EA029738B1 - Синтез и композиция аминокислотных линкерных групп, конъюгированных с соединениями, применяемыми для направленной визуализации опухолей - Google Patents

Синтез и композиция аминокислотных линкерных групп, конъюгированных с соединениями, применяемыми для направленной визуализации опухолей Download PDF

Info

Publication number
EA029738B1
EA029738B1 EA201591802A EA201591802A EA029738B1 EA 029738 B1 EA029738 B1 EA 029738B1 EA 201591802 A EA201591802 A EA 201591802A EA 201591802 A EA201591802 A EA 201591802A EA 029738 B1 EA029738 B1 EA 029738B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tumor
folate
compound
compounds
tissue
Prior art date
Application number
EA201591802A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591802A1 (ru
Inventor
Филип С. Лоу
Сумит А. Куларатне
Саккарапалаям М. Махалингам
Original Assignee
Пердью Рисерч Фаундейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пердью Рисерч Фаундейшн filed Critical Пердью Рисерч Фаундейшн
Publication of EA201591802A1 publication Critical patent/EA201591802A1/ru
Publication of EA029738B1 publication Critical patent/EA029738B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к соединениям, имеющим структурную формулу, приведенную ниже, которые пригодны в качестве зондов, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области, где соединения включают i) птероиловый лиганд, который связывается с рецепторным белком-мишенью, ii) молекулу красителя и iii) молекулу линкера, которая включает аминокислоту или ее производное. В раскрытии дополнительно описываются способы и композиции для получения и применения соединений, способы, включающие соединения, и наборы, включающие соединения.

Description

Изобретение относится к соединениям, имеющим структурную формулу, приведенную ниже, которые пригодны в качестве зондов, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области, где соединения включают ι) птероиловый лиганд, который связывается с рецепторным белкоммишенью, И) молекулу красителя и ίίί) молекулу линкера, которая включает аминокислоту или ее производное. В раскрытии дополнительно описываются способы и композиции для получения и применения соединений, способы, включающие соединения, и наборы, включающие соединения.
029738 Β1
029738
Родственные заявки
Заявка на данное изобретение относится к и по ней испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США с сер. № 61/791921, зарегистрированной 15 марта 2013 г., содержание которой включено, таким образом, в данное изобретение в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее раскрытие относится к области диагностики. В данном раскрытии предлагаются способы получения и применения аминокислотных линкерных групп, которые конъюгированы с соединением, используемым для направленной визуализации опухолей. Конъюгация аминокислотных линкерных групп повышает специфичность и определяемость соединения. Охватываются способы и композиции для их применения в диагностической визуализации.
Известный уровень техники
Хирургическое удаление злокачественного новообразования является одним из наиболее обычных и эффективных методов лечения при первичной терапии рака. Резекция всех определяемых злокачественных поражений ведет к отсутствию определяемого рецидива заболевания приблизительно у 50% всех больных раком и может продлить ожидаемую продолжительность жизни или снизить распространенность заболевания у больных с выявленным рецидивом рака. Не удивительно, что хирургические методы достижения удаления клеток более количественно в настоящее время привлекают все большее внимание.
Резекция всех определяемых злокачественных поражений ведет к отсутствию определяемого рецидива заболевания приблизительно у 50% всех больных раком и может продлить ожидаемую продолжительность жизни или снизить распространенность заболевания у больных с выявленным рецидивом рака. Учитывая важность полного удаления злокачественных поражений, полезно убедиться в том, что злокачественные поражения точно и полностью идентифицированы. Идентификация злокачественной ткани в процессе хирургического вмешательства в настоящее время осуществляется с помощью трех методов. Во-первых, многие опухолевые массы и узлы могут быть определены визуально на основе аномального цвета, текстуры и/или морфологии. Таким образом, опухолевая масса может иметь неоднородный цвет, выглядеть асимметричной с неровной границей или выступать за контуры здорового органа. Масса злокачественного новообразования может быть также определена тактильно из-за отличий в пластичности, эластичности или солидности по сравнению с прилегающими здоровыми тканями. Наконец некоторые очаги рака могут быть локализованы в процессе операции с использованием флуоресцентных красителей, которые пассивно проходят из первичной опухоли в дренирующее лимфатические узлы. При этом последнем методе флуоресцирующие (защитные) лимфатические узлы могут быть идентифицированы визуально, удалены и проверены для определения того, метастазировали ли раковые клетки в эти лимфатические узлы.
Несмотря на понимание важности удаления опухоли и доступность определенных методов идентификации для визуализации опухолевой массы многие злокачественные узлы все еще ускользают от выявления, что ведет к рецидиву заболевания и часто к смерти. Таким образом, существует потребность в улучшенной идентификации опухолей. Такая мотивация привела к введению двух новых подходов для визуализации злокачественного новообразования в ходе операции. При первом подходе флуоресцентный краситель с гасителем вводят системно животному, несущему опухоль, и высвобождение гасящей части под действием специфичного для опухоли фермента, изменения рН или изменения окислительновосстановительного потенциала используют для селективной активации флуоресценции в пределах массы злокачественной ткани. При втором подходе флуоресцентный краситель конъюгируют со специфичным для опухоли направляющим лигандом, который является причиной аккумуляции присоединенного красителя в раковых новообразованиях, которые гиперэкспрессируют рецептор этого лиганда. Примеры направленных на опухоль лигандов, применяемых для этой последней цели, включают фолиевую кислоту, которая специфична для позитивных в отношении рецептора фолата (РК) опухолей яичника, почки, легкого, эндометрия, молочной железы и ободочной кишки, и ΌυΡΑ, который может доставлять присоединенные флуоресцентные красители селективно к клеткам, экспрессирующим специфичный для простаты мембранный антиген (Ρ8ΜΑ), т.е. к раковым клетками простаты и к клеткам, неоваскулинизирующим другие солидные опухоли. Удачно, что один флуоресцентный краситель, направляемый фолатом (фолат-флуоресцеин или ЕС17), недавно протестирован в процессе операции у людей, больных раком яичника. В этом исследовании в ~5Х больше злокачественных поражений было удалено с помощью направленного на опухоль флуоресцентного красителя, чем без него, и злокачественность всех удаленных флуоресцирующих поражений была подтверждена патологами.
Обычные флуоресцентные методы используют зонды в спектре видимого света (~400-600 нм), которые не являются оптимальными для хирургического вмешательства, руководствующегося интраоперационной визуализацией, так как это связано с относительно высоким уровнем неспецифической фонового свечения в тканях, обусловленного коллагеном. Следовательно, отношение сигнала к шуму у этих обычных соединений низка. Кроме того, поглощение видимого света биологическими хромофорами, в частности гемоглобином, ограничивает глубину проникновения до нескольких миллиметров. Таким образом, опухоли, которые расположены в ткани глубже нескольких миллиметров, могут оставаться незамеченными. Кроме того, ионизационное равновесие флуоресцеина (рКа=6,4) приводит к рН-зависимому
- 1 029738
поглощению и излучению в диапазоне от 5 до 9. Таким образом, флуоресценция красителей на основе флуоресцеина гасится при низком рН (рН ниже 5).
Например, потенциальное применение красителя ЕС17 для более широкого использования в оптической визуализации для характеристики и измерения пораженной ткани в клинических условиях было затруднено из-за главного недостатка этого присоединенного красителя (флуоресцеина), излучающего флуоресценцию в видимом диапазоне. Это делает ЕС17 и родственные красители неудачными для использования ίη νίνο в тканях, так как ткани, как правило, обладают сильной автофлуоресценцией в видимом диапазоне, и свет проникает в ткани плохо. Кроме того, ЕС17 (изотиоцианат фолат-этилендиаминфлуоресцеина) содержит тиомочевинный линкер. Хорошо известно, что соединения тиомочевины имеют низкую сохранность из-за нестабильности тиомочевинной связи. Таким образом, такое соединение как ЕС17 не является оптимальным для использования в оптической визуализации из-за его нестабильности и связанным разрушением тиомочевинного мостика.
Сочетание поглощения света гемоглобином в спектре видимого света (<600 нм) и воды и липидов в ИК-диапазоне (>900 нм) предоставляет оптическое окно визуализации приблизительно 650-900 нм, в котором коэффициент поглощения ткани является минимальным. Подходящей альтернативой красителям, которые излучают свет в видимом диапазоне, была бы разработка красителей, которые могут быть использованы в ближней инфракрасной области (ΝΙΚ), потому что свет в ближней инфракрасной области вызывает очень маленькую автофлуоресценцию и проникает в ткань гораздо более эффективно. Другим преимуществом метода ближней ИК флуоресценции является то, что фон от рассеянного света источника возбуждения значительно снижен, так как интенсивность рассеяния обратно пропорциональна длине волны в четвертой степени. Низкий фон флуоресценции необходим для высокочувствительного детектирования. Кроме того, оптически прозрачное окно в ближней ИК-области (от 650 до 900 нм) в биологической ткани делает флуоресценцию в ΝΙΚ ценным методом визуализации ίη νίνο и методом, применяемым для субклеточного детектирования, который требует пропускания света через биологические компоненты.
В то время как использование света в диапазоне ΝΙΚ для более глубокой визуализации тканей предпочтительнее света в видимой области спектра, красители для визуализации в ΝΙΚ, используемые в настоящее время в этой области техники, имеют ряд проблем и недостатков, таких как восприимчивость к фотоотбеливанию, плохую химическую стабильность, поглощение и спектры излучения, которые попадают в пределы того же диапазона что и многие физиологические молекулы (что ведет в результате к высокому фоновому сигналу и автофлуоресценции). Кроме того, большинство красителей ΝΙΚ не являются стабильными во время синтеза особенно при конъюгации лиганда с аминным линкером, что приводит к множественным нежелательным побочным продуктам. Следовательно, использование направляемого лигандом агента визуализации ΝΙΚ в клинике может быть дорогим. Таким образом, современные методы визуализации, которые используют флуоресцентные зонды ΝΙΚ, не являются эффективными для визуализации глубоких тканей (>5 мм от поверхности), для количественной оценки сигнала флуоресценции в тканях млекопитающих, или для себестоимости производства, что повышает время перехода от доклинических к клиническим испытаниям.
Два перспективных подхода к хирургическому вмешательству, руководствующемуся флуоресценцией, в настоящее время интенсивно исследуются для использования в клинике. При одном способе активируемый ΝΙΚ флуоресцентный зонд, который минимально флуоресцирует в стационарном состоянии из-за своей близости к прикрепленному гасителю, становится высоко флуоресцентным при высвобождении гасителя в злокачественной ткани. Один из наиболее широко используемых механизмов высвобождения заключается во включении пептидной последовательности между красителем и гасителем, которая может специфически расщепляться протеазой, которая обогащена в опухоли (например, катепсинами, каспазами и металлопротеиназами матрикса). Основное преимущество этой стратегии заключается в отсутствии флуоресценции в тканях, которые не имеют активирующего фермента, позволяя тканям, участвующим в экскреции (например, почкам, мочевому пузырю, печени), оставаться нефлуоресцирующими пока они случайно не экспрессируют расщепляющий фермент. Такие активируемые в опухоли красители ΝΙΚ могут также генерировать существенную флуоресценцию в опухолевой массе до тех пор, пока злокачественное поражение обогащено расщепляющей протеазой и высвобожденный краситель задерживается в опухоли. Основной недостаток этого метода заключается в низкой специфичности многих соответствующих гидролаз для опухолей (большинство которых также экспрессируется в здоровых тканях, подвергающихся естественному ремоделингу или находящихся в условиях воспаления). Кроме того, обогащение желаемыми протеазами может меняться в зависимости от опухолевых масс, что приводит к замедлению флуоресценции или отсутствию ее активации в некоторых злокачественных поражениях и быстрому развитию флуоресценции в других.
Таким образом, сохраняется потребность в красителе, который может быть использован для специфического направленного включения в пораженную ткань и обладает повышенной стабильностью и яркостью, для применения ίη νίνο для визуализации тканей.
- 2 029738
Краткое изложение существа изобретения
В изобретении предлагается способ синтеза аминокислотных линкерных групп, которые конъюгированы с соединением, используемым для направленной визуализации опухолей и лимфатических узлов. В некоторых вариантах осуществления это раскрытие относится к соединению или его солевому производному, которое включает фолат или птероиловый лиганд, линкерную группу и флуоресцентный краситель. В некоторых вариантах осуществления линкерная группа может представлять собой аминокислоту, изомер, производное или их рацемическую смесь. В других аспектах флуоресцентный краситель выбран из группы, состоящей из Ь8288, ΙΚ800, 8Р054, 80121, ΚΘΌΛΚ, 82076 и 80456.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагается способ конъюгации аминокислотной линкерной группы с флуоресцентным красителем, где аминокислота может представлять собой тирозин, серин, треонин, лизин, аргинин, аспарагин, глутамин, цистеин, селеноцистеин, изомеры и их производные. В некоторых вариантах осуществления аминокислота, изомеры или их производные содержат функциональную группу -ОН, -ΝΗ2 или -8Н, которая при добавлении флуоресцентного красителя в небольшом молярном избытке осуществляет конъюгацию флуоресцентной группы с аминокислотой, изомером или их производными. В других вариантах осуществления аминокислота, изомеры или их производные содержат функциональную группу -ОН, которая при синтезе генерирует простую эфирную связь с флуоресцентным красителем, которая увеличивает яркость и обнаружение соединения. В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие относится к конъюгации аминокислотной линкерной группы с флуоресцентным красителем, где аминокислота, изомеры или их производные содержат функциональную группу -8Н, -8еН, -РоН или -ТеН, которая при синтезе генерирует мостик С-8, С-8е, С-Ро или С-Те с флуоресцентным красителем. В некоторых аспектах это изобретение относится к конъюгации аминокислотной линкерной группы с флуоресцентным красителем, который имеет максимумы поглощения и излучения между приблизительно 500 и приблизительно 900 нм. В других аспектах аминокислотная линкерная группа конъюгирована с флуоресцентным красителем, который имеет максимумы поглощения и излучения между приблизительно 600 и приблизительно 800 нм.
В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к способу конъюгации аминокислотной линкерной группы с фолатным лигандом, где аминокислотная линкерная группа представляет собой тирозин, серин, треонин, лизин, аргинин, аспарагин, глутамин, цистеин, селеноцистеин, изомеры или их производные, и она конъюгируется с фолатом через дипептидную связь. В дополнительных аспектах настоящее раскрытие относится к способу конъюгации линкерной группы с фолатным лигандом, где линкерная группа представляет собой тирозин, серин, треонин, лизин, аргинин, аспарагин, глутамин, цистеин, селеноцистеин, изомеры или их производные, и она конъюгируется с фолатом через гомо-олигопептидную связь. В других вариантах осуществления это раскрытие относится к способу конъюгации птероилового лиганда с аминокислотной линкерной группой, где линкерная группа представляет собой тирозин, серин, треонин, лизин, аргинин, аспарагин, глутамин, цистеин, селеноцистеин, изомеры или их производные. В некоторых аспектах карбоновая кислота линкерной группы связана с альфа-углеродом любой аминокислоты, в результате чего увеличивается специфичность соединения для рецепторов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная линкерная группа вносит вклад в специфичность соединения, где наблюдается аффинность связывания соединения с рецепторамимишенями, представляющими собой рецептор фолата.
В дополнительных аспектах соединение обладает высокой селективностью в отношении направленности на опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор-мишень.
В других вариантах осуществления это раскрытие относится к применению соединения, обозначенного как Р1е-Туг-80456 (ОТЬ-0038), для хирургического вмешательства, руководствующегося визуализацией, визуализации опухоли, визуализации лимфатических узлов, воспалительных заболеваний, атеросклероза, инфекционных заболеваний, применений в судебной медицине, применений в неорганической химии, стоматологического применения, окрашивания гелей, секвенирования ДНК, окрашивания нервов или пластической хирургии. В других аспектах производное Р1е-Туг-80456 может представлять собой Р1е-Э-Туг-80456, Р1е-гомо-Туг-80456, Р1е-бета-гомо-Туг-80456, Р1е-ЩМе)-Туг-80456, Р1е-Туг(ОМе)80456, Р1е-Туг(ОВи)-80456, Рΐе-NΗNΗ-Ту^-ОΑс-80456, соли или их производные.
В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу синтеза соединения, в котором используется защитная группа во избежание нежелательной реактивности с группами, отличными от аминогрупп, что может генерировать нежелательные соединения. Методы, предлагаемые в данном описании, дают конечное соединение с выходом более 98% чистоты.
В некоторых аспектах это изобретение относится к соединению, используемому для направленной визуализации опухолей, где соединение может быть использовано для исследования, диагностики или для терапевтических целей. В других вариантах осуществления это раскрытие относится к композиции, включающей визуализирующее соединение и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, разбавители или соли.
- 3 029738
В других аспектах настоящее раскрытие относится к соединению, которое имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из:
- 4 029738
- 5 029738
где X, Υ или Ζ представляют собой Η, Να или ΝΗ4+,
где X, Υ или Ζ представляют собой Η, Να или ΝΗ4+,
- 6 029738
где X, Υ или Ζ представляют собой Н, Ыа или ЫН4+,
где X, Υ или Ζ представляют собой Н, Ыа или ЫН4+,
где X, Υ или Ζ представляют собой Н, Ыа или ΝΗ4+,
- 7 029738
где тирозин представляет собой бета-гомотирозин,
- 8 029738
где А. X, Υ или Ζ представляют собой Η, Να или ΝΗ4+,
- 9 029738
ЗО3Н
и к его фармацевтически приемлемой соли.
