CN103313724A - 化合物和方法 - Google Patents

Abstract

在基于一组多肽提供能够结合靶分子的分子的方法中使用的分子工具。一种多肽，其具有选自SEQ ID NO 1-32的序列。这种多肽可以在筛选能够结合配体的靶分子的配体-多肽缀合物的方法中使用。配体-多肽缀合物例如用于疗法中。

Description

化合物和方法

发明领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及新多肽和基于这些多肽的分子工具以及其中使用这类工具的方法和使用这些工具获得的产物。

背景技术

WO03/080653中描述了一些联系关键生物感知识别和报告事件的折叠的配体修饰的螺旋-环-螺旋多肽支架，所述专利也教导所述多肽支架在生物分析应用/生物传感器应用中和用于确定蛋白质浓度和/或蛋白质亲和力的生物传感器中的用途。

另外，先前已经将配体修饰的不同多肽描述为能够结合众多指定的靶分子。因此，在WO07/117215中公开了与至少一种磷酸胆碱衍生物连接的多肽二聚体，因而获得的多肽显示对C-反应蛋白(CRP)的特异性结合作用。同样地，在上述WO03/080653中，公开了配体-多肽缀合物与人碳酸酐酶II的结合。

发明概述

本发明人现在已经令人惊讶地发现，通过使用选自少到16种不同多肽序列的多肽集合，可获得对多种靶分子具有增强的选择性和/或亲和力的多肽缀合物结合物。

因此，借助本发明的多肽集合，提供一种有力工具，所述工具允许获得配体-多肽缀合物作为类型庞大的靶分子的结合物，与配体本身相比，所述结合物具有大幅度增强的亲和力和选择性。

通过使用本发明工具可获得的配体-多肽缀合物包含能够结合至与多肽连接的靶分子的配体。本发明的十分有利特征是，尽管配体本身(即不与本发明的多肽连接)可以仅对靶分子显示中度亲和力和/或选择性，但是根据本发明提供的缀合物分子将有利地显示大幅度增强的亲和力和/或选择性。

一项突出特征是，可以使用本发明的多肽集合作为具有巨大多样性的分子工具，允许针对宽谱的靶分子找到最佳结合物。

因此，根据本发明的第一方面，提供一种具有选自SEQIDNO1-32的序列的多肽。

根据又一个方面，提供多种多肽，其包含根据本发明的至少两种不同多肽。

另外，提供一种在提供能够结合靶分子的分子的方法中使用的分子工具，所述工具包含根据SEQIDNO1-32中任一种或几种的多种多肽，每种多肽具有能够结合靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在选自所述多肽序列的位置8、17、22和34中的位置内，和用于检测与靶分子结合的报道基团，所述报道基团通过酰胺键与能够同所述报道基团形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在选自所述多肽序列的位置15、10、25和37中的位置内。

通过将靶分子的配体连接至所选择的多肽集合的每个成员并且就针对缀合物分子的结合亲和力和选择性而筛选(例如以高通量筛选方法)所获得的配体-多肽缀合物组，可以鉴定最佳配体-多肽缀合物作为所述靶分子的结合物。如本文中将显示，本发明的一个有利特征是，即便使用中度亲和力和/或中度选择性配体，筛选方法仍将提供对靶分子具有高亲和力和/或选择性或具有最佳亲和力和选择性组合的的结合物。

因此，根据另一个方面，提供了一种筛选能够结合靶分子的配体-多肽缀合物的方法，所述方法包括

-提供至少一种缀合物分子，所述缀合物分子包含具有选自SEQIDNO1-32的序列的多肽，所述多肽具有所述靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置8、17、22和34的位置，并且所述多肽具有报道基团，所述报道基团通过酰胺键与能够同所述报道基团形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置15、10、25和37的位置；

-使所述靶分子与所述缀合物分子接触；并且

-检测来自所述报道基团的信号。

根据又一个方面，提供一种配体-多肽缀合物，所述缀合物包含具有选自SEQIDNO1-32的序列的多肽，所述多肽具有靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处于选自所述多肽序列的位置8、17、22和34中的位置内。

还提供如本文定义用于疗法中的配体-多肽缀合物和包含如本文定义的配体-多肽缀合物的药物组合物。

还提供根据本发明的配体-多肽缀合物和其中使用这类缀合物的诊断方法或治疗方法以及包含本发明配体-多肽缀合物的药物组合物或例如诊断试剂盒。

本发明的其他方面以及其实施方案将从以下描述和所附权利要求书轻易地显现。

附图简述

图1是本发明16种多肽的集合的单字母代码表示，在序列左侧显示这种多肽的本文所用命名，并且在序列右侧显示这种多肽的净电荷。充当配体连接位点的赖氨酸残基以粗体书写。

图2显示实施例1中获得的电泳凝胶，从左边起：1.CSF(10X稀释)，2.通过PS-F108-4-C10L17-Ac从CSF捕获的蛋白质，3.含有PluronicF108的粒子的非特异性摄取，4.hAChE(Sigma)，5.MW标准(97(非常弱)、65、40、30、20.1、14.4kDa)，6.预染MW标准。

图3显示实施例2中作为靶分子使用的人碳酸酐酶II(HCAII)的带状图示，其中Zn²⁺离子可视作酶活性部位中的黑色圆圈。还显示配体L，它在此是苯磺酰胺，一种已知的HCAII抑制剂；与间隔臂连接的配体L的活性酯衍生物；和携带间隔臂的L与其在位置8内连接并且荧光团作为报道基团也与其在位置15内连接的本发明多肽(3-C15L8)。

图4显示银染的电泳凝胶，其显示从实施例2中裂解的血液中提取的蛋白质。从左至右，1：来自稀释500倍的血清中的蛋白质。2：来自稀释500倍的裂解血液中的蛋白质。3：由结合物3-C15L8-B捕获的蛋白质。4：由4-C37L34-B捕获的蛋白质。5：市售HCAI和HCAII的混合物。6：HCAI。7：HCAII。8：MW标准(顶部至底部97、65、40、30、20.1和14.4kDa)。9：预染MW标准。将条带切下并且在凝胶内进行胰蛋白酶消化，随后进行MALDI-TOF-MS分析，显示条带来源。在70kDa处的条带含有HSA，在30kDa处的条带含有HCAI和HCAII，并且在20kDa处的条带含有来自血红蛋白的片段。在70kDa处的条带存在于全部样品中并且归因于HSA和珠子的非特异性相互作用，血红蛋白条带源自凝结的血红蛋白片段，这些片段在离心期间自始至终跟随珠子。

图5显示在结合物3-C15L8-B和4-C37L34-B的SPR分析中获得的曲线。七种不同浓度(对于3-C15L8-B，2.4nM至240nM，并且对于4-C37L34-B，3.6nM至360nM)的两种结合物在HCAI和HCAII固定于不同流动小室中的CM5芯片上方流过。A：3-C15L8-B在固定的HCAI上方流过，B：4-C37L34-B在固定的HCAI上方流过，C：3-C15L8在固定的HCAII上方流过，D：4-C37L34-B在固定的HCAII上方流过。

图6显示实施例3中制备的本发明配体-多肽，4-C15L8-PP1，和多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列显示由Dpa基团螯合的锌离子的位置。小分子PP1与(加下划线的)赖氨酸8的侧链连接。荧光团与赖氨酸15的侧链连接。

图7示意性地显示作为实施例3中所用配体的磷酸酯结合物PP1的合成。

图8.使用3步骤滴定法从4个系列的多肽中鉴定α-酪蛋白的高亲和力结合物。7-甲氧基香豆素-3-羧酸与每种多肽缀合以充当荧光探针。显示了在没有α-酪蛋白的情况下(曲线在约2000具有最大值)和在500nM、1000nM和1500nMα-酪蛋白存在的情况下(曲线在1000-1200具有最大值)500nM结合物的发射光谱。强度因结合作用而下降并且结合作用在500nM浓度在500nM蛋白质存在下饱和，显示以低nM范围或更小K_d强烈结合。

图9.使用3步骤滴定法从3个系列的多肽中鉴定α-酪蛋白的高亲和力结合物。7-甲氧基香豆素-3-羧酸与每种多肽缀合以充当荧光探针。显示了在没有α-酪蛋白的情况下(最低强度曲线)和在500nM(中间强度曲线)、1000nM(中间强度曲线)和1500nM(最高强度曲线)α-酪蛋白存在的情况下500nM结合物的发射光谱。强度因结合作用而增加并且结合作用随渐增量α-酪蛋白而增加，未达到饱和，显示以高nM至μM范围Kd弱结合。结合物3-C10L17-PP1似乎在1000nMα-酪蛋白的浓度饱和，显示60nM解离常数。

图10.在锌离子不存下用未连接PP1的α-酪蛋白多肽滴定(顶部)和用紧密结合物4-C10L17-PP1滴定(底部)。α-酪蛋白的添加对荧光发射强度产生不明显的影响。两项实验均显示在充分装配的结合物分子不存在下结合不存在或不明显。

图11.与磷酸根阴离子(10mMPBS缓冲液，150mMNaCl，pH7.2)(A)和序列中具有一个磷酸酪氨酸的对照肽PhosPep(B)竞争时，α-酪蛋白由4-C15L8-PP1拉下。下拉磷酸根耗尽的α-酪蛋白(C)。

(A)泳道1。阳性对照，α-酪蛋白。泳道2：来自50mMPBS缓冲液中500nMα-酪蛋白溶液的提取物。(B)泳道1.阳性对照，α-酪蛋白。泳道2：来自500nMα-酪蛋白溶液和和400μM磷酸化肽PhosPep1的提取物；泳道3.来自500nMα-酪蛋白溶液和和40μM磷酸化肽PhosPep1的提取物；泳道4.来自100nMα-酪蛋白溶液和80μM磷酸化肽PhosPep1的提取物；泳道5.来自100nMα-酪蛋白溶液和和8μM磷酸化肽PhosPep1的提取物；泳道6.阴性对照，来自珠子的提取物，所述珠子没有来自500nMα-酪蛋白和400μM磷酸化肽PhosPep1的结合物。(C)泳道1.阳性对照，α-酪蛋白；泳道2.来自500nMα-酪蛋白溶液的提取物，泳道3.来自500nM80%脱磷酸的α-酪蛋白溶液的提取物。

图12.对α-酪蛋白总浓度(左侧)和α-酪蛋白游离浓度(右侧)作图的荧光强度。从针对描述1:1复合物解离的等式的实验结果的最佳拟合获得解离常数17nM。

图13.下拉（pull down）实验中从蛋白质混合物提取的蛋白质的SDS-PAGE。蛋白质混合物含有溶菌酶(15kDa)、磷酸化酶B(97kDa)、β-半乳糖苷酶(116kDa)、α-酪蛋白和卵清蛋白。泳道1：通过与Pluronic共价连接的4-C15L8-PP1包被的珠子取得的提取物。泳道2：对照：通过Pluronic包被的珠子在500nMα-酪蛋白溶液中温育取得的提取物；泳道3：500nM蛋白质混合物；泳道4：在500nMα-酪蛋白溶液中通过携带缺少螯合Zn²⁺的4-C15L8-PP1的珠子取得的提取物；泳道5：通过携带缺少螯合Zn²⁺的4-C15L8-PP1的珠子在蛋白质混合物中温育取得的提取物；泳道6:在蛋白质混合物中通过携带在Lys8处乙酰化的4-C15L8肽的珠子所取得的提取物。在凝胶底部的微弱条带是结合物分子，MW5kD。4-C15L8-PP1从蛋白质混合物中特异性提取α-酪蛋白。

图14.β-酪蛋白由4-C15L8-PP1下拉。泳道1：阳性对照，β-酪蛋白。泳道2：来自pH7.2含有150mM NaCl的10mM HEPES缓冲液中的100nM β-酪蛋白溶液的提取物。泳道3：阴性对照。500nM β-酪蛋白溶液中通过Pluronic包被的珠子取得的提取物。

图15.4-C15L8-PP1从乳和人血清拉下α-酪蛋白。A)泳道1：阳性对照，α-酪蛋白。泳道2：来自10倍稀释的牛乳中的提取物。B)泳道1：阳性对照α-酪蛋白。泳道2：阳性对照，100倍稀释的人血清，用α-酪蛋白内标至500nM浓度。泳道3：来自用缓冲液稀释100倍并用500nMα-酪蛋白内标的人血清的提取物。泳道4：来自500nMα-酪蛋白内标的人净血清的提取物。泳道5：通过仅用Pluronic包被的珠子从500nMα-酪蛋白内标的100倍稀释的人血清中取得的提取物。

图16显示胸苷和来自解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)的TK之间相互作用的棒模型(stick representation)。

图17显示核苷酸和核苷酸单磷酸、二磷酸和三磷酸的组成。这里，核碱基是鸟嘌呤。

图18.45分钟后3-C15L8-dT在缓冲液A(不含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图19.45分钟后3-C15L8-dT在缓冲液B(含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图20.45分钟后4-C10L17-dT在缓冲液A(不含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图21.45分钟后4-C10L17-dT在缓冲液B(含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图22.45分钟后4-C25L22-dT在缓冲液A(不含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图23.45分钟后4-C25L22-dT在缓冲液B(含ATP)中的荧光光谱。数据点对应于4个独立测量值的均值。

图24.在20mM Tris缓冲液中和以2μM肽浓度采用TK上dT的竞争测定法的3-C15L8-dT荧光光谱。数据点对应于3个独立测量值的平均值。

图25.在20mM Tris缓冲液中和以2μM肽浓度采用TK上dT的竞争测定法的2-C10L17-dT荧光光谱。数据点对应于3个独立测量值的平均值。

图26.在20mM Tris缓冲液中和以2μM肽浓度采用TK上dT的竞争测定法的4-C10L17-dT荧光光谱。数据点对应于3个独立测量值的平均值。为了图更清晰，省略从420-475nm的数据点。

图27.在20mM Tris缓冲液中和以2μM肽浓度采用TK上dT的竞争测定法的3-C25L22-dT荧光光谱。数据点对应于3个独立测量值的平均值。

图28.在19的DMSO-d6中的1H/1H-COSY。

图29显示维生素D结合蛋白的结合物分子的示意图。小分子配体经8碳间隔团与肽序列中赖氨酸残基的侧链连接。出于定量目的并且为荧光滴定蛋白质的亲和力，掺入丹磺酰荧光团。

图30显示设计构思的图示。由维生素D结合蛋白复合的维生素D的晶体结构显示维生素D的碳11暴露。间隔团因此与碳11共价连接。

图31是原理图示，其显示来自D-二聚复合的GPRP的晶体结构的细节，其中N端甘氨酸残基对结合至关重要。GPRP通过与C端Pro连接的6-碳间隔团连接至多肽序列中赖氨酸残基的侧链。多肽的N端乙酰化并且序列中不存在其他赖氨酸残基，从而确保GPRP活性酯的特异性反应。

图32.使用浓度仅1nM、10nM和100nM的结合物，在筛选结合物寻找D-二聚体时所获得的传感图的小图。注射时间是3分钟并且清除时间是10分钟。

图33(A和B).传感图的小图，其显示7种最佳结合物与pH7.4的HBS-EP缓冲液中的固定D-二聚体结合。小图A显示7种最佳单体结合物。小图B显示通过带有PEG间隔团的双官能接头发生二聚化的相应结合物。小图A上行从左至右3-D15L8-GPRP、3-D10L17-GPRP、3-D25L22-GPRP、3-D37L34-GPRP。小图A下行4-D15L8-GPRP、4-D10L17-GPRP、4-D25L22-GPRP。小图B相同结合物但是通过接头二聚体化。为直接比较结合物之间的摄取，轴刻度是相同的。注射时间是3分钟并且清除时间是10分钟。

图34显示传感图的小图，其显示GPRP抑制4-D10L17-GPRP结合D-二聚体。左传感图，在pH7.4和结合物浓度为0nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM和160nM的运行缓冲液中由4-D10L17-GPRP结合固定的D-二聚体。中部传感图，在pH7.4和0M、1M、10M、100M和1mM浓度的运行缓冲液中GPRP结合固定的D-二聚体。右传感图，0nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM和160nM浓度的4-D10L17-GPRP与GPRP竞争结合固定的D-二聚体。为直接比较结合物之间的摄取，轴刻度是相同的。注射时间是3分钟并且清除时间是10分钟。

图35显示在pH7.5的磷酸盐缓冲盐水中采用D-二聚体蛋白时4-C15L8-GPRP的滴定曲线。描述1:1复合物解离的等式与实验数据的最佳拟合产生3nM解离常数Kd。

图36显示具有间隔团的GPRP配体的合成。

发明详述

出于本发明的目的，使用氨基酸的IUPAC三字母代码和IUPAC单字母代码并且如下显示。

氨基酸         3字母代码   1字母代码

丙氨酸           Ala         A

精氨酸           Arg         R

天冬酰胺         Asn         N

天冬氨酸         Asp         D

半胱氨酸         Cys         C

谷氨酸           Glu         E

谷氨酰胺         Gln         Q

甘氨酸           Gly         G

组氨酸           His         H

异亮氨酸         Ile         I

亮氨酸           Leu         L

赖氨酸           Lys         K

甲硫氨酸         Met         M

苯丙氨酸         Phe         F

脯氨酸           Pro         P

丝氨酸           Ser         S

苏氨酸           Thr         T

色氨酸           Trp         W

酪氨酸           Tyr         Y

缬氨酸           Val         V

本发明的多肽

在一些实施方案中，本发明的多肽具有根据SEQIDNOs.17-32中任一个的序列，所述序列任选地具有受合适保护基保护的一个或两个末端。

在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽具有根据SEQIDNOs.1-16中任一个的序列。

在一个实施方案中，本发明的多肽集合选自

1-C15L8:

NEADLEAKIRHLAEKLEARGPEDAEQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:1)；

2-C15L8:

NEADLEAKIRHLAEKLAARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:2)；

3-C15L8:

NAADLEAKIRHLAEKLAARGPVDAAQLAEQLARRFEAFARAG(SEQ ID NO:3)；

4-C15L8:

NAADLEAKIRHLREKLAARGPRDAAQLAEQLARRFERFARAG(SEQ ID NO:4)；

1-C10L17:

NAADLEAAIKHLAEALKERGPEDCEQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:5)；

2-C10L17:

NAADLEAAIKHLAEALKARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:6)；

3-C10L17:

NAADLEARIKHLAERLKARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:7)；

4-C10L17:

NAADLEARIKHLRERLKARGPRDAAQLAEQLARAFERFARAG(SEQ ID NO:8)；

1-C25L22:

NEADLEAAIRHLAEALEARGPKDAKQLAEQLARAFEAFERAG(SEQ ID NO:9)；

2-C25L22:

NEADLEAAIRHLAEALAARGPKDAKQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:10)

3-C25L22:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPKDAKQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:11)；

4-C25L22:

NAADLEARIRHLRERLAARGPKDAKQLAEQLARAFERFARAG(SEQ ID NO:12)；

1-C37L34:

NEADLEAAIRHLAERLEARGPADAAQLAEQLAAKFEKFARAG(SEQ ID NO:13)；

2-C37L34:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPVDAAQLAEQLAAKFEKFARAG(SEQ ID NO:14)；

3-C37L34:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPVDAAQLAEQLARKFEKFARAG(SEQ ID NO:15)；和

4-C37L34:

NAADLEARIRHLRERLAARGPRDAAQLAEQLARKFEKFARAG(SEQ ID NO:16)；

或这些序列中任一者的任何C端酰胺化产物或N端酰化产物。

已经设计本发明多肽的每一种以便折叠成由短环连接的两个两性螺旋。多肽的氨基酸已经基于它们形成螺旋或环的倾向性进行选择。另外，已经导入能够形成盐桥、进行N-和C端加帽和稳定螺旋双极的残基以便稳定螺旋区段。通过NMR和CD光谱法和通过分析性超速离心的广泛研究已经确立，一个密切相关的多肽序列的家族折叠成螺旋-环-螺旋基序，所述基序二聚化以形成具有熔球样特性的反平行4-螺旋束。先前已经报道，16成员集合中的未缀合序列的平均残余椭圆率完全处于落入形成螺旋-环-螺旋二聚体的相似序列范围内。CD和NMR光谱研究已经阐明，设计成结合人碳酸酐酶II的多肽缀合物具有熔球样螺旋-环-螺旋二聚体典型的特性。基于与先前经证实形成具有熔球样特性的螺旋-环-螺旋二聚体的几种序列的相似性，假定本发明的多肽也形成相似的折叠。

本发明多肽的变化主要地集中在两种变量上：电荷分布和连接配体的位点。在一个实施方案中，本发明的多肽具有图1中所示的序列。在图1中所示的多肽中，多肽的总电荷从-7至+2变动，并且变动的残基均处于暴露于溶剂的位置内。连接配体的残基例如赖氨酸残基(图1中的粗体)处于位置8、17、22和34内。这些多肽形成螺旋-环-螺旋二级结构(螺旋I-环-螺旋II)并且配体在所示位置处的连接分别允许在螺旋I的始端、在螺旋I的末端和在环内并在螺旋II的中部并入。连接配体的每个位点的4种不同的总电荷和4个配体连接位点产生总计16种序列。

肽-蛋白质相互作用中的大量结合能预期源自蛋白质表面上的疏水性残基和折叠螺旋的疏水面之间的疏水相互作用，而预期电荷-电荷相互作用提供选择性。

可以变动多肽的某些氨基酸，即旨在提供与固体载体连接的位点。例如，Ala，例如在位置24或25中或在任何其它可用位点内Ala，可以由Cys替换，从而通过与合适的表面材料(例如这样一种表面材料，其具有与游离巯基官能团反应的活性二硫化物基团)形成二硫键或通过例如与金表面连接而能够进行连接，其中所述的表面材料。如果需要，也可以使用Cys作为连接其他官能团(例如其他报道基团)的位点，例如通过利用马来酰亚胺-巯基偶联化学，如本领域普通技术人员熟知。

如上文指出，优选地使用多肽的N-和C端加帽作用。然而，尽管是优选的，但是这类加帽作用不应当解释为绝对要求。

如本领域普通技术人员熟知，也可以通过使用其他保护基实现N端和C端保护。因此，除乙酰基之外，N端保护基的实例还包括任何酰基，例如C2-C6烷氧羰基。另外，保护基也可以例如是烷氧羰基或芳氧羰基，例如C2-C6烷氧羰基或苯氧或苄氧羰基。除通过酰胺化保护即作为伯、仲或叔酰胺之外，C-末端处的羧基也可以例如通过酯化进行保护，即作为任选地取代的烷基酯或芳基酯。本发明多肽中的任何基团的其他保护基和保护方法可以容易地由本领域普通技术人员想起，并且可以在文献“Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis(Greene有机合成中的保护基)”，PeterG.M.Wuts和TheodoraW.Greene，第4版，2007年，John Wiley and Sons中找到，所述文献的教导内容通过引用方式并入本文。

在一些实施方案中，本发明的多肽也包含根据SEQIDNOs.1-32(例如根据SEQIDNO1-16或SEQIDNO17-32)的任何多肽，但是含有代替Ala的Cys，尤其在位置24内的Cys。

在一些实施方案中，本发明多肽中的某些氨基酸可以衍生化，例如通过与保护基反应或由具有相似化学特性和/或结构特性的氨基酸替换(即保守性置换)进行，其中所述氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸。

例如，在一些实施方案中，可能需要在分别用配体和/或报道基团衍生化选定的酰胺键形成残基之前保护多肽的氨基酸。

如众所周知，天然存在的氨基酸可以基于其侧链的化学特性和/或结构特性划分成不同的组，即脂族氨基酸Gly、Ala、Val、Leu和Ile；具有羟基或含硫侧链的氨基酸Ser、Cys、Thr和Met；芳族氨基酸Phe、Tyr、Thr和His(虽然His也可以划分为碱性氨基酸)；碱性氨基酸Lys和Arg(和His)以及酸性氨基酸和它们的酰胺Glu、Asp、Gln和Asn。因此，在一些实施方案中，根据SEQIDNOs.1-32中任一个的多肽的任何氨基酸可以通过保守性置换进行替换，即将它替换为具有相似化学特性和/或结构特性(例如属于如上文概述的相同组)的氨基酸。

