CN110464873B - 具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，包括以下步骤：首先通过“一锅法”合成介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒，同时通过双酸腐蚀以及氨基化硅烷偶联剂(APTES)修饰构建表面氨基化的钛材，通过Michael加成反应将MPDA纳米颗粒整合到钛材表面；其次，锚定在钛材表面的MPDA可作为光热材料和光敏剂载体，MPDA中具有丰富的芳香环可通过π‑π堆积相互作用促进了光敏剂(吲哚菁绿，ICG)的大量负载；最后，在MPDA表面可通过Michael加成反应进一步修饰生物相容性的RGD多肽，将所改性后的钛材命名为Ti‑M/I/RGD。

Description

具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体是一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法。
背景技术
细菌倾向于将自己组织成粘稠而强大的多细胞群落，称为生物膜，能够抵御宿主免疫系统、抗生素和环境压力。临床上，与骨植入相关的感染主要是由生物膜中的细菌引起的，而不是由浮游生长的悬浮细菌造成的。一旦生物膜形成，植入体置换手术是不可避免的，这给患者带来了沉重的经济负担。到目前为止，已有许多实质性的表面改性策略来防止生物膜的形成或破坏已形成的生物膜，比如，抗粘附界面，抗生素、抗菌肽、银纳米颗粒、DNA酶I等整合的界面。但在一些特殊情况下，植入体的抗菌界面失效仍可能出现细菌感染，甚至生物膜的形成。因此，迫切需要开发一些非手术或非侵入性的治疗方法以对抗已在植入体上形成的生物膜。
近年来，由于极小的侵袭性、较深的组织穿透性和较高的选择性，近红外光触发的的光热治疗(PTT)在纳米医学领域得到了越来越多的关注。并且，PTT被认为是一种很有前途的抗菌策略，它可以将光能转化为局部热能以破坏细菌的完整性或生物膜的结构。但是，单独使用PTT杀死细菌需要较高的局部温度，可能造成组织损伤。因此，PTT与其它抗菌策略的协同应用尤其值得考虑，这对于抑制细菌感染或消除建立生物膜具有显著的效果。光动力治疗(PDT)是一种具有潜力的抗菌策略，PDT产生的活性氧(ROS)破坏细菌膜的完整性，从而安全的PTT温度可显著提高生物膜清除效率。
但是，良好的抗生物膜能力与潜在的细胞毒性是同时存在的。因此，对钛基植入材料进行表面改性，赋予钛植入体非置换性的生物膜消除能力和生物膜消除之后的骨整合性能，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)利用合成介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒；
1.1)称取聚氧乙烯聚氧丙烯(
Figure BDA0002087006740000011
F127)倒入反应器中，并量取的三甲苯(TMB)加入反应瓶中，依次倒入蒸馏水和乙醇，室温下搅拌；
1.2)将盐酸多巴胺和三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于蒸馏水中，再将溶解后的混合物加入到上述1.1)的混合液中，室温下充分反应；
步骤1.1)～1.2)中，聚氧乙烯聚氧丙烯的质量(mg)、三甲苯的体积(mL)、步骤1.1)的蒸馏水的体积(mL)、乙醇的体积(mL)、盐酸多巴胺的质量(mg)、三羟甲基氨基甲烷的体积(mL)、步骤1.2)的蒸馏水中的体积(mL)之比为：(2000～4000)∶(2～5)∶(500～1000)∶(500～1000)∶(200～800)∶(200～1000)∶100
1.3)将1.2)反应后得到的产物进行离心处理，离心得到的沉淀是非介孔多巴胺纳米颗粒。将上述分散在在乙醇和丙酮混合液中，超声以去除模板，离心收集得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒
本步骤中，乙醇和丙酮的配比为1∶(1～3)
2)利用双酸腐蚀在钛材表面形成大量的羟基，并对其进行进一步的氨基化修饰；