- 10 029738
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - 1-е поколение конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата; фиг. 2 - связывающие изотермы 1-го поколения конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ. Кривые связывания конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ с клетками КВ, экспрессирующими рецептор фолата. Направляемые конъюгаты представляют собой ЭуЫдШ 680 (треугольники), А1еха Р1иог 750 (ромбы) и ΙΒ800ί'.’\ν (кружки);
фиг. 3 - флуоресцентные изображения мышей с метастазами (экспериментальная модель) через 4 ч после внутривенной инъекции 1-го поколения конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ. Наложения флуоресцентной визуализации и визуализации в белом свете интактных (А-Ό) и хирургически вскрытых (а-й) мышей-опухоленосителей. Бестимусным голым мышам с РК-экспрессирующими метастатическими опухолями Ь1210А внутривенно вводили 10 нмоль фолат-ЭуЫдЫ 680 (А/а) или фолат-ОуЫдЫ 750 (В/Ь) и визуализировали через 4 ч;
фиг. 4 - Н&Е анализ ткани, удаленной в процессе последовательного хирургического уменьшения объема опухоли. А-Ό. Наложения флуоресцентной визуализации и визуализации в белом свете мышей, несущих метастатические опухоли Ь1210А, через 4 ч после инъекции в хвостовую вену 10 нмоль фолат1К800С\У. А. Визуализация всего организма. В. Открытая грудная клетка. С. После удаления первичной опухоли. Ό. После удаления всех вторичных узлов. а-й: Н&Е окрашивание: а: здорового контрольного легкого, Ь: первичной опухоли, с: вторичного опухолевого узла, й: остаточной ткани;
фиг. 5 - 2-е поколение конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата;
фиг. 6 - связывающие изотермы (исследования конкуренции с радиоактивно меченной фолиевой
кислотой. Этот анализ должен предоставить аффинность связывания и специфичность для рецептора фолата в одно и то же время) линкеров фолата и 2-го поколения конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ с культивируемыми раковыми клетками. Связывающие кривые: А: фолат-ΕΌΛ- и В: конъюгатов фолат-Ьуккраситель ΝΙΚ с клетками КВ, экспрессирующими рецептор фолата;
фиг. 7 - флуоресцентная визуализация тканевого биораспределения ех νίνο 2-го поколения конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ. А: флуоресцентная визуализация голых мышей с ксенотрансплантатами опухоли КВ через 2 ч после внутривенного введения 10 нмоль конъюгата фолат-краситель ΝΙΚ. (а) конъюгаты фолат-ЕОА-№К, вводимые группе мышей, визуализировали индивидуально, (Ь) прямое сравнительное исследование мышей с введенным конъюгатом фолат-ЕПА-ΝΙΚ, и (с) конъюгаты фолат Ανδ-ΝΙΒ. вводимые группе мышей, визуализировали индивидуально. В: тканевое биораспределение ех νίνο у животных, которым вводили конъюгаты фолат-краситель ΝΙΚ;
фиг. 8 - 3-е поколение конъюгатов красителя ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата;
фиг. 9 - рациональное представление конъюгата Р1е-Ь-Туг-80456- краситель ΝΙΚ. Химическая
структура птероил-Туг-80456 (ОТЬ-0038) с четырьмя полезными функциональными свойствами. а=птероиновая кислота в качестве молекулы-мишени; В=а-карбоновая кислота от тирозина для специфичности для опухоли и улучшения сродства связывания к рецептору фолата; с=фенольная часть от тирозина для повышения (яркости) интенсивности флуоресценции; й=флуоресцентный зонд в ближней ИКобласти. Таким образом, тирозин действует как часть лиганда, линкера и красителя в ближней ИКобласти. Иными словами, тирозин представляет собой линкер, который улучшает связывающее сродство и специфичность лиганда (птероиновой кислоты). Он также повышает яркость красителя ΝΙΚ;
фиг. 10 - контроль за ходом реакции (А) Р1е-Туг-80456 (ОТЬ-0038) и (В) фолат-Е0А4К800С^ с помощью ЖХ/МС. Р1е-Туг-80456 дал желаемый продукт 99% чистоты с выходом более 98%, тогда как фолат- Е0А-ГК800С^ дал множественные побочные продукты с 30-40% от желаемого продукта;
фиг. 11 - флуоресцентная визуализация всего организма и тканевое биораспределение ех νίνο у мышей, которым вводили 10 нмоль Р1е-Туг-80456. (1) Флуоресцентная визуализация голых мышей с ксенотрансплантатами опухоли КВ через 2 ч после внутривенного введения 10 нмоль конъюгатов ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата (наложение флуоресцентной визуализации и визуализации в белом свете). (2) Тканевое биораспределение конъюгатов после извлечения тканей у мышей, предварительно подвергнутых визуализации;
фиг. 12 - прямое сравнительное исследование Р1е-Ь-Тгу-80456 (ОТЬ-0038) с 2-м поколением конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ. (А) Флуоресцентная визуализация всего организма, (В) тканевое биораспределение ех νίνο, и (С) визуализация опухолей и почек через 2 ч после введения Р1е-Туг-80456 и 2-го поколения конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ (10 нмоль) голым мышам. Препарированные опухоли (их срезы) показали однородный захват агентов визуализации, направленных на опухоли;
фиг. 13 - сравнение накопления в опухоли и специфичности для опухоли Р1е-Туг-80456 с другим конъюгатом птероил-краситель ΝΙΚ после введения 10 нмоль каждого из конъюгатов мышам, несущим ксенотрансплантаты опухолей, позитивных в отношении рецептора фолата;
на фиг. 14 изображена структура четырех соединений, конъюгированных с аминокислотной линкерной группой, включая Р1е-Ьу8-80456, птероил-Су8-80456, Р1е-8ег-80456 и Р1е-4-амино-Ь-Рго-80456;
на фиг. 15 - относительная аффинность связывания ОТЬ-0038, ОТЬ-0039 (Ό-изомера ОТЬ-0038) и фолиевой кислоты с рецептором фолата;
фиг. 15А представляет собой график, который изображает кривую связывания каждого соединения
- 11 029738
с рецепторами фолата;
фиг. 15В - таблица, иллюстрирующая аффинность связывания и относительное связывающее сродство всех трех соединений;
на фиг. 16А изображена визуализация флуоресценции всего тела голых мышей с ксенотрансплантатами опухоли КВ, которым вводили ОТЬ-0039. Мышам вводили внутривенно 10 нмоль ОТЬ-0039 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (100 мкл). Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего тела затем осуществляли с использованием системы визуализации СаПрег 1У18 Ьитта II с программным обеспечением ЬМпд 1таде 4.0;
на фиг. 16В иллюстрируется тканевое биораспределение у мышей, которым вводили ОТЬ-0039 как на фиг. 5А, через 2,5 ч после введения соединения. После визуализации всего организма животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцу, кожу и опухоль) анализировали на активность флуоресценции с использованием визуализатора 1У18, как описано выше;
на фиг. 17 изображена таблица, которая суммирует захват ОТЬ-0038 опухолью. Тканевое биораспределение анализировали у мышей, которым вводили возрастающие количества ОТЬ-0038 в диапазоне 0,3-90 нмоль. Анализ данных по биораспределению проводили через 2,5 ч после введения;
фиг. 18 иллюстрирует тканевое биораспределение у мышей, которым вводили возрастающие количества ОТЬ-0038. Концентрации соединения в диапазоне 0,3-90 нмоль вводили мышам внутривенно. Анализ данных по биораспределению проводили через 2,5 ч после введения;
фиг. 19 - визуализацию флуоресценции всего тела голых мышей с ксенотрансплантатами опухоли КВ, которым вводили 1 нмоль ОТЬ-0038. Демонстрируется, что необходима очень низкая концентрация ОТЬ-0038 для визуализации опухоли из-за его высокой аффинности к РК и более высокой яркости красителя. Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего тела затем осуществляли с использованием системы визуализации СаПрег 1У18 Ьитта II с программным обеспечением ЬМпд Ийаде 4.0;
на фиг. 20А изображена визуализация флуоресценции всего тела мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли, негативной в отношении рецепторов фолата. Визуализацию всего тела осуществляли через 2,5 ч после введения 10 нмоль ОТЬ-0038;
на фиг. 20В проиллюстрирован захват ОТЬ-0038 инвазивной опухолью и почками в случае ксенотрансплантатов опухоли, негативной в отношении рецептора фолата, и почек, позитивных в отношении рецептора фолата. Анализ данных проводили через 2,5 ч после введения;
на фиг. 21 изображена схема трехстадийной реакции синтеза визуализирующих соединений в жидкой фазе;
на фиг. 22 изображена схема двухстадийной реакции синтеза визуализирующих соединений на твердой фазе;
на фиг; 23А представлена визуализация флуоресценции всего тела мышей, которым вводили 10 нмоль Р1е - аналоги тирозина - 80456, через 2 ч после введения;
на фиг. 23В - тканевое биораспределение Р1е - аналоги тирозина - 80456 через 2 ч после введения; на фиг. 24 - визуализация флуоресценции всего тела мышей, которым вводили 10 нмоль ОТЬ-0038
(Рке-Туг-80456), ОТЬ-0053 (птероил-Ьу8-80456) и ОТЬ-0054 (птероил-Су8-80456) через 2 ч после введения. Возбуждение: 745 нм. Излучение: 830 нм;
на фиг. 25 демонстрируется тканевое биораспределение ОТЬ-0038 (Рке-Туг-80456), ОТЬ-0053 (птероил-Ьу8-80456) и ОТЬ-0054 (птероил-Су8-80456) через 2 ч после введения. Возбуждение: 745 нм. Излучение: 830 нм;
на фиг. 26 представлена визуализация флуоресценции всего тела и половины тела мышей, которым вводили 10 нмоль ОТЬ-0051 (птероил-Туг-!КО28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак) через 2 ч после введения;
на фиг. 27 демонстрируется тканевое биораспределение ОТЬ-0051 (птероил-Туг-!КО28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак) через 2 ч после введения.
Подробное описание изобретения
Хирургическое вмешательство является одним из лучших методов лечения всех солидных опухолей, таких как рак простаты, яичников, легких, молочной железы, толстой кишки и поджелудочной железы. В то время как в США операция является эффективной у 50% больных с солидными опухолями, химио- и лучевая терапия в отдельности эффективны менее чем у 5% от всех больных раком. Каждый год в США более 700000 больных подвергаются операции по поводу рака и 40% хирургических больных имеют рецидив местно-регионарного заболевания в пределах 5 лет. Несмотря на значительные успехи в области онкологии за последнее десятилетие, в этой области сохраняются значительные препятствия, требующие преодоления. Например, по-прежнему трудно добиться полной резекции первичной опухоли с негативными краями, удаления лимфатических узлов, несущих метастатические раковые клетки, и идентификации сопутствующего заболевания. Достижение улучшений в этих трех случаях не только улучшает длительность отсутствия рецидивов болезни, но также приводит к решениям относительно послеоперационной химиотерапии и облучения. Поскольку флуоресцентные красители без направленно- 12 029738
го действия, как было показано, пассивно накапливаются в некоторых опухолях, это очень часто приводит к плохим отношениям опухоли к фону, и определение границ между злокачественными и здоровыми тканями может быть затруднено. Хотя направляемые лигандом флуоресцентные красители (например, ЕС17: фолат-ЕЭЛ-ПТС) были использованы для визуализации ткани, эти красители оказались неэффективными, поскольку они не проникают глубоко в ткань и, следовательно, идентифицируют только конкретные клетки на поверхности ткани, а не более глубоко в пределах образца ткани. Кроме того, было показано, что спектры возбуждения и излучения этих предшествующих флуоресцентных красителей были таковы, что они давали значительный фоновый шум, так что ткань-мишень было нелегко обнаружить. Кроме того, как обсуждалось выше для фона, красители на основе флуоресцеина имеют такие недостатки, как низкая стабильность и срок годности. ЕС17 легко разлагается в результате нестабильности тиомочевинного мостика в этом соединении. Кроме того, в ЕС17 используется флуоресцеин, который имеет такой недостаток, как относительно высокий уровень неспецифического фонового шума из-за коллагена в тканях, окружающих сайт визуализации. Кроме того, поглощение видимого света биологическими хромофорами, в частности, гемоглобином дополнительно ограничивает используемость красителей, которые включают флуоресцеин. Это означает, что обычные красители не могут легко обнаружить опухоли, которые могут быть расположены глубже, чем несколько миллиметров в ткани. Кроме того, флуоресценция флуоресцеина гасится при низком рН (рН ниже 5).
Для того чтобы вещество красителя было пригодным для обнаружения и служить руководством при хирургическом вмешательстве или предоставления визуализации другой ткани, необходимо преодолеть эти недостатки.
Рассматривалось несколько критериев для получения конъюгатов, включая красители в ближней инфракрасной области. Легкость синтеза и химическая стабильность были главными химическими показателями. Рассматривались спектральные свойства, такие как спектры поглощения и излучения и квантовый выход. Оценивались некоторые биологические свойства, такие как сродство связывания в исследованиях на клеточном уровне, визуализация всего тела животного с использованием мышей с опухолями и биораспределение. Специально для биораспределения рассматривалось несколько аспектов, включая мышей, забитых через 2 ч после перорального распределения, визуализацию живых мышей и увеличение дозы. Наконец, были учтены соображения безопасности, включая максимальную допустимую дозу (ΜΤΌ), иммуногистохимический анализ (1НС) и общий клинический анализ патологии.
В настоящем изобретении предлагаются птероиловые конъюгаты красителей в ближней инфракрасной области, которые являются стабильными, флуоресцируют в инфракрасном диапазоне, и глубоко проникают в ткань-мишень с получением специфической и яркой идентификации областей ткани, которые экспрессируют рецептор фолата. Более конкретно, птероиловые конъюгаты соединены с красителями в ближней инфракрасной области через аминокислотный линкер. Еще более конкретно, было обнаружено, что когда аминокислотный линкер представляет собой тирозин или производное тирозина, интенсивность флуоресценции красителя сохраняется или даже усиливается.
Аминокислота определяется как включающая функциональную аминогруппу, соединенную с функциональной группой карбоновой кислоты, и имеющая боковую цепь, специфичную для каждой аминокислоты. Альфа-аминокислота представляет собой любое соединение общей формулы К5СН(ЫН2)СООН, (α-аминокислота), в котором К5 выбран из группы, состоящей из Н или любой известной боковой цепи аминокислоты.
Бета-аминокислота определяется как включающая функциональную аминогруппу, соединенную с бета-углеродом, и функциональную группу карбоновой кислоты, связанную с альфа-углеродом. Бетагомо-аминокислота определяется как включающая функциональную аминогруппу, связанную с бетауглеродом, функциональную группу карбоновой кислоты, соединенную с альфа-углеродом, и боковую цепь, начиная либо с альфа-углерода, либо с бета-углерода, где боковая цепь связана с другой аминокислотой.
Природные аминокислоты могут быть разделены на следующие четыре группы: (1) кислые аминокислоты, (2) основные аминокислоты, (3) нейтральные полярные аминокислоты и (4) нейтральные неполярные аминокислоты. Характерные аминокислоты в этих различных группах включают, но не ограничиваются этим: (1) кислые (отрицательно заряженные) аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; (2) основные (положительно заряженные) аминокислоты, такие как аргинин, гистидин и лизин; (3) нейтральные полярные аминокислоты, такие как глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; и (4) нейтральные неполярные (гидрофобные) аминокислоты, такие как аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.
Консервативная замена аминокислоты природной аминокислотной последовательностью может быть выбрана из других членов группы, к которой принадлежит природная аминокислота. Например, группа аминокислот с алифатическими боковыми цепями представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин. Консервативная замена природной аминокислоты валина включает использование глицина, аланина, лейцина или изолейцина.
- 13 029738
Группа аминокислот с алифатической гидроксильной боковой цепью включает серин и треонин. Группа аминокислот с содержащей амид боковой цепью включает аспарагин и глутамин. Группа аминокислот с ароматической боковой цепью включает фенилаланин, тирозин и триптофан. Группа аминокислот с основной боковой цепью включает лизин, аргинин и гистидин. Группа аминокислот с серосодержащей боковой цепью включает цистеин и метионин. Примеры консервативных замен природных аминокислот представляют собой замены: лейцина на валин, серина на треонин, фенилаланина на тирозин, лизина на аргинин, цистеина на метионин и глутамина на аспарагин.
В предпочтительных вариантах осуществления в настоящем документе показано, что такие птероиловые конъюгаты специфически направлены на опухолевые клетки в пределах ткани. Кроме того, интенсивность флуоресценции является более высокой, чем интенсивность, наблюдаемая ранее с другими красителями в ближней инфракрасной области, которые направленно действуют с помощью фолата на опухоли, позитивные в отношении рецептора фолата. Эта повышенная интенсивность позволяет направленно действовать и четко идентифицировать небольшие области биологических образцов (например, мелкие опухоли) в ткани, подвергаемой мониторингу. Кроме того, повышенная интенсивность флуоресценции соединений по настоящему изобретению обеспечивает дополнительное преимущество в том, что более низкие дозы/количества красителя могут быть введены и все еще давать значимые результаты. Таким образом, соединения по настоящему изобретению приводят к более экономичным методам визуализации. Кроме того, существует дополнительное преимущество в том, что более низкая доза соединений по раскрытию по сравнению с обычными соединениями для визуализации сводит к минимуму токсичность и другие побочные эффекты, которые сопровождают введение чужеродных веществ в организм.
Кроме того, идентификация мелких опухолей должна приводить к более точной и более эффективной резекции первичной опухоли с получением отрицательных полей, а также к точной идентификации и удалению лимфатических узлов, несущих метастатические раковые клетки и к идентификации сопутствующего заболевания. Каждое из этих преимуществ положительно коррелирует с более хорошим клиническим исходом для больного, подвергаемого лечению.
В конкретных экспериментах было обнаружено, что использование аминокислот, отличных от тирозина, в качестве линкера приводит к потере флуоресценции в ближней инфракрасной области. Например, см. обсуждение схемы I. Конкретно следует отметить путь синтеза, ведущий к нежелательному побочному продукту 4 в качестве основного продукта, который не имеет свойств ΝΙΚ.
Тем не менее, предполагается, что в дополнение к тирозину и производным тирозина, птероиловый конъюгат красителя в ближней инфракрасной области с цистеином или производным цистеина также может быть пригоден. Кроме того, предполагается, что прямая связь птероиловой или фолатной части с красителем или связывание красителя с птероиновой кислотой или фолиевой кислотой через аминный линкер также приведет к потере интенсивности флуоресценции конъюгата, тогда как присутствие тирозина или производного тирозина в качестве линкерной части между птероиловой частью (направляющей частью) и красителем в ближней инфракрасной области (флуоресцирующей частью) является полезным для сохранения или улучшения флуоресценции конъюгированного соединения. Соединения на основе тирозина по данному раскрытию не требуют дополнительного аминного линкера для конъюгации 80456 и других, потому что конъюгация через фенольную часть тирозина приводит к повышенной флуоресценции.
Соединения могут быть использованы с молекулярными томографическими системами визуализации, опосредованной флуоресценцией, такими как созданные для обнаружения активации флуоресценции в ближней инфракрасной области в глубоких тканях. Соединения обеспечивают молекулярную и тканевую специфичность, выход флуоресценции с высокой контрастностью, более яркий флуоресцентный сигнал, а также уменьшение фоновой автофлуоресценции, что позволяет улучшить раннее выявление и оценку молекулярной мишени пораженной ткани ίη νίνο (например, рака). Соединения могут быть использованы для трехмерной визуализации глубоких тканей, направляемой хирургии и методов количественной оценки количества клеток-мишеней определенного типа в биологическом образце.
Соединения.
В одном аспекте изобретение относится к соединениям, включающим формулу I
где X представляет собой аминокислоту или ее производное и
Υ представляет собой краситель, который характеризуется спектрами возбуждения и излучения флуоресценции в ближней инфракрасной области,
и указанное соединение поддерживает или усиливает флуоресценцию Υ.
- 14 029738
В некоторых вариантах осуществления аминокислота или производное аминокислоты вызывают сдвиг электронного спектра излучения, электронного спектра поглощения или обоих электронных спектров излучения и поглощения относительно электронных спектров немодифицированной молекулы красителя. Соответственно, сдвиг электронного спектра представляет собой батохромный сдвиг (т.е. сдвиг к волне большей длины/более низкой частоты), что способствует улучшению обнаружения соединения в ближней инфракрасной области спектра (ΝΙΚ) спектрального окна и/или снижению количества фонового сигнала, автофлуоресценции, помех от ткани, окружающей визуализируемую область. Более конкретно, этот сдвиг в электронном спектре, в частности, наблюдается у красителей ΝΙΚ, которые включают электронегативные атомы, которые включены в 6-членное кольцо. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аминокислота или производное аминокислоты (X) включают обогащенную электронами часть, такую как, например, кислород, сера или азот. Неограничивающие примеры таких аминокислот могут включать цистеин, метионин, треонин, серин, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин, лизин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аспарагин и глутамин или их производные.
В вариантах осуществления этого аспекта в изобретении предлагаются соединения формул (1)а, (1)Ь, (1)с и (Ι)ά:
где группы Туг, Су§, 8ег и Ьу§ указывают на тирозин, цистеин, серин и аминокислотный остаток лизина соответственно или на их производные, и
Е предпочтительно представляет собой птероил или фолат, и
Кх, каждый независимо, включает выбранную солюбилизирующую группу, которая необязательно отсутствует.
- 15 029738
где группы Туг, Суз, 5ег и Ьуз указывают на тирозин, цистеин, серин и аминокислотный остаток лизина соответственно или на их производные и Ь предпочтительно представляет собой птероил или фолат. Предпочтительно Ь представляет собой птероил.
В конкретных предпочтительных вариантах осуществления в изобретении предлагается соединение формулы 1(а), в котором Туг выбран из группы, состоящей из:
- 16 029738
Соответственно, соединения, раскрытые в настоящем документе, имеют максимальную длину волны поглощения света в ближней инфракрасной области от приблизительно 650 до 1000 нм, например предпочтительно приблизительно 800 нм.
В конкретных предпочтительных вариантах осуществления соединения, раскрытые в настоящем документе, включают лиганд (Ь), который эффективен для направленной доставки соединения к конкретному типу клеток или тканей и позволяет визуализировать эту клетку- или ткань-мишень. Предпочтительно, чтобы Ь представлял собой либо птероиловую часть, либо часть фолата и более предпочтительно, чтобы Ь представлял собой птероиловую часть. Тем не менее, предполагается, что специалист в данной области техники может использовать некоторые другие лиганды Ь для направленной доставки соединений к определенному белку клеточной поверхности или рецепторному белку, представляющему интерес. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления лиганд включает птероил
Синтез соединений.
Соединения, раскрытые в настоящем документе, могут быть получены с использованием обычных методов, известных в литературе. См., например, синтез соединений красителя, как сообщалось ранее.
Тем не менее, в определенных предпочтительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагаются более эффективные способы синтеза для получения описанных в настоящем документе соединений (т.е. соединений формулы I). Например, соединения, имеющие формулы 1(а)-1(ф, могут быть получены в соответствии с общими схемами, представленными в каждой из схем I, II и III ниже.
На схеме I иллюстрируется схема синтеза, ранее используемая для получения соединений формулы I, где направляющий лиганд включает фолат, связанный через аминокислоту (лизин) с молекулой красителя. Вкратце, фолатный лиганд, модифицированный путем присоединения к аминогруппе аминокислоты, вступает в реакцию с эфирным производным мостика красителя в условиях для получения продуктов (3) и (4). Тем не менее, следует отметить, что соединение 3 является предпочтительным, желаемым соединением, но путь синтеза ведет к присутствию нежелательного побочного продукта 4 в качестве основного продукта, который не имеет свойств №К. Кроме того, его спектральные свойства зависят от рН. Таким образом, эта схема демонстрирует основной недостаток красителей с эфирным мостиком. При обычном получении этих красителей 30-60% выхода составляет желаемый продукт, тогда как 40-70% выхода составляет нежелательный побочный продукт.
