CN111760035B - 一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用。其中,方法包括步骤:将阳离子脂质体储备液同AIE光敏剂储备液按照预定比例进行混合,得到混合液;将所述混合液在预定温度下加热,对加热后得到的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料。该制备方法具有工艺简单,易操作,利于放大生产,制得的的纳米材料稳定性高、水分散性好,易于保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用纳米材料技术领域,尤其涉及一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术
荧光成像具有操作简单、结果直观、灵敏度高等优点。与可见光相比,近红外光(波长>700nm)具有穿透深度大、生物自发荧光干扰小、对生物体造成的光损伤小等优势,传统的荧光染料例如荧光素、香豆素、BODIPY以及罗丹明通常具有较大的刚性平面结构,在高浓度或聚集态下易发生π-π堆积而导致荧光淬灭(aggregation-caused quenching,ACQ),除此之外,传统染料常常具有较小的斯托克斯位移、荧光效率低、光稳定性差等缺点。
聚集诱导荧光(aggregation-induced emission,AIE)材料是一类与传统的ACQ荧光染料相反的分子,这类特殊的化合物在溶液中不发光或者发很弱的荧光,而在聚集态时光化学效应显著增强,不影响ROS在生物体内的释放。AIE材料普遍具有良好的生物兼容性、斯托克斯位移大、光稳定性好及发光效率高的性能。但是现有的具有荧光成像引导的癌症光动力治疗的AIE分子,具有光稳定性弱,荧光成像效果差的问题。
因此,如何制备一种光稳定性高,荧光成像效果好的AIE纳米材料是亟需解决的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用,旨在解决现有具有荧光成像引导的癌症光动力治疗的AIE分子,具有光稳定性弱,荧光成像效果差和组织穿透能力差的问题。
一种双光子激发诊疗一体化纳米材料的制备方法,其中,包括步骤:
将阳离子脂质体储备液同AIE光敏剂储备液按照预定比例进行混合,得到混合液;
将所述混合液在预定温度下加热,对加热后得到的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料。
上述双光子激发诊疗一体化纳米材料的制备方法,通过将阳离子脂质体储备液同AIE光敏剂储备液按照预定比例进行混合,将所述混合液加热后进行超声处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料,所得到的双光子激发诊疗一体化纳米材料兼具良好的生物相容性和双光子荧光成像和高效治疗。光稳定性好,可以对肿瘤及附近血管部位进行很好的3D重构,双光子激发波长在近红外区,增加了组织穿透能力,组织损伤小。
可选地,所述的制备方法,其中,所述阳离子脂质体储备液包括:溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵储备液、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷储备液和二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯储备液。
可选地,所述的制备方法,其中,所述阳离子脂质体储备液为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵储备液、二油酰磷脂酰乙醇胺储备液;所述混合液中所述溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵储备液与所述二油酰磷脂酰乙醇胺储备液的质量比为1:1。
可选地,所述的制备方法,其中,所述混合液包括两种阳离子脂质体储备液,且所述两种阳离子脂质体储备液与所述TPE-PTB储备液的质量比为3:3:0.1。
可选地,所述的制备方法,其中,所述将将所述混合液在预定温度下加热,对加热后的混合液进行分散处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料的步骤,具体包括:
