CN115490672B

CN115490672B - 一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115490672B
Application number: CN202211207815.8A
Authority: CN
Inventors: 杨晴来; 伍桂龙; 李娜; 谭啸峰
Original assignee: University of South China
Current assignee: University of South China
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2042-09-30
Also published as: CN115490672A

Abstract

本发明提供了一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用，属于抗菌药物技术领域。在808nm激光的照射下，本发明提供的光敏剂IR820‑DAA光热转换效率为34％，具有优异的光热转换能力，满足光热治疗细菌感染的要求；本发明提供的光敏剂IR820‑DAA具有良好的活性氧生成能力，可以通过酶促反应参与细菌壁的合成，在激光照射下，IR820‑DAA兼具PTT‑PDT的联合抗菌效果，能够破坏细菌的细胞膜结构，从而提高抗菌效率。同时IR820‑DAA表现出良好的水溶性和临床转化的生物安全性，甚至对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的生物膜具有降解活性。

Description

一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗菌药物技术领域，特别涉及一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染已成为全球公共卫生的主要威胁，由于发病率和死亡率高，给整个世界带来了经济负担。如今，各种抗生素药物已经发展成为临床治疗致病菌感染的主要方法之一。然而，过度使用和滥用抗生素会导致耐药菌株甚至是超级细菌的出现。因此，迫切需要开发创新的替代性抗菌疗法，以减少对抗生素治疗的依赖。令人欣慰的是，最近已经利用各种抗菌纳米材料和一些新的治疗策略来解决致病菌的感染问题，例如光热疗法(PTT)、光动力疗法(PDT)和光催化疗法等。

其中，PTT和PDT由于具有微创、易于定位和高效的特点，比传统的抗菌策略更具优势。在光热过程中，药剂产生的局部热量可以破坏细菌膜，提高通透性，使蛋白质/酶变性，然后导致细胞死亡。此外，在各种光热剂中，近红外(NIR)有机染料，特别是吲哚青绿(ICG)，具有更好的生物降解性和生物安全性，经美国食品和药物管理局批准用于临床，不会长期停留在体内，长期毒性风险低。然而，吲哚青绿作为光热试剂时，抗菌效率还有待进一步提升，需要生物体长期暴露在近红外激光下以满足杀菌要求，容易产生炎症和对附近健康组织的热损伤。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用，本发明提供的兼具光热和光动力效应的光敏剂能够同时进行光热/光动力协同抗菌治疗，具有优异的抗菌效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种兼具光热和光动力效应的光敏剂，具有式I所示结构：

本发明提供了上述兼具光热和光动力效应的光敏剂的制备方法，包括以下步骤：

将具有式a所示结构的新吲哚青绿、具有式b所示结构的化合物、氢化钠和极性有机溶剂混合，进行偶联反应，得到具有式c所示结构的化合物：

将具有式c所示结构的化合物、具有式d所示结构的D-丙炔甘氨酸、催化剂和醇溶剂混合，进行环化反应，得到具有式I所示结构的兼具光热和光动力效应的光敏剂；

优选的，所述具有式b所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将具有式e所示结构的化合物、叠氮化钠和极性有机溶剂混合，进行叠氮化反应，得到具有式b所示结构的化合物；

优选的，所述偶联反应的温度为室温，时间为4h。

优选的，所述催化剂为乙酸铜和抗坏血酸钠。

优选的，所述乙酸铜和抗坏血酸钠的质量比为1:2。

优选的，所述成环反应的温度为75℃，时间为1h。

本发明提供了上述兼具光热和光动力效应的光敏剂在制备抗菌药物中的应用。

本发明提供了上述兼具光热和光动力效应的光敏剂在制备细菌诊断试剂中的应用。

本发明提供了上述兼具光热和光动力效应的光敏剂在非诊断目的的细菌成像中的应用。

本发明提供了一种兼具光热和光动力效应的光敏剂，具有式I所示结构。本发明将商业化的新吲哚青绿(IR820)和D-丙炔甘氨酸(DAA)结合起来，得到一种兼具光热和光动力效应的光敏剂(简写为IR820-DAA)，具有光动力活性和光热转化性能，能够同时进行光热/光动力协同抗菌治疗。在808nm激光的照射下，本发明提供的光敏剂IR820-DAA光热转换效率(η)为34％，具有优异的光热转换能力，满足光热治疗细菌感染的要求；本发明提供的光敏剂IR820-DAA具有良好的活性氧(ROS)生成能力，可以通过酶促反应参与细菌壁的合成，在激光照射下，IR820-DAA兼具PTT-PDT的联合抗菌效果，能够破坏细菌的细胞膜结构，从而提高抗菌效率。同时IR820-DAA表现出良好的水溶性和临床转化的生物安全性，甚至对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的生物膜具有降解活性。实施例结果表明，本发明提供的IR820-DAA对于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率可达98％。

