WO2003002730A2 - Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode - Google Patents

Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode Download PDF

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Isabelle Richard
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting the activity of calpaine 3 in a biological sample consisting of either cells, cell lines or tissues. It also relates to the peptides intended to be used in said method. The invention also relates to the use of said peptides for the in vitro diagnosis of dystrophy of type 2A belts (LGMD 2A). It also relates to a method for analyzing the efficiency of the transfer of the calpaine 3 gene in animal or human cells in vitro but also in animals in vivo. It also relates to a method of screening for inhibiting or activating substances of calpain 3. The method of detecting the activity of calpaine 3 finally constitutes a means of studying the function of calpaine 3.
  • Calpains are a family of non-lysosomal calcium-activated cysteine proteases [Sorimachi, 1997]. This family currently includes 11 members including 2 ubiquitous proteins. The physiological functions of calpains are still largely unknown. As regulatory proteases, they are likely to regulate important cellular functions. In particular, ubiquitous calpains have been implicated in apoptosis [Squier, 1994], myogenic differentiation [Kwak, 1993], cell division and fusion [Yamaguchi, 1994]; [Schollmeyer, 1986]; [Balcerzak, 1995].
  • Calpaine 3 also known under the name p94, is a calcium cysteine-dependent enzyme belonging to the calpain family expressing itself specifically in skeletal muscle [Sorimachi, 1989]. She is involved in an autosomal recessive genetic disorder called type 2A belt dystrophy [Richard, 1995]. This myopathy is characterized by atrophy and progressive weakness of the muscles of the pelvic and shoulder girdles and an aspect of necrosis regeneration on muscle biopsies [Fardeau, 1996]. The gene located on chromosome 15 in humans codes for a 3.5kb transcript, itself coding for a 94kDa protein.
  • LGMD2A is due to mutations appearing on the calpain 3 gene, mutations leading to an inhibition of the proteolysis of calpaine 3 present in skeletal muscle.
  • the clinical diagnosis of LGMD 2 A is very difficult since patients present clinical signs similar to at least ten other pathologies. Molecular diagnosis can be carried out using different methods.
  • the first possibility is to search for a mutation on the calpain gene.
  • search for a mutation on the calpain gene is very cumbersome insofar as the gene is relatively large, that there are therefore a large number of different mutations and that there is no preferential mutation.
  • Another technique is to detect the presence of the protein using specific antibodies.
  • calpaine 3 is present in the sample, this does not mean that the individual is not sick since the mutation on the calpaine gene can make the protein present but that the autolysis phenomenon does not exist.
  • the calpain is absent or diminished, it may be a secondary calpainopathy due to mutations on a gene other than that of calpain.
  • the problem which the invention proposes to solve is not so much to detect the presence of calpaine 3 in a biological sample but rather that of detecting its activity.
  • the problem which the invention proposes to solve is to develop a new specific substrate for calpain 3 which can be used to detect the activity of calpaine 3 in a biological sample.
  • the invention relates first of all to a peptide coupled to at least one fluorogenic or colorogenic reporter molecule, said peptide being characterized in that it contains at least one amino acid sequence capable of being cleaved by calpain 3 or an isoform of calpain 3.
  • the peptide of the invention advantageously contains at least one autolysis site of calpaine 3 or of an isoform of calpaine 3, the number of which d amino acids is less than 10.
  • autolysis site denotes an amino acid sequence contained in calpaine 3 or one of its isoforms capable of being cleaved by calpaine 3 or one of its isoforms in at least two peptides as well as any derived sequence.
  • amino acid sequence of the autolysis site of calpaine 3 is chosen from the following sequences NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL (SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3) called in the following description respectively site 1, site 2 and site 3. These sites are identical in all the species for which the sequence of calpaine 3 is known to date (man, mouse, rat,).
  • the amino acid sequence of the calpain 3 autolysis site can also be chosen from the following human sequences VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ LD5), and the following murine sequences NAPRTG AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).
  • the amino acid sequence of the autolysis site comes from an isoform of calpaine 3 called Lp82 present in rodents, rats, mice and is chosen from the following amino acid sequences: ⁇ PYLLPGFFC (SEQ ID8) and TISNDRPVP (SEQ ID9).
  • the substrate proteins have the following sequences:
  • REVTIPP YRELL (SEQ LD10) (human calpastatin)
  • KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11) (mouse and rat calpastatin)
  • PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12) (human alpha-A-crystalline)
  • PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13) (alpha-A-crystalline mouse and rat)
  • KSTNLQQQYNR SEQ ID14
  • the peptide containing a sequence cleavable by calpaine 3 or an isoform of calpaine 3, is obtained by screening a library of peptides by calpaine 3 or an isoform of calpaine 3.
  • the peptide of the invention is coupled to a colorogenic or fluorogenic reporter molecule.
  • the reporter molecule When the reporter molecule is a colorogenic molecule, the cleavage of the amino acid sequence by calpaine 3 will be detected with a spectrophotometer by the appearance of a colored compound.
  • the colored compound used is paranitroanilide. It can also be thioesters.
  • the cleavage is detected by a change in the fluorescent emission.
  • the fluorogenic compound used is methyl 4 coumarilamide 7 (MCA) or naphthilamide.
  • MCA methyl 4 coumarilamide 7
  • Naphthilamide and amino 7 fluoromethylcoumarylamide 3 can be used as a colorogenic or fluorogenic substrate.
  • the peptide cleavable by calpaine 3 is coupled at its two ends by two fluorogenic compounds, the cleavage being detected by a change in the fluorescent emission of a first compound (donor molecule) due to the distancing, secondarily upon cutting, of a second compound (acceptor molecule) located on the other side of the peptide and which absorbs the fluorescence of the first when these are close.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET is a physical phenomenon which can occur between two fluorescent molecules under certain conditions: the two molecules must be close enough to each other (less than 100 ⁇ ) and the emission spectrum of one of the molecules (the donor molecule) must cover the excitation spectrum of the second molecule (the acceptor molecule).
  • the donor molecule when the donor molecule is excited at its excitation wavelength, it reaches a higher energy level. In a few picoseconds, part of the energy is dispersed in the medium in different forms (heat ). If the donor molecule is in an optimal orientation and close to an acceptor molecule, its energy can be transferred to this acceptor molecule without the intervention of a photon or the need for collision between the two molecules.
  • the acceptor molecule is then excited and emits light at its own emission wavelength.
  • the fluorogenic reporter molecule can be a synthetic molecule obtained by chemical synthesis or a protein allowing the emission of a fluorescent signal.
  • the peptide has at each of its ends a synthetic fluorogenic reporter molecule, respectively MCA (donor molecule) and Dnp (acceptor molecule).