2.1)配制浓度为0.1％～0.5％的氢氟酸溶液，浓度为50％～70％的硫酸溶液，将两种酸(HF:H2SO4)按照(1～2)∶(1～2)的比例混合在一起成双酸溶液，将钛箔放入双酸溶液中，充分反应，得到表面带有大量羟基的钛材；
2.2)将2.1)得到的钛材浸泡在浓度为1％～5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，充分反应，得到氨基化修饰的钛材；
3)利用Michael加成反应将MPDA纳米颗粒整合到氨基化的钛材表面；
3.1)将步骤1.3)中得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒分散在pH为7～9的Tris-HCl中，得到浓度为1～5mg/mL的MPDA溶液
3.2)将步骤2.2)得到的氨基化修饰的钛材浸泡在MPDA溶液中，反应12～24h，得到Ti-M基板；
4)利用Michael加成反应将RGDC多肽整合到MPDA纳米颗粒表面以及通过π-π堆积相互作用将光敏剂ICG负载到钛材表面的MPDA中：
4.1)配制1～5mg/mL的RGDC多肽溶液，溶剂为pH为7～9的Tris-HCl溶液，将步骤3.1)得到的Ti-M基板浸泡在RGDC溶液中，充分反应，得到Ti-M/RGD基板；
4.2)配制2～20μg/mL的吲哚菁绿(ICG)溶液，溶剂为蒸馏水，将步骤4.1)得到的Ti-M/RGD基板浸泡在ICG溶液中，充分反应，最终得到一种非侵入性的远程近红外光(NIR)触发的光热/光动力效应杀死生物膜兼具促成骨的功能性钛材，所述钛材为命名为Ti-M/I/RGD。
进一步，步骤1)利用“一锅法”合成介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒。
进一步，步骤1.1)需要在室温下搅拌10～60min；
进一步，步骤1.2)所述反应过程中，均在室温下进行，反应时间为6～24h；
进一步，步骤1.3)超声20～60min以去除模板后，离心收集沉淀，反复1～5次，收集离心下来的纳米颗粒
进一步，步骤2.1)反应温度为40～80℃，反应时间为5～20min；
进一步，步骤2.2)，钛箔尺寸为10mm×10mm(根据所用的培养板的尺寸来裁剪钛箔)，反应时间为12～48h。反应时间为12～48h。
进一步，步骤4.1)反应时间为12～24h；步骤4.2)反应时间为12～24h。
进一步，步骤2.1)，2.2)，3.1)，4.1)和4.2)中的不同钛材均需要进行3次蒸馏水的润洗以及室温下干燥。
本发明要求保护制备方法所获得的钛材，其特征在于：该钛材是基于光热/光动力治疗策略消除钛植入体表面已形成的生物膜的钛材。
值得说明的是，贻贝启发的聚多巴胺(PDA)的仿生材料因其良好的生物相容性、高的近红外光热转换效率、易于进行功能化等优点，在生物材料领域受到越来越多的关注。研究表明，PDA相关的纳米颗粒作为光热材料已广泛应用于抗肿瘤光热剂的开发中。此外，装载抗生素的PDA纳米粒，近红外光照下可增加抗生素的释放，并触发PDA纳米颗粒的光热效应，协同作用发挥高效的抗菌作用。近期的研究表明，协同使用光热/光动力治疗是极具潜力的杀伤细菌和消除生物膜的策略。
本研究中，通过“一锅法”合成了介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒，通过Michael加成反应将其整合到氨基化的钛材表面；通过π-π堆积，钛材上的MPDA纳米颗粒可以作为药物储池，进一步吸附光敏剂ICG；同时通过Michael加成反应，MPDA仍可以在表面修饰生物相容性的RGDC多肽，将最终构建的钛材命名为Ti-M/I/RGD。
进行以下推测：在近红外光照下，触发Ti-M/I/RGD产生局部的高温，促进ICG的释放并扩散到生物膜中；同时近红外光刺激光敏剂ICG产生大量的ROS去破坏细菌膜结构，使其对高温更加敏感；最后近红外光触发MPDA引起的局部高温最终导致了生物膜的死亡。此外，钛植入体表面的生物膜清除后，由于RGDC多肽的存在，仍显示出良好的骨整合效应。因此，本研究提出了一种切实可行的体内抗生物膜的策略，通过NIR触发的PDT/PTT效应，通过一种远程可控的方式，在体内消除在钛材表面已经形成的生物膜而无需外科或侵入性治疗。