同时，IR820-DAA对细菌壁具有高效的标记能力，可以用于制备细菌诊断试剂和非诊断目的的细菌成像。

附图说明

图1为IR820-DAA的合成路线；

图2为IR820-DAA的¹H NMR表征图片；

图3为IR820-DAA的质谱图片；

图4为IR820-DAA和IR820在水溶液中的吸收光谱；

图5为IR820-DAA和IR820在水溶液中的发射光谱；

图6为IR820-DAA在水溶液中的粒度分布；

图7为IR820-DAA的Zeta电位；

图8为IR820-DAA、IR820和水在808nm激光照射下的温度变化曲线；

图9为不同浓度的IR820-DAA在808nm激光照射下的加热曲线；

图10为不同功率密度的IR820-DAA的红外热图像；

图11为IR820-DAA在水中用808nm激光照射时的光热效应；

图12为IR820-DAA的光动力作用；

图13为IR820-DAA溶液和水的电子自旋共振曲线；

图14为IR820-DAA溶液和水在808nm激光照射下，加入ABDA后的吸光度曲线；

图15为IR820和IR820-DAA孵化的MRSA的共聚焦荧光图像；

图16为用IR820-DAA加D-Ala和L-Ala孵育的MRSA的共聚焦荧光图像；

图17为MRSA和金黄色葡萄球菌中的ROS由不同的处理方法诱发的共聚焦荧光图像；

图18为MRSA和金黄色葡萄球菌LB琼脂平板照片；

图19为MRSA和金黄色葡萄球菌的存活率；

图20为MRSA和金黄色葡萄球菌的生物膜清除率；

图21为经不同处理的死亡和活体MRSA的共聚焦显微镜图像；

图22为MRSA和金黄色葡萄球菌在808纳米激光照射下与IR820-DAA作用前后的TEM和SEM图像；

图23为感染MRSA的小鼠伤口在12天内的六种不同处理的代表性照片；

图24为不同处理的小鼠在10分钟内暴露于808nm激光的代表性热图像；

图25为小鼠感染伤口愈合率；

图26为六个不同治疗组感染MRSA小鼠伤口皮肤组织中细菌培养的代表照片及菌落数量；

图27为MRSA感染皮肤组织的H&E染色结果；

图28为MRSA感染皮肤组织的Masson染色结果；

图29为不同处理组血液中性粒细胞的血常规分析；

图30为不同浓度IR820-DAA对HC11细胞活力的影响；

图31为IR820-DAA的溶血试验测试结果；

图32为IR820-DAA的抗菌应用流程图。

具体实施方式

本发明将具有式a所示结构的新吲哚青绿、具有式b所示结构的化合物、氢化钠和极性有机溶剂混合，进行偶联反应，得到具有式c所示结构的化合物。在本发明中，所述具有式b所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

在本发明中，所述极性有机溶剂优选为二甲基甲酰胺。在本发明中，所述具有式e所示结构的化合物与叠氮化钠的质量比优选为1:1。在本发明中，所述叠氮化反应的温度优选为70℃，时间优选为5h。

本发明将具有式a所示结构的新吲哚青绿、具有式b所示结构的化合物、氢化钠和极性有机溶剂混合，进行偶联反应，得到具有式c所示结构的化合物。在本发明中，所述极性有机溶剂优选为二甲基甲酰胺和/或四氢呋喃。

在本发明中，所述具有式a所示结构的新吲哚青绿、具有式b所示结构的化合物的摩尔比优选为1:3。在本发明中，所述具有式a所示结构的新吲哚菁绿与氢化钠的摩尔比优选为1:6.6。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为室温，时间优选为3～4h。本发明优选通过LC/MS监测反应进展。

在本发明中，所述偶联反应后，本发明优选对所得偶联反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将所述偶联反应液与甲醇混合，淬灭反应，得到淬灭反应液；

对所述淬灭反应液依次进行微滤，在离心体条件下加入乙酸乙酯结晶，得到具有式c所示结构的化合物。

在本发明中，所述微滤使用的过滤器优选为疏水性PTFT针式过滤器，所述过滤器的孔径优选为0.22微米。在本发明中，所述离心的速率优选为5000rpm，时间优选为15min。