  • the donor is 5 - [(2 'aminoethyl) - amino] naphthalene sulfonic acid (EDANS) and the acceptor is 4 - [[4' - (dimethyl amino] phenyl] acid) azo] benzoic (DABCYL).
  • the peptide of the invention coupled to the colorogenic or fluorogenic molecule is obtained by chemical synthesis.
  • the reporter molecule can also be a protein allowing the emission of a fluorescence signal. Therefore and in an advantageous embodiment, the peptide has at each of its ends a mutated GFP.
  • CFP When these two proteins are close enough to each other and when CFP is excited at its excitation wavelength, CFP can transfer its activation energy to YFP which can then emit light at 535 nm.
  • the sequences corresponding to the previously mentioned calpain 3 autolysis sites will therefore be cloned between the CFP and YFP sequences.
  • This system will be used to detect calpaine 3 by producing in living cells chimeric proteins within which CFP will be linked to YFP by a peptide cleavable by calpaine 3.
  • the invention also relates to a DNA sequence coding for a peptide coupled to at least one fluorescent protein, said peptide containing at least one amino acid sequence capable of being cleaved by calpain 3 or an isoform of calpam 3.
  • the DNA sequence codes for the following peptides: CFP-site 1- YFP; CFP-site 2- YFP; CFP-site 3- YFP
  • the invention also relates to a vector containing said DNA sequence and a promoter for inducing expression of the DNA sequence in a host cell.
  • a vector is for example the plasmid pTOM developed by the Applicant, directly derived from the plasmid described in [Nanderklish 2000]. It also relates to a host cell transformed by said vector.
  • the invention also relates to a method for in vitro detection of the activity of calpaine 3 or of an isoform of calpaine 3 in a biological sample according to which: in a first step, said biological sample is brought into contact with the peptide previously described, in a second step, the presence or absence of cleavage of said peptide by calpaine 3 or an isoform of calpaine 3 is detected by measuring the intensity of the colorimetric or fluorimetric reaction.
  • the first step can take different forms depending on whether the detection is carried out on a biological sample consisting of either living cells or a cell extract, the cells being of animal or human origin, or of tissue.
  • contact with the peptide can be done in two ways.
  • the peptide is brought directly into contact with the cell so that it must have sufficient permeability properties to penetrate the cell.
  • the permeability of the peptide will be determined according to the nature of the reporter molecule.
  • the biological sample corresponds to host cells transfected with a vector coding for the DNA sequence corresponding to the peptide of the invention, the reporter molecules then corresponding to proteins allowing the emission of a fluorescent signal.
  • the peptide is simply brought into contact with said extract.
  • the detection of the activity can also be done, as already said, directly on tissue sections.
  • the biological sample organ, part of an organ, for example muscle biopsies
  • isopentane cooled with liquid nitrogen. It is stored at -80 ° C until use.
  • Sections from 5 to 15 ⁇ m are made using a cryostat and placed on a glass slide.
  • the sections are also stored at -80 ° C if they are not used immediately.
  • the detection of calpain activity can be carried out by depositing the peptide directly on the slide.
  • the peptide has, at each of its ends, respectively a donor fluorogenic molecule and an acceptor fluorogenic molecule, the intensity of the fluorogenic reaction being determined by FRET.
  • FRET fluorogenic reaction
  • the method for detecting the activity of calpaine 3 or of an isoform of calpaine 3 finds an advantageous application for the in vitro diagnosis of
  • LGMD2A Consequently, the invention also relates to the use of the detection method described above for the in vitro diagnosis of LGMD2A.
  • the invention also relates to a method for screening for inhibiting or activating substances of calpain 3 or of an isoform of calpaine 3.
  • Said method can take two different embodiments. According to a first embodiment, the method consists:
  • the biological sample can be in the form of cells, cellular extracts or even tissues.
  • the preparation of the biological sample containing the peptide is then carried out by mixing the treated sample (cell, cell or tissue extract) with the peptide.
  • the peptide has, at each of its ends, respectively a donor fluorogenic molecule and an acceptor fluorogenic molecule, the intensity of the fluorogenic reaction being determined by FRET.
  • the method consists:
  • the biological sample consists of cells or cell lines transfected with a vector comprising the DNA sequence coding for the peptide of the invention, in the event that the reporter molecule is of protein origin.
  • the peptide has at each of its ends respectively a donor fluorogenic molecule and an acceptor fluorogenic molecule and the method consists in: a / preparing a biological sample containing said peptide, b / measuring the FRET level in l absence of the activator or inhibitor substance of calpain 3 or of a calpain 3 isoform, c / bringing the biological sample containing the peptide into contact with the activating or inhibiting substance of calpaine 3 or of an isoform of calpaine 3, d / measuring the FRET level in the presence of the activating or inhibiting substance of calpaine 3 or an isoform of calpain 3, e / conclude that there is: an activating substance if the FRET level measured in b / is greater than the FRET level measured in d / an inhibiting substance if the rate FREIGHT measured in b / is equal to the FRET rate measured in d /
  • the subject of the invention is also a method of analyzing the efficiency of the gene transfer from calpaine 3 consisting of:
  • the peptide has, at each of its ends, respectively a donor fluorogenic molecule and an acceptor fluorogenic molecule, the intensity of the fluorogenic reaction being determined by FRET.
  • the calpaine 3 gene is perfectly identified and the transfection techniques precisely described in document EP 717110 so that they will not be further detailed.
  • Figure 1 Partial sequence of calpaine 3; the position of the autolysis sites is indicated by the arrows; the sequences used in the peptides are underlined and are identical in all the species for which the sequence of calpain 3 is known to date (man, mouse, monkey, rat, ox).
  • Figure 2 Measurement over time of the cleavage activity of the peptides corresponding to the autolysis site 1, 2 and 3 of calpain 3 (curves A, B and C, respectively) by calpains 1 (left column) and 2 (right column) recombinant
  • Figure 3 Measurement over time of the cleavage activity of the peptides corresponding to the autolysis sites of calpain 3 with extracts of C2C12 cells transfected or not with a plasmid coding for calpain 3.
  • Figure 4 Measurement during of the time of the cleavage activity of the peptides corresponding to the autolysis sites of calpain 3 by extracts of myoblasts of normal (+ / +) or deficient in calpain 3 (- / -) mice.
  • Figure 5 Measurement over time of the cleavage activity of the peptide corresponding to the site 3 of autolysis of calpain 3 by extracts of normal myotubes from mice (+ / +) or deficient in calpain 3 (- / -)
  • Figure 6 Measurement for 6 hours of the cleavage activity of the peptides corresponding to the autolysis sites of calpain 3 by extracts of normal myoblasts from mice (+ / +) or deficient in calpain 3 (- / -)
  • Figure 7 Measurement for 6 hours of the cleavage activity of the peptides corresponding to the autolysis sites of calpain 3 by extracts of normal mouse quadriceps (+ / +) or calpain-3 deficient (- / -)
  • Figure 8 portion of sequence of the plasmid pTOM.