将所述混合液在预定温度条件下旋转蒸发,蒸发结束后降温至室温,得到磷脂膜;
将所述磷脂膜溶解,在冰浴条件下对溶解后的磷脂膜进行分散,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料。
可选地,所述的制备方法,其中,所述AIE光敏剂为TPE-PTB,所述TPE-PTB的结构式如下:
可选地,所述的制备方法,其中,所述室温静置时间为10-15小时。
可选地,所述的制备方法,其中,所述旋转蒸发的蒸发时间为10-25分钟。
基于相同的发明构思,本发明还提供一种双光子激发诊疗一体化纳米材料,其中,所述双光子激发诊疗一体化纳米材料采用如上所述制备方法制备得到。
基于相同的发明构思,本发明还提供一种如上所述双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备肿瘤诊断和/或治疗剂中的应用。
附图说明
图1为设计和制备阳离子脂质体包裹的AIE纳米颗粒及其在双光子成像和光动力治疗肿瘤的示意图;
图2为TPE-PTB(AIE)纳米颗粒的性能表征图,其中,(A)粒径和TEM形貌图;(B)TPE-PTB和AIE纳米颗粒吸收图;(C)TPE-PTB和AIE纳米颗粒发射图;(D)AIE纳米颗粒双光子吸收截面图;
图3为光照下TPE-PTB(AIE)纳米颗粒单线态氧和羟基自由基测试,其中,(A)TEMP做捕获剂,电子顺磁共振测单线态氧;(B)ABDA做指示剂,测单线态氧;(C)DMPO做捕获剂,电子顺磁共振测单线态氧;(D)HPF做指示剂,测羟基自由基;
图4为单光子、双光子激发细胞成像和双光子激发下AIE纳米颗粒荧光稳定性图,其中,(A)单光子、双光子激发A375细胞成像图,(B)双光子连续时间激发下A375细胞荧光成像图,(C)双光子激发下AIE纳米颗粒荧光稳定性;
图5为双光子激发下小鼠肿瘤(黑色素瘤)活体成像图,其中,(A)不同层面小鼠肿瘤成像图,(B)小鼠肿瘤3D成像图;
图6为体外光动力杀伤A375细胞图,其中,(A)利用流式细胞仪进行细胞内ROS检测,(B)细胞内ROS荧光信号柱状图,(C)利用流式细胞仪进行双光子照射下细胞死亡率检测,(D)双光子照射下定量分析细胞存活和死亡率;
图7为AIE纳米颗粒生物相容性示意图;
图8为双光子治疗小鼠肿瘤直观图、肿瘤生长曲线和小鼠肿瘤切片HE染色,其中,(A)双光子治疗小鼠肿瘤直观图,(B)双光子治疗后小鼠肿瘤生长曲线,(C)双光子治疗后小鼠肿瘤切片HE染色;
图9为AIE纳米颗粒生物安全性评价图,其中,(A)AIE纳米颗粒注射不同时间段小鼠肿瘤荧光成像图,(B)AIE纳米颗粒注射不同时间段小鼠肿瘤荧光强度,(C)AIE纳米颗粒注射5天后,小鼠肿瘤和体内主要器官(脑、心、肝、脾、肺和肾)荧光成像图,(D)AIE纳米颗粒注射5天后,小鼠体内血液荧光强度图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。
将诊断与治疗结合的诊疗一体化技术,可以实时跟踪肿瘤的发生、发展与治疗过程,对肿瘤实施有效精准治疗,提高病人存活率和治愈率。荧光成像技术具有操作简单、背景噪音低、灵敏度高、时空分辨率高以及非侵入性等诸多优势,已成为当今生命科学领域最重要的技术手段之一。
传统的荧光染料,例如荧光素、香豆素、BODIPY以及罗丹明存在“聚集导致猝灭”(ACQ)现象,难以实现对体内、体外的实时动态监测和原位成像,成像深度制约该技术发展和实用,在疾病发生机制和防控领域的研究相对受限。
光动力治疗是将光敏剂输入机体,在一定时间后,以特定波长的光照射病变部位,通过一系列光化学和光生物学反应将分子氧转化为具有细胞毒性的活性氧(ROS),从而氧化破坏组织和细胞中的各种生物大分子(DNA,RNA,蛋白等),使病变细胞发生不可逆的损伤,最终引起细胞死亡的一种新兴治疗技术;相比于化疗其副作用小、可控性强,临床研究和实践证明光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是具有时空精确性的癌症有效疗法。但由于传统光敏剂对生物组织的光学透明窗吸收较弱,在浓溶液或纳米颗粒中荧光猝灭,导致传统有机染料产生的活性氧效率较低。
聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)材料是一类与传统的ACQ荧光染料相反的分子,这类特殊的化合物在溶液中不发光或者发很弱的荧光,而在聚集态时光化学效应显著增强,不影响ROS在生物体内的释放。AIE材料普遍具有良好的生物兼容性、斯托克斯位移大、光稳定性好及发光效率高的性能。但是开发高效的、能够用于癌症诊疗实际应用的AIE材料依然是一个难题。目前报道的具有荧光成像引导的癌症光动力治疗的AIE分子,仍具有缺点:例如吸收和发射波长太短、光敏效果不够显著和到达肿瘤部位的药物浓度低等。
基于此,本发明提供一种能够解决上述技术问题的方案,其详细内容将在后续实施例中得以阐述。
本发明所提供的一实施例中,如图1所示,利用具有双光子(近红外,800nm)性能的AIE光敏剂和阳离子脂质体DOPE/DOTAP。阳离子脂质体可被表面带负电的细胞膜吸附,再通过膜融合或细胞内吞作用将AIE递送入细胞内发挥细胞成像和光动力治疗作用。材料光稳定性好,可以对肿瘤及附近血管部位进行很好的3D重构,双光子激发波长在近红外区,增加了组织穿透能力,组织损伤小;AIE光敏剂同时释放单线态氧和羟基自由基对肿瘤部位进行高效治疗;阳离子脂质体使较多的AIE纳米颗粒聚集在肿瘤部位,增强治疗;同时拓展了AIE在双光子诊疗一体化中的应用。
本实施例中,AIE光敏剂与阳离子脂质体制备双光子激发诊疗一体化材料的工艺简单,易操作,利于放大生产,制得的纳米材料稳定性高、水分散性好,易于保存。
示例性制备方法:
本发明所提供的一种双光子激发诊疗一体化纳米材料制备方法包括如下步骤:
S1、将阳离子脂质体储备液同AIE光敏剂储备液按照预定比例进行混合,得到混合液;
S2、将所述混合液在预定温度下加热,对加热后得到的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料。
具体地,所述阳离子脂质体储备液包括但不限于:溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵储备液、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷储备液和二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯储备液。所述AIE光敏剂可以为TPE-PTB,所述TPE-PTB的结构式如下:
在本实施例中配制溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的三氯甲烷储备液和TPE-PTB三氯甲烷储备液。其中,DOTAP和DOPE的配制浓度可以是10mg/mL,TPE-PTB的浓度为1mg/mL。
取相应体积的DOTAP、DOPE与TPE-PTB储备液,例如DOTAP:DOPE:TPE-PTB的体积比为3:3:1加入20mL茄型瓶,在37℃水浴旋转蒸发15分钟后(其中,转速设定为180rpm),取下茄型瓶,室温静置12小时以除去残留三氯甲烷,形成磷脂膜结构。使用超声清洗仪短暂超声,使磷脂膜溶解,冰浴下使用细胞破碎仪超声15分钟(其中设置200W,5s/5s),稀释获得双光子激发诊疗一体化纳米材料(即AIE纳米颗粒)。过夜透析后,放置于4℃保存。容易理解的,AIE纳米颗粒还可以通过脂质体挤出器和微流控芯片来进行制备。
现对上述所制备的双光子激发诊疗一体化纳米材料进行如下表征:
如图2所示,利用动态光散射(Dynamic Light Scattering,DSL)去测AIE纳米颗粒的粒径(178nm)。将10μL样品滴加到超薄碳膜铜网(如200目)上,并在室温下干燥。通过HT7700(Hitchi,Japan)记录透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)图像。利用紫外吸收光谱仪测量AIE纳米颗粒在水溶液中的吸收(495nm),PL光谱扫描仪测得发射为626nm。同时测得AIE纳米颗粒有双光子效应,其在800nm处的双光子吸收截面为560GM。
如图3所示,黑暗和不同时间的光照情况下,通过电子顺磁共振仪,利用TEMP捕获剂,测试AIE纳米颗粒是否释放单线态氧。随着光照时间的增加TEMP释放的信号增强,说明有单线态氧产生。同时利用ABDA做指示剂,进一步证实单线态氧的产生。通过电子顺磁共振仪,利用DMPO捕获剂,测试自由基的产生。随着光照时间的增加DMPO释放的信号增强,说明有自由基。同时利用HPF做指示剂,进一步验证羟基自由基的产生。实验结果证实,AIE纳米颗粒既有单线态氧产生又有羟自由基产生。