本发明将具有式c所示结构的化合物、具有式d所示结构的D-丙炔甘氨酸、催化剂和醇溶剂混合，进行环化反应，得到具有式I所示结构的兼具光热和光动力效应的光敏剂。

在本发明中，所述催化剂优选为乙酸铜和抗坏血酸钠；在本发明中，所述乙酸铜和抗坏血酸钠的质量比优选为1:2。在本发明中，所述醇溶剂优选为异丙醇。

在本发明中，所述D-丙炔甘氨酸优选以水溶液的形式加入；所述催化剂优选以水溶液的形式加入。

在本发明中，所述成环反应的温度优选为65～70℃，更优选为75℃，时间优选为1～2h。本发明优选通过LC/MS监测反应进展。

在本发明中，所述成环反应后，本发明优选对所得成环反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

对所述成环反应液进行透析和冷冻干燥，得到具有式I所示结构的兼具光热和光动力效应的光敏剂纯品。

在本发明中，所述透析的截留分子量优选为1000；所述透析的时间优选为3天。本发明对所述冷冻干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冷冻干燥方式即可。

在本发明中，所述兼具光热和光动力效应的光敏剂的合成路线如图1所示。

本发明提供了上述兼具光热和光动力效应的光敏剂在制备抗菌药物中的应用。在本发明中，所述抗菌药物杀灭的细菌优选为金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

下面结合实施例对本发明提供的兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

兼具光热和光动力效应的光敏剂IR820-DAA的制备：

在50mL烧瓶中，依次加入IR820(80mg，0.094mmol)和氢化钠(15mg，0.62mmol)到干燥的DMF(10mL)并搅拌。将具有式b所示结构的化合物2(46mg，0.28mmol)溶于DMF(0.5mL)并加入到溶液中。通过LC/MS监测反应进展。4小时后，用甲醇(10mL)淬灭反应。将得到的混合物通过疏水性PTFT针式过滤器(0.22μm)(ANPEL)过滤，在5000rpm离心15min的情况下，慢慢滴入乙酸乙酯(30mL)，得到深绿色固体(41.6mg，45.23％)。将深绿色固体(41.6mg，0.047mmol)用异丙醇(3mL)溶解，并与丙炔甘氨酸(7.39mg，0.074mmol)在水(3mL)中的溶液混合。加入乙酸铜水溶液(4mg/mL，0.5mL)和抗坏血酸钠水溶液(4mg/mL，1mL)，并将混合物在75℃下加热1小时，通过LC/MS监测反应进程。冷却后，将反应混合物加入截留分子量为1000的透析袋，在暗室中透析三天，最后冷冻干燥，得到IR820-DAA，为深绿色固体(32.6mg，66.53％)。

结构表征：

(1)¹H NMR表征

IR820-DAA溶于MeOH-d4，然后用布鲁克AVANCE NEO 500光谱仪进行测试，所得结果如图2所示。

(2)高分辨率质谱仪测量

将IR820-DAA溶于甲醇，使用质谱仪以正离子模式进行分析，所得结果如图3所示。

(3)紫外-可见-近红外吸收光谱的测量

吸收光谱由紫外-可见分光光度计(MAPADA UA-3200S)在200～1100nm之间测量。IR820-DAA和IR820在水溶液中的吸收光谱如图4所示。IR820-DAA和IR820在水溶液中的发射光谱如图5所示。

由图4可以看出，IR820-DAA在600～900nm之间表现出一个宽而明显的吸收峰，在725nm处有一个最大的吸收。

由图5可以看出，IR820-DAA在405nm的激发下，在825nm处有一个明显的荧光峰，这是从IR820中继承下来的，这意味着DAA的引入对IR820-DAA的影响可以忽略不计。

(4)尺寸和Zeta电位表征

用纳米粒度电位计(MalvernNano-ZS90)测量IR820-PTX纳米颗粒的粒度分布和Zeta电位。IR820-PTX纳米颗粒的制备方法如下：

在磁力搅拌器的作用下，将IR820-DAA(3mg)在二甲亚砜(DMSO，1毫升)中的溶液加入水(5mL)中，时间为30min，然后转移到透析袋(MWCO＝1000)中，在蒸馏水中透析40h。

IR820-DAA在水溶液中的粒度分布如图6所示。由图6可以看出，IR820-DAA的流体力学直径约为324nm。

IR820-DAA的Zeta电位如图7所示。由图7可以看出，IR820-DAA表现出净负电荷，这对进入炎症组织和良好的生物相容性是有利的。

性能测试

(1)体外光热性能

为了评估IR820-DAA的光热效应，将1.0mL不同浓度(0、10、20、40、60、80和100μM)的IR820-DAA水溶液加入EP管中，用808nm激光(MDL-XF-808nm/10W；1W·cm^-2，10min)照射。然后，研究了不同功率密度(0.5、0.75、1.0和1.25W·cm^-2)对IR820-DAA(80μM)的光热效应的影响。温度变化曲线和热图像由红外热成像仪(Fotric 225s)测试。