  • the amino acids in italics are part of the EYFP sequence.
  • the amino acids in fat are part of that of ECFP.
  • the STOP codon of EYFP was eliminated in the vector pTOM.
  • the bases in italics and in bold show the phases of the EYFP and ECFP sequences, respectively.
  • the underlined bases correspond to the fragment which was eliminated to construct the vector pTOMp.
  • sequences A and B correspond to the translation of the vector pTOM from the ATG of the coding sequence of EYFP, respectively before and after elimination of the double-stranded fragment located between the sites restriction Ee / 136II and Smal.
  • sequence A the sequences coding for ⁇ YFP and ⁇ CFP are not in phase. They are in sequence B.
  • Figure 9 A: Migration on agarose gel of the PCR products on colonies subcultured after transformation with pTOMp. The PCRs were carried out with the oligonucleotides midEYFP.a and midECFP.m. B: Migration of these PCR products after digestion with EcoRI; Well n ° l: scale lkb; # 2: pTOM; n ° 3: pTOM after digestion with Ec ⁇ RI; n ° 4 to n ° 9: migration of the PCR products from gel A after digestion with Ec ⁇ RI; their size is always 800bp.
  • Figure 10 cloning site on the vector pTOM (10a) and sequence of the oligonucleotides coding for the autolysis sites of calpain 3 (10b, 10c, 10d).
  • Each pair of complementary oligonucleotides is composed of an oligonucleotide whose name ends in ".a" and an oligonucleotide whose name ends in
  • Figure 11 Migration on agarose gel of PCR products on colonies subcultured after transformation with pTOM and the insert coding for site 2 of autolysis; the PCR was carried out with the oligonucleotides SGp94S2.a and midECFP.m.
  • Figure 12 restriction map of the plasmid pTOM
  • FIG. 13 restriction map of the plasmid pTOMs1, pTOMs2, TOMs3
  • Mca-NMDNSLL-Dnp site 2
  • Mca-PVQYETR-Dnp site 3
  • calpain 2 Rat, recombinant, E.coli (Calbiochem) caspase 3: Human, recombinant, E.coli (Calbiochem)
  • the reaction is carried out at 37 ° C., either over one hour (with a fluorescence measurement every 50 seconds in this case) or over 6 hours (measurement every 2 minutes).
  • the medium is agitated between each measurement.
  • the wavelengths used for the detection of the fluorescence of the peptides are: - Mca excitation wavelength: 325nm.
  • the reaction conditions were developed, and in particular the composition of the reaction buffer. Indeed, the detection of fluorescence has proven to be very sensitive.
  • the first tests consisted in varying the different components of the buffer and their concentration. Different NaCl concentrations have been tested. The importance of a low concentration of DMSO, in which the peptides are resuspended, has been demonstrated. It has also been shown that the presence of CHAPS in the reaction medium, as well as BSA, allows optimal detection of fluorescence.
  • the reactions are carried out at 37 ° C., in the presence of 10 mM of calcium. Indeed, calpaine 3 is active when it is in the presence of calcium concentrations of the order of nanomolar. Buffer composition:
  • TrisHCl 50mM, Bmercaptoethanol 5mM, glycerol 40%, pH 7.8. Storage at room temperature. Fluorescent peptide resuspension buffer: The peptides are resuspended at 1 mg / ml in 100% DMSO>. Storage at 4 ° C, protected from light.
  • DMEM Eagle medium modified by Dulbecco (Gibco BRL)
  • MEM Non-essential amino acid solution
  • SVF Fetal calf serum
  • C2C12 DMEM + 10% SVF
  • Plasmids used pECFP-Nl (Clontech); pEYFP-Cl (Clontech). Methods: 1 st day:
  • FUGENE 6 is to be expected (cell control), as well as a well in which the cells will have been in contact with FUGENE 6 only (FUGENE 6 toxicity control).
  • PB S Distrachloro phosphate-buffered solution (without calcium, magnesium or sodium bicarbonate) -
  • calpain 3 has greater stability in muscle cells due to the presence of titin. In order to prove that calpain 3 could cleave its own autolysis sites, it is therefore overexpressed in C2C12 cells by transfecting these cells with a plasmid coding for calpam 3. A control transfection with pECFP was carried out at the same time than transfection with the plasmid coding for calpam 3. The transfection efficiency on C2C12 is less than 10%>. The proteins are then extracted and their activity is tested at the autolysis sites ( Figure 3).
  • the curves representing the activity of transfected or non-transfected C2C12 extracts at sites 1 and 2 show a slight increase in fluorescence, which could mean that calpain 3 can cleave these sites.
  • Calpain 3 is a protein expressed in muscle, therefore the basal activity observed for extracts from non-transfected cells is normal. However, no difference can be detected between transfected or non-transfected cells for sites 1 and 2.
  • site 3 the cleavage activity is greater in the transfected cells. The difference is minimal but it is consistent with the small percentage of cells transfected.
  • the cleavage activity on sites 1 and 2 is greater in extracts of cells + / + than in extracts of cells - / -.
  • the increase in activity on site 3 is here confirmed when the reaction takes place over 6 hours.
  • the activity is greater in cell extracts - / - than in cell extracts + / +.
  • Oligonucleotides site 1, site 2, site 3
  • SCSI 10 dam-Str R bacteria (Stratagene); XLl-Blue (Stratagene).
  • Plasmid vector pTOM (Genethon) ( Figure 12).
  • the complementary single-stranded oligonucleotides are brought into contact with one another at a concentration of 20 ng / ⁇ l final each in the SYBR Green buffer.
  • the vector pTOM is digested with the two enzymes BamHlet BspEl at 37 ° C. for 2 h for each enzyme.
  • Ligation of the oligonucleotides in pTOM In the ligation mixture, the ratio between the quantity of insert and the quantity of vector is 3 (in moles). The ligation reaction is carried out in the presence of T4 DNA ligase (BioLabs) overnight at 16 ° C.
  • Electroporation conditions 2500 V, 200 ohm, 25 ⁇ F.
  • the colonies are counted and subcultured in a 96-well plate in 100 ⁇ l LB + kanamycin at 10 ⁇ g / ml final. To verify the presence of the plasmid in the colonies. PCR is carried out on these colonies with either the midEYFP.a and midECFP.m pair, or the pair formed by one of the following forward oligos:
  • Each oligonucleotide is SG P 94S1.
