JP2005040132A - 細胞内ip3測定用分子センサー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 IP3受容体のリガンド結合部及び蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす2種の蛍光物質から成る分子センサーである。この2種の蛍光物質として、ECFP又はその改変体及びEYFP又はその改変体が好ましい。この分子センサーをコードする遺伝子を細胞などに導入し、この分子センサーを発現した細胞(SH-SY5Y細胞)にIP3を結合させると、2種の蛍光物質(例えば、ECFPとEYFP)の間の蛍光共鳴エネルギー転移の効率が変化するので、蛍光強度の比を感知してIP3を測定する。
【選択図】 なし
Description
IP3-Ca2+系は血圧、学習、免疫機能、内分泌及び外分泌機能、炎症などの調節において重要な働きをしており、IP3-Ca2+系の障害が記憶・学習機能、運動機能、発生に深刻な障害を与えることなどが明らかにされている(非特許文献1等)。従って、IP3濃度の定量はこのような病態の解明、治療や診断法の確立、薬剤の開発において極めて重要である。
特に近年、fura-2などのCa2+感受性蛍光色素を用いて、生きた細胞のCa2+反応をリアルタイムで可視化する技術が確立された(非特許文献2)。このような研究によって、IP3が時間・空間的なパターンの異なる多彩なCa2+シグナルを発生させることが明らかにされてきた。しかし、従来の技術では細胞内のIP3を測定することができない。
近年、蛍光ラベルしたIP3結合タンパク質の蛍光強度の変化によってIP3濃度を定量する方法が開発されている(非特許文献4)。この方法は、放射性同位元素を用いる方法より簡便であるが細胞集団から抽出したサンプルを用いる点は同じである。
従来法の中で最も注目されているのは、IP3結合タンパク質(PLCdのPHドメイン)とGFPの融合遺伝子を細胞に導入し、その遺伝子でコードされる融合タンパク質(GFP-PHD)の局在によって細胞内のIP3濃度の変化を解析する方法である(非特許文献5及び6、特許文献1)。この方法によって、生きた細胞でIP3の動態を知ることが初めて可能になった。しかし、GFP-PHDが細胞膜から遊離する微少な分布の変化を検出する必要があり定量的な測定は極めて難しい。また、この解析には共焦点レーザー顕微鏡が不可欠であり、汎用性が低い。
なお、IP3受容体においてIP3と高親和性を示す領域があることが知られている(非特許文献7、特許文献2)。
また最近、2種類の蛍光物質(例えば、フルオロセイントとローダミン、ECFPとEYFP)の間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用した分子プローブの開発が注目されており(非特許文献8〜10)、各種標的物質や阻害剤などの検出に用いられている(特許文献3,4)
本発明の方法は、以下の特徴を有し、従来のIP3の測定における問題点を解消することができる。
(1) 蛍光強度の比の変化によって測定が可能であるため、正確な細胞内のIP3濃度の変化をリアルタイムで可視化することができる。
(2) 蛍光光度計を用いて、簡便にIP3の定量を行うことができる。
(3) IP3がCa2+放出反応を起こす時のターゲットであるIP3受容体のリガンド結合部位を用いるため特異性が高い。
(4) IP3受容体の新規リガンドや新規阻害剤の検索が可能になり、このような機能を有する新薬のスクリーニングができる。
また、分子センサーを発現したSH-SY5Y細胞をムスカリン受容体アゴニスト(例えば、アセチルコリンやカルバーコル)で刺激すると、細胞内のIP3濃度の上昇に伴なって蛍光強度の比が変化することが確認された。
2種の蛍光タンパク質として、ECFP又はその改変体及びEYFP又はその改変体が好ましい。この分子センサーは、更に、局在化シグナルを有してもよい。
この分子センサーにおいて、IP3受容体のリガンド結合部が、以下の(1)又は(2)のいずれかのポリペプチドから成り、蛍光タンパク質ECFPが、(3)又は(4)のいずれかのポリペプチドから成り、蛍光タンパク質EYFPが、(5)又は(6)のいずれかのポリペプチドから成ることがより好ましい。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列の少なくとも490〜842番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(2)(1)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、イノシトール1,4,5三リン酸との親和性を有するポリペプチド
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列の21〜259番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
(4)(3)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、465〜495nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
