JP2003518246A5 - - Google Patents
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Description
【特許請求の範囲】
【請求項1】 膜の電位を測定する方法であって、
(a)膜電位の変化に応じて、膜の第一の面から膜の第二の面へと再分布することができる疎水性蛍光イオンを含む第一の試薬を導入する段階、
(b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンに付与するか、または(ii)蛍光イオンから励起状態のエネルギーを受け取ることによって、エネルギー移動を行なうことができる発色団を含み、膜の第一の面、または第二の面を標識する第二の試薬を導入する段階、
(c)膜を励起光に曝す段階、
(d)蛍光イオンと第二の試薬との間のエネルギー移動を測定する段階、および
(e)エネルギー移動を膜電位と関係づける段階
を含む方法。
【請求項2】 蛍光イオンと第二の試薬との間のエネルギー移動が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものである、請求項1記載の方法。
【請求項3】 膜が生物細胞の原形質膜である、請求項1記載の方法。
【請求項4】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項5】 膜が細胞内オルガネラである、請求項4記載の方法。
【請求項6】 細胞が、L-M(TK-)細胞、神経芽腫細胞、星状腫細胞、および新生児の心筋細胞からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項7】 膜がリン脂質二重層を含む、請求項1記載の方法。
【請求項8】 イオンがアニオンである、請求項1記載の方法。
【請求項9】 アニオンが一価である、請求項1記載の方法。
【請求項10】 アニオンが、ポリメチンオキソノール(polymethine oxonol)、ホウ酸テトラアリール(tetraaryl borate)、および遷移金属複合体からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項11】 アニオンが、以下の式:
【化1】
において、
Rが、独立にH、ヒドロカルビル、およびヘテロアルキルからなる群より独立に選択され、
Xが酸素またはイオウであり、かつ
nが1〜3の整数である化学式を有するオキソノール、およびその塩である、請求項10記載の方法。
【請求項12】 Xがイオウである、請求項11記載の方法。
【請求項13】 各Rが同一であり、C1-10のアルキルから選択されたヒドロカルビルであって、かつ
n=2である、請求項11記載の方法。
【請求項14】 アニオンが、以下の式:
[(Ar1)3B-Ar2-Y-FLU]-
において、
Ar1がアリール基であり、
Ar2がアリーレン(arylene)基であり、
Bがホウ素であり、
Yが酸素またはイオウであり、かつ
FLUが中性フルオロフォアである化学式を有するホウ酸テトラアリール、およびその誘導化合物である、請求項10記載の方法。
【請求項15】 Ar1がトリフルオロメチルフェニルであり、
Ar2がテトラフルオロフェニルであり、かつ
Yが酸素である、請求項14記載の方法。
【請求項16】 中性フルオロフォアが、ビマン(bimanes)、ジフルオロボラジアザインダセン(difluoroboradiazaindacenes)、およびクマリンからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項17】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化2】
において、
各R5が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、またはアルキレン付着点(alkylene attachment point)である化学式を有するビマンである、請求項16記載の方法。
【請求項18】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化3】
において、
各R1が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、アリール、ヘテロ芳香族、アラルケニル(aralkenyl)、およびアルキレン付着点からなる群より選択され、
各R2が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、フェニル、およびアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するジフルオロボラジアザインダセンである、請求項16記載の方法。
【請求項19】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化4】
【化5】
において、
各R3が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、ハロゲン、低級アルキル、CN、CF3およびOR5からなる群より選択され、
各R4が同一または異なっていてもよく、H、OR5、およびアルキレン付着点からなる群より選択され、
Zが、O、S、またはNR11であり、かつ
R5が、H、低級アルキル、またはアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するクマリンである、請求項16記載の方法。
【請求項20】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化6】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、かつ
XおよびYが、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、またはXおよびYがともにCH=CH-であり、
Z=アルキレンジイル(alkylenediyl)、ヘテロアルキレンジイル(heteroalkylenediyl)、またはヘテロシクロジイル(heterocyclodiyl)である化学式を有する遷移金属複合体である、請求項16記載の方法。
【請求項21】 Z=1,2-エタンジイル、1,3-プロパンジイル、2,3-ブタンジイル、1,2-シクロヘキサンジイル、1,2-シクロペンタンジイル、1,2-シクロヘプタンジイル、1,2-フェニレンジイル、3-オキサ-1,5-ペンタンジイル(1,3-oxa-1,5-pentanediyl)、3-アザ-3-(低級アルキル)-1,5-ペンタンジイル(1,3-aza-(lowere alkyl)-1,5-pentanediyl)、ピリジン-2,6-ビス(メチレン)、またはテトラヒドロフラン-2,5-ビス(メチレン)である、請求項20記載の方法。
【請求項22】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化7】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
X'およびY'が、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、または、X'およびY'がともにCH=CH-であり、かつ
Z'が独立に原子価結合、CR2、ピリジン-2-6-ジイルまたはテトラヒドロフラン-2,5-ジイルである化学式を有する遷移金属複合体である、請求項16記載の方法。
【請求項23】 第二の試薬がフルオロフォアである、請求項1記載の方法。
【請求項24】 第二の試薬が、それぞれフルオロフォアで標識されたレクチン、脂質、炭水化物、シトクロム、および抗体からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項25】 フルオロフォアが、キサンテン、シアニン、およびクマリンからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項26】 第二の試薬がリン脂質である、請求項24記載の方法。
【請求項27】 第一の試薬と第二の試薬がリンカーで共有結合している、請求項1記載の方法。
【請求項28】 リンカーが、以下の式:
X-(CH2)m-Zq-(CH2)m'-Z'q'-(CH2)m"q"-Y
において、
Xが、ポリメチンオキソノールおよび蛍光ホウ酸テトラアリールからなる群より選択される疎水性蛍光アニオンであり、
Yが、レクチンおよびリン脂質からなる群より選択される蛍光性の第二の試薬であり、
Z、Z'、Z"が、独立にO、S、SS、CO、COOであり、
m、m'およびm"が、0〜約32の整数であり、
q、q'、q"が、独立に0または1であり、かつ
m+q+m'+q'+m"+q"が約20〜40である化学式を有する化合物である、請求項27記載の方法。
【請求項29】 リンカーがチオエーテルである、請求項28記載の方法。
【請求項30】 (a)膜電位の変化に応じて、膜の第一の面から膜の第二の面へと再分布することができる疎水性蛍光イオンを含む第一の試薬、および、
(b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンに付与するか、または(ii)蛍光イオンから励起状態のエネルギーを受け取ることによって、エネルギー移動を行なうことができる発色団を含み、膜の第一の面、または第二の面を標識する第二の試薬
を含むキット。
【請求項31】 第一の試薬が、ポリメチンオキソノール、ホウ酸テトラアリール、および遷移金属複合体からなる群より選択され、かつ第二の試薬が、それぞれ、フルオロフォアで標識されたレクチン、脂質、炭水化物、シトクロム、および抗体からなる群より選択される、請求項30記載のキット。
【請求項32】 溶解補助剤をさらに含む、請求項30記載のキット。
【請求項33】 式A-L-Bにおいて、
Aが、独立にフルオロフォアに結合したポリメチンオキソノールまたはホウ酸テトラアリールであり、