  • E has CCGGAAGTGGCACGAACATG for site 1 specific for a fragment
  • SGp94S2 a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT for site 2 double-strand clone. They are centered at the SGp94S3 site level. a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC for j es j te 3 BspEl restriction.
  • DMEM Middle of Eagle modified by Dulbecco (Gibco BRL)
  • MEM Non-essential amino acid solution (Gibco BRL)
  • SVF Fetal calf serum (Gibco BRL)
  • the DNA of the different plasmids is prepared according to the QIAGEN Endofree protocol
  • Plasmids used pECFP-Nl (Clontech); pEYFP-Cl (Clontech).
  • pTOMp The strategy of construction of the vector carrying the two sequences coding for ECFP and EYFP in phase (called pTOMp) consisted in digesting the plasmid pTOM by two restriction enzymes at unique sites on pTOM and generating blunt ends, Ec / 136II and Smal ( Figure 8). The linearized vector was purified and a ligation reaction of the vector on itself was carried out. After transformation and subculturing of positive colonies, a PCR reaction made it possible to confirm the presence of the plasmid in these colonies (FIG. 9). About a third of the transplanted colonies were thus able to be amplified and therefore had to contain the vector pTOMp.
  • oligonucleotides coding for cleavage sites with calpain 3 in the expression vector pTOM To facilitate the phenomenon of FRET between the two proteins EYFP and ECFP, amino acids glycine and serine were added by hand and on the other side of the cleavage site so as to facilitate the bringing together of the two proteins, the glycines facilitating the flexibility of the chimeric protein and the serines increasing its solubility in an aqueous medium (FIG. 10).
  • the sequence of the oligonucleotides is such that they form restriction sites for BspEl and BamBI at each end when they are paired.
  • the bases marked in bold underlined in the sequences of the oligonucleotides are bases which do not modify the protein sequence but which are different from the genomic sequence. These bases have been modified in order to limit the formation of duplexes of homologous primers, which could hinder the formation of double-stranded oligonucleotides.
  • the modification of the bases was also made according to the frequency of use of the codons in the mouse.
  • the restriction sites used for cloning are unique sites.
  • the enzyme BspEl is inactive if the cloning site is methylated.
  • the cloning of the vector pTOM intended to receive the double-stranded oligonucleotides was therefore done in bacteria whose gene coding for Dam methylase is mutated.

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Abstract

Peptide couplé à au moins une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3. Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.

Description

METHODE DE DETECTION DE L'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET PEPTIDES POUR LA MISE EN ŒUVRE DE LADITE METHODE
L'invention concerne une méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique constitué soit de cellules, soit de lignées cellulaires, soit de tissus. Elle se rapporte également aux peptides destinés à être utilisés dans ladite méthode. L'invention a également pour objet l'utilisation desdits peptides pour le diagnostic in vitro de la dystrophie des ceintures type 2A (LGMD 2A). Elle concerne par ailleurs une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert du gène de la calpaine 3 dans des cellules animales ou humaines in vitro mais également chez l'animal in vivo. Elle a aussi pour objet une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 constitue enfin un moyen d'étudier la fonction de la calpaine 3.
Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles doivent vraisemblablement réguler des fonctions cellulaires importantes. En particulier, les calpaïnes ubiquitaires ont été impliquées dans l'apoptose [Squier, 1994], la différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires [Yamaguchi, 1994]; [Schollmeyer, 1986]; [Balcerzak, 1995].
La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique[Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A [Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose regénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène situé sur le chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3,5kb, lui-même codant pour une protéine de 94kDa. Il a été démontré que la calpaïne 3 pouvait se lier à la titine, protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région IS2 et qu'elle subissait une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle elle est exprimée dans les cellules Cos7 [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette région comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine peut être localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. Il a par ailleurs été montré que la calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3 semble aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante atrophique du muscle (cachexie, etc...).
Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des mutations apparaissant sur le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à une inhibition de la protéolyse de la calpaine 3 présente dans le muscle squelettique. Le diagnostic clinique de la LGMD 2 A est très difficile puisque les patients présentent des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies. Le diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes méthodes.
La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le gène de la calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où le gène est relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes et qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.
Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide d'anticorps spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon, cela ne signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la mutation sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations sur un autre gène que celui de la calpaine. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention n'est pas tant de détecter la présence de la calpaine 3 dans un échantillon biologique mais plutôt celui de détecter son activité.
Guttman et al. décrivent dans le document Methods in molecular biology vol 144, ch 18, une méthode de mesure de l'activité de calpaine ubiquitaire consistant à mettre une calpaine purifiée au contact d'un peptide non spécifique fluorescent (Succ-LLVY- AMC), puis de mesurer la variation de fluorescence apparaissant lorsque la molécule est clivée. Dans une seconde méthode, on met en contact la calpaine avec la protéine TAU entière, puis on effectue un Western blot. En aucun cas ce document ne concerne spécifiquement la calpaine 3. De plus, les substrats sont, soit non spécifiques (substrat de la m-calpaine et la μ-calpaine), soit des protéines entières.
Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un nouveau substrat spécifique de la calpaine 3 qui puisse être utilisé pour détecter l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.
Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un peptide couplé à au moins une molécule rapportrice fluorogénique ou colorogénique, ledit peptide se caractérisant en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Par "isoforme de la calpaine 3", on désigne toute protéine produite par le gène de la calpaine 3, résultant d'un événement alternatif du type promoteur alternatif ou épissage alternatif.
Dans un premier mode de réalisation et compte tenu des propriétés autolytiques de la calpaine 3, le peptide de l'invention contient avantageusement au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10. Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression "site d'autolyse", on désigne une séquence d'acides aminés contenue dans la calpaine 3 ou un de ses isoformes susceptible d'être clivée par la calpaine 3 ou un de ses isoformes en au moins deux peptides ainsi que toute séquence dérivée.
En pratique, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL (SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3) dénommées dans la suite de la description respectivement site 1, site 2 et site 3. Ces sites sont identiques dans toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaine 3 est connue à ce jour (homme, souris, rat, ).
La séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 peut être également choisie parmi les séquences humaines suivantes VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ LD5), et les séquences murines suivantes NAPRTG AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).
Dans le mode de réalisation selon lequel le peptide de l'invention contient au moins un site d'autolyse d'une isoforme de la calpaine 3, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 présent chez le rongeur, rat, souris et est choisi parmi les séquences d'acides aminés suivantes : ΝPYLLPGFFC (SEQ ID8) et TISNDRPVP (SEQ ID9).
Dans un second mode de réalisation, la séquence d'acides aminés clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat du type par exemple calpastatine, filamine, taline, calpaines ubiquitaires, cristalline, heat shock protéine, etc.