将人皮肤黑色素瘤细胞(A375细胞)接种在共聚焦小皿中,数量为每皿10000个细胞。在37℃,5%二氧化碳的条件下培养24小时后,用含有AIE纳米颗粒(1μg/mL)的新鲜DMEM培养基替换原培养基,孵育2小时后,PBS清洗3次。如图4所示,分别使用激光共聚焦显微镜的单光子与双光子模块表征细胞荧光分布。与商业溶酶体荧光染料进行共定位确定进入到了溶酶体中。然后对其双光子稳定性进行表征并与商业溶酶体荧光染料进行对比。在双光子(激光能量2.0%)连续照射10分钟,AIE纳米颗粒的荧光信号仍然为原信号的75%,而商业染料只有原信号的18%。长时间照射,双光子稳定性较好。
示例性应用
本发明实施例提供一种AIE纳米颗粒在活体小鼠肿瘤成像中的应用,使用DMEM培养基培养A375细胞,细胞汇合至90%后,消化离心并使用无血清DMEM培养基重悬细胞。在Balb/c裸鼠耳部接种40微升DMEM培养液其中含有1×106个A375细胞以构建黑素瘤模型。肿瘤长至30-50mm3的时候进行肿瘤和血管成像。荧光成像时瘤内注射的的剂量为24微升(4μg/mL)。双光子激发为800nm,发射为635nm。图5可以清晰地看到血管及和血管相连的肿瘤,可以拍到肿瘤的深度为505nm,3D图呈现出血管和肿瘤的形貌和分布图。
在本实施例的一种实施方式中,使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS基本原理:CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH,DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF,用于检测ROS的生成。胞内ROS流式细胞仪定量检测:将细胞接种在96孔板中,密度为每孔10000个细胞(100μL)。在37℃,5%二氧化碳的条件下培养24小时,然后分别用含有PBS、AIE纳米颗粒的新鲜DMEM培养基替换原培养基,孵育2小时。使用PBS清洗细胞3遍后,加入ROS检测试剂,双光子激光照射5分钟(800nm,450mW/cm2),用于激活纳米复合体的光动力效应。使用胰蛋白酶将消化贴壁细胞,制成细胞悬液,将ROS检测试剂加入各组细胞,室温孵育30分钟,离心用PBS清洗2遍,通过流式细胞仪检测细胞中ROS的荧光信号。结果显示AIE纳米颗粒处理,经双光子照射后细胞内有大量ROS释放。
碘化丙啶(PI)能够结合DNA发出强烈红色荧光,但PI膜通过性不佳,仅能在细胞膜不完整的情况下进入细胞,因此可以通过流式细胞术检测PI荧光信号阳性的细胞所占比例,以定量评价细胞杀伤率。流式细胞仪定量检测:将细胞接种在96孔板中,密度为每孔10000个细胞(100μL)。37℃,5%二氧化碳的条件下培养24小时,然后分别用含有PBS、AIE纳米颗粒的新鲜DMEM培养基替换原培养基,孵育2小时。使用PBS清洗细胞3遍后,双光子激光照射5分钟(800nm,450mW/cm2),用于激活纳米复合体的光动力效应。使用胰蛋白酶将消化贴壁细胞,制成细胞悬液,将PI加入各组细胞,室温孵育10分钟,离心用PBS清洗2遍,通过流式细胞仪检测细胞的杀伤率。结果显示双光子照射下AIE纳米颗粒处理的A375细胞有90%的死亡率。
在本实施例的一种实施方式中,将A375细胞接种在96孔板中,密度为每孔10000个细胞(200μL)。37℃,5%CO2条件下培养24小时后,用含有PBS、不同浓度的AIE纳米颗粒(0.625,1.25,2.5和5μg/mL)新鲜DMEM培养基替换原培养基,培养24小时。使用PBS清洗细胞3遍,每孔加入90μL新鲜培养基与10μL MTT试剂的混合液,37℃孵育2小时后,使用酶标仪检测各孔570nm波长吸收值,计算细胞存活率。结果显示,所有浓度组细胞的活力都维持在90%以上,说明AIE纳米材料在无激光照射时细胞生物相容性好。