- 17 029738
На схеме II представлен путь синтеза, который включает только три стадии реакции и обеспечивает продукцию соединения (5) с высоким выходом (более 98%). Вкратце, направляющий лиганд (1) (представленный на схеме II с птероиловой группой) и аминокислоту или производное аминокислоты (2), которые необязательно включают защитные группы для избегания нежелательной реактивности с группами, отличными от аминогруппы аминокислоты, смешивают в системе растворителей НАТи [(О-(7-азабензотриазол-1-ил)-НН№,№-тетраметилурония гексафторфосфат^/ЭГРЕА (диизопропилэтиламин)/ЭМР (диметилформамид), и реакцию проводят при комнатной температуре и в течение достаточного времени (5 мин) для возможности присоединения (2) через функциональную аминогруппу к лиганду (1) для получения (3). Соединение (3) может быть с успехом осаждено добавлением к реакционной смеси разбавленной кислоты. Более конкретно, соединение 3 осаждали в 1Ν НС1 (хлористоводородной кислоты) с получением конечного соединения с чистотой более 98%, в этих вариантах осуществления избегаются дорогие стадии ВЭЖХ или колоночной хроматографии. Соединение (3) вводят в реакцию для удаления защитных групп аминокислотной части соединения путем взаимодействия соединения при комнатной температуре в системе растворителей ТХУ (трифторуксусная кислота):вода:Т!Р8 (триизопропилсилан) для получения соединения (4). Соединение 4 очищали осаждением диэтиловым эфиром или метил-трет-бутиловым эфиром с получением более чем 98% чистоты без ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или колоночной хроматографии. Соединение (4) вводят в реакцию в основной водной системе (например, в №ОН, гидроксиде натрия) для удаления функциональных защитных групп и затем в небольшом молярном избытке вводят в реакцию с красителем (80456) в воде в течение периода времени 15 мин и при температуре 80-100°С, что позволяет создать связи между красителем и (4) с получением конечного соединения (5). Соединение 5 осаждали ацетоном с получением Р1е-Туг-80456 с чистотой более 98%. При использовании ΝαΟΗ получают натриевую соль Р1е-Туг-80456.
- 18 029738
описанных в настоящем документе, и обеспечения выхода, сходного с описанным в схеме II. Вкратце, аминокислоту, связанную с субстратом (1) (проиллюстрированным на схеме III ниже как защищенный тирозин, присоединенный к шарику смолы), вводят в реакцию для удаления Ртос (флуоренилметилоксикарбонильной) защитной группы в 20% пиперидине в ДМФ, и затем вводят в реакцию с направляющим лигандом (снова проиллюстрированным ниже как птероил) в НАТИ/ОШЕА/ОМР в течение периода времени и при температуре, достаточных для возможности соединения лиганда с функциональной аминогруппой аминокислоты с получением (2). Соединение (2) вводят в реакцию для удаления субстрата и любых защитных групп на аминокислоте в сериях реакций в системе растворителей ТХУ:вода:ТРР8 с получением (3). Затем следует сходная с описанной на схеме II конечная стадия, соединение (3) вводят в реакцию в основной водной системе для удаления функциональных защитных групп и затем в небольшом молярном избытке вводят в реакцию с красителем (80456) в воде в течение времени и при температуре, которые позволяют образовать связь между красителем и (3) с получением конечного соединения (4).
- 19 029738
Схема III
Вышеуказанные схемы лишь иллюстрируют несколько неограничивающих подходов к синтезу, с помощью которых могут быть получены соединения, описанные в настоящем документе. Следует понимать, что специалист в данной области техники может определить и включить изменения в приведенные выше схемы, которые обеспечивали бы другие соединения, имеющие физические свойства, которые находятся в пределах объема изобретения. Например, в то время как приведенные выше схемы иллюстрируют фолатные и птероиловые группы в качестве направляющих лигандов описанных в настоящем документе соединений, специалист должен понимать, что другие направляющие лиганды могут быть с легкостью включены в схему синтеза с получением альтернативных соединений формулы I. В качестве другого примера специалист в данной области техники должен понимать, что длины волн поглощения/излучения части красителя соединений можно модулировать путем регулировки длины полиметиновой цепи и выбора соответствующих арильных или гетероарильных групп (например, индола относительно бензиндола), а также присоединения аминокислотных групп. В другом примере специалист в данной области техники должен понимать, что коэффициент экстинкции и интенсивность флуоресценции красителя может варьироваться путем изменения жесткости полиметиновой цепи (например, путем введения циклической системы в полиметиновую цепь, такой как циклогексен, циклобутенон среди прочего), как известно в данной области техники. Соответственно, специалист в данной области техники будет иметь возможность изменять синтез, выбрав соответствующие реагенты, с получением любого из соединений, описанных в настоящем документе, и необязательно, будучи в состоянии изменять определенные физические свойства соединений.
Способы применения
Как отмечалось выше в настоящем изобретении, существует потребность в соединениях красителей в ближней инфракрасной области, которые специально направлены на области в пределах ткани. Это связано с тем, что эти соединения могут быть использованы в методах визуализации и для оказания помощи в диагностике и терапевтическом вмешательстве в заболевание. Как обсуждалось подробно выше, представленные в настоящем документе соединения являются пригодными в качестве красителей и визуализирующих агентов в ΝΙΚ области светового спектра. Таким образом, соединения характеризуются широкой применимостью к любому количеству способов визуализации, диагностики и направленной терапии.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, которые включают по меньшей мере одно из соединений (например, формулы I, 1(а), 1(Ь), 1(с) и/или Ι(ά)), описанных в настоящем документе, и могут быть использованы для специфической и чувствительной идентификации опухолей в пределах ткани. Более конкретно, идентифицированные опухоли могут быть затем
- 20 029738
терапевтически удалены с помощью хирургических методов. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут быть пригодны для руководствующейся флуоресценцией хирургической резекции опухолей, лимфатических узлов и тому подобного. Альтернативно, соединения по настоящему изобретению легко могут быть использованы для визуализации всего тела, при которой соединение вводят индивидууму, и локализация флуоресценции облегчает идентификацию места опухоли.
Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации ίη νίνο пораженной ткани у нуждающегося в этом индивидуума. Способ по изобретению включает облучение ίη νίνο части тела индивидуума, имеющего пораженную ткань, светом, имеющим по меньшей мере одну длину волны возбуждения в ближнем инфракрасном диапазоне от приблизительно 600 до приблизительно 1000 нм. Для определения локализации и/или площади поверхности пораженной ткани у индивидуума непосредственно рассматривается флуоресценция, исходящая от соединения по настоящему изобретению, введенного индивидууму, которое специфически связано и/или захвачено пораженной тканью в части тела, в ответ, по меньшей мере, на одну длину волны возбуждения.
Свет, имеющий диапазон длин волн от 600 до 850 нм, находится в пределах ближнего инфракрасного диапазона спектра в отличие от видимого света, который находится в пределах диапазона от приблизительно 401 до 500 нм. Таким образом, возбуждающий свет, использующийся в практике диагностических методов по настоящему раскрытию, должен иметь по меньшей мере одну длину волны света для высвечивания ткани при инфракрасной длине волны для возбуждения соединений для того, чтобы полученная флуоресценция в области, характеризующейся захватом соединений по настоящему раскрытию, была отчетливо видна и отличалась от автофлуоресценции окружающей ткани. Возбуждающий свет может быть монохромным или полихромным. Таким образом, соединения по настоящему изобретению являются предпочтительными, поскольку они устраняют необходимость в использовании механизмов фильтрации, которые должны использоваться для получения желаемого диагностического изображения, если флуоресцентный зонд представляет собой зонд, который флуоресцирует при длинах волн ниже 600 нм. Таким образом, при использовании соединений по настоящему раскрытию избегаются неясные диагностические изображения, которые получают в результате возбуждающего света с длинами волн, которые будут давать свечение в здоровой ткани и приводить к потере разрешающей способности флуоресцентного изображения.
Операционные помещения для хирургических процедур могут быть оснащены верхним светом, который дает длины волн света в оптическом спектре излучения, пригодном для практики диагностических методов по настоящему раскрытию, таких как лампы, которые дают свет соответствующей длины волны. Такой свет может быть использован для практики диагностических методов по настоящему раскрытию только при выключении других источников света в операционном помещении (для устранения постороннего света, который будет визуально отражаться от ткани исследуемой части тела) и освещении возбуждающим светом с длиной волны в ближней инфракрасной области полости тела или хирургически созданной полости так, чтобы флуоресцентное изображение, воспринимаемое непосредственно глазом наблюдателя (например, хирурга), являлось преимущественно флуоресцентным изображением, исходящим от флуорофора(ов) в поле зрения. Свет, исходящий от источника в диапазоне 600 и 850 нм, предпочтительно в диапазоне 750-850 нм, должен использоваться для достижения цели прямой визуализации наблюдателем так, чтобы свет, отражающийся от части тела, отличной от флуоресцирующей(их) части (ей), сводился к минимуму или был устранен.
Соответственно, в раскрытых диагностических методах пораженная ткань (и связанный или захваченный направляющий конструкт) "подвергается воздействию" возбуждающего света (например, путем хирургически созданной открытой полости или эндоскопической доставки света к внутреннему месту локализации поражения). Раскрытый способ особенно подходит для обнаружения ίη νίνο пораженной ткани, расположенной во внутренней полости индивидуума, такой как естественная полость тела или хирургически созданная открытая полость, когда пораженная ткань находится "на виду" (т.е. экспонируется глазу человека), для облегчения процедуры биопсии или хирургической резекции области, которая высвечена в результате захвата соединений по настоящему изобретению. Так как точная локализация и/или площадь поверхности опухолевой ткани с легкостью определяется по захвату соединений по настоящему изобретению, способы, использующие соединения по настоящему изобретению, дают ценную руководящую информацию для хирурга, который нуждается в "выявлении" в режиме реального времени точных очертаний, размера и т.д. массы, которая должна быть удалена в процессе хирургического вмешательства.
Таким образом, в конкретных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривается оптическая визуализация биологической ткани, которая экспрессирует рецептор фолата, путем контактирования ткани с композицией, включающей соединения по настоящему изобретению (например, соединения формулы I), предоставления времени для того, чтобы соединение в композиции распределилось в ткани и провзаимодействовало с сайтом рецептора фолата. После того как прошел достаточный период времени для такого взаимодействия, ткань освещается возбуждающим светом, чтобы вызвать флуоресценцию соединения в композиции. Флуоресценцию затем определяют, и та область, где такая флуоресценция наблюдается, является областью, которая содержит рецептор фолата.
- 21 029738
Подобным же образом соединения по настоящему изобретению используются для идентификации типа клеток-мишеней в биологическом образце путем контактирования биологического образца с такими соединениями в течение периода времени и в условиях, которые позволяют соединению связываться по меньшей мере с одной клеткой этого типа клеток-мишеней. Связанное соединение затем оптически детектируют так, что наличие флуоресценции при длине волны в ближней инфракрасной области, исходящей от связанного направленного соединения по настоящему изобретению, показывает, что тип клеткимишени присутствует в биологическом образце. Этот метод, таким образом, дает изображение типа клетки-мишени в оцениваемой ткани. Наиболее предпочтительно, чтобы тип клетки-мишени представлял собой опухолевую клетку или клетку лимфатического узла, в который опухолевая клетка внедрилась.
Эти способы преимущественно обеспечивают усовершенствованным методом осуществления хирургического вмешательства, руководствующегося визуализацией, у индивидуума, так как введение композиции, включающей соединение по раскрытию, в условиях и в период времени, достаточные для того, чтобы указанное соединение накапливалось в данной хирургической области, помогает хирургу визуализировать ткань, которая должна быть удалена. Предпочтительно ткань представляет собой опухолевую ткань, освещение с использованием инфракрасного света соединения, которое захвачено тканью, облегчает визуализацию опухоли в результате флуоресценции соединения в ближней инфракрасной области. С помощью визуализации, облегчаемой направлением соединения по настоящему раскрытию к месту опухоли, хирургическая резекция областей, которые флуоресцируют при возбуждении светом в инфракрасной области, дает возможность улучшения и правильного удаления даже небольших опухолей.
Следует понимать, что в любом из хирургических методов по настоящему раскрытию соединения по настоящему изобретению могут быть введены, перед тем как происходит хирургический разрез или даже после получения хирургического полости и после того как место локализации опухоли было выявлено хирургом.
Если предполагаемый пораженный участок находится в природной полости тела или во внутреннем участке, полученном в результате хирургического вмешательства, для доставки возбуждающего света к участку может необязательно использоваться эндоскопическое устройство для получения флуоресценции, испускаемой участком в полости тела, и с целью помощи в формировании прямой визуализации флуоресценции пораженной ткани. Например, линза в эндоскопическом устройстве может быть использована для фокусирования обнаруженной флуоресценции в качестве вспомогательного средства формирования изображения. При использовании в настоящем документе такая флуоресценция, предоставляемая эндоскопически, называется "непосредственно наблюдаемой" практическим работником, и ткань, с которой связывается направляющий конструкт, или в которой он захватывается, должна быть "в области видимости" эндоскопа, так как свет, используемый в диагностической процедуре по раскрытию, не должен содержать длины волн света, которые проникают в ткань, такие как длины волн в ближней инфракрасной области. Альтернативно, возбуждающий свет может быть направлен любым удобным способом в полость тела или хирургическое отверстие, содержащие направляющий конструкт, вводимый, как описано в настоящем документе, и флуоресцентное изображение, полученное таким образом, может быть непосредственно визуализировано глазом наблюдателя без помощи эндоскопа. С помощью любого типа эндоскопического устройства или без него флуоресцентное изображение, полученное с помощью метода по раскрытию, таково, что оно может быть выявлено без помощи устройства обработки изображений, такого как камера ССЭ. ТВ-монитор, коллектор фотонов и т.д.
Следует понимать, что диагностические методы или методы визуализации по настоящему изобретению позволяют хирургу/практикующему врачу одновременно видеть/наблюдать/визуализировать пораженные или аномальные ткани через хирургическое отверстие для облегчения процедуры биопсии или хирургического иссечения. Так как локализация и/или площадь поверхности пораженной ткани с легкостью определяется с помощью диагностической процедуры по настоящему изобретению, использующей соединения, описанные в настоящем изобретении, раскрытый способ дает ценную руководящую информацию для хирурга, который нуждается в выявлении точных очертаний, размера и т.д. массы, например, для резекции в процессе хирургического вмешательства. В частности, следует отметить, что соединения по настоящему раскрытию флуоресцируют в ближнем инфракрасном диапазоне с большей интенсивностью, чем соединения, описанные ранее. Таким образом, предпочтительно, предполагается, что меньшее количество соединения будет необходимо для достижения диагностической визуализации. Кроме того, соединения по настоящему изобретению проникают глубоко в опухоль и, следовательно, раскрытие выгодно позволяет добиться большей точности удаления опухоли.
Изобретение относится к способам применения в диагностической процедуре во время операции у нуждающегося в этом больного, путем введения индивидууму композиции, включающей соединение по настоящему изобретению, и облучения ίη νίνο части тела индивидуума, содержащей пораженную ткань, светом, имеющим по меньшей мере одну длину волны возбуждающего света в интервале от приблизительно 600 до приблизительно 850 нм, непосредственного наблюдения флуоресценции, исходящей от направляющего конструкта, вводимого индивидууму, который специфически связывается и/или захватывается пораженной тканью в части тела, в которой направляющий конструкт флуоресцирует в ответ по
- 22 029738
меньшей мере на одну длину волны возбуждающего света, определения локализации и/или площади поверхности пораженной ткани у индивидуума, и удаления по меньшей мере части опухолевой ткани.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам диагностики ίη νΐνο опухолевой ткани у нуждающегося в этом индивидуума. В этом варианте осуществления способ по настоящему раскрытию включает контактирование образцов опухолевых клеток, полученных от индивидуума, ίη νίίτο с множеством соединений с определяемой меткой, каждое из которых связывается или селективно захватывается определенным типом опухоли, определение того, какие из соединений связываются или захватываются образцом опухолевых клеток, введение диагностически эффективного количества по меньшей мере одного биологически совместимого флуоресцентного направляющего конструкта, содержащего соединение по настоящему изобретению, которое было определено как связывающееся и/или захватываемое опухолевыми клетками образца, и флуорофор, чувствительный по меньшей мере к одной длине волны света в диапазоне от приблизительно 600 до приблизительно 850 нм, и диагностирование локализации и/или площади поверхности опухолевой ткани в части тела ίη νΐνο путем непосредственного наблюдения флуоресценции, исходящей от направляющего конструкта, связанного или захваченного опухолевой тканью при ее облучении светом, обеспечивающим по меньшей мере одну возбуждающую длину волны для флуоресценции направляющего конструкта.
В некоторых вариантах осуществления единственный тип флуоресцентной части используется для генерации флуоресценции, исходящей от облученной части тела (т.е. от флуоресцентного направляющего конструкта, который связывается или захватывается пораженной тканью), и направляющий конструкт подвергается воздействию источника света с длиной волны в ближнем инфракрасном спектре.
В других вариантах осуществления предполагается, что множество (т.е. два, три, четыре или более) направляющих конструктов используется для получения диагностического изображения. Такие дополнительные направляющие конструкты могут представлять собой дополнительные соединения по настоящему изобретению, отличные от первого такого соединения. Альтернативно, дополнительные направляющие конструкты могут содержать красители, описанные в данном документе, но с замещением птероиловой части на лиганд другого рецептора, отличного от рецептора фолата. В других вариантах осуществления дополнительные направляющие части могут представлять собой другие флуоресцентные направляющие конструкты (например, антитела или их биологически активные фрагменты, имеющие прикрепленные флуорофоры), которые связываются с другими рецепторами или антигенами на опухоли или ткани (например, в месте атеросклероза, инфекции, сердечнососудистых заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, иммунологических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, болезней органов дыхания, метаболических заболеваний, наследственных заболеваний, инфекционных заболеваний, болезней костной ткани и заболеваний, вызванных загрязнением окружающей среды, и т.п.), для их визуализации. Любая дополнительная направляющая часть, которая специфически направлена на опухоль или специфический участок в ткани, может быть использована при условии, что она является специфичной для исследуемого участка. Цель дополнительного флуоресцентного направляющего конструкта заключается в увеличении интенсивности флуоресценции в участке, подвергаемом мониторингу, тем самым помогая в определении пораженной или аномальной ткани в части тела. Например, данная опухоль может иметь многочисленные маркеры и в дополнение к соединениям по настоящему изобретению обеспечивается коктейль из флуоресцентных частей, которые специфичны для данной опухоли, так что сигнал, исходящий от опухоли, генерируется более чем одним соединением или флуоресцентной частью, которые направляются и локализуются в месте опухоли, представляющей интерес.
На практике специалист в данной области техники должен вводить соединение по настоящему изобретению или отдельно, или как часть коктейля направляющих поддающихся определению частей и позволять этим соединениям и направляющим частям связываться и/или захватываться любой тканьюмишенью, которая может присутствовать в месте, подвергаемом исследованию, а затем обеспечивать подачу источника света. Как правило, соединения по настоящему изобретению и любые дополнительные направляющие части могут быть введены до операции в течение периода времени и в композициях, которые позволяют флуоресцентным соединениям по настоящему изобретению, а также любым дополнительным флуоресцентным конструктам захватываться тканью-мишенью.
Специалисты в данной области техники способны разработать сочетания последовательно вводимых флуоресцентных направляющих конструктов, каждый из которых специфически связывается с сайтом-мишенью. Предпочтительно, чтобы все флуоресцентные направляющие конструкты, используемые в таких коктейлях для идентификации ткани-мишени, включали флуорофоры, которые флуоресцируют в пределах той же полосы длин волн или на той же длине волны, что и соединение по настоящему изобретению (например, были чувствительными к флуоресценции при длине волны света в ближней инфракрасной области, как в соединениях по настоящему изобретению), чтобы свести к минимуму количество различных источников света, которые должны быть использованы для одновременного возбуждения флуоресценции всех различных направляющих конструктов, используемых в практике способа раскрытия. Тем не менее, предполагается, что дополнительные направляющие части, отличные от соединений по настоящему изобретению, могут флуоресцировать в ответ на облучение светом отличного цвета (т.е. имеющим отличную длину волны), чем флуоресцентные соединения по настоящему изобретению. Раз- 23 029738
личия в цветах флуоресценции, исходящей от соединений по настоящему изобретению и тех дополнительных направляющих соединений, могут помочь наблюдателю в определении локализации и размера пораженной ткани. В некоторых примерах может быть желательно включать в направляющие конструкты флуорофоры, направленные на нормальную ткань-мишень, и соединения по настоящему изобретению, направленные на пораженную ткань-мишень, так что контраст между пораженной тканью и здоровой тканью дополнительно усиливается, создавая дополнительную помощь наблюдателю в определении локализации и размера ткани-мишени. Использование таких дополнительных флуорофоров и направляющих агентов в дополнение к соединениям по настоящему изобретению обеспечивает то преимущество, что любая природная флуоресценция, исходящая от нормальной ткани, заглушается флуоресценцией, исходящей от флуорофора(ов) в дополнительных направляющих конструктах, направленных на нормальную ткань в части тела. Чем больше различие в цвете между флуоресценцией, исходящей от нормальной такни и ткани-мишени, тем легче для наблюдателя визуализировать контуры и размер тканимишени. Например, флуоресцентный направляющий конструкт, включающий флуорофор, дающий инфракрасный свет от соединений по настоящему изобретению, направленный на ткань-мишень (т.е. на патологическую ткань), и флуорофор, дающий зеленый свет в здоровой ткани, помогают наблюдателю отличить ткань-мишень от нормальной ткани. Специалисты в данной области техники могут легко выбрать сочетание флуорофоров, которые дают четкий визуальный цветовой контраст.