另外，存在可以划入上述组的多种非天然存在的氨基酸，并且许多的这类氨基酸是可商业获得的。例如，丙氨酸(2-氨基丙酸)可以由2-甲基丙氨酸(2-氨基-2-甲基丙酸)替换；亮氨酸(2-氨基-4-甲基戊酸)可以由正亮氨酸(2-氨基己酸)或由叔-亮氨酸(2-氨基-3,3-二甲基丁酸)替换等。

在一些实施方案中，位置5、16和27中的亮氨酸以3系列和4-系列分别由正亮氨酸替换。

用其他氨基酸(天然或非天然)替换多肽的一个或多个氨基酸时，优选地保留多肽的总净电荷。然而，在一些实施方案中，也可以允许总净电荷变动。

应当选择发挥连接配体(即分别是位置8、17、22和3内的氨基酸)和连接报道基团(即分别是位置10、15、25和37内的氨基酸在)作用的氨基酸，从而分别能够与配体和报道基团形成酰胺键。就这一点而论，这些氨基酸优选地应当包含具有伯胺功能性的侧基(不参与形成多肽链的残基，或“氨基酸残基”)。氨基酸可以是天然或非天然的。

为了氨基酸发挥能够分别与配体或报道基团形成酰胺键的连接位点的作用，报道基团或配体基团优选地应当形成其活性酯进行衍生化，如下文将讨论。

就上文而言，在根据SEQ ID NOs.1-16中任一个的多肽中，构思任何赖氨酸可以由任何合适的同系物或衍生物替换，条件是如果赖氨酸充当配体或报道分子连接位点，则与配体或报道分子的活性酯形成键的能力保留。例如，赖氨酸(2,6-二氨基己酸)可以由鸟氨酸(2,5-二氨基戊酸)或由2,4-二氨基丁酸或由这些氨基酸的任何其他碳链同系物(例如具有支链的碳链同系物)替换。

另外，在一些实施方案中，根据SEQ ID NOs.1-32中任一个的多肽的任何氨基酸可以由具有相似化学特性和/或结构特性的任何修饰的氨基酸替换。

在一些实施方案中，本发明的多肽可以包含已经通过掺入保护基加以修饰的氨基酸，如本领域普通技术人员熟知，还参见上文“Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis(Greene有机合成中的保护基)”，例如，当适当地使用配体保护基的活性酯的缀合，从而仅与配体连接的赖氨酸是可接近之时。

位置8、10、15、17、22、25、34和37中的酰胺键形成氨基酸优选地是赖氨酸。然而，在一些实施方案中，分别与配体和报道基团连接的位置8、10、15、17、22、25、34和37中任一位置以由任何等同氨基酸或氨基酸类似物或修饰的氨基酸占据，前提是这种氨基酸或氨基酸类似物能够连接选择的配体和报道基团。因此，例如，形成酰胺的氨基酸也可以同等地是鸟氨酸或2、4-二氨基丁酸或这些氨基酸的任何其他碳链同系物(例如具有支链的碳链同系物)。

在一些实施方案中，当提到根据SEQ ID NO1-32中任一个的多肽时，这也包括如上述置换或修饰中任一种所获得的这些多肽的变体的任一种。

在一些实施方案中，本发明的多肽处于二聚体形式。在这种情况下，二聚体可以包含根据SEQ ID NO1-32中任一个的两条多肽，例如根据SEQ ID NO1-16中任一个的两条多肽，或这些多肽的任何变体，如本文以上讨论。二聚体的多肽可以通过非共价键彼此结合，如可以在本发明多肽的溶液中自发形成，或可以例如通过一个或两个二硫键彼此共价结合。

分子工具

如上文提到，根据一个方面，提供一种分子工具，其包含上文限定的多种多肽。例如，本发明的多肽集合可以包含如上文限定的16种螺旋-环-螺旋多肽，例如16种含42个氨基酸的多肽，所述多肽具有分别允许配体在位置8、17、22或34处和报道基团在位置10、15、25和37处连接的氨基酸并且具有总体上从负(例如-7)变成正(例如+2)的总电荷。这类多肽的实例在序列表中提供，但是例如通过保守性置换这些多肽的一个或几个氨基酸或通过化学修饰多肽的氨基酸，技术人员将还能够制备这些多肽的修饰变体。另外，应当认识到，可以使用本发明16种多肽的子集，或甚至更大的集合，例如包含额外多肽的集合。将全部这些变体视为处于本发明的范围内。

在一个实施方案中，分子工具包含具有根据SEQ ID NO 1-32的序列的多肽集合。

在一个实施方案中，分子工具包含具有根据SEQ ID NO 1-16的序列的多肽集合。

在一些实施方案中，分子工具包含具有根据SEQ ID NO 17-32的序列的多肽集合。

在其他实施方案中，分子工具包含具有根据图1的序列的多肽集合。

在一些其他实施方案中，分子工具包含选自SEQ ID NO 1-32的多肽集合，但是其中分别在3系列和4系列的位置5、16和27内的亮氨酸已经由正亮氨酸(单字母代码：J)替换。

在另外的实施方案中，分子工具包含选自SEQ ID NO 1-16的多肽集合，但是其中分别在3系列和4系列的位置5、16和27内的亮氨酸已经由正亮氨酸(单字母代码：J)替换。

在另外的实施方案中，分子工具包含选自SEQ ID NO 1-32的多肽集合，其中一个或两个多肽末端携带保护基。

因此，根据一个实施方案，分子工具包含以下多肽集合

1-C15L8:

NEADLEAKIRHLAEKLEARGPEDAEQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:1)；

2-C15L8:

NEADLEAKIRHLAEKLAARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:2)；

3-C15L8:

NAADLEAKIRHLAEKLAARGPVDAAQLAEQLARRFEAFARAG(SEQ ID NO:3)；

4-C15L8:

NAADLEAKIRHLREKLAARGPRDAAQLAEQLARRFERFARAG(SEQ ID NO:4)；

1-C10L17:

NAADLEAAIKHLAEALKERGPEDCEQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:5)；

2-C10L17:

NAADLEAAIKHLAEALKARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:6)；

3-C10L17:

NAADLEARIKHLAERLKARGPVDAAQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:7)；

4-C10L17:

NAADLEARIKHLRERLKARGPRDAAQLAEQLARAFERFARAG(SEQ ID NO:8)；

1-C25L22:

NEADLEAAIRHLAEALEARGPKDAKQLAEQLARAFEAFERAG(SEQ ID NO:9)；

2-C25L22:

NEADLEAAIRHLAEALAARGPKDAKQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:10)

3-C25L22:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPKDAKQLAEQLARAFEAFARAG(SEQ ID NO:11)；

4-C25L22:

NAADLEARIRHLRERLAARGPKDAKQLAEQLARAFERFARAG(SEQ ID NO:12)；

1-C37L34:

NEADLEAAIRHLAERLEARGPADAAQLAEQLAAKFEKFARAG(SEQ ID NO:13)；

2-C37L34:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPVDAAQLAEQLAAKFEKFARAG(SEQ ID NO:14)；

3-C37L34:

NAADLEAAIRHLAERLAARGPVDAAQLAEQLARKFEKFARAG(SEQ ID NO:15)；和

4-C37L34:

NAADLEARIRHLRERLAARGPRDAAQLAEQLARKFEKFARAG(SEQ ID NO:16)；

或这些序列中任一者的任何C端酰胺化产物或N端酰化产物。

该多肽集合优选地包含2-16种不同的多肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种不同的多肽。例如，这个集合包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO1-32(例如1-16)任一个中的至少两种不同SEQ ID NO的序列。

例如，合适的组可以包含具有至少3不同SEQ ID NO或至少4种不同SEQ ID NO，例如至少5种不同SEQ ID NO、至少6种不同SEQ ID NO、至少7种不同SEQ ID NO、至少8种不同SEQ ID NO、至少9种不同SEQ ID NO、至少10种不同SEQ ID NO、至少11种不同SEQ ID NO、至少12种不同SEQ ID NO、至少13种不同SEQ IDNO、至少14种不同SEQ ID NO或至少15种不同SEQ ID NO的多肽。在一些优选的实施方案中，这个集合包含根据16种SEQ ID NO(例如SEQ ID NO1-16或SEQ ID NO 17-32)的多肽。

优选使用的工具包含至少16种多肽(具有4种不同的配体并入位点和每个配体并入位点的4种不同电荷)。原因在于，结合给定配体，预测哪种多肽将产生最佳结合亲和力和选择性是十分困难的，即便不能说不可能。因此，使用基于序列表的全部16个序列的多肽集合作为分子工具可能产生最佳结果。然而，也构思可能使用仅基于一些序列的多肽子集，或甚至可能包括其他多肽，例如，通过保守性置换改变氨基酸所获得的多肽。

在一些实施方案中，这个组包含在氨基酸序列中均具有相同电荷的多肽(参见图1)，而在其他实施方案中，这个组包含其中某些多肽具有不同电荷的多肽。在另外的实施方案中，这个组包含均具有不同电荷的，例如在氨基酸序列中具有不同电荷但配体连接位置相同的多肽。

小分子配体在位置8、17、22和34中赖氨酸残基的侧链处连接。作为基础的设计原则是对于最佳选择性和亲和力，小分子和多肽必须协作地有助于结合。配体可以通过间隔团与多肽连接，所述间隔团的功能将允许多肽支架找到与小分子战斗部的结合位点紧邻的形状和电荷互补性结合位点。因此，间隔团的选择通常是开发结合物的重要方面。

实施例中相对于具体配体给出可以使用的间隔团的实例，但是这些间隔团也可以与其他配体一起使用。可以使用的其他间隔团分子将容易地由本领域技术人员想起。例如，间隔团可以是1-12个碳原子的脂族链，所述脂族链可以任选地以亲水基团取代以增强溶解度。在一些情况下，间隔团可能甚至不得不具有超过12个碳原子的长度，在这种情况下，这可以带来溶解度问题。为缓解这类问题，可以将一个或几个极性基团引入间隔团的主链中或替换到间隔团主链上。

配体(任选地包含间隔团)以及报道基团可以通过使多肽分别与配体(任选地包含间隔团)以及报道基团的活性酯接触而与多肽连接。配体L(或报道分子R)的活性酯衍生物具有通式(I)

Q-COOR¹     (I)

其中Q是配体L或者报道分子R和R¹是pe_a为约6-8的离去基团，例如硝基苯基。

在配体L经间隔团与多肽接合的情况下，活性酯衍生物可以由式(I')代表

L-X-COOR¹     (I')

其中X代表间隔团。例如，在X是1-12个碳原子的脂族链情况下，

活性酯衍生物可以由式(I')代表

L-(CH₂)_n-COOR¹     (I')

其中n是1至12的整数。

已经在WO07/117215中描述了合成其中n是4、6或11并且R¹是对硝基苯基的活性酯的实例，所述专利的内容完整并入本文。

报道基团在位置10、15、25和37内形成酰胺的残基(例如赖氨酸残基)的侧链处连接，并且通常与多肽或多肽缀合物连接时能够产生可检测信号的基团，所述可检测信号分别指示靶分子和多肽或多肽缀合物之间的结合性相互作用。报道基团的优选实例是荧光探针如丹磺酰、香豆素、荧光素、罗丹明和俄勒冈绿衍生物。报道基团也可以是酶如磷酸烯醇式丙酮酸激酶。报道基团可以根据供应商的说明书或通过其他常规方法(例如作为活性酯衍生物)与形成酰胺的残基连接。

42氨基酸的多肽因此可以如下划分：

多肽名称	配体连接位点	报道分子连接位点
			C10L17	17	10
C15L8	8	15
			C25L22	22	25
C37L34	34	37

根据本发明的一个方面，提供筛选能够结合靶分子的配体-多肽缀合物的方法，所述方法包括

-提供至少一种缀合物分子，所述缀合物分子包含具有选自SEQIDNO1-32的序列的多肽，所述多肽具有所述靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置8、17、22和34的位置，并且所述多肽具有报道基团，所述报道基团通过酰胺键与能够同所述报道基团形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置15、10、25和37的位置；

-使所述靶分子与所述缀合物分子接触；并且

-检测来自所述报道基团的信号。

在本发明方法中使用的多肽如本文以上所述。例如，能够与配体或报道基团形成酰胺键的氨基酸优选地包含伯胺官能团(即-NH2)并且在一些实施方案中，所述氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸或2,4-二氨基丁酸。

因此，在一个实施方案中，筛选方法包括

-提供至少一种缀合物分子，所述缀合物分子包含具有选自SEQIDNO1-16的序列的多肽，所述多肽具有靶分子的配体，所述配体与选自位置8、17、22和34的位置处的赖氨酸连接，并且所述多肽具有报道基团，所述报道基团与选自位置15、10、25和37的位置处的赖氨酸连接；

-使所述靶分子与所述缀合物分子接触；并且

-检测来自报道分子基团的信号。

本发明的一个实施方案包含提供通过以下方式获得的一组缀合物分子

-使靶分子的配体和用于检测与这种靶分子结合的报道分子与本发明多肽集合的每一种多肽连接，从而获得相应的配体-报道分子-多肽缀合物集合，

-使靶分子与每一种配体-报道分子-多肽缀合物接触，并且

-检测来自所述报道基团的信号。

根据又一个方面，本发明涉及通过筛选与多肽不连接时的配体相比能够以增强的亲和力和选择性结合靶分子的配体-多肽缀合物所获得的产物。

这种产物例如可以是配体-多肽缀合物或额外包含一种或多种其他基团(例如报道基团、允许多肽与固体载体连接的基团)等的配体-多肽缀合物。下文提供作为通过本发明筛选方法所获得的产物的配体-多肽缀合物的几种实例，并且这些产物及其可能变体(例如通过保守性置换缀合物的多肽的氨基酸获得的变体)均处于本发明的范围内。

本发明的配体-多肽将在生物技术和制药领域具有众多应用。根据一个方面，提供本发明的配体-多肽在疗法中的用途。例如，根据一个方面，本发明提供用于诊断方法中的本发明配体-多肽缀合物。根据另一个方面，本发明提供用于体内成像方法中的本发明配体-多肽缀合物。

下文提供本发明的配体-多肽缀合物的一些实例，但是技术人员将认识到，归因于本发明分子工具的多样性，应用领域是极其宽广的并且将有可能针对众多有医学意义的蛋白质(例如已知或疑似参与病理状况的各种酶和受体)开发高亲和力、高选择性结合物。

由本发明提供的配体-多肽缀合物不仅限于在疗法中使用的那些。相反，本发明的配体-多肽缀合物可以用于任何种类的生物技术应用中，如用于法医方法或用于蛋白质纯化，例如大规模(工业规模)蛋白质纯化中。

实施例

实施例1

在实施例1中，使用人乙酰胆碱酯酶hAChE作为靶分子。

hAChE在对神经信号传输至关重要的反应中水解乙酰胆碱以形成胆碱并因此是化学战中的靶。神经气体如沙林、索曼和VX通过抑制hAChE并且降低其活性至某种程度发挥作用，其中暴露的人遭受严重损伤或被杀死(Evison,D.,Hinsley,D.和P.Rice.British MedicalJournal.2002,324,332-335.Marrs,T.Pharmacy.Ther.1993,58,51-66)。另外，hAChE是重要的药物靶，因为乙酰胆碱的丢失在阿尔茨海默病中发挥作用(Talesa,V.N.Mechanisms of Ageing and Development2001,122,1961-1969.Perry,E.K.；Tomlinson,B.E.；Blessed,G.；Bergmann,K.；Gibson,P.H.；Perry,R.H.British Medical Journal,1978,2,1457-1459.Perry,E.K.；Perry,R.H.；Blessed,G.；Tomlinson,B.E.Neuropathology and Applied Neurobiology1978,4,273-277)，并且对hAChE的抑制减少症状(PolinskyR.J.Clin.Ther.1998,20,4,634-647)。hAChE的选择性高亲和力结合物因此在众多生物医学应用中引起巨大的兴趣。

结果和讨论

设计和合成

结合物设计中利用活性部位抑制剂是有吸引力的，因为对靶酶具有中度亲和力和良好选择性的有机小分子是经常可获得的，尤其对于已建立和验证的蛋白质而言。在hAChE的情况下，文献中存在几种报道的抑制剂(^{Mooser,G.；Sigman,D.S.Biochemistry1974,13,2299-2307}；^{Taylor,P.；Lappi,S. Biochemistry,1975,14,1989-1997}；^{Nolte,H.-J.；Rosenberry,T.L.；Neumann,E.Biochemistry,1980,19, 3705-3711})并且选择9-氨基吖啶，一种具有30-100nM范围内的已报道亲和力的已知抑制剂(Steinberg,G.M.；Mednick,M.L.；Maddox,J.；Rice,R.:Cramer,J.JMedChem1975,18,1056-1061.Radic,Z.,Taylor,P..JBiol.Chem.2001,276,4622-4633,2001)。然而，基于活性部位抑制剂的hAChE结合物提出了特殊问题，因为hAChE的活性部位位于

深的腔内(Sussman,J.L.；Harel,M.；Frolow,F.；Oefner,C.；Goldman,A.；Toker,L.；Silman,I.Science1991,253,872-9.ShaffermanA.；KronmanC.；FlashnerY.；Leitner；GrosfeldH.；OrdentlichA.；GazesH.；CohenS.；ArielN.；BarakD.；HareM.；SilmanI.；SussmanJ.L.；VelaB.J.Biol.Chem.1992,267,17640-17648)。hAChE抑制剂与多肽支架的缀合因此需要可比较长度的间隔团以便能够使活性部位抑制剂和多肽同时结合于它们的独特结合表位。这种多肽缀合物的设计因此包括选择合适的间隔团和间隔团与配体连接的合适位点。脂族间隔团将预期在该腔内良好结合，所述腔因疏水相互作用而产生活性部位，但是

脂族链的的疏水性也带来关于溶解度的顾虑。另外，使支架和抑制剂组合的熵优势可能并不如较短间隔团那样大。

使用本发明的16种多肽序列集合(图1)。每种多肽的总电荷在4个步骤中从-7至+2变动，并且变动的残基均处于暴露于溶剂的位置内。用于连接配体的赖氨酸残基处于位置8、17、22和34内，以分别允许在螺旋I的始端、在螺旋I的末端和在环内并在螺旋II的中部并入。

通过缀合7-甲氧基香豆素-3-羧酸与选择性去保护的赖氨酸残基的侧链(即分别在位置10、15、25和37内的赖氨酸残基)，将每种多肽用报道基团(即香豆素探针)修饰。这种荧光团使测量与靶分子的结合成为可能，因为与蛋白质结合时，荧光强度受分子环境的变化影响。

9-氨基吖啶配体是充分研究的活性部位抑制剂ShaffermanA.；KronmanC.；FlashnerY.；Leitner；GrosfeldH.；OrdentlichA.；GazesH；CohenS.；ArielN.；BarakD.；HareM.；SilmanI.；SussmanJ.L.；VelaB.J.Biol.Chem.1992,267,17640-17648.Olofsson,S.；Johansson,G.；Baltzer,L.J.Chem.Soc.,PerkinTrans.21995,2047-56.Olofsson,S.；Baltzer,L.Fold.Des.1996,1,347-356.Andersson,L.；Stenhagen,G.；Baltzer,L.J.Org.Chem.1998,63,1366-1367.Broo,K.S.；Brive,L.；Ahlberg,P.；Baltzer,L.J.Am.Chem.Soc.1997,119,11362-11372)。对hAChE晶体结构的观察揭示，活性部位深埋于蛋白质中的

深袋状物内(Dupre，D.J.；Robinson,F.A.J.Chem.Soc.1945,549-51)。因此，间隔团将必须能够容纳可能在蛋白质表面上结合表位的多肽和可能在活性部位结合的吖啶残基，它们彼此相距如果仅考虑靶亲和力，则这种间隔团将优选地脂族的。然而，亚甲基多于15个的脂族间隔团具有这种水平的疏水性，其中它在合成时以及在多肽缀合时造成溶解度问题，并且构建这种具有改进溶解度特性的长间隔团的替代方式将是以两个区段制备它，极性基团处于中部。

多肽缀合物结合物和蛋白质之间的复合物的高分辨率结构仍是不可获得的，并且控制结合的确切相互作用可能仅是猜测性的。虽然，直观上这种抑制剂将预期在活性部位内结合，一种意境在人碳酸酐酶II(Perry,E.K.；Tomlinson,B.E.；Blessed,G.；Bergmann,K.；Gibson,P.H.；Perry,R.H.British Medical Journal,1978,2,1457-1459)和C-反应蛋白(Talesa,V.N.Mechanisms of Ageing and Development 2001,122,1961-1969)的情况下得到验证的假设，但是多肽和蛋白质之间的相互作用仍是假定性的。仅在间隔团相容于多肽和战斗部的同时结合，同时没有迫使间隔团成为高能构象或使活性部位的战斗部脱离的情况下，缀合物才紧密结合。归因于难以精确预测的e多肽支架结合表位，间隔团策略将不得不在尺寸方面允许一些灵活性。通过合成6-氨基己酸和8-氨基辛酸的全部4种组合制备与多肽缀合的间隔团(方案1)。

除提供3种不同的间隔团长度之外，也获得间隔团的中等长度酰胺基的两个不同位置。虽然预期最短的间隔团将产生最高选择性，但是合成了全部4种间隔团，因为不可能从hAChE的晶体结构预测最佳间隔团长度并且因为它们可能在未来应用中有意义。为了促进配体与多肽的快速和位点特异性缀合，制备由仅一个游离赖氨酸残基和配体组成的序列作为活化酯。

如方案1中所显示那样合成配体-间隔团组合9、10、11和12。

方案1.a)i.SOCl2、无水苯、N2，Δii.苯酚，K2CO3、无水DMF、N2，Δ.b)6-氨基己酸或8-氨基辛酸，无水DMF、N2，Δ.c)i.DIPEA、HATU，ii.6-氨基己酸或8-氨基辛酸、N2、无水DMF，室温，d)i.Et3N，ii.4-硝基苯基氯甲酸酯，0℃，iii.DMAP，0℃至室温，MeCN。

参考方案1，如文献(Dupre,D.J.;Robinson,F.A.J.Chem.Soc.1945,549-51.Ghaneolhosseini，H.；Tjarks，W.；

S.Tetrahedron1998,54,3877-3884)中报道那样，通过原位形成9-氯吖啶，随后用苯酚进行芳族亲核性取代，合成9-苯氧基吖啶(2)9-苯氧基吖啶(2)与6-氨基己酸或8-氨基辛酸反应以分别形成3或4。HATU是6-氨基己酸或8-氨基辛酸与3或4中的羧酸官能团之间最有效的偶联试剂以产生化合物5、6、7和8。通过搅拌相应的酸与HATU和DIPEA持续大约1小时，预活化这些羧酸。1.1-1.5当量的HATU是使未反应原料最小化和偶联第二胺的最好折中。利用用于其他羧酸的文献方法，将酸5、6、7和8活化为它们的对硝基苯酚酯(Gagnon,P.；Huang,X.；Therrien,E.；Keillor,J.W.Tetrahedron Lett.2002,43,7717-7719)。为了使酯水解最小化，在HPLC纯化后，将含有的产物的部分在N₂(l)中直接冷冻并且随后通过冻干除去溶剂。

