JP4604187B2 - 糖鎖を介したルシフェラーゼと有機蛍光色素間のエネルギー移動を利用した可視−近赤外光プローブ - Google Patents
糖鎖を介したルシフェラーゼと有機蛍光色素間のエネルギー移動を利用した可視−近赤外光プローブ Download PDFInfo
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Description
本発明は，糖鎖を介して有機蛍光色素が連結されたルシフェラーゼ誘導体、該誘導体と生理活性物質の複合体、これらによる生体イメージング及び可視−近赤外光プローブとしての使用に関する。
生命科学の分野では、細胞内カルシウム量の変動、細胞内タンパクのリン酸化、エネルギーであるＡＴＰの分布或いは遺伝子の転写活性の測定など、細胞内に起きるさまざまな現象を解析することが大変重要であり、解析する手段として各種分子プローブが作成され、イメージングが行われている。これらのイメージング技術は生きた細胞レベルから個体レベルの観察にも用いられており、例えば、ガン細胞を標識、イメージングすることで、抗がん剤の評価、がんの転移などを視覚的に解析することが行われている。個体イメージングのプローブとして厳重に管理された施設、及び限られた研究者しか活用できない放射性プローブに対して、光プローブ群が注目されている。光プローブは発光、蛍光プローブに大別され、共に管理された空間で使用する必要がなく、高価な計測装置も必要としない。プローブは安定且つ概ね安価であり、操作も容易である。光プローブのうち、蛍光プローブは励起光を必要とすることから、外部の光源から励起できない個体深部の情報を得ることは難しい。また、外部光による細胞レベルの光損傷が問題となる。それに対して発光プローブは自家発光であり、励起光を必要とせず、多種多様な光プローブが生み出され、細胞から個体レベルでのイメージングに用いられている。
発光プローブとしてルシフェラーゼが最も活用されているが、そのうち甲虫ルシフェラーゼは既に細胞内イメージングには活用され、長時間レベルでの可視化プローブとして優れていることが明らかである（特許文献１，２）。しかしながら、最大発光波長535nmで
あり、個体イメージングに最も適する650-750nmの光エネルギーは極わずかである。また
、ウミホタルルシフェラーゼは、そのルシフェリン類縁体やナノ量子ドットの組み合わせにより紫外光に近い最大発光波長380nm（特許文献３）から個体深部からの透過効率の高
い赤色から近赤外光最大発光波長650 nm近くの光（特許文献４）を生み出すことができる、有用性の高い発光プローブであることは明らかである。特にウミホタルルシフェラーゼとナノ量子ドット融合体の間のエネルギー移動を活用した近赤外発光プローブは、個体透過性の高い光を生み出す有効な方法であることは明らかである。しかしながら、ナノ量子ドットはカドミウムなどの生体毒金属を用いる点、腎臓等で排出しにくい大きさである点など、個体イメージングに際して、安全毒性の問題や発光プローブの引き起こす生命情報かく乱の問題が指摘されている。併せて、ウミシイタケルシフェラーゼとナノ量子ドット融合体による近赤外発光プローブも報告されている(非特許文献１)が、上記の理由により安全性が懸念されている。
WO2007/058140
WO2006/106752
特願2005-169768
US60/907234
So MK et al. Nat Biotechnol. 2006, 24:339-43
あり、個体イメージングに最も適する650-750nmの光エネルギーは極わずかである。また
、ウミホタルルシフェラーゼは、そのルシフェリン類縁体やナノ量子ドットの組み合わせにより紫外光に近い最大発光波長380nm（特許文献３）から個体深部からの透過効率の高
い赤色から近赤外光最大発光波長650 nm近くの光（特許文献４）を生み出すことができる、有用性の高い発光プローブであることは明らかである。特にウミホタルルシフェラーゼとナノ量子ドット融合体の間のエネルギー移動を活用した近赤外発光プローブは、個体透過性の高い光を生み出す有効な方法であることは明らかである。しかしながら、ナノ量子ドットはカドミウムなどの生体毒金属を用いる点、腎臓等で排出しにくい大きさである点など、個体イメージングに際して、安全毒性の問題や発光プローブの引き起こす生命情報かく乱の問題が指摘されている。併せて、ウミシイタケルシフェラーゼとナノ量子ドット融合体による近赤外発光プローブも報告されている(非特許文献１)が、上記の理由により安全性が懸念されている。
本発明は、生体に及ぼす影響が少なく、且つ個体イメージングに優れた可視−近赤外光を効率よく発する発光プローブの作製とその利用を目的とする。
また、本発明は、ルシフェラーゼ・有機蛍光色素結合体において高エネルギーである可視−紫外光を含む光をルシフェラーゼが発し、タンパク上の糖鎖を介し有機蛍光色素を効率よく励起できるシステムを開発することを目的とする。