Спектр света, используемый в практике способа по раскрытию, выбран для включения по меньшей мере одной длины волны, соответствующей преобладающей длине волны возбуждения направляющего конструкта, или биологически совместимой флуоресцентной части, содержащейся в направляющем конструкте. Обычно возбуждающий свет, используемый в практике способа по раскрытию, включает по меньшей мере одну длину волны возбуждающего света в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн от приблизительно 600 до приблизительно 850 нм.
Однако, когда сочетание направляющих лигандов, которые флуоресцируют при различных длинах волн, используется в практике раскрытия, спектр возбуждающего света должен быть достаточно широким, чтобы обеспечить по меньшей мере одну длину волны возбуждения для каждого из используемых флуорофоров. Например, особенно благоприятно, когда флуорофоры различных цветов выбраны для различения нормальной и пораженной ткани, так что спектр возбуждающего света(ов) включает длины волн возбуждения для флуорофоров, направленных на нормальную ткань и ткань-мишень.
Как отмечается в настоящем документе, соединения по настоящему изобретению специфически направлены на рецептор фолата за счет того, что птероиловый или фолатный лиганд является частью соединений по настоящему изобретению. В вариантах осуществления, в которых используется дополнительная направляющая часть, направляющий конструкт такой дополнительной направляющей части выбран для специфического связывания и/или захвата интересующей тканью-мишенью, например, антигеном или другой структурой поверхности, содержащейся на клетке или в ней, которая характеризует заболевание или аномальное состояние в ткани-мишени. Как и в других диагностических анализах, желательно, чтобы направляющий конструкт селективно связывался или захватывался тканью-мишенью или антигеном, связанным с заболеванием или аномальным состоянием; однако, направляющие конструкты, содержащие части лиганда, которые также связываются или захватываются здоровой тканью или клеточными структурами, могут быть использованы в практике способа по раскрытию до тех пор, пока концентрация антигена в ткани-мишени или сродство направляющего конструкта к ткани-мишени существенно выше, чем для здоровой ткани в поле зрения, так что флуоресцентное изображение, представляющее ткань-мишень, может быть четко визуализировано как отличное от любой флуоресценции, исходящей от здоровой ткани или структуры в поле зрения.
Например, рак толстой кишки часто характеризуется наличием карциноэмбрионального антигена (СЕА), но этот антиген также связан с определенными тканями у здоровых лиц. Тем не менее, концентрация СЕА в раковой ткани толстой кишки часто выше, чем обнаруживаемая в здоровой ткани, так что антитела против СЕА могут быть использованы в качестве лигандной части в практике изобретения. В другом примере дезоксиглюкоза захватывается и используется здоровой тканью в разной степени, хотя ее метаболизм в здоровых тканях за исключением некоторых известных органов, таких как сердце, существенно ниже, чем в опухоли. Известный характер потребления дезоксиглюкозы в организме, следовательно, может быть использован с целью определения тех областей, в которых неожиданно высокий захват дезоксиглюкозы сигнализирует о присутствии опухолевых клеток.
Заболевание или аномальное состояние, определяемое способом по раскрытию, может представлять собой заболевание любого типа, характеризуемое присутствием известной ткани-мишени, для которой известен специфический связывающий лиганд. Например, различные заболевания сердца характеризуются возникновением некротической или ишемической ткани или возникновением атеросклеротической ткани, для которых известны специфические связывающие лиганды. В качестве другого иллюстративного примера, рак молочной железы характеризуется возникновением раковой ткани, идентифицируемой моноклональными антителами против СА15-3, СА19-9, СЕА или НЕК2/№и. Предполагается, что тканьмишень может быть охарактеризована клетками, которые продуцируют либо антиген поверхности, для которого известен связывающий лиганд, либо внутриклеточный маркер (т.е. антиген), так как многие
- 24 029738
направляющие конструкты проникают через клеточную мембрану. Характерные патологические состояния, которые могут быть идентифицированы с помощью способа по изобретению, включают такие различные состояния как различные типы опухолей, бактериальные, грибковые и вирусные инфекции и тому подобное. Используемый в настоящем документе термин "аномальная" ткань включает предраковые состояния, некротическую или ишемическую ткань и ткань, связанную с заболеваниями соединительной ткани и аутоиммунными расстройствами, и тому подобное. Кроме того, примеры типов ткани-мишени, пригодных для диагностики или экспертизы с использованием способа по изобретению, включают ткани сердца, молочной железы, яичников, матки, легких, эндотелиальные ткани, ткани сосудов, желудочнокишечного тракта, колоректального рака, ткани предстательной железы, эндокринные ткани и тому подобное, а также сочетания любых двух или более из них.
Просто в качестве примера, антигены некоторых распространенных злокачественных новообразований и места локализации в организме, в которых они обычно встречаются, известны специалистам в данной области техники, и направляющие лиганды, такие как антитела или для этих антигенов, или даже лиганды, когда антигены являются их рецепторами, известны специалистам в данной области техники. Например, СЕА (карциноэмбриональный антиген) обычно находят в опухолях толстой кишки, молочной железы и легких; ПСА (простатический специфический антиген или иногда обозначаемый как простатический специфический мембранный антиген (Р8МА)) является специфическим для рака простаты; СА-125 обычно находят в опухолях рака яичников, СА15-3, СА19-9, МИС-1, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона и НЕК2/№и обычно встречаются в раковых опухолях молочной железы, альфафетопротеин находят как при раке яичка, так и при раковых опухолях печени, бета-хорионический гонадотропин человека находят при раке яичек и хориокарциноме, как рецептор эстрогена, так и рецептор прогестерона также находят в раковых опухолях матки, и рецептор эпидермального фактора роста обычно находят в раковых опухолях мочевого пузыря. Другие специфичные опухолевые лиганды и маркеры хорошо известны специалистам в данной области техники. В предпочтительных вариантах осуществления в настоящем изобретении используются фолатные или птероиловые части для направленного взаимодействия с фолатным рецептором и направляющие части РМ8А для направленной доставки красителей к клеткам рака простаты.
Предполагается, что любой из этих общеизвестных маркеров опухолей может быть мишенью либо при использовании красителей, описанных в настоящем документе (путем перемены птероиловой части на часть, которая специфически направлена на эти маркеры), либо альтернативно эти маркеры могут быть мишенью в дополнение и в сочетании с рецептором фолата, так что будут представлять собой мишень, использующую соединения по настоящему изобретению. Как обсуждалось выше, возможно особенно выгодно иметь направляющие части к нескольким различным маркерам на данной опухоли, служащие в качестве диагностического коктейля, где направленность на несколько маркеров служит для более яркой и четкой визуализации опухоли.
В дополнение к химическим соединениям направляющие части в таких коктейлях могут включать белок или полипептид, такой как антитело или его биологически активный фрагмент, предпочтительно моноклональное антитело. Дополнительный направляющий флуоресцентный конструкт(ы), используемый в практике способа по настоящему раскрытию, может также представлять собой или включать поликлональные или моноклональные антитела с присоединенной меткой флуорофора. Термин "антитело" при использовании в этом описании включает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты, такие как РаЬ, Е(аЬ')2 и Εν, которые способны связывать эпитопную детерминанту. Способы получения этих фрагментов известны в данной области техники. (См., например, руководство Наг1о\у & Ьапе, АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, №\у Уогк, 1988, включенное в настоящий документ в качестве ссылки). При использовании в данном описании термин "эпитоп" означает любую антигенную детерминанту на антигене, с которой связывается паратоп антитела. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда.
В дополнение к антителам коктейли могут включать соединения, в которых лигандная часть, присоединенная к флуоресцентному направляющему конструкту, выбрана из числа многих биологически совместимых соединений, которые специфически связываются с рецепторами и/или предпочтительно захватываются опухолевыми клетками и могут быть использованы в качестве лигандной части в раскрытых направляющих конструктах. Соединения, которые предпочтительно "захватываются" опухолевыми клетками, могут проникать в клетки через рецепторы поверхности или ядерные рецепторы (например, рецепторы гормонов), поры, гидрофильные "окна" в липидном бислое клеток и тому подобное.
Примерами такого класса соединений, которые направлены на опухоли, являются соматостатин, пептиды, связывающие рецептор соматостатина, дезоксиглюкоза, метионин и тому подобное. Особенно пригодные пептиды, связывающие рецептор соматостатина, представляют собой длительно действующий, октапептидный аналог соматостатина, известный как октреотид (Ό-фенилаланил-Е-цистеинил-Ефенилаланил-О-триптофил-Е-лизил-Е-треонил-Х-[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)пропил]-Ецистеинамида циклический (2^7)дисульфид), ланреотид, пероральный препарат октреотида, Р829, Р587
- 25 029738
и т.п. Связывающие соматостатин пептиды раскрыты в патенте США № 5871711, и методы ковалентного присоединения таких пептидов к радиоактивному изотопу через карбоксил концевой аминокислоты в восстанавливающих условиях описаны в патенте США № 5843401, оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Специалист в данной области техники может легко адаптировать такие принципы для получения чувствительных к флуоресценции пептидов, связывающих рецептор соматостатина, путем замены радиоизотопа на флуоресцентные части по этому раскрытию.
Соматостатин и пептиды, связывающие рецептор соматостатина, являются особенно эффективными при использовании в качестве лигандной части, направленной на опухоль, в направляющем конструкте, когда патологическое состояние представляет собой нейроэндокринную или эндокринную опухоль. Примеры нейроэндокринных опухолей, которые могут быть диагностированы с помощью способа по настоящему раскрытию, включают аденомы (продуцирующие СТГ и продуцирующие ТТГ), опухоли островковых клеток, карциноиды, недифференцированные нейроэндокринные карциномы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, нейроэндокринные и/или промежуточно-клеточные карциномы, нейроэндокринные опухоли яичника, шейки матки, эндометрия, молочной железы, почек, гортани, околоносовых пазух и слюнных желез, менингиомы, хорошо дифференцированные опухоли, происходящие из глии, феохромоцитомы, нейробластомы, ганглионейро(бласто)мы, параганглиомы, папиллярные, фолликулярные и медуллярные карциномы клеток щитовидной железы, карциномы из клеток Меркеля и меланомы, а также гранулемы и лимфомы. Эти опухолевые клетки, как известно, содержат рецепторы соматостатина, и на них можно направленно действовать с использованием соматостатина или пептидов, связывающихся с рецептором соматостатина, в качестве лигандов, направляющих на опухоль, в раскрытом флуоресцентном направляющем конструкте.
Вазоинтестинальный пептид (ВИП), который используется в сцинтиграфии рецептора ВИП (I. νίΓ§ο1ίηί, Еиг. 1. С1ш. 1пуе®1. 27 (10):793-800, 1997), также пригоден для способа по настоящему раскрытию для диагностики малых первичных аденокарцином, метастазов в печень и определенных эндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта.
Другой молекулой, иллюстрирующей лиганды, направленные на опухоль, которые предпочтительно захватываются опухолями, является дезоксиглюкоза, которая, как известно, предпочтительно захватывается множеством различных типов опухолей. Примерами типов опухолей, которые могут быть обнаружены с помощью дезоксиглюкозы, как направленного на опухоль лиганда, включают меланому, колоректальную опухоль и опухоль поджелудочной железы, лимфомы (как НЭ и ИНЬ), опухоли головы и шеи, миелому, рак яичников, рак молочной железы и мозга (высокодифференцированный и аденомы гипофиза), саркомы (в зависимости от дифференцированности), гепатомы, рак яичка, щитовидной железы (в зависимости от дифференцированности), мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря и матки и тому подобное.
Еще одни соединения, направленные на опухоль, которые могут быть использованы в коктейлях по настоящему изобретению, включают 1-амино-1-циклобутан-карбоновую кислоту и Ь-метионин. Ь-метионин является незаменимой аминокислотой, которая необходима для синтеза белка. Известно, что злокачественные клетки имеют измененный метаболизм метионина и требуют внешнего источника метионина.
Дополнительные примеры биологически совместимых соединений, направленных на опухоль, которые специфически связываются с рецепторами опухоли и/или преимущественно захватываются опухолевыми клетками, включают гормоны млекопитающих, особенно половые гормоны, нейротрансмиттеры и соединения, экспрессируемые опухолевыми клетками для передачи информации друг другу, которые преимущественно захватываются опухолевыми клетками, такие как новые конструкты секретируемого белка, возникающие из-за хромосомных аберраций, таких как переносы или инверсии в пределах клона.
Гормоны, включая половые гормоны, гормоны роста клеток, цитокины, гормоны эндокринных желез, эритропоэтин и тому подобное, также хорошо служат в качестве частей, направляющих на опухоль. Как известно в данной области техники, ряд типов опухолей экспрессирует рецепторы гормонов, например, эстрогенов, прогестерона, андрогенов, таких как тестостерон и тому подобное. Такие гормоны предпочтительно захватываются опухолевыми клетками, например, с помощью специфических рецепторов.
Направляющие конструкты и дополнительные направляющие конструкты, используемые в практике способа по настоящему раскрытию, могут быть введены любым путем, известным специалистам в данной области техники, например, их можно вводить местно, внутрисуставно, интрацистернально, внутриглазным путем, интравентрикулярно, интратекально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, внутритрахеально, внутриполостно и тому подобное, а также с помощью любого сочетания любого из двух или более путей.
Наиболее подходящий для введения путь должен варьироваться в зависимости от патологического состояния, подлежащего лечению, или локализации предполагаемого заболевания или опухоли, подлежащих диагностике. Например, для лечения воспалительных состояний и различных опухолей местное
- 26 029738
введение, включая введение путем инъекции непосредственно в ту часть тела, которая должна облучаться возбуждающим светом (например, внутриполостно), обеспечивает то преимущество, что направляющий конструкт (например, флуоресцентно-меченные антитела) могут быть введены в высокой концентрации без риска осложнений, которые могут сопровождать их системное введение.
Соединения по настоящему изобретению, а также любые дополнительные направляющие конструкты, используемые в диагностических коктейлях, включающих соединения по настоящему изобретению, вводят для диагностики в "эффективном количестве". Эффективное количество представляет собой количество направляющего конструкта, необходимое для помощи в непосредственной визуализации любой ткани-мишени, расположенной в части тела, которая исследуется у индивидуума. "Индивидуум", в качестве термина, используемого в данном документе, рассматривается как включающий любое млекопитающее, такое как домашние животные, сельскохозяйственные животные или животные зоопарка, но предпочтительно представляет собой человека. Количества, эффективные для диагностики, будут, конечно, зависеть от размера и локализации части тела, подвергаемой исследованию, от сродства направляющего конструкта к ткани-мишени, типа ткани-мишени, а также от пути введения. Местное введение направляющего конструкта, как правило, будет требовать более низкой дозы, чем любой способ системного введения, хотя локальная концентрация направляющего конструкта в некоторых случаях может быть более высокой после местного введения, чем может быть достигнуто при безопасном системном введении.
Так как у отдельных индивидуумов могут быть представлены широкие варианты тяжести симптомов, и каждый направляющий конструкт имеет свои уникальные диагностические характеристики, включая, аффинность направляющего конструкта к мишени, скорость клиренса направляющего конструкта в результате процессов, происходящих в организме, свойства флуорофора, содержащегося в нем, и тому подобное, опытный практикующий специалист должен взвесить эти факторы и соответственно варьировать дозировку.
Соединения по настоящему изобретению, а также коктейли, включающие эти соединения, могут быть составлены в виде стерильной инъекционной суспензии в соответствии с известными способами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может также быть стерильным инъекционным раствором или суспензией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1-4-бутандиоле. Стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. С этой целью может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды, жирные кислоты (включая олеиновую кислоту), природные растительные масла, такие как кунжутное масло, кокосовое масло, арахисовое масло, хлопковое масло и т.д., или синтетические жирные носители, такие как этилолеат или тому подобное. Буферы, консерванты, антиоксиданты и тому подобное могут быть включены по мере необходимости, или, альтернативно, могут включаться в композицию.
Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что в раскрытии могут быть сделаны различные изменения, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения, и, следовательно, раскрытие охватывает варианты осуществления, в дополнение к тем, которые конкретно раскрыты в описании, но только как указано в прилагаемой формуле изобретения.
Последующие примеры представлены лишь с целью иллюстрации конкретных вариантов осуществления раскрытия и не предназначены для ограничения объема прилагаемой формулы изобретения. Как обсуждалось в настоящем документе, конкретные особенности раскрытых соединений и способов могут быть изменены различными путями, которые не являются необходимыми для применения или преимуществ, которые они обеспечивают. Например, соединения могут включать различные аминокислоты и производные аминокислот, а также направляющие лиганды в зависимости от конкретного применения, для которого будет использоваться соединение. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что такие модификации охватываются объемом прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Разработка направленных на опухоль красителей в ближней инфракрасной области для хирургии, руководствующейся флуоресценцией.
Полное хирургическое удаление злокачественного новообразования является единственным надежным методом вмешательства в раковое заболевание. К сожалению, количественная резекция опухоли часто ограничивается способностью хирурга локализовать все злокачественное новообразование и отличить его от здоровой ткани. Хирургическое вмешательство, руководствующееся флуоресценцией, возникло как инструмент, помогающий хирургам в идентификации и удалении злокачественных поражений. В то время как флуоресцентные красители без направленного действия, как было показано, пассивно накапливаются в некоторых опухолях, часто приводя в результате к плохим отношениям опухоли к фону, и границы между злокачественными и здоровыми тканями может быть трудно определить. Чтобы обойти эти проблемы, в данном изобретении предлагается разработка направляющих лигандов с высокой аффинностью к опухоли, которые связываются с рецепторами, которые гиперэкспрессируется на раковых клетках, и доставляют присоединенные молекулы избирательно в эти клетки.
- 27 029738
В настоящем примере используются два специфичных для опухоли направляющих лиганда (т.е. фолиевая кислота, которая направлена на рецептор фолата (РК), для доставки флуоресцентных красителей в ближней инфракрасной области (ΝΙΚ) специально к типам рака, экспрессирующим РК, тем самым придавая только злокачественным клеткам высокую флуоресценцию. Данный пример показывает, что все направленные на РК исследованные красители ΝΙΚ связываются с культивируемыми раковыми клетками в низком наномолярном диапазоне. Кроме того, при внутривенном введении мышамопухоленосителям с метастатическим заболеванием, эти же самые конъюгаты лиганд-краситель ΝΙΚ придают экспрессирующим рецепторы опухолевым тканям флуоресценцию, позволяя легко их удалить с минимальным загрязнением здоровыми тканями.
1А. Материалы и методы.
Результаты, представленные в настоящем примере, получены с использованием конкретных материалов и способов, описанных в настоящем документе. Следует понимать, что специалист в данной области техники может модифицировать эти методы, условия реакции и условия испытаний все еще получая результаты, которые демонстрируют эффективность красителей ΝΙΚ, направленных на РК, по настоящему изобретению.
a) Синтез и характеристика конъюгатов фолиевой кислоты-краситель ΝΙΚ. Все лиганды и линкеры синтезированы, как ранее сообщалось в литературе. После очистки, направляющие с помощью фолата лиганды конъюгировали с выбранными красителями ΝΙΚ, как показано на фиг. 1, 5 и 8. Конъюгаты красителей очищали с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ |^а1сг5. хТегга С18 10 мкм; 19x250 мм; λ=280 нм; градиент растворителя: от 0 до 30% или 80% В в течение 30 мин прохождения, λ=10 мМ буфер ΝΗ.-ОАс в воде (рН 7,0), В - ацетонитрил (АСИ)]. Очищенные соединения анализировали с помощью ЖХ-МС (ΕδΙ) масс-спектрометрии (^а1ет8, Х-ВтШде С18 5 мкм; 3,0x15 мм).
b) Культура клеточных линий, экспрессирующих рецептор фолата. Клетки Ь1210А получали от доктора Маиойат КаШат и клетки КВ получали от Американской коллекции типовых культур (АТСС; КоскуШе, МО). Клетки культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 с дефицитом фолата, дополненной 10% инактивированной нагреванием сывороткой плодов телят (ΗΙΡΒδ), 1% Ь-глутамином и 1% пенициллинстрептомицином Дпуйтодеп, СаткЬаф СА). Все клеточные линии культивировали в 5% двуокиси углерода в атмосфере 95% увлажненного воздуха при 37°С.
c) Анализ аффинности и специфичности связывания конъюгатов фолат-краситель ΝΙΒ по флуориметрии. КВ (200000 клеток/лунка в 500 мкл) высевали в 24-луночные планшеты и давали возможность сформировать монослои в течение более 48 ч. Израсходованную среду в каждой лунке заменяли свежей средой (0,5 мл), содержащей возрастающие концентрации конъюгата фолат-краситель ΝΙΒ в присутствии или в отсутствие 100-кратного избытка конкурирующего лиганда; т.е. фолиевой кислоты. После инкубации в течение 1 ч при 37°С клетки промывали свежей средой (3x0,5 мл), растворяли в 1% водном δΌδ (0,600 мл) и анализировали на флуоресценцию путем переноса в кварцевую кювету и анализа интенсивности флуоресцентного излучения при максимуме возбуждения и излучения каждого красителя, используя флуоресцентный спектрофотометр АдйеШ Тесйпо1од1е8 Сагу Есйрке. Константу диссоциации конъюгата (Κά) рассчитывали с помощью программного обеспечения ОтарЬРай Ргкт 4.03 путем построения графика, откладывая единицы излучения флуоресценции против концентрации добавленного направленного красителя в ближней инфракрасной области.
