~~re 2 jour Dans un premier tube stérile en polystyrène (T 1 ), déposer 94 p l de milieu sans sérum de veau foetal.

Ajouter à chaque tube T1 6 u1 de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 p.8 de plasmide EndoFree.
Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon (T1)+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, l0 en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37°C / 7% COz.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
9/ Protocole de lyse cellulaire:
Principe : Les cellules animales, transfectées ou non, sont lysées dans le but de préparer des extraits protéiques les propriétés pourront être étudiées.
Méthode Éliminer le milieu de culture des puits et laver les puits au PBS (Solution de Dulbecco tamponnée au phosphate (sa.ns calcium, ni magnésium, ni bicarbonate de sodium) -Gibco BRL) Récolter les cellules et les centrifuger à 5008 pendant 10 min à
4°C.
Éliminer le surnageant et reprendre les cellules dans le tampon de lyse (50mM
HEPES, 1mM DTT, O,ImM EDTA, 0,1% CHAPS, pH=7,4) à raison de 700p.1 de tampon de lyse par puits.
Laisser agir à 4°C pendant 5 minutes.
Centrifuger à 100008 / 10 minutes / 4°C.
Récupérer le surnageant et conserver à-20°C.

10-Protocole de lyse tissulaire Principe : Les muscles sont broyés dans le but de préparer des extraits protéiques dont on pourra ensuite étudier les propriétés.
Mc~téYiel : Quadriceps de souris normales et de souris déficientes en calpaïne 3.
Méthode Broyer les muscles dans l'azote liquide.
Resuspendre dans le tampon de lyse (cf. composition dans le protocole de lyse cellulaire plus haut) à raison de 19p1 de tampon de lyse par milligrant~ne de tissu broyé.
Laisser agir pendant 10 minutes dans la glace.
Centrifuger à 100008 pendant 10 minutes à 4°C.
Récupérer le surnageant et conserver à -20°C
B/ Test de la spécificité du clivage des peptides "sites d'autolyse" par la calpaïne 3 Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à
ses sites d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site l, site 2, site 3) ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les calpaïnes ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaïnes 1 et 2 n'ont pas d'activité de clivage sur chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles "peptide sans enzyme" se 2o superposent aux courbes "peptide + enzyme" Des résultats analogues ont été
obtenus avec une autre protéase, la caspase 3.
On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules musculaires en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne 3 pouvait cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules C2C12 en transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Une transfection témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le plasmide codant pour la calpaïne 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est inférieure à
10%. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les sites d'autolyse (Figure 3).

Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de fluorescence, ce qui pouvait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne 3 est une protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les extraits de cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut être détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et 2. En revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les cellules transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible pourcentage de cellules transfectées.

On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires déficientes ou non en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la calpaïne 3 pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées [Richard, 2000].
Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3 (cellules -l-) peuvent donc être comparées à des extraits de culW res de cellules musculaires normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des cellules lloll différenciées (myoblastes) (Figure 4).
Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage pouvait être détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et -/-est cependant 2o très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2.
Une activité de clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est visible entre cellules +/+ et cellules -/-.
Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante entre des extraits +/+ et des extraits -/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des extraits de cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est en effet théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes.
Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans les extraits de cellules -/- est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce qui est étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules -/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.

Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre extraits de cellules +/+ et de cellules -/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au lieu de 1h (Figure 6) L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des extraits de cellules +/+ que dans des extraits de cellules -/-. L'augmentation d'activité
sur le site 3 est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus important,. dans des extraits de cellules -/- que dans des extraits de cellules +/+. Ces expériences permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité
de clivage sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et -/-.
Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de souris déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats de quadriceps (Figure 7).
L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus importante que celle des extraits de tissus -/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus -/- est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une plus forte activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente est confirmée.
z0 Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont l'activité
est activée en absence de calpaïne 3.
II/ TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAINE 3 EN CELLULES
A/ Matériel et méthode Clonage d 'oligonucléotides dans le vecteur d 'expression pTOM
Principe : Deux oligonucléotides complémentaires sont mis en présence de manière à
former des séquences double-brin correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3.
Les oligonucléotides sont choisis de telle façon que leur appariement forme à
chaque extrémité des sites de restriction. Ces fragments sont clonés dans le vecteur d'expression pTOM digéré au préalable par des enzymes de restriction.