因此，以下配体-间隔团部分与以下多肽的赖氨酸连接：

hAChE的多肽缀合物结合物的鉴定和亲和力

活性酯9与本发明的这组16种多肽的每个成员偶联，并且在筛选方法中估计每个成员对hAChE的亲和力。每种多肽结合物候选溶解于pH7.0的50mM磷酸钠缓冲液中并且添加蛋白质后分配至微量滴定平板的9个孔中以产生终浓度500nM。把来自母液的hAChE等分试样添加至3个孔，以产生最终蛋白质浓度500nM，并且添加至另外3个孔以产生最终蛋白质浓度1000nM。总而言之，每种结合物以3个步骤滴定，并且每个测量一式三份实施。与没有蛋白质时结合物的强度相比，向其添加第一蛋白质等同物的结合物导致强度显著差异，并且在第二蛋白质等同物存在时，强度没有导致任何进一步的强度变化，假定所述结合物在第一次添加蛋白质后被复合超过90%。在这种假设下，可以估计10nM或更小的解离常数K_d，并且将满足这些标准的结合物视为一个“命中”。选择多肽4-C10L17-Ac(4-C10L17在C端酰化)以便在这种筛选方法中进一步评价选择性，并且显示多肽至9-氨基吖啶的缀合已经产生具有亲和力比这种小分子的亲和力更高的结合物。使用微量滴定平板读数仪在298K测量荧光强度，在在350nm激发并在420nm发射。

通过监测对来自脑脊液(CSF)的hAChE的捕获确定4-C10L17-Ac，其中所述脑脊液从乌普萨拉大学医院获得。CSF代表几种其他蛋白以高浓度存在的复杂生物环境和就未来应用而言一种意义巨大的生物环境。将选择的结合物再合成，所述结合物在位置24具有乙酰氨基甲基-(Acm-)保护的Cys残基替代这个位置中的Ala，并且在Acm脱保护后，通过形成二硫键与

包被的聚苯乙烯纳米粒子连接。这种涂敷物质形成配备活化二硫化基团的单层PEG，所述二硫化基团在释放2-巯基吡啶下与游离巯基自发反应。将官能化的纳米粒子在CSF中温育1小时并且离心，此后移除上清液。通过在缓冲液中温育随后离心并移除上清液，将粒子洗涤3次。在洗涤步骤后，通过ELISA和凝胶电泳分析粒子。对于SDS-PAGE分析，将结合物使用二硫苏糖醇从粒子切下并通过离心与粒子分开。将上清液施加至电泳凝胶。不幸地，来自hAChE的条带不能与来自以高浓度存在并且非特异性吸附于聚苯乙烯珠的人血清白蛋白(HSA)的条带分开(图2)。在对照实验中通过SDS-PAGE展示HSA吸附，在对照实验中，将非功能化的珠与对结合物缀合物所述相同的患者CSF温育并且以相同方式处理。

也通过基于发光的纳米粒子ELISA分析4-C10L17-Ac对hAChE的捕获。在ELISA实验中，将等分试样的洗涤粒子与针对hAChE的多克隆抗体温育，所述多克隆抗体已经与辣根过氧化物酶预先缀合。在3个洗涤步骤后，添加底物鲁米诺并且记录所得到的发光信号。作为参考，无结合物的粒子在来自相同患者的CSF中温育并且以与具有结合物的粒子相同的方式处理。根据夹心ELISA，与结合物缀合的粒子捕获hAChE，并且显示4-C10L17-Ac可以与CSF中存在的全部蛋白质相竞争地从CSF选择性提取hAChE(图2)。也从来自参考粒子的上清液获得信号，不过官能化珠的信号弱得多。这种背景信号可以归因于高水平的可能难以彻底除去的所用抗体缀合物。结果显示，选择性地从收集自患者的CSF提取hAChE，并且结合物4-C10L17-Ac在其中存在来自高浓度蛋白质(如HSA)和CSF内全部其他蛋白质的强大竞争的测量环境下具有高亲和力和选择性。

结论

9-氨基吖啶与一组多肽支架的每个成员的缀合已经导致可以获得对hAChE具有高亲和力和选择性的结合物4-C10L17-Ac。诸项特性与抗体的那些特性可比较，虽然其大小仅是IgY的1/30。结果显示可以使用酶的小分子抑制剂以发育结合物，其中所述酶具有埋入的结合袋。

实验

概述

纯化的人乙酰胆碱酯酶从SigmaAldrich购买。

¹HNMR谱在CDCl₃(7.26ppm)、CD₃OD(3.31ppm)、CD₃CN:D₂O9:1(1.94ppm)、丙酮-d₆(2.05ppm)或DMSO-d₆(2.50ppm)中在499.9MHz处运行的VarianUnityInova500谱仪上记录。¹³CNMR谱在CDCl₃(77.0ppm)、CD₃OD(49.0ppm)、CD₃CN:D₂O9:1(1.32ppm)、丙酮-d₆(29.84ppm)或DMSO-d₆(39.52ppm)中在100.6MHz处运行的VarianUnity400谱仪上记录。全部波谱在25℃记录。方案2中显示在NMR谱赋值时所用的编号。将Merck硅凝胶60(230-400目)用于快速层析。使用Merck二氧化硅60F₂₅₄凝胶进行TLC。将TLC或分析性HPLC-MS用来监测反应。在配备FinniganAQAThermoquest和SEDEX85LT-ELSD的Gilsone上实施分析性反相HPLC-MS。使用Phenomenex GeminiC18柱(5μm，

150×3.0mm)并使用H₂O+0.1%HCO₂H/MeCN+0.1%HCO₂H作为分析性HPLC的流动相，使用流速1mL/分钟。在使用Phenomenex LunaC8柱(5μm，

250×30.0mm)的Gilson上实施制备性反相HPLC。使用H₂O+0.05%HCO₂H/MeCN+0.05%HCO₂H或H₂O+0.1%TFA/MeCN+0.1%TFA作为制备性HPLC的流动相，使用流速30mL/分钟。对于冷冻干燥，使用HetoLyolab300。使用标准方法干燥DMF和苯(Perrin,D.D.；Armarego,W.L.F.Purification of Laboratory Chemicals；第3版；Pergamon Press:Oxford,1992)。

配体的合成

9-苯氧基吖啶(2)将无水苯(450mL)在N₂气氛下添加至1.50g吖啶酮(1当量)。添加SOCl₂(3.37mL，6当量)并且使反应混合物回流过夜，随后通过蒸发移除溶剂。在N₂气氛下添加无水DMF(75mL)，苯酚(2.17g，3当量)和K₂CO₃(4.26g，3当量)。将反应在60℃搅拌3.5日。在过滤和蒸发后，使用快速层析(CH₂Cl₂至CH₂Cl₂:Et₂O,6:1)纯化粗产物，产生2.04g的2,98%产率。1HNMR(CDCl₃)：8.28(5+4,brddd,J=8.9,1.1,0.8Hz,2H),8.11(8+1,ddd,J=8.7,1.3,0.8Hz,2H),7.79(6+3,ddd,J=8.9,6.6,1.3Hz,2H),7.47(7+2,ddd,J=8.7,6.6,1.1Hz,2H),7.28(2'+4',m,2H),7.06(3',m,1H),6.86(1'+5',m,2H).3.40(6,m,2H)。

6-(9'-吖啶基氨基)己酸(3)将溶解于15mL无水DMF中的9-苯氧基吖啶(2)(0.099g，1当量)在N₂下添加至溶解于50mL无水DMF中的6-氨基己酸(0.617g，12当量)。将反应混合物在70℃加热2日并在100℃加热1日。在冷却至室温(rt)后，蒸发溶剂。使用MeCN/H₂O+0.1%TFA，从25%至30%MeCN的35分钟梯度，通过RP-HPLC纯化粗产物，产生0.148g3，产率76%。¹HNMR(CD₃OD)：8.34(8+1,brddd,J=8.3,1.2,>0.9Hz,2H),7.84(6+3,ddd,8.4,6.9,1.2Hz,2H),7.68(5+4,br ddd,8.4,0.9,<0.9Hz,2H),7.45(7+2,ddd,J=8.3,6.9,0.9Hz,2H),4.03(1',brt,2H),2.32(5',t,J=7.3Hz,2H),1.95(2',qui,J=7.3Hz,2H),1.68(4',qui,J=7.3Hz,2H),1.50(3',qui,J=7.3Hz,2H)。¹³CNMR(DMSO-d₆)：175.0,157.7,139.6,135.5,123.8,118.7,112.3,48.9,33.8,28.9,26.1,24.4。

8-(9'-吖啶基氨基)辛酸(4)将溶解于25mL无水DMF中的9-苯氧基吖啶(2)(0.218g，1当量)在N₂下添加至溶解于25mL无水DMF中的8-氨基辛酸(1.580g，12当量)。将反应混合物在100℃加热2日。在冷却至室温后，蒸发溶剂。使用H₂Cl₂:MeOH:HCl6:1:0.007，通过快速层析纯化粗产物，产生0.271g4，产率66%。¹HNMR(CD₃OD)：8.46(8+1,ddd,J=8.8,1.3,0.6Hz,2H),7.92(6+3,ddd,J=8.6,6.9,1.3Hz,2H),7.79(5+4,ddd,J=8.6,1.2,0.6Hz,2H),7.53(7+2,ddd,J=8.8,6.9,1.2Hz,2H),4.11(1',brt,2H),2.26(7',t,J=7.4Hz.,2H),1.98(2',m,2H),1.58(6',m,2H),1.47(3',m,2H),1.44-1.31(4'+5',m,4H)。¹³CNMR(CD₃OD)：177.5,159.4,141.0,136.3,124.9,119.5,113.7,50.4,34.8,30.5,30.0,29.9,27.6,25.9。

6-[6'-(9''-吖啶基氨基)己酰氨基]己酸(5)6-('9-吖啶基氨基)己酸(3)(0.026g，1当量)在N₂下溶解于6mL无水DMF中。添加DIPEA(68μL，8当量)和HATU(0.029g，1.5当量)并且将反应混合物在室温搅拌约1小时。添加6-氨基己酸(0.013g，2当量)并且将反应混合物搅拌额外18小时。添加H₂O(2mL)，随后通过蒸发移除溶剂。使用MeCN/H₂O+0.05%HCO₂H，从15%至18%MeCN的30分钟梯度，通过RP-HPLC纯化粗产物，产生11.4mg5，产率56%。¹HNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：8.35(8+1,ddd,J=8.6,1.2,0.6Hz,2H),7.89(6+3,ddd,J=8.5,6.9,1.2Hz,2H),7.75(5+4,ddd,J=8.5,1.1,0.6Hz,2H),7.49(7+2,ddd,J=8.6,6.9,1.1Hz,2H),4.04(1',brt,2H),3.04(7',t,J=6.9Hz,2H),2.36(11',brm,2H),2.12(5',t,J=7.3Hz,2H),1.91(2',m(部分地在溶剂下),2H),1.59(4',qui,J=7.3Hz,2H),1.50(10',brm,2H),1.44-1.32(3'+8',m,4H),1.23(9',brm,2H)。¹³CNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：175.3,159.2,140.9,136.3,126.5,124.8,119.6,113.5,50.1,39.9,36.6,29.9,29.7,27.2,26.9,26.0。

8-[6'-(9''-吖啶基氨基)己酰氨基]辛酸(6)6-('9-吖啶基氨基)己酸(3)(0.022g，1当量)在N₂下溶解于6mL无水DMF中。添加DIPEA(56μL，8当量)和HATU(0.024g，1.5当量)并且将反应混合物在室温搅拌约1小时。添加8-氨基己酸(0.013g，2当量)并且将反应混合物搅拌额外18小时。添加H₂O(1mL)，随后通过蒸发移除溶剂。使用MeCN/H₂O+0.1%TFA，从25%至40%MeCN的30分钟梯度，通过RP-HPLC纯化粗产物，产生12mg6，产率44%。¹HNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：8.36(8+1,ddd,J=8.7,1.2,0.6Hz,2H),7.90(6+3,ddd,J=8.6,6.9,1.2Hz,2H),7.76(5+4,ddd,J=8.6,1.2,0.6Hz,2H),7.50(7+2,ddd,J=8.7,6.9,1.2Hz,2H),4.04(1',brt,2H),3.04(7',t,J=7.0Hz,2H),2.20(13',t,J=7.3Hz,2H),2.13(5',t,J=7.3Hz,2H),1.91(2',m,2H),1.60(4',m,2H),1.47(12',m,2H),1.40(3',m,2H),1.35(8',m,2H),1.25-1.16(11'+10'+9',m,6H)。¹³CNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：177.1,175.3,159.3,140.8,136.4,126.5,124.9,119.6,113.3,50.1,40.0,36.6,34.7,29.93,29.90,29.6,29.5,27.3,26.9,26.0,25.6。

6-[8'-(9''-吖啶基氨基)辛酰氨基]己酸(7)8-('9-吖啶基氨基)辛酸(4)(0.029g，1当量)在N₂下溶解于17mL无水DMF中。添加DIPEA(71μL，8当量)和HATU(0.025g，1.1当量)并且将反应混合物在室温搅拌约1小时。添加8-氨基己酸(0.015g，2当量)并且将反应混合物搅拌额外3小时。添加H₂O(2mL)，随后通过蒸发移除溶剂。使用MeCN/H₂O+0.1%TFA，30分钟均等30%MeCN，通过RP-HPLC纯化粗产物，产生7.3mg7，产率21%。¹HNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：8.36(8+1,ddd,J=8.7,1.2,0.5Hz,2H),7.90(6+3,ddd,J=8.6,6.9,1.2Hz,2H),7.76(5+4,ddd,J=8.6,1.2,0.5Hz,2H),7.50(7+2,ddd,J=8.7,6.9,1.2Hz,2H),4.04(1',brt,2H),3.06(9',t,J=7.0Hz,2H),2.23(13',t,J=7.4Hz,2H),2.07(7',t,J=7.4Hz,2H),1.89(2',m,2H),1.55-1.45(12'+6',m,4H),1.44-1.36(10'+3',m,4H),1.32(4',m,2H),1.29-1.19(11'+5',m,4H)。¹³CNMR(CD₃CN:D₂O9:1)：177.0,175.5,159.3,140.7,136.4,126.4,124.9,119.6,113.5,50.2,39.8,36.9,34.6,30.2,29.7,29.6,29.4,27.2,27.0,26.4,25.3。

8-[8'-(9''-吖啶基氨基)辛酰氨基]辛酸(8)通过添加K₂CO₃(0.015g，2当量)至溶解于约5mLMeOH中的4(0.012g，1当量)随后搅拌5分钟除去TFA盐。滤出沉淀物并且通过蒸发除去溶剂。在N₂下添加无水DMF(25mL)。添加DIPEA(32μL，5当量)和HATU(0.022g，1.5当量)并且将反应混合物在室温搅拌约1小时。添加8-氨基辛酸(0.013g，2当量)并且将反应混合物搅拌额外3小时。添加H₂O(2mL)，随后通过蒸发移除溶剂。使用MeCN/H₂O+0.1%TFA，从30%至40%MeCN的30分钟梯度，通过RP-HPLC纯化粗产物，产生8.9mg8，产率58%。¹HNMR(CD₃OD)：8.52(2×HCO₂H,brs,2H),8.50(8+1,ddd,J=8.7,1.2,0.6Hz,2H),7.96(6+3,ddd,J=8.6,6.9,1.2Hz,2H),7.82(5+4,ddd,J=8.6,1.2,0.6Hz,2H),7.57(7+2,ddd,J=8.7,6.9,1.2Hz,2H),4.15(1',brt,2H),3.13(9',t,J=7.0Hz,2H),3.22(15',t,J=7.5Hz,2H),2.16(7',t,J=7.3Hz,2H),1.98(2',m,2H),1.63-1.53(6'+14',m,4H),1.53-1.38(3'+12'+10'+4',m,8H),1.38-1.28(5'+11'+13',m,6H)。¹³CNMR(CD₃OD)：179.0,176.0,159.6,141.4,136.3,126.6,124.9,119.7,114.0,50.5,40.3,37.2,37.0,30.6,30.4,30.3,30.1,29.94,29.90,27.8,27.7,26.8,26.4。

6-[6'-(9''-吖啶基氨基)己酰氨基]己酸对硝基苯酯(9)将5(11.4mg，1当量)溶解于约10mLMeCN中，随后添加Et₃N(4.15μL，1.1当量)。反应混合物冷却至0℃。添加氯甲酸4-硝基苯酯(6.2mg，1.1当量)，在搅拌5分钟后添加DMAP(0.7mg，0.2当量)并且移去冷却浴。将反应在室搅拌3.5小时。将反应混合物经一团玻璃棉过滤并且直接注射在RP-HPLC上，使用MeCN/H₂O+0.05%HCO₂H，从25%至35%MeCN的30分钟。在洗脱后，在N₂(l)中直接冷冻含有产物的级分，通过冻干除去溶剂，产生6.3mg9，产率43%。¹HNMR(丙酮-d₆)：8.35-8.27(8+1+3''+5'',m,4H),7.76-7.60(5+4+酰胺+6+3,m,5H),7.42(2''+6'',m,2H),7.30(7+2,brddd,J=8.7,6.6,<0.9Hz,2H),3.82(1',brt,J=Hz,2H),3.01(7',m,2H),2.60(11',t,J=7.4Hz,2H),2.02(5',t,J=7.4Hz,2H),1.74(2',m,2H),1.62(10',m,2H),1.51(4',m,2H),1.39(8',m,2H),1.36-1.28(9'+3'',m,2H)。¹³CNMR(丙酮-d₆)：171.8,171.1,155.4,152.3,145.0,130.4,125.3,125.1,123.2,121.6,50.2,38.0,35.4,33.4,30.6,28.8,26.2,25.7,25.1,23.8。未找到5a+4a、8a+9a，这归因于¹³CNMR谱中的宽共振和低信噪比。

8-[6'-(9''-吖啶基氨基)己酰氨基]辛酸对硝基苯酯(10)通过添加K₂CO₃(2.6mg，2当量)至溶解于约5mLMeOH中的6(6.6mg，1当量)随后搅拌5分钟除去TFA盐。滤出沉淀物并且通过蒸发除去溶剂。添加MeCN(约10mL)至烧瓶，随后添加E_t3N(1.5μL，1.1当量)。反应混合物冷却至0℃。添加氯甲酸4-硝基苯酯(2.7mg，1.1当量)，在搅拌5分钟后添加DMAP(0.4mg，0.2当量)并且移去冷却浴。将反应在室温搅拌4小时。将反应混合物经一团玻璃棉过滤并且直接注射在RP-HPLC上，使用MeCN/H₂O+0.05%HCO₂H，从25%至41%MeCN的30分钟。在洗脱后，在N₂(l)中直接冷冻含有产物的级分，通过冻干除去溶剂，产生3.7mg10，产率57%。¹HNMR(丙酮-d₆)：8.44(8+1,unresddd,J=8.6,1.2,<0.9Hz,2H),8.31(3''+5'',m,.2H),7.90(5+4,unresddd,J=8.6,0.9,<0.9Hz,2H),7.72(6+3,ddd,J=8.6,6.6,1.2Hz,2H),7.43(2''+6'',m,2H),7.40(7+2,ddd,J=8.6,6.6,0.9Hz,2H),7.01(酰胺,部分交换的1H),4.00(1',brt,J=Hz,2H),3.18(7',m,2H),2.63(13',t,J=7.4Hz,2H),2.16(5',t,J=7.3Hz,2H),1.92(2',m,2H),1.72(12',m,2H),1.66(4',m,2H),1.54-1.45(3'+8',m,4H),1.45-1.27(10'+11'+9',m,6H)。¹³CNMR(丙酮-d₆)：172.8,171.9,156.8,154.2,147.3,146.3,131.7,126.6,125.9,125.4,123.9,123.3,117.0,51.3,39.6,36.5,34.5,31.4,30.4,29.62,29.58,27.6,27.2,25.9,25.3。

6-[8'-(9''-吖啶基氨基)辛酰氨基]己酸对硝基苯酯(11)。通过添加K₂CO₃(2.8mg，2当量)至溶解于约5mLMeOH中的7(6.8mg，1当量)随后搅拌5分钟除去TFA盐。滤出沉淀物并且通过蒸发除去溶剂。添加MeCN(约10mL)至烧瓶，随后添加E_t3N(1.5μL，1.1当量)。反应混合物冷却至0℃。添加氯甲酸4-硝基苯酯(2.8mg，1.1当量)，在搅拌5分钟后添加DMAP(0.4mg，0.2当量)并且移去冷却浴。将反应在室温搅拌4.5小时。将反应混合物经一团玻璃棉过滤并且直接注射在RP-HPLC上，使用MeCN/H₂O+0.05%HCO₂H，从25%至40%MeCN的30分钟。在洗脱后，在N₂(l)中直接冷冻含有产物的级分，通过冻干除去溶剂，产生2.5mg11，产率38%。¹HNMR(丙酮-d₆)：8.35(8+1,brddd,J=8.7,1.3,0.6Hz,2H),8.30(3''+5'',m,2H),7.87(5+4,brddd,J=8.7,1.3,0.6Hz,2H),7.64(6+3,ddd,J=8.7,6.6,1.3Hz,2H),7.42(2''+6'',m,2H),7.34(7+2,ddd,J=8.7,6.6,1.3Hz,2H),6.96(酰胺，部分交换的1H),3.91(1',brt,J=Hz,2H),3.18(9',m,2H),2.64(13',t,J=7.4Hz,2H),2.07(7',部分地在溶剂下,2H),1.84(2',m,2H),1.74(12',m,2H),1.58-1.49(6'+10',m,4H),1.48-1.40(11'+3',m,4H),1.35-1.25(5'+4',m,2H)。¹³CNMR(丙酮-d₆)：172.7,171.8,152.9,156.7,149.0,146.2,130.6,125.9,125.1,125.0,123.9,123.0,117.8,51.6,39.4,36.7,34.5,32.1,30.2,29.80,29.79,27.5,27.0,26.3,25.1。

8-[8'-(9''-吖啶基氨基)辛酰氨基]辛酸对硝基苯酯(12)。通过添加K₂CO₃(6.7mg，2当量)至溶解于约5mLMeOH中的8(13.7mg，1当量)随后搅拌5分钟除去TFA盐。滤出沉淀物并且通过蒸发除去溶剂。添加MeCN(约15mL)至烧瓶，随后添加E_t3N(3.7μL，1.1当量)。反应混合物冷却至0℃。添加氯甲酸4-硝基苯酯(6.0mg，1.1当量)，在搅拌5分钟后添加DMAP(0.6mg，0.2当量)并且移去冷却浴。将反应在室温搅拌3小时。使用MeCN/H₂O+0.05%HCO₂H，从25%至50%MeCN的25分钟梯度，通过RP-HPLC纯化粗产物。在洗脱后，在N₂(l)中直接冷冻含有产物的级分，通过冻干除去溶剂，产生4.4mg12，产率26%。¹HNMR(DMSO-d₆)：8.43(8+1,unresddd,2H),8.28(3''+5'',m,2H),7.86-7.75(6+3+5+4,m,4H),7.69(酰胺,brt,J=5.6Hz,1H),7.44(7+2,unresddd,2H),7.41(2''+6'',m,2H),3.95(1',brt,2H),3.00(9',dt,J=7.1,5.6Hz,2H),2.61(15',t,J=7.4Hz,2H),2.01(7',t,J=7.4Hz,2H),1.81(2',m,2H),1.62(14',m,2H),1.45(6',m,2H),1.40-1.15(3'+10'+4'+11'+12'+13'+5',m,14H)。¹³CNMR(DMSO-d₆)：171.8,171.1,155.3,155.1,144.9,142.5,133.0,125.4,125.2,123.1,122.6,114.1,49.4,38.3,35.4,33.4,29.6,29.1,28.5,28.4,28.30,28.25,26.20,26.16,25.2,24.0。