ά) Мышиные модели метастазов ίη У1уо. Все процедуры на животных были проведены с одобрения комитета по уходу и использованию животных РшДие. Для исследований, включающих опухоли, экспрессирующие РК, 5-6 недельных самок мышей ΌΒΑ/2 приобретали у Наг1ап ЬаЬотаФпек ДпФапароПю ΙΝ) и переводили на диету с дефицитом фолата в течение двух недель до и в процессе каждого исследования. Метастазы опухоли индуцировали путем введения 1 χ 106 клеток Ь1210А (экспрессирующих РК) в левый желудочек сердца с использованием иглы 30 калибра. Опухолям давали развиваться в течение 4 недель, после чего животным вводили внутривенно 10 нмоль желаемого красителя ΝΙΒ, направленного на РК, растворенного в 100 мкл физиологического раствора. Через 4 ч животных забивали путем СО2 асфиксии и визуализировали, как описано ниже.
е) Флуоресцентные изображения мышей с метастатическим заболеванием. Эксперименты по визуализации животных проводили с использованием системы визуализации Сайрет ΙνΙδ Ьит1па ΙΙ с программным обеспечением Ыушд Ппаде 4.0. Настройки для визуализации конъюгатов А1еха Р1иог 647 и 680 ИуЫдйк уровень лампы: высокий; возбуждение: 605; излучение: Су5.5; освещение отраженного света; сортировка по бинам: (М) 4; РΟV=7,5; £-стоп = 4; время обнаружения = 1 с. Настройки для визуализации конъюгатов ИуЫдй! 750 и ΙΒ800ί'.'\ν: уровень лампы: высокий; возбуждение: 745; излучение: ЮО; освещение отраженного света; сортировка по бинам: (М) 4, РΟV = 12,5; £-стоп = 4; время обнаружения = 1 с.
ί) Н&Е окрашивание нормальных и пораженных тканей. После визуализации органы выделяли и хранили в 5 мл формалина и посылали в РшДие Нк1о1оду & РНепоПтпд ЬаЬотаФту для окрашивания Н&Е. Вкратце, образцы ткани обрабатывали с помощью δΗίαΐΗΐ Ткще-Тек νΙΡ 6, срезы получали с помощью микротома Тйетто Ршекке МЕ и окрашивали их реагентом Н&Е с использованием автоматического при- 28 029738
бора для окрашивания ЗЬаибои Уагь§1аш 24-2. Окрашенные Н&Е срезы затем визуализировали с помощью исследовательского микроскопа О1утри8 ВН-2 с камерой О1утри8 ΌΡ70.
B. Результаты.
a) Синтез направленных на опухоль красителей ΝΙΚ. Для селективной направленности на опухоль изобретатели конъюгировали коммерчески доступные красители ΝΙΚ с фолатом. Большинство конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ было синтезировано с высоким выходом и затем очищено с помощью ВЭЖХ до гомогенности.
b) Связывающее сродство и специфичность направленных красителей ΝΙΚ. Так как структура, присоединенная к лиганду, часто может препятствовать связыванию лиганда, выгодно проверять аффинность связывания конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ с раковыми клетками, экспрессирующими РК. Аффинность связывания всех конъюгатов была определена как находящаяся в низком наномолярном диапазоне (фиг. 2) с некоторыми вариациями в зависимости от присоединенного красителя, предполагая, что присоединенная структура только слегка влияет на связывание лиганда. Специфичность конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ для их рецепторов также определяли ίη νίίτο путем добавления избытка фолиевой кислоты. Как видно на фиг. 2, связывание почти количественно ингибировалось при совместной инкубации со 100-кратным молярным избытком фолиевой кислоты.
c) Визуализация направленных на опухоль красителей ΝΙΚ ίη νίνο. Перед оценкой специфичности для опухоли направленных на опухоль красителей ίη νίνο, выгодно сравнить интенсивность флуоресценции выбранных красителей при воздействии возбуждающего света через ткань. Для этой цели 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора, содержащего 100 нМ каждого из красителей (А1еха Р1иог 647, ОуЫдЫ 680, ОуЫдЫ 750, 1К800СА). помещали в пробирку Эппендорфа, которую в свою очередь помещали под срез свежей мышцы свиньи толщиной 1 см, и полученные ткани визуализировали при тех же условиях с помощью как зеркальной системы визуализации Кобак, так и ΐνΐδ Ьитта 1тадег, всегда выбирали только оптимальные длины волн возбуждения и излучения для каждого красителя в каждом приборе. 1К800СА дал яркий флуоресцентный сигнал, у ОуЫдЫ 750 сигнал был промежуточной интенсивности, и А1еха Р1иог 647 и 680 ОуЫдЫ дали слабую флуоресценцию.
Для сравнения способности представленных выше конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ выявлять узлы метастатической опухоли ίη νίνΌ, была разработана мышиная модель метастатической опухоли, которая включала введение внутрь сердца 106 клеток Ь1210А (клеток, экспрессирующих РК) с последующим нормальным содержанием мышей в течение 4 недель для возможности роста возникающей опухоли. Мышей-опухоленосителей затем обрабатывали 10 нмоль выбранного конъюгата фолат-краситель ΝΙΚ с помощью инъекции в хвостовую вену, и мышей забивали через 4 ч для визуализации флуоресценции. Как видно на фиг. 3, локусы опухоли можно легко отличить по выявляемому сильному контрасту между флуоресцирующими раковыми узлами и прилегающими здоровыми тканями. В некоторых случаях флуоресцирующие опухоли можно даже видеть при визуализации интактных мышей (фиг. 3, верхние панели), однако, из-за различий в размере опухолей, локализации и глубины, невозможно однозначно установить, какой краситель ΝΙΚ дал наилучшее изображение у интактных животных.
Наконец, для того, чтобы имитировать настоящее хирургическое вмешательство, выполняли постадийно резекцию флуоресцирующей опухолевой ткани, причем наибольшую массу удаляли первой, и более мелкие злокачественные локусы извлекали после освобождения от более крупных флуоресцирующих масс (фиг. 4). Удобно, что удаление первичных масс часто выявляло вторичные метастазы, которые не были видны перед первоначальным этапом хирургической операции и скорее всего, были бы пропущены, если не задаваться целью создания флуоресценции, специфичной для опухоли. После этих множественных этапов резекции, когда все видимые участки флуоресценции были удалены, извлеченные ткани подвергали гистологическому анализу, и эти исследования показали, что все флуоресцентные узлы были действительно злокачественными. Важно, что случайный отбор образцов оставшихся тканей показал, что нефлуоресцирующие области не были злокачественными (фиг. 4б), предполагая очевидное количественное удаление раковых поражений с помощью направленных на опухоль флуоресцентных красителей.
C. Обсуждение.
Второй подход к хирургическому вмешательству, руководствующемуся флуоресценцией, включает конъюгацию красителя ΝΙΚ со специфичным для опухоли направляющим лигандом, который связывается с высокой аффинностью с раковыми клетками и количественно вымывается из большинства здоровых тканей. Преимущества этого подхода включают: ί) высокую скорость визуализации опухоли в связи с тем, что захват красителя опухолью и клиренс нормальными тканями может происходить в течение нескольких минут после внутривенной инъекции, ίί) стабильность контрастирования опухоли, возникающая из того, что конъюгаты лиганд-краситель обычно интернализуются раковыми клетками с помощью опосредованного рецепторами эндоцитоза, ίίί) специфичность флуоресценции, когда рецептор-мишень либо отсутствует, слабо экспрессируется, либо недоступен в нормальных тканях, и ίν) отсутствие "утечки" флуоресценции из злокачественных тканей в доброкачественные из-за высокой аффинности удержания конъюгата лиганд-краситель на его рецепторе, что создает весьма определенные границы, которые четко ограничивают рак. Недостаток стратегии вытекает из того факта, что направляемый лигандом краситель всегда флуоресцирует, даже во время экскреции, что препятствует визуализации опухолей почек
- 29 029738
и мочевого пузыря до тех пор, пока экскреция красителя не завершена.
Одним неожиданным результатом этих исследований была возможность легко обнаружить ίη νίνο злокачественные поражения меньшего размера. Таким образом, более подробный анализ нескольких участков с точечными метастазами показал, что кластеры раковых клеток размером до 50 мкм могут быть визуализированы с использованием оптики высокого разрешения. Так как кластеры даже из нескольких клеток могут в конечном итоге привести к рецидиву рака, способность обнаруживать и удалять даже самые маленькие метастатические поражения в конечном счете может привести к снижению смертности больных, предполагая, что могут быть разработаны соответствующее камеры.
В то время как большинство приложений хирургического вмешательства, руководствующегося флуоресценцией, вероятно, остается задачей для будущих открытий, некоторые варианты использования технологии уже могут быть предусмотрены. Во-первых, больше злокачественных поражений потенциально может быть идентифицировано и иссечено из-за лучшей визуализации опухолевых масс. Вовторых, в тех случаях, когда максимальное сохранение нормальных тканей существенно (т.е. в случаях рака мозга, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и тому подобного), тщательное выскабливание люминесцентных поражений до тех пор, пока не будет выявляться остаточной флуоресценции, может позволить более эффективно сохранить здоровую ткань. В-третьих, стадия заболевания больных раком до операции в конечном итоге может создать возможность с помощью лапароскопического исследования проксимальных лимфатических узлов на флуоресцирующие поражения устранить необходимость в хирургической операции, когда существенные метастазы отчетливо наблюдаются, и устранить потребность в последующем хирургическом удалении сторожевых лимфатических узлов, когда обнаруживается только единственная масса опухоли.
В заключение в настоящем примере демонстрируется, что направленные на опухоль красители ΝΙΚ имеют потенциал для изменения стандартных хирургических процедур путем улучшения визуализации злокачественных тканей, что приводит к более полному и точному удалению пораженной ткани и улучшению результатов исхода для больного.
Пример 2. Дизайн и синтез оптимального зонда конъюгата фолат-краситель в ближней инфракрасной области с высоким направляющим сродством и чувствительностью для хирургии рака, руководствующейся флуоресценцией.
Даже со сложными инструментами для идентификации опухоли многие злокачественные узлы все еще не поддаются выявлению, приводя к рецидиву заболевания и часто к смерти. Руководствуясь необходимостью совершенствования идентификации опухоли, были введены два новых подхода для визуализации злокачественного заболевания в процессе операции. В первом подходе флуоресцентный краситель с гасителем вводят системно животному-опухоленосителю, и высвобождение гасящей части под действием специфичного для опухоли фермента, изменения рН или изменения окислительновосстановительного потенциала используют для селективной активации флуоресценции в пределах массы злокачественной ткани. При втором подходе флуоресцентный краситель конъюгируют со специфичным для опухоли направляющим лигандом, который является причиной аккумуляции присоединенного красителя в раковых новообразованиях, которые гиперэкспрессируют рецептор этого лиганда. Примеры лигандов, направленных на опухоль, применяемых для этой последней цели, включают фолиевую кислоту, которая специфична для позитивных для фолатного рецептора (РК) раковых опухолей яичника, почки, легкого, эндометрия, молочной железы и ободочной кишки. Удачно, что флуоресцентный краситель, направляемый фолатом (фолат-флуоросцеин или ЕС17), недавно протестирован в процессе операции у людей, больных раком яичника. В этом исследовании в ~5Х больше злокачественных поражений было удалено с помощью направленного на опухоль флуоресцентного красителя, чем без него, и злокачественность всех удаленных флуоресцирующих поражений была подтверждена патологами.
К сожалению, основной недостаток указанного выше клинического исследования вытекает из того факта, что присоединенный краситель (флуоресцеин) излучает флуоресценцию в видимом диапазоне, т.е. там, где автофлуоресценция является сильной, и свет плохо проникает в ткани. Так как свет в ближней инфракрасной области (ΝΙΚ) индуцирует мало автофлуоресценции и проникает в ткань гораздо более эффективно, изобретатели предположили, что более полная резекция опухоли должна быть возможной, если использовать краситель ΝΙΚ для хирургической операции, руководствующейся флуоресценцией. Хотя существует ограниченное количество коммерчески доступных флуорофоров ΝΙΚ, большинство основано на химической структуре цианина с определенными модификациями, сделанными каждым производителем (фиг. 6). К счастью, каждая из серии флуорофоров поставляется в качестве реакционноспособных флуорофоров, которые могут быть с легкостью конъюгированы с представляющим интерес белком или лигандом для специфического направленного действия ίη νίνο с помощью химических способов конъюгации. Большинство коммерчески доступных экспериментальных флуорофоров ΝΙΚ доступны как сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗ8), которые могут быть использованы для конъюгации флуорофора с Ν-концевым амином. Для оценки и идентификации наилучшего зонда в виде конъюгата фолат-краситель ΝΙΚ для хирургии рака, руководствующейся визуализацией, изобретатели конъюгировали фотостабильный сложный эфир ΝΗ8 красителей ΝΙΚ (соединения а-с ниже) с Ν-концевыми аминогруппами функционализированных фолатов (Ροϊ-ΕΌΑ и Ροϊ-Ьук) с получением ожи- 30 029738
даемых зондов Ν!Κ (1а-с и 2а-с) наряду с основными устраняемыми побочными продуктами (1е-д и 2е-д). Для того чтобы получить повышенный выход более стабильного красителя Ν!Κ Ь8288 использовали сложный эфир ΝΗδ (ά) и выделяли красители ХК конъюгированные с фолатом 1ά и 2ά, с хорошими выходами. Характеризовали оптические свойства и фотостабильность синтезированных зондов фолаткраситель ΝΊΚ 1а-с1 и 2а-й.
Спектры возбуждения и излучения флуоресценции всех зондов фолат-краситель №К 1а-с1 и 2а-с1 (500 л; 5 М в ΡΒδ) в той же концентрации показали почти одинаковую интенсивность. Цитотоксичность и сродство к рецептору фолата зонда исследовали ΐη νΐίΓΟ в клеточных экспериментах и возможность направленности на опухоль исследовали ΐη νίνο у пяти групп голых мышей, несущих ксенотрансплантат опухоли ΚΒ РК+, тестировали также биораспределение с помощью системы визуализации флуоресценции в ближней инфракрасной области [мппта II. К сожалению, биораспределение, показанное для синтетически благоприятных высоких выходов зондов фолат-краситель ΝΊΚ, на фиг. 6 для соединения 1ά и на фиг. 7 для соединения 2ά имело в два раза меньшую яркость интенсивности флуоресценции опухоли по сравнению с другими зондами фолат-краситель ΝΊΚ, показанными на фиг. 6 для соединений 1а-с и на фиг. 7 для соединений 2а-с.
- 31 029738
С точки зрения структуры выгодного варианта была выгодна замена (8ΝΚ1) у центрального углерода винилогического циклогексена (С(§р2)) частью фенола в красителях а-с и частью фенила в красителе ΝΊΚ ά также у их соответствующих конечных зондов фолат-краситель Приведенные выше причины побудили изобретателей разработать новый модифицированный зонд фолат-краситель с фотостабильной, селективной, чувствительной и высокой интенсивностью флуоресценции при физиологическом рН.
Для решения этой проблемы стратегия в целом заключалась в выборе 80456 в качестве коммерчески доступного предшественника флуорофора №К, который должен содержать четыре 8О3Н группы для растворимости и ригидности кольца циклогексенила в середине флуорофора для фотостабильности и хлорид винилогического циклогексена (С(§р2)С1) для связывания фенольного кислорода, что должно быть выгодно для высокой чувствительности и яркой флуоресценции при визуализации опухоли ΐη νΐνο. Кроме того, исследовали структурные требования для лигандов рецептора фолата с карманом, связывающим фолат, для улучшения аффинности связывания и селективности лигандов в отношении рецептора. Кристаллическая структура рецептора фолата не установлена, и существует доказательство, что птероиновая кислота, фрагмент фолиевой кислоты с отсутствием дистального глутамилового остатка, является достаточно хорошей для связывания с рецептором фолата с высоким сродством. Чтобы определить, является ли карбоновая кислота в глутамиловом остатке выгодной для связывания с рецептором фолата, изобретатели синтезировали различные аминокислотные и неаминокислотные птероиловые конъюгаты и их зонды ΝΊΚ. Далее изобретатели сравнили все эти новые модифицированные зонды фолат-краситель ΝΊΚ для исследования ΐη νΐίτο сродства связывания с раковыми клетками, позитивными в отношении рецептора фолата, и ΐη νΐνο визуализации опухоли КВ, позитивной в отношении рецептора фолата. Интересно, что изобретатели не наблюдали множественных вариантов аффинности связывания, но было замечательное изменение в специфичности для опухоли и интенсивности флуоресценции. Исследование подтверждалось для всех конъюгатов фолат-краситель ΜΙΚ и предполагало, что карбоновая кислота в глутамильном остатке выгодна для специфической направленности на опухоль, захват и замещение фенольного кислорода на центральный углерод винилогического циклогексена (С(§р2)) в красителе ΝΓΚ должен быть выгоден для высокой интенсивности флуоресценции опухолевой ткани. Таким образом, необходимо срочно разработать простую и более продвинутую стратегию для получения оптимального
- 32 029738
нового модифицированного флуоресцентного зонда фолат-краситель ΝΙΚ для хирургии рака, руководствующейся визуализацией. Изобретатели разработали и синтезировали чувствительный, фотостабильный и селективный для опухоли новый модифицированный флуоресцентный зонд фолат-краситель ΝΙΚ (птероил-Туг-§0456, фиг. 6) с высокой интенсивностью флуоресценции для клинического применения.
В настоящем примере авторы изобретения разработали флуоресцентный зонд в ближней инфракрасной области, направленный на рецептор фолата (птероил-Туг-§0456) с усиленной интенсивностью флуоресценции и фотостабильностью.
Продемонстрирована высокая способность к направленности на опухоли, гиперэкспрессирующие рецептор фолата, с яркой интенсивностью флуоресценции. Этот новый конъюгат птероил Туг §0456 улучшил динамику зонда у мышей и повысил способность к направленности на опухоли, гиперэкспрессирующие РК, и чувствительность к ним. Результаты данного примера демонстрируют, что этот новый зонд ΝΙΚ обладает большим потенциалом для диагностики опухолей на ранних стадиях.
Пример 3. Сравнительный анализ ОТЬ-0001 (ΡΑ-ΕΌΑ-Ε8288), ОТЬ-0002 (ΡΑ-ΕΌΑ-ΙΚ800), ОТЬ-0003 (ΡΑ-ΕΙ)Α-Ζ\\'800) и ОТЬ-0004 (ΡΑ-ΕΌ А-Кодак2).
Материалы и методы: клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (Αΐΐαηία ВЫодюаР ΟΑ) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОЛсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали у Наг1ап (ΙΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1аб, αΐ) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригбие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5хЬха2 (Ь - самая длинная ось и α - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого конъюгата (ΡΑ-ΕΌΑ-Ε8288, ΡΑ-ΕΌΑ-ΙΚ800, ΡΑ-ΕΌΑ-Ζα800 и ΡΑ-ΕΌΑКодак2) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений Сайрег ΐνΐ§ Ьит1па II с программным обеспечением Ыушд Ийаде 4.0 (Ρе^к^ηΕ1те^ Шс, ΜΑ). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 830 нм; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОV = 12,5; £-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоли) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора IVI§, как описано выше. Настройки для визуализации: - уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 830 нм; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОV = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 7а, ΡΑ-ΕΌΑ-Ε8288, ΡΑ-Ε0Α-!Ρ800 и ΡΑ-ΕΌΑ-Ζα800 аккумулировались преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях. Однако ΡΑ-Ε^Α-Кодак2 не накапливался в опухолях. Кроме того, непосредственное сравнение показало, что интенсивность флуоресценции вводимого мышам ΡΑ-ΕΟΑ-!^!)!) в опухоли ярче (выше интенсивность флуоресценции), чем у мышей, получавших другие конъюгированные с фолатом красители в ближней ИК-области (фиг. 7Ь).
Заключение.
Яркость и специфичность конъюгатов, представленных от лучшего к худшему, распределяется следующим образом: ΡΑ-ΕΌΑ4Κ800, ΡΑ-ΕΌΑ-Ζα800, ΡΑ-ΕΌΑ-Ε8288, ΡΑ-Ε^Α-Кодак2. Конъюгаты, содержащие ГК800 и Ζα800, показали самую высокую флуоресценцию, накапливающуюся в опухоли, в то время как конъюгат, содержащий Кодак, показал очень низкую специфичность для опухоли. Низкая
- 33 029738
флуоресценция, наблюдаемая для конъюгата Кодак, может быть связана с тем, что краситель возбуждается при 800 нм. Система визуализации изображений ΙνΙδ не имеет фильтра для возбуждения при 800 нм, так что низкая флуоресценция в опухолях может быть связана с использованием плохой длины волны возбуждения.