Matériel:
Oligonucléotides : site l, site 2, site 3 Enzymes de restriction: BamHl, BspEl, SmaI (BioLabs) ; Ec1136II (Fermentas).
Souches bactériemies utilisées: SCS110 : bactéries dam- StrR (Stratagene) ;
XLl-Blue 5 (Stratagene).
Vecteur plasmidique : pTOM (Généthon) (figure 12).
Méthodes Hybridation des deux oligonucléotides complémentaires Les oligonucléotides simple-brin complémentaires sont mis en présence l'un de l'autre 1o à raison d'une concentration de 20ng/pl final chacun dans le tampon SYBR
Green PCR Buffer (Applied Biosystems). L'hybridation se fait dans l'appareil ABI
Prism 7700 (Applied Biosystems) selon les conditions suivantes : 95°C/lmin ->
90°C/30sec -> 85°C/30sec -> 80°C/30sec -> 75°C/30sec ->
70°C/30sec -> 65°C/30sec ->
60°C/30sec -> 55°C/30sec. L'évolution de l'appariement est suivie au cours du temps 15 grâce au logiciel Sequence Detector 1.6.3.
Digestion du vecteur pTOM
Le vecteur pTOM est digéré par les deux enzymes BamHlet BspEl à 37°C
pendant 2h pour chaque enzyme.
Ligation des oligonucléotides dans pTOM:
2o Dans le mélange de ligation, le rapport entre la quantité d'insert et la quantité de vecteur est de 3 (en moles). La réaction de ligation se fait en présence de la ligase (BioLabs) sur la nuit à 16°C.
Protocole de préparation des bactéries électrocompétentes:
Ensemencer lSml de LB+agent de sélection avec lOpl de bactéries conservées à -80°C dans 20% de glycérol. Incuber 8 heures à 37°C sous agitation (300tpm environ) Ensemencer avec 2m1 de préculture 200m1 de LB+agent de sélection éventuel.
Laisser pousser jusqu'à DO(600nm)=0,5.
Tout le matériel à utiliser doit avoir été refroidi à 4°C au préalable.
Laisser reposer la culture dans la glace pendant 15 minutes puis la répartir à
raison de 25m1 par tube (8 tubes) Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4°C.

Éliminer les surnageants et reprendre doucement les culots dans 200 ml d'eau glacée (25m1 par W be- 8 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants et reprendre les culots dans 100 ml d'eau glacée (en regroupant les tubes 2 à 2 ; 4 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml de glycérol 10% (autoclavé et conservé à -20°C) et regrouper les 4 volumes d'ans un seul tube; centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 p1 de glycérol 10%, Aliquoter par 40 p1 en eppendorf, congeler à -80°C.
1 o Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide témoin selon le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 108 colonies par microgranune de vecteur transformé.
Prnt~p~nl~~jP trancfnrmatinm Ajouter 1 p1 d'ADN ligué (~ 0,1 ng) à 40p.1 de bactéries électrocompétentes, laisser en contact pendant 4 min. dans la glace.
Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gene pulser cuvette; 0,2 cm) Conditions d'électroporation: 2500 V, 200 ohm, 25 pF.
Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure à
37°C pour permettre l'expression du gène de résistance à
l'antibiotique.
2o Étaler 201 et 200p1 sur des boîtes de Pétri LB + kanamycine l Op.g/ml final Laisser pousser sur la nuit à 37°C.
nalvaP d~ç~nlnniecv Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans 100p1 LB
+
lcanamycine à l Opg/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les colonies.
une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP.a et midECFP.m, soit le couple formé par un des oligos forward suivants:
Chaque oligonucléotide est SGp94S1 . a CCGGAAGTGGCACGAACATG polir le site 1 spécifique d'un fragment SGp94S2 . a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pour le site 2 double-brin cloné. Ils sont centrés au niveau du site de SGp94S3 . a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pour le site 3 restriction BspEI.
... et l'oligonucléotide reverse midECFP.m.

Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0,8% + Bromure d'éthidium 0,5pg/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un certain nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquencés avec l'oligonucléotide midECFP.m.
2- Culture des cellules eucaryotes:
Lunées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins Milieux utilisés DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) 1o SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10%SVF + 1 % MEM
Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à O,SpM final sont ajoutés dans le milieu de culhme.
3- Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes:
Matériel L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-N1 (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).
Méthodes le'~ jour Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.
2~n~e jour Dms un premier tube stérile en polystyrène (T1), déposer 94 p1 de milieu sans sérum de veau foetal.
Ajouter à chaque tube T1 6 p1 de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.
3o Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 pg de plasmide EndoFree.

Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon (T1 )+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37°C / 7% COz.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
R/ R r~cnltatc Pour détecter l'activité protéolytique de la calpaïne 3 en cellules vivantes, on étudie le clivage de ses trois sites d'autolyse3 par phénomène de FRET.
Dans le but d'avoir un témoin « FRET positif », c'est-à-dire un plasmide codant pour une protéine chimère ECFP-EYFP ne pouvant pas être clivée par les calpaïnes et au sein de laquelle peut se produire un phénomène de FRET, on a dans un premier temps 2o modifié le vecteur pTOM de façon à ce que les séquences codantes pour les deux protéines fluorescentes Enhanced-CFP (ECFP) et EWanced-YFP (EYFP) qui se trouvent sur ce vecteur soient en phase. On a ensuite inséré entre ces séquences des fragments d'ADN codant pour les trois sites d'autolyse de la calpaïne 3. Nous avons ensuite vérifié que la protéine chimère produite pouvait réellement être clivée in vitro par les calpaines ubiquitaires. Enfin, ce clivage a été étudié en cellules par l'analyse d'images de fluorescence. Trois méthodes distinctes ont été utilisées pour cette analyse et, en particulier, pour celle du FRET.

1- Clonage d'un vecteur témoin et des vecteurs portant les fragments d'ADN
codant pour les sites de clivage Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour ECFP
et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à
bouts francs, Ec1136II et SmaI (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une réaction de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et repiquage de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence du 1o plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies repiquées ont pu ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion de ces produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec l'élimination du fragment Ec1136II-SmaI, a permis de confirmer que les colonies repiquées contenaient bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des produits de PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une avec l'autre.
2- Clonage d'oligonucléotides codant pour des sites de clivage par la calpaïne 3 dans le vecteur d'expression pTOM:
2o Pour faciliter le phénomène de FRET entre les deux protéines EYFP et ECFP, des acides aminés glycine et sérine ont été ajoutés de part et d'autre du site de clivage de façon à faciliter le rapprochement des deux . protéines, les glycines facilitant la souplesse de la protéine chimère et les sérines augmentant sa solublité dans un milieu aqueux (Figure 10). La séquence des oligonucléotides est telle qu'ils forment des sites de restriction pour BspEl et BamHI à chaque extrémité lorsqu'ils sont appariés.
Les bases marquées en gras souligné dans les séquences des oligonucléotides sont des bases qui ne modifient pas la séquence protéique mais qui sont différentes de la séquence génomique. Ces bases ont été modifiées de façon à limiter la formation de duplex de primers homologues, qui pourrait entraver la formation d'oligonucléotides double-brin. La modification des bases a également été faite en fonction de la fréquence d'utilisation des codons chez la souris.

Les sites de restriction utilisés pour le clonage sont des sites uniques.
L'enzyme BspEl est inactive si le site de clonage est méthylé. Le clonage du vecteur pTOM
destiné à recevoir les oligonucléotides double-brin a donc été fait dans des bactéries dont le gène codant pour la méthylase Dam est muté. Après digestion du vecteur par 5 les enzymes BspE 1 et BamHI, ligation des oligonucléotides et électroporation, certaines colonies résistantes sont prélevées. La présence du plasmide est vérifiée par PCR avec midECFP.m et un oligonucléotide spécifique du site de restriction (figure 11 ).
Le séquençage sur certains clones positifs obtenus en PCR a permis de vérifier la o présence des inserts dans pTOM, que ces inserts étaient bien en phase avec les séquences codant pour les protéines ECFP et EYFP et qu'il ne comportaient pas de mutations. Trois colonies contenant les trois plasmides clonés sont conservées. Les trois plasmides correspondent aux trois fragments d'ADN insérés : les trois sites de clivage de la calpaïne 3 (plasmides pTOMsI, pTOMs2 et pTOMs3) (figurel3).