Avantageusement, les protéines substrat ont les séquences suivantes :
REVTIPP YRELL (SEQ LD10) (calpastatine humaine) KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11) (calpastatine souris et rat) PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12) (alpha-A-cristalline humaine) PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13) (alpha-A-cristalline souris et rat) KSTNLQQQYNR (SEQ ID14) (taline humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession XP 045856 (filamine 2 humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 10809 (heat shock protéine 60 humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession NP 004355 (c/EBPbeta humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 17655 (m calpaine humaine)
Dans un troisième mode de réalisation, le peptide contenant une séquence clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3, est obtenu par criblage d'une banque de peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Pour permettre de détecter ultérieurement l'activité de la calpaine par colorimétrie ou fluorimétrie, le peptide de l'invention, comme déjà dit, est couplé à une molécule rapportrice colorogénique ou fluorogénique.
Lorsque la molécule rapportrice est une molécule colorogénique, le clivage de la séquence d'acides aminés par la calpaine 3 sera détecté au spectrophotomètre par l'apparition d'un composé coloré. En pratique, le composé coloré utilisé est le paranitroanilide. Il peut également s'agir de thioesters.
Lorsque le peptide est couplé à un composé fluorogénique, la coupure est détectée par un changement de l'émission fluorescente. Dans ce cas, et en pratique le composé fluorogénique utilisé est le méthyl 4 coumarilamide 7 (MCA) ou le naphtilamide. Le naphtilamide et l' amino 7 fluoromethylcoumarylamide 3 peuvent être utilisés en tant que substrat colorogénique ou fluorogénique.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide clivable par la calpaine 3 est couplé à ses deux extrémités par deux composés fluorogéniques, la coupure étant détectée par un changement de l'émission fluorescente d'un premier composé (molécule donneuse) dû à l'éloignement, secondairement à la coupure, d'un second composé (molécule accepteuse) situé de l'autre côté du peptide et qui absorbe la fluorescence du premier lorsque ceux-ci sont proches. Cette technique est bien connue sous le nom de FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) (Fôrster, 1948). Plus précisément, le FRET est un phénomène physique qui peut intervenir entre deux molécules fluorescentes dans certaines conditions : les deux molécules doivent être suffisamment proches l'une de l'autre (moins de 100 Â) et le spectre d'émission d'une des molécules (la molécule donneuse) doit recouvrir le spectre d'excitation de la' deuxième molécule (la molécule accepteuse). Ainsi, lorsque la molécule donneuse est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie plus élevé. En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu sous différentes formes (chaleur ...). Si la molécule donneuse est dans une orientation optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être transférée à cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon ni nécessité de collision entre les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la lumière à sa propre longueur d'onde d'émission. Lorsque le peptide est clivé, l'énergie n'est plus absorbée et la molécule donneuse émet de la fluorescence. L'augmentation de la fluorescence correspond donc à une activité mesurable de clivage du peptide. La molécule rapporteuse fluorogénique peut être une molécule synthétique obtenue par synthèse chimique ou une protéine permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Dans une première forme de réalisation, le peptide présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
Dans une seconde forme de réalisation, le donneur est l'acide 5-[(2' aminoéthyl)- amino] naphtalène sulfonique (EDANS) et l'accepteur est l'acide 4-[[4'-(diméthyl amino] phényl] azo] benzoïque (DABCYL).
Dans tous les cas qui précèdent, le peptide de l'invention couplé à la molécule colorogénique ou fluorogénique est obtenu par synthèse chimique. Comme déjà dit, la molécule rapporteuse peut être également une protéine permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Dès lors et dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée.
La GFP (« Green Fluorescent Protein ») est une protéine de 27 kDa qui est synthétisée par une méduse du Pacifique (Aequora Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu être purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être clonée en phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde ses propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une étude aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est liée, comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines mutations de la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999]. En particulier, les protéines CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP, pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène de FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (la molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).
Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie d'activation à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 nm. Les séquences correspondant aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc clonées entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la calpaine 3 en produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP sera reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.
L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpame 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code pour les peptides suivants : CFP-site 1- YFP ; CFP-site 2- YFP ; CFP-site 3- YFP
L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le Demandeur, directement dérivé du plasmide décrit dans [Nanderklish 2000].Elle se rapporte également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide précédemment décrit, dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est effectuée sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un extrait cellulaire, les cellules étant d'origine animale ou humaine, soit d'un tissu.
Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le peptide peut se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est mis directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des propriétés de perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du peptide sera déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second mode de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes transfectées par un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de l'invention, les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le peptide est simplement mis au contact dudit extrait.
La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement sur coupes de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par exemple biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à -80°C jusqu'à utilisation. Des coupes de 5 àl5 μm sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de verre. Les coupes sont conservées aussi à -80°C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. La détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant directement le peptide sur la lame.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène de FRET se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et le phénomène de FRET est alors diminué.
La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la
LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.
L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents. Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste :
- à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance,
- puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'invention,
- et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
L'échantillon biologique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits cellulaires ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le peptide est ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait cellulaire ou tissulaire) avec le peptide. En pratique, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste :
- à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention,
- puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier,
- et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
Dans ce cas, l'échantillon biologique est constitué de cellules ou de lignées cellulaires transfectées avec un vecteur comprenant la séquence d'ADN codant pour le peptide de l'invention, dans l'hypothèse où la molécule rapporteuse est d'origine protéique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et la méthode consiste à : a/ préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide , b/ mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, c/ mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, d/ mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, e/ conclure à la présence : d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/ est supérieur au taux de FRET mesuré en d/ d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/ est égal au taux de FRET mesuré en d/
L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant :
- tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec un plasmide codant pour la calpaine 3,
- puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention soit in vitro, soit in vivo,
- puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les techniques de transfection précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas d'avantage détaillés.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées. Figure 1 : Séquence partielle de la calpaine 3; la position des sites d'autolyse est indiquée par les flèches ; les séquences utilisées dans les peptides sont soulignées et sont identiques chez toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaïne 3 est connue à ce jour (homme, souris, singe, rat, bœuf). Figure 2 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant au site d'autolyse 1, 2 et 3 de la calpaïne 3 (courbes A, B et C, respectivement) par les calpaïnes 1 (colonne de gauche) et 2 (colonne de droite) recombinantes
Figure 3 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de cellules C2C12 transfectées ou non avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Figure 4 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-). Figure 5 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage du peptide correspondant au site 3 d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myotubes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-)
Figure 6 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-)
Figure 7 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de quadriceps de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 8 : portion de séquence du plasmide pTOM. Les acides aminés en italique font partie de la séquence de EYFP. Les acides aminés en gras font partie de celle de ECFP. Le codon STOP de EYFP a été éliminé dans le vecteur pTOM. Les bases en italique et en gras montrent les phases des séquences de EYFP et ECFP, respectivement. Les bases en soulignées correspondent au fragment qui a été éliminé pour construire le vecteur pTOMp. Les séquences protéiques A et B correspondent à la traduction du vecteur pTOM à partir de l'ATG de la séquence codante de EYFP, respectivement avant et après élimination du fragment double-brin situé entre les sites de restriction Ee/136II et Smal. Dans la séquence A, les séquences codant pour ΕYFP et ΕCFP ne sont pas en phase. Elles le sont dans la séquence B.