本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，ウミホタルルシフェラーゼに糖鎖を介した有機蛍光色素を結合した誘導体を構築、ルシフェリン及びその類縁体を用いることでエネルギーの高い励起光を生み出すことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のルシフェラーゼ誘導体、標識化生理活性物質、生体イメージング法、可視−近赤外光プローブとしての使用を提供するものである。
1． 有機蛍光色素がルシフェラーゼ由来糖鎖を介して糖鎖含有ルシフェラーゼに結合
してなる、ルシフェラーゼ誘導体。
してなる、ルシフェラーゼ誘導体。
２． ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼである、項１に記載の誘導体。
３． 有機蛍光色素とルシフェラーゼの間のエネルギー移動により、650-750nmの範囲
に蛍光極大を有する、項1又は2に記載の誘導体。
に蛍光極大を有する、項1又は2に記載の誘導体。
４． 有機蛍光色素が外部励起光源によって400nm〜700nmの蛍光極大（λmax）を有す
る色素である、項１〜３のいずれかに記載の誘導体。
る色素である、項１〜３のいずれかに記載の誘導体。
５． 有機蛍光色素がインドシアニングリーン、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、フルオレスカミンの各骨格を有する化合物のいずれかである、項１〜４のいずれかに記載の誘導体。
６． 有機蛍光色素がインドシアニングリーン、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、フルオレスカミンの各骨格を有し、且つ放射性元素が導入された化合物のいずれかである、項１〜４のいずれかに記載の誘導体。
７． 項１〜６のいずれかに記載のルシフェラーゼ誘導体で標識された、標識化生理活性物質。
８． 生理活性物質が抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、受容体やイオンチャンネルのリガンド、糖鎖および核酸からなる群から選ばれる少なくとも1種である、項７に記載の
標識化生理活性物質。
標識化生理活性物質。
９． 生理活性物質が、細胞により認識される物質である、項７又は８に記載の標識化生理活性物質。
１０． ルシフェラーゼの糖鎖を介して有機蛍光色素が連結されていて、ルシフェラーゼのポリペプチド部分と生理活性物質とが連結されている、項７〜９のいずれかに記載の生理活性物質。
１１． ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼである、項１０に記載の生理活性物質。
１２． ウミホタルルシフェラーゼと有機蛍光色素で標識された生理活性物質を生体に適用する工程を包含し、前記生理活性物質が抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、受容体やイオンチャンネルのリガンド、糖鎖および核酸からなる群から選ばれる少なくとも1種で
あり、ウミホタルルシフェラーゼと有機蛍光色素間のエネルギー移動による650-750nmの
範囲の蛍光極大を検出することを特徴とする、生体イメージング法。
あり、ウミホタルルシフェラーゼと有機蛍光色素間のエネルギー移動による650-750nmの
範囲の蛍光極大を検出することを特徴とする、生体イメージング法。
１３． 項１〜６のルシフェラーゼ誘導体、或いは項７〜１１のいずれかに記載の標識化生理活性物質の可視−近赤外光プローブとしての使用。
本発明によれば、ルシフェラーゼ、特にウミホタルルシフェラーゼから可視−近赤外を含む光を発することができ、ルシフェラーゼに付加された糖鎖を介して、効率よく有機蛍光色素をエネルギー移動に最適な位置に配位させ、色素を励起することが可能になった。本発明のルシフェラーゼ誘導体はタンパクサイズの発光プローブであり、安全性も高い。一方、ウミホタルルシフェラーゼのような糖鎖を有するルシフェラーゼはこの糖鎖を介してペプチド又はタンパク質(例えば抗体、抗原、ハプテン、ホルモン等)と連結でき、ガン組織等への集積化も可能であることから、ガン組織の近赤外光による個体イメージングが可能になり、各種病態の治療及び新薬開発への利用も可能となる。さらには、広い発光波長を利用した光力学的治療への利用も可能である。
従来のホタル発光酵素を導入した形質転換細胞では、発光量が十分ではなく、近赤外光を利用した、発光イメージングには不十分である。またルシフェラーゼ・量子ドット複合体は近赤外光プローブであるが、体内から排出されにくい大きさで、且つ金属ドットの生体への影響が懸念されていたが、本発明のルシフェラーゼ・有機蛍光色素複合体は、生体内に導入した場合に、従来使用されているルシフェラーゼ・量子ドット複合体と比較して可視光−近赤外光を効率よく発することができ、且つ大きさや材質による生体への有毒性を回避して、より深度の深い臓器からの長時間に渡る個体イメージングが可能になる。