Lがリンカーであり、かつBが、膜不透過性フルオロフォアまたは膜不透過性のフルオロフォア接合体である化学式を有する化合物。
【請求項34】 Aが、以下の式:
【化8】
において、少なくとも1個のRがアルキレン基であって、
Rが、独立にH、ヒドロカルビル、およびヘテロアルキルからなる群より選択され、
Xが酸素またはイオウであり、かつ
nが1〜3の整数である化学式を有するポリメチンオキソノールである、請求項33記載の方法。
【請求項35】 式Cou-PEを有する化合物において、
Couが、以下の式:
【化9】
において、
各R3が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、ハロゲン、低級アルキル、CN、CF3、COOR5、CON(R5)2、OR5、および付着点からなる群より選択され、
R4が、OR5およびN(R5)2からなる群より選択され、
Zが、O、S、またはNR5であり、かつ
R5が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、およびアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するクマリンであり、ならびに
PEが、N結合型ホスファチジルエタノールアミンである化合物。
【請求項36】 以下の式:
【化10】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、それぞれ独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
XおよびYが、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、またはXおよびYがともにCH=CH-であり、かつ
Z=アルキレンジイル(alkylenediyl)、ヘテロアルキレンジイル(heteroalkylenediyl)、またはヘテロシクロジイル(heterocyclodiyl)である化学式を有する化合物。
【請求項37】 Z=1,2-エタンジイル、1,3-プロパンジイル、2,3-ブタンジイル、1,2-シクロヘキサンジイル、1,2-シクロペンタンジイル、1,2-シクロヘプタンジイル、1,2-フェニレンジイル、3-オキサ-1,5-ペンタンジイル(1,3-oxa-1,5-pentanediyl)、3-アザ-3-(低級アルキル)-1,5-ペンタンジイル(1,3-aza-(lowere alkyl)-1,5-pentanediyl)、ピリジン-2,6-ビス(メチレン)、またはテトラヒドロフラン-2,5-ビス(メチレン)である、請求項36記載の化合物。
【請求項38】 以下の式:
【化11】
において、Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
X'およびY'が、それぞれ独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、または、X'およびY'がともにCH=CH-であり、かつ
Z'が独立して原子価結合、CR2、ピリジン-2-6-ジイルまたはテトラヒドロフラン-2,5-ジイルである化学式を有する化合物。
【請求項39】 以下の式:
【化12】
において、
Xが酸素またはイオウであり、
RがC4〜12ヒドロカルビルであり、
nが1〜3の整数であり、
nが1のときには、RがC7〜12ヒドロカルビルである化学式を有する化合物、およびその塩。
【請求項40】 以下の式:
【化13】
において、PEがN結合型ホスファチジルエタノールアミンである化学式を有する化合物。
【請求項41】 細胞における膜電位に影響を与える試験試料を同定する方法であって、
(a)請求項1記載の方法によって膜電位をともに測定する第一および第二の試薬を該細胞に添加する段階、
(b)膜を試験試料に曝す段階、
(c)膜電位を測定する段階、ならびに、
(d)段階(c)における電位と、試験試料不在下での電位とを比較し、それによって試験試料の膜電位に対する効果を測定する段階
を含む方法。
【請求項42】 (e)膜を、イオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる刺激に曝す段階、
(f)膜の電位を測定する段階、
(g)試験試料の存在下で膜電位を再測定する段階、および、
(h)段階(f)および(g)における膜電位を比較して、該刺激に対する試験試料の効果を測定する段階
をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項43】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項41または42記載の方法。
【請求項44】 試験試料をスクリーニングして、膜におけるイオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる化合物を同定する方法であって、
(a)第一の細胞集合および第二の細胞集合に、請求項1記載の方法によって膜電位をともに測定する第一および第二の試薬を添加する段階、
(b)第一および第二の細胞集合を、イオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体を変化させる刺激に選択的に曝す段階、
(c)第一の細胞集合を、試験試料に曝す段階、
(d)第一および第二の細胞集合の膜電位を測定する段階、および、
(e)第一の細胞集団と第二の細胞集合との膜電位の違いを、試験試料中の化合物が、膜におけるイオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる能力と関連づける段階
を含む方法。
【請求項45】 以下の式:
[(Ar1)3B-Ar2-Y-FLU]-
において、
Ar1がアリール基であり、
Ar2がアリーレン基であり、
Bがホウ素であり、
Yが酸素またはイオウであり、かつ
FLUが中性フルオロフォアである化学式を有する蛍光ホウ酸テトラアリールを合成する方法であって、
(a)式(P-Y-Ar2)-Mにおいて、Pが保護基であり、Mが保護されたホウ酸テトラアリール(Ar1)3B-Ar2-Y-Pを形成する金属である化学式を有する有機金属試薬によって、トリアリールボラン(Ar1)3Bを処理する段階、
(b)保護されたホウ酸テトラアリールから保護基を取り除いて、(Ar1)3B-Ar2-YHを形成する段階、および、
(c)(Ar1)3B-Ar2-YHを、離脱基を有するフルオロフォアFLUで処理して、蛍光ホウ酸テトラアリールを形成する段階
を含む方法。
【請求項46】 以下の式:
【化14】
において、
各R'が、それぞれ独立して、H、ヒドロカルビル、ハロゲン、CF3、またはリンカー基であり、
nが0〜5の整数であり、
各Xが、独立して、H、ハロゲン基、またはCF3であり、
mが0〜4の整数であり、
Yが、酸素またはイオウであり、かつ
FLUが、キサンテン、クマリン、シアニン、ビマン、およびジフルオロボラジアザインダセンからなる群より選択される中性フルオロフォアである化学式を有する化合物。
【請求項47】 少なくとも1個の細胞において、細胞膜における電位を検出する方法であって、
a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬を少なくとも1個の該細胞に提供する段階、
b)細胞膜に標的可能な発光性または蛍光性の化合物を含む第二の試薬であって、該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬を少なくとも1個の該細胞に提供する段階、および、
c)該第一の試薬または該第二の試薬からの光の放射を検出する段階
を含む方法。
【請求項48】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞膜の電位に依存する、請求項47記載の方法。
【請求項49】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞膜の電位に依存する、請求項47記載の方法。
【請求項50】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、少なくとも1個の細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項51】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、少なくとも1個の細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項52】 可動疎水性分子が荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項53】 可動疎水性分子が正に荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項54】 可動疎水性分子が負に荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項55】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項47記載の方法。
【請求項56】 第二の試薬が、天然蛍光タンパク質またはその相同体を含む、請求項47記載の方法。
【請求項57】 第二の試薬が、発光タンパク質またはその相同体を含む、請求項47記載の方法。
【請求項58】 第一の試薬がランタニドイオンを含む、請求項47記載の方法。
【請求項59】 細胞膜が生細胞の原形質膜である、請求項48記載の方法。