本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明具有以下优点：
1)本发明中，制备方法不需要特殊设备，操作简单、可控性强。
2)本发明中构建的基于光热/光动力治疗策略，非侵入性地消除植入体表面生物膜的钛材制备方法，在抗菌植入材料的应用中有重要的研究价值和临床意义。
附图说明
图1：介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒的透射电镜图(scale bar＝200nm)；
图2：双酸腐蚀后的Ti和构建的Ti-M的扫描电镜图；图2a(scale bar＝2μm)为双酸腐蚀后的Ti表面的扫描电镜图；图2b(scale bar＝2μm)和2c(scale bar＝400nm)为MPDA纳米颗粒整合后的Ti-M表面的扫描电镜图。
图3：在近红外光照下，Ti和Ti-M/I/RGD基板的表面温度变化曲线；
图4：在近红外光照下，Ti和Ti-M/I/RGD基板的产生ROS的情况比较；图4a表示Ti基板在近红外光照后ROS检测探针DPBF的消耗情况；图4b表示Ti-M/I/RGD基板在近红外光照后ROS检测探针DPBF的消耗情况。
图5：金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜在不同基板表面和不同处理之后的代表性的平板照片(5a)和抗生物膜效率评价(5b)；
图6：金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜在不同基板表面和不同处理之后的活死染色情况；
图7：生物膜在不同基板表面和不同处理之后，通过邻硝基苯-β-D-半乳糖(ONPG)检测反应金黄色葡萄球菌(S.aureus)细菌膜通透性的变化；
图8为不同修饰样品表面间充质干细胞(MSCs)培养4天和7天后的细胞活性图；
图9为不同修饰样品表面间充质干细胞(MSCs)培养4天和7天后的碱性磷酸酶活性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1：
提出一种基于光热/光动力治疗策略非侵入性地消除植入体表面生物膜的钛材制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用“一锅法”合成介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒；
1.1)称取350mg的聚氧乙烯聚氧丙烯(
Figure BDA0002087006740000051
F127)倒入250mL反应瓶中，并量取400μL的三甲苯(TMB)加入反应瓶中，依次倒入60mL蒸馏水和65mL乙醇，室温下搅拌30min；
1.2)然后将60mg的盐酸多巴胺和90mg的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于10mL的蒸馏水中，溶解后加入到上述1.1)的混合液中；
所述反应过程中，均在室温下进行，反应时间为24h；
1.3)将1.2)反应后得到产物进行离心处理，得到的沉淀为非介孔聚多巴胺纳米颗粒。将上述的纳米颗粒在30mL乙醇/丙酮(1：1)混合液中超声30min以去除模板，离心收集沉淀，反复3次，收集离心下来的介孔聚多巴胺纳米颗粒。
2)利用双酸腐蚀在钛材表面形成大量的羟基，并对其进行进一步的氨基化修饰；
2.1)配制浓度为0.2％的氢氟酸溶液，浓度为66％的硫酸溶液，将两种酸以一定体积比(HF:H2SO4＝1:1)混合在一起成双酸溶液，将10mm×10mm的钛箔放入双酸溶液中，80℃反应10min，得到表面带有大量羟基的钛材；
2.2)将2.1)得到的钛材浸泡在浓度为3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液，反应24h，得到氨基化修饰的钛材；
3)利用Michael加成反应将MPDA纳米颗粒整合到氨基化的钛材表面；
3.1)将步骤1.3)中得到的纳米颗粒分散在pH为8.5的Tris-HCl中，得到2mg/mL的MPDA溶液；