肽的合成

使用标准芴基甲氧羰基(Fmoc)化学，以O-(7-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟硼酸盐(HBTU，Iris Biotech GmbH)和二异丙基乙胺(DIPEA，Aldrich)作为活化剂在Pioneer自动化肽合成仪上合成肽。使用DMF中的20%哌啶进行氨基端的Fmoc脱保护。在每次偶联中使用Fmoc-甘氨酸-聚乙二醇-聚苯乙烯(Fmoc-Gly-PEG-PS)树脂和4倍过量的氨基酸，以0.2mmol规模进行合成。氨基酸的侧链(Calbiochem-NovabiochemAG，Iris Biotech GmbH)由碱稳定基团保护：叔丁酯(Asp、Glu)，三苯甲基(His、Asn；Gln)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Arg)。使用赖氨酸残基的正交保护以便能够进行选择性脱保护，随后连接荧光探针。其中荧光团将与之缀合的赖氨酸残基受烯丙氧羰基(Alloc)保护，而其中配体将与之缀合的赖氨酸残基受叔丁氧羰基(Boc)保护。使用DMF中的0.5M乙酸酐使N-'末端乙酰化。

通过DCM、乙酸和N-甲基吗啉(比率37:2:1v/v；每克树脂10mL)的四(三苯基膦)钯(0))(Pd(PPh₃)₄，2当量)在室温在N₂下处理树脂用2小时，进行Alloc基团的脱保护。随后使用DMF中的0.5%DIPEA和DMF中的0.5%v/v二乙基二硫代氨基甲酸洗涤树脂。在DMF中在室温伴以温和搅拌进行7-甲氧基香豆素-3-羧酸(3当量)与赖氨酸残基的偶联2小时。使用偶联混合物活化香豆素，所述偶联混合物由比率12:6:6的DIPEA、1-羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)组成。在2小时后，添加偶联混合物的另一个等分试样并留下反应过夜。在所有情况下，在脱保护和偶联之间用DMF和DCM洗涤树脂。通过添加TFA、水和TIS(95:2.5:2.5v/v，每克聚合物10mL)在室温持续3小时实现总体脱保护和从树脂中切下。在过滤和浓缩后，通过添加冷二乙醚、离心、在二乙醚中洗涤和晾干，使肽析出。

粗制肽通过使用半制备性HypersilC-18Gold柱(150×20mm，孔径

粒度

)的反相HPLC或用水中浅35-55%乙腈梯度和0.1%TFA作为添加物以10mL/分钟流速洗脱的半制备性Kromasil C8Hichrom柱(250×21.2mm，孔径

粒度

)纯化。收集的级分通过MALDI-TOF质谱法(Bruker Daltonics Ultraflex II TOF/TOF)鉴定、浓缩并且冻干2次。

通过添加溶解于DMSO(约0.1M)中的相应酯(3-5当量)至DMSO中的2mM多肽溶液，以1%DIPEA作为添加物，使配体与多肽缀合。将反应留在室温12至48小时，随后经历分析性HPLC和MALDI-TOF。将GenesisC-18柱(250×4.6mm，孔径

粒度)用于分析性HPLC。使用以下梯度：90分钟范围内水中的30-60%乙腈和0.1%TFA作为添加物，流速1mL/分钟。缀合的多肽在荧光筛选中使用，无需进一步纯化，而在其他反应步骤(例如Acm脱保护)的情况下，它们通过在冷甲基醚中沉淀进行纯化、再溶解于三氟乙酸中并且利用冷甲基-叔丁基醚来沉淀、收集并且晾干。

合成在位置24具有Acm保护的半胱氨酸的结合物以便能够与纳米粒子连接。通过用Silver三氟甲磺酸酯(AgOTf)处理除去Acm基团。将肽(2mg，0.3μmol)溶解于0.5mLTFA/茴香醚(99:1)中。将Silver三氟甲磺酸酯(10mg，100当量)添加至溶液并且将混合物在0°C搅拌1小时随后在室温搅拌2至12小时。使用冷二乙醚使肽银盐析出并将其离心。移去上清液并且将剩余的肽银盐与水中50%(v/v)乙酸内的二硫苏糖醇(DTT)(50当量)一起在室温搅拌2至12小时。将混合物离心，并将上清液溶液通过HPLC纯化，随后冻干。

荧光测量

使用SpectraMax GeminiXPS平板读数仪，用人AChE进行多肽的滴定。在使用之前，NUNC^TM聚苯乙烯384平板用

Prill泊洛沙姆338(BASF)和多肽包被；将平板在5%的Pluronics水溶液中温育过夜，随后用水彻底洗涤，此后与0.4mg/mL封闭肽溶液温育。使用90μL中的500nM多肽浓度并通过用50mM磷酸钾缓冲液pH7.0从母液(浓度2mM)稀释获得这种浓度。通过添加等分试样的1当量和2当量酶，滴定多肽。在添加酶后，使平板平衡20分钟。在350nm激发香豆素荧光团并且在370-450nm记录发射。通过添加相同体积的缓冲液替代酶溶液，产生每种多肽的一份空白。在不添加任何物质时，也产生每种多肽的一份空白。

与聚苯乙烯纳米粒子的缀合和从CSF提取。

通过将2%(w/v)粒子悬液与10mg/ml Pluronic F108-PDS在室温在恒定振摇下温育过夜，使Pluronic F108-PDS(Allvivo Inc)。吸附于聚苯乙烯乳胶纳米粒子(Bangs laboratories Inc)。在吸附后，通过使用Eppendorff桌面型离心机以14000转/分钟离心5分钟，使得过量的表面活性剂与包被的粒子分离。移去上清液并且使粒子重悬于10mMHepes缓冲液pH7.4中。在添加作为10mMHepes缓冲液pH7.4中1mg/mL溶液的半胱氨酸去保护的多肽缀合物之前，将这个洗涤过程重复3次。任由反应混合物温和振摇1至12小时。随后将纳米粒子用缓冲液洗涤三次并重悬于100μL缓冲液中并随后与200至500μL脑脊液(来自乌普萨拉大学医院)在室温温育，伴以温和振摇。在1小时后，将混合物离心并移除上清液并且将粒子用缓冲液洗涤三次。将纳米粒子分成两份，其中1份用于ELISA(见下文)和1份如下处理：将结合物连同它们捕获的蛋白质通过使用Hepes缓冲液pH7.4中的50mMDTT还原性裂解从粒子切下，随后离心(14000转/分钟，5分钟)以便从样品中除去粒子。使用

Bis-Tris4-12%(v/w)凝胶和MES运行缓冲液(Invitrogen)，通过梯度SDS-PAGE凝胶电泳分析8μL等分试样上清液。在电泳后，将凝胶在100mL固定缓冲液(40%乙醇，10%乙酸)中固定并且使用SilverQuest^TM银染试剂盒(Invitrogen)银染，或在100mL固定缓冲液(35%甲醇，10%乙酸)中固定并且使用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen)染色。

制备用于ELISA的抗体-酶缀合物

将10μL等分试样的20mM6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)(Thermo Scientific)添加至0.5mg辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma)并且在室温温育30分钟。通过使用NAP5柱(GEHealthcare)脱盐除去过量试剂。将额外的10μL等分试样的LC-SPDP添加至0.5mL抗AChE羊多克隆IgG抗体(1mg/mL，Abcam)并且将混合物温育30分钟，随后是使用NAP5柱的脱盐步骤。随后将部分(0.5mL)的所得到溶液用DTT(25μL0.25MDTT在室温20分钟)还原，再次脱盐(NAP5柱)并立即转移至LC-SPDP-修饰的HRP。允许缀合在室温继续进行1小时。

ELISA

也在ELISA中分析通过纳米粒子上固定的结合物从CSF捕获的hAChE的存在。通过在CSF中温育和后续洗涤后取出15μL粒子悬液，做到这点。作为参考，使用以Pluronic F108包被但不含结合物的相同量的粒子。将稀释的缀合物(20μL)添加至两种粒子悬液并温育20分钟。通过如上节中所述洗涤粒子4次除去未结合的缀合物，并且粒子最终重悬于100μL PBS中。在添加100μL底物(50/50鲁米诺+增进剂和过氧化物，Thermo Fisher)后，发光在SpectraMax Gemeni XPS平板读数仪中在425nm处呈红色。

实施例2

在实施例1中，使用碳酸酐酶II(HCAII)作为靶分子。

设计和合成

用来结合HCA的小分子战斗部是苯磺酰胺羧酸，一种HCAI和HCAII抑制剂，对于HCAI，解离常数Kd为1.1-3.9μM(DeGrado,W.F.,Summa,C.M.,Pavone,V.,Nastri,F.和Lombardi.A.Ann.Rev.Biochem.68,779-819(1999).Jeckling,M.C.；Schauer,S.；Dumelin,C.E.；Zenobi,R.J.Mol.Recognit.2009；22:319-329)并且对于HCAII，为1.3-1.5μM(Enander,K.；Dolphin,G.T.；Liedberg,B.；

Baltzer,LChemEurJ,2004,10,2375-2385.Baltzer,L.Topics in Current Chemistry2007,277,89-106.DeGrado,W.F.,Summa,C.M.,Pavone,V.,Nastri,F.和Lombardi.A.Ann.Rev.Biochem.68,779-819(1999))。它经氨基己酸间隔团与本发明的多肽连接，其中所述氨基己酸间隔团已经先前显示允许苯磺酰胺残基和支架序列KE2协调地与HCAII相互作用(Krebs,H.A.Biochem.J.1948,43,525-528)(图3)。假定抑制剂苯磺酰胺将与HCAII的活性部位结合并且多肽支架将与蛋白质的表面结合。折叠的多肽不嵌入HCAII的结合袋并且不得不与表面残基相互作用。当这种小分子和多肽支架同时结合时，总亲和力比单独小分子的亲和力高几个数量级，因此为寻找蛋白质的高亲和力结合物提供便利途径。

多肽由自动化固相肽合成法、根据标准Fmoc操作方案合成，通过反相HPLC纯化并通过MALDI-TOF质谱法鉴定。根据HPLC每种多肽都是纯的，我们估计>95%，并且纯化肽的分子质量均处于理论值的一个质量单位范围内。每种多肽配备7-甲氧基香豆素荧光探针，所述荧光探针在通过Pd(PPh₃)₄选择性移除Alloc保护基团后在固相上在赖氨酸残基的侧链处引入。引入荧光团以便能够通过测量荧光强度检测与靶蛋白的结合。在每种序列中，将荧光团在配体连接位点附近即在位置15、10、25和37引入，对于小分子配体，分别在位置8、17、22和34引入。预期，当结合时分子环境的变化将在这些位置最明显并且产生最大的强度变化。先前已经详述通过NMR和CD光谱法以及通过分析性超速离心对相似序列的设计和结构性分析(Olofsson,S.；Johansson,G.；Baltzer,L.J.Chem.Soc.,PerkinTrans.21995,2047-2056.Broo,K.S.,Brive,L.,Ahlberg,P.和Baltzer,L.,J.Am.Chem.Soc.1997,119,11362-11372)。它们折叠成螺旋-环-螺旋基序并且二聚化以形成具有熔球样特性的4-螺旋束。

在两种浓度(大约30μM和大约1μM)记录16种支架多肽在222nm处的平均残余椭圆率[θ]₂₂₂,以便表征聚集状态，参见表1。

表1.文库中高浓度和低高浓度下本发明多肽的平均残余椭圆率。实验误差估计是+1000degcm²dmol^-1

螺旋形成的度与单体-二聚体平衡相关，因为单体是无序的，螺旋含量低，而二聚体是高度螺旋的。全部序列在两个浓度的较高浓度时是高度螺旋的，平均残余椭圆率在-20000degcm²dmol^-1左右，并且一些序列在两个浓度的较低浓度时显示部分解离。全部序列因此在低μM浓度优势地形成二聚体。先前已经记录所选择序列的¹HNMR谱，并且存在一个令人惊讶的例外的同时，均显示熔球标志。丹磺酰基与Lys-15侧链连接的的序列KE2-C15显示充分分散的NMR谱，不过熔化行为限定不良。尽管没有记录全部序列和全部多肽缀合物的¹HNMR谱，但可能将此处提出的序列最好描述为熔球。

先前已经描述间隔团苯磺酰胺及其活性酯的合成(Winum,J-Y.；Vullo,D.Casini,A.；Montero,J-L.；Scozzafava,A.；Supuran,C.T.J.Med.Chem.2003,46,2197-2204)。

苯磺酰胺残基的N-羟琥珀酰亚胺酯与16成员集合的每个成员在一个单步骤反应中在缓冲液或DMSO溶液内反应以形成缀合物分子。

HCAII的多肽缀合物结合物的亲和力

在筛选方法中估计每种多肽缀合物对HCAII的亲和力，其中将1、2和3当量的HCAI加至含有多肽缀合物的孔并且在平板读数仪中分析，其中香豆素荧光的强度与没有添加蛋白质的样品比较。将实验设计成在pH7.4的含有150mMNaCl的50mMHepes缓冲液中产生500nM、1μM和1.5μM的HCAII终浓度和500nM的结合物终浓度。在384微量滴定平板的独立孔中平行制备全部溶液，并且同时记录每个孔的强度以避免因温育时间差异所致的强度差异。在350nm激发后，使用微量滴定平板读数仪测量280至500nm处的荧光强度。聚苯乙烯平板用

Prill(水中的1%溶液)；和42残基肽的溶液(0.4mg/ml，2小时，序列4-C15L8-Ac(即Ac-NAADJEAKIRHLREKJAARGPRDAAQJAEQLARRFERFARAG-CONH₂)预涂布以避免结合物和蛋白质与聚苯乙烯表面黏附。蛋白质-结合物混合物的荧光强度(即在410nm最大值)与不存在蛋白质情况下结合物的强度比较，并且与不存在蛋白质情况下结合物的强度相比，在1当量蛋白质存在下荧光强度的显著变化解释为HCAII由结合物复合。选择在500nM HCAII存下显示强度变化但在1μM HCAII存在下强度没有进一步变化的的结合物用于进一步研究。因此，假定结合物在在500nM蛋白质浓度和500nM结合物浓度处被复合超过90%并且在这种假设下，可以根据用于双分子复合物的标准等式估计出解离常数K_d为10nM或更小：K_d=[B]*[P]/[PB]

在根据以上方法制备和分析的16种候选结合物集合中，选择3种多肽缀合物1-C10L17-B、3-C15L8-B和4-C37L34-B用于进一步研究。

通过荧光滴定并通过SPR分析确定1-C10L17-B、3-C15L8-B和4-C37L34-B对HCAII的亲和力(图5)。为了能够精确测定低nM解离常数，必须在相同数量级的浓度实施测量。7-甲氧基香豆素并不充分敏感到允许在约10nM或更低浓度精确滴定，原因是信号强度太弱。因此，将乙酰氨基甲基(Acm)保护的Cys残基引入1-C10L17-B和3-C15L8-B的环区域以允许引入更致密的荧光团。将Cys侧链去保护（Fuiji,N.；Otaka,A.；Watanbe,T.；Okamachi,A.；Tamamura,H.；Yajima,H.；Inagaki,Y.；Nomizu,M.；Asano,K.Chem.Soc.,Chem.Commun.1989,283-284)并且与经脂族间隔团缀合至马来酰亚胺的荧光素反应，其中所述脂族间隔团能够在平板读数仪中在约50nM或更低(一个比采用7-甲氧基香豆素时可能实现的数量级更低的数量级)时精确测量亲和力。使用与丹磺酰基团而非7-甲氧基香豆素缀合的多肽实施荧光滴定以避免与荧光素重叠，但是荧光团存在于支架文库的每个序列中以简化整个合成和纯化过程中的鉴定和量化。在384微量滴定平板的独立孔中平行制备全部溶液，并且同时记录每个孔的强度以避免因温育时间差异所致的强度差异。在420nm激发后，使用微量滴定平板读数仪和如上文所述预涂布的聚苯乙烯平板测量荧光强度。蛋白质-结合物混合物的荧光强度与不存在蛋白质的结合物的强度比较。在pH7.4的含有150mM NaCl的50mM Hepes缓冲液中进行分析。将HCAII在25个步骤中以20pM至1μM的浓度范围添加至50nM浓度的结合物，并且通过曲线拟合分析结果。在丹磺酰和7-甲氧基香豆之间存在结构差异的情况下，差异是相对小，并且我们假定对测量的亲和力的影响小。测量最高的亲和力是1-C10L17-B的亲和力，Kd为5±3nM，而发现3-C15L8-B具有29±10nM的K_d。与荧光素探针缀合的序列4-C37L34-B在缓冲液中溶解不良并且未进行滴定。

使用

仪、

芯片和添加1%DMSO用于相互作用研究的pH7.4的HBS-EP缓冲液(

GEHealthcare)，也通过SPR生物传感器分析(GEHealthcare)表征16种多肽缀合物。通过在缓冲液中从DMSO内的20μM母液稀释，制备肽溶液。使用标准EDC/NHS偶法在pH5.5的乙酸盐缓冲液中，使HCAII固定在芯片上。允许结合物以范围从1nM至500nM的7种浓度在芯片上流过，并且使用1:1结合模型评价相互作用(BiaEvaluation)。

通过SPR生物传感器分析测定3-C15L8-B和4-C37L34-B对HCAII的亲和力分别是43nM和15nM，与对KE2-D(15)-6⁵所报道的亲和力大致相符。解离常数或多或少地在各测定之间随不同方法和在配备不同荧光团的结合物之间有差异。然而，在各量值之间总体上存在相符并且我们得出结论，苯磺酰胺基团与多肽支架的缀合产生具有比小分子战斗部高两个数量级的亲和力的结合物。在通过SPR分析测定亲和力时，发现结合物1-C10L17-B具有80nM Kd，并且不考虑将它进一步用于选择性的评价。

候选结合物的选择性

在复杂介质血液中研究结合物3-C15L8-B和4-C37L34-B对HCAII的选择性。再合成选择的结合物，其在位置24具有Acm-保护的Cys残基。在移除Acm基团后，通过在pH7.4的含有150mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液中温育1小时，使结合物固定在用

涂布的聚苯乙烯纳米粒子上。这种涂敷物质形成配备活化二硫化基团的单层PEG，所述二硫化基团在释放2-巯基吡啶下与游离巯基自发反应(Fromell,K.,Hulting,G.,Ilichev,A.,Larsson,A.和Caldwell,K.C.AnalyticalChemistry79,8601-07(2007))。

通过在240μL蒸馏水中稀释，将大约60μL新鲜抽取的血液裂解，随后离心以除去细胞残片。HCAII位于在红细胞中并且为了接近这种蛋白质，必须将细胞裂解。将上清液分离并且与官能化的纳米粒子温育30分钟以允许它们捕获HCAII。将粒子在PBS中洗涤3次，并且在每次洗涤后离心。将结合物和捕获的蛋白质使用二硫苏糖醇从粒子切下并通过离心与粒子分开。将上清液施加至电泳凝胶并在电泳后，通过银染法使凝胶显色(图4)。存在3个条带并且通过质谱法鉴定为血红蛋白亚基、HSA和人碳酸酐酶。血红蛋白亚基和HSA均存在于没有结合物连接的对照珠的泳道中并且因此由聚苯乙烯纳米粒子非特异性吸附并且不由多肽结合物提取。结合物分子3-C15L8-B和4-C37L34-B因此优势地提取碳酸酐酶。

在ELISA中证实HCAII的提取，其中官能化的纳米粒子用来捕获HCAII并且与HRP缀合的抗HCAII抗体用于检测（数据未显示）。

血液中存在人碳酸酐酶的两种同工型HCAI和HCAII。

这两种同工型具有几乎相同的分子量和60%的总体序列同一性，而表面可及性残基的的同一性略微较低，为45%。HCAI和HCAII不能通过SDS-PAGE和从凝胶中分离(图4)，不可能得出结论，已经通过3-C15L8-B和4-C37L34-B从血液提取的是否为HCAI或HCAII或这两者。切割来自凝胶的条带，将它们进行胰酶消化并通过MALDI-TOF分析，显示这些条带含有两种同工型。HCAI在人类中相对于HCAII以5-7倍过量存在，并且为了特异性结合HCAII，将需要几个数量级的亲和力差异。两种同工型均以约1-4μM的K_d结合苯磺酰胺抑制剂，并且针对两种同工型的亲和力的任何差异将必须是多肽和这两种蛋白质之间相互作用的差异的结果。存在通过使用对所需同工型特异的小分子抑制剂针对HCAI或HCAII设计结合物的众多方式，这里解决的问题是可以通过多肽实现怎样的差异以区分人碳酸酐酶的两种同工型。它代表可以由这个新类别的蛋白质结合物实现的选择性水平的关键试验，并且因此通过SPR生物传感器(Biacore)分析实施对合成性结合物的区分能力的进一步分析。

使用标准EDC/NHS偶法在pH5.5的乙酸盐缓冲液中，使HCAI和HCAII固定在CM-5(Biacore)芯片上的不同流通池中。使用范围从1nM至500nM的结合物浓度实施对3-C15L8-B和4-C37L34-B的亲和力测量，均伴随1%DMSO存在，并且与描述1:1相互作用模型的等式的实验结果的最佳拟合用来测定解离常数。在表2中显示结果。

表2来自SPR分析的亲和力数据

多肽缀合物3-C15L8-B以针对HCAI的390nM解离常数和以针对HCAII的60nM解离常数6结合，而4-C37L34-B显示针对HCAI的470nM解离常数和针对HCAII的17nMnM解离常数。结合物分子4-C37L34-B因此能够以大约30(超过一个数量级)的倍数区分HCAI和HCAII。虽然存在交叉反应性并且这种结合物不是彻底特异性的，但是就结合物分子的简单性而言，所展示的区分令人瞩目。HCAI和HCAII均结合苯磺酰胺并且多肽缀合物的差异性结合作用明显归因于与这种多肽的相互作用。通过将表面的静电势作图获得与蛋白质表面的相互作用为何不同的线索，图4。表面暴露的残基仅45%相同并且HCAII活性部位周围的区域比HCAI的更疏水和带有更少正电荷。虽然带有更多负电荷的HCAI表面将预期与略微带有更多正电荷的多肽4-C37L34更强烈地相互作用，但是疏水相互作用似乎主导促进HCAII和4-C37L34-B之间的相互作用。

结论

在这个实施例中，显示可以组合本发明的多肽和对HCAII具有中度亲和力的有机小分子以形成对这种蛋白质的特异性高亲和力结合物。具体而言，合成性结合物分子的特异性与单克隆抗体可比较，因为仅人碳酸酐酶由结合物分子从血液中提取。观察到的血红蛋白亚基和HSA提取归因于聚苯乙烯珠上的非特异性吸附。区分具有60%同源性的蛋白质同工型提出一项巨大挑战，并且实现的几乎一个数量级的亲和力差异强有力展示这种类型的结合物分子的区分能力。使用以体系方式变动并且用亲和力和选择性的要素编码的多肽小集合与分子生物学中充分建立的其中搜寻良好结合物分子时使用庞大的候选结合物文库的常见方法形成对比。显示结合HCAII的多肽缀合物的尺寸小于IgG单克隆抗体的1/30并且不要预先组织以形成在形状和电荷方面与靶蛋白互补的表面。尽管本文提出的结合物分子的这些看似不利特征，但是它们识别和结合甚至人血液的复杂环境中的蛋白质方面性能极好。多肽支架小集合在搜寻蛋白质的特性高亲和力结合物方面的用途提供了寻找特异性和高亲和力的高效途径，并且将搜寻结合物简化为搜寻中等亲和力的小分子或肽。在采用HCAII的这项研究中，我们已经用[θ]₂₂₂对具有高亲和力的几种结合物展示一种快速途径，并且这种方法因此也可以用来构建用于芯片上测量浓度的结合物阵列。