本発明で用いるルシフェラーゼは、有機蛍光色素、さらには生理活性物質を連結するための糖鎖を有するルシフェラーゼであれば限定されないが、好ましくはウミホタルルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは、糖鎖を有することが必要であるので、酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞などの真核細胞で発現されたものが好ましく使用できる。
有機蛍光色素としては、糖鎖と連結可能なアミノ基、ヒドラジノ基（NH2NH-）を有し、かつ、ルシフェラーゼとエネルギー移動を起こして可視から近赤外、好ましくは650〜750nm程度の波長の光を放出するものであれば特に限定されない。有機蛍光色素の蛍光極大（λmax）は、400〜700nm程度、例えば400-500nm程度であればよい。好ましい有機蛍光色素は、インドシアニン、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリンおよびフルオレスカミンの各骨格を有する化合物など、より好ましくはインドシアニングリーン又はその誘導体のようなシアニン系色素が挙げられる。
生理活性物質としては、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、受容体やイオンチャンネルのリガンド、糖鎖および核酸などが挙げられる。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。抗体は、例えばヒトに投与する場合にはヒト化された抗体又はそのフラグメントが挙げられる。核酸としては、アプタマーのような生理活性物質を認識可能な物質が挙げられる。抗原としては、免疫細胞や生体内の細胞の受容体に結合可能な抗原が好ましい。ホルモンとしては、ペプチドホルモン、ステロイドホルモン、各種の成長ホルモンが挙げられる。受容体やイオンチャンネルのリガンドとしては、ニ
コチン、グルタミン酸、セロトニンなどが挙げられる。糖鎖としては、シアリルルイスＸ又はその誘導体などの生体ないし細胞に認識され得る糖鎖が好ましい。
コチン、グルタミン酸、セロトニンなどが挙げられる。糖鎖としては、シアリルルイスＸ又はその誘導体などの生体ないし細胞に認識され得る糖鎖が好ましい。
本発明の1つの好ましい実施形態において、ウミホタルルシフェラーゼ・有機蛍光色素
複合体及びルシフェリンによる発光は、例えばウミホタルホタルルシフェラーゼと量子ドットの組み合わせと比較して、2倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは10倍以上
の発光量を有する。且つナノ金属ドットの有毒性を回避できる。
本発明で使用され得るウミホタルルシフェラーゼは公知である。本明細書および特許請求の範囲において、「ウミホタルルシフェラーゼ」とは、野生型ウミホタルルシフェラーゼあるいは任意のその改変体を広く包含する。野生型ウミホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列はAAB86460, AAA30332, BAD08210などに記載されている。 ウミホタルルシフェラーゼ改変体は、1または複数個、好ましくは1または十数個(例えば15,14, 13,12,11,10,9，8，7，6，5，4，3，2個)のアミノ酸が置換、付加、欠失、挿入されていてもよく、ウミホ
タルルシフェリンを基質として発光させる活性を有している限り任意の改変体を包含する。該改変体は、上記の野生型ウミホタルルシフェラーゼとホモロジーが70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは９９％以上のホモロジーを有する。
複合体及びルシフェリンによる発光は、例えばウミホタルホタルルシフェラーゼと量子ドットの組み合わせと比較して、2倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは10倍以上
の発光量を有する。且つナノ金属ドットの有毒性を回避できる。
本発明で使用され得るウミホタルルシフェラーゼは公知である。本明細書および特許請求の範囲において、「ウミホタルルシフェラーゼ」とは、野生型ウミホタルルシフェラーゼあるいは任意のその改変体を広く包含する。野生型ウミホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列はAAB86460, AAA30332, BAD08210などに記載されている。 ウミホタルルシフェラーゼ改変体は、1または複数個、好ましくは1または十数個(例えば15,14, 13,12,11,10,9，8，7，6，5，4，3，2個)のアミノ酸が置換、付加、欠失、挿入されていてもよく、ウミホ