(5)配列番号1で表されるアミノ酸配列の899〜1137番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
(6)(5)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、522〜548nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
更に、本発明は、このDNAを含む組換えベクターである。
更に、本発明は、この組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
更に、本発明は、上記いずれかの分子センサーを細胞内に有する細胞である。
更に、本発明は、上記いずれかの分子センサーを体内に有する動物又は植物である。
更に、本発明は、上記形質転換体、上記細胞又は上記動物若しくは植物に350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、該形質転換体又は該細胞におけるイノシトール1,4,5三リン酸の濃度(又は量)を見積もる方法である。
更に、本発明は、、上記形質転換体、上記細胞又は上記動物若しくは植物に未知の薬剤を導入し、これに350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、IP3受容体のリガンド又は阻害剤をスクリーニングする方法である。
また本発明は、この装置と被検物とを接触させ、350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、被検物中のイノシトール1,4,5三リン酸の濃度を見積もる方法である。
装置と被検物とを接触させる方法は装置の構成による。例えば、装置にセンサーを組み込んで、この装置に被検物を入れる方法をとってもよいし、センサーを小型にして被検物(例えば、組織や細胞など)にこのセンサーを入れる方法をとってもよい。
IP3受容体はIP3が結合することによって開口するCa2+チャンネルで、IP3はそのN末端部分に特異的に結合する(特許文献2)。IP3受容体としては、ニワトリ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、ヒトデ、線虫等の広範な生物種のものを用いてもよいが、本発明においては、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物のものを用いることが好ましい。また、哺乳類のIP3受容体にはタイプ1からタイプ3の3つのサブタイプが知られており、そのいずれを用いてもよい。
このIP3が特異的に結合するIP3受容体の領域は、例えば、ラットタイプ3IP3受容体(Blondel et al., J. Biol. Chem., 268:11356-11363 (1993)、L06096)のアミノ酸配列のうち少なくとも226〜578番目(配列番号1の490〜842番目、非特許文献6及び特許文献1)、好ましくは1〜578番目(配列番号1の265〜842番目)である。後述の実施例において1〜604番目のもの(配列番号1の265〜868番目)が機能することが確かめられているが、より短いものでも機能すると考えられる。即ち、この配列の1〜225番目(配列番号1の265〜489番目)のいずれかから578〜604番目(配列番号1の842〜868番目)のいずれかまでのものが好ましいと考えられる。
このECFPとEYFPは、改変することによりFRETの効率やpH安定性を向上させたり、またEYFPを改変して蛍光波長を長波長側にシフトさせることにより適当な光源(例えば、457nmのアルゴンイオンレーザー)を利用するように改変することができる。特にアクセプターであるEYFP部分の改変は、FRET効率の向上に有効である。また、ECFPとEYFP以外の蛍光ペアを用いることによって様々な光源を利用したりFRET効率を高めることが可能である。本発明においては、これら2つの蛍光タンパク質が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こしている限りにおいて、これら2つの蛍光タンパク質を改変したものを用いることも本発明の範囲内であると考えるものである。
EYFPの改変体として、更にPhi-Yellow (Evrogen JSC社製、pH安定性の向上とFRETの検出効率の向上を目的とする。)等を用いることもできる。
更に、以下のような組み合わせも可能である。各励起波長(Ex)と蛍光波長(Em)を挙げる。
EBFP/EGFP Ex 350-390nm:Em 420-480nm/515-555nm
ECFP/DsRed Ex 400-460nm: Em 465-495nm/565-595nm
EGFP/DsRed Ex 450-480nm: Em 485-510nm/565-595nm
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Midoriishi-Cyan/Kusabira-Orange Ex 400-460nm: Em 465-510nm/540-600nm
EBFP、ECFP、EGFP、EYFP(クローンテック社製)及びSapphire(オーロラ社製)はオワンクラゲ由来のGFPの変異体であり、DsRed(クローンテック社製)、HcRed-tandem(Evrogen JSC社製)、Midoriishi-Cyan及びKusabira-Orange((株)医学生物学研究所製)はサンゴ由来の蛍光タンパク質である。