筛选方法取决于以下假定：荧光团周围存在分子环境的变化，并且荧光的变化反映与靶蛋白的结合。在不能预测蛋白质-结合物复合物的结构的每种情况下，这种可以不是真实的。然而，本文所述的方法已经能够鉴定具有高亲和力的3种候选结合物，并且因此这种筛选操作方案在鉴定紧密结合物方面显示巨大前景。从16种多肽集合中，将3种多肽鉴定为命中，并且以下事实而言：搜寻候选结合物集合所花费的时间否则将太长而不可行，良好结合物逃脱鉴定的可能性是可接受。

蛋白质识别的需求最迫切方面是需要在复杂生物环境中的特异性，其中庞大数目的生物分子竞争结合作用。不仅通过区分碳酸酐酶和其他蛋白质，还区分两种同工型HCAI和HCAII，合成性多肽缀合物4-C37L34-B具有经证明的良好特异性。这表明，化学产生的结合物分子提供了相对于通过分子生物学方法产生的那些结合物分子而言改进的性能并且可以预期在诊断以及制药应用中具有许多优点。

实验

概述

从Sigma购买作为冻干粉末的HCAI和HCAII，在恰好使用之前制备溶液。

配体的合成

如先前所描述那样合成苯磺酰胺配体(Winum,J-Y.；Vullo,D.Casini,A.；Montero,J-L.；Scozzafava,A.；Supuran,C.T.J.Med.Chem.2003,46,2197-2204)。

肽的合成

使用标准芴基甲氧羰基(Fmoc)化学，以O-(7-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(HBTU，IrisBiotechGmbH)和二异丙基乙胺(DIPEA，Aldrich)作为活化剂在Pioneer自动化肽合成仪上合成肽。使用DMF中的20%哌啶进行氨基端的Fmoc脱保护。使用Fmoc-甘氨酸-聚乙二醇-聚苯乙烯(Fmoc-Gly-PEG-PS)树脂以0.2mmol规模进行合成，并且在每次偶联中使用4倍过量的氨基酸。氨基酸的侧链(Calbiochem-NovabiochemAG，IrisBiotechGmbH)由碱稳定基团保护：叔丁酯(Asp、Glu)，三苯甲基(His、Asn；Gln)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Arg)。待与荧光团缀合的赖氨酸残基以正交方式受烯丙氧羰基(Alloc)保护，而其中配体将与之缀合的赖氨酸受叔丁氧基甲基(Boc)保护。使用DMF中的0.5M乙酸酐使N-'末端乙酰化。

通过用DCM中的四(三苯基膦)钯(0))(Pd(PPh₃)₄，2当量)、乙酸和N-甲基吗啉(比率37:2:1v/v；每克树脂10ml)在室温在N2下处理树脂2小时，进行Alloc基团的脱保护。随后使用DMF中的0.5%DIPEA和DMF中的0.5%v/v二乙基二硫代氨基甲酸洗涤树脂。在DMF中在室温伴以温和搅拌进行7-甲氧基香豆素-3-羧酸(3当量)与赖氨酸残基的偶联2小时。使用偶联混合物活化香豆素，所述偶联混合物由比率12:6:6的DIPEA、1-羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)组成。在2小时后，添加偶联混合物的另一个等分试样并留下反应过夜。在所有情况下，在脱保护和偶联之间用DMF和DCM洗涤树脂。通过在室温下添加TFA、水和三异丙基硅烷(TIS)(95:2.5:2.5v/v，每克聚合物10ml)持续3小时实现总脱保护和从树脂中切下。在过滤和浓缩后，通过添加冷二乙醚使肽沉淀、离心、在二乙醚中洗涤和晾干。

粗制肽通过使用半制备性HypersilC-18Gold柱(150×20mm，孔径

粒度

的反相HPLC或用水中浅35-55%乙腈梯度和0.1%TFA作为添加物以10ml/分钟流速洗脱的半制备性KromasilC8Hichrom柱(250×21.2mm，孔径

粒度

)纯化。收集的级分通过MALDI-TOF质谱法(BrukerDaltonicsUltraflexIITOF/TOF)鉴定、浓缩并且冻干2次。

通过添加溶解于DMSO(约0.1M)中的相应酯(4当量)至DMSO中的30μl2mM多肽溶液，以1%DIPEA作为添加物，使配体与多肽缀合。使反应在室温留下过夜，并且通过分析性HPLC和MALDI-TOF-MS证实官能化的程度。将GenesisC-18柱(250×4.6mm，孔径

粒度

)用于分析性HPLC。使用以下梯度：90分钟范围内水中的30-60%乙腈和0.1%TFA作为添加物，流速1ml/分钟。

反应混合物在不作进一步纯化的情况下用于荧光筛选实验(在pH7的含有50mM NaCl的50mM TRIS缓冲液中稀释至10μM母液)。

合成结合物4-C37L34-B和3-C15L8-B(其中“-B”表示多肽与针对选定分子的配体连接)并且用环区域中半胱氨酸残基受Acm保护C37L34-B-Cys24和3-C15L8-B-Cys24纯化。

用于荧光滴定实验的结合物1-C10L17-B和3-C15L8-B与苯磺酰胺残基缀合并且使Acm基团去保护。

典型的标记实验如下进行。将Acm去保护的多肽溶解于含有6M盐酸胍盐的pH7.5的0.01M磷酸钠缓冲液中至终浓度1.0mM。将3摩尔当量的N-(5-荧光素基)马来酰亚胺(Sigma-Aldrich)预先溶解于最小量的DMSO中并且直接添加至反应混合物。通过分析性HPLC监测反应，并且4小时后，它基本上完成。通过HPLC纯化产物并且用MALDI-MS鉴定产物质量。

用于最终SPR实验的结合物4-C37L34-B和3-C15L8-B和用于选择性研究的结合物4-C37L34-B-Cys24和3-C15L8-B-Cys24以5mg规模规模与苯磺酰胺残基缀合并且通过使用半制备性HypersilC-18Gold柱(150×20mm，孔径

粒度

)、用水中浅30-60%乙腈梯度和0.1%TFA作为添加物以10ml/分钟流速洗脱的反相HPLC纯化。收集的级分通过MALDI-TOF质谱法(AppliedBiosystemVoyagerPRO)鉴定、浓缩并且冻干。在DMSO中制备4-C37L34-B和3-C15L8-B的母液并且将其通过定量性氨基酸分析法分析。4-C37L34-B和3-C15L8-B的母液浓度分别是35μM和24μM。

通过在含有2%(v/v)茴香醚的0.50mLTFA中溶解冻干肽(1μmol)进行Acm基团的脱保护。将溶液冷却至0℃并且添加AgOTf(26mg，0.1mmol，100当量)在0.5mLTFA中的溶液。将反应混合物在0℃搅拌1小时并且允许其达到环境温度并在环境温度搅拌2小时。通过添加冷二乙醚和通过离心分离从反应混合物中析出肽的银盐。将沉淀物溶解于0.5mL蒸馏水中并且将二硫苏糖醇(8mg，0.05mmol，50当量)在0.5mL冰醋酸中的溶液添加至肽的溶液。允许混合物搅拌2小时并将其离心。通过HPLC纯化上清液溶液中含有的肽。

荧光测量

使用GeminiXPS平板读数仪记录荧光光谱。在使用之前，NUNC^TM聚苯乙烯384平板用

泊洛沙姆338(BASF)包被；将平板在1%Pluronic水溶液中温育过夜，随后用水彻底洗涤，并且随后用0.4mg/ml肽溶液包被2小时并用水洗涤10次。使用95μL中的500nM多肽浓度并通过用含有150mM NaCl的pH7的50mM TRIS缓冲液从10μM母液稀释获得这种浓度。将HCAII从14μM母液添加至微量滴定平板的孔。使用消光系数54000M^-1cm^-1通过UV光谱法在280nm处测定浓度。

在350nm激发香豆素探针并且在380-500nm区间记录发射。全部测量在室温进行并且一式三份做出。在5分钟后和在30分钟后读取各孔。

SPR测量

在

2000仪上进行SPR测量，其中蛋白质固定在

CM-传感器芯片(GE Healthcare)上。在添加1%(v/v)DMSO的

缓冲液中进行全部相互作用研究。将HCAII(Sigma，冻干粉末)溶解于pH5.5的乙酸盐缓冲液成2mg/mL溶液。在pH5.5的乙酸盐缓冲液通过EDC/NHS偶联反应，使HCAII与表面缀合。在HBS-EP缓冲液中从DMSO中的20μM母液制备多肽结合物的溶液并且允许所述溶液在表面上以20μL/分钟流过，在每个系列后进行空白注射。将全部样品调节成含有1%(v/v)DMSO。注射进行30秒并且允许解离超过3000秒。使用1:1结合模型评价。

与聚苯乙烯纳米粒子的缀合和从血液提取

通过将2%(w/v)粒子悬液与10mg/ml Pluronic F108-PDS在室温在恒定振摇下温育过夜，使Pluronic F108-PDS(Allvivo Inc)吸附于聚苯乙烯乳胶纳米粒子(Bangs laboratories Inc)。在吸附后，通过使用Eppendorff桌面型离心机以14000转/分钟离心5分钟，使得过量的表面活性剂与包被的粒子分离。移去上清液并且使粒子重悬于pH7.4的10mM Hepes缓冲液中。在添加作为pH7.4的10mM Hepes缓冲液中1mg/mL溶液的半胱氨酸去保护的多肽缀合物之前，将这个洗涤过程重复3次。将反应混合物在温和振摇下温育1至12小时。将纳米粒子用缓冲液洗涤3次并重悬于100μL缓冲液中。通过添加双倍体积的Milli-Q级水并温和地振摇15分钟来裂解新鲜血液(从我们中的一人抽取)。离心裂解的血液并且收集上清液。与结合物缀合的重悬的纳米粒子在室温与100至500μL裂解物温育，伴随温和振摇。在1小时后，将混合物离心并移除上清液并且将粒子用缓冲液洗涤三次。使用Hepes缓冲液pH7.4中的50mM DTT从粒子切下结合物连同它们捕获的蛋白质，随后离心(14000转/分钟，5分钟)以便从样品中除去粒子。使用

Bis-Tris4-12%(v/w)凝胶和MES运行缓冲液(Invitrogen)，通过梯度SDS-PAGE凝胶电泳分析8μL等分试样上清液。在电泳后，将凝胶在100mL固定缓冲液(40%乙醇，10%乙酸)中固定并且使用SilverQuest^TM银染试剂盒(Invitrogen)银染，或在100mL固定缓冲液(35%甲醇，10%乙酸)中固定并且使用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen)染色。

实施例3

本实施例涉及本发明的分子工具在开发磷酸化蛋白的结合物中的用途。

蛋白质磷酸化在引领和指导基本生命功能方面发挥重要作用。磷酸化是受激酶和磷酸酶控制的可逆共价修饰并且充当信号转导级联、凋亡进程、代谢变化和基因表达的“分子触发器”。无论异常磷酸化何时出现，均启动诱变性活性、神经致病性活性或致癌活性并且激酶是重要的药物靶。监测磷酸化对于理解许多复杂生物学功能以及药物开发中理解药物的作用是十分重要的。

蛋白质磷酸化是全部翻译后修饰中研究最广泛，并且很大程度上受磷蛋白组学中最新进展推动，迫切需要用于选择性检测和分析磷酸化蛋白的方法。对于免疫沉淀法或蛋白质印迹法，磷酸化特异性抗体常规地用来识别磷酸化表位并且虽然抗磷酸酪氨酸抗体显示令人满意的效率，但是抗磷酸丝氨酸和抗磷酸苏氨酸抗体通常仅是中等特异性的。非特异性捕获磷酸酯基团与质谱法组合使用。在固定金属离子层析(IMAC)中，带正电荷的金属离子通过静电相互作吸引带负电荷的种类如磷酸酯基团。金属氧化物如TiO₂用来富集定量性或定性分析之前复杂样品中的磷酸化蛋白。也使用间接检测磷酸酯的方法，其中想法是用更易检测的更稳定基团替换磷酸酯部分。这些方法一般要求在捕获和质谱分析之前，蛋白质由胰蛋白酶消化。

关于磷酸酪氨酸的兴趣源自它们参与细胞信号传导并且因此例如涉及癌症研究，但是磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸具有大约2000倍更多的丰度。丝氨酸和苏氨酸的磷酸化在酪氨酸磷酸化下游发生并且激起巨大兴趣。抗磷酸化丝氨酸和抗磷酸化苏氨酸抗体的相对低劣性能表明，需要针对在丝氨酸和苏氨酸的侧链处磷酸化的蛋白质的高亲和力、选择性、稳健和高效结合物以允许改进下游磷酸化事件的监测。有力结合物的取得将可能拓宽理解蛋白质磷酸化的生物学功能和机制以及开发体外诊断药的范围。为了作为生物分析工具使用，这种结合物不仅应当显示特异性和高亲和力，还应当在储存和生理条件下显示长期稳定性、毒性最小和易于制备。

尽管经常需要获得高度特异性的结合物分子，但是用于鉴定和量化一组磷酸化蛋白的一般试剂在生物分析应用中是有巨大意义的，尤其作为与质谱法组合时用于富集磷酸化蛋白和用于检测电泳凝胶上磷酸化蛋白(例如在蛋白质印迹法中)的固定的高亲和力试剂。多肽缀合物结合物分子背后的构思在于，小分子战斗部主导结合物和蛋白质之间的相互作用，并且除引入上文描述的特性之外，多肽增强亲和力以及选择性。在小分子战斗部对特定官能团而非特定蛋白质具有选择性的情况下，预期所得到的结合物分子能够识别大部分、可能全部的携带这类官能团的蛋白质。我们已经解决磷酸化氨基酸侧链的组特异性识别和磷酸化蛋白的结合问题，并且在原理验证展示中，将结合物概念应用于模型蛋白α-酪蛋白、β-酪蛋白和卵清蛋白。为此目的，本发明的分子工具已经用来通过缀合已知结合磷酸酯基团的小分子PP1，制备结合物分子。

这里，所用的多肽集合由图1内所示16种多肽中的8种多肽集合组成，即使用分别具有总电荷-1(即3-系列)和+2(即4-系列)的多肽。就在复杂性可变的介质中的亲和力、结合机制和选择性而评价结合物。结果表明，这些结合物分子是在其中磷酸化事件发挥重要作用的情况下诊断应用的有力候选物。

结果和讨论

结合物设计使用正交保护基团分别保护作为连接配体和报道基团的位点使用的赖氨酸。用半胱氨酸代替位置24中的丙氨酸用于固定或连接其他官能团上。可以在肽合成期间在固相上和在切割和纯化后在溶液中进行修饰。6图中显示结合物4-C15L8-PP1的折叠结构和氨基酸序列的示意图。

在针对磷酸酯基团显示选择性的许多可用分子当中(Aoki,S.,Kimura,E.,Rev.Mol.Biotechnol.2002,90,129-155)，决定使用由Hamachi等人先前报道的Zn(II)-2,2'-二甲基吡啶胺(Dpa)络合物来结合磷酸根阴离子(Ojida,A.,InoueM.,Mito-okaY.,HamachiI.,J.Am.Chem.Soc.2003,125,10184-10185.OjidaA.,InoueM.,Mito-okaY.,TsutsumiH.,SadaK.,HamachiI.,J.Am.Chem.Soc.2006,128,2052-2058.OjidaA.,Mito-okaY.,SadaK.,HamachiI.,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,2454-2463.Ishida,Y.,Inoue,M.,Inoue,T.,Ojida,A.,Hamachi,I.,Chem.Commun.2009,2848-2850)。替代的选择性磷酸酯识别单元(Phos-标签)由Kinoshita等人报道，对磷酸化肽和蛋白具有高亲和力(Kinoshita,E.,Yamada,A.,Takeda,H.,Kinoshita-Kikuta,E.,Koike,T.,J.Sep.Sci.2005,28,155-162.Kinoshita,E.,Takahashi,M.,Takeda,H.,Shiro,M.,KoikeT.,DaltonTrans.2004,1189-1193.Kinoshita,E.,Kinoshita-Kikuta,E.,Takiyama,K.,KoikeT.,Mol.Cell.Proteomics2006,5,749-757)。选择由由二甲基苯甲酸(PP1)连接的两个Dpa基团组成组成的分子于今天开发和授课结合物。这种修改先前已经用于构建磷酸酯受体并且结合与磷酸酯氧配位的两个Zn²⁺离子。已经报道它结合以μM范围的解离常数磷酸肽(Yamaguchi,S.,Yoshimura,I.,Kohira,T.,Tamaru,S.,Hamachi,I.,J.Am.Chem.Soc.2005,127,11835-11841.)（Mangalum,A.,Smith,R.C,Tetrahedron2009,65,4298-4303)）。

图7中示意性地显示PP1的合成。最初，使用NBS，使化合物1经历自由基二溴化，随后用二乙基亚磷酸处理，旨在除去不想要的过度溴化的化合物(^{Liu,P.,Chen,Y.,Deng,J.,Tu,Y.,Synthesis2001,14,2078-2080})。接下来的步骤包含用Dpa-H片段亲核性攻击2以产生化合物3，所述化合物3经进一步水解以形成羧酸4。由于难以纯化这种极性化合物，将羧酸4通过在水和有机相之间分配进行纯化并且最后转化成相应的TEA盐，所述TEA盐因反离子的疏水性质而易于进入有机相。优化上述合成途径并且与文献中报道的那些产率相比，以裂解和纯化非常高的产率产生靶化合物。

磷酸化在折叠的蛋白质的表面上发生，并且在这种情况下，不包含间隔团，PP1战斗部与赖氨酸8的侧链直接缀合。

结构的表征。为了确定引入PP1和Zn²⁺离子是否影响多肽的溶液构象，通过圆二色光谱法在1、10和50μM浓度在pH7.2的10mMHEPES缓冲液中研究处于各种装配阶段的结合物分子4-C15L8-PP1，表3。

表3.处于各种装配阶段的4-C15L8在298K于150mMNaCl和pH7.2的10mMHEPES缓冲液中于222nm处的平均残余椭圆率

[a]在Lys15的侧链具有Tfa酰胺并且在Lys8的侧链具有游离氨基的4-C15L8。

[b]在Lys15的侧链具有Tfa并且在Lys8的侧链具有PP1的4-C15L8。

[c]在Lys15的侧链具有7-甲氧基香豆素-3-酰胺并且在Lys8的侧链具有PP1的4-C15L8。

[d]在Lys15的侧链具有Tfa并且在Lys8的侧链具有PP1的Zn²⁺螯合物的4-C15L8。

肽的浓度从重量估计并且可以与大误差相关，但是因为溶液从母液中制备，所以相对量值是精确的。以肽浓度的20%过量添加Zn(NO₃)₂。

全部肽均显示在209和222nm，具有最小值的螺旋标记，表明它们在这些浓度至少部分地二聚化以形成4-螺旋束。亲本肽4-C15L8和携带PP1的Zn²⁺络合物的充分修饰的4-C15L8显示出指示单体-二聚体平衡的适中浓度依赖性，而PP1官能化的4-C15L8在Zn²⁺不存在的情况下不显示浓度依赖性。得出结论，无论修饰是什么，这些多肽在μM范围的浓度折叠成螺旋-环-螺旋基序，所述基序二聚化成4螺旋束，并且溶液结构没有因引入官能团而强烈地受到影响。

结合物亲和力在概念验证展示中，研究了模型蛋白α-酪蛋白、β-酪蛋白和卵清蛋白的结合。研究最广泛和表征最充分的磷蛋白可能是α-酪蛋白。它具有8个和13个之间的磷酸酯基团，而β-酪蛋白具有5个并且卵清蛋白具有1个磷酸酯基团。在这些蛋白质中，磷酸化在丝氨酸的侧链发生。它们从商业来源轻易可获得并且因此适合于系统研究。酪蛋白和卵清蛋白均具有约5的等电点，α-酪蛋白的IEP是4.6，β-酪蛋白的IEP是5.1，并且卵清蛋白的IEP是4.6。

为测定亲和力，使用两种荧光探针，其中预期所述荧光探针响应于因结合作用而环境疏水性变化时改变的量子产率。

在以微量滴定平板形式可执行的初步和简单测定法中，在pH7.2的10mMHEPES缓冲液和150mMNaCl中浓度500nM的8种候选结合物的每一种(所述候选结合物配有荧光团7-甲氧基香豆素-3-羧酸)在用α-酪蛋白3个步骤中滴定(图8)。从香豆素探针的吸光度确定肽的浓度并且将浓度5μM的从等分试样中制备的母液转移至微量滴定平板。添加Zn(NO₃)₂至终浓度12μM。在蛋白质不存在和在500nM、1000nM和1500nM蛋白质存在的情况下记录荧光发射谱，以便定量地确定结合作用是否在结合物和蛋白质二者的500nM浓度时饱和。在这些浓度时实验误差范围内的饱和作用与低nM亲和力和紧密结合作用相一致。

发现4-系列结合物的荧光发射的强度在α-酪蛋白存在时因结合作用而下降(图8)。反之，发现来自3-系列的结合物的荧光发射强度在α-酪蛋白存在时增加。在结合强度和荧光发射强度的相对变化在之间不存在关系，因为不同的响应归因于处于结合和游离状态下的荧光团周围相对疏水性的差异。它甚至不指示具有α-酪蛋白的复合物的不同结构，因为他可能归因于未结合的多肽缀合物内部不同的相互作用。

相反，与增加的α-酪蛋白浓度相对对应的差异与亲和力的差异相关。4-系列的结合物分子显示几乎相同的荧光发射光谱，无论α-酪蛋白的浓度什么，这表明结合作用在500nM结合物和蛋白质浓度饱和。在实验误差是10%或更少的假定下，可以估计，结合物-蛋白质复合物的浓度是450nM和游离蛋白质和游离结合物的浓度各自是50nM。从这些数字中，可以计算出5nM的表观亲和力。显然，这个估计值是大约1，实验误差可能大于10%，并且它仅提供解离常数的上限(亲和力的下限)。然而，它是一项迅速和富有信息的实验。从荧光滴定中，具有4-系列的候选结合物具有约5nM或更小的解离常数。相反，3-系列结合物的强度随增加α-酪蛋白浓度而增加并且在实验条件下没有达到饱和，可能例外是3C10L17-PP1(图9)。得出结论，3-系列结合物具有高nM至μM范围的解离常数。在3系列内部和在4-系列内部几乎相同的亲和力可能是偶然的。

作为阴性对照，未修饰的多肽4-C17L10和4-C10L17-PP1在不存在Zn2+离子情况下用α-酪蛋白滴定(图10)。没有观察到对荧光发射谱的影响并且显示需要PP1以及Zn²⁺离子用于结合。对α-酪蛋白的多肽亲和力低，但是从公布的PP1解离常数中，可以得出结论，多肽与PP1的缀合产生结合比PP1更好多个数量级的多肽缀合物。因此，这种多肽明显有助于缀合物中的结合作用，这种结合作用是可从一般结合物概念中期望那样的。

结合物亲和力.亲和力实施竞争实验，旨在进一步探查结合物和α-酪蛋白之间的相互作用，并且通过下拉实验进行分析，随后是SDS-PAGE分析。通过将2%粒子悬液与10mg/ml Pluronic F108-PDS在室温在恒定振摇下温育过夜，使Pluronic吸附于聚苯乙烯乳胶纳米粒子。通过与配备二硫吡啶(PDS)端基的固定Pluronic反应，具有去保护的巯基的结合物4-C15L8-PP1经二硫键偶联至聚苯乙烯粒子的表面。如此制备的粒子在蛋白质的溶液中温育并且在反复洗涤和离心后用DTT处理，以释放来自珠中被捕获的蛋白质。将所得到的上清液施加至凝胶以进行电尝试分析。