IR820-DAA的光热转换效率(η)是通过记录808nm激光(1W·cm^-2)照射10分钟并冷却到环境温度后水悬浮液(80μM)的温度变化与时间的关系来计算的。光热转换效率(η)根据公式(1)～(5)计算。

η＝(hS(T_max-T_surr)-Q₀)/(I(1-10^^(-A808))) (1)

hS可以通过以下公式计算。

hS＝m/τ_s (2)

τ_s＝t/(-lnθ) (3)

θ＝(T-T_surr)/(T_max-T_surr) (4)

Q₀＝hS(T_max-T_surr) (5)

其中h代表传热系数，S代表样品容器的表面积，T_max代表稳态最高温度，T_surr代表环境室温，T代表冷却过程中的瞬时温度，t代表冷却阶段的时间，θ代表水的比热容，m代表溶液的质量(g)，Q₀代表同一溶剂在相同条件下激光照射后不含NPs的能量输入。

首先探讨IR820-DAA在808nm激光照射下的水溶液的光热特性。IR820-DAA、IR820和水在808nm激光(1W·cm^-2)照射下的温度变化曲线如图8所示。由图8可以看出，IR820和IR820-DAA在浓度为80μM的情况下，6分钟内的加热速率是相当的。然而，由于IR820的稳定性很差，在照射6分钟后，温度会下降。IR820-DAA的温度在10分钟的照射下上升了32.5℃，这意味着它们具有有效和稳定的光热转换能力。

之后探讨样品浓度和激光功率对IR820-DAA的光热特性的影响。不同浓度的IR820-DAA在808nm激光照射下的加热曲线如图9所示。不同功率密度的IR820-DAA的红外热图像如图10所示。IR820-DAA在水中用808nm激光(1W·cm^-2)照射时的光热效应如图11所示。由图9～11可以看出，IR820-DAA的加热曲线和热图像显示了在808nm照射下浓度和功率密度不同的光热转换性能。根据加热和冷却曲线图，IR820-DAA的光热转换效率(η)为34％，与已报道的商用IR820的36.4％相当，说明IR820-DAA继承了IR820的优良光热转换能力。这些结果证实，所获得的IR820-DAA可以成为一种有前途的光热剂，并满足光热治疗细菌感染的要求。

(2)活性氧(ROS)的测定

为了确定IR820-DAA的光动力作用，2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)溶液是一种典型的ROS探针，在ROS的存在下可以氧化成荧光2-(2,7-二氯-9,9a-二氢-6-羟基-3-氧代-3H-黄原-9-基)苯甲酸(DCF)。

活性氧(ROS)的测定方法如下：

首先，将1μL的DCFH-DA溶液(10μM)分别加入到水、IR820和IR820-DAA溶液(1mL，80μM)。然后，将上述溶液用808nm激光照射10分钟。最后，在488nm的激发下，在不同时间记录510-610nm的荧光光谱。用Xe灯(日本日立F-7100)在荧光分光光度计上测量荧光发光光谱。

DCFH-DA(10μM)探针也与细菌悬液在37℃下孵育20分钟。之后，将上述制备的细菌悬液转移到一次性无菌培养皿中，用808纳米的近红外激光(1W·cm^-2)照射或在黑暗中照射10分钟。然后，通过在3000rpm下离心3分钟收获细菌，并用PBS洗涤三次。将处理过的细菌分散在1mL PBS中，随后将200μL分散液稀释4倍(1mL)，然后加入共聚焦皿中进行CLSM成像(蔡司LSM980)；IR820和IR820-DAA的激发波长为405nm，发射波长为550～700nm；DCFH-DA的激发波长为488nm，发射波长为525nm)。ROS通过ESR和化学方法进行鉴定。ESR光谱在空气中和室温下用布鲁克A-300磁共振仪记录。TEMP被用作ESR的自旋捕集器。化学方法是由空气中的吸收光谱确定的，ABDA被用作诱捕剂。

IR820-DAA的光动力作用如图12所示。图12中，(a)为5分钟时，IR820-DAA、IR820和水中的DCF在525nm处经808nm激光照射的荧光强度；(b)为相同条件下，IR820-DAA、IR820和水中的DCF在525nm处经808nm激光照射的荧光强度曲线。由图12可以看出，当IR820-DAA与DCFH-DA一起暴露在808纳米的激光照射下时，在488纳米的激发下，氧化的DCF在525纳米附近表现出强烈的荧光峰，并且荧光强度与照射时间的延长呈正相关，标志着ROS物种的积累。值得注意的是，在相同条件下，IR820-DAA的荧光强度要强于IR820，说明IR820-DAA的光动力作用对细菌的杀伤能力更强。