【請求項60】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の一方の側から該細胞膜の他方の側に再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項61】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の外に再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項62】 第二の試薬が、細胞膜の電位に応じて、生細胞の中で再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項63】 第二の試薬が、膜結合タンパク質、もしくは膜内在性タンパク質、またはそれらの断片に機能的に結合する、請求項49記載の方法。
【請求項64】 細胞が膜電位調節因子をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項65】 細胞が組織試料に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項66】 細胞が初代培養に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項67】 細胞が神経細胞である、請求項49記載の方法。
【請求項68】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項56記載の方法。
【請求項69】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項56記載の方法。
【請求項70】 発光タンパク質またはその相同体が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項71】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項64記載の方法。
【請求項72】 生細胞における、細胞内小器官の膜電位をモニターする方法であって、
1)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬を生細胞に提供する段階、
2)細胞内小器官膜に標的可能な発光性または蛍光性の化合物を含み、かつ該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬を該生細胞に提供する段階、
3)該第一の試薬または該第二の試薬からの光の放射を検出する段階
を含む方法。
【請求項73】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞内小器官膜の電位に依存する、請求項72記載の方法。
【請求項74】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞内小器官膜の電位に依存する、請求項72記載の方法。
【請求項75】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、生細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項76】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、生細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項77】 第二の試薬が生細胞の中で発現される、請求項72記載の方法。
【請求項78】 可動疎水性分子が、細胞内小器官膜の電位に応じて、該細胞内小器官膜の一方の側から該細胞内小器官膜の他方の側に再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項79】 可動疎水性分子が、細胞内小器官膜の電位に応じて、該細胞内小器官膜から再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項80】 第二の試薬が、細胞内小器官膜の電位に応じて、生細胞の中で再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項81】 第二の試薬が、細胞内小器官膜結合タンパク質、もしくは細胞内小器官膜内在性タンパク質、またはそれらの断片に機能的に結合する、請求項72記載の方法。
【請求項82】 細胞が膜電位調節因子をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項83】 可動疎水性分子が荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項84】 可動疎水性分子が正に荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項85】 可動疎水性分子が負に荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項86】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項72記載の方法。
【請求項87】 第一の試薬がランタニドイオンを含む、請求項72記載の方法。
【請求項88】 第一および第二の試薬を共焦的に照射する、請求項74記載の方法。
【請求項89】 第一および第二の試薬を二光子照射法(two photon irradiation)によって照射する、請求項74記載の方法。
【請求項90】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項82記載の方法。
【請求項91】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項92】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項91記載の方法。
【請求項93】 発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項94】 a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬、
b)細胞膜に標的可能な生物発光性または天然蛍光性のタンパク質を含む第二の試薬であって、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬
を含む遺伝子組換え生物。
【請求項95】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞膜の電位に依存する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項96】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞膜の電位に依存する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項97】 第二の試薬が一定の組織で発現される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項98】 一定の組織が膜電位調節因子をも発現する、請求項97記載の遺伝子組換え生物。
【請求項99】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項100】 荷電した疎水性蛍光分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の一方の側から該細胞膜の他方の側に再分布する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項101】 生物発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項102】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項98記載の遺伝子組換え生物。
【請求項103】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項99記載の遺伝子組換え生物。
【請求項104】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項103記載の遺伝子組換え生物。
【請求項105】 a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬、
b)細胞膜に標的可能な生物発光性または天然蛍光性のタンパク質を含み、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光し、かつ該第一の試薬または該第二の試薬の光の放射が、該細胞膜の電位に依存するものである第二の試薬
を含む生細胞。
【請求項106】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が細胞膜の電位に依存する、請求項105記載の生細胞。
【請求項107】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項105記載の生細胞。
【請求項108】 可動疎水性分子が荷電している、請求項105記載の生細胞。
【請求項109】 第二の試薬が神経組織で発現される、請求項105記載の生細胞。
【請求項110】 神経組織が非天然型の膜電位調節因子をも発現する、請求項105記載の生細胞。
【請求項111】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項105記載の生細胞。
【請求項112】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に反応して、細胞膜の一方の側から、該細胞膜の他方の側へ再分布する、請求項105記載の生細胞。
【請求項113】 生物発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項105記載の生細胞。
【請求項114】 第二の試薬が、膜電位調節因子と機能的に共役している、請求項110記載の生細胞。
【請求項115】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFPまたはその相同体である、請求項111記載の生細胞。