虽然与Zn²⁺螯合的PP1设计成通过使磷酸酯基团配位而结合磷酸化氨基酸侧链，但是与磷酸根阴离子相对于磷酸化丝氨酸过量3个数量级相对应的10mMPBS缓冲液在500nM蛋白质浓度时不抑制对α-酪蛋白的捕获，图11。这为其中磷酸根阴离子浓度高的诊断目的开辟类型广泛的应用(Rapoport,S.,Guest,G.M.,J.Biol.Chem.1941,138,269-282.Lehman,E.P.,J.Biol.Chem.1921,48,293-303.Gustin,P.,DetryB.,CaoM.L.,ChenutF.,RobertA.,AnsayM.,FransA.,Clerbaux,T.,JApplPhysiol,1994,77,202-208)。500nMα-酪蛋白和具有磷酸酪氨酸侧链合成肽之间对结合物的竞争。仅在PhosPep在400μM浓度时，明显有利于α-酪蛋白。仅当α-酪蛋白浓度降至100nM和肽的浓度保持在高μM水平时，结合事件才被抑制。通过结合物也轻易地提取去磷酸化至20%水平的市售α-酪蛋白。这些结果提供以下的有力证明：这种结合物通过多肽和PP1之间的协同作用提供针对α-酪蛋白的高亲和力。

为了更精确测定解离常数，在pH7.2的10mM HEPES缓冲液和150mM NaCl中以100nM结合物浓度实施用蛋白质滴定(图12)。在这种浓度，要求更强烈发射的探针，并且通过马来酰亚胺基团与移除乙酰氨基甲基(Acm)保护基团后多肽的游离巯基反应，使荧光素与Cys-24的侧链连接。结合物浓度保持恒定处于100nM，并且制备其中仅变动α-酪蛋白浓度的样品系列。描述1:1复合物解离的等式与实验结果的最佳拟合产生3nM表观解离常数，不过可能包括众多解离常数。就单一解离常数而描述α-酪蛋白和一个或多个拷贝的4-C15L8-PP1的复杂解离行为，明显是过度简单化。不知道多少结合物分子与α-酪蛋白的磷酸酯基团结合并且如果它们与不同的亲和力相关，不知道它们可能最大多少。

测量值可能是真实Kd的低估值。为了获得最可靠的解离常数值，需要在与解离常数值相似的浓度下实施测量。在这种情况下，这是不可行的，因为荧光发射的变化并未强到足以允许在17nM或以下以所要求的准确度测量。另外，在转折点附近和以下，α-酪蛋白的浓度低于浓度of4-C15L8-PP1，并且荧光发射的变化因此低估结合强度。表观解离常数显示，杂合结合物分子紧密结合α-酪蛋白并且我们得出结论，17nM是结合物效率的低估值。不幸地有助的实践限制，我们不能确立更精确的K_d值。

结合物选择性

图13中显示来自蛋白质混合物的提取物的分析结果，所述蛋白质混合物各自含有500nM的α-酪蛋白和卵清蛋白以及含有非磷酸化蛋白溶菌酶、磷酸化酶B和β-半乳糖苷酶的蛋白质混合物。使用3种阴性对照，用于确定非特异性结合的用Pluronic包被的珠，用Pluronic包被的珠和固定的4-C15L8(其中在位置8的赖氨酸经乙酰化用于确定与肽支架的非特异性结合)，和用Pluronic包被的珠和无Zn²⁺离子的固定的4-C15L8-PP1。为了确保从络合物中除去Zn²⁺离子，实验在1mMEDTA存在的情况下实施。

结合物4-C15L8-PP1从混合物中选择性提取α-酪蛋白，伴随不明显的非特异性摄取，不过观察到与非/磷酸化蛋白磷酸化酶B相对应的条带。对照实验显示，磷酸化酶B与Pluronic包被的珠非特异性结合(结果未显示)。一项重要结果是显示锌是结合α-酪蛋白必需的。

为了评价比α-酪蛋白更低的磷酸化水平下的结合磷蛋白，展示从100nM溶液提取β-酪蛋白(图14)。这种蛋白质具有α-酪蛋白的大约一半数目的磷酸酯基团。然而，不能提取在100nM浓度的单磷酸化蛋白卵清蛋白。这种差异可以归因于亲和力的差异，因为预期针对多磷酸化蛋白的亲合力高于单磷酸化蛋白的亲和力。也可以归因于多肽和蛋白质之间最佳性较低的相互作用，并且可能通过选择不同的多肽进行改进。

通过下拉实验在牛乳和人血清中评价4-C15L8-PP1在更复杂介质中的选择性(图15)。除非常多的其他蛋白质之外，牛乳还含有众多酪蛋白，其中α-酪蛋白是最丰富的。人血清含有数千种不同的蛋白质并且来自人血清的提取物提供与生物医学应用中测量磷酸化蛋白关联的结合物选择性的关键评价。虽然人血清不含α-酪蛋白，α-酪蛋白不得不添加，但是选择人血清作为培养基。从牛乳中下拉α-酪蛋白被明确地实现并且仅伴有少量与β-酪蛋白相对应的条带。成功地展示从内标的100倍稀释人血清中下拉α-酪蛋白并且从内标的未稀释性人血清中下拉是成功的，尽管几个条带在凝胶上出现。不可能在未稀释性人血清的复杂介质中避免由珠所致的非特异性摄取且因此不可能清晰地限定4-C15L8-PP1在未稀释性血清中的选择性水平。然而，展示了通过合成性结合物分子4-C15L8-PP1与上千种蛋白质竞争时提取α-酪蛋白。

本文报道的结合物在缓冲液中以及在乳和血清中对模型磷蛋白α-酪蛋白和β-酪蛋白显示高亲和力和选择性并且进一步显示用来开发结合物的多肽集合序列总体适用于开发针对实际上任何蛋白质的结合物。这个概念与生物学结合物如抗体和适配体的概念不同，其中需要高度复杂和预组织的具有高分子量的结构物，并且提供了用于溶液中以及在固相支持物上捕获及检测磷蛋白、尤其用于监测涉及丝氨酸和苏氨酸的磷酸化事件的替代手段。这种类型的结合物高度地适于其中稳健捕获技术具有巨大意义的生物技术和生物医学中的广泛类型应用。它可以在无需特别预防措施下在室温贮存并且使用充分建立的化学方法和试剂轻易衍生化。应牢记与相应的非磷酸化蛋白相比，磷酸化蛋白较不可电离，因此对于这项技术，在色谱分析之前富集生物样品是有吸引力的。结合物也在“下拉”实验中表现得非常好并且预期在监测因暴露于药物所致的细胞磷酸化事件方面具有巨大应用。我们相信，这种结合物将是能够在体外和体内充当成像剂，这归因于有机分子可以与其共价连接的灵活性而不扰乱结合性能。缀合荧光探针和放射性核素位点的可能性尤其使这项技术高度灵活和通用。最后，与常见抗体相比，它是小的结合分子。

实验部分

小分子的合成

一般信息

全部试剂均从商业来源购买并且无需进一步纯化就使用。对于薄层层析(TLC)，使用预涂0.25mm硅胶和氧化铝平板(Merck)并且用UV光(λ=254nm)使各点可视化。在500MHz(499.9MHz)质谱仪上记录¹HNMR谱并且在400MHz(100.6MHz)光谱仪上记录¹³CNMR谱。使用氘化氯仿作为溶剂在25℃记录波谱。使用残余氯仿作为内参(1Hδ7.26，13Cδ77.0)以ppm为单位报告化学位移(δ)并且以Hz为单位报告。耦合常数(J)在Perkin Elmer SCIEX API 150EX分光仪上使用阳离子模型记录低分辨率质谱。

3,5-双(溴甲基)-苯甲酸甲酯(2)

步骤1

将3,5-二甲基苯甲酸酯(5g，30mmol)溶解于CCl₄(50mL)中，随后在1小时期间以3个相等部分添加NBS(16.2g，90mmol)和过氧化苯甲酰(0.2g，0.8mmol)。使反应混合物回流过夜。将沉淀物(琥珀酰亚胺(succyimide))滤出并用DCM洗涤。合并的滤液用饱和NaHCO₃溶液和盐水洗涤。将溶剂在减压下蒸发，产生无需进一步加工而用于下一个步骤的黄色油。

步骤2

将源自步骤1的产物溶解于无水THF(20mL)中，冷却至0℃并且添加亚磷酸二乙酯(12.6g，90mmol)和DIPEA(11.78g，90mmol)。将溶液逐渐加温至室温并且继续搅拌过夜。将混合物蒸发至大约一半体积并且倾倒在冰/水混合物上并用Et₂O(2X50mL)提取。将有机层用1MHCl和盐水洗涤并且蒸发。通过快速层析(硅胶:AcOEt/正-戊烷1:9)纯化粗产物，产生白色粉末。产率：5.5g(56%)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ8.00(d,J=1.7Hz,2H),7.62(s,1H),4.50(s,4H),3.94(s,3H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ165.8,138.9,138.5,133.7,133.3,131.3,129.9,129.5,52.4,45.0,31.8,31.8。

MS(ESI，m/z)：计算值：321.9；观察值：344.2[M+Na]⁺。

3,5-双[[双(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯甲酸甲酯(3)

将3,5-双(溴甲基)-苯甲酸甲酯(500mg，1.6mmol)和二-(2-吡啶甲基)-胺(800mg，725μL，4mmol)溶解于ACN中，随后添加无水K₂CO₃(1.1g，7.9mmol)。使反应混合物在配备CaCl₂管的回流冷凝器下回流过夜。过滤反应混合物并且在减压下蒸发滤液。通过快速层析纯化黄色残余物(中性(Al₂O₃，首先使用AcOEt来洗脱杂质，并且随后是MeOH/AcOEt=1:9(v/v))，提供作为黄色油的纯产物。产率：850mg(95%)。¹HNMR(500MHz,CDCl3₃)δ8.51(m,4H),7.94(d,J=1.5Hz,2H),7.70(s,1H),7.61(m,8H),7.12(m,4H),3.92(s,3H),3.81(s,8H),3.73(s,4H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ197.9,167.1,159.5,148.9,139.7,136.2,133.8,130.2,128.7,122.8,121.9,60.1,58.2,52.0。MS(ESI，m/z)：计算值：558.7；观察值：559.5[M+H]⁺。

3,5-双[[双(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯甲酸*TEA盐/PP1(4)

将3,5-双[[双(2-吡啶基甲基)氨基]甲基]苯甲酸甲酯(1g，1.8mmol)溶解于MeOH(50mL)中并添加10%NaOH溶液(5mL)。使反应混合物回流2小时(通过TLC监测反应进程，Al₂O₃，MeOH/AcOEt1:9(v/v))。将反应混合物冷却至0℃，随后添加10MHCl直至达到pH=2，随后在降低的压力下蒸发溶剂。将获得的黄色油质悬液重溶于水(50mL)中并逐滴添加TEA(3.6g，36mmol)。将水溶液用DCM(2x50mL)提取并且将有机层合并、蒸发和在高真空下干燥以获得作为粘稠油的产物。产率：1.1g(95%)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.50(m,3H),7.99(d,J=1.3Hz,2H),7.66(d,J=8.7Hz,1H),7.59(m,8H),7.11(m,4H),3.82(s,8H),3.70(s,4H),3.06(q,J=7.3Hz,6H),1.29(t,J=7.3Hz,9H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,159.4,148.9,148.6,138.8,136.6,136.5,133.4,132.7,129.1,122.9,122.0,77.3,76.7,60.1,59.8,58.5,45.0,8.5。

肽合成和肽合成后修饰

一般信息

使用自动化、固相方法在Applied Biosystems433A肽合成仪上，使用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)化学，使用FastMoc合成程序，实施肽的合成。合成以0.1mmol规模进行并且使用具有0.54mmolg^-1负载量的H₂N-RinkAmide-ChemMatrix(PCASBioMatrixInc)树脂作为固相支持物。全部偶联步骤均用HCTU/6Cl-HOBt/DIPEA(Iris Biotech GmbHand Pepnet Inc)。活化混合物实施。肽合成中所用的全部试剂均根据不做修饰的制造商操作方案制备。氨基酸的侧链(Iris Biotech GmbH andPepnet Inc.)由碱稳定基团保护：叔丁酯(Asp、Glu)，三苯甲基(His、Asn；Gln)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Arg)。为了允许连接结合亚基时灵活地正交性，用三氟乙酰基和4-甲基三苯甲基保护荧光探针或与Lys15和Lys8的聚苯乙烯珠主链的连接。用乙酰基-氨基甲基保护Cys侧链。使用两组溶剂A(10%ACN/90%H₂O/0.1%TFA)、B(90%ACN/10%H₂O/0.1%TFA)，通过HPLC(半制备性hypersil C-18柱250×20mm，5μm粒度)进行肽的HPLC纯化：。以下程序中包括流动相组成的细节。使用α-氰-4-羟-肉桂酸作为基质、通过MALDI-TOF MS(Applied Biosystems，Voyager-DEPRO)进行肽的鉴定。在25℃使用50μM至1μM肽浓度在5mM HEPES缓冲液中进行CD光谱法(JASCO J-810)。在测量之前将pH设定至7.2。全部CD测量均在1mm和10mm石英比色皿中进行。

Mtt切割：在合成后，为了脱保护Lys8上的Mtt，将含肽树脂用含有TFA/DCM(3:97(v/v))的混合物以10分钟循环洗涤两次。将树脂用DCM洗涤并且在真空下干燥。

将PP1(4)掺入肽支架上：将大约1/4的含肽树脂(0.025mmol肽)浸没于4(80mg，0.125mmol)、PyBOP(65mg，0.125mmol)和DIPEA(32mg，0.25mmol)的NMP(1.5mL)溶液中并且温育过夜。将树脂用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤。使用含有TFA/三异丙基硅烷/H₂O(95:2.5:2.5v/v)的混合物3小时，从树脂切下肽并随后使用冰冷的MTBE沉淀之。将肽团块重溶于最小量的TFA中并且使用冷Et₂O重复沉淀。将肽溶解于水中，冻干并且随后使用流动相梯度(17分钟内30%B至45%B，流速：8mL/分钟)，通过HPLC纯化。

Acm脱保护：将肽(1μmol)溶解于0.5mL含有2%(v/v)茴香醚的TFA中。将溶液冷却至0°C并且向它添加AgOTf(26mg，0.1mmol，100当量)在0.5mLTFA中的溶液。将反应混合物在0°C搅拌1小时并且随后允许其达室温。继续在室温搅拌12小时。通过添加冷二乙醚从反应混合物中析出肽的银盐并离心。弃去上清液溶液并将残余物溶解于0.5mL蒸馏水中。将DL-二硫苏糖醇(8mg，0.05mmol，50当量)在0.5mL冰醋酸中的溶液添加至肽的溶液。允许将混合物搅拌2小时并且离心。弃去残余物并且使用Sep-Pak加(C-18管柱，Waters)和HPLC溶剂A和B，纯化上清液中含有的肽。样品用HPLC溶剂A稀释至10mL并且加载于SEP-PACK管柱上。管柱通过极性逐渐增加的流动相洗涤。通过MALDI分析收集的级分，并且将含有所需产物的那些合并和冻干。

Tfa脱保护：将肽(1μmol)溶解于水(1mL)中并且将溶液冷却至0℃。向搅拌的溶液，添加哌啶(200μL，2mmol)，并且在0℃继续搅拌2小时。通过添加冷TFA(154μL，2mmol)中和溶液，并且使用Sep-PakPlus(C-18管柱，Waters)和HPLC溶剂A和B纯化所述溶液。样品用HPLC溶剂A稀释至10mL并且加载于SEP-PACK管柱上。管柱用极性逐渐增加的流动相洗涤。通过MALDI分析收集的级分，并且将含有所需产物的那些合并和冻干。

荧光实验

一般信息

全部荧光实验均在96孔聚苯乙烯平板中实施。全部读数均由平板读数仪MolecularDevicesSpectramaxGEMINIXPS在25℃进行。每块平板含有300μL分析物。全部聚苯乙烯平板在测量之前进行专门准备，以便使分析物的非特异性结合最小化。全部孔均用1%Pluronic水溶液填充并留下过夜。在彻底洗涤后，各孔用含有结构上与其他实验中所用的肽相似的肽(0.3mg/ml)的溶液填充。将平板过夜温育并且随后彻底地洗涤并干燥。

初步荧光筛选：制备3种溶液：第一种溶液含有HEPES缓冲液(pH=7.2，10mMHEPES，150mMNaCl)中的500nMPP1_4-C15L8Cys24，第二种溶液含有HEPES缓冲液(pH=7.2，10mMHEPES，150mM NaCl)中的500nMPP1_4-C15L8Cys24和500nMα-酪蛋白，第三种溶液含有HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl)中的500nMPP1_4-C15L8Cys24和1000nMα-酪蛋白。靠近测量之前才在孔中准备每种溶液。将3种溶液的每个系列一式三份并且取得均值。记录仅含有溶解于缓冲液中的蛋白质的溶液的荧光，但是响应仅处于噪声水平(未报告)。

荧光光谱法确定亲和力：制备一系列溶液。每种溶液含有浓度100nM的结合物4-C15L8-PP1*，并且α-酪蛋白的浓度从1nM变化至最多10μM。全部溶液均在HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mMNaCl)中制备。观察到在525nm的荧光随总蛋白浓度的变化而变化，并且通过拟合等式(1)确定解离常数K_d。

         等式1在等式1中，F_观察是观察的荧光强度，F_结合是与α-酪蛋白结合的肽-结合物的荧光，F_游离是游离肽的荧光并且[αC]是游离α-酪蛋白的浓度。可以从等式2推导[αC]，其中[P]_tot是肽的总浓度和[αC]_tot是α-酪蛋白的总浓度。

$\&lsqb;\mathrm{\&alpha;C}\&rsqb;=-\frac{{\&lsqb;P\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}+K_d-{\&lsqb;\mathrm{\&alpha;C}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}}{2}+\sqrt{{\left(\frac{{\&lsqb;P\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}+K_d-{\&lsqb;\mathrm{\&alpha;C}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}}{2}\right)}^2+K_d{\&lsqb;\mathrm{\&alpha;C}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}}$        等式2

数值拟合用IGOR Pro4.03(WaveMetrics Inc.)进行。

下拉实验和荧光实验

一般信息：

从Bangs Laboratories,Inc.购买作为水中悬液的聚苯乙烯珠(公称直径：1μm)。Pluronic从BASF购买并且Pluronic F108-PDS由AllvivoInc.(LakeForest,CA,USA)供应。全部蛋白质均从Sigma Aldrich购买。用于凝胶电泳的全部试剂和凝胶均来自Invitrogen。使用Novex4-12%Bis-Tris凝胶1.5mm实施SDS-PAGE电泳。在MES缓冲液中实施凝胶显影。全部凝胶使用银染试剂盒SilverQuest^TM试剂盒染色。

Pluronic吸附于聚苯乙烯粒子：聚苯乙烯珠(1μm，10mg)用miliQ-水洗涤一次并且随后离心(14,000转/分钟持续7分钟)。将粒子重悬于F108-PDS的水溶液(1mL，2%)中并且翻转振摇24小时。随后通过离心(14,000转/分钟持续7分钟)分离，将Pluronic包被的粒子与过量的表面活性剂分开。随后将珠子重悬于HEPES缓冲液(pH=7.2，10mMHEPES，150mM NaCl，1mM EDTA)中，超声处理并再次离心。该过程重复三次。

多肽在聚苯乙烯珠上固定：用氮气吹扫过的HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl，1mM EDTA)洗涤Pluronic-PDS包被的聚苯乙烯珠(1μm，10mg)。此后，将珠子浸没于含有带游离半胱氨酸的肽(0.5mg)的1mL溶液中，其中所述肽溶解于氮饱和的HEPES缓冲水溶液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl，1mMEDTA)中。全部操作均在无氧条件下实施。在温育12小时后，珠用HEPES缓冲水溶液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl)洗涤(3次)，随后用含有Zn离子(pH=8.2，10mM TRIS，5mM Zn(NO₃)₂)的TRIS缓冲水溶液(pH=8)洗涤。将珠子洗涤并重悬于HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl)中。

下拉实验：如上文所述包被的聚苯乙烯珠(0.5mg-1mg)与缓冲液、乳或血清(0.5mL-1mL)温育。将悬液翻转振摇90分钟并离心(14,000转/分钟持续7分钟)。将珠团通过依次重悬于1mL HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl)中洗涤至少4次，并离心(14,000转/分钟持续7分钟)。在洗涤过程之间，偶尔实施超声波处理以便减少与表面的非特异性结合。在洗涤过程后，将珠子离心并将团块重悬于DTT溶液(1mM，于HEPES缓冲液(pH=7.2，10mM HEPES，150mM NaCl)中)(20μL)中并且伴以偶尔超声波处理温育1小时。此后，将悬液离心并通过SDS-PAGE分析和使用银染法染色上清液。根据制造商的说明书制备用于凝胶电泳的样品。

实施例4

在实施例4中，选择的靶分子是胸苷激酶(TK)。

TK负责将2-脱氧胸苷磷酸化至5'单磷酸-2'-脱氧胸苷。图16中给出对解脲支原TK的结合袋的深入认识。

高等生物具有化学上十分不同的两种同工酶TK1和TK2。TK1存在于仅预计发生细胞分裂的细胞质中，而TK2位于线粒体中并且是细胞周期非依赖性的。

TK1水平在不良分化且高度增殖的细胞(例如癌细胞)中增加。TK1因此成为抗癌药物设计以及诊断应用的有吸引力的靶。能够进一步区分不同物种的TK1形式(例如人TK1和细菌TK1)的紧密TK1结合物是有巨大意义的。

核苷是由结合于核糖或脱氧核糖的核碱基组成的糖基(图17)。最重要地，它们充当DNA和RNA链的结构单元。它们还以单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐的不同形式参与众多细胞过程。

如方案3中所示，从脱氧胸苷合成胸苷激酶的结合物。

方案3：条件：a：14(1.5当量)，NaH(1.5当量)，DMF，室温，20小时。b：1M NaOHMeOH/H₂O，0℃，1小时。c：对硝基苯酚(2.5当量)，DIPCDI(3当量)，吡啶，室温，2小时。

再次使用氢化钠条件以中等产率，使10-溴癸酸甲酯与核碱基的N³-位置偶联。TLC显示，接头A也连接至其他位置，尽管作为少量副产物。通过COSY NMR实验验证18的结构(见实验部分)。后续皂化和对硝基苯酚的导入以良好产率产生脱氧胸苷探针19。

为了研究胸苷激酶(TK)，在试验研究中使脱氧胸苷(dT)探针19与2D10L17缀合并且HPLC显示在2小时后大约80%转化成所需的缀合物。对于快速筛选实验，将dT在Tris-缓冲液中并持续3小时与8种文库肽缀合(表4)(详见实验部分)。

采用TK的荧光结合研究

估计至少60%的肽随后携带配体，将溶液稀释至2μM浓度并添加蛋白质TK。在15分钟、45分钟、2小时和20小时后，筛选荧光反应。在2小时温育时间后见到最大反应。

当添加第二当量的TK没有导致荧光强度进一步增加时，将4种肽3-C15L8-dT、2-C10L17-dT、4-C10L17-dT和3-C25L22-dT鉴定为“命中”。估计K_d是20nM或更小。

与无TK或一个当量TK相比，当两个当量TK存在时，其他4种筛选到的肽4-C15L8-dT、3-C10L17-dT、4-C25L22-dT和2-C37L34-dT显示荧光强度增加并且因此不视为紧密结合物。

在ATP存在下采用TK的结合研究

在含有和不含ATP的缓冲液中存在1、2和3当量时测量荧光强度。ATP的引入代表实际测量情况，因为它存在于生物样品中并且可能在TK存在的情况下与探针反应。在添加酶后15分钟、45分钟和2小时采集数据。在添加酶后约5分钟、45分钟和2小时后采集用于MALDI-TOF的样品以测量质量的变化。