本发明进一步通过电子自旋共振(ESR)研究了单线态氧(¹O₂)的生成能力，IR820-DAA溶液和水的电子自旋共振(ESR)曲线如图13所示，随着照射时间的延长，代表单线态氧(¹O₂)的信号增加，其中2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)被用来作为¹O₂的捕获剂。

此外，另一种市售的ROS检测探针9,10-蒽二基双(亚甲基)-二马龙酸(ABDA)被用来评估IR820-DAA的单线态氧生成能力。ABDA的吸光度会因¹O₂生成的增加而逐渐降低，IR820-DAA溶液和水在808nm激光照射下，加入9,10-蒽二基双(亚甲基)二马酮酸(ABDA)后的吸光度如图14所示，图14中，(a)为R820-DAA溶液的吸光度，(b)为水的吸光度。由图14可知，在IR820-DAA的存在下，ABDA的分解率远远高于水，这表明IR820-DAA在生成单线态氧方面具有优异的性能。

(3)IR820-DAA的代谢性细菌标记

为了验证IR820-DAA是否能通过D-氨基酸依赖的代谢途径有效地在体外标记细菌，选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为模型，在相同条件下与IR820和IR820-DAA进行共孵育，然后用PBS洗涤以去除未标记的物质。IR820和IR820-DAA孵育的MRSA的共聚焦荧光图像(CLSM)如图15所示。通过共聚焦激光扫描显微镜可以观察到IR820-DAA实验组有明亮的荧光信号，而IR820组则表现为微弱的荧光信号。

由于L-丙氨酸不参与细菌的肽聚糖合成，为了进一步认识IR820-DAA的标记过程，还进行了竞争抑制试验。用IR820-DAA加D-Ala和L-Ala孵育的MRSA的共聚焦荧光图像如图16所示。图15和图16中，IR820或IR820-DAA的红色荧光通道：λ_ex＝405nm，λ_em＝500～600nm。Hoechst的蓝色荧光通道：λ_ex＝405nm,λ_em＝430～470nm。由图16可以看出，IR820-DAA处理过的MRSA的荧光信号在标记过程中存在额外的D-丙氨酸时有所下降，而额外的L-丙氨酸则不影响细菌的发光成像，表明在IR820的结构上引入DAA基团后，对细菌细胞壁具有高效的标记能力。

ROS可以使膜蛋白、核酸和各种不同的酶变性，从而抑制形成膜的成分的传递，阻碍细菌的呼吸和电子运输系统。因此，ROS是实现有效抗菌应用的有力工具。一个传统的荧光探针DCFH-DA被用于评估MRSA和金黄色葡萄球菌在不同处理下产生的总ROS。MRSA和金黄色葡萄球菌中的ROS由不同的处理方法(IR820或IR820-DAA)与或不与808nm激光照射(1W·cm^-2)诱发的共聚焦荧光图像如图17所示。图17中，(a)为MRSA，(b)为金黄色葡萄球菌。图17中，ROS的绿色荧光通道：λ_ex＝488nm，λ_em＝525nm；红色荧光通道：λ_ex＝405nm，λ_em＝550～800nm。由图17可以看出，激光照射下IR820-DAA的ROS荧光信号(绿色)最强，并与IR820-DAA的固有荧光信号重叠。相比之下，IR820组的ROS信号可以忽略不计，这证明IR820-DAA可以通过代谢标记与细菌发生特异性联系，表现出PDT通过诱导产生一定量的ROS来杀灭细菌的良好潜力。

(4)体外抗菌试验

IR820-DAA的抗菌活性通过两种不同的代表菌株，即金黄色葡萄球菌(S.aureus)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)得到证实。为了进一步探讨IR820-DAA的协同抗菌性能，对细菌进行了如下处理：(1)PBS(对照)；(2)PBS+NIR；(3)IR820；(4)IR820+NIR；(5)IR820-DAA；(6)IR820-DAA+NIR，具体方法如下：