【請求項116】 オワンクラゲ(Aequorea)のGFPまたはその相同体が、S72A、Y145F、およびT203Iの変異を含む、請求項115記載の生細胞。
【請求項117】 標的イオンチャネルの活性を修飾する試験化学物質をスクリーニングする方法であって、
1)i)標的イオンチャネルと、
ii)生細胞における細胞膜の静止膜電位を約-150 mV〜+100 mVの安定な所定値にセットする膜電位調節因子とを含む、生細胞を提供する段階、
2)生細胞に試験化学物質を接触させる段階、
3)細胞膜の膜電位を検出する段階を含む、方法。
【請求項118】 膜電位調節因子が非天然型である、請求項117記載の方法。
【請求項119】 生細胞が、以下を含む第一の試薬を含む電位センサーをさらに含む、請求項118記載の方法であって、
a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性蛍光分子を含む第一の試薬、
b)生細胞の細胞膜に標的可能な発光化合物または蛍光化合物を含む第二の試薬であって、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬。
【請求項120】 検出する段階が、第一の試薬、または第二の試薬からの光の放射を検出する段階、および第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を、細胞膜の膜電位に関連づける段階を含む、請求項119記載の方法。
【請求項121】 4)細胞に試験化学物質を接触させる前に、第一の試薬または試薬からの光を検出する段階、および
5)第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を、細胞膜の膜電位に関連づける段階をさらに含む、請求項119記載の方法。
【請求項122】 試験化学物質の存在下における生細胞の膜電位を、試験化学物質の非存在下における生細胞の膜電位と比較する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項123】 標的イオンチャネルおよび膜電位調節因子が同一である、請求項121記載の方法。
【請求項124】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、生細胞に電磁放射線を照射して、第一の試薬を選択的に照射する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項125】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、生細胞に電磁放射線を照射して、第一の試薬を選択的に照射する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項126】 膜電位調節因子が外因的に発現される、請求項121記載の方法。
【請求項127】 膜電位調節因子が内因的に発現される、請求項121記載の方法。
【請求項128】 膜電位調節因子が、イオンチャネル、イオンポンプ、リガンド依存性イオンチャネルおよびイオノフォアからなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項129】 膜電位調節因子および第一の試薬が機能的に共役している、請求項121記載の方法。
【請求項130】 細胞にチャネル遮断物質を接触させる段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項131】 イオンチャネルが、内向き整流性カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、およびGABA輸送体からなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項132】 チャネル遮断物質が、バリウム、カドミウム、セシウム、およびガドリニウムからなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項133】 イオンチャネルが内向き整流性カリウムチャネルまたはその相同体である、請求項121記載の方法。
【請求項134】 イオンチャネルがリガンド依存性イオンチャネルまたはその相同体である、請求項121記載の方法。
【請求項135】 細胞膜が形質膜である、請求項121記載の方法。
【請求項136】 細胞膜がミトコンドリア膜である、請求項121記載の方法。
【請求項137】 細胞膜が小胞体膜である、請求項121記載の方法。
【請求項138】 細胞膜が筋小胞体膜である、請求項121記載の方法。
【請求項139】 標的イオンチャネル活性を修飾する試験化学物質をスクリーニングする方法であって、
1)i)標的イオンチャネルと、
ii)標的イオンチャネルの活性化によって生じ、通常は不安定な膜電位を安定に維持する、生細胞中の細胞膜の膜電位調節因子とを含む生細胞を提供する段階、
2)生細胞に試験化学物質を接触させる段階、
3)細胞膜の膜電位を検出する段階を含む、方法。
【請求項1】 膜の電位を測定する方法であって、
(a)膜電位の変化に応じて、膜の第一の面から膜の第二の面へと再分布することができる疎水性蛍光イオンを含む第一の試薬を導入する段階、
(b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンに付与するか、または(ii)蛍光イオンから励起状態のエネルギーを受け取ることによって、エネルギー移動を行なうことができる発色団を含み、膜の第一の面、または第二の面を標識する第二の試薬を導入する段階、
(c)膜を励起光に曝す段階、
(d)蛍光イオンと第二の試薬との間のエネルギー移動を測定する段階、および
(e)エネルギー移動を膜電位と関係づける段階
を含む方法。
【請求項2】 蛍光イオンと第二の試薬との間のエネルギー移動が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものである、請求項1記載の方法。
【請求項3】 膜が生物細胞の原形質膜である、請求項1記載の方法。
【請求項4】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項5】 膜が細胞内オルガネラである、請求項4記載の方法。
【請求項6】 細胞が、L-M(TK-)細胞、神経芽腫細胞、星状腫細胞、および新生児の心筋細胞からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項7】 膜がリン脂質二重層を含む、請求項1記載の方法。
【請求項8】 イオンがアニオンである、請求項1記載の方法。
【請求項9】 アニオンが一価である、請求項1記載の方法。
【請求項10】 アニオンが、ポリメチンオキソノール(polymethine oxonol)、ホウ酸テトラアリール(tetraaryl borate)、および遷移金属複合体からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項11】 アニオンが、以下の式:
【化1】
において、
Rが、独立にH、ヒドロカルビル、およびヘテロアルキルからなる群より独立に選択され、
Xが酸素またはイオウであり、かつ
nが1〜3の整数である化学式を有するオキソノール、およびその塩である、請求項10記載の方法。
【請求項12】 Xがイオウである、請求項11記載の方法。
【請求項13】 各Rが同一であり、C1-10のアルキルから選択されたヒドロカルビルであって、かつ
n=2である、請求項11記載の方法。
【請求項14】 アニオンが、以下の式:
[(Ar1)3B-Ar2-Y-FLU]-
において、
Ar1がアリール基であり、
Ar2がアリーレン(arylene)基であり、
Bがホウ素であり、
Yが酸素またはイオウであり、かつ
FLUが中性フルオロフォアである化学式を有するホウ酸テトラアリール、およびその誘導化合物である、請求項10記載の方法。
【請求項15】 Ar1がトリフルオロメチルフェニルであり、
Ar2がテトラフルオロフェニルであり、かつ
Yが酸素である、請求項14記載の方法。
【請求項16】 中性フルオロフォアが、ビマン(bimanes)、ジフルオロボラジアザインダセン(difluoroboradiazaindacenes)、およびクマリンからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項17】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化2】
において、
各R5が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、またはアルキレン付着点(alkylene attachment point)である化学式を有するビマンである、請求項16記載の方法。
【請求項18】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化3】
において、
各R1が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、アリール、ヘテロ芳香族、アラルケニル(aralkenyl)、およびアルキレン付着点からなる群より選択され、
各R2が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、フェニル、およびアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するジフルオロボラジアザインダセンである、請求項16記載の方法。
【請求項19】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化4】
【化5】
において、
各R3が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、ハロゲン、低級アルキル、CN、CF3およびOR5からなる群より選択され、