Figure 9 : A : Migration sur gel d'agarose des produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOMp. Les PCR ont été effectuées avec les oligonucléotides midEYFP.a et midECFP.m. B : Migration de ces produits de PCR après digestion par EcoRI ; Puits n°l : échelle lkb ; n°2 : pTOM ; n°3 : pTOM après digestion par EcσRI ; n°4 à n°9 : migration des produits de PCR du gel A après digestion par EcσRI ; leur taille est toujours de 800pb.
Figure 10 : site de clonage sur le vecteur pTOM (10a) et séquence des oligonucléotides codant pour les sites d'autolyse de la calpaïne 3 (10b, 10c, lOd).
Chaque couple d'oligonucléotides complémentaires est composé d'un oligonucléotide dont le nom se termine par « .a » et d'un oligonucléotide dont le nom se termine par
« .m ».
Figure 11 : Migration sur gel d'agarose de produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOM et l'insert codant pour le site 2 d'autolyse ; la PCR a été réalisée avec les oligonucléotides SGp94S2.a et midECFP.m.
Figure 12 : carte de restriction du plasmide pTOM
Figure 13 : carte de restriction du plasmide pTOMsl, pTOMs2, TOMs3
1/ TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAÏNE 3 À PARTIR D'EXTRAITS
PROTÉIQUES :
Le clivage de peptides synthétiques correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne
3 (Figure 1) permet la détection de son activité à l'aide d'une technique faisant intervenir le FRET. A/ Matériel et méthode
1/ Fluorimètre : SpectraMax Gemini XS Microplate fluorometer (Molecular Devices).
2/ Séquence des peptides fluorescents :
Mca-NMTYGTS-Dnp (site 1)
Mca-NMDNSLL-Dnp (site 2) Mca-PVQYETR-Dnp (site 3) 3/ Références des enzymes commerciales et des inhibiteurs utilisés : calpaïne 1 : Human eryhtrocytes (Calbiochem) calpaïne 2: Rat, recombinant, E.coli (Calbiochem) caspase 3 : Human, recombinant, E.coli (Calbiochem)
4/ Conditions de réaction :
Volume final de 200μl ; calcium (CaC12) lOmM final ; peptides fluorescents l,9μM final.
5/ Détection de la fluorescence:
La réaction se fait à 37°C, soit sur une heure (avec dans ce cas une mesure de fluorescence toutes les 50 secondes) ou sur 6 heures (mesure toutes les 2 minutes).
Le milieu est agité entre chaque mesure. Les longueurs d'onde utilisées pour la détection de la fluorescence des peptides sont : - Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325nm.
Longueur d'onde d'émission de Dnp : 392nm.
6/ Mise au point des tampons
Dans un premier temps, les conditions de réaction ont été mises au point, et en particulier la composition du tampon de réaction. Effectivement, la détection de la fluorescence s'est révélée y être très sensible. Les premiers tests ont consisté à faire varier les différents composants du tampon et leur concentration. Différentes concentrations en NaCl ont été testées. L'importance d'une faible concentration en DMSO, dans lequel sont resuspendus les peptides, a été démontrée. Il a également été montré que la présence du CHAPS dans le milieu de réaction, ainsi que de la BSA permettait une détection optimale de la fluorescence. Pour être certain d'activer la calpaïne 3, les réactions se font à 37°C, en présence de lOmM de calcium. Effectivement, la calpaine 3 est active lorsqu'elle est en présence de concentrations en calcium de l'ordre du nanomolaire. Composition des tampons :
Tampon de resuspension des calpaïnes commerciales : NaCl lOOmM, EDTA 5mM,
TrisHCl 50mM, Bmercaptoéthanol 5mM, glycérol 40%, pH=7,8. Conservation à température ambiante. Tampon de resuspension des peptides fluorescents : Les peptides sont resuspendus à lmg/ml dans du DMSO 100%>. Conservation à 4°C, à l'abri de la lumière.
Tampon de réaction : NaCl lOOmM, HEPES 50mM, DTT lOmM, EDTA ImM, glycérol 10%, CHAPS 0,1%, BSA lOOng/μl, pH=7,4, fîltration. Conservation à température ambiante.
7/ Culture des cellules eucaryotes:
Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins; Milieux utilisés :
DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau fœtal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0,5μM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
8/ Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes: Matériel :
L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (réf. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-Cl (Clontech). Méthodes : 1er jour :
Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80%) de confluence le lendemain. 2ème jour :
Dans un premier tube stérile en polystyrène (Tl), déposer 94 μl de milieu sans sérum de veau fœtal. Ajouter à chaque tube Tl 6 μl de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim)
Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 μg de plasmide EndoFree. Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6
(Tl)+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37°C / 7% CO2.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le
FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
9/ Protocole de lyse cellulaire:
Principe : Les cellules animales, transfectées ou non, sont lysées dans le but de préparer des extraits protéiques les propriétés pourront être étudiées. Méthode :
Éliminer le milieu de culture des puits et laver les puits au PB S (Solution de Dulbecco tamponnée au phosphate (sans calcium, ni magnésium, ni bicarbonate de sodium) -
Gibco BRL)
Récolter les cellules et les centrifuger à 500g pendant 10 min à 4°C. Éliminer le surnageant et reprendre les cellules dans le tampon de lyse (50mM
HEPES, ImM DTT, 0,lmM EDTA, 0,1% CHAPS, pH=7,4) à raison de 700μl de tampon de lyse par puits.
Laisser agir à 4°C pendant 5 minutes.
Centrifuger à 10000g / 10 minutes / 4°C. Récupérer le surnageant et conserver à-20°C. 10-Protocole de lyse tissulaire :
Principe : Les muscles sont broyés dans le but de préparer des extraits protéiques dont on pourra ensuite étudier les propriétés.
Matériel : Quadriceps de souris normales et de souris déficientes en calpaïne 3. Méthode :
Broyer les muscles dans l'azote liquide.