3-C15L8-dT

在ATP存在下3-C15L8-dT的强度比ATP不存在时高。通过MALDI-TOF质谱法发现这种肽在ATP存在时45分钟后充分磷酸化，而质量分析显示在5-10分钟后一个巨大的非磷酸化肽峰。实际结合物因此是磷酸化形式的3-C15L8-dT。结合亲和力是良好但是不如4-C10L17-dT那样好。见图18和图19。

4-C10L17-dT

ATP存下4-C10L17-dT的强度与无ATP存下的那些强度明显不同。在ATP存在的情况下，全部TK浓度中的相似强度显示充分饱和水平。质量分析显示在5-10分钟后磷酸化dT-结合物的巨大峰和非磷酸化肽的较小峰，并且在45分钟后基本上仅存在磷酸化的结合物。结果显示磷酸化4-C10L17-dT对TK的强的结合亲和力。在图20和图21中显示4-C10L17-dT的荧光谱。

4-C25L22-dT

无论ATP是否存在，4-C25L22-dT的强度差异显示针对TK的总的良好结合亲和力。然而，这些强度在不同的TK浓度之间变化，在1当量TK时产生最高值。在ATP存在的情况下，发现这种肽在5-10分钟后充分磷酸化，这是最快的磷酸化速率，但是测量期间没有观察到强度的巨大差异。在图22和图23中显示4-C25L22-dT的荧光谱。

在“良好”结合物上采用dT的竞争实验

在荧光筛的后续实验中，我们尝试用TK的天然底物即脱氧胸苷(dT)竞争胜过肽-结合物。为此目的，进行两种分析，其中相对于肽结合物，将1、10、100和1000当量的dT添加至混合物。在分析I中，将蛋白质首先与“良好”肽结合物温育1小时，随后添加dT。在任何情况下都没有观察到荧光减少，这表明肽-结合物不会被dT竞争超过dT。在测定法II中，将蛋白质首先与不同浓度的dT温育，随后添加结合物-肽。旋即，观察到荧光变化，这再次表明肽-探针缀合物比dT更紧密地与TK结合。

在图24、25、26和27中，描述来自分析I和分析II的荧光谱。蓝色曲线代表含有脱氧胸苷的肽的荧光激发，粉色曲线对应于用1当量TK对肽-dT缀合物所测量的荧光激发。绿色曲线是来自分析I的结果，而橙曲线是来自分析II的结果。

实验部分

概述

仪器

层析

薄层层析(TLC)：

使用来自Fluka的Silica凝胶(在254nm的荧光指示剂，0.2mm铝层片)进行硅胶薄层层析。通过UV光(254nm)和/或用茴香醛(10ml对-茴香醛，10ml浓H₂SO₄，2ml浓乙酸，180ml乙醇)将平板染色，进行显影。

快速层析(FC)：

使用硅胶(Matrex硅凝胶

35-70μm Amicon)进行快速层析(FC)。

高效液相色谱(HPLC)：

使用分析性和/或制备性反相C-18柱在Varian ProStar系统上进行寡核苷酸的HPLC纯化。溶剂A：90%H₂O+10%ACN+0.1%TFA。溶剂B：90%ACN+10%H₂O+0.1%TFA。

NMR光谱法

在室温在Varian Unity400MHz光谱仪上测量全部NMR谱。相对于未氘化的残余溶剂峰以ppm为单位报告化学位移(δ)(对于CHCl₃，为7.27ppm；对于CHD₂OD，为3.35ppm并且对于d₆-DMSO，为2.49ppm)。以Hz为单位给出耦合常数J。多重性缩写如下：s=单峰，d=双峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，br=宽峰。

通过COSY实验进行信号归属(signal assignment)。

¹³CNMR谱以101MHz记录。相对于中部溶剂峰以ppm为单位报告化学位移(δ)(对于CDCl₃，为77.0ppm)。

质谱法

在Perkin Elmer API 150 EX上记录电喷雾电离质谱(ESI)。

MALDI-TOF

在Voyager-DE PRO系统（由Applied Biosystems提供）上记录肽的MALDI-TOF谱。

荧光光谱法

使用GeminiXPS平板读数仪和NUNC^TM聚苯乙烯96孔或384孔平板实施荧光测量。在使用之前，将平板用

F108NFPrillPooloxamer338(BASF)包被。

SDS-PAGE

使用来自Invitrogen的NuPAGE MES-SDS-试剂盒进行SDS-PAGE凝胶电泳。使用Invitrogen公司SilverQuest银染试剂盒F版将凝胶染色。

反应、化学品、肽和蛋白质

全部反应均在N₂下在加热的玻璃器具中进行。在减压下进行溶剂浓缩(槽温度<40℃)。用于反应的溶剂作为锯齿盖瓶装物从Aldrich购买(DMSO，DMF，吡啶)。在使用之前蒸馏用于提取和FC的溶剂。全部化学品均从Aldrich购买(可获得的最高质量)。

N³-癸酸-甲酯-2'-脱氧胸苷18

2′-脱氧胸苷(500mg，2.06mmol)和溴代癸酸甲酯14(800mg，3.09mmol，1.5当量)溶解于无水DMF(5ml)中并冷却至0℃。缓慢添加NaH(油中的50-60%，148.6mg，3.09mmol，1.5当量)。将悬液在N2下及在0℃搅拌15分钟，随后允许加温至室温。在16小时后通过添加饱和盐水使反应猝灭。水相用EtOAc(3x)提取，并且随后将有机相在MgSO₄上干燥，过滤并浓缩。FC纯化(硅胶，纯CH₂Cl₂至93:7的CH₂Cl₂/MeOH)产生标题化合物18(无色油，358.1mg，0.84mmol，40.7%)作为主要产物。

TLC(硅胶，93:7的CH₂Cl₂/MeOH)：R_f0.21。

LR-ESI⁺-TOF-MS(甲醇)：C₂₁H₃₄O₇N₂Na的计算值：449.49；观察值：449.0。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ(ppm))：7.75(s,1H,H-C(6)),6.20(t,1H,J=6.6,H-C(1')),5.21(d,br,1H,J=4.0,OH-C(3')),5.01(t,br,1H,J=4.8,OH-C(5')),4.24(m,1H,H-C(3')),3.76(m,2H,-CH₂),3.58(m,2H,H-C(5')),3.56(s,3H,-OCH₃),2.26(t,2H,J=7.0,-CH₂),2.01(t,2H,J=5.8,H-C(2')),1.81(s,3H,-C(5)-CH₃),1.48(d,4H,J=6.8,2x-CH₂),1.23(s,10H,5x-CH₂)。

¹³C-NMR(101MHz,DMSO-d₆,δ(ppm))：173.1,162.4,150.2,134.5,108.3,87.2,84.6,70.1,61.1,50.9,33.1,28.4,26.8,26.1,24.2,12.7。

N³-癸酸-对硝基苯基酯-2'-脱氧胸苷19

2′-脱氧胸苷衍生物18(260mg，0.61mmol)溶解于1MNaOH(2ml，1:1H₂O/MeOH)中并且在0℃搅拌1小时。随后通过添加(MeOH中的)1.25MHCl-溶液直至达到pH5，将溶液中和。将溶剂蒸发(不加热超过25℃)并且将剩余物冻干过夜。残余物溶解于无水吡啶(3ml)中，并且添加对硝基苯酚(212.3mg，1.53mmol，2.5当量)和二异丙基碳二亚胺(0.28ml，1.83mmol，3当量)。将黄色溶液在N₂下和在室温搅拌2小时，随后通过添加饱和盐水使其猝灭。用CH₂Cl₂提取，随后在MgSO₄上干燥有机相，过滤和浓缩，产生粗产物。FC纯化(硅胶，纯CH₂Cl₂至90:10CH₂Cl₂/MeOH)产生作为黄色油的标题化合物19(213.4mg，0.400mmol，65.6%)。

TLC(硅胶，97:3CH₂Cl₂/MeOH)：R_f0.12。

LR-ESI⁺-TOF-MS(甲醇)：C₂₆H₃₅O₉N₃Na的计算值：556.58；观察值：556.4。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,δ(ppm))：8.27(d,2H,J=8.8,对硝基苯酚),7.30(m,2H,对硝基苯酚),7.29(s,1H,H-C(6)),6.17(dt,1H,J=6.8,3.6,H-C(1')),4.60(m,1H),4.01(m,1H),3.92(m,2H),3.66(m,2H,-CH₂),2.59(t,1H,J=7.2),2.44(t,2H,J=6.8),2.30(t,3H,J=7.2,H-C(2')),1.93(s,3H,-C(5)-CH₃),1.76(t,2H,J=6.8,-CH₂),1.23(m,10H,5x-CH₂)。

核苷-探针与肽支架的缀合

DMSO中dT-结合物偶联的一般程序

将多肽(3mg，0.52μmol)溶解于含有10%吡啶的DMSO(1ml)中，并添加AMP-结合物或dT-结合物(3当量)。添加DIPEA(3μl)，并且将溶液在室温搅拌4-20小时。通过分析性HPLC监测反应。通过缓慢添加冷二乙醚终止反应。在离心下来后，将沉淀的肽溶解于水中(含有0.01%TFA的)，随后冻干。通过半制备性HPLC纯化粗制肽以产生大约2mg靶肽。通过MALDI-TOF-MS分析纯化的级分。

分析性HPLC：C-18柱，30分钟内10-60%B或40分钟内20-80%B。

制备性HPLC：半制备性C-18柱，40分钟内10-50%B或40分钟内20-90%B。

用于Acm脱保护的一般程序

将三氟甲磺酸银(100当量)溶解于TFA/茴香醚(99:1)中，并在0℃将1ml添加至acm-保护的多肽。2小时后，允许反应加温至室温并且随后将反应搅拌过夜。将肽用冷二乙醚沉淀、离心和倾析。将银盐溶解于50%(v/v)乙酸与DTT(50当量)中并且在室温搅拌过夜。将acm去保护的肽冻干并且通过HPLC纯化(30分钟内10-70%%B)。

缓冲液中dT-结合物偶联的一般程序

将多肽(0.5mg，0.1μmol)溶解于Tris-缓冲液(见0，97.5μl)中至浓度1mM，并且添加AMP-结合物或dT-结合物(2当量)和DIPEA(0.5μl)。0在2至4小时后取得用于荧光筛选的探针。

荧光实验

采用TK的结合研究

将NUNC^TM聚苯乙烯384孔平板(100μl-体积)和吸头尖用

涂布过夜，随后用H₂O洗涤并且干燥。在Tris-缓冲液(用于TK-研究的缓冲液：20mMTris/HCl，0.4MNaCl，0.3M咪唑，2mMDTT，50%甘油，pH7.6)中实施荧光测量。假定至少60%的dT-结合物与多肽缀合(见0)，制备浓度为60μM的母液。TK母液的浓度是0.10mM。使用95ml中2μM的多肽浓度。将蛋白质添加至含有肽缀合物的孔以产生2或4μM的TK终浓度。蛋白质-结合物混合物的荧光强度与不存在蛋白质情况下结合物的强度比较，并且与不存在蛋白质情况下结合物的强度相比，在1当量蛋白质存在下荧光强度的显著变化解释为靶蛋白被结合物复合。在2μM蛋白质存在下显示强度变化但是在4μM蛋白质存在下不显示强度进一步变化的结合物视为“命中”。假定超过90%的结合物在2μM蛋白质浓度复合，估计K_d是20nM或更小(K_d=[P][B]/[PB])。

在335nm激发丹磺酰探针并且在420-600nm记录发射。全部测量在室温进行并且一式三份。在15分钟、45分钟和2小时后读取各孔。

下拉实验

将聚苯乙烯乳胶纳米粒子(0.96μM，Bangs laboratories Inc.)用1mlMQ洗涤3次，随后与Pluronic F108-PDS(Allvivo Inc.)在室温在恒定振摇下温育过夜。在吸附后，通过以14000转/分钟离心10分钟，使得过量的表面活性剂与包被的粒子分离。珠随后用300μlMQ洗涤，随后用300μl HEPES-缓冲液1(10mM HEPES，50mM KCl，1mMEDTA，pH7.9)洗涤2次。随后使珠子摄入300μlHEPES-缓冲液1中，并且添加acm-去保护的多肽2-C10L17-AMP(大约25μg)并且使其反应1小时。在离心后，珠子用HEPES-缓冲液2(10mM HEPES，50mMKCl，pH7.9)洗涤3次。添加封闭肽(100μl，0.4mg/ml，4-C15L8K24Tfa)并且温育1小时。在离心及在200μlHEPES2中洗涤3次后，将珠子摄入200μl HEPES2中。添加Nuclear-resp.HeLa胞质提取物(BIOTECH)(150μl)并将珠子温育1小时。将珠离心下来并用HEPES2洗涤6次(每次300μl)，随后重悬于100mM DTT(100μl)中并温育20分钟以切下多肽-蛋白质缀合物。将珠以14000转/分钟持续10分钟离心下来并且收集上清液(K.Fromell,HultingG.,IlichevA.,LarssonA.,CaldwellK.D.,Anal.Chem.2007,79,86019)。

加载5μl样品缓冲液和15μl探针至各个孔，通过SDS-PAGE分析样品。将凝胶以200V电泳35分钟。

实施例5

在本实施例中，使用维生素D结合蛋白作为靶分子。

维生素D分子家族与调节高等生物中的钙和磷代谢相关，并且各种维生素D衍生物已经显示影响疾病病况如佝偻病、骨质疏松症、乳腺癌、前列腺癌、银屑病和阿尔茨海默病。维生素D衍生物对这些及其他疾病的影响已经激励广泛的研究工作，其中已经合成并以生物学方式评价大量的维生素D衍生物。维生素D衍生物的生物学评价包括体内和体外研究，后者经常调查各种维生素D衍生物与受体蛋白结合的能力。两种广泛研究的这类受体蛋白是维生素D受体(VDR)和维生素D结合蛋白(DBP)。后者是维生素D及其代谢物在血清中的主要载体，并且因此它是身体中维生素D水平的重要调节物。考虑到维生素D在健康和疾病中的重要性，异常血清DBP水平与疾病病状相关并不令人惊讶(Finehout,E.J.；Franck,Z.；Choe,L.H.；Relkin,N.；Lee,K.H.Ann Neurol2007,61,120-129.Zhang,J.；Sokal,I.；Peskind,E.R.；Quinn,J.F.；Jankovic,J.；Kenney,C.；Chung,K.A.；Millard,S.P.；Nutt,J.G.；Montine,T.J.Am J ClinPathol2008,129,526-529.Liu,X.-D.；Zeng,B.-F.；Xu,J.-G.；Zhu,H.-B.；Xia,Q.-C.Proteomics2006,6,1019-1028)。使用体液中的DBP水平作为阿尔茨海默病、ALS和帕金森病的生物标记将是高度令人感兴趣的。精确和快速测量DBP则是基本要求，并且在本发明分子工具的一项应用中，提供了维生素D衍生物的肽缀合物，其可能因结合强度增加和多功能性而潜在有用。构思了如此提供的多肽缀合物将是测量体液中DBP水平的重要工具，其中所述DBP水平作为阿尔茨海默病、ALS和帕金森病及与体液中DBP水平相关的任何其他病症的生物标记。

配备间隔团的小分子配体的合成最近已经发表(Q.；Zhang,T.；Norberg,J.；Bergquist,L.；Baltzer.Tetrahedron2010,66,4577-4586)。方案4中概述了最成功的小分子配体25OHVD₃(即碳原子25上羟化的维生素D)的合成途径。

方案4.(a)NaIO₄/RuCl₃/CCl₄-CH₃CN-磷酸盐缓冲液/45℃/2-4日，43%-55%；(b)TESCl/咪唑/DMF/室温/过夜，97%；(c)(i)LDA/THF/-78℃/1小时；(ii)TMSCl/-78°C至0℃；(d)Pd(OAc)₂/THF-CH₃CN/室温/过夜，75%(来自22)；(e)(i)10/t-BuLi/-85℃/Et₂O/1.5小时；(ii)CuI·n-Bu₃P/-85°C至-50℃/1小时；(iii)23/-78°C/2h，73%；(f)PPTs/丙酮-H₂O/reflux/17小时；(g)Ph₃P=CHCO₂Et/CH₂Cl₂/室温/过夜，83%(来自24)；(h)Pd-C/H₂/MeOH/2h，100%；(j)TESCl/咪唑/DMF/室温/6小时，97%；(k)TESCl/咪唑/DMF/室温/过夜，69%；(l)(i)28/n-BuLi/-78℃/40分钟；(ii)27/-78℃/2小时，84%；(m)PPTs/丙酮-H₂O/回流/3小时，100%；(n)LiOH·H₂O/THF-H₂O/室温/44小时；(o)对硝基苯酚/DCC/DMAP/CH₂Cl₂/室温/2.5小时，76%(来自30)。

图29中显示装配的结合物分子的图示。图30中显示设计构思。

使用Biacore2000仪(Biacore，瑞典乌普萨拉)通过表面等离子体共振法测定针对维生素D结合蛋白的亲和力。维生素D结合蛋白通过胺偶联法固定至CM5传感芯片(Biacore)的表面。固定和相互作用研究在25℃在作为运行缓冲液的pH7.4的10mM Hepes缓冲液(HBS-EP缓冲液，Biacore)中实施，所述Hepes缓冲液含有150mM NaCl、1mMEDTA和0.005%表面活性剂P20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇)，同时添加有5%v/vDMSO。将结合物在运行缓冲液中稀释并且在固定的蛋白质上以10-85nM的浓度系列以流速30L/分钟注射3分钟。注射10mMpH4的乙酸钠缓冲液有效地再生蛋白质传感器表面。实验重复至少3次。

5中显示通过将1:1相互作用模型的等式与实验结果拟合而获得的解离常数值。发现4-C15L8-6C-25OHVD₃(即配体-多肽缀合物，其中多肽是4-C15L8，配体是在碳25上羟化的维生素D3并且经6-碳间隔团与多肽连接的)具有最高亲和力。所述系列中的总变异是系数40，这清楚显示多肽缀合对亲和力的影响。

*VD₃是维生素D3；25OHVD₃是在碳25具有羟基的维生素D₃衍生物。

实施例6

在实施例6中，选择的靶分子是D-二聚体蛋白并且配体是GPRP肽。

人血液中的凝血过程是分子事件级联，包括酶促切割纤维蛋白原以形成纤维蛋白，所述纤维蛋白聚集成蛋白原纤维(proteofibril)，其在D片段位点处交联时形成不溶性凝胶并且随后形成血凝块。(Furie,B.和Furie,B.C.(2005)Thrombus formation in vivo(体内血栓形成).J.Clin.Invest.115,3355-3362.

Davie,E.W.(1964)Waterfall sequence for intrinsic blood clotting(内在血液凝固的级联顺序).Science145,1310-1312)。血凝块的酶降解释放交联的D片段，称作D-二聚体，所述D片段在正常情况下不存在于血液中，除非凝血已经发生，并且D-二聚体因此充当血栓形成的生物标记。(Lippi,G.,Cervellin,G.,Franchini,M.和Favaloro,E.J.(2010)Biochemical markers for the diagnosis of venous thromboembolism:thepast,present and future(诊断静脉血栓栓塞的生物化学标记：过去、现在和未来).J.Throm.Thrombolysis30,459-471.Wada,H.和Sakuragawa,N.(2008) Are fibrin-related markers useful for diagnosis ofthrombosis?(纤维蛋白相关标记可用于诊断血栓形成吗?)Semin.Thromb.Hemost.34，33-38)。测量血液中的D-二聚体浓度是认可和常见的诊断试验，它常用来排除血栓栓塞病的可能性。(Linkins,L.-A.,Bates,S.M.,Ginsberg,J.S.和Kearon,C.(2004)Use of differentD-dimerlevels to exclude venous thromboembolism depending on clinical pretestprobablility(取决于临床检验前概率，不同D-二聚体水平排除静脉血栓栓塞的用途).J.Throm.Haemost.2,1256-1260)。

需要D-二聚体蛋白的特定高亲和力结合物用于在生物分析应用中，尤其体外诊断领域内测量D-二聚体水平。在诊断应用中，单克隆抗体是金标准并且识别在蛋白质表面上单克隆抗体以高亲和力和选择性与之结合的特异性表位。最近，我们报道了基于有机小分子与42-残基多肽缀合而识别和结合蛋白质的替代性策略，经证实这项技术显示提供性能等同于或好于一般抗体的小型和加强的结合物分子。(Baltzer,L.(2011)Crossing borders to bind proteins-a new concept in  protein recognition based on the conjugation of small organic molecules  or short peptides to polypeptides from a designed set.(跨界结合蛋白质- 基于有机小分子或短肽与来自设计集合的多肽缀合的蛋白质识别新 概念)Anal.Bioanal.Chem.400,1653-1664)。要求这种有机分子仅对蛋白质具有适中的亲和力和选择性并且多肽选自仅有16个成员的集合，其中将所述成员设计成强化对任何蛋白质的亲和力和选择性。这些小分子配体和多肽显示在缀合后协作结合结合于蛋白质如C-反应蛋白(CRP)和人碳酸酐酶II(HCAII)。(Tegler,L.T.,Nonglaton,G.,

Caldwell,K.,Christopeit,T.,Danielson,U.H.,Fromell,K.,Gossas,T.,Larsson,A.,Longati,P.,Norberg,T.,Ramapanicker,R.,Rydberg,J.和Baltzer,L.(2011)Powerful Protein Binders from Designed Polypeptidesand Small Organic Molecules-A General Concept for ProteinRecognition(来自设计的多肽和有机小分子的有力蛋白质结合物-用于蛋白质识别的一般概念).Angew Chemie Int Ed.50,1823-1827.Enander,K.,Dolphin,G.,andBaltzer,L.(2004)Designed,functionalizedhelix-loop-helix motifs that bind Human Carbonic Anhydrase II:a newclass of synthetic receptor molecules(结合人碳酸酐酶II的设计的官能化螺旋-环-螺旋基序：新类别的合成性受体分子).J.Am.Chem.Soc.126,4464-4465.Tegler,L.T.,Fromell,K.,Jonsson,B.-H.,Viljanen,J.,Winander,C.,Carlsson,J.和Baltzer,L.(2011)Polypeptide conjugatebinders that discriminate between two isoforms of human Carbonicanhydrase in human blood(区分人血液中人碳酸酐酶的两种同工型多肽缀合物结合物).ChemBioChem.12,559-566.Andersson,T.,Lundquist,M.,Dolphin,G.T.,Enander,K.,Jonsson,B-H.,Nilsson,J.W.和Baltzer,L.(2005)The binding of Human Carbonic Anhydrase II by functionalizedfolded polypeptide receptors(人碳酸酐酶II由折叠的官能化多肽受体结合).Chem.Biol.12,1245-1252)。这些结合物的亲和力比小分子的那些亲和力高2至4个数量级，虽然这些多肽先前与CRP或HCAII不具有任何关系并且结合并没有强烈到足以独立地测量。多肽缀合物的分子量处于5-6kD范围内并且因此是IgY的大约1/30。它们不具备有序结构并且适应于生物靶的表面。这种构思不同于生物产生的结合物分子。尽管使用有机小分子作为官能团在设计蛋白质的高亲和力结合物方面是一项有吸引力的策略，原因是它们稳定并且不被天然酶识别，但是考虑(例如，来自噬菌体展示技术)可鉴定的序列的数目，可用肽的汇集物实质上是无穷的。(Smith,G.P.和Petrenko,V.A.(1997)Phagedisplay(噬菌体展示).Chem.Rev.97,391-410)。因此十分有意义的是，确定是否也可以通过缀合短肽而非有机小分子来获得紧密结合物，因为这将大幅度扩充容易获得的候选结合物集合。