在本实施例的一种实施方式中,使用DMEM培养基培养A375细胞,细胞汇合至90%后,消化离心并使用无血清DMEM培养基重悬细胞,细胞浓度为3×106/mL(200μL)。在Balb/c裸鼠皮下接种A375细胞以构建黑素瘤模型。待肿瘤长至40-60mm3后,通过瘤内注射法给药AIE纳米颗粒(4μg/mL)50μL,并施加双光子激光照射(800nm,450mW/cm2,10分钟)。使用游标卡尺测量肿瘤大小,并根据体积(mm3)=0.5×长度×宽度2的公式计算。同时使用电子天平测量动物的体重。并绘制生长曲线。治疗18天结束后取小鼠的肿瘤组织进行HE切片分析。AIE纳米颗粒处理后,双光子仪治疗肿瘤得到很好地抑制。肿瘤组织切片同样显示PBS未光照组及PBS光照组的肿瘤组织结构密实,肿瘤细胞间结缔组织完整,可见大量异性细胞核;AIE纳米颗粒未光照组出现轻微松散;AIE纳米颗粒光照组肿瘤组织明显破坏,细胞间连接消失,肿瘤细胞数量减少细胞核发生皱缩。
在本实施方式中,AIE纳米颗粒瘤内注射后,1小时观察,荧光信号很强。随着时间的增加荧光信号逐渐减弱,在5天的时候,荧光信号与组织自发的荧光强度相同。将小鼠肿瘤和体内主要器官(脑、心、肝、脾、肺和肾)取出进行成像无明显的荧光信号。同时小鼠眼球取血,通过PL仪器测量,在处理5天后,小鼠血液内无明显的荧光信号。而且随着时间的增加,AIE纳米颗粒处理过的小鼠肿瘤生长并不受影响。说明AIE纳米颗粒生物安全性高。
综上所述,本发明提供了一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用,其中,本发明首次将同时释放单线态氧和羟基自由基且具有双光子效应的AIE光敏剂与阳离子脂质体结合形成诊疗一体化纳米材料,该纳米材料具有良好的水分散性和稳定性,高分辨的近红外细胞和肿瘤荧光成像及高效的光动力治疗,可实现双光子指导的光动力治疗肿瘤。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备癌症光动力治疗中所用药物的应用,其特征在于,所述纳米材料的制备方法包括步骤:
将阳离子脂质体储备液同AIE光敏剂储备液按照预定比例进行混合,得到混合液;
将所述混合液在预定温度下加热,对加热后得到的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料;
所述阳离子脂质体储备液包括:溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵储备液、二油酰磷脂酰乙醇胺储备液、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷储备液和二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯储备液中的一种或多种;
所述AIE光敏剂为TPE-PTB,所述TPE-PTB的结构式如下:
;
按照质量比,所述预定比例为1-2:1;所述预定温度为37℃。
2.如权利要求1所述的双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备癌症光动力治疗中所用药物的应用,其特征在于,所述阳离子脂质体储备液为溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵储备液、二油酰磷脂酰乙醇胺储备液。
3.如权利要求2所述的双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备癌症光动力治疗中所用药物的应用,其特征在于,所述溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵储备液与所述二油酰磷脂酰乙醇胺储备液的质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备癌症光动力治疗中所用药物的应用,其特征在于,将所述混合液在预定温度下加热,对加热后得到的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料的步骤,具体包括:
将所述混合液在预定温度条件下旋转蒸发,蒸发结束后降温至室温,得到磷脂膜;
将所述磷脂膜溶解,在冰浴条件下对溶解后的磷脂膜进行破碎处理,得到双光子激发诊疗一体化纳米材料。
5.如权利要求4所述的双光子激发诊疗一体化纳米材料在制备癌症光动力治疗中所用药物的应用,其特征在于,所述旋转蒸发的蒸发时间为10-25分钟。
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