将单个细菌菌落接种于相应的6～8mL液体培养基(MRSA和金黄色葡萄球菌为LB)中，在37℃、120rpm的培养箱摇床中培养至对数生长中期(OD600＝0.5)。然后，将1mL的MRSA或金黄色葡萄球菌悬液转移到2mL的无菌EP管中，以3000rpm离心5分钟。弃去上清液，将细菌重新悬浮在1mL含有IR820和IR820-DAA(80μM)的新鲜液体培养基中(细菌浓度为10⁸CFU/mL)，在37℃下培养20分钟(PBS作为对照)。然后，以3000rpm离心3分钟收获细菌，用PBS洗涤三次。最后，将标记的细菌重新分散在1mL PBS中，然后用808nm近红外激光照射或在黑暗中(1W·cm^-2)照射10分钟。之后，细菌悬浮液被超声处理1分钟。然后，将10微升稀释了100倍的悬浮液铺在琼脂板上。细菌存活率(％)＝实验组CFU/对照组CFU×100％，其中实验组CFU和对照组CFU分别为808nm激光照射下的IR820-DAA实验组和PBS处理的对照组的平均CFU。所有实验均重复三次。

其中，MRSA和金黄色葡萄球菌LB琼脂平板照片如图18所示。结果表明IR820-DAA在没有808nm激光照射的情况下对金黄色葡萄球菌和MRSA几乎没有杀菌作用，而在808nm激光照射下可以有效地抑制细菌生长。

MRSA和金黄色葡萄球菌的存活率如图19所示。IR820-DAA组可获得98％的抑菌效率，而IR820组在808nm激光照射下的抑菌效率约为50％。这表明代谢标记策略在提高杀菌效率方面发挥了重要作用。

(5)体外生物膜的分散试验。

首先，将200μL的MRSA和金黄色葡萄球菌(10⁸CFU/mL)加入到96孔板中，在37℃下培养24小时以形成细菌被膜。之后，将细菌悬浮液从每个孔中取出。在不同的孔中加入IR820和IR820-DAA(终浓度为80μM)孵育20分钟，后置于808nm激光照射(1W·cm^-2)或黑暗环境下10分钟。37℃孵育3小时后，再用甲醇固定被膜30分钟。然后，在每个孔中加入0.1％的结晶紫，并在黑暗中孵化，对生物膜进行染色。再过30分钟后，用PBS洗涤以去除未结合的结晶紫。最后，加入95％的乙醇来溶解结晶紫染料，用微孔板阅读器记录每个孔在590nm处的吸光度，以评估生物膜的生物量。

生物膜清除率(％)＝OD_590nm实验/OD_590nm对照×100％。

MRSA和金黄色葡萄球菌的生物膜清除率如图20所示，图20中，(a)为MRSA，(B)为金黄色葡萄球菌。由图20可以看出，IR820-DAA在激光照射下展示出卓越的消除金黄色葡萄球菌和MRSA被膜的能力，证明IR820-DAA可以作为临床生物医药来治疗细菌被膜形式的细菌感染。

(6)活/死染色

活/死染色试验是通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)评估不同处理后的抗菌活性的有效工具。用含有Calcein acetoxymethyl ester(Calcein-AM，标记活菌的绿色荧光染料)和propidium iodide(PI，标记死菌的红色荧光染料)的活/死试剂盒来评估不同处理组对细菌的杀伤效果。将MRSA和金黄色葡萄球菌悬液(10⁸CFU/mL)在3000rpm下离心5分钟，再用PBS缓冲液洗涤三次。然后，将细菌悬液与IR820-DAA、IR820(80μM)和PBS(对照组)在37℃下孵育20分钟，然后用808nm激光照射(1W·cm^-2)或黑暗处理10分钟。之后，将PI染料溶液(2μL)和Calcein-AM染料溶液(5μL)加入到细菌悬浮液中，并在37℃的黑暗中培养15分钟。用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM880)记录这些样品的荧光信号。

死亡的MRSA和金黄色葡萄球菌可以用PI(红色荧光)进行标记，PI可以通过穿透被破坏的细胞膜与细胞核结合。经不同处理的死亡(红色荧光，PI染色)和活体(绿色荧光，AM染色)MRSA的共聚焦显微镜图像如图21所示。图21中，红色荧光通道：λ_ex＝535nm，λ_em＝630nm。绿色荧光通道：λ_ex＝488nm,λ_em＝530nm。在整个视野中可以观察到红色荧光，表明用IR820-DAA处理的细菌几乎被两种单一的抗菌方法(PTT或PDT)联合杀死了。此外，IR820-DAA在没有808nm激光照射的情况下，其抗菌效果没有明显的变化，这说明IR820-DAA本身的抗菌活性需要被激活。这些结果证实了IR820-DAA在激光照射下诱导的PTT-PDT的联合抗菌效果对杀灭细菌起到了很大的作用。