开发D-二聚体的结合物是基于肽的多肽缀合物的概念验证展示的有吸引力目标，因为D-二聚体是验证过的生物标记并且因为存在经充分表征并且已知以25MKd结合D-二聚体的短肽，GPRP。(Laudano,A.P.和Doolittle,R.F.(1980)Studies on synthetic peptidesthat bind to fibrinogen and prevent fibrin polymerization.Structuralrequirements,number of binding sites,and species differences(关于与纤维蛋白原结合并防止纤维蛋白聚合的合成肽的研究-构性要求、结合位点数目和物种差异).Biochemistry19,1013-1019.Laudano,A.P.和Doolittle,R.F.(1981)Influence of calcium ion on the binding of fibrinamino terminal peptides to fibrinogen(钙离子对纤维蛋白氨基端肽与纤维蛋白原结合的影响).Science212,457-459)。纤维蛋白原的E结构域的GPRV序列参与活化的纤维蛋白原的聚集以形成纤维蛋白并随后形成高级聚集物，并且已知与D-结构域上的结合位点特异性结合。(Olexa,S.A.和Budzynski,A.Z.(1980)Evidence for four differentpolymerization sites involved in human fibrin formation(参与人纤维蛋白形成的4个不同聚合位点的证据).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,1374-1378.Pratt,K.P.,Cote,H.C.F.,Chung,D.W.,Stenkamp,R.E.和Davie,E.W.(1997)Theprimary fibrin polymerization pocket:three-dimensional structure of a30-kDa C-terminal γ chain fragmentcomplexedwiththepeptideGLy-Pro-Arg-Pro(主要纤维蛋白聚合袋：与肽GLy-Pro-Arg-Pro复合的30-kDaC端γ链片段的三维结构).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94,7176-7181)。开发了GPRP序列并且发现它比GPRV以更高亲和力与D-二聚体结合。已经解析D-二聚体和GPRP之间的复合物的结构并且已经显示N端Gly残基参与同GPRP结合裂隙中的氨基酸残基形成氢键合。(Spraggon,G.,Everse,S.J.和Doolittle,R.F.(1997)Crystal structures of fragment D from human fibrinogen andits crosslinked counterpart from fibrin(来自人纤维蛋白原的片段D及其来自纤维蛋白的交联对应物的晶体结构),Nature389,455-462.Everse,S.J.,Spraggon,G.,Veerapandian,L.,Riley,M.和Doolittle,R.F.(1998)Crystal structure of fragment double-D from human Fibrin with twodifferent bound ligands(来自人纤维蛋白的片段双-D加两种不同所结合配体的晶体结构)Biochemistry37,8637-8642)。

在本实施例中，显示与来自本发明的所设计的42-残基序列集合的多肽连接的GPRP肽形成针对D-二聚体的有力结合物(图31)。

结果和讨论

设计

所用的16成员多肽集合如图1中显示。

如本文以上指出，结合物开发的重要方面是间隔团的选择。间隔团的尺寸决定蛋白质表面多大程度是多肽可接近的。直观上，将预期选择性随间隔团长度增加而下降而亲和力可能增加。经验表明，脂族间隔团产生最高亲和力，这可能原因在于附加的与蛋白质的疏水性接触，而聚乙二醇间隔团显示较弱结合作用。(Gao,J.,Qiao,S.和Whitesides,G.M.(1995)Increacing binding constants of ligands tocarbonic anhydrase by using“greasy tails”(通过使用“脂性尾”增加碳酸酐酶配体的结合常数).J.Med.Chem.38,2292-2301.Jain,A.,Huang,S.G.和Whitesides,G.M.(1994)Lack of effect of the length ofoligoglycine-and oligo(ethyleneglycol)-derived para-substituents on theaffinity of benzenesulfonamides for carbonic anhydrase II in solution(溶液中低聚甘氨酸衍生和低聚(乙二醇)衍生的对位取代基的长度不影响苯磺酰胺对碳酸酐酶II的亲和力).J.Am.Chem.Soc.116，5057-5062)。在设计D-二聚体的结合物时，引入6碳间隔团以基于与C-反应蛋白的相似之处，使GPRP与多肽连接。

从这种复合物的晶体结构分析GPRP与D-二聚体的结合，并且最重要的是，发现N端Gly参与结合。间隔团因此不得不与C端Pro残基连接。此外，为了使间隔的小分子配体与肽连接，在间隔团的羧基处掺入Gly残基，主要为了易于合成，因为用于短肽的固相肽合成的最合适的树脂配有预载的Gly。

合成

多肽的合成遵循标准SPPS Fmoc操作方案并且先前已经详细报道。(Tegler,L.T.,Nonglaton,,G.等人,(2011)，见上文)。它们由半制备性反向HPLC纯化并由MALDI-TOF质谱法鉴定。也在固相上合成并且如以下实验部分中所述那样纯化和鉴定配备辛酸间隔团的GPRP，所述辛酸间隔团由转化成对硝基苯酯的Gly残延长。缀合反应在DMSO中以基本上定量的反应实施并且如上述多肽那样纯化和鉴定最终结合物分子，见实验部分。

结合物的选择

在Biacore分析中评价通过缀合每种多肽至间隔团GPRP所获得的候选结合物的16成员集合，其中D-二聚体固定在芯片上并且允许结合物分子在标准运行缓冲液中以0、1、10和100nM的浓度在芯片上方流过。获得的初步结果展示，结合物4D15L8-GPRP、4D10L17-GPRP、4D25L22-GPRP与D-二聚体强烈结合。对于描述D-二聚体蛋白和15种多肽缀合物之间相互作用的传感图和估计的解离常数，参见表6和图32。在100nM浓度，摄取是明显的，并且还在10nM浓度观察到一些摄取，而对于1nM溶液，没有观察到结合。为了效率，从称量肽制备结合物溶液并且报告的浓度可能存在20-30%误差。这不影响结合物是最紧密的结论，因为滴定步骤为数众多，但是可能产生不正确的最佳结合物排序。因此基于最大摄取，还基于从1:1结合模型与实验数据的最佳拟合获得的Kd值，选择7种结合物用于进一步结合分析。尽管1:1模型的拟合远算不上优异并且应当非常谨慎地对待获得的Kd，然而来自Biacore的摄取的估计值的联合排序与Kd“值”是合理吻合的。对于估计的解离常数，参见表6。

表6通过SPR相互作用分析测量的D-二聚体蛋白和结合物的解离常数(Kd)

通过使用Biaevaluation程序3.2版(Biacore)并且假定简单1:1朗格缪尔结合机理，获得解离常数Kd。

在Biacore筛选实验中摄取量多于100RU的还具有小于1μM表观Kd的结合物视为中等至紧密结合物，而摄取量小于100RU和Kd高于1μM的那些结合物视为弱结合物并且不再予以考虑。

随着将浓度为0nM(纯粹缓冲液)、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM和160nM的结合物用于SPR相互作用分析，以更高的分辨率研究D-二聚体蛋白和7种选择的结合物之间的相互作用，图33A，并且通过定量性氨基酸分析测定浓度。传感图显示，来自4-系列的结合物比来自4-系列的那些结合物以更高亲和力结合，表明带更多正电荷的多肽更好与结合位点附近的D-二聚体的表面区域结合。为了显示结合物分子按设计结合，使用Biacore实施竞争实验，其中在运行缓冲液中包含一定浓度范围内的GPRP以抑制与D-二聚体的结合，图34。作为对照，也监测GPRP结合。100nM4-D10L17-GPRP的结合作用被标准运行缓冲液中的1mMGPRP完全抑制，并且随GPRP浓度变化而下降，其中在大约50μM的GPRP浓度观察到50%抑制，这对应于结合物的亲和力比GPRP高500倍。结果显示，GPRP残基对于结合至关重要，结合物分子与GPRP结合位点特异性结合并且多肽促进GPRP的亲和力几乎3个数量级，全部符合设计。为了确定溶液中的解离常数在不受表面效应影响，将荧光素荧光团与结合物4-C15L8-GPRP的Cys侧链缀合。用D-二聚体蛋白仔细滴定相应的结合物分子，随后进行数据分析，其中确定描述1:1复合物解离的等式与实验结果的最佳拟合，图35。发现解离常数是3nM，或比GPRP四肽的溶液亲和力大4个数量级。(Laudano,A.P.和Doolittle,R.F.(1980)，见上文)。

为了进一步强化结合性能，通过使螺旋-环-螺旋基序的环区内去保护的Cys残基与双官能接头反应，使4-系列结合物二聚化以形成聚乙二醇连接的螺旋-环-螺旋二聚体。来自3-和4-系列的经证实是最强结合物的7种结合物二聚化并通过Biacore分析它们与D-二聚体的结合，图33B。与单体性结合物分子相比，基于观察到增加的摄取量，通常对全部结合物观察增加的结合物性能。难以根据Biacore数据从下降的解离常数定量地确定亲和力的实际增加，原因在于1:1朗格缪尔模型与实验数据拟合不良。然而，摄取量明显增加，并且通过1:1朗格缪尔模型与实验数据拟合所获得的解离常数显示相对亲和力因二聚化而增加2-4倍，参见表7。

表7来自SPR相互作用分析的结合物的D-二聚体结合的解离常数Kd

通过使用Biaevaluation程序3.2版(Biacore)并且假定简单1:1朗格缪尔结合机理，获得解离常数Kd。

对于结合物4-C2522-GPRP，二硫键比PEG间隔团产生更好的性能并进一步强化亲和力2倍并且因此强化亲和力总计几乎一个数量级。因此使结合物分子二聚化的简单化学过程显示进一步增加亲和力5-10倍，因而能够从轻易自噬菌体展示肽生成早期阶段可获得的具有低级至中等μM亲和力的肽开发基于肽的具有高pM亲和力的结合物分子。期望更充分发展的噬菌体展示肽与设计多肽的连接产生具有按比例更高亲和力的结合物分子。

从结合D-二聚体时所获得的传感图类似于从传感器分析其他蛋白质时获得的那些传感图，在于它们不显示饱和，并且标准动力学模型应用于实验结果并不产生良好拟合。相反，结合作用的荧光滴定实验以及Rif、反射干涉光谱学(Albrecht,C.,Fechner,P.,Honcharenko,D.,Baltzer,L.和Gauglitz,G.(2010)A new assay design for clinicaldiagnostics based on alternative recognition elements(基于交替识别元件的经设计用于临床诊断的新测定法).Biosens.Bioelectron.25,2302-2308)显示预期的行为，并且从Biacore量值获得不良拟合的原因仍不清楚。动力学曲线清楚地不显示单指数行为，不过需要非常复杂的模型来阐明结合动力学。

然而，数据显示基于GPRP肽的结合物的强烈摄取和紧密结合。

实验部分

全部试剂和溶剂均从商业来源购买并且无需进一步纯化就使用。在60F254二氧化硅和60F254氧化铝平板(Merck)上进行薄层层析(TLC)并且用UV光(λ=254nm)使各点可视化。在Varian Inova500MHz(499.9MHz)光谱仪上记录¹H NMR谱并且在Varian Unity400MHz(100.6MHz)光谱仪上记录¹³C NMR谱。使用氘化氯仿作为溶剂在25℃记录波谱。使用TMS作为内参(1Hδ0.0)以ppm为单位报告化学位移(δ)并且以Hz为单位报告残余氯仿信号(13Cδ77.0)和耦合常数(J)。在PerkinElmer SCIEX API150EX光谱仪上以阳离子模型记录低分辨率质谱。人D-二聚体蛋白从Abcam Inc.UK获得。

肽合成

使用标准芴基甲氧羰基(Fmoc)操作方案，以O-(7-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU，Iris Biotech GmbH)和二异丙基乙胺(DIPEA，Aldrich)作为活化剂在Pioneer自动化肽合成仪上合成肽。通过二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶除去Fmoc保护基。在每次偶联中用Fmoc-甘氨酸-聚乙二醇-聚苯乙烯(Fmoc-Gly-PEG-PS)或Fmoc-PAL-PEG-PS(Applied biosystems)树脂和4倍过量的氨基酸，以0.1mmol规模进行合成。氨基酸的侧链(Calbiochem-Novabiochem AG，Iris Biotech GmbH)由碱稳定基团保护：叔丁酯(Asp、Glu)，三苯甲基(His、Asn；Gln)、叔丁氧基甲基(Lys)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Arg)。

通过烯丙氧羰基(Alloc)基团分别正交保护C15L8、C10L17、C25L22和C37L34序列中的赖氨酸残基15、10、25和34实现在每种多肽中位点特异性导入荧光探针。在室温在N₂下2小时期间，通过用三氯甲烷中的四(三苯基膦)钯(0))(Pd(Ph₃)₄)、乙酸和N-甲基吗啉(比率37:2:1v/v；10mL每克树脂)处理树脂，进行烯丙氧羰基的脱保护。树脂连续用DMF中的0.5%DIPEA和DMF中的0.5%v/v二乙基二硫代氨基甲酸、DMF和DCM洗涤并且脱水。

7-甲氧基香豆素-3-羧酸与赖氨酸侧链的氨基的偶联在室温于DMF中在2小时期间伴以温和搅拌用两倍过量的由偶联混合物活化的酸进行，所述偶联混合物由比率12:6:6的N-N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)组成。在2小时后，添加偶联混合物的额外等分试样并留下反应过夜。对于每种多肽，通过用三氟乙酸(TFA)、水和三异丙基硅烷(95:2.5:2.5v/v，10mL每克聚合物)在室温处理2上小时实现脱保护和从树脂切下。在过滤和浓缩后，通过添加冷二乙醚、离心、在二乙醚中洗涤和空气干燥，使肽析出。粗制肽通过孔径粒度

的半制备性HypersilC-18Gold柱或者孔径

粒度

的半制备性Kromasil C8Hichrom柱上反相HPLC来纯化，用浅35-55%乙腈梯度（水中）和0.1%TFA作为添加物以10mL/分钟流速洗脱。收集的级分通过MALDI-TOF质谱法(Bruker Daltonics Ultraflex II TOF/TOF)鉴定、浓缩并且冻干2次。

具有间隔团的GPRP配体的合成(图36)

六肽配体的制备

通过连接6-氨基己酸残基与C-末端处的脯氨酸残基，合成用于GPRP配体的6碳间隔团。在预载有甘氨酸(0.75mmol/g)的氯三苯甲基树脂上使用手动SPPS(使用Fmoc/^tBu策略，该策略使用PyBOP用于活化、2倍过量的氨基酸和偶联试剂)以0.5mmol规模进行肽的合成。精氨酸侧链和N端甘氨酸分别作为Pbf和Boc基受到保护。通过用CH₂Cl₂(10mL)中的1.5%TFA处理5分钟，从树脂切下从SPPS获得的六肽。树脂用CH₂Cl₂(2x5mL)中的1%TFA洗涤以确保完全切下肽。将肽溶液用饱和柠檬酸洗涤以除去溶液中存在的任何游离胺(因Pbf或Boc基团的脱保护所形成)并且在MgSO₄上干燥及浓缩。粗制残余物直接用于活性酯的制备。

制备用于缀合的活性酯

将粗制六肽溶解于无水CH₃CN(10mL)中并且在0℃搅拌。将吡啶(2mL)，DIC(0.3mL，4当量)和对硝基苯酚(0.28g，4当量)添加至肽溶液，并且继续搅拌15小时(过夜)。将反应混合物在真空下浓缩，残余物溶解于CH₂Cl₂(50mL)中并且用饱和柠檬酸(2x50mL)洗涤。将活性酯的CH₂Cl₂溶液在MgSO₄上干燥并且通过蒸发将溶液体积缩减至10mL。粗产物通过硅胶(60-90目)柱层析纯化，由CH₂Cl₂中的0至100%丙酮洗脱。肽的活性酯作为白色固体(150mg，30%总产率)获得。

Biacore测量

固定.在固定之前，用NAP5(GE Healthcare Bio-Sciences，乌普萨拉，瑞典)将D-二聚体蛋白的储存缓冲液变成pH4.6的10mM NaOAc。蛋白质随后用pH4.6的10mM NaOAc进一步稀释以产生约32μg/ml的浓度。通过胺偶联，以HBS-EP(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005%P20)(GE Healthcare Bio-Sciences，乌普萨拉，瑞典)作为运行缓冲液，将D-二聚体蛋白共价地固定在传感芯片表面上。通过注入EDC/NHS(200mM1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/50mMN-羟琥珀酰亚胺)(GE Healthcare Bio-Sciences，乌普萨拉，瑞典)溶液将CM5传感芯片表面活化7分钟。将D-二聚体蛋白以流速5uL/分钟在活化的表面上注射1.5分钟并且随后7分钟脉冲的pH8.5的1M乙醇胺以使残余活性酯失活。最终固定水平在6000和7500共振单位(RU)之间。

相互作用分析.使用在25℃平衡的Biacore2000仪(GE HealthcareBio-Sciences，乌普萨拉，瑞典)研究D-二聚体蛋白和结合物之间的相互作用以及表面竞争实验。CM5传感芯片(研究级，Biacore)和试剂来自GE Healthcare Bio-Sciences，乌普萨拉，瑞典。对于固定的D-二聚体蛋白和多肽缀合物之间的直接相互作用研究，使用HBS-EP作为运行缓冲液。对于初始筛选，使用3分钟接触时间，将多肽缀合物在运行缓冲液中稀释并且在固定的蛋白质上以5-160nM或1-100nM的浓度系列注射。对于最小样品分散体，将样品以流速50uL/分钟注射。在10分钟解离后，通过30秒脉冲注射pH3.0的10mM甘氨酸使表面再生。全部注射是连续的并且首先通过失活的葡聚糖表面并且随后在固定的表面上通过。对于每次测量系列，包含空白注射并且将其从数据中扣除。除非另外声明，否则实验进行至少2次。在表面竞争分析中，在固定的D-二聚体蛋白上方注射结合物4-D10L17-GPRP(100nM)与0-1mM范围内多种浓度GPRP的一系列混合物。使用Biaevaluation程序3.2版(Biacore)并且假定简单1:1朗格缪尔结合机理，获得解离常数Kd。

荧光素与4-D15L8-GPRP的偶联

将环区域内含有游离半胱氨酸的1.27mg(22.0μmol)4-D15L8-GPRP溶解于0.1M NaPi，pH7.3(1mM)中的N2(g)鼓泡的210μL6M GuHCl内并且与预溶解于10μL DMSO中的4摩尔当量(0.38mg)的荧光素-5马来酰亚胺(Pierce Biotechnology)在室温温育4小时。反应后，使用GraceVydac，MSC₁₈柱(4.6x150mm)伴以30至55%ACN的ACN:H2O浅梯度，进行分析性反相HPLC。使用α-氰基-4-羟肉桂酸和2-(4-羟-苯偶氮)-苯甲酸的混合物作为基质，以正模式检测，用MALDI-MS(VoyagerPRO，Applied Biosystems)证实产物的身份。在反应完成后，通过反相HPLC纯化荧光素-肽缀合物并且将汇集的级分蒸发和冻干。

荧光光谱法确定亲和力

在25℃在Fluoromax GeminiXPS微板读数仪上记录荧光谱。激发波长是495nM并且在510-600nM范围内监测发射。在实验设计之前，全部塑料(管、吸头和微板)均用1%

Prill Polaxamer338(BASF)水溶液包被12小时，随后用水彻底洗涤，以便使非特异性表面相互作用最小化。对于亲和力测定，在384孔黑色微板(Nunc)中建立100nM荧光素标记的4-D15L8-GPRP在N₂(g)鼓泡的磷酸盐缓冲盐水(50mM  NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH7.5)中的样品。随后添加来自D-二聚体溶液(AbcamInc.UK，3.0μM，0.6μM，0.1μM和10nM)的等分试样至1.0nM至1.5μM范围内的孔。0.6μM至10nM溶液从3.0μM母液用磷酸盐缓冲盐水稀释。在全部孔中的总体积是100μL并且由缓冲液体积补足。监测到在525nm的荧光强度随总蛋白浓度的变化而变化，并且在假定1:1结合模型时，通过将以下等式与实验结果拟合，确定解离常数K_d：

$F_{\mathrm{obs}}=\frac{F_{\mathrm{bound}}\&CenterDot;\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;+F_{\mathrm{free}}\&CenterDot;K_d}{\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;+K_d}$

F_obs是观察到的荧光强度，F_结合是与D-二聚体结合的肽的荧光，F_游离是游离肽的荧光，并且[Ddim]是游离D-二聚体的浓度。可以从以下等式推导出[Ddim]：

$\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;=-\frac{{\&lsqb;P\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}+K_d-{\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}}{2}+\sqrt{{\left(\frac{{\&lsqb;P\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}+K_d-{\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}}{2}\right)}^2+K_d}\&CenterDot;{\&lsqb;\mathrm{Ddim}\&rsqb;}_{\mathrm{tot}}$

，其中[P]_tot是肽的总浓度并且[Ddim]_tot是D-二聚体的总浓度。拟合用IGOR Pro6.0软件(WaveMetrics Inc.)进行。

Claims (15)

1.一种在提供能够结合靶分子的分子的方法中使用的分子工具，所述工具包含根据SEQ ID NO1-32中任一种或几种的多种多肽，所述每种多肽具有能够结合靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与选自所述多肽序列的位置8、17、22和34中的位置内的氨基酸连接，和检测与靶分子结合的报道基团，所述报道基团通过酰胺键与选自所述多肽序列的位置15、10、25和37中的位置内的氨基酸连接。

2.根据权利要求2所述的分子工具，其中所述多肽是根据选自SEQ ID NO1-32的至少两种不同SEQ ID NO。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的分子工具，其中每种多肽的配体与8、17、22或34位置内独立选自赖氨酸、鸟氨酸和2,4-二氨基丁酸的氨基酸连接，并且每种多肽的报道基团与15、10、25或37位置内独立选自赖氨酸、鸟氨酸和2,4-二氨基丁酸的氨基酸连接。

4.筛选能够结合靶分子的配体-多肽缀合物的方法，所述方法包括

-提供至少一种缀合物分子，所述缀合物分子包含具有选自SEQID NO1-32的序列的多肽，所述多肽具有所述靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置8、17、22和34的位置，并且所述多肽具有报道基团，所述报道基团通过酰胺键与能够同所述报道基团形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处在所述多肽序列中选自位置15、10、25和37的位置；

-使所述靶分子与所述缀合物分子接触；并且

-检测来自所述报道基团的信号。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括提供一组2至16种缀合物分子，所述缀合物分子具有选自SEQ ID NO1-32的不同多肽序列。

6.一种配体-多肽缀合物，所述缀合物包含具有选自SEQ ID NO1-32的序列的多肽，所述多肽具有所述靶分子的配体，所述配体通过酰胺键与选自位置8、17、22和34的位置内能够形成酰胺键的氨基酸连接。

7.根据权利要求6所述的用于疗法中的配体-多肽缀合物。

8.一种药物组合物，包含根据权利要求6或权利要求7所述的配体-多肽缀合物和可药用载体。

9.一种多肽，其具有选自SEQ ID NO1-32的序列。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中能够结合靶分子的配体通过酰胺键与能够同所述配体形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处于选自所述多肽序列的位置8、17、22和34中的位置内。

11.根据权利要求10所述的多肽，其中所述靶分子是蛋白质或多肽。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的多肽，其中用于检测与靶分子结合的报道基团通过酰胺键与能够同所述报道基团形成酰胺键的氨基酸连接，所述氨基酸处于选自所述多肽序列的位置15、10、25和37的位置内。

13.一种多肽，其是独立选自根据权利要求9至12中任一项所述的多肽中的两种多肽的二聚体。

14.多种多肽，其包含根据权利要求9至13中任一项所述的至少两种不同多肽。

15.根据权利要求14所述的多种多肽，其包含具有选自SEQ IDNO 1-32的不同SEQ ID NO的多肽。

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