タルルシフェリンを基質として発光させる活性を有している限り任意の改変体を包含する。該改変体は、上記の野生型ウミホタルルシフェラーゼとホモロジーが70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは９９％以上のホモロジーを有する。
ルシフェラーゼ改変体の製造は、常法に従い行なうことができ、例えば天然のルシフェラーゼ遺伝子を、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同100, p468 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12,p9441 (1984)；続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)
〕などの方法により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967)；同91, p3350 (1969)；Science, 150,p178 (1968) ；Tetrahedron Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983)〕により変異させたDNAを合成したり、それらの組合せにより実施することができる。
〕などの方法により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967)；同91, p3350 (1969)；Science, 150,p178 (1968) ；Tetrahedron Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983)〕により変異させたDNAを合成したり、それらの組合せにより実施することができる。
アミノ酸配列同一性ないしホモロジー（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。同一性（％）はまた、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０ ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ、ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ １２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ４を用いることができる。アミノ酸配列同一性は、上記の任意の方法で決定されたものであれば構わず、例えば計算に際して、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法が採用され得る。
糖鎖を有するルシフェラーゼと有機蛍光色素の結合は、例えばルシフェラーゼの糖鎖をＮａＩＯ４などの過ヨウ素酸塩により処理して糖鎖のビシナルジオールを開裂してアルデヒドとし、これに、アミノ基ないしヒドラジノ基（ＮＨ２ＮＨ−）を有する有機蛍光色素と反応させ、色素のアミノ基と連結する場合にはＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を必要に応
じて使用して、有機蛍光色素が糖鎖部分で連結されたルシフェラーゼ誘導体を得ることができる。
じて使用して、有機蛍光色素が糖鎖部分で連結されたルシフェラーゼ誘導体を得ることができる。
ウミホタルルシフェラーゼ（Cypridina luciferase）に有機蛍光色素(Organic dye)を
導入する反応スキームの１例を以下に示す。
導入する反応スキームの１例を以下に示す。
ルシフェラーゼを酢酸緩衝液などの適当な緩衝液に溶解し、１当量又は過剰量のNaIO4
の溶液と混合し、4℃などの低温から室温で１０分から３時間程度反応させ、必要に応じ
てカラムで精製するなどの後処理を行なうことで、アルデヒド基を有するルシフェラーゼとする。このルシフェラーゼを有機蛍光色素-NHNH2(当量又は過剰量または化学量論量未
満の量)と反応させることにより、有機蛍光色素が連結された目的とするルシフェラーゼ
誘導体を得ることができる。
の溶液と混合し、4℃などの低温から室温で１０分から３時間程度反応させ、必要に応じ
てカラムで精製するなどの後処理を行なうことで、アルデヒド基を有するルシフェラーゼとする。このルシフェラーゼを有機蛍光色素-NHNH2(当量又は過剰量または化学量論量未
満の量)と反応させることにより、有機蛍光色素が連結された目的とするルシフェラーゼ
誘導体を得ることができる。
上記反応において、アルデヒドをルシフェラーゼあたり２個以上になるようにNaIO4の