3.2)将步骤2.2)得到的氨基化修饰的钛材浸泡在2mg/mL的MPDA溶液中，反应24h，得到Ti-M基板；
4)利用Michael加成反应将RGDC多肽整合到MPDA纳米颗粒表面以及通过π-π堆积相互作用将光敏剂ICG负载到钛材表面的MPDA中；
4.1)配制2mg/mL的RGDC多肽溶液，溶剂为pH为8.5的Tris-HCl溶液，将步骤3.1)得到的Ti-M基板浸泡在RGDC溶液中，反应24h，得到Ti-M/RGD基板；
4.2)配制10μg/mL的吲哚菁绿(ICG)溶液，溶剂为蒸馏水，将步骤4.1)得到的Ti-M/RGD基板浸泡在ICG溶液中，反应24h，最终得到一种非侵入性的远程近红外光(NIR)触发的光热/光动力效应杀死生物膜兼具促成骨的功能性钛材，所述钛材为命名为Ti-M/I/RGD。
采用以上制备方法得到的产品即为，基于光热/光动力治疗策略非侵入性地消除表面生物膜的钛植入体。
图1为介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒的透射电镜图(scale bar＝200nm)；具体是步骤1)完成后得到的介孔聚多巴胺(MPDA)的透射电镜图；由图1中可见本实施例中制备得到的MPDA纳米颗粒直径分布在200nm左右；
图2a(scale bar＝2μm)为双酸腐蚀后的Ti表面的扫描电镜图；图2b(scale bar＝2μm)和2c(scale bar＝400nm)为MPDA纳米颗粒整合后的Ti-M表面的扫描电镜图；从图2c可以看出MPDA纳米颗粒已成功整合到钛材表面；
图3为Ti和Ti-M/I/RGD基板在近红外光照下(0.75W cm-2)的温度变化；从图3中可以看出，600s的照射后，Ti表面的温度从23.3℃上升到39.2℃，而Ti-M/I/RGD表面的温度从23.3℃上升到54.2℃，表明Ti-M/I/RGD基板的光热性能；
图4为证明Ti和Ti-M/I/RGD基板在近红外光照下的ROS产生情况；图4a表明Ti基板在近红外光照后，ROS检测探针DPBF并未明显消耗；图4b表明Ti-M/I/RGD基板在近红外光照后，ROS检测探针DPBF明显消耗，表明T/I/RGD基板的产生ROS的能力。
由上述内容可以证明，本发明成功地在钛材上构建了近红外光触发的光热及ROS产生的界面。
在构建流程中，诸多因素会影响介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒的合成，钛材表面MPDA纳米颗粒的整合以及后续RGDC多肽的整合、光敏剂ICG的吸附，例如双蒸水和乙醇的加入量、MPDA纳米颗粒与氨基化钛基板的反应时间、RGDC多肽的浓度、ICG的浓度以及反应时间等，不同的控制条件将影响到具有双重功能的钛材界面的构建。
本实施例着重对MPDA合成过程中双蒸水/乙醇的加入量、MPDA纳米颗粒与氨基化钛基板的反应时间、RGDC多肽的浓度、ICG的浓度以及反应时间进行了考察。结果显示，当用双蒸水60mL和乙醇65mL时，即可得到形貌均匀的直径在200nm左右的介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒；当使用MPDA纳米颗粒的浓度为2mg/mL时，与氨基化的钛材反应时间为24h，即可在氨基化的钛表面整合上稳定均匀的MPDA纳米颗粒；当RGDC浓度为2mg/mL，ICG浓度为10μg/mL且反应时间为24小时，最终将得到具有双重功能的钛材Ti-M/I/RGD。
实施例2：
一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)利用“一锅法”合成介孔聚多巴胺(MPDA)纳米颗粒；
1.1)称取聚氧乙烯聚氧丙烯(
Figure BDA0002087006740000071
F127)倒入250mL反应瓶中，并量取的三甲苯(TMB)加入反应瓶中，依次倒入蒸馏水和乙醇，室温下搅拌10～60min；
1.2)将盐酸多巴胺和三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于蒸馏水中，再将溶解后的混合物加入到上述1.1)的混合液中，室温下充分反应；