同様に、オリゴヒスチジンやアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基に結合する蛍光色素を化学的に結合させることができる。
本発明の分子センサーは図1に示すようにIP3受容体のリガンド結合部と2種類の蛍光物質(ECFP及びEYFP等)とからなる。これらの2種類の蛍光物質はそれぞれ入れ替えてもよく、またこれらの構成部分の間に1残基以上、好ましくは4〜30残基程度のアミノ酸からなるリンカーを挿入してもよい。
また、この分子センサーは局在化シグナルを有してもよく、特定部位に不動化することにより、蛍光変化を起こりやすくし、IP3濃度の定量測定も容易になると考えられる。分子センサーにおける局在化シグナルの結合位置は、N末端、C末端のどちらでもよいが、N末端が好ましい。
局在化部位としては、細胞膜、ミトコンドリア、細胞骨格、核、小胞体などが挙げられるが、実施例に示すようにIP3センサーを細胞膜に局在させるために、ニューロモジュリンのバルミトイル化ドメインを含む20コのアミノ酸をN末端に付加してもよい。
さらに、この分子センサーには、FLAG、His-tag, strep-tag, GST, HA-tag, c-myc等のタンパク質精製用のアミノ酸配列やプロテアーゼ等の基質となるアミノ酸配列等を含んでもよい。
また、分子センサー遺伝子の開始コドンの上流に、コザック配列(Kozak 配列;CGCCACCATGC)を有することが好ましい。
また、これらのトランジェニック動物やトランスジェニック植物から得られた細胞は薬剤のスクリーニング等にも利用することができる。さらに、分子センサーを用いることによって、従来の方法に比べて容易に溶液中のlP3濃度を容易に測定することも可能であり、そのための測定キットや測定機器を作成することも可能である。
また、細胞中のIP3生成系や代謝系に影響を与え、その結果IP3濃度に影響をあたえるシグナル分子や薬物の検索を行うこともできる。更に、この分子センサーを用いて、IP3受容体を活性化あるいは抑制する薬物を検出し、その濃度を測定することも可能である。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
また、pECFP-C1(クローンテック社、図3)をBamH1とXba1で切断し、そこにEYFP遺伝子を含むDNA断片を連結させた。
次に、ECFPとEYFPの融合遺伝子ベクターをBspE1とBamH1で切断し、ベクター(図3)の1331-1390番目までの60コの塩基を除去し、そこにBspE1、Xho I、Bgl II、Sal I、Bam H1の制限酵素サイトを含む合成DNA断片(配列番号3,リンカー部分)を挿入した(pCY-N、図4)。
pCY-NをBsrG Iで切断して、そこにECFPの一部、MCS及びEYFPの遺伝子が連結したDNA断片を切り出した。
同様にpECFP-mem(クローンテック社、図5)をBsrGIで切断し、そこにpCY-Nから切り出したDNA断片を挿入した(mCY-N、図6)。
さらに、mCY-NをEco47 III/Sma Iで切断して、バルネシル化ドメイン(膜局在シグナル)上流の62塩基を分離除去し、そのまま融合させた。これにより、非翻訳部位の不要な制限酵素切断部位を除去し、5'末端にバルネシル化ドメインを付加したECFPとEYFPの融合タンパク質遺伝子ベクター(mCY、図7)を作成した。
このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。この切り出されたDNA断片をXhoIで切断したmCYに挿入して、IP3センサー発現ベクター(mCY-IP3R-N1.8)を作成した。
図8aはmCY-IP3R-N1.8ベクター(配列番号7)の制限酵素地図と分子センサー(配列番号6)の位置を示す。また、図8bは分子センサーの部品の遺伝子の位置及び制限酵素部位を示す。このmCY-IP3R-N1.8ベクター(配列番号7)の617〜4027番目は分子センサー(配列番号6)であり、この配列番号6の塩基配列において、1〜60番目は膜局在ドメイン、61〜777番目はECFP、778〜792番目はリンカー1、793〜2604番目はIP3受容体リガンド結合部位、2605〜2694番目はリンカー2、2695〜3411番目はEYFPをコードする。
この分子センサーにIP3を直接作用させるために、チャンバー内の細胞をサポニンで穿孔した。細胞の穿孔は、100μg/mlのサポニンを含む細胞内液様メディウム(ICM;125mM KCl, 25mM NaCl, 1mM EGTA, 330μM CaCl2, pH 7.3)に、細胞を約1分間曝露した(穿孔後はチャンバー内の液をサポニンを含まないICMに置換した)。分子センサーは、細胞を穿孔した後でも細胞膜への局在していた。
実験装置として、ニコン製倒立顕微鏡、浜松ホトニクス社製画像解析装置、W-viwe光学系、画像解析装置ソフトウェア(AQUACOSMOS)を用いた。