溶液と反応させ、アルデヒド残基がルシフェラーゼあたり１個以上残存するように有機蛍光色素-NHNH2を反応させ、次いでアミノ基を有する生理活性物質を反応させ、ＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を使用して、さらに生理活性物質が連結された有機蛍光色素−ルシフェラーゼ−生理活性物質複合体を得ることができる。或いは、有機蛍光色素が連結されたルシフェラーゼ誘導体を再度NaIO4の溶液と反応させてアルデヒド基を生成し、次いでアミ
ノ基を有する生理活性物質を反応させ、ＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を使用して、さらに生理活性物質が連結された有機蛍光色素−ルシフェラーゼ−生理活性物質複合体を得ることができる。
溶液と反応させ、アルデヒド残基がルシフェラーゼあたり１個以上残存するように有機蛍光色素-NHNH2を反応させ、次いでアミノ基を有する生理活性物質を反応させ、ＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を使用して、さらに生理活性物質が連結された有機蛍光色素−ルシフェラーゼ−生理活性物質複合体を得ることができる。或いは、有機蛍光色素が連結されたルシフェラーゼ誘導体を再度NaIO4の溶液と反応させてアルデヒド基を生成し、次いでアミ
ノ基を有する生理活性物質を反応させ、ＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を使用して、さらに生理活性物質が連結された有機蛍光色素−ルシフェラーゼ−生理活性物質複合体を得ることができる。
糖鎖を介した有機蛍光色素の導入方法はルシフェラーゼ改変体にも適応できる。ルシフェラーゼ改変体とはルシフェラーゼの活性反応基に直接あるいは架橋剤を介して生理活性物質と結合しているものである、あるいはルシフェラーゼのN末とC末にペプチド配列が挿入されたルシフェラーゼ類である。
ルシフェラーゼと生理活性物質の結合はルシフェラーゼのCOOH基がジシクロヘキシルカルボジイミドのような縮合剤によって活性化されたのち、生理活性物質のアミノ基とカップリングさせる方法の他に、任意の二価または多価の架橋剤で連結させる方法が挙げられる。架橋剤は、マレイミド基、スクシンイミド基、活性エステル基、ヒドラジン基などの連結可能な反応性基を少なくとも2個有し、これらの基をアルキレン、アリーレン、アル
ケニレン、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンなどの任意の二価又は多価の基で連結したものが挙げられる。具体的な架橋剤としては、AEDP,AMAS,APG,ASBA,BASED,BMB, BMDB,DTSSP,EMCA,EMCH,EMCS,HBVSKMUA,SADP,SAEDなどが例示でき、架橋剤は、生理活性物
質が有する反応性基(アミノ基、ＳＨ基、ＯＨ基、アルデヒド基またはケトン基など)の種類によって適宜選択することができる。架橋剤は、へテロ二官能性の架橋剤であって、ルシフェラーゼと生理活性物質を段階的に連結可能なものが好ましい。ルシフェラーゼのN
末とC末に挿入されるペプチド配列はHaloTag、AviTag、SNAPTag、抗体ならびにその断片
などが挙げられる。
ケニレン、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンなどの任意の二価又は多価の基で連結したものが挙げられる。具体的な架橋剤としては、AEDP,AMAS,APG,ASBA,BASED,BMB, BMDB,DTSSP,EMCA,EMCH,EMCS,HBVSKMUA,SADP,SAEDなどが例示でき、架橋剤は、生理活性物
質が有する反応性基(アミノ基、ＳＨ基、ＯＨ基、アルデヒド基またはケトン基など)の種類によって適宜選択することができる。架橋剤は、へテロ二官能性の架橋剤であって、ルシフェラーゼと生理活性物質を段階的に連結可能なものが好ましい。ルシフェラーゼのN
末とC末に挿入されるペプチド配列はHaloTag、AviTag、SNAPTag、抗体ならびにその断片
などが挙げられる。
有機蛍光色素とルシフェラーゼの間にはエネルギー移動(BRET)があり、これにより650-750nmの可視−近赤外の範囲の発光を得ることができ、生体のイメージングを行なうこと
ができる。エネルギー移動が生じるために、有機蛍光色素は400nm〜700nm程度、例えば400nm〜550nm程度、或いは420nm〜500nm程度、の蛍光極大λmaxを有する色素であるのがよ
い。
ができる。エネルギー移動が生じるために、有機蛍光色素は400nm〜700nm程度、例えば400nm〜550nm程度、或いは420nm〜500nm程度、の蛍光極大λmaxを有する色素であるのがよ
い。
以下、本発明を実施例を用いてさらに具体的に例示するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
１、ウミホタルルシフェラーゼの糖鎖に蛍光色素の導入
実施例１
１、ウミホタルルシフェラーゼの糖鎖に蛍光色素の導入