(7)细菌形态学破坏的观察

为了进一步系统地评估IR820-DAA的抗菌机制，我们记录了扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)图像，以估计细菌在808nm激光照射下与IR820-DAA作用后的形态变化。

用PBS缓冲液(对照组)和80μM的IR820-DAA分别和10⁸CFU/mL的MRSA和金黄色葡萄球菌在37℃下孵育20分钟，然后将IR820-DAA处理的菌悬液在808nm激光照射下10分钟。之后，将细菌悬液在3500rpm下离心5分钟，然后用PBS缓冲液洗三次。收集的细菌先用2.5％戊二醛固定，在4℃下保存过夜。最后，用不同浓度(10％、30％、50％、70％、90％和100％)的乙醇对细菌进行脱水，用扫描电镜(SEM SU8100)和透射电镜(TEM HT7800)对其形态进行表征。

MRSA和金黄色葡萄球菌在808纳米激光照射下与IR820-DAA作用前后的TEM和SEM图像如图22所示。箭头指向的是细菌收缩、塌陷和融合的位置。TEM和SEM的标尺分别为200nm和1μm。IR820-DAA和IR820的浓度为80μM。

由图22可以看出，用PBS缓冲液处理的MRSA和金黄色葡萄球菌显示出完整的细胞壁，表面光滑。然而，在与IR820-DAA孵育后，再应用808nm激光照射10分钟，MRSA和金黄色葡萄球菌的细胞壁起皱，细胞结构塌缩，细胞质成分渗出，这表明激光激发下的IR820-DAA是通过破坏细菌细胞质膜来发挥抗菌作用的。

(8)用MRSA感染的伤口愈合进行体内抗菌试验

考虑到IR820-DAA高效的杀菌活性和良好的生物相容性，本发明探索了体内抗菌治疗的潜在应用。研究在不同条件下治疗MRSA引起的皮肤感染模型的效果。在小鼠(雌性Balb/c小鼠，6～8周)左背部制造一个8mm的人工伤口，再将MRSA(1×10⁶CFU)涂抹于伤口上形成细菌感染的创口。将完成造模的小鼠分为六组(PBS，PBS+NIR，IR820，IR820+NIR，IR820-DAA，IR820-DAA+NIR)，每两天治疗一次。具体方法如下：

BALB/c小鼠(6～8周，雌性)被随机分配到六个实验组(每组三只小鼠，n＝3)，其中小鼠分别用PBS缓冲液、IR820、IR820-DAA与或不与808nm激光照射处理。具体来说，将100μL的MRSA悬浮液(10⁶CFU/mL)涂抹在小鼠背部的人工伤口上。24小时后，每组开始用100μL的PBS缓冲液、IR820(80μM)、IR820-DAA(80μM)处理，随后在808nm激光照射下或在黑暗中分别处理10分钟。

在治疗过程中，用热像仪收集不同处理(PBS、IR820和IR820-DAA)的小鼠在10分钟内暴露于808纳米激光(1W·cm^-2)的代表性的热图像。感染MRSA的模型在12天内根据分组的不同每两天接受一次治疗。在整个治疗期间，记录每组小鼠的伤口直径。

治疗结束后，处死小鼠，收集整个伤口和邻近的皮肤组织，并将其置于2mL PBS中，然后超声处理15分钟。伤口感染组织中的细菌的CFU是通过标准的固体琼脂培养方法进行评估的。为了评估不同治疗方法的体内治疗效果，治疗结束后切除感染的皮肤组织，将其固定在4％多聚甲醛中，包埋于石蜡中，再制成切片，用苏木精和伊红(H&E)和Masson染色方法对处理后组织切片进行染色。收集全血样本进行血常规分析和IR820-DAA的溶血试验。此外，还收集了重要器官(心、肝、脾、肺和肾)，以进一步分析甲状腺的生物安全。

感染MRSA的小鼠伤口在12天内的六种不同处理(PBS；PBS+NIR；IR820；IR820+NIR；IR820-DAA；IR820-DAA+NIR)的代表性照片如图23所示。由图23可以看出，在第4天，与未光照组相比，所有近红外光照组的伤口都开始愈合。在第6天，我们观察到实验组的伤口更小、愈合效果更明显。第10天，IR820-DAA+NIR组的伤口几乎消失，而其他组的伤口边界和不完整的真皮层仍可观察到。

不同处理(PBS、IR820和IR820-DAA)的小鼠在10分钟内暴露于808nm激光(1W·cm^-2)的代表性热图像如图24所示。由图24可以看出，与IR820和PBS相比，用IR820-DAA处理的感染部位在激光照射下的温度明显升高，证明IR820-DAA在体内仍有出色的光热性能。