蛍光顕微鏡に試料(分子センサーを発現したSH-SY5Y細胞)をセットし、425nmの光を照射した。試料からの蛍光を485nmのダイクロイックミラーで2光路に分離し、それぞれの光路に取り付けた蛍光フィルターで480±15nm と535±12.5nmの蛍光だけを抽出した。それぞれの蛍光像をcooled CCDカメラで同時に記録し、画像解析装置ソフトウェアで480nmの蛍光(ECFP)を535nmの蛍光(EYFP)で割った蛍光比を算出した。
より親和性の高いIP3受容体のアゴニストであるアデノフォスチンAは、その約1/10の濃度でIP3と同等の蛍光比の増加を起こした。それに対し、イノシトール1,3,4三リン酸やイノシトール4,5二リン酸では、蛍光比の変化はほとんど認められなかった。高濃度のイノシトール1,3,4,5四リン酸は蛍光比をわずかに上昇させた(図11)。これらの性質は、これまでに報告されているnativeなIP3受容体の性質とよく一致していた。
コントロール実験としてmCYを発現した細胞で同様の実験を行ったが、蛍光比の変化全く認められなかった。
これらの結果から、この融合タンパク質がIP3特異性の高い、高感度な分子センサーとして利用できることが確認された。
この結果から、この発明の分子センサーの蛍光強度の比の変化を測定することによって、細胞内のIP3濃度を正確に定量することができることが確認された。
まず最初にプライマー(配列番号8)とアンチセンスプライマー(配列番号9)を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene社製)を用いてpEYFP-N1のアミノ酸置換(F46L)を行った。次にプライマー(配列番号10)とアンチセンスプライマー(配列番号11)を用い、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitで(F64L)のアミノ酸置換を行った。さらに、プライマー(配列番号12)とアンチセンスプライマー(配列番号13)を用いて(M153T/V163A/S175G)のアミノ酸置換を行ってYFP変異体を作成した。
図15は実施例1で作成した変位導入を行っていないIP3分子センサー(mCY-IP3R-N1.8)と変位導入を行ったpH安定型IP3分子センサー(mCYv-IP3R-N1.8)の蛍光比の変化をサポニン穿孔細胞を用いて比較したものである。mCY-IP3R-N1.8に使われているEYFPはpHの低下によって蛍光強度が減弱するために蛍光比(480nm/535nm)の大きな増加が見られるが(a)、EYFP変異体を用いたmCYv-IP3R-N1.8ではpHによる蛍光比の変化が約1/3に押さえられる事が確認された(b)。
さらにサポニン穿孔細胞を用いてIP3に対する反応性を比較すると(図16)、変異導入前の分子センサー(a)と比較して、変異導入後の分子センサー(b)では、IP3によって変化する蛍光比の割合が約1.5倍に増強する事が確認された。
ラットIP3受容体(タイプ1)の遺伝子配列からプライマー(センスプライマー(配列番号16)、アンチセンスプライマー(配列番号17))を設計し、ラット耳下腺cDNAライブラリーを鋳型とした PCR反応により、タイプ1IP3受容体のリガンド結合部位(1-604番目まで)を含むポリペプチドをコードする1.8kbのDNAの5'末端及び3'末端にXhoI切断部位を付加したDNA断片を作成した。このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。実施例4で作成したpH安定型IP3分子センサー(mCYv-IP3R-N1.8)をXho Iで切断し、TAクローニングベクターから切り出されたDNA断片を挿入して、高感受性IP3分子センサー・タイプ1(mCYv-IP3R1)を作成した。
同様にプライマー(センスプライマー(配列番号16)、アンチセンスプライマー(配列番号18))を設計し、ラット耳下腺cDNAライブラリーを鋳型とした PCR反応により、タイプ2IP3受容体のリガンド結合部位を含むポリペプチドをコードする1.8kbのDNAの5'末端及び3'末端にXhoI切断部位を付加したDNA断片を作成した。このPCR産物をTAクローニングベクターに挿入して増幅した後、XhoIで切り出した。この切り出されたDNA断片をXho Iで切断したpH安定型IP3分子センサーに挿入して、高感受性IP3分子センサー・タイプ2(mCYv-IP3R2)を作成した。
プライマー(配列番号19)とアンチセンスプライマー(配列番号20)を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R-N1.8の配列番号1の704番目のアルギニンをグルタミンに置換して高感度型IP3分子センサー・タイプ3(mCYv-IP3R3S)を作成した。
同様にプライマー(配列番号21)とアンチセンスプライマー(配列番号22)を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R2の705番目のアルギニンをグルタミンに置換して高感度型IP3分子センサー・タイプ2S(mCYv-IP3R2S)を作成した。
変異導入前の分子センサーの蛍光比の変化を起こす最小のIP3濃度は100nMであったのに対し、高感度型タイプ1,高感度型タイプ2、高感度型タイプ2Sでは10nMのIP3で明らかな蛍光比の上昇が認められた。また、高感度型タイプ2、高感度型タイプ2S、高感度型タイプ3では、100nMのIP3による蛍光比の変化は4〜6倍に増大した(図17)。これらの結果から、高感度型IP3分子センサー・タイプ1、タイプ2、タイプ2S、タイプ3は、いずれも低濃度のIP3に対する反応性が増大していることが確認された。