0.1mgの精製されたルシフェラーゼを0.05mlの0.1Macetate buffer pH5.2で溶解し、同
量の20 ｍM NaIO4の0.1M acetate buffer pH5.2溶液と混合し、4度で0.5時間ゆっくり
攪拌した。反応液をGE Health社PD-10カラムに載せ、１００ｍM リン酸ナトリウム、１５０ｍM NaCl 溶液で溶出し、活性分画のみ回収し（約2ｍL）した。ミリポア社のBiomax100kで２ｍL液を約0.02ｍｌまでに濃縮した。1mgのHilyte fluore647（NH2NH-インドシアニングリーン；Anaspec）を0.1Macetate buffer pH5.2溶液0.1mlで溶かした。ルシフェラーゼ液0.02mlと同量で、室温で2時間反応させた。反応液をGE Health社PD-10カラムに載せ、１００ｍM リン酸ナトリウム、１５０ｍM NaCl 溶液で溶出し、活性分画のみ回収
（約2ｍL）した。
量の20 ｍM NaIO4の0.1M acetate buffer pH5.2溶液と混合し、4度で0.5時間ゆっくり
攪拌した。反応液をGE Health社PD-10カラムに載せ、１００ｍM リン酸ナトリウム、１５０ｍM NaCl 溶液で溶出し、活性分画のみ回収し（約2ｍL）した。ミリポア社のBiomax100kで２ｍL液を約0.02ｍｌまでに濃縮した。1mgのHilyte fluore647（NH2NH-インドシアニングリーン；Anaspec）を0.1Macetate buffer pH5.2溶液0.1mlで溶かした。ルシフェラーゼ液0.02mlと同量で、室温で2時間反応させた。反応液をGE Health社PD-10カラムに載せ、１００ｍM リン酸ナトリウム、１５０ｍM NaCl 溶液で溶出し、活性分画のみ回収
（約2ｍL）した。
２、ウミホタルルシフェラーゼ・蛍光色素の発光スペクトル
0.001ml Cluc-dyeを0.1ｍｌ下記の緩衝液の一種類で溶かし、0.001 mLウミホタルルシフェリン溶液(0.001ｍM)と反応させ、発光スペクトルを測定した。結果を図１、図２に示す。
0.1 M Phosphate buffer pH6.4 /100 mM NaCl
0.1 M Phosphate buffer pH7.4 /100 mM NaCl
0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 / 100 mM NaCl
0.1 M Phosphate buffer (0.1 M) pH6.4 /500 mM NaCl
0.1 M Phosphate buffer (0.1 M) pH7.4 /500 mM NaCl
0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 / 500 mM NaCl
結果、ルシフェラーゼの最大発光波長（460nm）と発光エネルギー移動による色素の最
大発光波長（670nm）が観測された。さらに、この発光スペクトルは塩やｐHの条件の変化による影響を受けないことがわかった。
0.1 M Phosphate buffer pH7.4 /100 mM NaCl
0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 / 100 mM NaCl
0.1 M Phosphate buffer (0.1 M) pH6.4 /500 mM NaCl
0.1 M Phosphate buffer (0.1 M) pH7.4 /500 mM NaCl
0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 / 500 mM NaCl
結果、ルシフェラーゼの最大発光波長（460nm）と発光エネルギー移動による色素の最
大発光波長（670nm）が観測された。さらに、この発光スペクトルは塩やｐHの条件の変化による影響を受けないことがわかった。
Claims (5)
- 糖鎖と連結可能なアミノ基又はヒドラジノ基（NH2NH-）を有し、かつ、インドシアニングリーン又はキサンテンの骨格を有する化合物である有機蛍光色素がルシフェラーゼ由来糖鎖を介して糖鎖含有ルシフェラーゼに結合してなる、ルシフェラーゼ誘導体。
- ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼである、請求項１に記載の誘導体。
- 有機蛍光色素とルシフェラーゼの間のエネルギー移動により、650-750nmの範囲に蛍光極
大を有する、請求項１又は２に記載の誘導体。 - 有機蛍光色素が外部励起光源によって400nm〜700nmの蛍光極大（λmax）を有する色素で
ある、請求項１〜３のいずれかに記載の誘導体。 - 請求項１〜４のいずれかに記載のルシフェラーゼ誘導体の可視−近赤外光プローブとしての使用。
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