Resuspendre dans le tampon de lyse (cf. composition dans le protocole de lyse cellulaire plus haut) à raison de 19μl de tampon de lyse par milligramme de tissu broyé. Laisser agir pendant 10 minutes dans la glace. Centrifuger à 10000g pendant 10 minutes à 4°C. Récupérer le surnageant et conserver à -20°C
B/ Test de la spécificité du clivage des peptides "sites d'autolyse" par la calpaïne 3 Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à ses sites d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site 1, site 2, site 3) ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les calpaïnes ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaïnes 1 et 2 n'ont pas d'activité de clivage sur chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles "peptide sans enzyme" se superposent aux courbes "peptide + enzyme" Des résultats analogues ont été obtenus avec une autre protéase, la caspase 3.
On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules musculaires en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne 3 pouvait cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules C2C12 en transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpame 3. Une transfection témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le plasmide codant pour la calpame 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est inférieure à 10%>. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les sites d'autolyse (Figure 3). Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de fluorescence, ce qui pourrait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne 3 est une protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les extraits de cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut être détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et 2. En revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les cellules transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible pourcentage de cellules transfectées.
On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires déficientes ou non en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la calpaïne 3 pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées [Richard, 2000]. Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3 (cellules -/-) peuvent donc être comparées à des extraits de cultures de cellules musculaires normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des cellules non différenciées (myoblastes) (Figure 4).
Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage pouvait être détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et -/- est cependant très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2. Une activité de clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est visible entre cellules +/+ et cellules -/-.
Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante entre des extraits +/+ et des extraits -/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des extraits de cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est en effet théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes. Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans les extraits de cellules -/- est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce qui est étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules -/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable. Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre extraits de cellules +/+ et de cellules -/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au lieu de lh (Figure 6)
L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des extraits de cellules +/+ que dans des extraits de cellules -/-. L'augmentation d'activité sur le site 3 est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus importante dans des extraits de cellules -/- que dans des extraits de cellules +/+. Ces expériences permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité de clivage sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et -/-.
Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de souris déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats de quadriceps (Figure 7). L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus importante que celle des extraits de tissus -/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus -/- est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une plus forte activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente est confirmée. Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont l'activité est activée en absence de calpaïne 3.
11/ TEST D'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 EN CELLULES
A/ Matériel et méthode
Clonage d Oligonucléotides dans le vecteur d'expression pTOM Principe : Deux oligonucléotides complémentaires sont mis en présence de manière à foπner des séquences double-brin correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3. Les oligonucléotides sont choisis de telle façon que leur appariement forme à chaque extrémité des sites de restriction. Ces fragments sont clones dans le vecteur d'expression pTOM digéré au préalable par des enzymes de restriction. Matériel :
Oligonucléotides : site 1, site 2, site 3
Enzymes de restriction: BamHl, BspEl, Smal (BioLabs) ; Ec/136II (Fermentas).
Souches bactériennes utilisées: SCSI 10 : bactéries dam- StrR (Stratagene) ; XLl-Blue (Stratagene).
Vecteur plasmidique : pTOM (Généthon) (figure 12).
Méthodes :
Hybridation des deux oligonucléotides complémentaires :
Les oligonucléotides simple-brin complémentaires sont mis en présence l'un de l'autre à raison d'une concentration de 20ng/μl final chacun dans le tampon SYBR Green
PCR Buffer (Applied Biosystems). L'hybridation se fait dans l'appareil ABI Prism
7700 (Applied Biosystems) selon les conditions suivantes : 95°C/lmin -> 90°C/30sec
-> 85°C/30sec -> 80°C/30sec -> 75°C/30sec -> 70°C/30sec -> 65°C/30sec ->
60°C/30sec -> 55°C/30sec. L'évolution de l'appariement est suivie au cours du temps grâce au logiciel Séquence Detector 1.6.3.
Digestion du vecteur pTOM :
Le vecteur pTOM est digéré par les deux enzymes BamHlet BspEl à 37°C pendant 2h pour chaque enzyme.
Ligation des oligonucléotides dans pTOM: Dans le mélange de ligation, le rapport entre la quantité d'insert et la quantité de vecteur est de 3 (en moles). La réaction de ligation se fait en présence de la T4 DNA ligase (BioLabs) sur la nuit à 16°C.
Protocole de préparation des bactéries électrocompétentes:
Ensemencer 15ml de LB+agent de sélection avec lOμl de bactéries conservées à - 80°C dans 20%> de glycérol. Incuber 8 heures à 37°C sous agitation (300tpm environ)
Ensemencer avec 2ml de préculture 200ml de LB+agent de sélection éventuel. Laisser pousser jusqu'à DO(600nm)=0,5.
Tout le matériel à utiliser doit avoir été refroidi à 4°C au préalable.
Laisser reposer la culture dans la glace pendant 15 minutes puis la répartir à raison de 25ml par tube (8 tubes)
Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4°C. Éliminer les surnageants et reprendre doucement les culots dans 200 ml d'eau glacée (25ml par tube- 8 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants et reprendre les culots dans 100 ml d'eau glacée (en regroupant les tubes 2 à 2 ; 4 tubes), centrifuger comme précédemment. Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml de glycérol 10% (autoclave et conservé à -20°C) et regrouper les 4 volumes dans un seul tube; centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 μl de glycérol 10%, Aliquoter par 40 μl en eppendorf, congeler à -80°C. Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide témoin selon le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 10^ colonies par microgramme de vecteur transformé.
Prntnr.nl e dp transformation-
Ajouter 1 μl d'ADN ligué (≈ 0,1 ng) à 40μl de bactéries électrocompétentes, laisser en contact pendant 4 min. dans la glace.
Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gène puiser cuvette; 0,2 cm)
Conditions d'électroporation: 2500 V, 200 ohm, 25 μF.
Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure à
37°C pour permettre l'expression du gène de résistance à l'antibiotique. Étaler 20μl et 200μl sur des boîtes de Pétri LB + kanamycine lOμg/ml final
Laisser pousser sur la nuit à 37°C.
Analyse des colonies-
Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans lOOμl LB + kanamycine à lOμg/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les colonies. une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP.a et midECFP.m, soit le couple formé par un des oligos forward suivants:
" Chaque oligonucléotide est SGP94S1 . a CCGGAAGTGGCACGAACATG pour le site 1 spécifique d'un fragment
SGp94S2 . a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pour le site 2 double-brin clone. Ils sont centrés au niveau du site de SGp94S3 . a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pour je sjte 3 restriction BspEl.