Пример 4. Визуализация всего тела и биораспределение направленных на рецептор фолата красителей в ближней инфракрасной области.
Материалы и методы.
Клетки КВ (линию клеток носоглотки человека) получали от Американской коллекции типовых культур (КоскуШс. ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΡΡΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛсо, ΝΥ) 10% инактивированной нагреванием сыворотки плодов телят (АНаШа Вю1одюа1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОЛсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали у Наг1ап (ΙηЛапороНв, ΙΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1аД, ΥΙ) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных РигДие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде ΡΡΜΙ 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5хЬх^2 (Ь - самая длинная ось и Υ - ось, перпендикулярная Ь в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2-3 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого конъюгата в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений Сакрег ΙνΙδ Египта ΙΙ с программным обеспечением Ыуш§ Ийаде 4.0 (РегктЕ1тег Шс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: Ιί',Ό (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора ΙνΙδ, как описано выше. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: Ιί',Ό (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 1, ΡΑ-ΕΌΑ-Εδ288, ΡΑ-ΕΌΑ-ΙΡ800 и ΡΑ-ΕΌΑ-ΖΥ800 аккумулировались преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях. Кроме того, непосредственное сравнение показало, что интенсивность флуоресценции вводимого мышам ΡΑ-ΕΌΑ-ΙΡ800 в опухоли ярче (выше), чем у мышей, получавших другие конъюгированные с фолатом красители в ближней ИК-области (фиг. 2).
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на животных в тех же самых условиях путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора ΙνΙδ. Как видно на фиг. 2, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в ΡΡ-положительных опухолях и почках. Захват почками ожидался, поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Кроме того, возможно, что зонды экскретируются через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (у большинства фолатных конъюгатов период полураспада <30 мин).
Заключение.
Яркость и специфичность конъюгатов, представленных от лучшего к худшему, распределяется следующим образом: ΡΑ-ΕΌΑ-ΙΡ800, ΡΑ-ΕΌΑ-ΖΥ800, ΡΑ-ΕΌΑ-Εδ288, ЕЛ-ЕОЛ-Кодак2. Конъюгаты, содержащие ΙΡ800 и ΖΥ800, показали самую высокую флуоресценцию, накапливающуюся в опухоли, в то время как конъюгат, содержащий Кодак, показал очень низкую специфичность для опухоли и низкую флуоресценцию по сравнению с другими конъюгатами.
- 34 029738
A. Материалы и методы.
Результаты, представленные в настоящем примере, получены с использованием конкретных материалов и способов, описанных в настоящем документе. Следует понимать, что специалист в данной области техники сможет модифицировать эти методы, условия реакции и условия испытаний и все еще получит результаты, которые демонстрируют эффективность красителей ΝΙΚ, направленных на РК, по настоящему изобретению.
a) Синтез и характеристика конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ. Синтез и характеристика конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ выполнены, по существу, как описано в примере 1.
b) Относительная аффинность связывания конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ (4) с РК. Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют РК-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты Ра1соп и давали сформировать монослои в течение периода в 24 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолата в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ - 1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали РВ§ (2x0,5 мл) и 1 М трихлоруксусной кислотой (1x0,5 мл) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 1% додецилсульфата натрия в РВ§ (0,5 мл) клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль Есо1ите (3,0 мл), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе. Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика связанной с клетками радиоактивности относительно концентрации исследуемого вещества с использованием программы СтарйРай Рт18т 4.
c) Мышиные модели подкожных ксенотрансплантатов опухоли ίη νίνο. Пятинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в их плечи клетки КВ (1,0х106/мышь в среде КРМ1). Рост опухолей измеряли в двух перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5хЬх^2 (Ь - самая длинная ось и - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животные получали конъюгат красителя ΝΙΚ, направленный на рецептор фолата (10 нмоль) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии и визуализировали, как описано ниже.
й) Флуоресцентная визуализация мышей с РК+ опухолью КВ. Эксперименты по визуализации животных осуществляли с использованием системы визуализации изображений Сайрет ΙνΊ§ Ьит1па II с программным обеспечением ЬМп§ 1таде 4.0. Настройки для визуализации конъюгатов А1еха Р1иог 647 и 680 БуЬ1§Ы: уровень лампы: высокий; возбуждение: 605; излучение: Су5.5; освещение отраженного света; сортировка по бинам: (М) 4; ΡΟν = 7,5; £-стоп = 4; время обнаружения = 1 с. Настройки для визуализации конъюгатов БуиДи 750 и 1К800С\У: уровень лампы: высокий; возбуждение: 745; излучение: 1СС; освещение отраженного света; сортировка по бинам: (М) 4; ΡΟν = 12,5; £-стоп = 4; время обнаружения = 1 с.
B. Результаты.
a) Синтез направленных на опухоль красителей ΝΙΚ. Для селективной направленности на опухоль, изобретатели конъюгировали имеющиеся в продаже красители ΝΙΚ либо с фолатом, либо с птероатом через образование амидной связи с использованием красителя, активированного ΝΗ§, или реакции Вильямсона синтеза простого эфира, использующей хлорное производное красителя ΝΙΚ. Рΐе-аминокислота-NIК, особенно тирозин, синтезированы с высоким выходом (>98%) без какой-либо ВЭЖХ или специального метода очистки (осаждением) с очень высокой чистоты (>98%). Аминокислоты, на которые ссылаются в настоящем документе, представляют собой тирозин и его аналоги, цистин, серин, лизин и т.д. Красители ΝΙΚ, которые использовали изобретатели, представляют собой §0456, Кодак, §0121 и §2076 (не ограничиваясь ими). Синтез связанных эфирными связями конъюгатов фолатыкраситель, таких как фолат-ГК800С^ (3) и фолат-2^800 (5), однако, приводил к получению заметных побочных продуктов (фиг. 10Ь), которые требуют специальных способов очистки, таких как ВЭЖХ, тем самым приводя к более высокой цене получения и повышению периода времени от доклинических до клинических испытаний. Это не только будет влиять на успехи хирургической онкологии, но и на больных, которые ждут новых терапевтических агентов. Кроме того, высокая стоимость получения может косвенно влиять на больных и поставщиков их страховых услуг вследствие повышения стоимости препарата. Важно отметить, что реакция Р1е-Тут-§0456 не дала никаких нежелательных побочных продуктов, и реакция завершалась в течение 15 мин с высоким выходом и высокой степенью чистоты (фиг. 10А).
b) Связывающее сродство и специфичность красителей ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата. Сродство и специфичность конъюгатов фолат- и птероат-краситель ΝΙΚ сначала оценивали с использованием раковых клеток (КВ), которые гиперэкспрессируют рецептор фолата. Исследования конкуренции с меченной тритием фолиевой кислотой (радиоактивно меченной фолиевой кислотой) показали, что конъюгаты фолат- или птероат-краситель ΝΙΚ не только связываются с рецептором фолата с высоким сродством (в низких наномолярных величинах), но также с высокой специфичностью (фиг. 6). Исследо- 35 029738
вания конкуренции с меченной тритием фолиевой кислотой (радиоактивно меченной фолиевой кислотой) показали, что Р1е-Туг-§0456 связывает рецептор фолата с высоким сродством и специфичностью, предполагая, что конъюгация крупной части §0456 через кислород фенольной части не нарушает связывание Р1е-Туг с рецептором фолата.
с) Визуализация направленных на опухоль красителей ΝΙΚ ίη νίνο. Для того чтобы сравнить способность описанных выше конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ обнаруживать опухоли, разработали модель ксенотрансплантата, которая включала подкожную имплантацию клеток КВ (клеток, экспрессирующих РК) с последующим нормальным содержанием мышей в течение 4 недель для возможности роста возникающих опухолей. Мышам-опухоленосителям затем давали 10 нмоль выбранного конъюгата фолаткраситель ΝΙΚ путем инъекции в хвостовую вену и мышей забивали через 2 ч для флуоресцентной визуализации. Как видно на фиг. 7А, локусы опухолей могут быть легко определены по сильному контрасту между флуоресцирующими раковыми узлами и прилегающими здоровыми тканями. Наиболее важно, что интактные флуоресцирующие опухоли видны даже при визуализации интактных мышей без их вскрытия или извлечения опухоли (фиг. 7А). Прямое сравнительное исследование флуоресцентной визуализации всего тела с помощью 2-го поколения агентов ΝΙΚ, направленных на рецептор фолата, показало, что фолат-1К800С№ (3) был более конкурентоспособен (в отношении яркости флуоресценции), чем все другие красители (фиг. 7А, 2-й ряд). Однако, к сожалению, фолат-1К800С№ (3) не был стабильным в процессе синтеза, приводя к образованию более 60% нежелательных побочных продуктов. Как упоминалось выше, это является причиной поиска специальных методов очистки, представляющих путь к более высокой стоимости получения, более высокому периоду ожидания перевода в клинику и отсутствию доступа врачей и больных к препарату.
Для установления специфичности ίη νίνο Р1е-Тут-§0456 вводили мышам, несущим на плечах ксенотрансплантаты опухолей, позитивных в отношении рецептора фолата. Исследования визуализации всего тела ίη νίνο показали, что Р1е-Туг-§0456 в основном накапливается в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, и никакой флуоресценции не наблюдалось в других тканях (фиг. 11а). Исследования биораспределения в тканях ех νίνο показали, что Р1е-Туг-§0456 аккумулировался преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других органах за исключением почек (фиг. 11В и 12В). Значительное поглощение в почках ожидалось, так как на апикальной мембране проксимального канальца почки, как известно, экспрессируются высокие уровни РК. Прямое сравнительное исследование Р1е-Туг-§0456 с фолат-1К800С№, фолат-Ь§288 и фолат^№800 показало, что Р1е-Туг-§0456 является конкурентоспособным с точки зрения яркости флуоресценции всех конъюгатов фолат-краситель ΝΙΚ (фиг. 12 А и В). Кроме того, визуализация флуоресценции срезов (иссеченных) опухолей предполагает, что как Р1е-Туг-§0456. так и все конъюгаты фолат-краситель ΝΙΚ накапливались однородно во всех опухолевых клетках даже, в тех, которые заключены внутри опухоли (фиг. 12С).
Пример 5. Фармакологические исследования ίη νίίτο фолат- и птероил-красителей ΝΙΚ.
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (ΚοοΚνίΙΕ, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΒΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ΟΛοο, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (Αί1аШа Βίοίοβίοαΐ, ΟΑ) и 1% пенициллин-стрептомицин (Οίόοο, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют ΡΚ-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты Ραΐαοη (ΒΌ ВО^оемсе^, СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ - 1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты (Зщта-АИпск МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали РВ§ (3x0,5 мл, Οί^ο, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕсцШе (3,0 мл, МР ВютеФсаК ОН), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскатф. Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1ο§ концентрации исследуемого вещества с использованием программы ОтарЬРаб Ргкт 4.
Результаты.
Константы диссоциации (Кс), полученные из исследований, рассчитаны как составляющие 30,7, 19,3, 23,3, 30,6, 50,1, 22,8, 30,5, 39,7, 49,6, 30,5 и 8 нМ для соединений 0ТЬ-001-0ТЬ-0010 и фолиевой кислоты соответственно. Относительная аффинность связывания рассчитана как составляющая 0,270, 0,430, 0,356, 0,271, 0,166, 0,364, 0,272, 0,209, 0,167, 0,272 и 1 для 0ТЬ-0001-0ТЬ-0010 и фолиевой кислоты соответственно. Все тестируемые соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кисло- 36 029738
той. Относительная аффинность связывания определяется как молярное отношение соединения, требуемое для вытеснения 50% [3Н]-фолиевой кислоты, связанной с рецептором фолата на клетках; относительное сродство фолиевой кислоты=1; относительная сродство <1 указывает на более слабое сродство к рецептору фолата; относительное сродство >1 указывает на более сильное связывание с рецептором фолата.
Заключение.
Все соединения имеют сродство к рецептору фолата, и оно достаточно хорошо сравнимо с аффинностью связывания фолиевой кислоты. Все соединения хорошо конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой, что указывает на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт связывания на раковых клетках, и они высокоспецифичны для рецептора фолата.
Пример 6. Фармакологические исследования ίη νίΐτο ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039 (Ό-изомера ОТЬ-0038).
Разработано два конъюгата лиганд-краситель ΝΙΚ и они обозначены как ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039. Соединение ОТЬ-0038 относится к РТЕ-Ь-Туг-80456, где птероиловый лиганд конъюгируют с Ь-тирозином, который присоединен к 80456. ОТЬ-0039 является Ό- изомером ОТЬ-0038. Связывающее сродство и специфичность связывания обоих соединений в отношении рецепторов фолата исследовали в сравнении с фолиевой кислотой как конъюгированным лигандом рецепторов фолата.
A. Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛто, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (Αΐ1айа Вю^щсак ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (Οί^ο, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют ΡΚ-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты ΡηΚοη (ΒΏ В^аемсе^, СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ - 1 мкМ) ОТЬ-0039 (Ώ-изомера) и ОТЬ-0038 (Ь-изомера) или фолиевой кислоты (81дта-А1ДгюЬ, МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали РВ8 (3x0,5 мл, ОЛто, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕтоШе (3,0 мл, МР ВютеДюак, ОН), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскагф. Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1ο§ концентрации исследуемого вещества с использованием программы ОгарЬРаД Ргып 4.
B. Результаты.
Рассчитывали константы диссоциации (Кс), полученные из исследований, составляющие 81,8, 10,4 и 7,4 нМ для ОТЬ-0039, ОТЬ-0038 или фолиевой кислоты соответственно.
Рассчитывали относительную аффинность связывания, составляющую 0,09, 0,71 и 1 для ОТЬ-0039, ОТЬ-0038 и фолиевой кислоты соответственно. Все три тестируемых соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой.
Относительная аффинность связывания определяется как молярное отношение соединения, требуемое для вытеснения 50% [3Н]-фолиевой кислоты, связанной с рецептором фолата на клетках; относительное сродство фолиевой кислоты=1; относительная сродство <1 указывает на более слабое сродство к рецептору фолата; относительное сродство >1 указывает на более сильное связывание с рецептором фолата.
C. Заключение.
ОТЬ-0038 имеет сродство к рецептору фолата, и оно хорошо сравнимо с аффинностью связывания фолиевой кислоты (10,4 нМ относительно 7,4 нМ). С другой стороны, ОТЬ-0039 имеет более низкое сродство к рецептору фолата по сравнению с фолиевой кислотой и ОТЬ-0038. ОТЬ-0038 хорошо конкурировал с [3Н]-фолиевой кислотой, что указывает на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт связывания ОТЬ-0038 на раковых клетках, и он высокоспецифичен для рецептора фолата.
Пример 7. Визуализация всего тела и биораспределение ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039 (Ό-изомера ОТЬ0038) у мышей, несущих ксенотрансплантаты опухолей, позитивных в отношении рецептора фолата.
Захват ОТЬ-0038 (РТЕ-Ь-Туг-80456) и ОТЬ-0039 (РТЕ-О-Туг-80456) опухолями, позитивными в отношении рецептора фолата, исследовали для определения того, насколько хорошо оба соединения захватываются рецепторами-мишенями на опухолях. Исследовали также тканевое биораспределение соединений. Оба свойства изучали у мышей через два с половиной часа после внутривенного введения соединений.
- 37 029738
A. Материалы и методы.
Культивирование клеток и подготовка животных.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап1а ВЫоДсак ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (О1Ьсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (пи/пи) (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Иаг1ап ЪаЬога1опе5 (ГСЛапороГС, ΙΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (ТеЫаф VI) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ритйие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде КРМ1 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5χΕχν2 (Ь - самая длинная ось и V - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (5 мышей/группа) внутривенно вводили 10 нмоль ОТЬ-0038 или ОТЬ-0039 в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений Сайрет ΐνΐδ Ьитта II с программным обеспечением Ьтушд 1таде 4.0 (РеткзпЕ1тег 1пс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ГСО (индоцианин зеленый); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора IVΊδ, как описано ранее. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ГСО; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
B. Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 14, ОТЬ-0038 аккумулировался преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях.
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на тех же животных, что и подвергавшиеся визуализации всего тела, путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора ГУТС. Как видно на фиг. 15, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в РК-положительных опухолях при отсутствии аккумуляции в других тканях за исключением почек. Захват ОТЬ-0038 почками ожидался, поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Кроме того, возможно, что зонды экскретируются через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (у большинства фолатных конъюгатов период полураспада <30 мин).
C. Заключение.
ОТЬ-0038 главным образом накапливается в ксенотрансплантатах опухолей, позитивных в отношении рецептора фолата, и в почках. Все остальные нормальные ткани характеризовались минимальным уровнем или отсутствием аккумуляции, что приводит в результате к отличному отношению флуоресценции опухоли к нормальной ткани.
Пример 8. Сравнительный анализ ОТЬ-0038 (Ь-изомера) и агентов, происходящих от фолата, в ближней ИК-области.
Визуализацию всего тела и тканевое биораспределение ОТЬ-0038 сравнивали у фолат-Ь§288, фолат-ГК800 и фолат-ΖV800. Эти соединения конъюгировали с фолатом и коммерчески доступными красителями в ближней инфракрасной области Ь§288, ^800 и Ζν800.
- 38 029738
A. Материалы и методы.
Клеточная культура и подготовка мышей.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШс, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап1а Вю1од1са1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ЬаЪога1опс5 (1пШапоро118, ΙΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1ай, ΑΙ) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Рнгйне. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде ΚΡΜΙ 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5хЬхА2 (Ь - самая длинная ось и А - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого соединения (ОТЬ-0038, фолат-Ь8288, фолат-1К800, фолат-2А800) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений СаНрег !У!8 Ьит1па II с программным обеспечением ЬМпд 1таде 4.0 (РегкшИтег 1пс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 1СО (индоцианин зеленый); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора 1У18, как описано ранее. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 1СО; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; £-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
B. Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 14, ОТЬ-0038 (Ь-изомер), фолат-Ь8288, фолат-1К800, фолат-2А800 аккумулировались преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях. Кроме того, непосредственное сравнение показало, что интенсивность флуоресценции в опухоли ОТЬ-0038, вводимого мышам, была ярче (выше), чем у мышей, получавших другие конъюгированные с фолатом красители в ближней ИК-области (фиг. 15).
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на тех же животных, что и подвергавшиеся визуализации всего тела, путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора 1У18. Как видно на фиг. 16, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в РК-положительных опухолях и в почках. Захват почками ожидался, поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Кроме того, возможно, что зонды экскретируются через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (у большинства фолатных конъюгатов период полураспада составляет <30 мин).
C. Заключение.
ОТЬ-0038 характеризуется благоприятными свойствами относительно фолат-Ь8288, фолат-1К800 и фолат-2А800 в отношении интенсивности флуоресценции, аккумулируемой в опухоли. ОТЬ-0038 может быть более ярким, чем другие коммерчески доступные красители в ближней ИК-области, такие как Ь8288, ΙΚ800 и ΖΑ800.
Пример 9. Исследования с возрастанием доз ОТЬ-0038 у мышей, несущих ксенотрансплантаты опухолей, позитивных в отношении рецептора фолата.
Эксперименты с диапазоном доз выполняли для определения самой низкой дозы ОТЬ-0038, которая может быть введена для получения наилучшего отношения опухоли к фону. Кроме того, эксперименты выполняли для определения самой высокой дозы ОТЬ-0038, которая может быть введена для получения
- 39 029738
наилучшего отношения опухоли (мишени) к ткани (немишени).
A. Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КРМ1 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап1а ВЫодюак ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (О1Ьсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (пи/пи) (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап И-аЬогаЮпе® ДпФапороН®, ΙΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1ай, XVI) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригйие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде КРМ1 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5χΕχν2 (Ь - самая длинная ось и V - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (3 мыши/группа) внутривенно вводили повышающиеся концентрации ОТЬ-0038 (0,3, 1, 3, 10, 30, 60, 90 нмоль) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Исследования тканевого биораспределения осуществляли с использованием системы визуализации изображений СаЬрег ΐνΐ8 Битша II с программным обеспечением Ыуш§ 1таде 4.0 (Регк1пЕ1тег 1пс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 1СО (индоцианин зеленый); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡОV = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Визуализацию всего тела животных (интактной опухоли) проводили через 2,5 ч после введения 1 нмоль ОТЬ-0038 с помощью системы визуализации изображений СаНрег ΐνΐ8 Битша II с программным обеспечением Ыуш§ Ийаде 4.0 (Регк1пЕ1тег Икх МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: Κ.Ό; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡОV = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
B. Результаты.
Как показано в табл. 1 и на фиг. 14, все дозы за исключением дозы 0,3 нмоль захватывались опухолями, позитивными в отношении рецептора фолата, в более высокой степени. С другой стороны, более высокий захват почками наблюдался также в диапазоне доз 0,3-10 нмоль, и более низкий захват почками (по отношению к захвату в опухоли) наблюдался в диапазоне доз 30-90 нмоль. Кроме того, более высокое неспецифическое поглощение наблюдалось при дозах 60 и 90 нмоль.