步骤1.1)～1.2)中，聚氧乙烯聚氧丙烯的质量(mg)、三甲苯的体积(mL)、步骤1.1)的蒸馏水的体积(mL)、乙醇的体积(mL)、盐酸多巴胺的质量(mg)、三羟甲基氨基甲烷的体积(mL)、步骤1.2)的蒸馏水中的体积(mL)之比为：(2000～4000)∶(2～5)∶(500～1000)∶(500～1000)∶(200～800)∶(200～1000)∶100
所述反应过程中，均在室温下进行，反应时间为6～24h；
1.3)将1.2)反应后得到的纳米颗粒在30mL乙醇和丙酮(1：1，1：2，1：3)混合液中，超声20～60min以去除模板，离心收集介孔聚多巴胺纳米颗粒
本步骤中，乙醇和丙酮的配比为1∶(1～3)
离心收集沉淀，反复1～5次，收集离心下来的纳米颗粒
2)利用双酸腐蚀在钛材表面形成大量的羟基，并对其进行进一步的氨基化修饰；
2.1)配制浓度为0.1％～0.5％的氢氟酸溶液，浓度为50％～70％的硫酸溶液，将两种酸(HF:H2SO4)按照(1～2)∶(1～2)的比例混合在一起成双酸溶液，将10mm×10mm的钛箔放入双酸溶液中，充分反应，40～80℃反应5～20min，得到表面带有大量羟基的钛材；
2.2)将2.1)得到的钛材浸泡在浓度为1％～5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，充分反应12～48h，得到氨基化修饰的钛材；
3)利用Michael加成反应将MPDA纳米颗粒整合到氨基化的钛材表面；
3.1)将步骤1.3)中得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒分散在pH为7～9的Tris-HCl中，得到MPDA浓度为1～5mg/mL的MPDA溶液
3.2)将步骤2.2)得到的氨基化修饰的钛材浸泡在MPDA溶液中，反应12～24h，得到Ti-M基板；
4)利用Michael加成反应将RGDC多肽整合到MPDA纳米颗粒表面以及通过π-π堆积相互作用将光敏剂ICG负载到钛材表面的MPDA中：
4.1)配制1～5mg/mL的RGDC多肽溶液，溶剂为pH为7～9的Tris-HCl溶液，将步骤3.1)得到的Ti-M基板浸泡在RGDC溶液中，充分反应12～24h，得到Ti-M/RGD基板；
4.2)配制2～20μg/mL的吲哚菁绿(ICG)溶液，溶剂为蒸馏水，将步骤4.1)得到的Ti-M/RGD基板浸泡在ICG溶液中，充分反应12～24h，最终得到一种非侵入性的远程近红外光(NIR)触发的光热/光动力效应杀死生物膜兼具促成骨的功能性钛材，所述钛材为命名为Ti-M/I/RGD。
实验1：
针对实施例1所获得的材料表面抗生物膜效率检测和活死染色观察
将已经稀释好的金黄色葡萄球菌(S.aureus)以1×106个/孔的密度接种于不同的材料表面，37℃条件下培养48小时后，在不同材料表面构建形成的生物膜；然后用808nm近红外激光照射不同的样品10min。
为了检测不同材料表面的抗生物膜效率，将不同的钛材取出来，用PBS轻轻冲洗3次洗掉已经死亡的细菌，然后加入1ml PBS并超声使粘附生物膜脱落下来，再次超声10min后梯度稀释，吸取50μL稀释后的菌液在MHB固体培养基上进行涂平板，37℃条件下培养18h后计数不同组的菌落个数，最后以纯钛加近红外光处理(Ti+NIR)作为对照组计算抑菌率；Ti-M/+NIR(50℃)，Ti-M/RGD+NIR(50℃)，Ti-M/I/RGD+NIR(50℃)是指近红外光刺激下使材料升温至50℃；Ti-M/RGD+NIR(37℃)是指近红外光刺激下使材料升温至37℃。
为了制备用于荧光显微镜观察的活死染色样本，首先利用4％的多聚甲醛溶液在4℃条件下对细菌进行30分钟的固定，将不同材料表面的生物膜分别用混合染色液SYTO9和PI染料(细菌活/死染色试剂盒)染色20min。活菌和死菌将分别染成绿色和红色。用PBS微洗3次后，用倒置荧光显微镜观察生物膜中细菌的存活情况。
图5a为不同样品上金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜经过近红外光照之后，材料表面剩余活细菌的平板照片；图5b为定量后的抗生物膜效率。抗生物膜效率评价中，在近红外光照射10min后，Ti-M+NIR(50℃),Ti-M/RGD+NIR(50℃),Ti-M/I/RGD+NIR(37℃)and Ti-M/I/RGD+NIR(50℃)处理组的抗生物膜效率分别达到了34.7％,17.7％,43.9％,87.9％。