... et l'oligonucléotide reverse midECFP.m. Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0,8% + Bromure d'éthidium
0,5μg/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un certain nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquences avec l'oligonucléotide midECFP.m. 2- Culture des cellules eucaryotes:
Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins
Milieux utilisés :
DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL)
MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau fœtal (Gibco BRL)
Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10%SVF + 1% MEM
Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine
(Calbiochem) à 0,5μM final sont ajoutés dans le milieu de culture. 3- Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes:
Matériel :
L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree
(réf. 12362)
Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-Cl (Clontech).
Méthodes :
1er jour :
Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain. 2èmejour :
Dans un premier tube stérile en polystyrène (Tl), déposer 94 μl de milieu sans sérum de veau fœtal.
Ajouter à chaque tube Tl 6 μl de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim)
Incuber 5 min. à température ambiante. Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 μg de plasmide EndoFree. Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl)+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur. Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation. Changer le milieu des puits. Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits. Laisser pousser à 37°C / 7% CO2.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).
B/ Résultats
Pour détecter l'activité proteolytique de la calpaïne 3 en cellules vivantes, on étudie le clivage de ses trois sites d'autolyse3 par phénomène de FRET.
Dans le but d'avoir un témoin « FRET positif», c'est-à-dire un plasmide codant pour une protéine chimère ECFP-EYFP ne pouvant pas être clivée par les calpaïnes et au sein de laquelle peut se produire un phénomène de FRET, on a dans un premier temps modifié le vecteur pTOM de façon à ce que les séquences codantes pour les deux protéines fluorescentes Enhanced-CFP (ECFP) et Enhanced-YFP (EYFP) qui se trouvent sur ce vecteur soient en phase. On a ensuite inséré entre ces séquences des fragments d'ADN codant pour les trois sites d'autolyse de la calpaïne 3. Nous avons ensuite vérifié que la protéine chimère produite pouvait réellement être clivée in vitro par les calpaines ubiquitaires. Enfin, ce clivage a été étudié en cellules par l'analyse d'images de fluorescence. Trois méthodes distinctes ont été utilisées pour cette analyse et, en particulier, pour celle du FRET. 1- Clonage d'un vecteur témoin et des vecteurs portant les fragments d'ADN codant pour les sites de clivage :
Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase : La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour ECFP et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à bouts francs, Ec/136II et Smal (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une réaction de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et repiquage de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence du plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies repiquées ont pu ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion de ces produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec l'élimination du fragment Ec/136II-Sm<2l, a permis de confirmer que les colonies repiquées contenaient bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des produits de PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une avec l'autre.
2- Clonage d'oligonucléotides codant pour des sites de clivage par la calpaïne 3 dans le vecteur d'expression pTOM: Pour faciliter le phénomène de FRET entre les deux protéines EYFP et ECFP, des acides aminés glycine et serine ont été ajoutés de part et d'autre du site de clivage de façon à faciliter le rapprochement des deux protéines, les glycines facilitant la souplesse de la protéine chimère et les serines augmentant sa solublité dans un milieu aqueux (Figure 10). La séquence des oligonucléotides est telle qu'ils forment des sites de restriction pour BspEl et BamBI à chaque extrémité lorsqu'ils sont appariés.
Les bases marquées en gras souligné dans les séquences des oligonucléotides sont des bases qui ne modifient pas la séquence protéique mais qui sont différentes de la séquence génomique. Ces bases ont été modifiées de façon à limiter la formation de duplex de primers homologues, qui pourrait entraver la formation d'oligonucléotides double-brin. La modification des bases a également été faite en fonction de la fréquence d'utilisation des codons chez la souris. Les sites de restriction utilisés pour le clonage sont des sites uniques. L'enzyme BspEl est inactive si le site de clonage est méthylé. Le clonage du vecteur pTOM destiné à recevoir les oligonucléotides double-brin a donc été fait dans des bactéries dont le gène codant pour la méthylase Dam est muté. Après digestion du vecteur par les enzymes BspEl et BamHl, ligation des oligonucléotides et électroporation, certaines colonies résistantes sont prélevées. La présence du plasmide est vérifiée par PCR avec midECFP.m et un oligonucléotide spécifique du site de restriction (figure 1 1). Le séquençage sur certains clones positifs obtenus en PCR a permis de vérifier la présence des inserts dans pTOM, que ces inserts étaient bien en phase avec les séquences codant pour les protéines ECFP et EYFP et qu'il ne comportaient pas de mutations. Trois colonies contenant les trois plasmides clones sont conservées. Les trois plasmides correspondent aux trois fragments d'ADN insérés : les trois sites de clivage de la calpaïne 3 (plasmides pTOMsl, pTOMs2 et pTOMs3) (figurel3).
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Peptide couplé à au moins une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
2/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10.
3/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce la séquence d'acides aminés des sites d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes : NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL (SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3).
4/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ ID5), et les séquences murines suivantes VAPRTG AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).
5/ Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés du site d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 et est choisi parmi les séquences d'acides aminés suivantes : NPYLLPGFFC (SEQ LDI 2) et TISVDRPVP (SEQ ID13).
61 Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat et est choisi parmi les séquences suivantes : REVTIPPKYRELL (SEQ ID10), KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11), PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12), PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13), KSTVLQQQYNR (SEQ JD14).
7/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide est obtenu par criblage d'une banque de peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3. 8/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
9/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule rapporteuse est une protéine.
10/ Peptide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée
1 1/ Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que les GFP mutées sont respectivement la CFP et la YFP.
12/ Séquence d'ADN codant pour le peptide objet de la revendication 1.
13/ Vecteur contenant la séquence d'ADN objet de la revendication 12 et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte.
14/ Cellule hôte transformée par le vecteur objet de la revendication 13.
15/ Méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : - dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide objet de la revendication 1, - dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
16/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce la première étape consiste à transfecter des cellules hôtes avec le vecteur objet de la revendication 13. 17/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la première étape consiste à mettre le peptide objet de la revendication 1 au contact d'un extrait cellulaire ou d'une coupe de tissu.
18/ Méthode selon la revendication 15, caractérisé en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
19/ Utilisation de la méthode objet de la revendication 15, pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A.
20/ Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, ladite méthode consistant :
- à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance,
- puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de la revendication 1,
- et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
21/ Méthode selon la revendication 20, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
22/ Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, ladite méthode consistant : - à préparer un échantillon biologique contenant le peptide objet de la revendication 1,
- puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.
23/ Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et consiste à : al à préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide , b/ à mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inliibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, c/ à mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, d/ à mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inliibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, e/ à conclure à la présence : d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/ est supérieur au taux de FRET mesuré en d/ d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/ est égal au taux de FRET mesuré en d/
24/ Méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant : tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec le gène de la calpaine 3, puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide objet de la revendication 1 soit in vitro, puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
25/ Méthode selon la revendication 24, caractérisée en ce que le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.
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