C. Заключение.
Наблюдаемый более низкий захват в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, (слабая интенсивность флуоресценции) при дозе 0,3 нмоль может быть обусловлен неполным насыщением рецепторов фолата на опухолевых клетках. С другой стороны, наблюдаемая более высокая интенсивность флуоресценции в почках может быть обусловлена клиренсом зонда через почки. Кроме того, апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Диапазон доз между 1,0-30,0 нмоль выявил захват опухолями и прекрасное соотношение сигнала в опухоли к сигналу в нормальной ткани (отношение сигнал-фон). Более высокий захват почками может быть связан с клиренсом зонда через почки (за исключением дозы 30 нмоль) и экспрессией рецептора фолата в почках. Уровень дозы 60,0 нмоль и выше демонстрирует более высокий неспецифический захват. Однако эти дозы по-прежнему характеризуются высоким захватом опухолями и более низким захватом почками (включая дозу 30 нмоль). Меньший захват почками может быть связан с альтернативным клиренсом зонда через печень и кишечник. Следовательно, ОТЬ-0038 может образовывать агрегаты при этой более высокой концентрации. Можно сделать вывод, что 10,0 нмоль является самой низкой дозой для введения с целью получения хорошего отношения опухоли к фону при сохранении неинвазивного аспекта для визуализации опухоли (фиг. 22), и 30 нмоль рассматривается как самая высокая доза для введения с целью получения наилучшего отношения опухоли к фону.
Пример 10. Визуализация всего тела и биораспределение ОТЬ-0038 у мышей, несущих ксенотрансплантаты опухолей, негативных в отношении рецептора фолата.
Визуализацию всего тела и тканевое биораспределение осуществляли для определения ш У1уо специфичности ОТЬ-0038 для рецепторов фолата. В экспериментах использовали мышей, несущих опухоль,
- 40 029738
которая негативна в отношении рецепторов фолата, для характеристики специфичности соединения ОТЬ-038 в отношении рецепторов фолата.
A. Материалы и методы.
Культура клеток и подготовка мышей.
Клетки А549 (клеточную линию альвеолярной базальной эпителиальной карциномы) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚΡΜΐ 1640, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (АНаШа ВЫощсак ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (пи/пи) (6-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ЬаЪогакопез ДпФапороНз, ΙΝ) и поддерживали на нормальной диете (Тек1аб, XVI). Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ритбие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки А549 (1,0х106/мышь в среде ΚΡΜΐ 1640). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5χΕχν2 (Ь - самая длинная ось и V - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (6 мышей/группа) внутривенно вводили 10 нмоль ОТЬ-0038 в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2,5 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Затем осуществляли эксперименты по тканевому биораспределению (интактной опухоли) с использованием системы визуализации изображений Сакрет ΐνΐδ Ьитта II с программным обеспечением ЬМпд 1таде 4.0 (Ретк1пЕ1тет 1пс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 1СО (индоцианин зеленый); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоли) анализировали на активность флуоресценции с помощью системы визуализации изображений ΐνΐδ, как описано выше. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: 1СО; освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); ΡΟν = 12,5; £-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
B. Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 14, ОТЬ-0038 не накапливался опухолях, негативных в отношении рецептора фолата, и не наблюдалось никакой существенной флуоресцентной активности в других тканях, кроме почек.
Захват инвазивной опухолью и почками.
Анализ аккумуляции в опухолях и почках проводили на тех же животных, которые были подвергнуты визуализации всего тела, путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации с использованием визуализатора ΐνΐδ. Как и ожидали изобретатели, никакой флуоресценции не наблюдалось в опухолях, негативных в отношении рецептора фолата, наблюдался высокий захват почками. Так как на апикальной мембране проксимального канальца почки, как известно, экспрессируются высокие уровни РК, захват почками ожидался. Кроме того, возможно, что зонды выводится через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (большинство фолатных конъюгатов имеют полураспад <30 мин).
C. Заключение.
ОТЬ-0038 является высокоспецифичным для рецептора фолата.
Пример 11. Оценка токсичности ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039 (Ό-изомера ОТЬ-0038) у здоровых голых мышей.
Токсичность ш У1уо ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039 характеризовали у здоровых мышей. Мышам вводили 1 нмоль или 1000х клинической дозы каждого соединения для изучения токсичности соединений.
А. Материалы и методы.
Самок бестимусных голых мышей (пи/пи) (6-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ЬаЪотаШпез ДпЛапороНз, ΐΝ) и поддерживали на нормальной диете (Тек1аб, νΐ). Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандарт- 41 029738
ном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригбие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Семинедельным здоровым самкам голых мышей (5 мышей/группа) вводили 1 мкмоль свежеприготовленного ОТЬ-0038 или ОТЬ-0039, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, забуренного фосфатом, путем инъекции в хвостовую вену на нулевой день. Массу тела и клинические показатели прослеживали перед введением доз и ежедневно после начала введения от нулевого дня до 7 дня. Любые животные с потерей массы тела на 20% или более в течение двух последовательных дней должны были подвергнуться эвтаназии, но этого не потребовалось. Животных забивали СО2 асфиксией на 7-й день, и выбранные ткани (мозг, сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу) собирали во флаконы, содержащие 4% формалин. Делали срезы фиксированных формалином тканей толщиной 10 мкм и монтировали на стекла 8ирегРго81 Р1и8™ (ЫхНег §аепбйс, Рб1аЬиг§ РА). После окрашивания срезов Н&Е, проводили иммуногистохимический анализ (1НС) тканей для определения токсичности ОТЬ-0038 и ОТЬ-0039.
B. Результаты.
Сразу после инъекции ОТЬ-0038 или ОТЬ-0039, кожа животных стала зеленой. Тем не менее, зеленый цвет исчез в течение 24 ч. Животные были активными после введения исследуемых соединений и вели себя нормально, как правило, на протяжении всего исследования. Как видно на фиг. 14, масса тела в течение исследования оставалась стабильной. По данным 1НС (фиг. 15) не было никаких повреждений, идентифицированных в каких-либо тканях.
C. Заключение.
1 мкмоль (1000х клинических доз) ОТЬ-0038 или ОТЬ-0039 не является токсичным для животных, предполагая, что ОТЬ-0038 (1 нмоль) и ОТЬ-0039 (1 нмоль) не должны быть токсичными для человека в клинике.
Пример 12.
Фармакологические исследования ίη νίίτο аналогов Р1е-тирозин-80456 (модифицированных аналогов ОТЬ-0038).
Тестируемые соединения: ОТЬ-0040 (Р1е-Туг-13С-80456), ОТЬ-0042 (Р1е-Туг-2Н (дейтерированный)80456), ОТЬ-0043 ^-1^--^^-804561, ОТЬ-0044 [Р1е-^Ме)-Туг-80456], ОТЬ-0045 |Р1е-\Н\Н-Т\г(ОАс)-80456], ОТЬ-0046 (Р1е-гомо-Туг-80456), ОТЬ-0047 (Р1е-в-гомо-Туг-80456), ОТЬ-0049
(Р1е-тирамин-80456).
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КцскуШе, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КРМ1 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛто, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (Абайа Βίο1ο§Κ;·ι1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШто, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют ΡΚ-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты ΡαΚοη (ВИ В^ο8с^еηсе8, СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ-1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты (Ыдта-АИпсН, МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С клетки промывали РВ8 (3x0,5 мл, ОШто, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕтоШе (3,0 мл, МР ВютебйаЬ, ОН), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскагб). Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1ο§ концентрации исследуемого вещества с использованием программы ОгарНРаб Рпхт 4.
Результаты.
Константы диссоциации (Кс), получаемые из исследований, рассчитаны как составляющие 27,6 нМ, 61,7, 14,8, 13,8, 12,8, 30,2 и 8 нМ для соединений ОТЬ-0040, ОТЬ-0042-ОТЬ-0047, ОТЬ-0049 и фолиевой кислоты соответственно. Рассчитывали относительную аффинность связывания, составляющую 0,290 0,130, 0,177, 0,580, 0,625, 0,265 и 1 для ОТЬ-0040, ОТЬ-0042-ОТЬ-0047, ОТЬ-0049 и фолиевой кислоты соответственно. Все тестируемые соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой.
Заключение.
Все соединения имеют сродство к рецептору фолата за исключением ОТЬ-0044 и ОТЬ-0045, и оно достаточно хорошо сравнимо с аффинностью связывания фолиевой кислоты. Все соединения хорошо конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой, указывая на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт
- 42 029738
связывания на раковых клетках, и они высоко специфичны для рецептора фолата.
Пример 13. Визуализация всего тела и биораспределение аналогов Рке-тирозин-80456.
Тестируемые соединения: ОТЬ-0043 [Рке-Туг-(ОВп)-80456], ОТЬ-0044 [Рке-Ы(Ме)-Туг-80456], ОТЬ-0045 [Рке^ИМН-Туг-(ОАс)-80456], ОТЬ-0046 (Рке-гомо-Туг-80456), ОТЬ-0047 (Рке-З-гомо-Туг80456), ОТЬ-0049 (Рке-тирамин-80456).
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КРМI 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (ЛЙапка В1о1од1са1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (О1Ьсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение, по меньшей мере, шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ЬаЬогакопе5 (ИгШапороШ, ΓΝ) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1ай, XVI) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригйие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей ии/ии инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде КРМI 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5χΕχν2 (Ь - самая длинная ось и V - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2-3 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого соединения в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений СаПрег IVI8 Ьитта II с программным обеспечением Ыушд Ийаде 4.0 (РегШпИтег Шс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ЮО (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; £-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу, опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора IVI8, как описано ранее. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ЮО (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
В. Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 28А, ОТЬ-0044, ОТЬ-0046 и ОТЬ-0047 аккумулировались преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях.
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на животных в тех же условиях путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора IУI8. Как видно на фиг. 28В, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в РК-положительных опухолях и в почках. Захват почками ожидался, поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Кроме того, возможно, что зонды экскретируются через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (у большинства фолатных конъюгатов период полураспада составляет <30 мин).
Заключение.
В то время как биораспределение Ш У1уо продемонстрировали все соединения, аккумулируемые в опухолях и почках, биораспределение по всему телу показало, что ОТЬ-0044, ОТЬ-0046 и ОТЬ-0047 накапливаются, главным образом, в опухолях, указывая на необходимость альфа-карбоновой кислоты для специфичности и аффинности.
Пример 14. Фармакологические исследования Ш уйго ОТЬ-0050 (птероил-Туг-80122), ОТЬ-0051 (пгероил-Ту^-IК^28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак).
- 43 029738
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе. МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚРМI 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (Αί1аШа Вю1ощса1 ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют ΡΚ-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты Ра1соп (ВО Вюкаепсек, СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ-1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты (81дта-А1бгюЬ, МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали РВ8 (3x0,5 мл, ОШсо, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕсоШе (3,0 мл, МР ВютебюаЬ, ОН) и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскагб). Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1од концентрации исследуемого вещества с использованием программы ОгарЬРаб Рпып 4.
Результаты.
Константы диссоциации (Кс), полученные из исследований, рассчитывали как составляющие 29,3, 13,8, 15,3 и 7,4 нМ для соединений 0ТЬ-0050-0ТЬ-0052 и фолиевой кислоты соответственно. Относительную аффинность связывания рассчитывали как составляющую 0,25, 0,54, 0,48 и 1 для ОТЬ-0050ОТЬ-0052 и фолиевой кислоты соответственно. Все тестируемые соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой.
Заключение.
ОТЬ-0050, ОТЬ-0051 и ОТЬ-0052, каждое имеет сродство к рецептору фолата, и у соединений оно достаточно хорошо сравнимо с аффинностью связывания фолиевой кислоты. Все соединения хорошо конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой, что указывает на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт связывания на раковых клетках, и они высокоспецифичны для рецептора фолата.
Пример 15. Фармакологические исследования ίη νίίΐΌ конъюгатов птероил-неаминокислотное соединение-краситель №К.
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (Κ^ΡνίΙ^, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды ΚРМI 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (АНаШа Вю1одюа1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки КВ, которые гиперэкспрессируют ΡΚ-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты Ρа1сοη (ВО Вю^аенсет СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ-1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты (81дта-А1бпсЬ, МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали РВ8 (3x0,5 мл, ОШсо, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕсоШе (3,0 мл, МР ВютебюаЬ, ОН), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскагб). Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1од концентрации исследуемого вещества с использованием программы ОгарЬРаб Рплп 4.
Результаты.
Константы диссоциации (Кс), полученные из исследований, рассчитывали как составляющие 95,2, 121,3, 90,2, 250,5, 225,8, 41,7 нМ для соединений ОТЬ-0056 (птероил-ОАР-80456), ОТЬ-0057 (птероилВАМВ-30456), ОТЬ-0058 (птероил-АМНМВ-80456), ОТЬ-0059 (птероил-0Н0А08-80456), ОТЬ-0060 (птероил-ОАО8-30456), ОТЬ-0061 (птероил-4АРЕР-8О456) и фолиевой кислоты соответственно. Относительную аффинность связывания рассчитывали как составляющую 0,078, 0,061, 0,082, 0,029, 0,033, 0,171 и 1 для ОТЬ-0056-0061 ОТЬ-и фолиевой кислоты соответственно. Все тестируемые соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой.
- 44 029738
Заключение.
Соединения ОТЬ-0056 - ОТЬ-0061, каждое, имеет сродство к рецептору фолата, и у соединений оно достаточно хорошо сравнимо с аффинностью связывания фолиевой кислоты. Все соединения хорошо конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой, что указывает на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт связывания на раковых клетках, и они высокоспецифичны для рецептора фолата.
Пример 16. Фармакологические исследования ίη νίΐτο конъюгатов птероил-неаминокислотное соединение-краситель ΝΓΚ.
Материалы и методы.
Клетки ΚΒ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КРМ! 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап!а В1о1од1са1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОФсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Клетки ΚΒ, которые гиперэкспрессируют РК-α, высевали (100000 клеток/лунка) в 24-луночные планшеты Ра1соп (ΒΌ Вюкшепсек, СА) и давали сформировать монослои в течение периода в 12 ч. Использованную среду в каждой лунке заменяли на 10 нМ [3Н]-фолиевой кислоты (меченной тритием фолиевой кислоты) в присутствии возрастающих концентраций (0,1 нМ-1 мкМ) тестируемого соединения или фолиевой кислоты (Ыдта-АИпск МО) в свежей среде (0,5 мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С, клетки промывали ΡΒ8 (3x0,5 мл, ОФсо, ΝΥ) для удаления любых несвязанных радиоактивных веществ. После добавления 0,25М гидроксида натрия (0,5 мл) и инкубации в течение 12 ч при 4°С клетки переносили в индивидуальные сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционный коктейль ЕсоШе (3,0 мл, МР Β^οтеά^са1δ, ОН), и радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном анализаторе (Раскагб). Относительную аффинность связывания рассчитывали с использованием графика % связанной с клетками радиоактивности относительно 1од концентрации исследуемого соединения с использованием программы ОгарЬРаб Рпзт 4.
Результаты.
Константы диссоциации (Кс), полученные из исследований, рассчитывали как составляющие 95,2, 121,3, 90,2, 250,5, 225,8, 41,7 и 7,4 нМ для соединений ОТЬ-0056 - ОТЬ-0061 и фолиевой кислоты соответственно. Относительную аффинность связывания рассчитывали как составляющую 0,078, 0,061, 0,082, 0,029, 0,033, 0,171 и 1 для ОТЬ-0056 (Р1е-ОАР-80456), ОТЬ-0057 (Ρΐе-ΒАΜΒ-80456), ОТЬ-0058 (птероил-АМНМВ-80456), ОТЬ-0059 (Р1е-0Н0А08-80456), ОТЬ-0060 (Р1е-ОАО8-30456), ОТЬ-0061 (Р1е-4АРЕР-8О456) и фолиевой кислоты соответственно. Все тестируемые соединения количественно конкурировали с [3Н]-фолиевой кислотой.
Заключение.
Все соединения имеют низкое сродство к рецептору фолата. Все соединения конкурировали с [3Н]фолиевой кислотой, что указывает на то, что рецептор фолата имеет единственный сайт связывания на раковых клетках, и они высокоспецифичны для рецептора фолата.
Пример 17. Визуализация всего тела и биораспределение конъюгатов птероил-аминокислотакраситель №К.
Тестируемые соединения: ОТЬ-0038 [Р1е-Туг-80456], ОТЬ-0053 [птероил-Ьу8-80456], ОТЬ-0054 [птероил-Су8-80456].
Материалы и методы.
Клетки ΚΒ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КосктШе, ΜΌ) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КΡΜI 1640, свободной от фолата, содержащей (ОШсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап1а Β^ο1οд^са1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (ОШсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ^Ν) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1аб, XVI) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригбие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
- 45 029738
Визуализация всего тела.
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0/106/мышь в среде КРМ[ 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5/Ь/ГС2 (Ь - самая длинная ось и N - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2-3 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого соединения в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений Сайрег [VIδ Битша II с программным обеспечением Ыуш§ Ийаде 4.0 (Регк1пЕ1тег ГСс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ГСО (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; £-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу и опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора [VIδ, как описано ранее. Настройки для визуализации: - уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: ГСО (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОУ = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 29, ОТЬ-0038 (Р1е-Туг-80456) и ОТЬ-0054 (Р!е-Су8-80456) аккумулировались преимущественно в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях. Более того, непосредственное сравнение показало, что интенсивность флуоресценции в опухоли вводимого мышам ОТЬ-0038 была ярче, чем у мышей, получавших другие конъюгаты. С другой стороны, Р1е-Ьу8-80456 характеризовался яркой флуоресценцией в опухоли при возбуждающих длинах волн 605-675 нм и излучаемых при ГСО (830 нм) и только умеренной яркостью при возбуждении 710-745 нм и излучении при ГСО, как видно на фиг. 30 (те же параметры использовались с другими конъюгатами).
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на животных в тех же условиях путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора [VIδ. Как видно на фиг. 31, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в РК-положительных опухолях и в почках. Захват почками ожидался, поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата. Кроме того, возможно, что зонды экскретируются через почки в связи с их низкой молекулярной массой и периодом полураспада (у большинства фолатных конъюгатов период полураспада составляет <30 мин).
Заключение.
Яркость и специфичность конъюгатов, перечисленных от лучшего к худшему, при Ех=745 нм и Ет=ГСО распределяется следующим образом: Р1е-Туг-§0456, Р1е-Су§-80456 и Р1е- Ьу8-§0456. Р1е-Ьу880456 все показали более длинный сдвиг Стокса, указывая на то, что можно вызывать возбуждение при 605 нм и излучение в ГСО (830 нм) для выявления яркой флуоресценции опухоли.
Пример 18. Визуализация всего тела и биораспределение производных Р!е-Туг-Кодак [ОТЬ-0051 (птероил-Ту^-[К^28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак)].
Тестируемые соединения: ОТЬ-0051 (птероил-Ту^-[К^28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак).
Материалы и методы.
Клетки КВ (клеточную линию носоглотки человека) получали от американской коллекции типовых культур (КоскуШе, МО) и выращивали в виде монослоя с использованием среды КРМ[ 1640, свободной от фолата, содержащей (ОЛсо, ΝΥ) 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят (А11ап1а Вю1одюа1, ОА) и 1% пенициллин-стрептомицин (О1Ьсо, ΝΥ) в 5% диоксиде углерода: увлажненная атмосфера 95% воздуха при 37°С, в течение по меньшей мере шести пассажей, перед тем как их использовали для анализов.
Самок бестимусных голых мышей (5-недельного возраста, 18-20 г) приобретали в Наг1ап ^Ν) и поддерживали на гамма-облученной специальной диете с дефицитом фолата (Тек1а6, VI) в течение по меньшей мере 2 недель до начала исследования. Животных размещали по 5 штук/клетка в барьерном, свободном от патогенов скрытом стеллаже. Автоклавированную водопроводную воду и корм давали по потребности. Животных содержали в стерильных условиях при стандартном цикле свет-темнота 12 ч в течение исследования. Мышей идентифицировали индивидуально по проколам уха. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Ригбие. Уход за животными и исследования осуществляли в соответствии с национальными и международными руководящими принципами гуманного обращения с животными.
Визуализация всего тела.
- 46 029738
Семинедельным самкам мышей пи/пи инокулировали подкожно в плечо клетки КВ (1,0х106/мышь в среде КРМ1 1640, свободной от фолата). Рост опухолей измеряли в перпендикулярных направлениях каждые 2 дня, используя штангенциркуль (массу тела контролировали по той же схеме), и объемы опухолей рассчитывали как 0,5хЬх^2 (Ь - самая длинная ось и - ось, перпендикулярная Ь, в миллиметрах). После того как опухоли достигали в объеме от 400 до 500 мм3, животным (2-3 мыши/группа) внутривенно вводили 10 нмоль тестируемого соединения в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (100 мкл). Через 2 ч животных забивали путем СО2 асфиксии. Эксперименты по визуализации всего организма (интактной опухоли) затем осуществляли с использованием системы визуализации изображений СаЬрег ΙνΙ8 Ьишта ΙΙ с программным обеспечением Шшд Рпаде 4.0 (Регк1пЕ1шег Шс, МА). Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: Ιί',Ό (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОV = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с. В случае Р1е-Ьу8-80456 - возбуждение: 745, 710, 675, 640, 605 нм; излучение: Ιί'.Ό (830 нм) и остальные параметры те же.