各R4が同一または異なっていてもよく、H、OR5、およびアルキレン付着点からなる群より選択され、
Zが、O、S、またはNR11であり、かつ
R5が、H、低級アルキル、またはアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するクマリンである、請求項16記載の方法。
【請求項20】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化6】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、かつ
XおよびYが、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、またはXおよびYがともにCH=CH-であり、
Z=アルキレンジイル(alkylenediyl)、ヘテロアルキレンジイル(heteroalkylenediyl)、またはヘテロシクロジイル(heterocyclodiyl)である化学式を有する遷移金属複合体である、請求項16記載の方法。
【請求項21】 Z=1,2-エタンジイル、1,3-プロパンジイル、2,3-ブタンジイル、1,2-シクロヘキサンジイル、1,2-シクロペンタンジイル、1,2-シクロヘプタンジイル、1,2-フェニレンジイル、3-オキサ-1,5-ペンタンジイル(1,3-oxa-1,5-pentanediyl)、3-アザ-3-(低級アルキル)-1,5-ペンタンジイル(1,3-aza-(lowere alkyl)-1,5-pentanediyl)、ピリジン-2,6-ビス(メチレン)、またはテトラヒドロフラン-2,5-ビス(メチレン)である、請求項20記載の方法。
【請求項22】 中性フルオロフォアが、以下の式:
【化7】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
X'およびY'が、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、または、X'およびY'がともにCH=CH-であり、かつ
Z'が独立に原子価結合、CR2、ピリジン-2-6-ジイルまたはテトラヒドロフラン-2,5-ジイルである化学式を有する遷移金属複合体である、請求項16記載の方法。
【請求項23】 第二の試薬がフルオロフォアである、請求項1記載の方法。
【請求項24】 第二の試薬が、それぞれフルオロフォアで標識されたレクチン、脂質、炭水化物、シトクロム、および抗体からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項25】 フルオロフォアが、キサンテン、シアニン、およびクマリンからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項26】 第二の試薬がリン脂質である、請求項24記載の方法。
【請求項27】 第一の試薬と第二の試薬がリンカーで共有結合している、請求項1記載の方法。
【請求項28】 リンカーが、以下の式:
X-(CH2)m-Zq-(CH2)m'-Z'q'-(CH2)m"q"-Y
において、
Xが、ポリメチンオキソノールおよび蛍光ホウ酸テトラアリールからなる群より選択される疎水性蛍光アニオンであり、
Yが、レクチンおよびリン脂質からなる群より選択される蛍光性の第二の試薬であり、
Z、Z'、Z"が、独立にO、S、SS、CO、COOであり、
m、m'およびm"が、0〜約32の整数であり、
q、q'、q"が、独立に0または1であり、かつ
m+q+m'+q'+m"+q"が約20〜40である化学式を有する化合物である、請求項27記載の方法。
【請求項29】 リンカーがチオエーテルである、請求項28記載の方法。
【請求項30】 (a)膜電位の変化に応じて、膜の第一の面から膜の第二の面へと再分布することができる疎水性蛍光イオンを含む第一の試薬、および、
(b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンに付与するか、または(ii)蛍光イオンから励起状態のエネルギーを受け取ることによって、エネルギー移動を行なうことができる発色団を含み、膜の第一の面、または第二の面を標識する第二の試薬
を含むキット。
【請求項31】 第一の試薬が、ポリメチンオキソノール、ホウ酸テトラアリール、および遷移金属複合体からなる群より選択され、かつ第二の試薬が、それぞれ、フルオロフォアで標識されたレクチン、脂質、炭水化物、シトクロム、および抗体からなる群より選択される、請求項30記載のキット。
【請求項32】 溶解補助剤をさらに含む、請求項30記載のキット。
【請求項33】 式A-L-Bにおいて、
Aが、独立にフルオロフォアに結合したポリメチンオキソノールまたはホウ酸テトラアリールであり、
Lがリンカーであり、かつBが、膜不透過性フルオロフォアまたは膜不透過性のフルオロフォア接合体である化学式を有する化合物。
【請求項34】 Aが、以下の式:
【化8】
において、少なくとも1個のRがアルキレン基であって、
Rが、独立にH、ヒドロカルビル、およびヘテロアルキルからなる群より選択され、
Xが酸素またはイオウであり、かつ
nが1〜3の整数である化学式を有するポリメチンオキソノールである、請求項33記載の方法。
【請求項35】 式Cou-PEを有する化合物において、
Couが、以下の式:
【化9】
において、
各R3が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、ハロゲン、低級アルキル、CN、CF3、COOR5、CON(R5)2、OR5、および付着点からなる群より選択され、
R4が、OR5およびN(R5)2からなる群より選択され、
Zが、O、S、またはNR5であり、かつ
R5が同一または異なっていてもよく、それぞれ独立にH、低級アルキル、およびアルキレン付着点からなる群より選択される化学式を有するクマリンであり、ならびに
PEが、N結合型ホスファチジルエタノールアミンである化合物。
【請求項36】 以下の式:
【化10】
において、
Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、それぞれ独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
XおよびYが、独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、またはXおよびYがともにCH=CH-であり、かつ
Z=アルキレンジイル(alkylenediyl)、ヘテロアルキレンジイル(heteroalkylenediyl)、またはヘテロシクロジイル(heterocyclodiyl)である化学式を有する化合物。
【請求項37】 Z=1,2-エタンジイル、1,3-プロパンジイル、2,3-ブタンジイル、1,2-シクロヘキサンジイル、1,2-シクロペンタンジイル、1,2-シクロヘプタンジイル、1,2-フェニレンジイル、3-オキサ-1,5-ペンタンジイル(1,3-oxa-1,5-pentanediyl)、3-アザ-3-(低級アルキル)-1,5-ペンタンジイル(1,3-aza-(lowere alkyl)-1,5-pentanediyl)、ピリジン-2,6-ビス(メチレン)、またはテトラヒドロフラン-2,5-ビス(メチレン)である、請求項36記載の化合物。
【請求項38】 以下の式:
【化11】
において、Ln=Tb、EuまたはSmであり、
Rが、独立にH、C1〜C8アルキル、C1〜C8シクロアルキル、またはC1〜C4ペルフルオロアルキルであり、
X'およびY'が、それぞれ独立にH、F、Br、I、NO2、CF3、低級(C1〜C4)アルキル、CN、Ph、O-(低級アルキル)、もしくはOPhであるか、または、X'およびY'がともにCH=CH-であり、かつ
Z'が独立して原子価結合、CR2、ピリジン-2-6-ジイルまたはテトラヒドロフラン-2,5-ジイルである化学式を有する化合物。
【請求項39】 以下の式:
【化12】
において、
Xが酸素またはイオウであり、
RがC4〜12ヒドロカルビルであり、
nが1〜3の整数であり、
nが1のときには、RがC7〜12ヒドロカルビルである化学式を有する化合物、およびその塩。
【請求項40】 以下の式:
【化13】
において、PEがN結合型ホスファチジルエタノールアミンである化学式を有する化合物。
【請求項41】 細胞における膜電位に影響を与える試験試料を同定する方法であって、
(a)請求項1記載の方法によって膜電位をともに測定する第一および第二の試薬を該細胞に添加する段階、
(b)膜を試験試料に曝す段階、
(c)膜電位を測定する段階、ならびに、
(d)段階(c)における電位と、試験試料不在下での電位とを比較し、それによって試験試料の膜電位に対する効果を測定する段階
を含む方法。
【請求項42】 (e)膜を、イオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる刺激に曝す段階、
(f)膜の電位を測定する段階、
(g)試験試料の存在下で膜電位を再測定する段階、および、
(h)段階(f)および(g)における膜電位を比較して、該刺激に対する試験試料の効果を測定する段階
をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項43】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項41または42記載の方法。
【請求項44】 試験試料をスクリーニングして、膜におけるイオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる化合物を同定する方法であって、
(a)第一の細胞集合および第二の細胞集合に、請求項1記載の方法によって膜電位をともに測定する第一および第二の試薬を添加する段階、
(b)第一および第二の細胞集合を、イオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体を変化させる刺激に選択的に曝す段階、