图6的生物膜活/死染色进一步评价了抗生物膜效应，其中完整膜的活细菌和敏感膜的死细菌分别在荧光显微镜下被染成绿色和红色。Ti和Ti+NIR组金黄色葡萄球菌显示几乎没有红色荧光，表明生物膜中的细菌是活的。而Ti-M+NIR(50℃)、Ti-M/RGD+NIR(50℃)和Ti-M/I/RGD+NIR(37℃)组出现了部分红色荧光，而Ti-M/I/RGD+NIR(50℃)组则出现较多的红色荧光。活死染色结果表明，Ti-M/I/RGD+NIR(50℃)具有有效的抗生物膜性能，与扩散平板法的结果一致。
此外，图7用邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)表征了金黄色葡萄球菌的细胞膜透性，反映了PDT/PTT效应下细菌膜损伤的程度。细菌膜损伤越严重，ONPG对金黄色葡萄球菌的渗透能力越强，细菌内部的β-d-半乳糖苷酶催化渗透细菌内部的ONPG生成邻硝基苯酚，紫外/可见分光度计可在420nm处检测到。近红外光照之后，Ti-M/I/RGD+NIR(37℃)组相比Ti-M+NIR(50°c)和Ti-M/RGD+NIR(50℃)组，ONPG水解明显增加(p<0.01)，表明ROS对生物膜中金黄色葡萄球菌的膜损伤比单独使用光热更严重。Ti-M/I/RGD+NIR(50℃)组展现出最强的ONPG水解能力，说明，相较于其它组，它具有最有效的破坏细菌膜的能力。
具体来说，在近红外光(NIR)刺激下，ICG产生的ROS能够引起生物膜内细菌膜的破坏，细菌将对NIR刺激MPDA所产生的高温(50℃)非常敏感，从而发挥光热/光动力抗生物膜效应。
实验2：
针对实施例1所获得的材料表面间充质干细胞(MSCs)活性检测和碱性磷酸酶检测
当细胞成长到第三代时，2×104个/孔的密度接种于不同的钛表面(Ti、Ti-M、Ti-M/RGD、Ti-M/I/RGD)以及TCPS上，37℃、5％CO2条件下培养不同时间，每两天换液一次；
利用CCK-8技术检测了4天和7天培养后不同材料表面的细胞活性，在不同时间点，为了检测不同材料表面的细胞活性，吸弃旧培养液后各孔中加入200μL不含血清的新鲜培养基以及20μL CCK-8溶液，继续培养1.5h后在450nm处测量各组吸光值；
另外利用BCA试剂盒和碱性磷酸酶试剂盒检测了4天和7天培养后不同材料表面的细胞的碱性磷酸酶水平，在不同时间点，利用BCA试剂盒确定不同组的细胞的总蛋白量，然后用ALP试剂盒确定不同组在520nm处的吸光值，根据公式计算出每组的ALP活性。
细胞AKP活性(U/g prot)＝(测量OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.1mg/mL)÷待测样品蛋白浓度(gprot/mL)；
图8为样品表面间充质干细胞培养4天和7天后的细胞活性；从图8中的结果中可以看出，两个时间段(4天和7天)培养后，Ti和Ti-M材料表面的细胞活性均显著地低于Ti-M/RGD和Ti-M/I/RGD组；并且，Ti-M/RGD和Ti-M/I/RGD两组细胞活性并没有显著性的差异。
图9为不同样品表面间充质干细胞(MSCs)培养4天和7天后的碱性磷酸酶活性；从图9中可以看出，不论4天还是7天，Ti-M/RGD和Ti-M/I/RGD表面细胞的碱性磷酸酶活性均显著地高于Ti和Ti-M组。
综上所述，本发明中的制备方法不需要特殊设备，操作简单、可控性强；并且本发明成功构建了基于光热/光动力治疗策略，非侵入性地消除植入体表面生物膜的钛材制备方法，且在生物膜消除之后仍具有能力实现有效的骨整合，在抗菌性骨植入材料的应用中有重要的研究价值和临床意义。

Claims (10)

1.一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
1）合成介孔聚多巴胺（MPDA）纳米颗粒；
1.1）称取聚氧乙烯聚氧丙烯（Pluronic® F127）倒入反应器中，并量取三甲苯（TMB）加入反应瓶中，依次倒入蒸馏水和乙醇，室温下搅拌；
1.2）将盐酸多巴胺和三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于蒸馏水中，再将溶解后的混合物加入到上述1.1）的混合液中，室温下充分反应；
1.3）将1.2）反应后得到的产物进行离心处理，离心得到的沉淀是非介孔聚多巴胺纳米颗粒；将上述颗粒分散在乙醇和丙酮混合液中，超声以去除模板，离心收集得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒；本步骤中，乙醇和丙酮的配比为1∶（1～3）；
2）利用双酸腐蚀在钛材表面形成大量的羟基，并对其进行进一步的氨基化修饰；
2.1）配制氢氟酸和硫酸的双酸溶液，将钛箔放入双酸溶液中，充分反应，得到表面带有大量羟基的钛材；
2.2）将2.1）得到的钛材浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，充分反应，得到氨基化修饰的钛材；
3）利用Michael加成反应将MPDA纳米颗粒整合到氨基化的钛材表面；
3.1）将步骤1.3）中得到的介孔聚多巴胺纳米颗粒分散在pH为7～9的Tris-HCl 中，得到MPDA溶液；
3.2）将步骤2.2）得到的氨基化修饰的钛材浸泡在MPDA溶液中，反应12～24 h，得到Ti-M基板；
4）利用Michael加成反应将RGDC多肽整合到MPDA纳米颗粒表面以及通过π-π堆积相互作用将光敏剂ICG负载到钛材表面的MPDA中：
4.1）配制1～5 mg/mL的RGDC多肽溶液，溶剂为pH为7～9的Tris-HCl溶液，将步骤3.2）得到的Ti-M基板浸泡在RGDC溶液中，充分反应，得到Ti-M/RGD基板；
4.2）配制2～20 μg/mL 的吲哚菁绿（ICG）溶液，溶剂为蒸馏水，将步骤4.1）得到的Ti-M/RGD基板浸泡在ICG溶液中，充分反应，最终得到一种非侵入性的远程近红外光（NIR）触发的光热/光动力效应杀死生物膜兼具促成骨的功能性钛材，所述钛材命名为Ti-M/I/RGD。
2.根据权利要求1所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤1）利用“一锅法”合成介孔聚多巴胺（MPDA）纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤1.1）需要在室温下搅拌10～60 min。
4.根据权利要求2或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤1.2）所述反应过程中，均在室温下进行，反应时间为6～24 h。
5.根据权利要求2或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤1.3）超声20～60 min以去除模板后，离心收集沉淀，反复1～5次，收集离心下来的纳米颗粒。
6.根据权利要求1或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤2.1）反应温度为40～80 °C，反应时间为5～20 min。
7.根据权利要求1或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤2.1），钛箔尺寸为10 mm × 10 mm；步骤2.2），反应时间为12～48 h。
8.根据权利要求1或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：步骤4.1）反应时间为12～24 h；步骤4.2）反应时间为12～24 h。
9.根据权利要求1或3所述的一种具有消除表面生物膜功能的医用钛植入体的制备方法，其特征在于：所述步骤2.1），2.2），4.1）和4.2）中的不同钛材均需要进行3次蒸馏水的润洗以及室温下干燥。
10.一种通过权利要求1～9任一项所述的制备方法所获得的钛材，其特征在于：该钛材是基于光热/光动力治疗策略消除钛植入体表面已形成的生物膜的钛材。
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