小鼠感染伤口愈合率如图25所示。由图25可以看出，在激光照射下，发现IR820-DAA的治疗中，伤口愈合的速度远远快于其他几种治疗，说明IR820-DAA的PTT和PDT治疗有助于感染伤口的愈合。

将最后一次处理后的伤口分泌物在LB琼脂平板上培养，评估不同处理组伤口MRSA数量，六个不同处理组感染MRSA小鼠伤口皮肤组织中细菌培养的代表照片及菌落数量如图26所示。由图26可以看出，IR820-DAA+NIR组的MRSA菌落数量比其他组约低20个数量级，证明了IR820-DAA的抗菌治疗效果更好。

以上结果证明，IR820-DAA可以成为体内杀灭细菌和伤口愈合的有效光疗剂。

在12天的治疗后，获得了典型的病理切片。伤口皮肤用苏木精和伊红(H&E)染色，检查IR820-DAA的伤口愈合能力。MRSA感染皮肤组织的H&E染色结果如图27所示。由图27可以看出，在PBS和IR820治疗后，无论是否有进行808nm激光照射，都能观察到光镜下皮肤结构充满了炎症细胞54(红色箭头标记)；而IR820-DAA+NIR处理组的伤口组织呈现较少的炎症，这表明MRSA感染的伤口在此处理下12天后可以有效愈合。

胶原纤维的代谢起着重要的作用，胶原纤维的增多通常意味着愈合后组织有更好的机械强度，所以也用Masson染色法来评估伤口皮肤中胶原纤维的形成情况。MRSA感染皮肤组织的Masson染色结果如图28所示。由图28可以看出，PBS组和IR820组的胶原纤维较少，而在IR820-DAA+NIR处理的伤口皮肤中，胶原纤维含量最高。因此，IR820-DAA的综合效应可以为体内病原微生物感染提供了有效的治疗策略。

在第12天收集小鼠的血样以评估炎症的程度。不同处理组血液中性粒细胞的血常规分析如图29所示。由图29可以看出，中性粒细胞的数量与HE染色的结果一致，进一步证实了IR820-DAA在PTT和PDT联合作用下可以有效杀灭细菌，减轻细菌感染的炎症。

(9)通过MTT检测IR820-DAA的细胞毒性

用MTT法测定HC11细胞的活力。在96孔板上用不同浓度的IR820-DAA培养后，将处理过的HC11细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下进一步培养24小时，然后对处理过的细胞进行MTT检测以研究其活力。在HC11细胞培养物中，用无血清培养基和MTT试剂(5mg/mL)取代含血清培养基。HC11细胞在37℃下培养3小时，然后去除培养基，加入150μLDMSO。将平板在轨道摇床上摇动15分钟。用微板阅读器(DK-35189)分析样品，在OD＝590nm处检测吸光度。

不同浓度IR820-DAA对HC11细胞活力的影响如图30所示。由图30可以看出，即使将材料IR820-DAA的浓度增加到140μΜ也不会影像HC11细胞的正常活性，说明IR820-DAA的生物安全性很好。

IR820-DAA的溶血试验测试结果如图31所示，由图31可以看出，随着IR820-DAA材料浓度的增加，红细胞的溶血率依旧低于3％，证明IR820-DAA的生物毒性极低，应用前景好。

在本发明中，所述IR820-DAA的抗菌应用流程图如图32所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种兼具光热和光动力效应的光敏剂，具有式I所示结构：

2.权利要求1所述的兼具光热和光动力效应的光敏剂的制备方法，包括以下步骤：

将具有式a所示结构的新吲哚菁绿、具有式b所示结构的化合物、氢化钠和极性有机溶剂混合，进行偶联反应，得到具有式c所示结构的化合物：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式b所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为室温，时间为3～4h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为乙酸铜和抗坏血酸钠。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸铜和抗坏血酸钠的质量比为1:2。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应的温度为60～75℃，时间为1～2h。

8.权利要求1所述兼具光热和光动力效应的光敏剂或权利要求2～7任意一项所述制备方法制备得到的兼具光热和光动力效应的光敏剂在制备抗菌药物中的应用。

9.权利要求1所述兼具光热和光动力效应的光敏剂或权利要求2～7任意一项所述制备方法制备得到的兼具光热和光动力效应的光敏剂在制备细菌诊断试剂中的应用。

10.权利要求1所述兼具光热和光动力效应的光敏剂或权利要求2～7任意一项所述制备方法制备得到的兼具光热和光动力效应的光敏剂在非治疗和诊断目的的细菌成像中的应用。