(c)第一の細胞集合を、試験試料に曝す段階、
(d)第一および第二の細胞集合の膜電位を測定する段階、および、
(e)第一の細胞集団と第二の細胞集合との膜電位の違いを、試験試料中の化合物が、膜におけるイオンチャンネル、イオンポンプ、またはイオン交換体の活性を変化させる能力と関連づける段階
を含む方法。
【請求項45】 以下の式:
[(Ar1)3B-Ar2-Y-FLU]-
において、
Ar1がアリール基であり、
Ar2がアリーレン基であり、
Bがホウ素であり、
Yが酸素またはイオウであり、かつ
FLUが中性フルオロフォアである化学式を有する蛍光ホウ酸テトラアリールを合成する方法であって、
(a)式(P-Y-Ar2)-Mにおいて、Pが保護基であり、Mが保護されたホウ酸テトラアリール(Ar1)3B-Ar2-Y-Pを形成する金属である化学式を有する有機金属試薬によって、トリアリールボラン(Ar1)3Bを処理する段階、
(b)保護されたホウ酸テトラアリールから保護基を取り除いて、(Ar1)3B-Ar2-YHを形成する段階、および、
(c)(Ar1)3B-Ar2-YHを、離脱基を有するフルオロフォアFLUで処理して、蛍光ホウ酸テトラアリールを形成する段階
を含む方法。
【請求項46】 以下の式:
【化14】
において、
各R'が、それぞれ独立して、H、ヒドロカルビル、ハロゲン、CF3、またはリンカー基であり、
nが0〜5の整数であり、
各Xが、独立して、H、ハロゲン基、またはCF3であり、
mが0〜4の整数であり、
Yが、酸素またはイオウであり、かつ
FLUが、キサンテン、クマリン、シアニン、ビマン、およびジフルオロボラジアザインダセンからなる群より選択される中性フルオロフォアである化学式を有する化合物。
【請求項47】 少なくとも1個の細胞において、細胞膜における電位を検出する方法であって、
a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬を少なくとも1個の該細胞に提供する段階、
b)細胞膜に標的可能な発光性または蛍光性の化合物を含む第二の試薬であって、該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬を少なくとも1個の該細胞に提供する段階、および、
c)該第一の試薬または該第二の試薬からの光の放射を検出する段階
を含む方法。
【請求項48】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞膜の電位に依存する、請求項47記載の方法。
【請求項49】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞膜の電位に依存する、請求項47記載の方法。
【請求項50】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、少なくとも1個の細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項51】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、少なくとも1個の細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項52】 可動疎水性分子が荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項53】 可動疎水性分子が正に荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項54】 可動疎水性分子が負に荷電している、請求項47記載の方法。
【請求項55】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項47記載の方法。
【請求項56】 第二の試薬が、天然蛍光タンパク質またはその相同体を含む、請求項47記載の方法。
【請求項57】 第二の試薬が、発光タンパク質またはその相同体を含む、請求項47記載の方法。
【請求項58】 第一の試薬がランタニドイオンを含む、請求項47記載の方法。
【請求項59】 細胞膜が生細胞の原形質膜である、請求項48記載の方法。
【請求項60】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の一方の側から該細胞膜の他方の側に再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項61】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の外に再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項62】 第二の試薬が、細胞膜の電位に応じて、生細胞の中で再分布する、請求項49記載の方法。
【請求項63】 第二の試薬が、膜結合タンパク質、もしくは膜内在性タンパク質、またはそれらの断片に機能的に結合する、請求項49記載の方法。
【請求項64】 細胞が膜電位調節因子をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項65】 細胞が組織試料に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項66】 細胞が初代培養に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項67】 細胞が神経細胞である、請求項49記載の方法。
【請求項68】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項56記載の方法。
【請求項69】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項56記載の方法。
【請求項70】 発光タンパク質またはその相同体が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項71】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項64記載の方法。
【請求項72】 生細胞における、細胞内小器官の膜電位をモニターする方法であって、
1)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬を生細胞に提供する段階、
2)細胞内小器官膜に標的可能な発光性または蛍光性の化合物を含み、かつ該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬を該生細胞に提供する段階、
3)該第一の試薬または該第二の試薬からの光の放射を検出する段階
を含む方法。
【請求項73】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞内小器官膜の電位に依存する、請求項72記載の方法。
【請求項74】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞内小器官膜の電位に依存する、請求項72記載の方法。
【請求項75】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、生細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項76】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、生細胞に電磁放射線を照射して、該第一の試薬を照射する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項77】 第二の試薬が生細胞の中で発現される、請求項72記載の方法。
【請求項78】 可動疎水性分子が、細胞内小器官膜の電位に応じて、該細胞内小器官膜の一方の側から該細胞内小器官膜の他方の側に再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項79】 可動疎水性分子が、細胞内小器官膜の電位に応じて、該細胞内小器官膜から再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項80】 第二の試薬が、細胞内小器官膜の電位に応じて、生細胞の中で再分布する、請求項72記載の方法。
【請求項81】 第二の試薬が、細胞内小器官膜結合タンパク質、もしくは細胞内小器官膜内在性タンパク質、またはそれらの断片に機能的に結合する、請求項72記載の方法。
【請求項82】 細胞が膜電位調節因子をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項83】 可動疎水性分子が荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項84】 可動疎水性分子が正に荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項85】 可動疎水性分子が負に荷電している、請求項72記載の方法。
【請求項86】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項72記載の方法。
【請求項87】 第一の試薬がランタニドイオンを含む、請求項72記載の方法。
【請求項88】 第一および第二の試薬を共焦的に照射する、請求項74記載の方法。
【請求項89】 第一および第二の試薬を二光子照射法(two photon irradiation)によって照射する、請求項74記載の方法。
【請求項90】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項82記載の方法。
【請求項91】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項92】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項91記載の方法。