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BI
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<150> FR0108614 <151> 2001-06-29 <160> 14 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 7 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 1 Asn Met Thr Tyr Gly Thr Ser <210> 2 <211> 7 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 2 Asn Met Asp Asn Ser Leu Leu <210> 3 <211> 7 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 3 Pro Val Gln Tyr Glu Thr Arg <210> 4 <211> 12 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 4 Val Ala Pra Arg Thr Ala Ala Glu Pro Arg Ser Pro <210> 5 <211> 12 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 5 Gln Ser Lys Ala Thr Glu Ala Gly Gly Gly Asn Pro <210> 6 <211> 12 <212> PRT

<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 6 Val Ala Pro Arg Thr Gly Ala Glu Pro Arg Ser Pro <210> 7 <211> 12 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 7 Gln Gly Lys Thr Thr Glu Ala Gly Gly Gly His Pro <210> 8 <211> 10 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 8 Asn Pro Tyr Leu Leu Pro Gly Phe Phe Cys <210> 9 <211> 9 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 9 Thr Ile Ser Val Asp Arg Pro Val Pro <210> 10 <211> 13 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 10 Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu <210> 11 <211> 13 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 11 Lys Glu Gly Thr Ile Pro Pro Glu Tyr Arg Lys Leu Leu <210> 12 <211> 14 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 12 Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser <210> 13 <211> 14 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<400> 13 Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ser <210> 14 <211> 11 <212> PRT
<213> DESIGNED PEPTIDE
<4~~> 14 Lys Ser Thr Val Leu Gln Gln Gln Tyr Asn Arg

Claims (25)

REVENDICATIONS

1/ Peptide couplé à au moins une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.

2/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10.

3/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce la séquence d'acides aminés des sites d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL (SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3).

4/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes VAPRTA
AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ IDS), et les séquences mucines suivantes VAPRTG AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).

5/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés du site d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 et est choisi parmi les séquences d'acides aminés suivantes : NPYLLPGFFC (SEQ ID12) et TISVDRPVP (SEQ ID13).

6/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat et est choisi parmi les séquences suivantes : REVTIPPKYRELL (SEQ ID 10), KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11), PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12), PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13), KSTVLQQQYNR (SEQ ID14).

7/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide est obtenu par criblage d'une banque de peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.

8/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente à
chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).

9/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule rapporteuse est une protéine.

10/ Peptide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il présente à
chacune de ses extrémités une GFP mutée

11/ Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que les GFP mutées sont respectivement la CFP et la YFP.

12/ Séquence d'ADN codant pour le peptide objet de la revendication 1.

13/ Vecteur contenant la séquence d'ADN objet de la revendication 12 et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte.

14/ Cellule hôte transformée par le vecteur objet de la revendication 13.

15/ Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel:
- dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide objet de la revendication 1, - dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 par mesure de l'intensité
de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.

16/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce la première étape consiste à
transfecter des cellules hôtes avec le vecteur objet de la revendication 13.

17/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la première étape consiste à mettre le peptide objet de la revendication 1 au contact d'un extrait cellulaire ou d'une coupe de tissu.

18/ Méthode selon la revendication 15, caractérisé en ce que le peptide présente à
chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.

19/ Utilisation de la méthode objet de la revendication 15, pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A.

20/ Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, ladite méthode consistant :
- à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de la revendication 1, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.

21/ Méthode selon la revendication 20, caractérisée en ce que le peptide présente à
chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.

22/ Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, ladite méthode consistant :
- à préparer un échantillon biologique contenant le peptide objet de la revendication 1, - puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.

23/ Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce que le peptide présente à
chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et consiste à :
a/ à préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide , b/ à mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, c/ à mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, d/ à mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, e/ à conclure à la présence :
d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/ est supérieur au taux de FRET mesuré en d/
d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/ est égal au taux de FRET
mesuré en d/

24/ Méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant :
tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec le gène de la calpaine 3, puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide objet de la revendication 1 soit in vitro, puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.

25/ Méthode selon la revendication 24, caractérisée en ce que le peptide présente à
chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.