タイプ1IP3受容体のリガンド結合部の508番目のリジンをアラニンに置換するとIP3に対する親和性が消失することが知られている(Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271: 18277-18284 (1996))。同様な親和性の消失はタイプ3IP3受容体でも起こることが予想されることから、pH安定型IP3分子センサ(mCYv-IP3R-N1.8)のリガンド結合部位のアミノ酸置換を行った。プライマー(配列番号23)とアンチセンスプライマー(配列番号24)を設計し、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてmCYv-IP3R-N1.8の771番目のリジンをアラニンに置換してコントロール分子(mCYv-IP3R3C)を作成した。
この分子をコードする遺伝子を導入したSH-SY5Y細胞をサポニンで穿孔し、IP3による蛍光比の変化を解析したところ、最大濃度(10μM)のIP3を添加しても、蛍光比の変化は全く認められなかった(図18)。この結果から、この分子はIP3に対する親和性を持たないコントロール分子として利用できることが確認された。
Claims (13)
- IP3受容体のリガンド結合部及び蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす2種の蛍光物質から成る分子センサー。
- 前記蛍光物質が、蛍光タンパク質ECFP又はその改変体及び蛍光タンパク質EYFP又はその改変体から成る請求項1に記載の分子センサー。
- 更に、局在化シグナルを有する請求項1又は2に記載の分子センサー。
- 前記IP3受容体のリガンド結合部が、以下の(1)又は(2)のいずれかのポリペプチドから成り、蛍光タンパク質ECFPが、(3)又は(4)のいずれかのポリペプチドから成り、蛍光タンパク質EYFPが、(5)又は(6)のいずれかのポリペプチドから成る請求項1〜3のいずれか一項に記載の分子センサー。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列の少なくとも490〜842番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(2)(1)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、イノシトール1,4,5三リン酸との親和性を有するポリペプチド
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列の21〜259番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
(4)(3)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、465〜495nmにピークを有する光を発光するポリペプチド
(5)配列番号1で表されるアミノ酸配列の899〜1137番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド
(6)(5)のポリペプチドにおいて、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、522〜548nmにピークを有する光を発光するポリペプチド - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の分子センサーをコードするDNA。
- 請求項5に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の分子センサーを細胞内に有する細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の分子センサーを体内に有する動物又は植物。
- 請求項7に記載の形質転換体、請求項8に記載の細胞又は請求項9に記載の動物若しくは植物に350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、該形質転換体又は該細胞におけるイノシトール1,4,5三リン酸の濃度を見積もる方法。
- 請求項7に記載の形質転換体、請求項8に記載の細胞又は請求項9に記載の動物若しくは植物に未知の薬剤を導入し、これに350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、IP3受容体のリガンド又は阻害剤をスクリーニングする方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の分子センサーから成るIP3検知装置。
- 請求項12に記載の装置と被検物とを接触させ、350〜500nmの光を照射して、400〜515nm及び515〜600nmにおける蛍光を測定し、これらの蛍光強度を指標として、被検物中のイノシトール1,4,5三リン酸の濃度を見積もる方法。
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