【請求項93】 発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項94】 a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬、
b)細胞膜に標的可能な生物発光性または天然蛍光性のタンパク質を含む第二の試薬であって、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬
を含む遺伝子組換え生物。
【請求項95】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が、細胞膜の電位に依存する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項96】 第一の試薬または第二の試薬の光の放射が、細胞膜の電位に依存する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項97】 第二の試薬が一定の組織で発現される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項98】 一定の組織が膜電位調節因子をも発現する、請求項97記載の遺伝子組換え生物。
【請求項99】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項100】 荷電した疎水性蛍光分子が、細胞膜の電位に応じて、該細胞膜の一方の側から該細胞膜の他方の側に再分布する、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項101】 生物発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項94記載の遺伝子組換え生物。
【請求項102】 第二の試薬が膜電位調節因子と機能的に結合している、請求項98記載の遺伝子組換え生物。
【請求項103】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:7にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項99記載の遺伝子組換え生物。
【請求項104】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、配列番号:1にコードされている配列と少なくとも85%一致する配列を含む、請求項103記載の遺伝子組換え生物。
【請求項105】 a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性分子を含む第一の試薬、
b)細胞膜に標的可能な生物発光性または天然蛍光性のタンパク質を含み、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光し、かつ該第一の試薬または該第二の試薬の光の放射が、該細胞膜の電位に依存するものである第二の試薬
を含む生細胞。
【請求項106】 第一の試薬と第二の試薬との間におけるエネルギー移動効率が細胞膜の電位に依存する、請求項105記載の生細胞。
【請求項107】 可動疎水性分子が蛍光性である、請求項105記載の生細胞。
【請求項108】 可動疎水性分子が荷電している、請求項105記載の生細胞。
【請求項109】 第二の試薬が神経組織で発現される、請求項105記載の生細胞。
【請求項110】 神経組織が非天然型の膜電位調節因子をも発現する、請求項105記載の生細胞。
【請求項111】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFP、ウミシイタケ(Renilla)のGFP、ウミエラ(Ptilosarcus)のGFP、スナギンチャク(Zoanthus)のGFP、イソギンチャク(Anemonia)のGFP、およびサンゴ(Discosoma)のGFPからなる群より選択される、請求項105記載の生細胞。
【請求項112】 可動疎水性分子が、細胞膜の電位に反応して、細胞膜の一方の側から、該細胞膜の他方の側へ再分布する、請求項105記載の生細胞。
【請求項113】 生物発光タンパク質が、ウミホタル(Cypridina)のルシフェラーゼ、ホタル(Photinus)のルシフェラーゼ、ホタル(Photuris)のルシフェラーゼ、ホタル(Luciola)のルシフェラーゼ、およびヒカリコメツキ(Pyrophorus)のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項105記載の生細胞。
【請求項114】 第二の試薬が、膜電位調節因子と機能的に共役している、請求項110記載の生細胞。
【請求項115】 天然蛍光タンパク質またはその相同体が、オワンクラゲ(Aequorea)のGFPまたはその相同体である、請求項111記載の生細胞。
【請求項116】 オワンクラゲ(Aequorea)のGFPまたはその相同体が、S72A、Y145F、およびT203Iの変異を含む、請求項115記載の生細胞。
【請求項117】 標的イオンチャネルの活性を修飾する試験化学物質をスクリーニングする方法であって、
1)i)標的イオンチャネルと、
ii)生細胞における細胞膜の静止膜電位を約-150 mV〜+100 mVの安定な所定値にセットする膜電位調節因子とを含む、生細胞を提供する段階、
2)生細胞に試験化学物質を接触させる段階、
3)細胞膜の膜電位を検出する段階を含む、方法。
【請求項118】 膜電位調節因子が非天然型である、請求項117記載の方法。
【請求項119】 生細胞が、以下を含む第一の試薬を含む電位センサーをさらに含む、請求項118記載の方法であって、
a)FRET受容体またはFRET供与体である可動疎水性蛍光分子を含む第一の試薬、
b)生細胞の細胞膜に標的可能な発光化合物または蛍光化合物を含む第二の試薬であって、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または該第一の試薬の光の放射を消光する第二の試薬。
【請求項120】 検出する段階が、第一の試薬、または第二の試薬からの光の放射を検出する段階、および第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を、細胞膜の膜電位に関連づける段階を含む、請求項119記載の方法。
【請求項121】 4)細胞に試験化学物質を接触させる前に、第一の試薬または試薬からの光を検出する段階、および
5)第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を、細胞膜の膜電位に関連づける段階をさらに含む、請求項119記載の方法。
【請求項122】 試験化学物質の存在下における生細胞の膜電位を、試験化学物質の非存在下における生細胞の膜電位と比較する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項123】 標的イオンチャネルおよび膜電位調節因子が同一である、請求項121記載の方法。
【請求項124】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する前に、生細胞に電磁放射線を照射して、第一の試薬を選択的に照射する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項125】 第一の試薬または第二の試薬からの光の放射を検出する過程で、生細胞に電磁放射線を照射して、第一の試薬を選択的に照射する段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項126】 膜電位調節因子が外因的に発現される、請求項121記載の方法。
【請求項127】 膜電位調節因子が内因的に発現される、請求項121記載の方法。
【請求項128】 膜電位調節因子が、イオンチャネル、イオンポンプ、リガンド依存性イオンチャネルおよびイオノフォアからなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項129】 膜電位調節因子および第一の試薬が機能的に共役している、請求項121記載の方法。
【請求項130】 細胞にチャネル遮断物質を接触させる段階をさらに含む、請求項121記載の方法。
【請求項131】 イオンチャネルが、内向き整流性カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、およびGABA輸送体からなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項132】 チャネル遮断物質が、バリウム、カドミウム、セシウム、およびガドリニウムからなる群より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項133】 イオンチャネルが内向き整流性カリウムチャネルまたはその相同体である、請求項121記載の方法。
【請求項134】 イオンチャネルがリガンド依存性イオンチャネルまたはその相同体である、請求項121記載の方法。
【請求項135】 細胞膜が形質膜である、請求項121記載の方法。
【請求項136】 細胞膜がミトコンドリア膜である、請求項121記載の方法。
【請求項137】 細胞膜が小胞体膜である、請求項121記載の方法。
【請求項138】 細胞膜が筋小胞体膜である、請求項121記載の方法。
【請求項139】 標的イオンチャネル活性を修飾する試験化学物質をスクリーニングする方法であって、
1)i)標的イオンチャネルと、
ii)標的イオンチャネルの活性化によって生じ、通常は不安定な膜電位を安定に維持する、生細胞中の細胞膜の膜電位調節因子とを含む生細胞を提供する段階、
2)生細胞に試験化学物質を接触させる段階、
3)細胞膜の膜電位を検出する段階を含む、方法。
発明の概要
生物学的系における膜電位の変化を検出するための方法および組成物が提供される。検出法の1つの局面は、以下の段階を含む:
a)生細胞に、荷電疎水性分子を含む第一の試薬を与える段階。典型的には、分子は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)受容体または供与体であるか、または、消光物質であり、膜を横切る電位の変化に応答して生物膜の膜内に再分布できる;
b)細胞に、細胞内の生物膜の第一の面または第二の面を標識できる第二の試薬を与える段階。1つの局面において、第二の試薬は、膜の電位変化に応答して膜から他の部位に再分布できる。典型的には、第二の試薬は、第一の試薬とエネルギー転移をすることのできる、または、第一の試薬の光放射を消失できる、発光または蛍光成分を含む;
c)第一の試薬または第二の試薬からの光放射を検出する段階。
生物学的系における膜電位の変化を検出するための方法および組成物が提供される。検出法の1つの局面は、以下の段階を含む:
a)生細胞に、荷電疎水性分子を含む第一の試薬を与える段階。典型的には、分子は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)受容体または供与体であるか、または、消光物質であり、膜を横切る電位の変化に応答して生物膜の膜内に再分布できる;
b)細胞に、細胞内の生物膜の第一の面または第二の面を標識できる第二の試薬を与える段階。1つの局面において、第二の試薬は、膜の電位変化に応答して膜から他の部位に再分布できる。典型的には、第二の試薬は、第一の試薬とエネルギー転移をすることのできる、または、第一の試薬の光放射を消失できる、発光または蛍光成分を含む;
c)第一の試薬または第二の試薬からの光放射を検出する段階。
本発明の別の局面は、生細胞における細胞下小器官膜電位をモニタリングする方法を含み、これは、
1)生細胞に、疎水性で、荷電した蛍光分子を含む第一の試薬を与える段階、そして
2)生細胞に、発光または蛍光成分を含む第二の試薬を与える段階、ここでの発光または蛍光成分は細胞下膜に標的可能であり、第二の試薬は、該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または第一の試薬の光放射を消失する、ことを含む。
1)生細胞に、疎水性で、荷電した蛍光分子を含む第一の試薬を与える段階、そして
2)生細胞に、発光または蛍光成分を含む第二の試薬を与える段階、ここでの発光または蛍光成分は細胞下膜に標的可能であり、第二の試薬は、該第一の試薬とエネルギー移動をするか、または第一の試薬の光放射を消失する、ことを含む。
本発明の別の局面は、荷電した疎水性蛍光分子を含む第一の試薬、および生物発光または天然蛍光タンパク質を含む第二の試薬を含むトランスジェニック生物である。生物発光または天然蛍光タンパク質は、典型的には、トランスジェニック生物内で発現され、細胞膜に標的可能である。トランスジェニック生物に提供された第二の試薬は、第一の試薬とエネルギー移動をするか、または、該第一の試薬の光放射を消失する。このようなトランスジェニック生物は、全動物試験で使用して、インビボでの神経活性に対する薬物作用をモニタリングし得るか、または、適切なモデル系での疾病状態を解明し得る。
本発明の方法に使用する組成物は典型的には、2つの試薬を含む。第一の試薬は、膜貫通電位の変化に応答して、生物膜内に迅速に再分布する、可動性疎水性分子を含む。典型的には、第一の試薬は荷電し、好ましくは生細胞内の生理的条件下で正に荷電している。この種を、可動性または疎水性分子と称する。第二の試薬は、典型的には可動蛍光分子に励起状態エネルギーを供与することにより、第一の試薬とエネルギー移動をすることのできる、発光または蛍光成分を含む。第二の試薬が蛍光成分である場合、それはまた、可動蛍光分子からの励起状態エネルギーを受けることも可能であり得る。
長寿命の(>100n秒)の放射脂質も、静止第二の試薬として機能できる。クラスの一例は、金属イオンとキレートを形成でき、光誘導長寿命放射をすることのできる、荷電頭基を有する脂質を含む。これらの分子は、共有結合的に付着した有機増感剤を用いて増強し得る。適切であり得る金属イオンの例は、Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+、Ru2+/3+、およびRh2+を含む。
実施例XIII-異なる膜ターゲッティング配列の比較
本発明者らは、Lynドメインを融合したN末端およびCAAXモチーフを融合したC末端を基盤とする6個のサファイアGFP構築物の電圧感度を系統的に特性づけおよび比較を行った。これらの実験から、本発明者らは、異なるGFP供与体について電圧感受性FRETの普遍性を決定し、そしてまた、固有により大きい電圧感度をもつプローブを見出すことを必要とした。この6個の構築物は表4に挙げている。これらの構築物を選択することの理論的根拠とは、ターゲッティング配列の長さ、付着点、および電荷を改変することにより、好機にFRETを調整することになったということであったが、FRETが供与体および受容体発色団の間の距離および配向に対して典型的に敏感に反応するというのが理由である。Lynドメインの先端の切断は、そのターゲッティング配列の短縮は膜結合を保持するかどうか、およびもしそうならば、そのより短いリンカーがGFPを膜により近く配置し、その結果としてより大きなFRET、およびあるいは電圧感受性FRETを生じるのかどうかを試験するために調製された。ターゲッティング配列の2つの先端切断は、アスパルギン酸10残基(D10 Sapphire)およびアスパルギン酸15残基(D15 Sapphire)でなされた。また、SrcチロシンプロテインキナーゼのN末端領域に存在するトリプルアルギニンパッチは、Lynサファイア構築物(Lyn RRR Sapphire)におけるその対応するLyn残基に代えて置換された。2つの他の構築物は、K-RasからのC末端原形質膜ターゲッティング配列を付加することにより作製され、一つは、サファイアGFPに融合したC末端アンカーをもち、もう一方はN末端に融合したLyn配列、2つの膜アンカーをもつ構築物からなっている。C末端構築物は、C末端による膜アンカーリングがオキソノールと異なるFRETの相互作用を引き起こすかどうかを試験するために調製された。2重にアンカーリングされたプローブの場合、そのような主なる改変は、FRETを調整できる配向変化へと導かれうると推測された。第三の要素としては、ペプチドリンカーにおける正電荷の数が変えられた。この論点は、いくぶん、トリプルアルギニンおよび正電荷を帯びたアミノ酸を多く含むK-RAS構築物によっても言えることであった。オキソノールは負に帯電しているため、供与体および受容体の間の弱い静電気の引力の可能性は興味がもたれた。最後に、小葉の内側における正電荷の数は、オキソノールの変位電流の電圧依存をより負の電圧へ移行することができ、電圧感度の最大値をより生理学的に適切な範囲、以前LmTK−細胞(GonzalezおよびTsien, (1995) Biophys. J. 69(4) 1272〜1280)で観察された、-5 mVのより負へと移動するであろう。
本発明者らは、Lynドメインを融合したN末端およびCAAXモチーフを融合したC末端を基盤とする6個のサファイアGFP構築物の電圧感度を系統的に特性づけおよび比較を行った。これらの実験から、本発明者らは、異なるGFP供与体について電圧感受性FRETの普遍性を決定し、そしてまた、固有により大きい電圧感度をもつプローブを見出すことを必要とした。この6個の構築物は表4に挙げている。これらの構築物を選択することの理論的根拠とは、ターゲッティング配列の長さ、付着点、および電荷を改変することにより、好機にFRETを調整することになったということであったが、FRETが供与体および受容体発色団の間の距離および配向に対して典型的に敏感に反応するというのが理由である。Lynドメインの先端の切断は、そのターゲッティング配列の短縮は膜結合を保持するかどうか、およびもしそうならば、そのより短いリンカーがGFPを膜により近く配置し、その結果としてより大きなFRET、およびあるいは電圧感受性FRETを生じるのかどうかを試験するために調製された。ターゲッティング配列の2つの先端切断は、アスパルギン酸10残基(D10 Sapphire)およびアスパルギン酸15残基(D15 Sapphire)でなされた。また、SrcチロシンプロテインキナーゼのN末端領域に存在するトリプルアルギニンパッチは、Lynサファイア構築物(Lyn RRR Sapphire)におけるその対応するLyn残基に代えて置換された。2つの他の構築物は、K-RasからのC末端原形質膜ターゲッティング配列を付加することにより作製され、一つは、サファイアGFPに融合したC末端アンカーをもち、もう一方はN末端に融合したLyn配列、2つの膜アンカーをもつ構築物からなっている。C末端構築物は、C末端による膜アンカーリングがオキソノールと異なるFRETの相互作用を引き起こすかどうかを試験するために調製された。2重にアンカーリングされたプローブの場合、そのような主なる改変は、FRETを調整できる配向変化へと導かれうると推測された。第三の要素としては、ペプチドリンカーにおける正電荷の数が変えられた。この論点は、いくぶん、トリプルアルギニンおよび正電荷を帯びたアミノ酸を多く含むK-RAS構築物によっても言えることであった。オキソノールは負に帯電しているため、供与体および受容体の間の弱い静電気の引力の可能性は興味がもたれた。最後に、小葉の内側における正電荷の数は、オキソノールの変位電流の電圧依存をより負の電圧へ移行することができ、電圧感度の最大値をより生理学的に適切な範囲、以前LmTK−細胞(GonzalezおよびTsien, (1995) Biophys. J. 69(4) 1272〜1280)で観察された、-5 mVのより負へと移動するであろう。
第一の主なる観察として、すべての構築物は電圧感受性FRETを生じたということであった。電圧感受性FRETは、そのGFPがオキソノールでFRETを生じるために膜へ特異的に標的され、十分接近している限りにおいて、普遍的に適用できることを証明しているから、これは重要である。
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