Тканевое биораспределение.
После визуализации всего тела животных вскрывали и выбранные ткани (сердце, легкое, печень, селезенку, почки, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, мышцы, кожу и опухоль) анализировали на активность флуоресценции с помощью визуализатора ΙνΙ8, как описано ранее. Настройки для визуализации: уровень лампы: средний; возбуждение: 745 нм; излучение: Ιί',Ό (830 нм); освещение отраженного света; сортировка по бинам: 4 (М); РОV = 12,5; ί-стоп = 2; время обнаружения = 1 с.
Результаты.
Визуализация всего тела.
Как видно на фиг. 32, ОТЬ-0051 (птероил-Ту^-IК^28) и ОТЬ-0054 (птероил-Туг-Кодак) аккумулировались относительно хорошо в опухолях, позитивных в отношении рецептора фолата, без существенной флуоресцентной активности в других тканях. Система визуализации ΙνΙ8 не имеет фильтра для возбуждения при 800 нм, тогда как краситель Кодак возбуждался при 800 нм. Следовательно, наблюдаемый низкий захват флуоресценции в опухолях может быть обусловлен использованием плохой волны возбуждения.
Тканевое биораспределение.
Анализ тканевого биораспределения проводили на животных в тех же условиях путем эвтаназии каждой мыши, извлечения ее органов и визуализации их с помощью визуализатора ΙνΙ8. Как видно на фиг. 33, самая высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в РК-положительных опухолях. Изобретатели наблюдали также захват в легких. Хотя изобретатели ожидали наличие захвата почками (поскольку апикальная мембрана проксимального канальца почки, как известно, экспрессирует высокие уровни рецептора фолата), захват почками был низким.
Заключение.
Исследования тканевого биораспределения показали, что конъюгаты ОТЬ-0051 (птероил-ТугΙΡΌ28) и ОТЬ-0052 (птероил-Туг-Кодак) захватываются опухолями, позитивными в отношении рецептора фолата.
- 47 029738

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, имеющее формулу
    или его фармацевтически приемлемая соль или его изотопы,
    где X представляет собой одну аминокислоту или одно производное аминокислоты, где одна аминокислота или одно производное аминокислоты содержит функциональную группу -ОН, ΝΗ2 или -8Н; и
    Υ представляет собой краситель, который имеет спектры возбуждения и излучения флуоресценции в ближней инфракрасной области, где Υ представлен формулой
    причем X связан с Υ через функциональную группу аминокислоты, где X' независимо выбран из группы, состоящей из О, 8, N и С, и К' независимо выбран из группы, состоящей из СН2 и СН2СН2.
    2. Соединение по п.1, где аминокислота выбрана из группы, состоящей из тирозина, цистеина, лизина, серина или их производного.
    3. Соединение по п.1, где аминокислота представляет собой тирозин, где ароматическое кольцо тирозина включает изотоп углерода и/или изотоп водорода.
    4. Соединение по п.1, где производное аминокислоты представляет собой производное тирозина, выбранное из группы, состоящей из:
    или его рацемические смеси.
    5. Соединение по п.1, где аминокислота представляет собой цистеин или производное цистеина.
    6. Соединение по п.1, где соединение имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из:
    - 48 029738
    или представляет собой его калиевую, натриевую или аммонийную соль или его фармацевтически приемлемую соль.
    7. Соединение по п.1, где соединение имеет формулу
    или его фармацевтически приемлемая соль.
    8. Соединение по п.1, где соединение имеет максимумы поглощения и излучения приблизительно между 600 и 800 нм.
    9. Диагностическая композиция, включающая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
    10. Способ идентификации типа клеток-мишеней в биологическом образце, включающий:
    a) контактирование биологического образца с соединением по п.1 в течение периода времени и в условиях, позволяющих соединению связаться по меньшей мере с одной клеткой этого типа клетокмишеней; и
    b) оптическое обнаружение присутствия или отсутствия соединения в биологическом образце,
    где присутствие соединения на стадии обнаружения Ь) указывает на то, что тип клеток-мишеней присутствует в биологическом образце.
    11. Способ по п.9, где ткань представляет собой опухоль или лимфатический узел.
    12. Способ выполнения у индивидуума хирургической операции, руководствующейся визуализацией, включающий:
    a) введение композиции, включающей соединение по п.1, в условиях и в течение периода времени, достаточных для аккумуляции соединения в данном хирургическом участке;
    b) освещение соединения для визуализации соединения с помощью инфракрасного света;
    c) проведение хирургической резекции областей, которые флуоресцируют при возбуждении инфракрасным светом.
    13. Способ по п.12, где стадии освещения и определения выполняются с помощью эндоскопа, катетера, томографической системы, ручной системы оптической визуализации, хирургических очков или интраоперационного микроскопа.
    14. Способ по п.12, где заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, иммунологических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний дыхательных путей, болезней обмена веществ, наследственных заболеваний, инфекционных заболеваний и заболеваний костей.
    15. Способ по п.12, где длина волны света в ближней инфракрасной области составляет от приблизительно 650 до 900 нм.
    16. Способ диагностики заболевания у индивидуума, включающий:
    a) введение индивидууму, нуждающемуся в диагностике, количества соединения по п.1 в течение периода времени и в условиях, позволяющих соединению связаться по меньшей мере с одной клеткой этого типа клеток-мишеней;
    b) измерение сигнала от соединения по п.1, присутствующего в биологическом образце;
    c) сравнение сигнала, измеренного в Ь), по меньшей мере с одним набором контрольных данных, где по меньшей мере один набор контрольных данных включает сигналы от соединения по п.1, контак- 49 029738
    тировавшего с биологическим образцом, который не включает этот тип клеток-мишеней; и
    б) предоставление диагноза заболевания, где сравнение на стадии с) указывает на присутствие заболевания.
    17. Соединение по п.1, где соединение имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из:
    где А, X, Υ или Ζ представляют собой Н, № или ΝΗ4+,
    где А, X, Υ или Ζ представляют собой Н, № или ΝΗ4+,
    где А, X, Υ или Ζ представляют собой Н, № или ΝΗ4+,
    где А, X, Υ или Ζ представляют собой Н, № или Ν^+,
    - 50 029738
    где А. X, Υ или Ζ представляют собой Н, Ма или ΝΗ4+,
    - 51 029738
    - 52 029738
    где X, Υ или Ζ представляют собой Η, Νη или ΝΗ4
    - 53 029738
    - 54 029738
    и его фармацевтически приемлемая соль.
    о СО2Н
    Соединение # Линкер (X) Краситель (Υ) 1 Азр-Агд-Азр-Суз □уидЫ680- малимид 2 Азр-Агд-Азр-Суз ОуидР1750-малимид 3 ΕϋΑ ϊΓδοοονν
EA201591802A 2013-03-15 2013-08-26 Синтез и композиция аминокислотных линкерных групп, конъюгированных с соединениями, применяемыми для направленной визуализации опухолей EA029738B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361791921P 2013-03-15 2013-03-15
PCT/US2013/056629 WO2014149069A1 (en) 2013-03-15 2013-08-26 Synthesis and composition of amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591802A1 EA201591802A1 (ru) 2016-08-31
EA029738B1 true EA029738B1 (ru) 2018-05-31

Family

ID=51527878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591802A EA029738B1 (ru) 2013-03-15 2013-08-26 Синтез и композиция аминокислотных линкерных групп, конъюгированных с соединениями, применяемыми для направленной визуализации опухолей

Country Status (13)

Country Link
US (7) US9333270B2 (ru)
EP (3) EP2968335B1 (ru)
JP (5) JP6192799B2 (ru)
CN (3) CN105228628B (ru)
AU (4) AU2013383382B2 (ru)
BR (1) BR112015022810B1 (ru)
CA (3) CA2903994C (ru)
EA (1) EA029738B1 (ru)
ES (1) ES2765896T3 (ru)
HK (1) HK1218257A1 (ru)
IL (3) IL240509B (ru)
MX (3) MX358184B (ru)
WO (3) WO2014149069A1 (ru)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008230771B2 (en) 2007-03-27 2014-05-08 Radiomedix Inc. Compositions for targeted imaging and therapy
EP2721045B1 (en) 2011-06-20 2017-04-12 Radiomedix Inc. Compositions, methods of synthesis and use of carbohydrate targeted agents
US9333270B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-10 Purdue Research Foundation Synthesis and composition of amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors
US20170232119A1 (en) * 2013-03-15 2017-08-17 Purdue Research Foundation Synthesis and composition of amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors
US11162937B2 (en) * 2013-11-19 2021-11-02 Purdue Research Foundation Patient selection method for inflammation
US10280307B2 (en) 2014-11-05 2019-05-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Class of stable heptamethine cyanine fluorophores and biomedical applications thereof
WO2016183351A1 (en) * 2015-05-12 2016-11-17 Medibeacon Inc. Compositions and methods for assessing eye vasculature
FR3036621B1 (fr) 2015-05-25 2017-05-19 Fluoptics Traceur fluorescent ciblant multivalent dans le proche infrarouge pour imagerie optique.
FR3036622B1 (fr) * 2015-05-25 2017-05-19 Fluoptics Traceur fluorescent ciblant multivalent optimise.
US10842887B2 (en) 2015-09-09 2020-11-24 On Target Laboratories, LLC PSMA-targeted NIR dyes and their uses
US9808538B2 (en) 2015-09-09 2017-11-07 On Target Laboratories, LLC PSMA-targeted NIR dyes and their uses
EP3430383B1 (en) * 2016-03-16 2024-06-26 On Target Laboratories, LLC Ca ix-target nir dyes and their uses
US11555821B2 (en) 2016-03-16 2023-01-17 On Target Laboratories, Inc. CA IX-NIR dyes and their uses
EP3493855A4 (en) 2016-08-02 2020-04-01 ISI Life Sciences, Inc. METHOD FOR DETECTION OF CANCER CELLS.
EP3496762A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Near-ir light-cleavable conjugates and conjugate precursors
CN110177565A (zh) * 2016-09-09 2019-08-27 目标实验室有限责任公司 胆囊收缩素2受体靶向近红外成像及其用途
CA3035542A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 On Target Laboratories, LLC Psma-targeted nir dyes and their uses
CN109963874A (zh) * 2016-10-26 2019-07-02 西尔欧集团 靶向并通过辐射能分解癌症的癌症结合着色肽
WO2018101473A1 (ja) * 2016-12-02 2018-06-07 国立大学法人東京大学 化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ及びそれらの使用
ES2972577T3 (es) 2016-12-14 2024-06-13 Purdue Research Foundation Formación de imágenes y terapia dirigidas a la proteína de activación de fibroblastos (FAP)
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
US10539567B2 (en) * 2017-05-15 2020-01-21 Indicator Systems International, Inc. Biopsy methods and devices
JP2021513988A (ja) * 2018-02-15 2021-06-03 チルドレンズ ナショナル メディカル センターＣｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 胆道系及び腎臓系の蛍光マーカーとして使用するためのヘプタメチン系シアニン
CN108840815A (zh) * 2018-05-29 2018-11-20 苏州百源基因技术有限公司 一种荧光标记的氨基酸及其制备方法和用途
CN108727245B (zh) * 2018-07-02 2021-09-28 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种水杨酸类化合物及其制备方法和应用
KR102150415B1 (ko) 2018-12-07 2020-09-01 원광대학교 산학협력단 암 표적용 화합물 및 이의 용도
JP7160694B2 (ja) 2019-01-08 2022-10-25 日立Ｇｅニュークリア・エナジー株式会社 流体接触部材及び流体接触部材の製造方法
US11716533B2 (en) 2019-06-20 2023-08-01 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed fluorescence imaging system
US11754500B2 (en) 2019-06-20 2023-09-12 Cilag Gmbh International Minimizing image sensor input/output in a pulsed fluorescence imaging system
US11986160B2 (en) 2019-06-20 2024-05-21 Cllag GmbH International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed hyperspectral imaging system
US11516387B2 (en) 2019-06-20 2022-11-29 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed hyperspectral, fluorescence, and laser mapping imaging system
US11892403B2 (en) 2019-06-20 2024-02-06 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed fluorescence imaging system
US20210353151A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 On Target Laboratories, LLC Targeted fluorescent markers in combination with a flexible probe
CN112010862B (zh) * 2020-10-23 2021-03-30 南京诺源医疗器械有限公司 一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法
CN114014843B (zh) * 2021-11-17 2022-09-20 北京大学第一医院 一种psma靶向核素/荧光双模态配体和分子探针与应用
US11986540B2 (en) * 2022-02-23 2024-05-21 On Target Laboratories, LLC Compositions including pafolacianine for the identification of malignant lesions
CN114751907A (zh) * 2022-03-17 2022-07-15 南京诺源医疗器械有限公司 一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法和用途
CN115504984B (zh) * 2022-09-09 2023-07-25 南京诺源医疗器械有限公司 一种靶向α型叶酸受体的培美近红外荧光分子及其制备方法和应用
CN115490672B (zh) * 2022-09-30 2023-11-17 南华大学 一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用
CN116621823B (zh) * 2023-07-06 2023-10-31 南京诺源医疗器械有限公司 诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂、合成方法及应用
CN118078219B (zh) * 2024-04-24 2024-08-02 新斗生物科技(苏州)有限公司 近红外荧光捕获系统、装置及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4337339A (en) * 1979-04-30 1982-06-29 Baker Instruments Corp. Process for preparation of folic acid derivatives
US7547721B1 (en) * 1998-09-18 2009-06-16 Bayer Schering Pharma Ag Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging
US20120003151A1 (en) * 2009-03-05 2012-01-05 Purdue Research Foundation Method for early imaging of atherosclerosis
WO2013130776A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Purdue Research Foundation Folate receptor alpha binding ligands

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716596A (en) 1992-06-23 1998-02-10 Diatide, Inc. Radioactively labeled somatostatin-derived peptides for imaging and therapeutic uses
US5871711A (en) 1992-06-23 1999-02-16 Diatide, Inc. Radioactively-labeled somatostatin-derived peptides for imaging and therapeutic uses
DE19717904A1 (de) * 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
JP2000095758A (ja) 1998-09-18 2000-04-04 Schering Ag 近赤外蛍光造影剤および蛍光造影方法
PL355891A1 (en) 1999-12-15 2004-05-31 Schering Aktiengesellschaft Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging
MXPA02009454A (es) 2000-03-31 2003-04-10 Purdue Research Foundation Metodo de tratamiento usando conjugados ligando-inmunogeno.
DE60116510T2 (de) * 2000-09-19 2006-07-13 Li-Cor, Inc., Lincoln Cyaninfarbstoffe
US7597878B2 (en) * 2000-09-19 2009-10-06 Li-Cor, Inc. Optical fluorescent imaging
US6875886B2 (en) 2001-02-07 2005-04-05 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Modified PSMA ligands and uses related thereto
EP1390077B1 (en) * 2001-05-02 2014-07-16 Purdue Research Foundation Treatment and diagnosis of macrophage mediated disease
US8044200B2 (en) * 2005-03-16 2011-10-25 Endocyte, Inc. Synthesis and purification of pteroic acid and conjugates thereof
EP1904183B1 (en) * 2005-07-05 2014-10-15 Purdue Research Foundation Pharmaceutical composition for the treatment of osteoarthritis
WO2007100755A1 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Nabi Biopharmaceuticals Method for decreasing the toxic effects of nicotine on fetuses in pregnant women
US20100226967A1 (en) * 2006-05-23 2010-09-09 Purdue Research Foundation Imaging and therapeutic method using progenitor cells
US8685752B2 (en) 2006-11-03 2014-04-01 Purdue Research Foundation Ex vivo flow cytometry method and device
US8168804B2 (en) * 2007-06-29 2012-05-01 Vanderbilt University Large stoke shift NIR dyes
EP2268317B1 (en) * 2008-03-14 2020-02-26 VisEn Medical, Inc. Integrin targeting agents and in vivo and in vitro imaging methods using the same
CA2737496A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Endocyte, Inc. Folate receptor binding conjugates of antifolates
US8916137B2 (en) * 2008-11-07 2014-12-23 The General Hospital Corporation Monofunctional carbocyanine dyes for in vivo and in vitro imaging
CN101440282B (zh) * 2008-12-18 2012-06-27 中国药科大学 近红外荧光分子探针及其合成方法和用途
CA2758952C (en) * 2009-04-17 2016-01-12 Li-Cor, Inc. Fluorescent imaging with substituted cyanine dyes
WO2011150392A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Purdue Research Foundation Delivery of therapeutic agents to inflamed tissues using folate-targeted agents
JP2013542182A (ja) * 2010-09-06 2013-11-21 モドプロ アクチボラグ 化合物及び方法
EP2630196B1 (en) * 2010-10-20 2017-09-06 Li-Cor, Inc. Cyanine dyes and their conjugates
US10080805B2 (en) * 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US9333270B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-10 Purdue Research Foundation Synthesis and composition of amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4337339A (en) * 1979-04-30 1982-06-29 Baker Instruments Corp. Process for preparation of folic acid derivatives
US7547721B1 (en) * 1998-09-18 2009-06-16 Bayer Schering Pharma Ag Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging
US20120003151A1 (en) * 2009-03-05 2012-01-05 Purdue Research Foundation Method for early imaging of atherosclerosis
WO2013130776A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Purdue Research Foundation Folate receptor alpha binding ligands

Also Published As

Publication number Publication date
US9333270B2 (en) 2016-05-10
EA201591802A1 (ru) 2016-08-31
IL240509A0 (en) 2015-10-29
US20160339122A1 (en) 2016-11-24
AU2013383386A1 (en) 2015-09-03
US9254341B2 (en) 2016-02-09
EP2968335A1 (en) 2016-01-20
HK1218257A1 (zh) 2017-02-10
US20140275533A1 (en) 2014-09-18
JP6270981B2 (ja) 2018-01-31
US9341629B2 (en) 2016-05-17
IL240828A0 (en) 2015-10-29
CA2902205A1 (en) 2014-09-18
EP2968335B1 (en) 2019-03-27
CA2903994A1 (en) 2014-09-25
US20140271484A1 (en) 2014-09-18
JP2017149776A (ja) 2017-08-31
ES2765896T3 (es) 2020-06-11
MX2015013223A (es) 2016-04-20
US20140271482A1 (en) 2014-09-18
WO2014149073A1 (en) 2014-09-25
CA2903727A1 (en) 2014-09-25
US9061057B2 (en) 2015-06-23
JP2017214425A (ja) 2017-12-07
US9782497B2 (en) 2017-10-10
US20170281800A9 (en) 2017-10-05
US20160011199A1 (en) 2016-01-14
CN105120903A (zh) 2015-12-02
EP2968614A4 (en) 2016-10-19
CN105492905A (zh) 2016-04-13
US20160375153A1 (en) 2016-12-29
IL240673A0 (en) 2015-10-29
CA2903994C (en) 2017-08-22
MX2015013219A (es) 2016-10-03
CN105228628B (zh) 2019-10-18
AU2017203340A1 (en) 2017-06-08
WO2014149069A1 (en) 2014-09-25
JP6192799B2 (ja) 2017-09-06
JP2016512813A (ja) 2016-05-09
US9789208B2 (en) 2017-10-17
MX358184B (es) 2018-08-08
CN105228628A (zh) 2016-01-06
AU2013381391A1 (en) 2015-08-27
IL240509B (en) 2018-06-28
JP2016512240A (ja) 2016-04-25
EP2968614A1 (en) 2016-01-20
AU2017203340B2 (en) 2019-05-02
CA2903727C (en) 2020-10-27
EP2972320A4 (en) 2016-10-26
AU2013383382A1 (en) 2015-09-03
EP2972320B1 (en) 2019-10-23
US20140271476A1 (en) 2014-09-18
IL240828A (en) 2017-10-31
AU2013383382B2 (en) 2017-02-23
EP2968614B1 (en) 2019-04-03
BR112015022810A2 (pt) 2020-04-28
EP2968335A4 (en) 2016-10-26
US9233175B2 (en) 2016-01-12
JP2016512814A (ja) 2016-05-09
IL240673B (en) 2019-06-30
EP2972320A1 (en) 2016-01-20
BR112015022810B1 (pt) 2021-11-30
CN105492905B (zh) 2018-12-07
WO2014143309A1 (en) 2014-09-18
MX2015011830A (es) 2017-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017203340B2 (en) Synthesis And Composition Of Amino Acid Linking Groups Conjugated To Compounds Used For The Targeted Imaging Of Tumors
US12053532B2 (en) Synthesis and composition of non-amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors
US10746741B2 (en) CA IX—NIR dyes and their uses
KR20180081494A (ko) 암의 표적화 치료를 위한 광역학 치료제의 합성 및 조성물
US11555821B2 (en) CA IX-NIR dyes and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM